特許 7446875 Ｌ－カルニチン測定方法及びＬ－カルニチン測定キット

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-03-01

(45)【発行日】2024-03-11

(54)【発明の名称】Ｌ－カルニチン測定方法及びＬ－カルニチン測定キット

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/32 20060101AFI20240304BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/32 ZNA

【請求項の数】 7

(21)【出願番号】P 2020044993

(22)【出願日】2020-03-16

(65)【公開番号】P2021145552

(43)【公開日】2021-09-27

【審査請求日】2022-08-22

(73)【特許権者】

【識別番号】000103840

【氏名又は名称】オリエンタル酵母工業株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110002572

【氏名又は名称】弁理士法人平木国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】松川 寛和

(72)【発明者】

【氏名】大場 貴史

(72)【発明者】

【氏名】宮地 真由

(72)【発明者】

【氏名】砂原 美子

【審査官】小倉 梢

(56)【参考文献】

【文献】特開平０３－０６１４９９（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開平０３－２５１１９６（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｑ １／００ － １／７０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

β－チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化型（Ｔｈｉｏ－ＮＡＤ^＋）及びβ－ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）の存在下、又は、
β－チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（Ｔｈｉｏ－ＮＡＤＨ）及びβ－ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化型（ＮＡＤ^＋）の存在下で、
測定対象から取り出した試料中のＬ－カルニチンを、カルニチンデヒドロゲナーゼ（ＣＤＨ）と反応させる反応工程を含み、
前記ＣＤＨが、（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるＣＤＨ、又は（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつＴｈｉｏ－ＮＡＤ^＋の存在下でＬ－カルニチンからデヒドロカルニチンへの反応を触媒する活性及びＴｈｉｏ－ＮＡＤＨの存在下でデヒドロカルニチンからＬ－カルニチンへの反応を触媒する活性を有するＣＤＨであり、
前記反応工程の反応系にトレハロースを共存させる、Ｌ－カルニチン測定方法。

【請求項2】

前記反応工程が、Ｔｈｉｏ－ＮＡＤ^＋及びＮＡＤＨの存在下で実施される、請求項１に記載のＬ－カルニチン測定方法。

【請求項3】

前記トレハロースの反応時終濃度が５～５０重量％である、請求項１又は２に記載のＬ－カルニチン測定方法。

【請求項4】

Ｔｈｉｏ－ＮＡＤ^＋又はＮＡＤ^＋を含有する水溶液からなる第１反応試液と、
ＮＡＤＨ又はＴｈｉｏ－ＮＡＤＨを含有する水溶液からなる第２反応試液と、を備え、
前記第１反応試液がＴｈｉｏ－ＮＡＤ^＋を含有する場合は、前記第２反応試液はＮＡＤＨを含有し、前記第１反応試液がＮＡＤ^＋を含有する場合は、前記第２反応試液はＴｈｉｏ－ＮＡＤＨを含有し、
前記第１反応試液と第２反応試液の少なくとも１つがＣＤＨを含有し、ここで、前記ＣＤＨが、（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるＣＤＨ、又は（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつＴｈｉｏ－ＮＡＤ^＋の存在下でＬ－カルニチンからデヒドロカルニチンへの反応を触媒する活性及びＴｈｉｏ－ＮＡＤＨの存在下でデヒドロカルニチンからＬ－カルニチンへの反応を触媒する活性を有するＣＤＨであり、
前記第１反応試液と第２反応試液の少なくとも１つがトレハロースを含有する、
Ｌ－カルニチン測定キット。

【請求項5】

前記第１反応試液がＴｈｉｏ－ＮＡＤ^＋を含有する水溶液からなり、前記第２反応試液がＮＡＤＨを含有する水溶液からなる、請求項４に記載のＬ－カルニチン測定キット。

【請求項6】

前記ＣＤＨと、前記トレハロースとが、別の反応試液にそれぞれ含まれる、請求項４又は５に記載のＬ－カルニチン測定キット。

【請求項7】

カルニチンデヒドロゲナーゼ（ＣＤＨ）とトレハロースを共存させて、Ｔｈｉｏ－ＮＡＤ^＋の存在下でＬ－カルニチンからデヒドロカルニチンへの反応及び／又はＴｈｉｏ－ＮＡＤＨの存在下でデヒドロカルニチンからＬ－カルニチンへの反応を促進する、ＣＤＨの反応促進方法であって、ここで、前記ＣＤＨが、（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるＣＤＨ、又は（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつＴｈｉｏ－ＮＡＤ^＋の存在下でＬ－カルニチンからデヒドロカルニチンへの反応を触媒する活性及びＴｈｉｏ－ＮＡＤＨの存在下でデヒドロカルニチンからＬ－カルニチンへの反応を触媒する活性を有するＣＤＨである、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、Ｌ－カルニチン測定方法及びＬ－カルニチン測定キットに関する。

【背景技術】

【0002】

Ｌ－カルニチン（以下、単に「カルニチン」とも称する）は、ビタミン様作用物質としてビタミンＢＴとも呼ばれる低分子窒素化合物であり、肝臓、腎臓、脳で合成され、他の組織では能動輸送で血中から取り込まれる。体内では大部分が骨格筋と心筋に存在する。カルニチンは、食肉などの食物として摂取され、組織内、血液、尿では遊離型カルニチン又はアシルカルニチンとして存在し、主に尿中へ遊離型又はアシル型として排泄される。カルニチンは、主として、長鎖脂肪酸と結合してアシルカルニチンの形でミトコンドリアに取り込ませ、長鎖脂肪酸をβ酸化系に送り込みエネルギー産生させる働きを有する。人体において、通常食を摂取している限り、血中のカルニチン濃度が極端に増加減少することはないと言われているが、原発性及び続発性カルニチン欠損症といった先天性の要因、長期経静脈栄養等によるカルニチン摂取減少、火傷、敗血症、Ｆａｎｃｏｎｉ症候群等によるカルニチン排泄の亢進、血液透析、及び薬剤使用といった後天性の要因により、大幅な減少がみられることが知られている。カルニチンが欠乏すると、骨格筋の筋力低下、筋委縮、心筋では心筋症、高アンモニア血症、低ケトン性低血糖による意識低下や昏睡などの症状がみられる（カルニチン欠乏症）。

【0003】

主にカルニチン欠乏症の診断補助を目的として、血中又は尿中のカルニチン濃度が測定される。遊離型カルニチン量は、血清、血漿、尿等のサンプルから直接測定可能である。アシルカルニチン量は、サンプル中のカルニチンを遊離型に変換して総カルニチン量を測定した後、別途測定した遊離型カルニチン量を差し引くことで測定可能である。カルニチン（遊離型カルニチン、総カルニチン）量の測定方法としては、例えば、カルニチンデヒドロゲナーゼとチオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類、及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類を使用する、酵素サイクリング法が知られる（特許文献１）。酵素サイクリング法に使用されるカルニチンデヒドロゲナーゼとしては、例えば、大腸菌等の微生物を用いて生成された組換え酵素を使用できることが知られる（特許文献３）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【文献】特開平３－２５１１９６号公報

【文献】特開平３－１２７９８５号公報

【文献】特開平５－１６１４９２号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

酵素サイクリング法によるカルニチン測定方法は、カルニチンデヒドロゲナーゼ（以下、「ＣＤＨ」とも称する）の酵素活性が水溶液中で不安定であることから、凍結乾燥させた酵素を測定直前に水系溶解液で溶解する工程を要し、操作が煩雑である、という問題があった。また、溶解後の酵素溶液について、残量を長期間保存することが困難であり、再利用できずに廃棄せざるを得ない、という問題もあった。

【0006】

本発明は、水溶液の状態で保存可能なカルニチンデヒドロゲナーゼ溶液を用いた、Ｌ－カルニチン測定方法及びＬ－カルニチン測定キットを提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、酵素サイクリング法によるカルニチン測定方法において、反応系にトレハロースを共存させることで、高いシグナルが得られることを見出し、本発明を完成させた。これにより、ＣＤＨを水溶液中で保存することで酵素活性がある程度低下したとしても、反応系に共存する糖類によるシグナル亢進でその低下分を補うことが可能であり、結果としてＣＤＨを含む水溶液の長期保存が可能となることが判明した。

【0008】

すなわち、本発明は、以下を提供するものである。
１．β－チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化型（Ｔｈｉｏ－ＮＡＤ^＋）及びβ－ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）の存在下、又は、β－チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（Ｔｈｉｏ－ＮＡＤＨ）及びβ－ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化型（ＮＡＤ^＋）の存在下で、測定対象から取り出した試料中のＬ－カルニチンを、カルニチンデヒドロゲナーゼ（ＣＤＨ）と反応させる反応工程を含み、前記反応工程の反応系にトレハロースを共存させる、Ｌ－カルニチン測定方法。
２．前記反応工程が、Ｔｈｉｏ－ＮＡＤ^＋及びＮＡＤＨの存在下で実施される、１のＬ－カルニチン測定方法。
３．前記ＣＤＨが、（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるＣＤＨ、又は（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつＴｈｉｏ－ＮＡＤ^＋の存在下でＬ－カルニチンからデヒドロカルニチンへの反応を触媒する活性及びＴｈｉｏ－ＮＡＤＨの存在下でデヒドロカルニチンからＬ－カルニチンへの反応を触媒する活性を有するＣＤＨである、１又は２のＬ－カルニチン測定方法。
４．前記糖類の反応時終濃度が５～５０重量％である、１～３のいずれかのＬ－カルニチン測定方法。
５．Ｔｈｉｏ－ＮＡＤ^＋又はＮＡＤ^＋を含有する水溶液からなる第１反応試液と、ＮＡＤＨ又はＴｈｉｏ－ＮＡＤＨを含有する水溶液からなる第２反応試液と、を備え、前記第１反応試液がＴｈｉｏ－ＮＡＤ^＋を含有する場合は、前記第２反応試液はＮＡＤＨを含有し、前記第１反応試液がＮＡＤ^＋を含有する場合は、前記第２反応試液はＴｈｉｏ－ＮＡＤＨを含有し、前記第１反応試液と第２反応試液の少なくとも１つがＣＤＨを含有し、前記第１反応試液と第２反応試液の少なくとも１つがトレハロースを含有する、Ｌ－カルニチン測定キット。
６．前記第１反応試液がＴｈｉｏ－ＮＡＤ^＋を含有する水溶液からなり、前記第２反応試液がＮＡＤＨを含有する水溶液からなる、５のＬ－カルニチン測定キット。
７．前記ＣＤＨと、前記トレハロースとが、別の反応試液にそれぞれ含まれる、５又は６のＬ－カルニチン測定キット。
８．トレハロースを共存させて、Ｔｈｉｏ－ＮＡＤ^＋の存在下でＬ－カルニチンからデヒドロカルニチンへの反応及び／又はＴｈｉｏ－ＮＡＤＨの存在下でデヒドロカルニチンからＬ－カルニチンへの反応を促進する、カルニチンデヒドロゲナーゼの反応促進方法。

【発明の効果】

【0009】

本発明によれば、予め水溶液に溶解させた状態で保存可能なカルニチンデヒドロゲナーゼ溶液を用いた、Ｌ－カルニチン測定方法及びＬ－カルニチン測定キットを提供することが可能となる。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】トレハロース濃度と吸光度変化量（ΔＡｂｓ／ｍｉｎ×１０，０００）との関係を示すグラフである。

【図2】第２反応試液の冷蔵保存期間と、５０μｍｏｌＬ－カルニチン測定時の吸光度変化量（ΔＡｂｓ／ｍｉｎ×１０，０００）との関係を示すグラフである。

【図3】１１か月間冷蔵保存した第２反応試液を用いて測定した、各カルニチン濃度溶液の実測濃度値／理論濃度値（％）を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0011】

＜Ｌ－カルニチン測定方法＞
本発明のＬ－カルニチン測定方法は、Ｔｈｉｏ－ＮＡＤ^＋及びＮＡＤＨの存在下、又は、Ｔｈｉｏ－ＮＡＤＨ及びＮＡＤ^＋の存在下で、測定対象から取り出した試料中のＬ－カルニチンを、カルニチンデヒドロゲナーゼ（ＣＤＨ）と反応させる反応工程を含み、前記反応工程の反応系にトレハロースを共存させる、ことを特徴とする。ＣＤＨの反応系にトレハロースを共存させることで、ＣＤＨの反応促進等により、得られるシグナル（例えば、吸光度）が亢進する、という効果が得られる。

【0012】

本発明のＬ－カルニチン測定方法は、酵素サイクリング法によるＬ－カルニチン測定方法を使用する。酵素サイクリング法によるカルニチンの測定には、補酵素として、Ｔｈｉｏ－ＮＡＤ^＋とＮＡＤＨの組み合わせ、又はＮＡＤ^＋とＴｈｉｏ－ＮＡＤＨの組み合わせをいずれも使用できるが、特に前者（Ｔｈｉｏ－ＮＡＤ^＋とＮＡＤＨの組み合わせ）が、生成されるＴｈｉｏ－ＮＡＤＨが後者で生成されるＮＡＤＨよりもモル吸光係数が２倍程度高く、高いシグナルを得ることが可能なことから、好適に使用できる。以下、Ｔｈｉｏ－ＮＡＤ^＋とＮＡＤＨの組み合わせを使用する方法について例示的に説明するが、本発明の方法を限定するものではない。酵素サイクリング法において、カルニチンは、ＣＤＨ及びＴｈｉｏ－ＮＡＤ^＋により特異的に酸化され、デヒドロカルニチン及びＴｈｉｏ－ＮＡＤＨを生成する。このデヒドロカルニチンは、ＣＤＨ及びＮＡＤＨの存在下でカルニチン及びＮＡＤ＋を生成する。すなわち、下記反応式に示すサイクリング反応が生じる。

【化1】

【0013】

酵素サイクリング法は、通常、測定時間内において反応がプラトーに達することなくシグナルが増加するため、カイネティックアッセイが可能であり、ノイズの影響を受けにくく、高感度の測定が可能である。本発明においては、上記反応で生じるＴｈｉｏ－ＮＡＤＨの量を、３９６ｎｍ付近の吸光度を経時的に測定することで、その生成速度を割り出し、例えば、既知濃度のカルニチンを含む標準液におけるＴｈｉｏ－ＮＡＤＨ生成速度と比較して、カルニチンの濃度を算出することができる。

【0014】

本発明の測定方法で測定するカルニチンは、遊離型カルニチン、アシルカルニチン、総カルニチンのいずれでもよい。総カルニチンを測定する場合は、試料中に含まれるアシルカルニチンを加水分解し、遊離型カルニチンの形にしてから測定する必要がある。また、アシルカルニチンを測定する場合は、試料中の遊離カルニチン量、総カルニチン量をそれぞれ測定し、総カルニチン量から遊離型カルニチン量を減じる必要がある。本明細書では、以下、遊離型カルニチン量の測定方法について例示的に説明するが、本発明の方法を限定するものではない。

【0015】

本発明の測定方法において、測定対象は、哺乳動物、特にヒトである。また、試料としては、血清、血漿、全血等の血液試料、尿、唾液等を使用できる。好適には、試料は血液試料であり、より好適には、血清又は血漿である。

【0016】

本発明の測定方法において、ＣＤＨの反応時にトレハロースを共存させる。トレハロースの濃度は、反応時終濃度で３．０～５０重量％であることが好ましく、６．０～２５重量％であることがより好ましい。糖類濃度は高濃度であるほど、シグナル亢進効果が高くなる傾向がみられるが、３５重量％以上とすると使用する水溶液の粘度が高くなる等、扱いにくくなるため、上記範囲の濃度とすることが望まれる。

【0017】

本発明の方法に使用するＣＤＨとしては、既知の方法で生成したものをいずれも使用可能である。ＣＤＨについては、種々の微生物供給源があるが、特に比較的熱安定性に優れたものとしてアルカリゲネシス属細菌由来のＣＤＨが知られている（特許文献２及び３）。例えば、本発明の方法で使用するＣＤＨとしては、アルカリゲネス属細菌のＣＤＨのアミノ酸配列（特許文献３参照）と同一又は類似のアミノ酸配列を有するＣＤＨを好適に挙げることができる。具体的には、具体的には、（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるＣＤＨ、又は（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつＴｈｉｏ－ＮＡＤ^＋の存在下でＬ－カルニチンからデヒドロカルニチンへの反応を触媒する活性及びＴｈｉｏ－ＮＡＤＨの存在下でデヒドロカルニチンからＬ－カルニチンへの反応を触媒する活性を有するＣＤＨである。なお、本明細書において、「同一性」とは、BLAST（Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ）を用いて計算したときの配列の同一性を意味する。本発明の方法に使用するＣＤＨは、好ましくは、配列番号２で表されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、より好ましくは、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１～５個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、さらに好ましくは、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、さらにより好ましくは、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する。

【0018】

本発明において、前記ＣＤＨは、ＣＤＨ遺伝子、例えば、前記アミノ酸配列をコードするＤＮＡを宿主に機能的に組込み、生成した組換えＣＤＨを使用できる。前記ＤＮＡの例としては、（ｃ）配列番号１で表される塩基配列を含むＤＮＡ；又は、（ｄ）配列番号１で表される塩基配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡを含み、かつＴｈｉｏ－ＮＡＤ^＋の存在下でＬ－カルニチンからデヒドロカルニチンへの反応を触媒する活性及びＴｈｉｏ－ＮＡＤＨの存在下でデヒドロカルニチンからＬ－カルニチンへの反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを挙げることができる。

【0019】

遺伝子を導入する宿主の種類は限定されず、細菌、真菌、各種の酵母などの単細胞真核生物、又は動物もしくは植物の生細胞を任意に選択できるが、本発明においては、微生物が好ましく、特に大腸菌が好ましい。宿主大腸菌は通常遺伝子工学に用いられる大腸菌Ｋ－１２株の中から適切なものを選択する。代表的なものとしてＪＭ１０５やＪＭ１０９が挙げられるが、ＤＨ５あるいは誘導型の発現系に用いられるＢＬ２１やＢＬ２１（ＤＥ３）などを使用してもよい。

【0020】

ＣＤＨ遺伝子は、当該遺伝子の発現を強化する発現ベクターによって導入される。発現ベクターは、導入しようとする遺伝子を、その発現を強化する種々のＤＮＡ断片又はＲＮＡ断片と融合させたものである。好ましくは、発現ベクターは、遺伝子を恒常的又は誘導的に発現させるための転写プロモーター、転写ターミネーター、選択マーカーを含み得る。所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、オペレーター、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。

【0021】

ベクターとしては、限定はされないが、大腸菌を宿主とする場合によく利用されるプラスミド、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＳＣ１０１、ｐＢＲ３２２、ｐＨＳＧ２９８、ｐＶＣ１８、ｐＶＣ１９、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＭａｌ－ｃ２、ｐＧＥＸ２Ｔ、ｐＴＶ１１８Ｎ、ｐＴＶ１１９Ｎ、ｐＴＲＰ等を好ましく使用でき、その他にもＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを宿主とする場合によく利用されるＹｅｐ１３、Ｙｅｐ２４、ＹＣｐ５０、ｐＲＳ４１４、ｐＲＳ４１５、ｐＲＳ４０４、ｐＡＵＲ１０１、ｐＫＧ１等も利用でき、枯草菌を宿主とする場合によく利用されるプラスミドｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４等も利用できる。更に、ｐＢＩ１２２、ｐＢＩ１１０１その他の各種のものも限定なく使用できる。

【0022】

本発明の方法に使用するＴｈｉｏ－ＮＡＤ^＋の反応時終濃度は２．０～８．０ｇ／Ｌ、ＮＡＤＨの反応時終濃度は０．０５～０．５ｇ／Ｌとすることが好ましい。また、本発明の方法に使用するＣＤＨの濃度は１００～５００ｋＵ／Ｌとすることが好ましい。なお、本明細書において、ＣＤＨ活性の１単位（Ｕ）は、３７℃で１分間あたりに１μｍｏｌのＮＡＤＨを生成する触媒量と定義する。

【0023】

試料と、Ｔｈｉｏ－ＮＡＤ^＋、ＮＡＤＨ、ＣＤＨ及び糖類とを混合して反応させる反応工程において、各成分の混合の順番は特に限定されないが、例えば、試料、Ｔｈｉｏ－ＮＡＤ^＋及び糖類を混合した後、ＮＡＤＨ及びＣＤＨを混合して反応させることができる。反応工程は、５．０～５５℃、特に２０～４５℃、さらに３０～４０℃の温度条件下で実施することが好ましい。また、反応時間は、温度条件、反応に使用する各成分の濃度等によって異なるが、１～３０分間、特に５～１５分間とすることが好ましい。

【0024】

＜Ｌ－カルニチン測定キット＞
本発明のＬ－カルニチン測定キットは、Ｔｈｉｏ－ＮＡＤ^＋又はＮＡＤ^＋を含有する水溶液からなる第１反応試液と、ＮＡＤＨ又はＴｈｉｏ－ＮＡＤＨを含有する水溶液からなる第２反応試液と、を備え、前記第１反応試液がＴｈｉｏ－ＮＡＤ^＋を含有する場合は前記第２反応試液はＮＡＤＨを含有し、前記第１反応試液がＮＡＤ＋を含有する場合は前記第２反応試液はＴｈｉｏ－ＮＡＤＨ含有し、前記第１反応試液と第２反応試液の少なくとも１つがカルニチンデヒドロゲナーゼを含有し、前記第１反応試液と第２反応試液の少なくとも１つが糖類を含有する、ことを特徴とする。

【0025】

酵素サイクリング法においては、通常、酵素反応に使用する試薬は、酸化型補酵素を含有する試液と、還元型補酵素を含有する試液との二液に分けて構成される。本発明のＬ－カルニチン測定キットにおいては、特に、前記第１反応試液がＴｈｉｏ－ＮＡＤ^＋を含有する水溶液からなり、前記第２反応試液がＮＡＤＨを含有する水溶液からなる構成とすることが、得られるシグナルの強度が高いことから好ましい。以下、前記第１反応試液がＴｈｉｏ－ＮＡＤ^＋を含有する水溶液からなり、前記第２反応試液がＮＡＤＨを含有する水溶液からなる構成について例示的に記載するが、本発明のキットの構成を限定するものではない。

【0026】

本発明のキットの構成成分として、ＣＤＨと糖類が含まれるが、ＣＤＨと糖類とは、同じ試液に含まれていてもよく、異なる試液に含まれていてもよい。また、いずれか又は両方の成分が、第１反応試液と第２反応試液の両方に含まれていてもよい。特に、高濃度の糖類を含む試液の粘度が高くなることを考慮すると、ＣＤＨの取り扱いをより容易とするため、ＣＤＨと糖類とは別の試液に含まれていることが好ましい。

【0027】

第１反応試液に含まれるＴｈｉｏ－ＮＡＤ^＋は、第２反応試液に使用されるＮＡＤＨよりも反応系において高濃度で必要とされることから、第１反応試液と第２反応試液の混合比率は、体積比で１：１～５：１とすることが好ましい。また、同様に高濃度で必要とされる糖類についても、第１反応試液に含有させることが好ましい。さらに、第１反応試液に糖類が含まれる場合、ＣＤＨは糖類を含まない第２反応試液に含まれることが好ましい。

【0028】

第１試液及び第２試液には、必要に応じてリン酸バッファー、Ｔｒｉｓ、ＭＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＰＩＰＥＳ等のｐＨ緩衝剤、ＥＤＴＡ等のキレート剤、防腐剤等を含有させてもよい。また、ＣＤＨを含む試液には、酵素安定化剤として、ＢＳＡ、カゼイン、グリシン等を含有させてもよい。

【0029】

本発明のキットは、第１反応試液、第２反応試液とは別に、既知濃度のＬ－カルニチンを含む標準液を備えることが好ましい。試料と同時に標準液を測定して、両者のＴｈｉｏ－ＮＡＤＨ生成速度を比較することで、試料中のＬ－カルニチン濃度を算出することが可能となる。

【0030】

本発明のキットの使用方法としては、例えば、試料と第１反応試液を混合し、至適温度（例えば３７℃）でインキュベーションした後、第２反応試液を混合してＣＤＨを反応させる方法とすることができる。ＣＤＨ反応開始時から、反応系の４０５ｎｍの吸光度を経時的に測定することで、吸光度の変化量（速度）を算出することができる。同時に、例えば６００ｎｍの吸光度を測定することで、ブランク値を差し引くことができる。上記の操作は、マイクロウェルプレートを用いて用手法で実施してもよいが、臨床検査用自動分析機（例えば、日立７１７０型、日立製作所製）を使用して実施することもできる。

【0031】

本発明のキットは上記のような構成を有することで、ＣＤＨを液状試薬の成分として含み、かつ、従来製品と同等の性能を有することができる。本発明のキットは、使用時に試液の用事調製を必要としないため、簡便に使用できるという利点を有する。なお、本発明のキットは、使用時以外は４℃程度で冷蔵保存することが推奨される。また、使用時には、予め室温に戻してから使用することが推奨される。

【0032】

＜カルニチンデヒドロゲナーゼの反応促進方法＞
本発明のカルニチンデヒドロゲナーゼの反応促進方法は、Ｔｈｉｏ－ＮＡＤ^＋及びＮＡＤＨの存在下、又は、Ｔｈｉｏ－ＮＡＤＨ及びＮＡＤ^＋の存在下で、さらに糖類を存在させてＬ－カルニチンとカルニチンデヒドロゲナーゼとを反応させる、ことを特徴とする。

【実施例】

【0033】

実施例１ 組換えＣＤＨの生成
以下の実施例に使用したＣＤＨは、以下の通りに調製した。配列番号２に示すＣＤＨのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列として、大腸菌に対してコドン最適化した配列番号１の９６６ｂｐのＤＮＡを合成した。合成したＤＮＡをプラスミド（ｐＴＲＰ ベクター）にクローニングし、大腸菌を形質転換した後、培養した。使用したプラスミド、形質転換の手法、培養条件等は、特許文献３と同様とした。培養液から集菌した菌体を破砕した後、バッファーで懸濁して遠心分離で残渣を除き、細胞抽出液を得た。細胞抽出液のＣＤＨ活性を、基質混合反応液（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１００ｍＭ カルニチン、１０ｍＭ ＮＡＤ^＋、ｐＨ９．０）を用いて確認した。細胞抽出液を基質混合反応液に加え、ＣＤＨの反応で得られるＮＡＤＨによる３４０ｎｍの吸光度を経時的に測定し、ＮＡＤＨのモル吸光計数を用いて１分間あたりのＮＡＤＨ産出量を算出した。その結果、培養液１ｍＬ相当量の細胞抽出液が、１分間あたり１０～３０ｍｍｏｌのＮＡＤＨを生成するＣＤＨ活性を有することを確認した。

【0034】

細胞抽出液に含まれる組換えＣＤＨは、以下の方法で精製した。細胞抽出液を陰イオン交換クロマトグラフィー（DEAE Cellufine A-500、JNC社）に供した。次いで、得られた画分に硫酸アンモニウムを添加した後、疎水クロマトグラフィー（TOYOPEARL Phenyl 650C、東ソー社）に供した。次いで、得られた画分を限外ろ過膜（SIP-1013、旭化成ファーマ社）により濃縮した後に脱塩カラム（Sepharose G-25、GEヘルスケア社）により脱塩した。次いで得られた画分をアフィニティークロマトグラフィー（Blue Sepharose CL-6B、GEヘルスケア社）に供した後、脱塩カラム（Sepharose G-25、GEヘルスケア社）により脱塩し、精製された組換えＣＤＨ溶液を得た。得られた組換えＣＤＨの酵素的諸性質を確認した。組換えＣＤＨの至適ｐＨはｐＨ８．５～９．０であり、ｐＨ６．０～９．０で安定であった。また、活性化する至適温度は５５℃、４５℃以下で熱安定性があった。

【0035】

実施例２ トレハロースによるカルニチン測定感度の向上
５０μｍｏｌ／ＬのＬ－カルニチン標準液（「Ｆ－Ｃａｒｎｉｔｉｎｅ試薬カイノス」カイノス社）について、臨床検査用自動分析機（日立７１７０型、日立製作所製）を使用して測定を行った。
カルニチン標準液７．２μＬを、０、１００、２００、３００、４００、５００ｇ／Ｌのトレハロース２水和物を含む第１反応試液（４．９ｇ／Ｌ Ｔｈｉｏ－ＮＡＤ^＋を含む、ｐＨ６．４）１２０μＬとそれぞれ混合し、３７℃で５分間インキュベートした。次いで、第２反応試液（０．２ｇ／Ｌ ＮＡＤＨ２Ｎａ、６００ｋＵ／Ｌ ＣＤＨを含む、ｐＨ９．０）６０μＬを加え、３７℃でインキュベートした。上記操作の間、反応液の４０５ｎｍ、６００ｎｍの吸光度を断続的に測定した。

【0036】

図１に、トレハロース濃度と、第２反応試液を加えた後の４０５ｎｍ、６００ｎｍの吸光度増加変化量（ΔＡｂｓ／ｍｉｎ×１０，０００）の関係を示す。４０５ｎｍの吸光度変化量は、トレハロース濃度に依存して高くなった。一方、トレハロース濃度は、ブランクである６００ｎｍの吸光度変化量には、ほとんど影響を与えなかった。

【0037】

実施例３ トレハロース含有カルニチン測定キットの冷蔵保存安定性（感度）
下記の３種類の組換えＣＤＨを含む第２反応試液を調製した。
第２反応試液ａ：ＮＡＤＨ２Ｎａ ０．４ｇ／Ｌ、組換えＣＤＨ６００ｋＵ／Ｌを含む、ｐＨ９．０
第２反応試液ｂ：ＮＡＤＨ２Ｎａ ０．２ｇ／Ｌ、組換えＣＤＨ６００ｋＵ／Ｌを含む、ｐＨ９．０
第２反応試液ｃ：ＮＡＤＨ２Ｎａ ０．４ｇ／Ｌ、組換えＣＤＨ８００ｋＵ／Ｌを含む、ｐＨ９．０
第２反応試液ａ～ｃは、液体の状態で、４℃で０、８、１１か月保存した。

【0038】

各第２反応試液と、０、１５０、４５０ｇ／Ｌのトレハロース２水和物を含む第１反応試液（４．９ｇ／Ｌ Ｔｈｉｏ－ＮＡＤ^＋を含む、ｐＨ６．４）とを用いて、それぞれ、実施例２と同様の条件で反応させ、５０μｍｏｌ／ＬのＬ－カルニチン標準液反応時の４０５ｎｍの吸光度変化量を測定した。

【0039】

各第２反応試液における、保存期間と吸光度変化量との関係を図２に示す。いずれの条件においても、冷蔵保存期間が長くなるほど、吸光度増加速度が低下したが、一方で、トレハロースを高濃度で含むものほど、全体的に高い吸光度変化量が得られた。カルニチン測定に十分な感度・精度を保つためには、吸光度変化量（ΔＡｂｓ／ｍｉｎ×１０，０００）が１００以上である必要があるが、第１反応試液にトレハロースが含まれない場合、第２反応試液ａでは、その保存可能期間は約６ヶ月程度と推察された。一方、第１反応試液がトレハロースを１５０ｇ／Ｌ、４５０ｇ／Ｌ含む場合、その保存期間はそれぞれ８か月、１０か月程度まで延長可能であることが推察された。第２反応試液ｂ、ｃにおいても、同様の保存可能期間の延長が見られた。第２反応試液ｃでは、使用する組換えＣＤＨが多いことから、第１反応試液にトレハロースが含まれない条件においても、１１か月を超える期間、十分な吸光度変化量が見られたが、第１反応試液にトレハロースを添加することで、さらに長期間の保存が可能となることが示唆された。

【0040】

実施例４ トレハロース含有カルニチン測定キットの冷蔵保存安定性（測定範囲）
Ｌ－カルニチンを、生理食塩水に溶解して、０～３００μｍｏｌ／Ｌの１１濃度のカルニチン溶液を調製した。１１ヶ月冷蔵保存した第２反応試液ｂｃと、０、１５０、４５０ｇ／Ｌのトレハロース２水和物を含む第１反応試液とを用いて、実施例２と同様の条件で反応させ、各カルニチン溶液反応時の４０５ｎｍの吸光度変化量（ΔＡｂｓ／ｍｉｎ×１０，０００）を測定した。５０μｍｏｌ／Ｌの測定値を標準として、各カルニチン溶液濃度の実測濃度値を算出した。

【0041】

各条件下で各カルニチン濃度の、実測濃度値／理論濃度値（％）を図３に示す。図３Ａは、第１反応試液にトレハロースを含まない条件で測定した結果である。特に第２反応試液ｃを使用した際に、２０ｍｍｏｌ／Ｌ以下の低濃度領域で、カルニチン測定値の理論濃度とのかい離が大きかった。図３Ｂ、Ｃは、それぞれ第１反応試液に、トレハロースを１５０ｇ／Ｌ、４５０ｇ／Ｌ添加した際の測定結果を示す。トレハロースを含まない条件と比較して、低濃度領域での測定値のかい離が小さいことが確認された。

【産業上の利用可能性】

【0042】

本発明は、主に、臨床検査、体外診断用医薬品の産業分野において利用可能である。

【図1】

【図2】

【図3】

【配列表】

0007446875000001.app