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特許7445709ステビオール配糖体の分離方法、レバウディオサイドＡの製造方法およびステビオール配糖体の分離装置
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-02-28
(45)【発行日】2024-03-07
(54)【発明の名称】ステビオール配糖体の分離方法、レバウディオサイドＡの製造方法およびステビオール配糖体の分離装置
(51)【国際特許分類】
C07H 15/256 20060101AFI20240229BHJP
C07H 1/06 20060101ALI20240229BHJP
B01J 20/281 20060101ALI20240229BHJP
G01N 30/46 20060101ALI20240229BHJP
G01N 30/88 20060101ALI20240229BHJP
G01N 30/26 20060101ALI20240229BHJP
B01D 15/00 20060101ALI20240229BHJP
B01J 20/26 20060101ALI20240229BHJP
【ＦＩ】
C07H15/256 A
C07H1/06
B01J20/281 X
G01N30/46 A
G01N30/88 N
G01N30/26 A
B01D15/00 101A
B01J20/26 G
B01J20/26 L
【請求項の数】
8
(21)【出願番号】P 2022114161
(22)【出願日】2022-07-15
(62)【分割の表示】P 2020509226の分割
【原出願日】2019-03-27
(65)【公開番号】P2022163035
(43)【公開日】2022-10-25
【審査請求日】2022-08-12
(31)【優先権主張番号】P 2018060212
(32)【優先日】2018-03-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】596136316
【氏名又は名称】三菱ケミカルアクア・ソリューションズ株式会社
(73)【特許権者】
【識別番号】000006035
【氏名又は名称】三菱ケミカル株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100104880
【弁理士】
【氏名又は名称】古部 次郎
(72)【発明者】
【氏名】西村 公志
(72)【発明者】
【氏名】渡部 貴裕
(72)【発明者】
【氏名】足立 正
【審査官】早乙女 智美
(56)【参考文献】
【文献】特表２００８－５２８９６６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００２－２１９３６７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１７－２１１３５２（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開平０６－３４０８１８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０００－３１０６２３（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１１－０５１９０９（ＪＰ，Ａ）
【文献】中国特許出願公開第１０６７４９４４８（ＣＮ，Ａ）
【文献】中国特許出願公開第１０１３６６４９６（ＣＮ，Ａ）
【文献】特開平０６－１９２２８３（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２００９／１４０３９４（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１６／０２３１０３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】BA,Jing et al.，Separation of Rebaudiana A from Steviol glycoside using a polymeric adsorbent with multi-hydrogen bo，Journal of Chromatography B，2014年，Vol.971，pp.141-149
【文献】ZHANG,R. et al.，Hydrophilic modification gigaporous resins with poly(ethylenimine) for high-throughput proteins ion-，Journal of Chromatography A，2014年，Vol.1343，pp.109-118
【文献】カラム総合カタログ2016-2017Shodex，昭和電工株式会社，2016年，22-23頁
【文献】CHEN,B. et al.，Purification and Preparation of Rebaudioside A from Steviol Glycosides Using One-Dimensional Hydroph，Journal of Chromatographic Science，2016年，Vol.54,No.8，pp.1408-1414
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｈ １５／２５６
Ｃ０７Ｈ １／０６
Ｂ０１Ｄ １５／００－１５／３６
Ｂ０１Ｊ ２０／２６－２０／３６
Ｇ０１Ｎ ３０／２６－３０／８８
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
複数種のステビオール配糖体を含む被分離液を、ポリエチレンイミンが担体に固定化され、当該担体が、エポキシ基を有する（メタ）アクリル系単量体、及び、アルキレングリコールジ（メタ）アクリレート類由来の構成単位を含む、多孔性粒子である分離剤に通液することで、少なくとも１種のステビオール配糖体を連続して分離する連続式液体クロマトグラフィーを行なう分離工程を含み、
前記分離剤は、前記担体に前記ポリエチレンイミンが担体に固定化された後に、前記多孔性粒子に残存する前記エポキシ基をジオールに変換させておく、ステビオール配糖体の分離方法。
【請求項2】
前記多孔性粒子におけるアルキレングリコールジ（メタ）アクリレート類単量体の含有量が、全単量体に対して、５質量％以上９５質量％以下である、請求項１に記載のステビオール配糖体の分離方法。
【請求項3】
前記被分離液は、ステビオール配糖体としてレバウディオサイドＡを含み、前記被分離液から前記レバウディオサイドＡを分離することを特徴とする請求項１に記載のステビオール配糖体の分離方法。
【請求項4】
前記被分離液は、ステビオール配糖体としてステビオサイドをさらに含み、前記被分離液から前記レバウディオサイドＡとステビオサイドとをそれぞれ分離することを特徴とする請求項３に記載のステビオール配糖体の分離方法。
【請求項5】
前記被分離液は、炭素数４以下の低級アルコールを溶媒とすることを特徴とする請求項３に記載のステビオール配糖体の分離方法。
【請求項6】
前記連続式液体クロマトグラフィーは、擬似移動床式の装置を使用して行なうことを特徴とする請求項１に記載のステビオール配糖体の分離方法。
【請求項7】
レバウディオサイドＡを含む複数種のステビオール配糖体を含む被分離液を、ポリエチレンイミンが担体に固定化され、当該担体が、エポキシ基を有する（メタ）アクリル系単量体、及び、アルキレングリコールジ（メタ）アクリレート類由来の構成単位を含む、多孔性粒子である分離剤に通液することで、前記レバウディオサイドＡを連続して分離する連続式液体クロマトグラフィーを行なう分離工程を含み、
前記分離剤は、前記担体に前記ポリエチレンイミンが担体に固定化された後に、前記多孔性粒子に残存する前記エポキシ基をジオールに変換させておく、レバウディオサイドＡの製造方法。
【請求項8】
被分離液中に含まれる複数種のステビオール配糖体をクロマトグラフィーにより分離するためのポリエチレンイミンが担体に固定化され、当該担体が、エポキシ基を有する（メタ）アクリル系単量体、及び、アルキレングリコールジ（メタ）アクリレート類由来の構成単位を含む、多孔性粒子である分離剤を充填する、複数の充填部と、前記充填部のそれぞれに設けられ、前記被分離液と、当該被分離液中の少なくとも１種のステビオール配糖体に富む分離液を抜き出すための溶離液とを、当該充填部に別々に供給する供給部と、
前記充填部のそれぞれに設けられ、前記分離液を当該充填部から抜き出す抜出部と、
を備え、
前記分離剤は、前記多孔性粒子に残存する前記エポキシ基がジオールに変換されている、
ステビオール配糖体の分離装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ステビオール配糖体の分離方法等に関し、より詳しくは、複数種のステビオール配糖体を含む被分離液から少なくとも１種のステビオール配糖体を分離するステビオール配糖体の分離方法等に関する。
【背景技術】
【0002】
キク科ステビア属の草木であるステビアは、甘味を有し、ステビアから抽出されたステビア抽出物には、甘味成分として複数種のステビオール配糖体が含まれる。具体的には、ステビオール配糖体として、レバウディオサイドＡ（Ｃ４４Ｈ７０Ｏ２３）およびステビオサイド（Ｃ３８Ｈ６０Ｏ１８）が主成分として含まれ、他にもこれらの誘導体が含まれる。このうちステビオサイドは、砂糖に対し３００倍の甘味度を有するが、苦味や渋味を有する。対してレバウディオサイドＡは、砂糖に対し４５０倍の甘味度を有するのみならず、苦みや渋味がない。さらに低カロリーであることから、レバウディオサイドＡは、例えば、甘味料として適している。
【0003】
特許文献１には、分子篩作用を有する樹脂を充填した少なくとも４つの充填塔を有する分離装置を用いて、レバウディオサイドＡとステビオサイドを含む組成物からレバウディオサイドＡを精製する方法であって、上記樹脂として水分含量が５０～５７質量％であるスチレン系のゲル型強酸性陽イオン交換樹脂を用いることを特徴とする、リサイクルクロマト法によるレバウディオサイドＡの精製方法が開示されている。
【0004】
また特許文献２には、キク科植物ステビア・レバウディアナ・ベルトニーに含まれる甘味成分中のレバウディオサイドＡをゲル濾過法を用いて単離するゲル濾過の濾過用ゲルとしては親水性ビニルポリマーを使用する純粋なレバウディオサイドＡを生産する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【文献】特開２０１１－５１９０９号公報
【文献】特開平６－１９２２８３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
前述の通り、レバウディオサイドＡは、例えば、甘味料として適しており、ステビア抽出物に含まれる複数種のステビオール配糖体を分離すること、特にレバウディオサイドＡを抽出することが求められる。
しかしながら従来の方法では、複数種のステビオール配糖体を効率よく分離することは困難であり、例えば、高純度のレバウディオサイドＡを得るには、分離処理に多大な労力や時間を要するという問題があった。
本発明の目的は、複数種のステビオール配糖体から少なくとも１種のステビオール配糖体を分離する際に、効率的に高純度化を図ることができるステビオール配糖体の分離方法等を提供するものである。
しかしながら従来の方法では、複数種のステビオール配糖体を効率よく分離することは困難であり、例えば、高純度のレバウディオサイドＡを得るには、分離処理に多大な労力や時間を要するという問題があった。
本発明の目的は、複数種のステビオール配糖体から少なくとも１種のステビオール配糖体を分離する際に、効率的に高純度化を図ることができるステビオール配糖体の分離方法等を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者らは、ポリエチレンイミンを担体に担持した新規な分離剤を用いて、ステビオール配糖体の液体クロマトグラフィーによる分離効率を高める検討を行った。その結果、工業化向けの効率的に高純度化を分離できるプロセスを見出して本発明を完成した。
かくして本発明によれば、複数種のステビオール配糖体を含む被分離液を、ポリエチレンイミンが担体に固定され、担体が、エポキシ基を有する（メタ）アクリル系単量体、及び、アルキレングリコールジ（メタ）アクリレート類由来の構成単位を含む、多孔性粒子である分離剤に通液することで、少なくとも１種のステビオール配糖体を連続して分離する連続式液体クロマトグラフィーを行なう分離工程を含み、分離剤は、担体にポリエチレンイミンが担体に固定化された後に、多孔性粒子に残存するエポキシ基をジオールに変換させておく、ステビオール配糖体の分離方法が提供される。
かくして本発明によれば、複数種のステビオール配糖体を含む被分離液を、ポリエチレンイミンが担体に固定され、担体が、エポキシ基を有する（メタ）アクリル系単量体、及び、アルキレングリコールジ（メタ）アクリレート類由来の構成単位を含む、多孔性粒子である分離剤に通液することで、少なくとも１種のステビオール配糖体を連続して分離する連続式液体クロマトグラフィーを行なう分離工程を含み、分離剤は、担体にポリエチレンイミンが担体に固定化された後に、多孔性粒子に残存するエポキシ基をジオールに変換させておく、ステビオール配糖体の分離方法が提供される。
【0008】
ここで、多孔性粒子におけるアルキレングリコールジ（メタ）アクリレート類単量体の含有量が、全単量体に対して、５質量％以上９５質量％以下にすることができる。この場合、ポリエチレンイミンに対する担体としてより優れている。
さらに被分離液は、ステビオール配糖体としてレバウディオサイドＡを含み、被分離液からレバウディオサイドＡを分離するようにすることができる。この場合、レバウディオサイドＡを他のステビオール配糖体から効率よく分離することができる。
またさらに被分離液は、ステビオール配糖体としてステビオサイドをさらに含み、被分離液からレバウディオサイドＡとステビオサイドとをそれぞれ分離するようにすることができる。この場合、レバウディオサイドＡとステビオサイドとを効率よく分離することができる。
そして被分離液は、炭素数４以下の低級アルコールを溶媒とすることができる。この場合、ステビオール配糖体の分離効率がより向上する。
連続式液体クロマトグラフィーは、擬似移動床式の装置を使用して行なうことができる。この場合、ステビオール配糖体の高純度化と回収効率の両立を図ることができる。
さらに被分離液は、ステビオール配糖体としてレバウディオサイドＡを含み、被分離液からレバウディオサイドＡを分離するようにすることができる。この場合、レバウディオサイドＡを他のステビオール配糖体から効率よく分離することができる。
またさらに被分離液は、ステビオール配糖体としてステビオサイドをさらに含み、被分離液からレバウディオサイドＡとステビオサイドとをそれぞれ分離するようにすることができる。この場合、レバウディオサイドＡとステビオサイドとを効率よく分離することができる。
そして被分離液は、炭素数４以下の低級アルコールを溶媒とすることができる。この場合、ステビオール配糖体の分離効率がより向上する。
連続式液体クロマトグラフィーは、擬似移動床式の装置を使用して行なうことができる。この場合、ステビオール配糖体の高純度化と回収効率の両立を図ることができる。
【0009】
また本発明によれば、レバウディオサイドＡを含む複数種のステビオール配糖体を含む被分離液を、ポリエチレンイミンが担体に固定化され、担体が、エポキシ基を有する（メタ）アクリル系単量体、及び、アルキレングリコールジ（メタ）アクリレート類由来の構成単位を含む、多孔性粒子である分離剤に通液することで、レバウディオサイドＡを連続して分離する連続式液体クロマトグラフィーを行なう分離工程を含み、分離剤は、担体にポリエチレンイミンが担体に固定化された後に、多孔性粒子に残存するエポキシ基をジオールに変換させておく、レバウディオサイドＡの製造方法を提供できる。
【0010】
さらに本発明によれば、被分離液中に含まれる複数種のステビオール配糖体をクロマトグラフィーにより分離するためのポリエチレンイミンが担体に固定化され、担体が、エポキシ基を有する（メタ）アクリル系単量体、及び、アルキレングリコールジ（メタ）アクリレート類由来の構成単位を含む、多孔性粒子である分離剤を充填する、複数の充填部と、充填部のそれぞれに設けられ、被分離液と、被分離液中の少なくとも１種のステビオール配糖体に富む分離液を抜き出すための溶離液とを、充填部に別々に供給する供給部と、充填部のそれぞれに設けられ、分離液を充填部から抜き出す抜出部と、を備え、分離剤は、多孔性粒子に残存するエポキシ基がジオールに変換されている、ステビオール配糖体の分離装置を提供できる。
【発明の効果】
【0011】
本発明によれば、複数種のステビオール配糖体から少なくとも１種のステビオール配糖体を分離する際に、効率的に高純度化を図ることができるステビオール配糖体の分離方法等を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】本実施形態が適用されるステビオール配糖体の分離フローについて示した図である。
【図2】本実施の形態が適用される擬似移動床式のクロマト分離装置について説明した図である。
【図3】本実施形態におけるクロマト分離装置の動作について説明したフローチャートである。
【図4】（ａ）～（ｂ）は、充填部内のＰ成分およびＲ成分のそれぞれの濃度分布について示した図である。
【図5】（ａ）～（ｈ）は、図３のステップ１０１～ステップ１０２の２工程（供給抜出工程、循環工程）を４回（１サイクル目～４サイクル目）繰り返した場合の充填部内の被分離液や溶離液の流れの向きを示した図である。
【図6】クロマト分離装置の他の例として、リサイクル式のクロマト分離装置を示した図である。
【図8】実施例Ａ１のクロマトグラムを示した図である。
【図9】実施例Ａ２のクロマトグラムを示した図である。
【図10】実施例Ａ３のクロマトグラムを示した図である。
【図11】比較例Ａ１のクロマトグラムを示した図である。
【図12】比較例Ａ２のクロマトグラムを示した図である。
【図13】比較例Ａ３のクロマトグラムを示した図である。
【図14】比較例Ｂ１のクロマトグラムを示した図である。
【発明を実施するための形態】
【0013】
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施の形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することができる。また、使用する図面は本実施の形態を説明するためのものであり、実際の大きさを表すものではない。
【0014】
＜被分離液、溶離液、分離剤の説明＞
（被分離液）
本実施の形態の被分離液は、含まれる複数の成分を、後述するクロマト分離装置を使用して分離する対象となる液体であり、水または有機溶媒等の溶媒に複数の成分が溶解したものである。そして、各成分の分離剤に対する相互作用の差を利用することで、複数の成分を大きく２つの画分に分離する。この複数の成分が、例えば、Ｐ成分およびＲ成分の２成分だった場合、これらを分離し、Ｐ成分およびＲ成分の何れかまたは双方を有用成分として選択的に抽出することができる。なお以下の説明では、分離剤との相互作用がより大きい成分をＰ成分、分離剤との相互作用がより小さい成分をＲ成分とし（分離剤との相互作用が、Ｒ成分＜Ｐ成分の場合）、このＰ成分とＲ成分とを分離する場合について説明を行なう。つまりこの場合、被分離液を分離剤に通液すると、Ｒ成分の通過速度の方が、Ｐ成分の通過速度より大きくなる。その結果、通液方向に向かいＲ成分が先に進みやすく、Ｐ成分が後に残りやすい。つまりＰ成分とＲ成分との分離が生ずる。なお以後、これらの成分を分離した後の液体であって、Ｐ成分とＲ成分の何れかに富む液体を、「分離液」と言うことがある。
（被分離液）
本実施の形態の被分離液は、含まれる複数の成分を、後述するクロマト分離装置を使用して分離する対象となる液体であり、水または有機溶媒等の溶媒に複数の成分が溶解したものである。そして、各成分の分離剤に対する相互作用の差を利用することで、複数の成分を大きく２つの画分に分離する。この複数の成分が、例えば、Ｐ成分およびＲ成分の２成分だった場合、これらを分離し、Ｐ成分およびＲ成分の何れかまたは双方を有用成分として選択的に抽出することができる。なお以下の説明では、分離剤との相互作用がより大きい成分をＰ成分、分離剤との相互作用がより小さい成分をＲ成分とし（分離剤との相互作用が、Ｒ成分＜Ｐ成分の場合）、このＰ成分とＲ成分とを分離する場合について説明を行なう。つまりこの場合、被分離液を分離剤に通液すると、Ｒ成分の通過速度の方が、Ｐ成分の通過速度より大きくなる。その結果、通液方向に向かいＲ成分が先に進みやすく、Ｐ成分が後に残りやすい。つまりＰ成分とＲ成分との分離が生ずる。なお以後、これらの成分を分離した後の液体であって、Ｐ成分とＲ成分の何れかに富む液体を、「分離液」と言うことがある。
【0015】
なお分離を行なうことができるのは、含まれる成分が２成分の場合に限られるものではなく、３成分以上であってもよい。そしてこれらの中から１成分を分離する場合や大きく２つの画分に分離する場合などにも適用できる。
【0016】
本実施の形態では、被分離液は、複数種のステビオール配糖体を含む。含まれるステビオール配糖体は、例えば、レバウディオサイドＡ、レバウディオサイドＢ、レバウディオサイドＣ、レバウディオサイドＤ、レバウディオサイドＥ、レバウディオサイドＦ、レバウディオサイドＧ、レバウディオサイドＨ、レバウディオサイドＩ、レバウディオサイドＪ、レバウディオサイドＫ、レバウディオサイドＬ、レバウディオサイドＭ、レバウディオサイドＮ、レバウディオサイドＯ、ステビオサイド、ズルコサイドＡ、ズルコサイドＢ、ルブソシド、ステビオールビオシドである。この場合、被分離液は、レバウディオサイドＡ、ステビオサイド、およびレバウディオサイドＡやステビオサイドの誘導体を含むと言うこともできる。このうちステビア抽出物に含まれるステビオール配糖体は、上述したように、レバウディオサイドＡおよびステビオサイドを主成分とする。
【0017】
（溶離液）
本実施の形態では、溶離液は、分離剤を充填する充填層において成分を展開し、分離剤と成分の相互作用の大きさを調整するために使用する液体である。分離剤と成分間の相互作用を溶離液濃度によって調整することで、各成分を分離して溶出させることができる。
本実施の形態では、溶離液は、分離剤を充填する充填層において成分を展開し、分離剤と成分の相互作用の大きさを調整するために使用する液体である。分離剤と成分間の相互作用を溶離液濃度によって調整することで、各成分を分離して溶出させることができる。
【0018】
（分離剤）
分離剤は、被分離液中の成分を吸着する。本実施の形態では、ポリエチレンイミンを担体に担持した分離剤を使用する。
分離剤は、被分離液中の成分を吸着する。本実施の形態では、ポリエチレンイミンを担体に担持した分離剤を使用する。
【0019】
［１］担体
本実施の形態で用いられる担体は、水やアルコールに不溶性のものであれば特に制限なく用いることができる。例えば、高分子材料からなる高分子担体や無機材料からなる無機担体が挙げられる。
本実施の形態で用いられる担体は、水やアルコールに不溶性のものであれば特に制限なく用いることができる。例えば、高分子材料からなる高分子担体や無機材料からなる無機担体が挙げられる。
【0020】
高分子担体を構成する高分子材料としては、ビニル系合成高分子、例えば、ポリスチレン（ＰＳ）などのスチレン系合成高分子、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）などの（メタ）アクリル系合成高分子、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリ塩化ビニリデン（ＰＶＤＣ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルブチラールなどのアセタール系合成高分子、ポリ酢酸ビニル（ＰＶＡｃ）、ポリアクリルアミド（ＰＡＡ）、ポリビニルエーテル系合成高分子など；ジエン系合成高分子、例えばポリブタジエン（ＰＢｄ）、ポリイソプレン（ＰＩＰ）など；縮合系合成高分子、例えばナイロン６、ナイロン６６などのポリアミド系合成高分子、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリラクトンなどのポリエステル系合成高分子、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリオキシメチレン（ＰＯＭ）などのポリエーテル系合成高分子；硬化型合成高分子、例えばポリウレタン樹脂、アルキッド樹脂、フェノール樹脂、ポリアニリン（ＰＡＮＩ）など；エポキシ系合成高分子；シリコーン系合成高分子；その他、キシレン系合成高分子、フラン系合成高分子、テルペン系合成高分子、石油系合成高分子、ケトン系合成高分子、ポリ環状チオエーテルなどの硫黄系合成高分子などが挙げられる。
【0021】
無機担体を構成する無機材料としては、例えば、活性炭、シリカゲル、珪藻土、ヒドロキシアパタイト、アルミナ、酸化チタン、マグネシア、ポリシロキサン等が挙げられる。
【0022】
このうち本実施の形態では、高分子担体を好適に用いることができ、（メタ）アクリル系合成高分子からなる高分子担体を特に好適に用いることができる。さらに高分子担体は、多孔性粒子であることが好ましい。
【0023】
本実施の形態で用いられる多孔性粒子は、架橋性（メタ）アクリル系合成高分子からなる多孔質の粒子を好適に用いることができる。例えば、多孔性粒子として、モノビニル（メタ）アクリレートと、架橋性（メタ）アクリレートとの共重合で得られる、架橋構造を有する多孔性粒子が挙げられる。なお、本明細書において（メタ）アクリル系合成高分子とは、重合体を構成する原料となる単量体の５０重量％以上、好ましくは８０重量％以上が、（メタ）アクリル系単量体からなることを言う。よって、本実施の形態で用いられる多孔性粒子は、高分子の全構成単位の５０重量％以上がアクリル系単量体またはメタクリル系単量体由来の構成単位であればよく、その他の重合性ビニル単量体由来の構成単位を含んでいてもよい。つまり耐加水分解性に優れ、得られる分離剤の使用可能期間が向上することから、好ましくは高分子の全構成単位の５０重量％以上をメタクリル系単量体由来の構成単位で構成されていることが好ましく、７０重量％以上、さらに好ましくは９０重量％以上であることがより好ましい。
【0024】
本実施の形態で用いられる（メタ）アクリル系合成高分子を構成する構成単位としては、後述の多孔性粒子の製造方法における原料として挙げた（メタ）アクリル系単量体または重合性ビニル単量体に由来する構成単位が例示される。また、種類や比率などの好ましい範囲も後述の（メタ）アクリル系単量体または重合性ビニル単量体と同様に考えられる。
本実施の形態で用いられる多孔性粒子は、特定の分子量のポリエチレンイミンを共有結合で固定化するための反応性官能基を有していることが好ましい。反応性官能基としては、水酸基、アミノ基、カルボキシル基、クロロメチル基等のハロゲン基やエポキシ基などが挙げられるが、官能基導入のし易さおよび反応性の観点からエポキシ基が好ましい。
本実施の形態で用いられる多孔性粒子は、特定の分子量のポリエチレンイミンを共有結合で固定化するための反応性官能基を有していることが好ましい。反応性官能基としては、水酸基、アミノ基、カルボキシル基、クロロメチル基等のハロゲン基やエポキシ基などが挙げられるが、官能基導入のし易さおよび反応性の観点からエポキシ基が好ましい。
【0025】
この反応性官能基は、上述の（メタ）アクリル系単量体または重合性ビニル単量体由来の構成単位として、反応性官能基となり得る官能基を有する単量体由来の構成単位を選択することで導入することができる。よって、本実施の形態で用いられる多孔性粒子は、エポキシ基含有（メタ）アクリル系単量体を含む（メタ）アクリル系単量体由来の構成単位で構成されていることが好ましい。反応性官能基となり得る官能基を有する単量体由来の構成単位やその比率については、多孔性粒子の製造方法における原料と同様に考えられる。
【0026】
（１）多孔性粒子の製造方法
本実施の形態で用いられる多孔性粒子は、典型的には重合性モノビニル単量体、重合性ポリビニル単量体、多孔質化剤、重合開始剤等を含むモノマー相を、分散安定剤等を含む水相に分散させ、加熱等による重合反応を行なうことにより製造することができる。そしてこれにより架橋構造を持つ、球状の多孔性粒子が得られる。この際、重合性モノビニル単量体、および重合性ポリビニル単量体の５０重量％以上が（メタ）アクリル系単量体であるようにすることができる。多孔性粒子が有する反応性官能基は、上述の重合性モノビニル単量体または重合性ポリビニル単量体として、反応性基となり得る官能基を有する単量体を選択することで導入することができる。
本実施の形態で用いられる多孔性粒子は、典型的には重合性モノビニル単量体、重合性ポリビニル単量体、多孔質化剤、重合開始剤等を含むモノマー相を、分散安定剤等を含む水相に分散させ、加熱等による重合反応を行なうことにより製造することができる。そしてこれにより架橋構造を持つ、球状の多孔性粒子が得られる。この際、重合性モノビニル単量体、および重合性ポリビニル単量体の５０重量％以上が（メタ）アクリル系単量体であるようにすることができる。多孔性粒子が有する反応性官能基は、上述の重合性モノビニル単量体または重合性ポリビニル単量体として、反応性基となり得る官能基を有する単量体を選択することで導入することができる。
【0027】
さらに具体的には、このような多孔性粒子は、例えば、特公昭５８－０５８０２６号公報や、特開昭５３－０９０９１１号公報に開示されているような方法を用いることができる。即ち、多孔性粒子は、反応性官能基付与性を有する（メタ）アクリル系単量体と（メタ）アクリル系単量体等とを、懸濁重合や乳化重合させることによって製造することができる。
重合性モノビニル単量体として選択される上記の（メタ）アクリル系単量体は、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸ヒドロキシエチル、（メタ）アクリル酸ヒドロキシプロピル、（メタ）アクリル酸ブチル、（メタ）アクリル酸２－エチルヘキシル、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、グリセリンモノ（メタ）アクリレート等の（メタ）アクリル酸エステル類、（メタ）アクリルアミド、ジメチル（メタ）アクリルアミド、ヒドロキシエチル（メタ）アクリルアミド等の（メタ）アクリルアミド類、（メタ）アクリロニトリルのようなニトリル類、グリシジル（メタ）アクリレート、４，５－エポキシブチル（メタ）アクリレート、９，１０－エポキシステアリル（メタ）アクリレート等のエポキシ基含有単量体などが例示できる。
重合性モノビニル単量体として選択される上記の（メタ）アクリル系単量体は、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸ヒドロキシエチル、（メタ）アクリル酸ヒドロキシプロピル、（メタ）アクリル酸ブチル、（メタ）アクリル酸２－エチルヘキシル、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、グリセリンモノ（メタ）アクリレート等の（メタ）アクリル酸エステル類、（メタ）アクリルアミド、ジメチル（メタ）アクリルアミド、ヒドロキシエチル（メタ）アクリルアミド等の（メタ）アクリルアミド類、（メタ）アクリロニトリルのようなニトリル類、グリシジル（メタ）アクリレート、４，５－エポキシブチル（メタ）アクリレート、９，１０－エポキシステアリル（メタ）アクリレート等のエポキシ基含有単量体などが例示できる。
【0028】
また、この多孔性粒子に架橋構造を付与するための重合性ポリビニル単量体としては、重合反応時に重合可能な官能基を分子中に複数個有する多官能性（メタ）アクリル系単量体を共存させる方法が一般的に用いられる。このような多官能性（メタ）アクリル系単量体としては、例えばエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート等のアルキレングリコールジ（メタ）アクリレート類や、その他アルキレンジ（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ’－アルキレンビス（メタ）アクリルアミド類、グリセロールジ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート等の多価（メタ）アクリル化合物、トリアリルイソシアヌレート、ジアリルフタレート等の多価アリル化合物などが挙げられる。
【0029】
このような多官能性（メタ）アクリル系単量体などの重合性ポリビニル単量体の使用量としては、全単量体に対して、多官能性単量体量が５重量％以上、９５重量％以下であるのが好ましく、より好ましくは１０重量％以上、９０重量％以下である。
重合性ポリビニル単量体が５重量％未満では、細孔構造の発達が不十分になったり、得られる重合体粒子の強度も低下する。一方、多官能性単量体量が９５重量％を超えて高くなると、ポリエチレンイミンの固定化が進行しにくくなり、導入量が低下して、ステビオール配糖体の吸着量が不十分となりやすい。
重合性ポリビニル単量体が５重量％未満では、細孔構造の発達が不十分になったり、得られる重合体粒子の強度も低下する。一方、多官能性単量体量が９５重量％を超えて高くなると、ポリエチレンイミンの固定化が進行しにくくなり、導入量が低下して、ステビオール配糖体の吸着量が不十分となりやすい。
【0030】
上述したように、本実施の形態で用いられる多孔性粒子の原料として、モノ（メタ）アクリル系単量体以外の重合性ビニル単量体を含んでいてもよい。重合性ビニル単量体は、通常、原料となる全単量体の３０重量％以下、好ましくは２０重量％以下、より好ましくは１０重量％以下含んでいてもよい。
モノ（メタ）アクリル系単量体以外の重合性モノビニル単量体としては、イタコン酸、マレイン酸等の不飽和カルボン酸類；スチレン、メチルスチレン、エチルスチレン、α－メチルスチレン、クロロスチレン、クロロメチルスチレン等のスチレンおよびそのアルキルまたはハロゲン置換体；酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル等のビニルエステル類、メチルビニルエーテル、エチルビニルエーテル等のビニルエーテル類；アリルアルコールおよびそのエステルまたはエーテル類；（メタ）アクリロニトリル、ビニルスルホン酸、ｐ－スチレンスルホン酸、ビニルピリジン、ビニルピロリドン等、その他のビニル化合物；等が挙げられる。
モノ（メタ）アクリル系単量体以外の重合性モノビニル単量体としては、イタコン酸、マレイン酸等の不飽和カルボン酸類；スチレン、メチルスチレン、エチルスチレン、α－メチルスチレン、クロロスチレン、クロロメチルスチレン等のスチレンおよびそのアルキルまたはハロゲン置換体；酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル等のビニルエステル類、メチルビニルエーテル、エチルビニルエーテル等のビニルエーテル類；アリルアルコールおよびそのエステルまたはエーテル類；（メタ）アクリロニトリル、ビニルスルホン酸、ｐ－スチレンスルホン酸、ビニルピリジン、ビニルピロリドン等、その他のビニル化合物；等が挙げられる。
【0031】
多官能系（メタ）アクリル系単量体以外の重合性ポリビニル単量体としては、ジビニルベンゼン、ジビニルナフタレン、２，４，６－トリビニルエチルベンゼン等の芳香族ポリビニル化合物；アジピン酸ジビニル、マレイン酸ジアリル、フタル酸ジアリル、１，３，５－ベンゼントリカルボン酸トリアリル等のポリカルボン酸ポリビニルエステル、ポリカルボン酸ポリアリルエステル類；ジビニルエーテル、（ポリ）エチレングリコールジビニルエーテル、トリメチロールプロパンジアリルエーテル、ペンタエリスリトールトリアリルエーテル等のポリオールポリビニルエーテル、ポリオールポリアリルエーテル類；ブタジエン、メチレンビスアクリルアミド等その他のポリビニル化合物；等が挙げられる。
【0032】
反応性官能基付与性を有する重合性ビニル単量体としては、特定の分子量のポリエチレンイミンを共有結合で固定化できるような反応性官能基そのものを有する重合性単量体がある。またはこのような反応性官能基を有する化合物（リンカー）と反応可能な官能基を有する重合性単量体がある。本実施の形態ではそのいずれも使用可能である。
この特定の分子量のポリエチレンイミンを共有結合で固定化できる反応性官能基としては、ポリエチレンイミンの結合部位に相当する官能基の種類に応じて選択すればよい。例えばエポキシ基、カルボキシル基などが挙げられる。中でも反応性の点から、エポキシ基が好ましい。
この特定の分子量のポリエチレンイミンを共有結合で固定化できる反応性官能基としては、ポリエチレンイミンの結合部位に相当する官能基の種類に応じて選択すればよい。例えばエポキシ基、カルボキシル基などが挙げられる。中でも反応性の点から、エポキシ基が好ましい。
【0033】
このようなエポキシ基を有する重合性単量体としては、上述の（メタ）アクリル系単量体の例として挙げられている、グリシジル（メタ）アクリレートなどのエポキシ基含有単量体の他、アリルグリシジルエーテル、ビニルグリシジルエーテル、４－エポキシ－１－ブテンなどが挙げられる。中でもグリシジル（メタ）アクリレートが好ましく、さらにグリシジルメタクリレートが特に好ましい。
【0034】
［２］ポリエチレンイミン
本実施の形態の分離剤は、前述の多孔性粒子にポリエチレンイミンが共有結合で固定化されていることが好ましい。
本実施の形態に用いられるポリエチレンイミンは、質量平均分子量（以下、単に「分子量」ともいう）が２００以上、１０万以下であることが好ましい。ポリエチレンイミンの分子量は、好ましくは３００以上、より好ましくは５００以上であって、好ましくは１０万以下、より好ましくは１万以下である。本実施の形態の分離剤では、官能基であるポリエチレンイミンが分離対象であるステビオール配糖体と三次元的に相互作用するために分離性が向上するものと推定されることから、分子量が２００を下回ると分離対象であるステビオール配糖体との相互作用程度が不十分となる。また１０万を上回ると粘度が高くなることから固定化反応に際して多量の溶媒での希釈が必要となり、また固定化反応の反応率が低下し分離剤への導入量が低下することから結果的にステビオール配糖体の吸着量が低下する。
なお、この分子量とは代表的な値であり、具体的には株式会社日本触媒より販売される工業用ポリエチレンイミン（商品名：エポミン）や各種試薬会社より販売される試薬ポリエチレンイミン等に表記される分子量を満たす。
本実施の形態の分離剤は、前述の多孔性粒子にポリエチレンイミンが共有結合で固定化されていることが好ましい。
本実施の形態に用いられるポリエチレンイミンは、質量平均分子量（以下、単に「分子量」ともいう）が２００以上、１０万以下であることが好ましい。ポリエチレンイミンの分子量は、好ましくは３００以上、より好ましくは５００以上であって、好ましくは１０万以下、より好ましくは１万以下である。本実施の形態の分離剤では、官能基であるポリエチレンイミンが分離対象であるステビオール配糖体と三次元的に相互作用するために分離性が向上するものと推定されることから、分子量が２００を下回ると分離対象であるステビオール配糖体との相互作用程度が不十分となる。また１０万を上回ると粘度が高くなることから固定化反応に際して多量の溶媒での希釈が必要となり、また固定化反応の反応率が低下し分離剤への導入量が低下することから結果的にステビオール配糖体の吸着量が低下する。
なお、この分子量とは代表的な値であり、具体的には株式会社日本触媒より販売される工業用ポリエチレンイミン（商品名：エポミン）や各種試薬会社より販売される試薬ポリエチレンイミン等に表記される分子量を満たす。
【0035】
（１）多孔性粒子の反応性官能基
上述のポリエチレンイミンを、架橋構造を有する（メタ）アクリル系合成高分子の多孔性粒子に共有結合で固定化する方法は、通常以下のような方法が用いられるが、これに限定されるものではない。
固定化は、（メタ）アクリル系合成高分子粒子に反応性官能基付与性を有する（メタ）アクリル系単量体を共重合等の形で取り込ませておいた上で、この反応性官能基と、ポリエチレンイミンとを直接反応させる方法を用いることができる。また他にも（メタ）アクリル系合成高分子の構成成分に含まれる官能基およびポリエチレンイミンにそれぞれ反応可能な官能基を分子内にそれぞれ１個以上有する低分子または高分子化合物（以下、このような化合物をまとめて「スペーサー」と記す）を介して結合させる方法を用いることができる。
上述のポリエチレンイミンを、架橋構造を有する（メタ）アクリル系合成高分子の多孔性粒子に共有結合で固定化する方法は、通常以下のような方法が用いられるが、これに限定されるものではない。
固定化は、（メタ）アクリル系合成高分子粒子に反応性官能基付与性を有する（メタ）アクリル系単量体を共重合等の形で取り込ませておいた上で、この反応性官能基と、ポリエチレンイミンとを直接反応させる方法を用いることができる。また他にも（メタ）アクリル系合成高分子の構成成分に含まれる官能基およびポリエチレンイミンにそれぞれ反応可能な官能基を分子内にそれぞれ１個以上有する低分子または高分子化合物（以下、このような化合物をまとめて「スペーサー」と記す）を介して結合させる方法を用いることができる。
【0036】
例えば前者の方法としては、（メタ）アクリル系合成高分子粒子にエポキシ基、カルボキシル基などのアミノ基と共有結合を形成する官能基を含有させておき、これとポリエチレンイミンを直接反応させて固定化する方法が例示できる。
また、後者の方法としては、例えば、スペーサーとしてアミノ酸（アミノカルボン酸）類を用い、そのアミノ基部位と（メタ）アクリル系合成高分子のエポキシ基とを反応させた上で、他の末端のカルボキシル基によってポリエチレンイミンのアミノ基と反応させる方法が挙げられる。また他にもスペーサーとして（ポリ）エチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリオールポリグリシジルエーテル等のポリグリシジル化合物を用いて、（メタ）アクリル系合成高分子中のヒドロキシル基やアミノ基とポリグリシジル化合物の一方の末端を結合させ、残る末端のエポキシ基をポリエチレンイミンと結合させる方法などが挙げられる。
また、後者の方法としては、例えば、スペーサーとしてアミノ酸（アミノカルボン酸）類を用い、そのアミノ基部位と（メタ）アクリル系合成高分子のエポキシ基とを反応させた上で、他の末端のカルボキシル基によってポリエチレンイミンのアミノ基と反応させる方法が挙げられる。また他にもスペーサーとして（ポリ）エチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリオールポリグリシジルエーテル等のポリグリシジル化合物を用いて、（メタ）アクリル系合成高分子中のヒドロキシル基やアミノ基とポリグリシジル化合物の一方の末端を結合させ、残る末端のエポキシ基をポリエチレンイミンと結合させる方法などが挙げられる。
【0037】
なお、スペーサーとしてはポリエチレンイミンとの反応性や固定化時の（メタ）アクリル系合成高分子粒子との立体障害の関係を考慮すると、直鎖状の構造を有していることが好ましい。分岐鎖状の構造のスペーサーを用いると、立体障害が大きくなって、ポリエチンイミンの固定化反応を抑制するためか、吸着量が低下する傾向となる。
【0038】
（２）ポリエチレンイミンの固定化反応
ポリエチレンイミンの固定化反応に際しては、例えばポリエチレンイミンをそのまま、あるいは有機溶媒溶液または水溶液として、上記エポキシ基等を有する（メタ）アクリル系合成高分子の多孔性粒子に供給し、反応を行わせる。
ポリエチレンイミンを単独で用いると粘度が高く、工業的に製造するには設備的な問題があることから、有機溶媒溶液または水溶液として上記エポキシ基等を有する（メタ）アクリル系多孔性粒子に供給することが好ましい。さらにエポキシ基を有する（メタ）アクリル系多孔性粒子を用いる場合には、水溶液系ではエポキシ基への水付加によるジオール生成反応との競争反応となることから、有機溶媒溶液として上記エポキシ基等を有する（メタ）アクリル系合成高分子の多孔性粒子に供給することが特に好ましい。
ポリエチレンイミンの固定化反応に際しては、例えばポリエチレンイミンをそのまま、あるいは有機溶媒溶液または水溶液として、上記エポキシ基等を有する（メタ）アクリル系合成高分子の多孔性粒子に供給し、反応を行わせる。
ポリエチレンイミンを単独で用いると粘度が高く、工業的に製造するには設備的な問題があることから、有機溶媒溶液または水溶液として上記エポキシ基等を有する（メタ）アクリル系多孔性粒子に供給することが好ましい。さらにエポキシ基を有する（メタ）アクリル系多孔性粒子を用いる場合には、水溶液系ではエポキシ基への水付加によるジオール生成反応との競争反応となることから、有機溶媒溶液として上記エポキシ基等を有する（メタ）アクリル系合成高分子の多孔性粒子に供給することが特に好ましい。
【0039】
有機溶媒については、ポリエチレンイミンを溶解することが可能なものが好ましく、ブチルアルコール類、プロピルアルコール類、エチルアルコールおよびメチルアルコール等のアルコール類や、エチレングリコールジメチルエーテル、ジエチレングリコールジメチルエーテル、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）およびジオキサン等のエーテル類、またジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド等のアミド類等が例示されるが、上記エポキシ基等を有する（メタ）アクリル系合成高分子の多孔性粒子を膨潤させるエチレングリコールジメチルエーテル、ジエチレングリコールジメチルエーテル、ジエチルエーテル、ＴＨＦおよびジオキサン等のエーテル類がさらに好ましい。
固定化反応の温度は常温（２５℃）～１００℃程度が好ましい。温度が高くなると（メタ）アクリル系多孔性粒子の分解の懸念があり、一方温度が低いと反応に長時間を要することとなる。
固定化反応の温度は常温（２５℃）～１００℃程度が好ましい。温度が高くなると（メタ）アクリル系多孔性粒子の分解の懸念があり、一方温度が低いと反応に長時間を要することとなる。
【0040】
（３）後処理
上記のように固定化反応を行った後、多孔性粒子側に残存する反応性官能基は、後処理により不活性化しておくことが好ましい。不活性化せずに残った反応性官能基は、徐々にステビオール配糖体やステビア葉抽出物中の夾雑物等の活性基と反応し、分離剤の吸着容量を低下させたり、分離選択性を悪化させたりする場合がある。
上記のように固定化反応を行った後、多孔性粒子側に残存する反応性官能基は、後処理により不活性化しておくことが好ましい。不活性化せずに残った反応性官能基は、徐々にステビオール配糖体やステビア葉抽出物中の夾雑物等の活性基と反応し、分離剤の吸着容量を低下させたり、分離選択性を悪化させたりする場合がある。
【0041】
このような後処理としては、例えば反応性官能基としてエポキシ基を例に取れば、水と反応させてジオールに変換する方法が例示できる。このときの触媒としてリン酸、硫酸等の無機酸水溶液、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ類水溶液が挙げられ、特に硫酸水溶液の使用が好ましい。硫酸水溶液の濃度や反応温度、反応時間等の処理条件は、特に制限されるものではないが、通常、濃度１％～３０％、温度１０℃～９０℃の条件で０．１時間～２４時間実施することができる。さらに好ましい処理条件は濃度３％～２０％、温度２０℃～８０℃にて１時間～１０時間である。
【0042】
＜ステビオール配糖体の分離フローの説明＞
図１は、本実施形態が適用されるステビオール配糖体の分離フローについて示した図である。なお図１で示したステビオール配糖体の分離フローは、ステビオール配糖体の分離方法と捉えることもできる。
図１は、本実施形態が適用されるステビオール配糖体の分離フローについて示した図である。なお図１で示したステビオール配糖体の分離フローは、ステビオール配糖体の分離方法と捉えることもできる。
【0043】
図示するように、本実施の形態のステビオール配糖体の分離フローは、熱水抽出工程５１と、薬剤処理工程５２と、ろ過工程５３と、吸着工程５４と、分離工程５５と、溶媒留去工程５６と、カチオン交換工程５７と、アニオン交換工程５８と、脱色工程５９と、濃縮工程６０と、噴霧乾燥工程６１とを含む。
【0044】
熱水抽出工程５１では、ステビアの葉を乾燥した乾葉を原料とし、この乾葉を熱水に入れ、乾葉に含まれる成分を抽出する熱水抽出を行なう。原料である乾葉は、例えば、ステビアの葉を、２０℃～６０℃にて１時間～２４時間乾燥させたものである。また乾燥後の葉をさらに粉砕したものを原料としてもよい。なお溶媒として、水の代わりに、アルコール等の有機溶媒を使用して抽出を行なってもよい。また超臨界流体を用いて抽出を行なう超臨界流体抽出、酵素を用いて抽出を行なう酵素抽出、微生物を用いて抽出を行なう微生物抽出、超音波を用いて抽出を行なう超音波抽出、マイクロ波を用い抽出を行なうマイクロ波抽出などの方法を利用することもできる。熱水抽出した後の抽出液には、複数のステビオール配糖体の他、不純物が含まれる。
【0045】
薬剤処理工程５２では、熱水抽出工程５１を経た後の抽出液に薬剤を添加し、不純物を凝集させる処理を行なう。ここでは、抽出液に含まれる不純物表面の電荷を中和し、ファンデルワールス力（分子間引力）により抽出液中に分散する粒子を集合させる凝結作用により凝集を生じさせる。つまり薬剤は、凝集剤であり、例えば、カリウムミョウバン（カリウムイオン、水和アルミニウムイオンおよび硫酸イオンを含む複塩）、硫酸アルミニウム（Ａｌ２（ＳＯ４）３）、水酸化アルミニウム（Ａｌ（ＯＨ）３）、酸化アルミニウム（Ａｌ２Ｏ３）、五酸化二リン（Ｐ２Ｏ５）、酸化マグネシウム（ＭｇＯ）、硫酸鉄（ＦｅＳＯ４）、塩化鉄（ＦｅＣｌ３）等を用いることができる。
薬剤処理工程５２では、抽出液に薬剤を添加し、ｐＨを例えば、８．５～９．０の間に調整しつつ、５分～１時間撹拌することで処理を行なう。ｐＨの調整は、例えば、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、水酸化カルシウム（Ｃａ（ＯＨ）２）、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）等を使用することで行なう。
薬剤処理工程５２では、抽出液に薬剤を添加し、ｐＨを例えば、８．５～９．０の間に調整しつつ、５分～１時間撹拌することで処理を行なう。ｐＨの調整は、例えば、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、水酸化カルシウム（Ｃａ（ＯＨ）２）、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）等を使用することで行なう。
【0046】
ろ過工程５３では、薬剤処理工程５２で凝集した不純物を、ろ過することにより除去する。ろ過は、例えば、フィルタを使用した重力ろ過や遠心ろ過により行なう。
【0047】
吸着工程５４では、合成吸着剤を用いてステビオール配糖体を吸着する。吸着工程５４では、例えば、合成吸着剤を充填した１つまたは複数のカラムにろ過工程５３によりろ過したろ過液を通液することで処理を行なう。合成吸着剤は、多孔質構造を有する架橋高分子からなり、例えば、球状とすることができる。吸着工程５４で使用できる合成吸着剤としては、例えば、スチレン－ジビニルベンゼン系合成吸着剤である三菱ケミカル株式会社製のダイヤイオン（登録商標）ＨＰ２０や、芳香族系合成吸着剤である同社製のＳＰ７００が挙げられる。なお合成吸着剤を通液後の液は、廃液とする。
【0048】
合成吸着剤に吸着させたステビオール配糖体は、アルコール水溶液を用いて溶出させる。アルコール水溶液に含まれるアルコール（アルコール溶媒）としては、水と自由に混和するアルコールであれば特に限られるものではない。アルコールとしては、例えば、炭素数４以下の低級アルコールであることが好ましく、炭素数３以下の低級アルコールであることがさらに好ましい。具体的には、例えば、メタノール、エタノール、ｎ－プロパノール、２－プロパノール（イソプロピルアルコール（ＩＰＡ））、１－ブタノール、２－ブタノール、およびこれらの混合物等が挙げられる。またアルコールは、アルコール水溶液全体に対し、例えば、３０重量％～９５重量％の濃度とすることができる。
吸着工程５４によりさらに不純物を除去することができる。そして吸着工程５４を経た後の被分離液は、不純物が除去されており、複数のステビオール配糖体が含まれる。
吸着工程５４によりさらに不純物を除去することができる。そして吸着工程５４を経た後の被分離液は、不純物が除去されており、複数のステビオール配糖体が含まれる。
【0049】
分離工程５５では、複数のステビオール配糖体の分離を行なう。具体的には、分離工程では、被分離液を、分離剤に通液することで、少なくとも１種のステビオール配糖体を連続して分離する連続式液体クロマトグラフィーを行なう。このとき使用される分離剤は、上述したポリエチレンイミンを担体に担持した分離剤である。分離工程５５では、例えば、レバウディオサイドＡを、他のステビオール配糖体から分離する。また上述したように、ステビア抽出物に含まれるステビオール配糖体は、レバウディオサイドＡおよびステビオサイドを主成分とするため、この主成分同士を分離することが重要である。よって分離工程５５では、レバウディオサイドＡとステビオサイドとを分離する、と言うこともできる。分離工程５５で使用されるステビオール配糖体の分離装置については、後で詳述する。
【0050】
溶媒留去工程５６では、分離工程５５を経た後の分離液に含まれるアルコール溶媒を除去する。具体的には、分離液を、減圧下で蒸留または蒸発することでアルコール溶媒を除去する。
【0051】
カチオン交換工程５７では、カチオン交換体が充填されたカラムに溶媒留去工程５６を経た後の分離液を通液する。これにより、溶媒留去工程５６を経た後の分離液中のカチオン成分と、カチオン交換体中のイオン交換基とがイオン交換を行ない、カチオン成分を吸着する。カチオン交換体としては、カチオン交換樹脂（陽イオン交換樹脂）を使用することができる。
【0052】
カチオン交換樹脂としては、強酸性カチオン交換樹脂と弱酸性カチオン交換樹脂とに大別されるが、何れも使用することができる。ただし本実施の形態では、強酸性カチオン交換樹脂を使用している。
強酸性カチオン交換樹脂は、例えば、スルホン基を持つ酸性イオン交換樹脂が挙げられる。また本実施の形態で使用するカチオン交換樹脂を架橋度または多孔度で分類した場合には、ゲル型、ポーラス型、ハイポーラス型等が挙げられるが、いずれも使用可能である。具体的には、強酸性カチオン交換樹脂として、三菱ケミカル株式会社製のゲル型の強酸性カチオン交換樹脂であるダイヤイオンＳＫ１Ｂ等を用いることができる。
弱酸性カチオン交換樹脂は、例えば、カルボキシル基（－ＣＯＯＨ）を交換基とするものが挙げられる。またカルボキシル基の対イオンである水素イオン（Ｈ＋）の替わりに、金属イオン、アンモニウムイオン（ＮＨ４ ＋）等の陽イオンとなっていてもよい。具体的には、弱酸性カチオン交換樹脂として、三菱ケミカル株式会社製のダイヤイオンＷＫ４０Ｌ等を用いることができる。
強酸性カチオン交換樹脂は、例えば、スルホン基を持つ酸性イオン交換樹脂が挙げられる。また本実施の形態で使用するカチオン交換樹脂を架橋度または多孔度で分類した場合には、ゲル型、ポーラス型、ハイポーラス型等が挙げられるが、いずれも使用可能である。具体的には、強酸性カチオン交換樹脂として、三菱ケミカル株式会社製のゲル型の強酸性カチオン交換樹脂であるダイヤイオンＳＫ１Ｂ等を用いることができる。
弱酸性カチオン交換樹脂は、例えば、カルボキシル基（－ＣＯＯＨ）を交換基とするものが挙げられる。またカルボキシル基の対イオンである水素イオン（Ｈ＋）の替わりに、金属イオン、アンモニウムイオン（ＮＨ４ ＋）等の陽イオンとなっていてもよい。具体的には、弱酸性カチオン交換樹脂として、三菱ケミカル株式会社製のダイヤイオンＷＫ４０Ｌ等を用いることができる。
【0053】
アニオン交換工程５８では、アニオン交換体が充填されたカラムにカチオン交換工程５７を経た後の分離液を通液する。これにより、カチオン交換工程５７を経た後の分離液中のアニオン成分と、アニオン交換体中のイオン交換基とがイオン交換を行ない、アニオン成分を吸着する。アニオン交換体としては、アニオン交換樹脂（陰イオン交換樹脂）を使用することができる。
【0054】
アニオン交換樹脂としては、強塩基性アニオン交換樹脂と弱塩基性アニオン交換樹脂に大別されるが、何れも使用することができる。ただし本実施の形態では、強塩基性アニオン交換樹脂を使用している。
強塩基性アニオン交換樹脂は、例えば、四級アンモニウム基を交換基とするものが挙げられる。具体的には、三菱ケミカル株式会社製のダイヤイオンＨＰＡ２５ＬやＰＡ３０８等を用いることができる。
弱塩基性アニオン交換樹脂は、例えば、一級アンモニウム基や二級アンモニウム基を交換基とするものが挙げられる。具体的には、三菱ケミカル株式会社製のダイヤイオンＷＡ１０等を用いることができる。
強塩基性アニオン交換樹脂は、例えば、四級アンモニウム基を交換基とするものが挙げられる。具体的には、三菱ケミカル株式会社製のダイヤイオンＨＰＡ２５ＬやＰＡ３０８等を用いることができる。
弱塩基性アニオン交換樹脂は、例えば、一級アンモニウム基や二級アンモニウム基を交換基とするものが挙げられる。具体的には、三菱ケミカル株式会社製のダイヤイオンＷＡ１０等を用いることができる。
【0055】
脱色工程５９では、カチオン交換工程５７およびアニオン交換工程５８を経た後の脱イオン液に対し、脱色を行なう。脱色は、例えば、脱イオン液を活性炭に通液することで行なう。これにより着色成分が活性炭に吸着され、脱色が行なわれる。
【0056】
濃縮工程６０は、脱色工程５９を経た後の脱色液を加熱し、水分を蒸発させることで濃縮を行なう。
【0057】
噴霧乾燥工程６１は、濃縮工程６０を経た後の濃縮液を、噴霧乾燥機（スプレードライヤー）を使用することで噴霧乾燥する。
【0058】
以上の工程により、複数のステビオール配糖体から、例えば、レバウディオサイドＡを選択的に分離し、これを甘味料等の製品とすることができる。また上述した工程によりレバウディオサイドＡを分離する方法は、レバウディオサイドＡの製造方法と考えることもできる。
なお熱水抽出工程５１、薬剤処理工程５２、ろ過工程５３、吸着工程５４は、複数種のステビオール配糖体を含む被分離液を準備する準備工程と捉えることができる。なおこれに限られるものではなく、例えば、被分離液を、例えば、購入し、用意するような場合もこの準備工程であると考えることができる。
なお熱水抽出工程５１、薬剤処理工程５２、ろ過工程５３、吸着工程５４は、複数種のステビオール配糖体を含む被分離液を準備する準備工程と捉えることができる。なおこれに限られるものではなく、例えば、被分離液を、例えば、購入し、用意するような場合もこの準備工程であると考えることができる。
【0059】
＜ステビオール配糖体の分離装置の説明＞
次に、分離工程５５で使用されるステビオール配糖体の分離装置について詳述する。
本実施の形態では、ステビオール配糖体の分離装置として、以下に示す擬似移動床式のクロマト分離装置を使用する。
次に、分離工程５５で使用されるステビオール配糖体の分離装置について詳述する。
本実施の形態では、ステビオール配糖体の分離装置として、以下に示す擬似移動床式のクロマト分離装置を使用する。
【0060】
図２は、本実施の形態が適用される擬似移動床式のクロマト分離装置１について説明した図である。
【0061】
クロマト分離装置１は、成分の分離を行なう充填部１０と、被分離液や溶離液の供給を行なう供給部２０と、分離液を抜き出す抜出部３０と、流路の切り換えを行なう切換部４０とを備える。
【0062】
本実施の形態では、充填部１０は、１つのクロマト分離装置１に４個備えられる。本実施の形態では、充填部１０として、充填部１１、１２、１３、１４（充填部１１～１４）を図示している。なお以後、充填部１１、１２、１３、１４のそれぞれを区別しない場合は、単に充填部１０と言うことがある。充填部１０は、被分離液中に含まれる複数種のステビオール配糖体をクロマトグラフィーにより分離するための分離剤を充填する。この分離剤は、上述したポリエチレンイミンを担体に担持した分離剤である。これらの分離剤を充填する分離塔は上部に空塔を持たないパックドカラムタイプとすることがより好ましい。なお充填部１０は、１つのクロマト分離装置１に２個備えれば足りる。ただし、分離効率の観点から３個以上備えることがより好ましく、被分離液の状態等に基づいて分離工程の条件を調整したい場合には、４個以上備えることがさらに好ましい。また充填部１０は、１つのクロマト分離装置１に５個以上備えてもよい。
【0063】
充填部１０は、例えば、カラムであり、分離剤を充填するための空間を内部に有する。充填部１０は、材質として例えば、鋼板などからなり、接液部はゴムライニングしたものとすることができるが、これに限られるものではない。例えば、充填部１０の材質として樹脂等も使用することができる。また充填部１０の形状としては特に限られるものではないが、本実施の形態では、例えば、略円筒形状とし、全体として塔形状をなす。
【0064】
供給部２０は、充填部１０のそれぞれに設けられ、被分離液と、被分離液中の少なくとも１種のステビオール配糖体に富む分離液を抜き出すための溶離液とを、充填部１０に別々に供給する。供給部２０は、例えば、充填部１０の上部に設けられた供給口である。本実施の形態では、供給部２０として、供給部２１、２２、２３、２４（供給部２１～２４）を図示している。なお以後、供給部２１、２２、２３、２４のそれぞれを区別しない場合は、単に供給部２０と言うことがある。
【0065】
抜出部３０は、充填部１０のそれぞれに設けられ、分離液を充填部１０から抜き出す。抜出部３０は、例えば、充填部１０の下部に設けられた排出口である。本実施の形態では、抜出部３０として、抜出部３１、３２、３３、３４（抜出部３１～３４）を図示している。なお以後、抜出部３１、３２、３３、３４のそれぞれを区別しない場合は、単に抜出部３０と言うことがある。
【0066】
切換部４０は、例えば、開閉弁（開閉バルブ）である。そしてこの開閉弁を開閉することで、被分離液、溶離液、分離液の流路を切り換えることができる。本実施の形態では、切換部４０は、溶離液開閉弁Ｗ１、Ｗ２、Ｗ３、Ｗ４（溶離液開閉弁Ｗ１～Ｗ４）、被分離液開閉弁Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４（被分離液開閉弁Ｆ１～Ｆ４）、接続路開閉弁Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４（接続路開閉弁Ｘ１～Ｘ４）、Ｒ成分開閉弁Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４（Ｒ成分開閉弁Ｒ１～Ｒ４）、およびＰ成分開閉弁Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４（Ｐ成分開閉弁Ｐ１～Ｐ４）を備える。
【0067】
被分離液において溶質であるステビオール配糖体の溶解度が温度に依存するため、クロマト分離装置１内の温度を一定に維持する必要がある。具体的には、３０重量％～９５重量％のイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）を溶媒としてステビオール配糖体を溶出させた場合には、装置内の温度が１０℃～５０℃であることが好ましく、２０℃～４０℃であることがより好ましく、２５℃～３５℃であることがさらに好ましい。装置内の温度が１０℃以下では、ステビオール配糖体が装置内に析出しやすくなるため、配管詰まりや樹脂固まりが発生しやすくなり、その結果、偏流が生じて液流れが悪化しやすい。この場合、被分離液を装置内に連続的に通液できない問題があり、工業化を実現することが難しい。また、装置内の温度が５０℃以上では、ステビオール配糖体の加熱による変質等の恐れがある。
装置内の温度を一定に維持するためには、保温材で配管やカラムの周囲を覆ってもよく、温度が変動しやすい場所にて熱交換装置を設置してもよい。また、ステビオール配糖体を含む被分離液の溶解を促進するために、超音波をかけてもよい。
装置内の温度を一定に維持するためには、保温材で配管やカラムの周囲を覆ってもよく、温度が変動しやすい場所にて熱交換装置を設置してもよい。また、ステビオール配糖体を含む被分離液の溶解を促進するために、超音波をかけてもよい。
【0068】
クロマト分離装置１内の温度が２２℃～３５℃であり、３０重量％～９５重量％のイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）を溶媒として用いた場合には、被分離液におけるステビオール配糖体の濃度が５ｇ／Ｌ～１２０ｇ／Ｌであることが好ましく、１０ｇ／Ｌ～１００ｇ／Ｌであることがより好ましい。被分離液の濃度が、１２０ｇ／Ｌを超ると、ステビオール配糖体が装置内に析出しやすくなる。また、被分離液の濃度が、濃度が５ｇ／Ｌ以下であると、分離効率低下の問題が生じる。
【0069】
クロマト分離装置１は、被分離液に含まれる不純物を確実に除去するため、前処理部を備えることが好ましい（図示せず）。複数種のステビオール配糖体を含む被分離液には、天然物由来の色素成分や有機酸等の不純物が含まれる。これらの不純物の中には、親水性の物質と疎水性の物質とがそれぞれ含まれる。このうち、親水性の物質は、分離剤における高分子担体の表面に固定されたポリエチレンイミンとの間で、負電荷を帯びた親水性の物質との静電相互作用に基づく吸着が発生しやすい。またさらに、疎水性の物質は、高分子担体である（メタ）アクリル多孔体粒子との間で、水素結合や疎水性相互作用に基づく吸着が発生しやすい。そのため、分離剤中の有効なイオン交換基が少なくなり、分離剤のイオン交換機能が低下していく問題が起こる。この場合、水酸化ナトリウム、純水等により分離剤の再生操作をしても、分離剤の機能を完全に回復させることは難しい。
また、被分離液に不純物が含まれると、或る充填部１０から抜き出した被分離液と溶離液を他の充填部１０に導入する際に、Ｐ成分、Ｒ成分と他の成分とのピークの位置や高さが充填部１０毎に異なる現象が起こる。そして、複数のピークの位置が重なる場合には、抜出部３０から抜出した成分の純度が低下する。また、ピークの高さが低くなると、抜出部３０から抜出した成分の回収率が低下する。よって、複数種のステビオール配糖体を含む被分離液に含まれる不純物を前処理より確実に除去しないと、安定的に連続式液体クロマトグラフィーを行えない問題が生じる。
前処理部は、例えば、プレカラムであり、分離剤を充填するための空間を内部に有する。そして、色素成分や有機酸等の不純物を含有する被分離液を前処理部に通液させ、不純物を除去してから充填部１１、１２、１３、１４に供給する。そうすると、安定的に連続式液体クロマトグラフィーを行うことができる。不純物除去率や、管理のしやすさを考慮すると、プレカラムに充填された分離剤と充填部１１、１２、１３、１４に充填された分離剤とは同じものであっても良い。不純物除去ができたかどうかの判断基準は、継続的に単管カラム試験を行い、Ｐ成分、Ｒ成分と他の成分とのピークの位置や高さが変化しないことである。
本発明において、不純物が除去されたか否かの判断は、単管カラム試験により行う。単管カラム試験では、一の単管カラムに、前処理後に行う連続式液体クロマトグラフィーと同一の条件で、前処理された被分離液を２回連続して通し、それぞれの通過液の、ＢＶ（ベッドボリューム）に対するＰ成分およびＲ成分の濃度を測定する。
１回目に単管カラムを通過した液のＰ成分およびＲ成分のピークトップのＢＶに対し、２回目に単管カラムを通過した液のＰ成分およびＲ成分のピークトップのＢＶの変化量が、通常Ｐ成分が２０％以下かつＲ成分が１０％以下、好ましくはＰ成分が１０％以下かつＲ成分が５％以下、より好ましくはＰ成分が５％以下かつＲ成分が３％以下、さらに好ましくはＰ成分が３％以下かつＲ成分が１％以下であると、不純物は除去されたと判断できる。
プレカラムに充填された分離剤と充填部１１、１２、１３、１４に充填された分離剤とが同じ場合には、前処理を行う条件は、クロマト分離工程の条件と同じであることが好ましい。具体的には、３０重量％～９５重量％のイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）を溶媒としてステビオール配糖体を溶出させた場合には、装置内の温度が１０℃～５０℃であることが好ましく、２０℃～４０℃であることがより好ましく、２５℃～３５℃であることがさらに好ましい。装置内の温度が１０℃以下では、ステビオール配糖体が装置内に析出しやすくなるため、配管詰まりや樹脂固まりが発生しやすくなり、その結果、偏流が生じて液流れが悪化しやすい。この場合、被分離液を装置内に連続的に通液できない問題があり、工業化を実現することが難しい。また、装置内の温度が５０℃以上では、ステビオール配糖体の加熱による変質等の恐れがある。
装置内の温度を一定に維持するためには、保温材で配管やカラムの周囲を覆ってもよく、温度が変動しやすい場所にて熱交換装置を設置してもよい。また、ステビオール配糖体を含む被分離液の溶解を促進するために、超音波をかけてもよい。
単管カラム内の温度が２２℃～３５℃であり、３０重量％～９５重量％のイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）を溶媒として用いた場合には、被分離液中ステビオール配糖体の濃度が５ｇ／Ｌ～１２０ｇ／Ｌであることが好ましく、１０ｇ／Ｌ～１００ｇ／Ｌであることがより好ましい。被分離液の濃度が、１２０ｇ／Ｌを超えると、ステビオール配糖体が装置内に析出しやすくなる。また、被分離液の濃度が、濃度が５ｇ／Ｌ以下であると、分離効率低下の問題が生じる。
また、被分離液に不純物が含まれると、或る充填部１０から抜き出した被分離液と溶離液を他の充填部１０に導入する際に、Ｐ成分、Ｒ成分と他の成分とのピークの位置や高さが充填部１０毎に異なる現象が起こる。そして、複数のピークの位置が重なる場合には、抜出部３０から抜出した成分の純度が低下する。また、ピークの高さが低くなると、抜出部３０から抜出した成分の回収率が低下する。よって、複数種のステビオール配糖体を含む被分離液に含まれる不純物を前処理より確実に除去しないと、安定的に連続式液体クロマトグラフィーを行えない問題が生じる。
前処理部は、例えば、プレカラムであり、分離剤を充填するための空間を内部に有する。そして、色素成分や有機酸等の不純物を含有する被分離液を前処理部に通液させ、不純物を除去してから充填部１１、１２、１３、１４に供給する。そうすると、安定的に連続式液体クロマトグラフィーを行うことができる。不純物除去率や、管理のしやすさを考慮すると、プレカラムに充填された分離剤と充填部１１、１２、１３、１４に充填された分離剤とは同じものであっても良い。不純物除去ができたかどうかの判断基準は、継続的に単管カラム試験を行い、Ｐ成分、Ｒ成分と他の成分とのピークの位置や高さが変化しないことである。
本発明において、不純物が除去されたか否かの判断は、単管カラム試験により行う。単管カラム試験では、一の単管カラムに、前処理後に行う連続式液体クロマトグラフィーと同一の条件で、前処理された被分離液を２回連続して通し、それぞれの通過液の、ＢＶ（ベッドボリューム）に対するＰ成分およびＲ成分の濃度を測定する。
１回目に単管カラムを通過した液のＰ成分およびＲ成分のピークトップのＢＶに対し、２回目に単管カラムを通過した液のＰ成分およびＲ成分のピークトップのＢＶの変化量が、通常Ｐ成分が２０％以下かつＲ成分が１０％以下、好ましくはＰ成分が１０％以下かつＲ成分が５％以下、より好ましくはＰ成分が５％以下かつＲ成分が３％以下、さらに好ましくはＰ成分が３％以下かつＲ成分が１％以下であると、不純物は除去されたと判断できる。
プレカラムに充填された分離剤と充填部１１、１２、１３、１４に充填された分離剤とが同じ場合には、前処理を行う条件は、クロマト分離工程の条件と同じであることが好ましい。具体的には、３０重量％～９５重量％のイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）を溶媒としてステビオール配糖体を溶出させた場合には、装置内の温度が１０℃～５０℃であることが好ましく、２０℃～４０℃であることがより好ましく、２５℃～３５℃であることがさらに好ましい。装置内の温度が１０℃以下では、ステビオール配糖体が装置内に析出しやすくなるため、配管詰まりや樹脂固まりが発生しやすくなり、その結果、偏流が生じて液流れが悪化しやすい。この場合、被分離液を装置内に連続的に通液できない問題があり、工業化を実現することが難しい。また、装置内の温度が５０℃以上では、ステビオール配糖体の加熱による変質等の恐れがある。
装置内の温度を一定に維持するためには、保温材で配管やカラムの周囲を覆ってもよく、温度が変動しやすい場所にて熱交換装置を設置してもよい。また、ステビオール配糖体を含む被分離液の溶解を促進するために、超音波をかけてもよい。
単管カラム内の温度が２２℃～３５℃であり、３０重量％～９５重量％のイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）を溶媒として用いた場合には、被分離液中ステビオール配糖体の濃度が５ｇ／Ｌ～１２０ｇ／Ｌであることが好ましく、１０ｇ／Ｌ～１００ｇ／Ｌであることがより好ましい。被分離液の濃度が、１２０ｇ／Ｌを超えると、ステビオール配糖体が装置内に析出しやすくなる。また、被分離液の濃度が、濃度が５ｇ／Ｌ以下であると、分離効率低下の問題が生じる。
【0070】
またクロマト分離装置１は、溶離液を溶離液槽等から供給する配管ＨＷ、溶離液を配管ＨＷから充填部１１に供給する配管ＨＷ１、溶離液を配管ＨＷから充填部１２に供給する配管ＨＷ２、溶離液を配管ＨＷから充填部１３に供給する配管ＨＷ３、および溶離液を配管ＨＷから充填部１４に供給する配管ＨＷ４を備える。この場合、溶離液開閉弁Ｗ１～Ｗ４は、それぞれ配管ＨＷ１～ＨＷ４に設けられ、充填部１１～１４への溶離液の供給を制御する。
【0071】
さらにクロマト分離装置１は、被分離液を被分離液槽等から供給する配管ＨＦ、被分離液を配管ＨＦから充填部１１に供給する配管ＨＦ１、被分離液を配管ＨＦから充填部１２に供給する配管ＨＦ２、被分離液を配管ＨＦから充填部１３に供給する配管ＨＦ３、および被分離液を配管ＨＦから充填部１４に供給する配管ＨＦ４を備える。この場合、被分離液開閉弁Ｆ１～Ｆ４は、それぞれ配管ＨＦ１～ＨＦ４に設けられ、充填部１１～１４への被分離液の供給を制御する。
【0072】
またさらにクロマト分離装置１は、各充填部１０間を接続する接続路として、充填部１１の抜出部３１と充填部１２の供給部２２とを接続する配管ＨＸ１、充填部１２の抜出部３２と充填部１３の供給部２３とを接続する配管ＨＸ２、充填部１３の抜出部３３と充填部１４の供給部２４とを接続する配管ＨＸ３、充填部１４の抜出部３４と充填部１１の供給部２１とを接続する配管ＨＸ４を備える。この場合、接続路開閉弁Ｘ１～Ｘ４は、それぞれ配管ＨＸ１～ＨＸ４に設けられ、充填部１１～１４の相互間の被分離液の流通を制御する。
なお配管ＨＸ４の接続路開閉弁Ｘ４の箇所には、バイパス路ＨＢが設けられ、バイパス路ＨＢには、ポンプＰＭが設けられる。なおバイパス路ＨＢおよびポンプＰＭは、配管ＨＸ４に設置されているが、配管ＨＸ１～ＨＸ４の何れに設置してもよく、配管ＨＸ１～ＨＸ４の複数位置（例えば、全ての位置）に設置してもよい。
なお配管ＨＸ４の接続路開閉弁Ｘ４の箇所には、バイパス路ＨＢが設けられ、バイパス路ＨＢには、ポンプＰＭが設けられる。なおバイパス路ＨＢおよびポンプＰＭは、配管ＨＸ４に設置されているが、配管ＨＸ１～ＨＸ４の何れに設置してもよく、配管ＨＸ１～ＨＸ４の複数位置（例えば、全ての位置）に設置してもよい。
【0073】
そしてクロマト分離装置１は、Ｒ画分を抜き出す配管ＨＲ、Ｒ画分を充填部１１から配管ＨＲに抜き出す配管ＨＲ１、Ｒ画分を充填部１２から配管ＨＲに抜き出す配管ＨＲ２、Ｒ画分を充填部１３から配管ＨＲに抜き出す配管ＨＲ３、およびＲ画分を充填部１４から配管ＨＲに抜き出す配管ＨＲ４を備える。この場合、Ｒ成分開閉弁Ｒ１～Ｒ４は、それぞれ配管ＨＲ１～ＨＲ４に設けられ、充填部１１～１４からの分離液の抜き出しを制御する。
【0074】
そしてクロマト分離装置１は、Ｐ画分を抜き出す配管ＨＰ、Ｐ画分を充填部１１から配管ＨＰに抜き出す配管ＨＰ１、Ｐ画分を充填部１２から配管ＨＰに抜き出す配管ＨＰ２、Ｐ画分を充填部１３から配管ＨＰに抜き出す配管ＨＰ３、およびＰ画分を充填部１４から配管ＨＰに抜き出す配管ＨＰ４を備える。この場合、Ｐ成分開閉弁Ｐ１～Ｐ４は、それぞれ配管ＨＰ１～ＨＰ４に設けられ、充填部１１～１４からの分離液の抜き出しを制御する。
【0075】
＜クロマト分離装置１の動作の説明＞
以上説明したクロマト分離装置１は、以下のように動作する。
以上説明したクロマト分離装置１は、以下のように動作する。
【0076】
図３は、本実施形態におけるクロマト分離装置１の動作について説明したフローチャートである。
また図４（ａ）～（ｂ）は、充填部１１～１４内のＰ成分およびＲ成分のそれぞれの濃度分布について示した図である。ここで横方向は、充填部１１～１４内の位置を表す。各充填部１１～１４において、図中において、より左方ほど充填部１１～１４内のより上部（より上流側）の位置であり、図中において、より右方ほど充填部１１～１４内のより下部（より下流側）の位置であることを意味する。また縦方向は、各位置におけるＰ成分およびＲ成分の濃度を表す。さらに右矢印は、充填部１１～１４内において、被分離液や溶離液の流れの向きを表し、この場合は、充填部１１～１４内を被分離液や溶離液が下向流で流れることを意味する。さらに右矢印および左矢印が図示されていない場合は、その充填部１１～１４内で、流れが生じていないことを意味する。また下矢印や上矢印は、被分離液や溶離液を供給する箇所、およびＰ成分に富む分離液であるＰ画分やＲ成分に富む分離液であるＲ画分を抜き出す箇所を表す。図中、被分離液を「Ｆ」、溶離液を「Ｗ」、Ｐ成分やＰ画分を「Ｐ」、Ｒ成分やＲ画分を「Ｒ」で表す。
また図４（ａ）～（ｂ）は、充填部１１～１４内のＰ成分およびＲ成分のそれぞれの濃度分布について示した図である。ここで横方向は、充填部１１～１４内の位置を表す。各充填部１１～１４において、図中において、より左方ほど充填部１１～１４内のより上部（より上流側）の位置であり、図中において、より右方ほど充填部１１～１４内のより下部（より下流側）の位置であることを意味する。また縦方向は、各位置におけるＰ成分およびＲ成分の濃度を表す。さらに右矢印は、充填部１１～１４内において、被分離液や溶離液の流れの向きを表し、この場合は、充填部１１～１４内を被分離液や溶離液が下向流で流れることを意味する。さらに右矢印および左矢印が図示されていない場合は、その充填部１１～１４内で、流れが生じていないことを意味する。また下矢印や上矢印は、被分離液や溶離液を供給する箇所、およびＰ成分に富む分離液であるＰ画分やＲ成分に富む分離液であるＲ画分を抜き出す箇所を表す。図中、被分離液を「Ｆ」、溶離液を「Ｗ」、Ｐ成分やＰ画分を「Ｐ」、Ｒ成分やＲ画分を「Ｒ」で表す。
【0077】
なお図４において、充填部１３を吸着帯域（Ｚｏｎｅ１）、充填部１４を精製帯域（Ｚｏｎｅ２）、充填部１１を脱着帯域（Ｚｏｎｅ３）、充填部１２を濃縮帯域（Ｚｏｎｅ４）と言うことがある。そして本実施の形態では、これらの帯域（Ｚｏｎｅ）を１つずつずらしながら分離運転を連続式に行なう。
【0078】
充填部１１～１４に対し、被分離液を分離剤に通液すると、上述したように、Ｒ成分の通過速度の方が、Ｐ成分の通過速度より大きくなる。そのため例えば、図４（ａ）に示すように、通液方向に向かいＲ成分が先に進みやすく、Ｐ成分が後に残りやすい。つまり充填部１１～１４内で、Ｐ成分とＲ成分との分離が生じた状態となる。
【0079】
そして図４（ａ）の状態において、被分離液および溶離液を別々の供給部から下向流で供給する。またこれとともに、Ｐ成分に富む分離液とＲ成分に富む分離液とをそれぞれ別々の抜出部から抜き出す（ステップ１０１：供給抜出工程）。
【0080】
この場合、被分離液開閉弁Ｆ３、溶離液開閉弁Ｗ１、接続路開閉弁Ｘ１、Ｘ２、Ｐ成分開閉弁Ｐ１、Ｒ成分開閉弁Ｒ３を開とし、他の開閉弁は、閉とする。これにより被分離液を、供給部２３から充填部１３に供給するとともに、溶離液を、供給部２１から充填部１１に供給する。またＰ成分に富む分離液であるＰ画分を、抜出部３１から抜き出し、Ｒ成分に富む分離液であるＲ画分を、抜出部３３から抜き出す。
【0081】
即ち、供給抜出工程では、供給部２１から充填部１１に供給する溶離液によってＰ成分を溶離させ、供給した溶離液の一部を、Ｐ成分に富む分離液であるＰ画分を配管ＨＰ１に抜き出す。また抜出部３１から抜き出さなかった溶離液の残部は、配管ＨＸ１から充填部１２に流入する。これにより、溶離液は、下向方向に移動し、充填部１２および充填部１３を流通する。そして充填部１２および充填部１３においてＰ成分とＲ成分との分離が進むとともに、Ｐ成分およびＲ成分の濃度分布についても下流側に移動する。そして、充填部１３に被分離液を供給し、充填部１３の抜出部３３から、Ｒ成分に富む分離液であるＲ画分を配管ＨＲ３に抜き出す。
【0082】
ここで、配管ＨＰ１に抜き出す液量は、供給部２１から供給する液量の一部である。よってこの流量を制御するため、配管ＨＰ１の先にポンプを取付け一定流量で抜き出すか、あるいは積算流量計で抜き出し量を調整する必要がある。
【0083】
なお、供給抜出工程では、供給部２３から被分離液を供給し、抜出部３３からＲ画分を抜き出す操作、供給部２１から溶離液を供給し、抜出部３１からＰ画分を抜き出す操作、および供給部２１から溶離液を供給し、抜出部３３からＲ画分を抜き出す操作をそれぞれ分割して実施してもよい。
【0084】
そしてステップ１０１の終了時点で、Ｐ成分およびＲ成分の濃度分布は、図４（ｂ）に示すようなものになる。
そして図４（ｂ）の状態において、充填部１０内の被分離液および溶離液を、下向流にて充填部１０間で循環させ、複数の成分の分離を進める（ステップ１０２：循環工程）。なおこのとき被分離液および溶離液の供給は行なわない。
そして図４（ｂ）の状態において、充填部１０内の被分離液および溶離液を、下向流にて充填部１０間で循環させ、複数の成分の分離を進める（ステップ１０２：循環工程）。なおこのとき被分離液および溶離液の供給は行なわない。
【0085】
この場合、接続路開閉弁Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３を開とし、他の開閉弁は、閉とする。そしてポンプＰＭを動作させることにより、充填部１０内の被分離液および溶離液を、下向流にて充填部１０間で循環させる。つまりこの場合、接続路開閉弁Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３を開けることで、配管ＨＸ１、ＨＸ２、ＨＸ３、ＨＸ４、バイパス路ＨＢにより、全ての充填部１０が連結された状態となり、循環路が形成される。そしてポンプＰＭを動作させ、この循環路内を、被分離液や溶離液を移動させる。ここでは、充填部１０内の被分離液および溶離液を、充填部１０の１個分、下向方向に移動する。またこの際に、Ｐ成分とＲ成分との分離が進む。その結果、図４（ａ）の状態から、充填部１０について、図中右側に１個分ずれた形の濃度分布となる。つまり図中右側に充填部１０について、１個分ずれた形で濃度分布が再現される。これにより、再びステップ１０１に戻り、同じ分離処理を繰り返すことができ、クロマト分離を連続して行なうことができる。
【0086】
そして、次にクロマト分離を終了させるか否かを決定する（ステップ１０３）。クロマト分離を終了させる場合としては、例えば、予め定められた量の被処理水を処理した場合である。また、圧力損失が予め定められた大きさを超えた場合に終了としてもよく、予め定められた分離運転時間が経過したときに終了としてもよい。
【0087】
そしてクロマト分離を終了させる場合（ステップ１０３でＹｅｓ）、分離運転を停止する（ステップ１０４）。
対して、クロマト分離を終了させない場合（ステップ１０３でＮｏ）、ステップ１０１に戻る。つまり上記ステップ１０１～ステップ１０２の２工程を繰り返す。
対して、クロマト分離を終了させない場合（ステップ１０３でＮｏ）、ステップ１０１に戻る。つまり上記ステップ１０１～ステップ１０２の２工程を繰り返す。
【0088】
図５（ａ）～（ｈ）は、図３のステップ１０１～ステップ１０２の２工程（供給抜出工程、循環工程）を４回（１サイクル目～４サイクル目）繰り返した場合の充填部１１～１４内の被分離液や溶離液の流れの向きを示した図である。ここで、図５（ａ）～（ｂ）は、１サイクル目であり、図５（ｃ）～（ｄ）は、２サイクル目である。また図５（ｅ）～（ｆ）は、３サイクル目であり、図５（ｇ）～（ｈ）は、４サイクル目である。また図５では、図３の場合と同様に、右矢印は、下向流であることを意味する。さらに右矢印が図示されていない場合は、その充填部１１～１４内で、流れが生じていないことを意味する。そして、下矢印や上矢印は、被分離液や溶離液を供給する箇所、およびＰ画分やＲ画分を抜き出す箇所を表す。この場合、被分離液を「Ｆ」、溶離液を「Ｗ」、Ｐ成分やＰ画分を「Ｐ」、Ｒ成分やＲ画分を「Ｒ」で表す。
【0089】
また以下の表１は、切換部４０の各開閉弁について開にするものを示している。なおここで示した開閉弁以外の開閉弁は閉とする。
【0090】
【表1】
【0091】
図５（ａ）～（ｂ）、図５（ｃ）～（ｄ）、図５（ｅ）～（ｆ）、図５（ｇ）～（ｈ）をそれぞれ比較すると、流れの方向の位置、被分離液や溶離液を供給する箇所、およびＰ画分やＲ画分を抜き出す箇所は、それぞれ充填部１０について、図中右側（下流側）に１個分ずつずれていく。また表１を参照すると、開にする開閉弁の位置も、同様に、それぞれ填部１０について、図中右側（下流側）に１個分ずつずれていく。なお１サイクルを４回行なうと、再び、元の状態に戻る。つまり図５（ｈ）の後は、図５（ａ）に戻る。
【0092】
ただし本実施の形態で使用されるステビオール配糖体の分離装置は、擬似移動床式のクロマト分離装置に限られるものではなく、連続式液体クロマトグラフィーを行なう装置であればよい。ここで連続式液体クロマトグラフィーとは、バッチ式のように、被分離液を供給して分離された成分を取り出し、さらにこれを繰り返す処理ではなく、被分離液を連続的に供給しつつ分離された成分を連続的に取り出す処理を言う。
【0093】
図６は、連続式液体クロマトグラフィーを行なう装置の他の例として、リサイクル式のクロマト分離装置を示した図である。
図示するリサイクル式のクロマト分離装置１００は、被分離液が貯留される被分離液槽１１０と、溶離液が貯留される溶離液槽１２０と、被分離液に含まれる成分の分離を行なうカラム１３０と、成分分離後の精製液を貯留する精製液槽１４０と、成分分離後の廃液を貯留する廃液槽１５０とを備える。またクロマト分離装置１００は、他にポンプＰ１と、開閉弁Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５とを備える。
このクロマト分離装置１００では、被分離液は、被分離液槽１１０から、開閉弁Ｂ１を開とし、開閉弁Ｂ２を閉とすることで、ポンプＰ１を使用し、配管Ｈ１および配管Ｈ３を介してカラム１３０に移送される。そして溶離液は、溶離液が貯留される溶離液槽１２０から開閉弁Ｂ１を閉とし、開閉弁Ｂ２を開とすることで、配管Ｈ２および配管Ｈ３を介してカラム１３０に移送される。そしてカラム１３０を通液し、カラム１３０から排出された精製液は、開閉弁Ｂ３を開とし、開閉弁Ｂ４および開閉弁Ｂ５を閉とすることで、配管Ｈ５を介し、精製液槽１４０に送ることができる。そしてカラム１３０を通液し、カラム１３０から排出された廃液は、開閉弁Ｂ３および開閉弁Ｂ４を閉とし、開閉弁Ｂ５を開とすることで、配管Ｈ６を介し、廃液槽１５０に送ることができる。
一方、カラム１３０を通過後の精製液は、開閉弁Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３および開閉弁Ｂ５を閉とし、開閉弁Ｂ４を開とすることで、循環配管Ｈ４を介して、再び配管Ｈ３に戻すことができる。つまり循環配管Ｈ４を使用することで、カラム１３０を複数回通過させることができる。
図示するリサイクル式のクロマト分離装置１００は、被分離液が貯留される被分離液槽１１０と、溶離液が貯留される溶離液槽１２０と、被分離液に含まれる成分の分離を行なうカラム１３０と、成分分離後の精製液を貯留する精製液槽１４０と、成分分離後の廃液を貯留する廃液槽１５０とを備える。またクロマト分離装置１００は、他にポンプＰ１と、開閉弁Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５とを備える。
このクロマト分離装置１００では、被分離液は、被分離液槽１１０から、開閉弁Ｂ１を開とし、開閉弁Ｂ２を閉とすることで、ポンプＰ１を使用し、配管Ｈ１および配管Ｈ３を介してカラム１３０に移送される。そして溶離液は、溶離液が貯留される溶離液槽１２０から開閉弁Ｂ１を閉とし、開閉弁Ｂ２を開とすることで、配管Ｈ２および配管Ｈ３を介してカラム１３０に移送される。そしてカラム１３０を通液し、カラム１３０から排出された精製液は、開閉弁Ｂ３を開とし、開閉弁Ｂ４および開閉弁Ｂ５を閉とすることで、配管Ｈ５を介し、精製液槽１４０に送ることができる。そしてカラム１３０を通液し、カラム１３０から排出された廃液は、開閉弁Ｂ３および開閉弁Ｂ４を閉とし、開閉弁Ｂ５を開とすることで、配管Ｈ６を介し、廃液槽１５０に送ることができる。
一方、カラム１３０を通過後の精製液は、開閉弁Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３および開閉弁Ｂ５を閉とし、開閉弁Ｂ４を開とすることで、循環配管Ｈ４を介して、再び配管Ｈ３に戻すことができる。つまり循環配管Ｈ４を使用することで、カラム１３０を複数回通過させることができる。
【0094】
図７は、図６に示したクロマト分離装置１００を使用し、被分離液をカラム１３０に５回ないし６回通過させたときのクロマトグラムを示した図である。図７において、横軸は、時間（分）を表し、縦軸は、分離液中に含まれる成分の濃度を表す。
この場合、１４２分～１９０分の間にカラム１３０から排出後の精製液は、循環配管Ｈ４を使用して再びカラム１３０に戻される。そして１９０分～３１０分の間にカラム１３０から排出後の精製液は、廃液槽１５０に送られる。さらに３１０分～３８０分の間にカラム１３０から排出後の精製液は、精製液槽１４０に送られる。またさらに３８０分～４８０分の間にカラム１３０から排出後の精製液は、廃液槽１５０に送られる。つまりこの一連の被分離液をカラム１３０に２回通過させる工程を１サイクルとした処理を、計３回行ない、Ｐ成分およびＲ成分の分離を行なう。これにより２倍の長さのカラム１３０を３回使用したのとほぼ同様の分離を行なうことができる。
この場合、１４２分～１９０分の間にカラム１３０から排出後の精製液は、循環配管Ｈ４を使用して再びカラム１３０に戻される。そして１９０分～３１０分の間にカラム１３０から排出後の精製液は、廃液槽１５０に送られる。さらに３１０分～３８０分の間にカラム１３０から排出後の精製液は、精製液槽１４０に送られる。またさらに３８０分～４８０分の間にカラム１３０から排出後の精製液は、廃液槽１５０に送られる。つまりこの一連の被分離液をカラム１３０に２回通過させる工程を１サイクルとした処理を、計３回行ない、Ｐ成分およびＲ成分の分離を行なう。これにより２倍の長さのカラム１３０を３回使用したのとほぼ同様の分離を行なうことができる。
【0095】
このときクロマトグラムにおいて、Ｌ１で示した箇所のＰ成分は、ロスとなる。対して、上述した擬似移動床式のクロマト分離装置１では、このようなロスが生じにくく、回収効率がより優れている。
【0096】
また連続式液体クロマトグラフィーを行なう装置としては、他にも環状式のクロマト分離装置（環状クロマト分離装置、環状クロマトグラフィー装置）が挙げられる。
【0097】
環状式のクロマト分離装置では、溶離剤の流れ方向と十字流となるように、充填剤を移動させることによって、被分離液供給を連続的に供給し、複数の多成分の連続分離を行なう十字流方式である。この方式は、充填剤を環状に充填した環状充填部の上部から下部に流れる溶離剤と被分離液の流れとが、相対的に十字流となるように、環状充填部を回転移動させる。環状式のクロマト分離装置は、例えば、周方向に回転する二重円筒体の内筒と外筒との間の間隙に充填剤を充填して環状充填部を形成し、この環状充填部に上部より被分離液および溶離剤を連続的に供給し、下部より分離された成分を連続的に取り出すものである。
【0098】
なお上述した形態において、開閉弁である切換部４０の開閉の制御は、手動で行ってもよく、自動で行ってもよい。また手動で行なう場合と自動で行なう場合とを併用してもよい。自動で行なう場合は、例えば、制御盤等の制御部を設け、制御部が、ソフトウェアとハードウェア資源とを協働させ切換部４０の制御を行なう。即ち、制御部に設けられた制御用ＰＬＣ（Programmable Logic Controller）が、切換部４０の開閉の制御を実現するプログラムを読み込み、このプログラムを実行することで、切換部４０の開閉の制御を行なう。
【0099】
以上詳述した擬似移動床式のクロマト分離装置１によれば、複数種のステビオール配糖体を含む被分離液から、少なくとも１種のステビオール配糖体を分離する際に、純度を向上させることができる。例えば、レバウディオサイドＡとステビオサイドとを分離する場合は、純度として９５％以上を実現できる。この９５％以上という純度は、アメリカ食品医薬品局（ＦＤＡ）より食品添加物に与えられる安全基準合格証であるＧＲＡＳ（Generally Recognized As Safe）を満たす。
一方、以上詳述した擬似移動床式のクロマト分離装置１を使用した場合、回収効率としても優れ、被分離液に含まれるレバウディオサイドＡのうち、例えば、９８％以上を回収することができ、ロスが少ない。即ち、高純度化と回収効率の両立を図ることができる。
一方、以上詳述した擬似移動床式のクロマト分離装置１を使用した場合、回収効率としても優れ、被分離液に含まれるレバウディオサイドＡのうち、例えば、９８％以上を回収することができ、ロスが少ない。即ち、高純度化と回収効率の両立を図ることができる。
【0100】
また上述したクロマト分離装置１では、被分離液に対し脱色を行なうこともできる。つまり上述した形態では、分離工程５５でクロマト分離装置１を使用したが、脱色工程５９で使用することもできる。よって分離工程５５および脱色工程５９の少なくとも一方で、クロマト分離装置１を使用することができる。
【0101】
なお以上説明したクロマト分離装置１で行なう被分離液の処理は、以下の（ｉ）、（ｉｉ）の工程を含むレバウディオサイドＡの製造方法であると捉えることもできる。この（ｉ）の工程は、上述した熱水抽出工程５１、薬剤処理工程５２、ろ過工程５３、吸着工程５４に対応する。また（ｉｉ）の工程は、上述した分離工程５５に対応する。
【0102】
（ｉ）レバウディオサイドＡを含む複数種のステビオール配糖体を含む被分離液を準備する準備工程
（ｉｉ）被分離液を、ポリエチレンイミンを担体に担持した分離剤に通液することで、レバウディオサイドＡを連続して分離する連続式液体クロマトグラフィーを行なう分離工程
（ｉｉ）被分離液を、ポリエチレンイミンを担体に担持した分離剤に通液することで、レバウディオサイドＡを連続して分離する連続式液体クロマトグラフィーを行なう分離工程
【実施例】
【0103】
以下、本発明を実施例を用いてより詳細に説明するが、本発明は、その要旨を越えない限りこれらの実施例により限定されるものではない。
【0104】
[単管カラム試験]
ここでは、レバウディオサイドＡを含む複数種のステビオール配糖体を含む被分離液の分離性能を確認するため、上述した本実施の形態の分離剤と、従来の分離剤とをそれぞれ単カラムに充填し、単管カラム試験を行なった。なおこの場合、分離モードは、ＨＩＬＩＣ（Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography：親水性相互作用クロマトグラフィー)モードである。この分離モードでは、レバウディオサイドＡとステビオサイドとは、溶媒として水が多いと早く溶出するが、アルコールが多いと溶出が遅くなる。ここでは、下記に記載するように、アルコールを多くし、レバウディオサイドＡおよびステビオサイドを遅く溶出させ、その間に分離を行なうことを行なっている。
ここでは、レバウディオサイドＡを含む複数種のステビオール配糖体を含む被分離液の分離性能を確認するため、上述した本実施の形態の分離剤と、従来の分離剤とをそれぞれ単カラムに充填し、単管カラム試験を行なった。なおこの場合、分離モードは、ＨＩＬＩＣ（Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography：親水性相互作用クロマトグラフィー)モードである。この分離モードでは、レバウディオサイドＡとステビオサイドとは、溶媒として水が多いと早く溶出するが、アルコールが多いと溶出が遅くなる。ここでは、下記に記載するように、アルコールを多くし、レバウディオサイドＡおよびステビオサイドを遅く溶出させ、その間に分離を行なうことを行なっている。
【0105】
（実施例Ａ１）
実施例Ａ１では、以下のようにして製造した分離剤を用いた。
つまり、グリシジルメタクリレート７０重量部、エチレングリコールジメタクリレート３０重量部から成り、比表面積３７ｍ２／ｇ、細孔直径９４２Å，細孔容積０．９９ｍＬ／ｇである（メタ）アクリル系多孔性粒子４００重量部に、ジエチレングリコールジメチルエーテル１４００重量部、ポリエチレンイミン（和光純薬社製、試薬、分子量６００）６００重量部を加え、撹拌して懸濁状態とした。この懸濁液を８０℃に昇温し、６時間反応させた。冷却後、ポリエチレンイミンが固定化された多孔性粒子を水洗した。
実施例Ａ１では、以下のようにして製造した分離剤を用いた。
つまり、グリシジルメタクリレート７０重量部、エチレングリコールジメタクリレート３０重量部から成り、比表面積３７ｍ２／ｇ、細孔直径９４２Å，細孔容積０．９９ｍＬ／ｇである（メタ）アクリル系多孔性粒子４００重量部に、ジエチレングリコールジメチルエーテル１４００重量部、ポリエチレンイミン（和光純薬社製、試薬、分子量６００）６００重量部を加え、撹拌して懸濁状態とした。この懸濁液を８０℃に昇温し、６時間反応させた。冷却後、ポリエチレンイミンが固定化された多孔性粒子を水洗した。
【0106】
水洗後のポリエチレンイミンが固定化された多孔性粒子に１０重量％硫酸水溶液２０００重量部を添加し、撹拌して懸濁状態とした。この懸濁液を５０℃に昇温し、５時間保持することにより未反応のエポキシ基への水付加によるジオール生成反応を実施した。
冷却後、多孔性粒子を水洗し、さらに２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液によりイオン交換基の再生を行って分離剤を得た。
得られた分離剤の平均粒径は１４０μｍ、総交換容量２．９９ミリ等量／ｇ、比表面積３１ｍ２／ｇ、細孔直径９４４Å，細孔容積０．８５ｍＬ／ｇであった。
冷却後、多孔性粒子を水洗し、さらに２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液によりイオン交換基の再生を行って分離剤を得た。
得られた分離剤の平均粒径は１４０μｍ、総交換容量２．９９ミリ等量／ｇ、比表面積３１ｍ２／ｇ、細孔直径９４４Å，細孔容積０．８５ｍＬ／ｇであった。
【0107】
この分離剤を直径２０ｍｍφ、長さ２５０ｍｍのカラムを４個直列に繋げたカラム（合計長さ１０００ｍｍ）に充填した。このとき充填した分離剤は、３１４ｍｌとなるようにした。よってこの場合、分離剤の量である１ＢＶ（ベッドボリューム）は、３１４ｍｌとなる。そしてサンプルとして、守田化学工業株式会社製のレバウディオＪＭ－１００を用意し、これを９０％エタノール水溶液とした。レバウディオＪＭ－１００には、ステビオール配糖体として、レバウディオサイドＡおよびステビオサイドが主成分として含まれる。またレバウディオＪＭ－１００には、他の種類のステビオール配糖体や不純物が含まれる。そしてこの９０％エタノール水溶液を、分離剤を充填したカラムに通液して、単管カラム試験を行なった。このとき流速は、５．２ｍｌ／分とした。この場合、空間速度ＳＶ（Space Velocity）は、１ｈ－１となる。また９０％エタノール水溶液は、カラムに室温２８℃にて５０ｇ／Ｌで計１５．７ｍｌ注入し、ＵＶ検出器波長２１０ｎｍにてクロマトグラムを測定した。
【0108】
（実施例Ａ２）
実施例Ａ２では、実施例Ａ１と同様の分離剤を用いた。
実施例Ａ２では、実施例Ａ１に比較して、溶離液を８９％イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）水溶液に変更した。またサンプルのレバウディオＪＭ－１００を、カラムに室温２４℃にて１０ｇ／Ｌで計１５．６ｍｌ注入した。そして他は、実施例Ａ１と同様にしてクロマトグラムを測定した。
実施例Ａ２では、実施例Ａ１と同様の分離剤を用いた。
実施例Ａ２では、実施例Ａ１に比較して、溶離液を８９％イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）水溶液に変更した。またサンプルのレバウディオＪＭ－１００を、カラムに室温２４℃にて１０ｇ／Ｌで計１５．６ｍｌ注入した。そして他は、実施例Ａ１と同様にしてクロマトグラムを測定した。
【0109】
（実施例Ａ３）
実施例Ａ３では、実施例Ａ１と同様の分離剤を用いた。
実施例Ａ３では、実施例Ａ２に比較して、サンプルのレバウディオＪＭ－１００を、カラムに室温２６℃にて１００ｇ／Ｌで計１５．６ｍｌ注入した。そして他は、実施例Ａ２と同様にしてクロマトグラムを測定した。
実施例Ａ３では、実施例Ａ１と同様の分離剤を用いた。
実施例Ａ３では、実施例Ａ２に比較して、サンプルのレバウディオＪＭ－１００を、カラムに室温２６℃にて１００ｇ／Ｌで計１５．６ｍｌ注入した。そして他は、実施例Ａ２と同様にしてクロマトグラムを測定した。
【0110】
（比較例Ａ１）
比較例Ａ１では、分離剤として、三菱ケミカル株式会社製の工業クロマト分離用カチオン交換樹脂である、ＵＢＫ５３０（Ｈ型）を用いた。
これを直径２０ｍｍφ、長さ１０００ｍｍの単管カラムに充填した。このとき充填したＵＢＫ５３０は、３１４ｍｌとなるようにした。よってこの場合、１ＢＶ（ベッドボリューム）は、３１４ｍｌとなる。そしてサンプルであるレバウディオＪＭ－１００を８９％イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）水溶液とした。そしてこの８９％イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）水溶液を、分離剤を充填したカラムに通液して、単管カラム試験を行なった。このとき流速は、５．２ｍｌ／分とした。この場合、空間速度（ＳＶ）は、１ｈ－１となる。また８９％イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）水溶液は、カラムに室温２５℃にて１０ｇ／Ｌで計１５．７ｍｌ注入し、ＵＶ検出器波長２１０ｎｍにてクロマトグラムを測定した。
比較例Ａ１では、分離剤として、三菱ケミカル株式会社製の工業クロマト分離用カチオン交換樹脂である、ＵＢＫ５３０（Ｈ型）を用いた。
これを直径２０ｍｍφ、長さ１０００ｍｍの単管カラムに充填した。このとき充填したＵＢＫ５３０は、３１４ｍｌとなるようにした。よってこの場合、１ＢＶ（ベッドボリューム）は、３１４ｍｌとなる。そしてサンプルであるレバウディオＪＭ－１００を８９％イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）水溶液とした。そしてこの８９％イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）水溶液を、分離剤を充填したカラムに通液して、単管カラム試験を行なった。このとき流速は、５．２ｍｌ／分とした。この場合、空間速度（ＳＶ）は、１ｈ－１となる。また８９％イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）水溶液は、カラムに室温２５℃にて１０ｇ／Ｌで計１５．７ｍｌ注入し、ＵＶ検出器波長２１０ｎｍにてクロマトグラムを測定した。
【0111】
（比較例Ａ２）
比較例Ａ２では、比較例Ａ１に比較して、分離剤を、スチレン系ジメチルアミン型の弱塩基性アニオン交換樹脂である、三菱ケミカル株式会社製のセパビーズＦＰ－ＤＡ１３（ＯＨ型）に変更したこと以外は、比較例Ａ１と同様にしてクロマトグラムを測定した。
比較例Ａ２では、比較例Ａ１に比較して、分離剤を、スチレン系ジメチルアミン型の弱塩基性アニオン交換樹脂である、三菱ケミカル株式会社製のセパビーズＦＰ－ＤＡ１３（ＯＨ型）に変更したこと以外は、比較例Ａ１と同様にしてクロマトグラムを測定した。
【0112】
（比較例Ａ３）
比較例Ａ３では、比較例Ａ１に比較して、分離剤を、スチレン系ポリアミン型の弱塩基性アニオン交換樹脂である、三菱ケミカル株式会社製のダイヤイオンＷＡ２０（ＯＨ型）に変更したこと以外は、比較例Ａ１と同様にしてクロマトグラムを測定した。
比較例Ａ３では、比較例Ａ１に比較して、分離剤を、スチレン系ポリアミン型の弱塩基性アニオン交換樹脂である、三菱ケミカル株式会社製のダイヤイオンＷＡ２０（ＯＨ型）に変更したこと以外は、比較例Ａ１と同様にしてクロマトグラムを測定した。
【0113】
（比較例Ａ４）
比較例Ａ４では、比較例Ａ１に比較して、分離剤を、スチレン系ジメチルアミン型の弱塩基性アニオン交換樹脂である、三菱ケミカル株式会社製のダイヤイオンＷＡ３３Ｌ（ＯＨ型）に変更したこと以外は、比較例Ａ１と同様にしてクロマトグラムを測定した。
比較例Ａ４では、比較例Ａ１に比較して、分離剤を、スチレン系ジメチルアミン型の弱塩基性アニオン交換樹脂である、三菱ケミカル株式会社製のダイヤイオンＷＡ３３Ｌ（ＯＨ型）に変更したこと以外は、比較例Ａ１と同様にしてクロマトグラムを測定した。
【0114】
[擬似移動床式のクロマト分離装置を使用した分離試験]
（実施例Ｂ１）
実施例Ｂ１では、図２で示した擬似移動床式のクロマト分離装置１を使用し、ステビオール配糖体の分離試験を行なった。このとき実施例Ａ１と同様の分離剤を用いた。
被分離液として、原料濃度が１０ｍｇ／ｍｇの水溶液を用意した。原料には、レバウディオサイドＡとステビオサイドが主成分として含まれ、その質量比は、５１：４４であった。また原料には、他の種類のステビオール配糖体や不純物が含まれる。また溶離液として８９％イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）水溶液を用いた。また装置の運転時の空間速度ＳＶは、１ｈ－１とした。また１時間あたりの分離剤に対する被分離液の注入量であるＬｏａｄ（負荷量）は、０．０５８ｈ－１とした。
（実施例Ｂ１）
実施例Ｂ１では、図２で示した擬似移動床式のクロマト分離装置１を使用し、ステビオール配糖体の分離試験を行なった。このとき実施例Ａ１と同様の分離剤を用いた。
被分離液として、原料濃度が１０ｍｇ／ｍｇの水溶液を用意した。原料には、レバウディオサイドＡとステビオサイドが主成分として含まれ、その質量比は、５１：４４であった。また原料には、他の種類のステビオール配糖体や不純物が含まれる。また溶離液として８９％イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）水溶液を用いた。また装置の運転時の空間速度ＳＶは、１ｈ－１とした。また１時間あたりの分離剤に対する被分離液の注入量であるＬｏａｄ（負荷量）は、０．０５８ｈ－１とした。
【0115】
（比較例Ｂ１）
比較例Ｂ１では、実施例Ｂ１と同様の分離剤を使用した。そしてこの分離剤を、直径２０ｍｍφ、長さ１０００ｍｍの単管カラムに充填した。このとき充填した分離剤は、３１４ｍｌとなるようにした。これに実施例Ｂ１と同様の被分離液と溶離液とを交互に単管カラムに通液し、ステビオール配糖体の分離試験を行なった。 このとき流速は、５．２ｍｌ／分とした。このとき空間速度ＳＶは、１ｈ－１とした。またＬｏａｄ（負荷量）は、０．０３８ｈ－１とした。なお以下、この方法で成分の分離を行なう方法を「単管カラム連続処理」と言うことがある。
比較例Ｂ１では、実施例Ｂ１と同様の分離剤を使用した。そしてこの分離剤を、直径２０ｍｍφ、長さ１０００ｍｍの単管カラムに充填した。このとき充填した分離剤は、３１４ｍｌとなるようにした。これに実施例Ｂ１と同様の被分離液と溶離液とを交互に単管カラムに通液し、ステビオール配糖体の分離試験を行なった。 このとき流速は、５．２ｍｌ／分とした。このとき空間速度ＳＶは、１ｈ－１とした。またＬｏａｄ（負荷量）は、０．０３８ｈ－１とした。なお以下、この方法で成分の分離を行なう方法を「単管カラム連続処理」と言うことがある。
【0116】
[結果]
実施例Ａ１～Ａ３、比較例Ａ１～Ａ３の結果について、それぞれ図８～図１３に示す。
図８～図１３は、実施例Ａ１～Ａ３、比較例Ａ１～Ａ３のクロマトグラムを示した図である。ここで、横軸は、ＢＶ（ベッドボリューム）を表し、縦軸は、分離液中に含まれる成分の濃度を表す。
実施例Ａ１～Ａ３の結果である図８～図１０と、比較例Ａ１～Ａ３の結果である図１１～図１３とを比較すると、実施例Ａ１～Ａ３では、レバウディオサイドＡとステビオサイドとが分離しているのに対し、比較例Ａ１～Ａ３では、これらは、イオン交換樹脂に吸着せずに同時に溶出し、分離できないことがわかる。なお比較例Ａ３では、溶出したレバウディオサイドＡおよびステビオサイドのピークが低く、濃度が他よりも低い。確認を行なったところ全体の６割程度しか分離液に溶出しておらず、残りの４割は、イオン交換樹脂に吸着したままであった。なお比較例Ａ４では、レバウディオサイドＡおよびステビオサイドの双方がイオン交換樹脂に吸着したままであり溶出しなかった。
実施例Ａ１～Ａ３、比較例Ａ１～Ａ３の結果について、それぞれ図８～図１３に示す。
図８～図１３は、実施例Ａ１～Ａ３、比較例Ａ１～Ａ３のクロマトグラムを示した図である。ここで、横軸は、ＢＶ（ベッドボリューム）を表し、縦軸は、分離液中に含まれる成分の濃度を表す。
実施例Ａ１～Ａ３の結果である図８～図１０と、比較例Ａ１～Ａ３の結果である図１１～図１３とを比較すると、実施例Ａ１～Ａ３では、レバウディオサイドＡとステビオサイドとが分離しているのに対し、比較例Ａ１～Ａ３では、これらは、イオン交換樹脂に吸着せずに同時に溶出し、分離できないことがわかる。なお比較例Ａ３では、溶出したレバウディオサイドＡおよびステビオサイドのピークが低く、濃度が他よりも低い。確認を行なったところ全体の６割程度しか分離液に溶出しておらず、残りの４割は、イオン交換樹脂に吸着したままであった。なお比較例Ａ４では、レバウディオサイドＡおよびステビオサイドの双方がイオン交換樹脂に吸着したままであり溶出しなかった。
【0117】
図１４は、比較例Ｂ１のクロマトグラムを示した図である。ここで、横軸は、ＢＶ（ベッドボリューム）を表し、縦軸は、分離液中に含まれる成分の濃度を表す。
図示するように、レバウディオサイドＡとステビオサイドとが交互に排出され、レバウディオサイドＡとステビオサイドとを別々に回収できる。
図示するように、レバウディオサイドＡとステビオサイドとが交互に排出され、レバウディオサイドＡとステビオサイドとを別々に回収できる。
【0118】
また実施例Ｂ１および比較例Ｂ１の結果を以下の表２に示す。
【0119】
【表2】
【0120】
実施例Ｂ１の擬似移動床式のクロマト分離装置１を使用した場合は、レバウディオサイドＡの純度が９５．８７％となった。さらにレバウディオサイドＡの回収率は、９８．２％となった。対して比較例Ｂ２の連続パルス式を使用した場合は、レバウディオサイドＡの純度が９５．３２％となったものの回収率は、８１．７％に過ぎなかった。
つまり実施例Ｂ１と比較例Ｂ１とを比較すると、レバウディオサイドＡの純度を同程度とする場合、回収率は、実施例Ｂ１の方が比較例Ｂ１よりも優れる結果となった。
つまり実施例Ｂ１と比較例Ｂ１とを比較すると、レバウディオサイドＡの純度を同程度とする場合、回収率は、実施例Ｂ１の方が比較例Ｂ１よりも優れる結果となった。
【0121】
これらの装置を１年に１８０日稼働させ、１０．００ｔのレバウディオサイドＡを生産したときに、使用する分離剤の量、および分離工程５５（図１参照）で使用するアルコール溶媒使用量を算出した。これによると、実施例Ｂ１の場合には、使用する分離剤の量が、１０ｍ３であるのに対し、比較例Ｂ１の場合には、１４ｍ３が必要となることがわかった。また溶媒使用量は、実施例Ｂ１の場合には、１００ｍ３／ｄであるのに対し、比較例Ｂ１の場合には、３２３ｍ３／ｄが必要となり、アルコール溶媒使用比として、約３．２倍必要なことがわかった。
つまり実施例Ｂ１と比較例Ｂ１とを比較すると、実施例Ｂ１の方が比較例Ｂ１に比べて、使用する分離剤の量や溶媒使用量が削減できる。よってレバウディオサイドＡを生産するのに要する費用について、実施例Ｂ１の方が比較例Ｂ１よりも低廉になる。
つまり実施例Ｂ１と比較例Ｂ１とを比較すると、実施例Ｂ１の方が比較例Ｂ１に比べて、使用する分離剤の量や溶媒使用量が削減できる。よってレバウディオサイドＡを生産するのに要する費用について、実施例Ｂ１の方が比較例Ｂ１よりも低廉になる。
【符号の説明】
【0122】
１、１００…クロマト分離装置、１０（１１、１２、１３、１４）…充填部、２０（２１、２２、２３、２４）…供給部、３０（３１、３２、３３、３４）…抜出部、４０…切換部、５４…吸着工程、５５…分離工程、５９…脱色工程
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】