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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-03-04
(45)【発行日】2024-03-12
(54)【発明の名称】プラズマを用いてゲノム編集酵素を植物細胞内に導入する方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20240305BHJP
C12N 15/87 20060101ALI20240305BHJP
A01H 1/00 20060101ALI20240305BHJP
【ＦＩ】
C12N15/09 110
C12N15/87 Z ZNA
A01H1/00 A
【請求項の数】
5
(21)【出願番号】P 2019206239
(22)【出願日】2019-11-14
(65)【公開番号】P2021078362
(43)【公開日】2021-05-27
【審査請求日】2022-10-18
(73)【特許権者】
【識別番号】501203344
【氏名又は名称】国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構
(73)【特許権者】
【識別番号】304021417
【氏名又は名称】国立大学法人東京工業大学
(74)【代理人】
【識別番号】110001047
【氏名又は名称】弁理士法人セントクレスト国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】光原 一朗
(72)【発明者】
【氏名】柳川 由紀
(72)【発明者】
【氏名】土岐 精一
(72)【発明者】
【氏名】岩上 真咲
(72)【発明者】
【氏名】廣瀬 咲子
(72)【発明者】
【氏名】加藤 悦子
(72)【発明者】
【氏名】沖野 晃俊
(72)【発明者】
【氏名】末永 祐磨
(72)【発明者】
【氏名】守屋 翔平
(72)【発明者】
【氏名】飯島 勇介
【審査官】田中 晴絵
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１９／０７２５９６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１８／０２６５８６４（ＵＳ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１８／０１６２１７（ＷＯ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１５／３４４９１２（ＵＳ，Ａ１）
【文献】YANAGAWA,Yuki et al.，Direct protein introduction into plant cells using a multi-gas plasma jet，PLoS ONE，2017年，vol.12,no.2,e0171942，p.1-15
【文献】SUBBURAJ,Saminathan et al.，Site-directed mutagenesis in Petunia × hybrida protoplast system using direct delivery of purified recombinant Cas9，Plant Cell Rep，2016年，vol.35，p.1535-1544
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ａ０１Ｈ １／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
植物細胞に、Ｃａｓタンパク質及びガイドＲＮＡを導入する方法であって、該細胞をプラズマで処理した後、２価以上の金属カチオンの存在下、当該細胞とＣａｓタンパク質及びガイドＲＮＡとを接触させ、
前記植物細胞は、細胞壁を備える植物細胞であり、かつ
前記２価以上の金属カチオンが、Ｍｇ ２＋ 、Ｍｎ ２＋ 、Ｚｎ ２＋ 、Ｃａ ２＋ 及びＢａ ２＋ からなる群から選択される少なくとも１の２価金属カチオンである、
方法。
【請求項2】
前記Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記プラズマが常温大気圧プラズマである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記プラズマが、二酸化炭素プラズマ及び窒素プラズマからなる群から選択される少なくとも一つのプラズマである、請求項１～３のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
ゲノム編集された植物体の製造方法であって、植物細胞をプラズマで処理した後、２価以上の金属カチオンの存在下、当該細胞とＣａｓタンパク質及びガイドＲＮＡとを接触させ、当該細胞に前記Ｃａｓタンパク質及びガイドＲＮＡを導入し、
前記Ｃａｓタンパク質及びガイドＲＮＡが導入された植物細胞から植物体を再生させ、
前記植物細胞は、細胞壁を備える植物細胞であり、かつ
前記２価以上の金属カチオンが、Ｍｇ ２＋ 、Ｍｎ ２＋ 、Ｚｎ ２＋ 、Ｃａ ２＋ 及びＢａ ２＋ からなる群から選択される少なくとも１の２価金属カチオンである、
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ゲノム編集酵素を、プラズマを用いて植物細胞内に導入し、ゲノム編集を生じさせる方法に関する。
【背景技術】
【0002】
ゲノム編集技術は、特定の遺伝子の狙った部位に変異を導入して、そのコードするタンパク質の活性を修飾（例えば、活性型から不活性型への置換や不活性型から活性型への置換）することにより、新たな細胞や品種を作製する技術である。この技術によれば、単に内在性遺伝子に変異が導入され、外来遺伝子を保持しない品種や系統を作成することが可能であり、この点で従来の遺伝子組換え技術と異なる。
【0003】
これまでに、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮｓ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム等のゲノム編集技術が開発され、遺伝子改変のための有用なツールとして注目されている。例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムにおいて、Ｃａｓタンパク質は、ガイドＲＮＡと複合体を形成し、この複合体が、ガイドＲＮＡと相補的な配列を持つゲノム上の標的部位に結合して、ＤＮＡ二本鎖の両方を切断する。このＤＮＡの二本鎖切断は、非相同末端結合により修復された場合、ヌクレオチドの挿入や欠失（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ／ｄｅｌｅｔｉｏｎ：ｉｎｄｅｌ）が生じ、フレームシフト等により遺伝子ノックアウトを行うことができる。一方、細胞外から、修復鋳型となるドナーＤＮＡを導入した場合には、ゲノムとドナーＤＮＡとの間の相同組換えにより、遺伝子ノックインを行うことができる。この遺伝子ノックインにおいては、ＤＮＡの挿入のみならず、１～数ヌクレオチドの置換や欠失を生じさせることも可能である。
【0004】
Ｃａｓタンパク質等のゲノム編集酵素を作物の育種に活用する場合、植物ではアグロバクテリウム法等の遺伝子組換え技術によって、当該酵素遺伝子を導入する方法が主流となっている（非特許文献１）。しかしながら、アグロバクテリウム法では、対象植物のゲノムＤＮＡにゲノム編集酵素遺伝子が組み込まれてしまうため、植物の標的遺伝子に修飾を入れた後、不要になった酵素遺伝子を除去することが必要になる。この場合、かけ合わせが可能な植物ではゲノム編集酵素遺伝子を除去できるが、栄養繁殖性植物や木本植物等、不要遺伝子のかけ合わせによる除去が事実上不可能な作物も多く存在する。
【0005】
そこで、植物においても、ゲノム編集酵素をタンパク質として直接細胞内へ導入し、ゲノムへの遺伝子の組込みを経ずにゲノム編集を行う技術の開発が行われているが、プロトプラスト化が必要であること等から適用できる植物種は限られている（非特許文献２、３）。同様に、パーティクルガンでトウモロコシ胚にＲＮＰ（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９タンパク質ＲＮＡ複合体）を直接導入して、標的変異に成功した報告もあるが（非特許文献４）が、パーティクルガンを用いる方法は、通常の遺伝子組み換えですら個体再生が可能な植物は限られていることから、ゲノム編集に関しては、それ以上に困難であると考えられる。また、ウイルスの媒介により植物のゲノム編集を行おうとする試みもあるが（非特許文献５）、ウイルスに導入できる外来遺伝子の長さの制約等のため、ゲノム編集酵素をウイルスにより導入してゲノム編集に成功した例は知られていない。また、組換えウイルスを用いる場合、ゲノム編集後の植物においてウイルスの非存在を証明することが困難である等の障害もある。この他に、タンパク質を植物の細胞に導入する方法としては、膜透過ペプチドを用いる方法（非特許文献６）等が知られているが、植物ゲノム編集への応用について報告はない。
【0006】
また、植物へのタンパク質等の物質導入に関し、本発明者らは従前、プラズマを用いることにより、その由来とする植物及び組織の種類を問わず、また障害をもたらすことなく、植物に簡便かつ高効率にて物質を導入することが可能となることを明らかにしている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【文献】国際公開第２０１８／０１６２１７号
【非特許文献】
【0008】
【文献】Ｅｎｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅ １４６９ ｐｐ１２３－１３５（２０１６）
【文献】Ｗｏｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．３３：１１６２－１１６４（２０１６）
【文献】Ｓｕｂｂｕｒａｊ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．３５：１５３５－１５４４（２０１６）
【文献】Ｓｖｉｔａｓｈｅｖ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ ７：１３２７４（２０１６）
【文献】Ａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ ８：１２８８－１２９１（２０１５）
【文献】Ｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌｏｓ Ｏｎｅ １０：１３７１（２０１６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本発明は、プラズマにより、ゲノム編集酵素を植物細胞に導入し、当該酵素によるゲノム編集を可能とする方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明者らは従前、プラズマを用いることにより、その由来とする植物及び組織の種類を問わず、また障害をもたらすことなく、植物に簡便かつ高効率にて物質を導入することが可能となることを明らかにしている。特に、植物細胞をプラズマで処理した後、当該細胞にタンパク質（ＧＦＰとＣｙａＡとの融合タンパク質）又はＤＮＡ（プラスミドＤＮＡ）を接触させることにより、これらの物質を前記細胞に導入できることを明らかにしている（特許文献１）。
【0011】
今回、かかるプラズマを用いた導入方法により、ゲノム編集系の一種であるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム（Ｃａｓタンパク質及びガイドＲＮＡ）を植物細胞に導入し、ゲノム編集を生じさせることを試みた。
【0012】
しかしながら、前述のタンパク質、ＤＮＡとは異なり、従前の前記方法では、Ｃａｓタンパク質及びＲＮＡの複合体によるゲノム編集を生じさせることは困難であった。
【0013】
そこで、本発明者らは、プラズマを用いてＣａｓタンパク質及びＲＮＡの複合体を植物細胞に導入し、ゲノム編集を生じさせるべく、鋭意研究を重ねた。その結果、植物細胞をプラズマで処理した後、２価以上の金属カチオンの存在下、当該細胞とＣａｓタンパク質及びガイドＲＮＡとを接触させることにより、該物質はその植物細胞内に導入され、効率良くゲノム編集を生じさせることが可能となることを見出し、本発明を完成するに至った。
【0014】
すなわち、本発明は、プラズマを用いて植物細胞内に、Ｃａｓタンパク質等のゲノム編集酵素を導入する方法に関し、より詳しくは、以下を提供するものである。
＜１＞ 植物細胞に、ゲノム編集酵素を導入する方法であって、
該細胞をプラズマで処理した後、２価以上の金属カチオンの存在下、当該細胞とゲノム編集酵素とを接触させる、方法。
＜２＞ 植物細胞に、Ｃａｓタンパク質及びガイドＲＮＡを導入する方法であって、
該細胞をプラズマで処理した後、２価以上の金属カチオンの存在下、当該細胞とＣａｓタンパク質及びガイドＲＮＡとを接触させる、方法。
＜３＞ 前記Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９タンパク質である、＜２＞に記載の方法。
＜４＞ 前記２価以上の金属カチオンが、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃａ２＋及びＢａ２＋からなる群から選択される少なくとも１の２価金属カチオンである、＜１＞～＜３＞のうちのいずれか一項に記載の方法。
＜５＞ 前記プラズマが常温大気圧プラズマである、＜１＞～＜４＞のうちのいずれか一項に記載の方法。
＜６＞ 前記プラズマが、二酸化炭素プラズマ及び窒素プラズマからなる群から選択される少なくとも一つのプラズマである、＜１＞～＜５＞のうちのいずれか一項に記載の方法。
＜１＞ 植物細胞に、ゲノム編集酵素を導入する方法であって、
該細胞をプラズマで処理した後、２価以上の金属カチオンの存在下、当該細胞とゲノム編集酵素とを接触させる、方法。
＜２＞ 植物細胞に、Ｃａｓタンパク質及びガイドＲＮＡを導入する方法であって、
該細胞をプラズマで処理した後、２価以上の金属カチオンの存在下、当該細胞とＣａｓタンパク質及びガイドＲＮＡとを接触させる、方法。
＜３＞ 前記Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９タンパク質である、＜２＞に記載の方法。
＜４＞ 前記２価以上の金属カチオンが、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃａ２＋及びＢａ２＋からなる群から選択される少なくとも１の２価金属カチオンである、＜１＞～＜３＞のうちのいずれか一項に記載の方法。
＜５＞ 前記プラズマが常温大気圧プラズマである、＜１＞～＜４＞のうちのいずれか一項に記載の方法。
＜６＞ 前記プラズマが、二酸化炭素プラズマ及び窒素プラズマからなる群から選択される少なくとも一つのプラズマである、＜１＞～＜５＞のうちのいずれか一項に記載の方法。
【発明の効果】
【0015】
本発明によれば、ゲノム編集酵素を、プラズマ処理により、植物細胞に導入し、ゲノム編集を生じさせることが可能となる。また後述の実施例に示すとおり、本発明によれば、植物細胞に、その由来とする植物及び組織の種類を問わず、また障害をもたらすことなく、ゲノム編集酵素を簡便に導入し、ゲノム編集を生じさせることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図1】実施例で用いた、本発明に係るプラズマ処理の一実施形態を示す、概略図である。すなわち、プラズマ発生装置１の内部にガス供給部２からプラズマ生成用ガスを流入させると共に、当該ガスをガス冷却装置４により冷却させた後、プラズマ発生装置内の内部電極に電力供給部３より電圧を印加することにより、プラズマ５を試料６（植物細胞）に照射することを示す、図である。
【図2】実施例で用いたレポーター遺伝子（Ｌ－（Ｉ－ＳｃｅＩ）－ＵＣ）システムの概要を示す、図である。図中の「オリジナル」及び「変異」の配列は、配列番号：６及び７に各々示す。
【図3】レポーター遺伝子 Ｌ－（Ｉ－ＳｃｅＩ）－ＵＣと、それを標的とするガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）との対応関係を示す、概略図である。図中のＬ－（Ｉ－ＳｃｅＩ）－ＵＣの配列の一部及びその相補的な配列は、配列番号：８及び９に各々示す。ガイドＲＮＡ標的配列は、配列番号：１０に各々示す。
【図4】レポーター遺伝子 Ｌ－（Ｉ－ＳｃｅＩ）－ＵＣが導入されたイネカルスに、プラズマを照射した後、物質と接触させ、該レポーター遺伝子（ルシフェリン遺伝子）の発現を検出した結果を示す、写真である。図中、左側には、接触させた物質（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（Ｃａｓ９タンパク質とｓｇＲＮＡとの複合体）又はＢＳＡ）を示し、上部には、照射したプラズマの種類（ＣＯ２プラズマ又はＮ２プラズマ）と、接触の際に用いた緩衝液又は培地の種類（１／４ＰＢＳ又は１／２ＭＳ（ｐＨ５．８））とを示し、右側には前記緩衝液又は培地へのＭｇ２＋の添加の有無を示す。
【図5】レポーター遺伝子 Ｌ－（Ｉ－ＳｃｅＩ）－ＵＣが導入されたイネカルスに、プラズマを照射した後、物質と接触させ、該レポーター遺伝子（ルシフェリン遺伝子）の発現を検出した結果を示す、写真である。図中、上部には、接触させた物質（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（Ｃａｓ９タンパク質とｓｇＲＮＡとの複合体）又はＢＳＡ）を示し、左側には、接触の際に用いた１／２ＭＳ（pＨ５．８）培地に添加した無機塩の種類及び濃度を示す。
【図6】レポーター遺伝子系 ｐＢＩ１２１－ｓＧＦＰ－ｗＴＡＬＥＮ－ＥＬＵＣの概要を示す、図である。図中のｗａｘｙ ＴＡＬＥＮ 標的配列は、配列番号：１２に示す。
【図7】レポーター遺伝子系 ｐＢＩ１２１－ｓＧＦＰ－ｗＴＡＬＥＮ－ＥＬＵＣが導入されたタバコの葉に、プラズマを照射した後、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（Ｃａｓ９タンパク質とｓｇＲＮＡとの複合体）と接触させ、カルス形成培地での培養を経て、該レポーター遺伝子（ルシフェリン遺伝子）の発現を検出したスキームを示す、概略図である。
【発明を実施するための形態】
【0017】
（植物細胞への物質導入方法）
後述の実施例に示すとおり、植物細胞をプラズマで処理した後、２価以上の金属カチオンの存在下、当該細胞とＣａｓタンパク質及びガイドＲＮＡとを接触させることにより、該物質はその植物細胞内に導入され、ゲノム編集を生じさせることが可能となる。
後述の実施例に示すとおり、植物細胞をプラズマで処理した後、２価以上の金属カチオンの存在下、当該細胞とＣａｓタンパク質及びガイドＲＮＡとを接触させることにより、該物質はその植物細胞内に導入され、ゲノム編集を生じさせることが可能となる。
【0018】
したがって、本発明は、植物細胞に、Ｃａｓタンパク質等のゲノム編集酵素を導入する方法であって、該細胞をプラズマで処理した後、２価以上の金属カチオンの存在下、当該細胞とゲノム編集酵素とを接触させる、方法を提供する。
【0019】
本発明において、「ゲノム編集酵素」とは、ゲノムＤＮＡ上の任意の部位に改変を生じさせ得る人工制限酵素を意味し、例えば、Ｃａｓ、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、ＰＰＲが挙げられる。
【0020】
（Ｃａｓ）
本発明において、「Ｃａｓタンパク質」は、ＣＲＩＳＰＥＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔ、クリスパー）関連酵素（ヌクレアーゼ）であり、クラス１ＣＲＩＳＰＥＲ関連酵素（例えば、Ｃａｓ３等のＩ型、IV型、Ｃａｓ１０等のIII型）であってもよく、クラス２ＣＲＩＳＰＥＲ関連酵素（例えば、Ｃａｓ９等のII型、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１），Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）、Ｃａｓ１２ｅ（ＣａｓＸ）及びＣａｓ１４等のＶ型、Ｃａｓ１３等のVI型）であってもよいが、好ましくはクラス２ＣＲＩＳＰＥＲ関連酵素であり、より好ましくはII型ＣＲＩＳＰＥＲ関連酵素であり、さらに好ましくはＣａｓ９である。また「Ｃａｓ９タンパク質」としては、例えば、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｃａｓ９、Ｓ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９が挙げられる。
本発明において、「Ｃａｓタンパク質」は、ＣＲＩＳＰＥＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔ、クリスパー）関連酵素（ヌクレアーゼ）であり、クラス１ＣＲＩＳＰＥＲ関連酵素（例えば、Ｃａｓ３等のＩ型、IV型、Ｃａｓ１０等のIII型）であってもよく、クラス２ＣＲＩＳＰＥＲ関連酵素（例えば、Ｃａｓ９等のII型、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１），Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）、Ｃａｓ１２ｅ（ＣａｓＸ）及びＣａｓ１４等のＶ型、Ｃａｓ１３等のVI型）であってもよいが、好ましくはクラス２ＣＲＩＳＰＥＲ関連酵素であり、より好ましくはII型ＣＲＩＳＰＥＲ関連酵素であり、さらに好ましくはＣａｓ９である。また「Ｃａｓ９タンパク質」としては、例えば、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｃａｓ９、Ｓ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９が挙げられる。
【0021】
なお、Ｃａｓタンパク質の典型的なアミノ酸配列及び塩基配列は公開されたデータベース、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）に登録されており、本発明においてはこれらを利用することができる。例えば、化膿性連鎖球菌由来のＣａｓ９タンパク質の典型的なアミノ酸配列及び塩基配列は、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＰ＿２６９２１５及びＮＣ＿００２７３７に記載の各々の配列である。
【0022】
また、本発明にかかる「Ｃａｓ９タンパク質」は、ガイドＲＮＡと複合体を形成して標的ＤＮＡを切断する活性を有している限り、前述の典型的なアミノ酸配列からなるタンパク質に限らず、そのホモログ、変異体、あるいは部分ペプチドであってもよい。
【0023】
ホモログとしては、例えば、対象となるＣａｓタンパク質のアミノ酸配列（例えば、ＮＰ＿２６９２１５に記載のアミノ酸配列）と、８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質が含まれる。配列の同一性は、ＢＬＡＳＴ等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ）を用いて計算したときの数値で評価することができる。
【0024】
また、変異体としては、天然型のＣａｓ９ンパク質のアミノ酸配列（例えば、ＮＰ＿２６９２１５に記載のアミノ酸配列）に対して１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、エンドヌクレアーゼ活性を有するタンパク質が含まれる。ここで、「複数個」とは、例えば、２～１５０個、好ましくは２～１００個、より好ましくは２～５０個（例えば、２～３０個、２～１０個、２～５個、２～３個、２個）である。
【0025】
変異体の例としては、例えば、特定のアミノ酸残基に変異を導入することによりＰＡＭの認識特異性を改変したＣａｓタンパク質が挙げられる。Ｃａｓタンパク質におけるＰＡＭの認識特異性を改変する技術は公知である（Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｐ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ５２３，４８１－４８５（２０１５）、Ｈｉｒａｎｏ，Ｓ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ６１，８８６－８９４（２０１６））が挙げられる。
【0026】
本発明にかかるＣａｓタンパク質には、核局在化シグナルを付加することが好ましい。これにより、細胞内で核への局在が促進され、その結果、ＤＮＡの編集が効率的に行われる。
【0027】
また、本発明にかかるＣａｓタンパク質は、当業者であれば、当該Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡを、適当なベクターに載せ、大腸菌、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等の宿主細胞、又は無細胞タンパク質合成系（例えば、網状赤血球抽出液、小麦胚芽抽出液）に導入することにより、組換えタンパク質として発現させることができる。さらに、宿主細胞等において発現させた組換えタンパク質は、公知のペプチド精製方法により精製することができる。例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除カラムクロマトグラフィー、本発明にかかるＣａｓタンパク質を特異的に認識する抗体を用いたアフィニティクロマトグラフィー）、遠心分離等によって精製することができる。
【0028】
宿主細胞等において発現させた組換えタンパク質を精製する公知の方法としては、Ｈｉｓ－タグタンパク質、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タンパク質、等の機能性タンパク質を融合させた形態で前記Ｃａｓタンパク質を合成し、金属キレート樹脂、ＧＳＴ親和性レジン等に結合させることにより精製する方法等が挙げられる（Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３，７２１１－７２１５（１９８８））。さらに、例えば、ＴＥＶプロテアーゼ、トロンビン、血液凝固因子Ｘａ等で、機能性タンパク質と前記Ｃａｓタンパク質との間に挿入したこれら酵素認識配列を切断することにより、前記Ｃａｓタンパク質のみを分離して精製することもできる。
【0029】
また、本発明にかかるＣａｓタンパク質は、そのアミノ酸配列に基づき、市販のポリペプチド合成機によって化学的に合成して調製することもできる。
【0030】
（ガイドＲＮＡ）
Ｃａｓタンパク質は、ガイドＲＮＡと複合体を形成することにより、標的領域に誘導され、そのエンドヌクレアーゼ活性によって標的領域中の標的部位を切断し、ゲノム編集が生じる。また後述の実施例に示すとおり、本発明によれば、Ｃａｓタンパク質のみならず、ガイドＲＮＡも植物細胞に導入することが可能となる。したがって、本発明による植物細胞への被導入対象として、Ｃａｓタンパク質のみならず、ガイドＲＮＡも含まれ得る。
Ｃａｓタンパク質は、ガイドＲＮＡと複合体を形成することにより、標的領域に誘導され、そのエンドヌクレアーゼ活性によって標的領域中の標的部位を切断し、ゲノム編集が生じる。また後述の実施例に示すとおり、本発明によれば、Ｃａｓタンパク質のみならず、ガイドＲＮＡも植物細胞に導入することが可能となる。したがって、本発明による植物細胞への被導入対象として、Ｃａｓタンパク質のみならず、ガイドＲＮＡも含まれ得る。
【0031】
本発明にかかる「ガイドＲＮＡ」はＣａｓタンパク質と相互作用する塩基配列（以下、「Ｃａｓ相互作用塩基配列」とも称する）と標的領域の塩基配列に対して相補的な塩基配列（以下、「標的化塩基配列」とも称する）とを含むＲＮＡである。
【0032】
本発明にかかるＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムのガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡを含む一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）でも、ｃｒＲＮＡ断片とｔｒａｃｒＲＮＡ断片とからなる二分子ガイドＲＮＡであってもよい。
【0033】
ｃｒＲＮＡ中の標的化塩基配列は、通常、１２～５０塩基、好ましくは、１７～３０塩基、より好ましくは１７～２５塩基からなる塩基配列であり、ＰＡＭ（ｐｒｏｔｏ－ｓｐａｃｅｒ ａｄｊａｃｅｎｔ ｍｏｔｉｆ）配列と隣接する領域を標的化するように選択される。
【0034】
ｃｒＲＮＡは、さらに、ｔｒａｃｒＲＮＡと相互作用（ハイブリダイズ）が可能な塩基配列を３’側に含む。一方、ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡの一部の塩基配列と相互作用（ハイブリダイズ）が可能な塩基配列を５’側に含む。これら塩基配列の相互作用により形成された二重鎖ＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質と相互作用する。
【0035】
植物細胞に導入されるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムにおいて、ガイドＲＮＡは、ＲＮＡの形態であっても、当該ＲＮＡをコードするＤＮＡの形態であっても、当該ＤＮＡを発現するベクターの形態であってもよい。
【0036】
ＲＮＡの形態を採用する場合には、その塩基配列に基づき、市販のポリヌクレオチド合成機によって化学的に合成して調製することもできる。また後述の実施例に示すとおり、インビトロ転写システムを用いて調製することもできる。
【0037】
発現ベクターの形態を採用する場合には、発現させるべきＤＮＡに作動的に結合している１つ以上の調節エレメントを含む。ここで、「作動可能に結合している」とは、調節エレメントに上記ＤＮＡが発現可能に結合していることを意味する。「調節エレメント」としては、プロモーター、エンハンサー、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、及び他の発現制御エレメント（例えば、転写終結シグナル、例えば、ポリアデニル化シグナルおよびポリＵ配列）が挙げられる。発現ベクターは、宿主ゲノムに組み込まれることなく、コードするタンパク質を安定して発現することができるものが好ましい。
【0038】
（ＴＡＬＥＮ）
本発明にかかる「ＴＡＬＥＮタンパク質」は、ＤＮＡ切断ドメイン（例えば、ＦｏｋＩドメイン）に加えて転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターのＤＮＡ結合ドメインを含む人工ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である（例えば、米国特許８４７０９７３号、米国特許８５８６３６３号）。細胞内に導入されたＴＡＬＥＮは、ＤＮＡ結合ドメインを介して標的部位に結合し、そこでＤＮＡを切断する。標的部位に結合するＤＮＡ結合ドメインは、公知のスキーム（例えば、Ｚｈａｎｇ，Ｆｅｎｇ ｅｔ． ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２９（２）に従って設計することができる。
本発明にかかる「ＴＡＬＥＮタンパク質」は、ＤＮＡ切断ドメイン（例えば、ＦｏｋＩドメイン）に加えて転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターのＤＮＡ結合ドメインを含む人工ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である（例えば、米国特許８４７０９７３号、米国特許８５８６３６３号）。細胞内に導入されたＴＡＬＥＮは、ＤＮＡ結合ドメインを介して標的部位に結合し、そこでＤＮＡを切断する。標的部位に結合するＤＮＡ結合ドメインは、公知のスキーム（例えば、Ｚｈａｎｇ，Ｆｅｎｇ ｅｔ． ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２９（２）に従って設計することができる。
【0039】
（ＺＦＮ）
本発明にかかる「ＺＦＮタンパク質」は、ジンクフィンガーアレイを含むＤＮＡ結合ドメインにコンジュゲートした核酸切断ドメインを含む人工ヌクレアーゼ（ＺＦＮ）である（例えば、米国特許６２６５１９６号、８５２４５００号、７８８８１２１号、欧州特許１７２０９９５号）。細胞内に導入されたＺＦＮタンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインを介して標的部位に結合し、そこでＤＮＡを切断する。標的部位に結合するＤＮＡ結合ドメインは、公知のスキームに従って設計することができる。
本発明にかかる「ＺＦＮタンパク質」は、ジンクフィンガーアレイを含むＤＮＡ結合ドメインにコンジュゲートした核酸切断ドメインを含む人工ヌクレアーゼ（ＺＦＮ）である（例えば、米国特許６２６５１９６号、８５２４５００号、７８８８１２１号、欧州特許１７２０９９５号）。細胞内に導入されたＺＦＮタンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインを介して標的部位に結合し、そこでＤＮＡを切断する。標的部位に結合するＤＮＡ結合ドメインは、公知のスキームに従って設計することができる。
【0040】
（ＰＰＲ）
本発明にかかる「ＰＰＲタンパク質」は、ｈｅｌｉｘ－ｌｏｏｐ－ｈｅｌｉｘ構造（ＰＰＲ；ｐｅｎｔａｔｒｉｃｏｐｅｐｔｉｄｅｒｅｐｅａｔ）を含む核酸結合ドメインにコンジュゲートした核酸切断ドメインを含む人工ヌクレアーゼである（Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ５３：１１７１－１１７９（２０１２））。細胞内に導入されたＰＰＲタンパク質は、ＰＰＲモチーフを介して標的部位に結合し、そこでＤＮＡを切断する。各種ＰＰＲモチーフとそれらが各々認識する塩基の対応関係は公知であるため、標的部位に応じ、核酸結合ドメインを設計することができる。
本発明にかかる「ＰＰＲタンパク質」は、ｈｅｌｉｘ－ｌｏｏｐ－ｈｅｌｉｘ構造（ＰＰＲ；ｐｅｎｔａｔｒｉｃｏｐｅｐｔｉｄｅｒｅｐｅａｔ）を含む核酸結合ドメインにコンジュゲートした核酸切断ドメインを含む人工ヌクレアーゼである（Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ５３：１１７１－１１７９（２０１２））。細胞内に導入されたＰＰＲタンパク質は、ＰＰＲモチーフを介して標的部位に結合し、そこでＤＮＡを切断する。各種ＰＰＲモチーフとそれらが各々認識する塩基の対応関係は公知であるため、標的部位に応じ、核酸結合ドメインを設計することができる。
【0041】
なお、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ及びＰＰＲ、これらタンパク質についても、当業者であれば、Ｃａｓタンパク質同様に、公知の手法を用いて調製することができる。
【0042】
（植物細胞）
本発明において「植物」とは特に制限はなく、例えば、双子葉植物（タバコ、シロイヌナズナ等）及び単子葉植物（イネ等）を含む被子植物、裸子植物、コケ植物、シダ植物、草本植物、並びに木本植物が挙げられる。
本発明において「植物」とは特に制限はなく、例えば、双子葉植物（タバコ、シロイヌナズナ等）及び単子葉植物（イネ等）を含む被子植物、裸子植物、コケ植物、シダ植物、草本植物、並びに木本植物が挙げられる。
【0043】
「植物細胞」としては、任意の組織中に存在する植物細胞又は任意の組織に由来する植物細胞を本発明においては対象とすることができ特に制限されない。このような組織としては、例えば、葉、根、根端、葯、花、種子、さや、茎、茎頂、胚、花粉が挙げられる。また、本発明の方法においては、人為的に処理された植物細胞（例えば、カルス、懸濁培養細胞）も対象とすることができる。また、本発明にかかる植物細胞は、細胞壁を備えるものであってもよく、さらにその細胞壁の外側にクチクラ層を備える細胞であってもよい。
【0044】
（プラズマ処理）
本発明において、「プラズマ」とは、気体を構成する分子が、電離により正（陽イオン）と負（電子）とに分かれている荷電粒子群を含み、全体として電気的にほぼ中性である粒子の集団（電離気体）を意味する。植物細胞を処理する「プラズマ」としては特に制限はなく、大気圧下で発生させるもの（大気圧プラズマ）であってもよく、また大気圧より低い圧力下で発生させるもの（低圧プラズマ）であっても良いが、発生させるために真空系を要することなく、また植物の生存環境に近いという観点から、大気圧プラズマであることが好ましい。なお、本発明において、大気圧とは、厳密に１０１３ｈＰａである必要はなく、その近傍の圧力（５００～２０３０Ｐａ）の範囲であればよい。
本発明において、「プラズマ」とは、気体を構成する分子が、電離により正（陽イオン）と負（電子）とに分かれている荷電粒子群を含み、全体として電気的にほぼ中性である粒子の集団（電離気体）を意味する。植物細胞を処理する「プラズマ」としては特に制限はなく、大気圧下で発生させるもの（大気圧プラズマ）であってもよく、また大気圧より低い圧力下で発生させるもの（低圧プラズマ）であっても良いが、発生させるために真空系を要することなく、また植物の生存環境に近いという観点から、大気圧プラズマであることが好ましい。なお、本発明において、大気圧とは、厳密に１０１３ｈＰａである必要はなく、その近傍の圧力（５００～２０３０Ｐａ）の範囲であればよい。
【0045】
大気圧プラズマを発生させる方法としては特に制限はなく、当業者であれば適宜公知の方法を用いて行うことができる。かかる公知の方法としては、例えば、誘電体バリア放電、誘導結合プラズマ放電（ＩＣＰ）、容量結合プラズマ放電（ＣＣＰ）、ホローカソード放電、コロナ放電、ストリーマ放電、グロー放電、アーク放電が挙げられる。これらの中では、比較的高いプラズマ・電子・ラジカル密度を得ることができ、かつプラズマガス温度を低く保ちやすいという観点から、グロー放電、ホロカソード放電が好ましい。
【0046】
また、放電を生じさせるための電流は、その放電の種類、その放電（ひいてはプラズマ）を発生させるための装置の大きさ及び形状、放電を生じさせるために電圧を印加する電極の大きさ及び形状等により一概には言えないが、直流であっても交流であってもよい。
【0047】
また、上述の植物細胞を処理する「プラズマ」の温度としては特に制限はなく、通常－９０～２００℃であり、好ましくは－１０～５０℃であり、より好ましくは１５～３０℃（常温）である。このような温度制御は、例えば、Ｏｓｈｉｔａ Ｔ，Ｋａｗａｎｏ Ｈ，Ｔａｋａｍａｔｓｕ Ｔ，Ｍｉｙａｈａｒａ Ｈ，Ｏｋｉｎｏ Ａ （２０１５）「温度制御可能な大気プラズマ源」ＩＥＥＥ Ｔｒａｎｓ Ｓｃｉ４３：１９８７－１９９２、特開２０１０－０６１９３８号公報等に記載の方法にて達成することができる。より具体的には、当該方法によれば、後述のプラズマを生成するために用いられるガスを、液体窒素等を用いたガス冷却装置によって低温（例えば、－１９５℃）迄冷却した後、ヒーターによって所望の温度に加熱し、プラズマ化し、更にその生成されたプラズマのガス温度をヒーターにフィードバックすることで、プラズマの温度を所望の値に１℃単位で制御することができる。
【0048】
プラズマを生成するために電圧を印加されるガスの種類としては特に制限はないが、導入効率の観点から、二酸化炭素、窒素、酸素、水素及びアルゴンから選択される少なくとも１のガスが好ましく、より好ましくは、二酸化炭素、窒素がより好ましい。また、水素及びアルゴンからなる混合ガス（体積百分率として、好ましくは０．０１～５０％水素及び９９．９９～５０％アルゴン）、窒素及び酸素からなる混合ガス（所謂、空気。体積百分率として、好ましくは９０～７０％窒素及び３０～１０％酸素）も用いられる。
【0049】
また、プラズマ発生装置に供給される前記ガスの流量は、当該装置の大きさ及び形状等、さらには試料（植物細胞）がプラズマの気流により吹き飛ぶのを避けつつ、プラズマの発生を安定させることを考慮し、当業者であれば適宜調整され得るものであり、例えば、３～５Ｌ／分が挙げられる。
【0050】
このようなプラズマを発生させる装置としては特に制限はないが、例えば、図１に示すような構成が提示される。より具体的には、プラズマを発生させることができるプラズマ発生装置１の他、プラズマを生成するために用いられるガスを該装置に供給するための装置（ガス供給部２）、前記ガスを電離させるための電力を供給する装置（電力供給部３）とを、本発明の植物細胞にゲノム編集酵素等を導入するための装置は少なくとも備えていることが好ましく、更にプラズマの温度を制御するためのガス冷却装置４及び／又は試料６（植物細胞）を載せるための台（載置台）を備えていることがより好ましい。また、図１には示していないが、ガス供給部２とプラズマ発生装置１との間に、ガス冷却装置４の代わりに、ガス冷却及びガス加温システム（ガス温度調整システム）を設けることがさらに好ましく。さらにまた、図１には示していないが、外部からの熱の流入を避けるため、ガス冷却装置４の代わりに断熱材を備えるものであってもよい。なお、プラズマ発生装置としても特に制限はなく、公知の装置を適宜用いれば良い。例えば、特開２０１５－０７２９１３号公報、特開２０１４－２１２８３９号公報、特開２０１３－２２５４２１号公報、特開２０１３－０９４４６８号公報、特開２０１２－２５６５０１号公報、特開２００８－０４１４２９号公報、特開２００９－０８２７９６号公報、特開２０１０－０６１９３８号公報において開示されている装置は、本発明において好適に用いられる。
【0051】
以上のとおりにして発生させたプラズマによる植物細胞の処理は、通常、プラズマ照射口の下に当該細胞を置きプラズマを照射することにより達成される。かかる場合、照射時間としては特に制限はなく、用いるプラズマ及び植物細胞の種類等により適宜調整され得るが、植物細胞への障害を抑えつつ、ゲノム編集酵素等の導入効率をより高めるという観点から、好ましくは０．０１～３分であり、より好ましくは１～３０秒であり、さらに好ましくは１～１０秒であり、特に好ましくは２～５秒である。
【0052】
さらに、プラズマ照射口から植物細胞までの距離としても特に制限はないが、プラズマはプラズマ発生部から離れた直後から失活を始めるので、プラズマ照射口からの距離は適切に調節されることが望ましい。当該距離は、好ましくは１～１００ｍｍ、より好ましくは５～２０ｍｍである。一方、プラズマは、ガス流として排気される必要があり、また植物細胞が吹き飛ぶのを抑えつつ、それにまんべんなく照射することも望ましい。そして、当業者であれば、用いるプラズマ装置及びそのガス流、並びに植物細胞の種類及び大きさ等を考慮し、上記観点を両立すべく適宜調整し得、例えば、プラズマ照射口から植物細胞までの距離として５～１５ｍｍ程度が挙げられる。また同観点からも、プラズマは植物細胞に直接照射することが望ましい。
【0053】
一方で、プラズマを液体中に直接導入してバブリングを行い、その液体中に植物を浸漬する、またはその液体を植物に照射、噴霧してもよい。かかるプラズマ処理は、大量の植物細胞を均一に処理する上で有用である。液体としては，水や培養液だけでなく、プラズマと相互作用して別途の活性種を生成する食塩水等を用いてもよい。液体の温度は、５～２０℃程度が望ましい。
【0054】
また、このようにしてプラズマ処理した植物細胞と、該細胞に導入するゲノム編集酵素等との接触開始時間としては、特に制限はないが、プラズマ処理による導入効率をより高めるという観点から、前記プラズマでの処理後０．０１～３０分の間であることが好ましく、０．０１～５分の間であることがより好ましい。さらに、植物細胞とゲノム編集酵素等との接触時間についても特に制限はないが、導入効率と植物細胞のその後の正常な生育の観点から、１分～３０時間であることが好ましい。
【0055】
プラズマ処理した植物細胞にゲノム編集酵素等を接触させる方法は、特に制限はなく、ゲノム編集酵素等自体をそのまま植物細胞のプラズマ接触部に添加してもよいが、導入を促進するための担体に担持、付加、混合又は含有させて添加してもよい。かかる担体としては、例えば、リポソーム等のリン脂質組成物、金属（金、タングステン等）、無機物（シリコン化合物等）から成る粒子やウイスカー、アルギン酸ビーズ、ウイルス性物質（例えばコートタンパク質）、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）が挙げられる。
【0056】
また、植物細胞とゲノム編集酵素等との接触は、ゲノム編集酵素等（又はゲノム編集酵素等と担体との混合物等）を含有する溶液に添加若しくは当溶液中に植物細胞を浸漬することでも行える。このような溶液としては、植物細胞を生存させたまま維持できるものであれば特に制限はなく、例えば、緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、リン酸緩衝液（ＮａＰＯ４及びＫＰＯ４）、ＨＥＰＥＳ緩衝液、トリス緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、クエン酸緩衝液等）、培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ＆Ｓｋｏｏｇ（ＭＳ）培地等）が挙げられる。なお、かかる緩衝液及び培地の組成は公知となっているが、本発明においては対象とする植物及び細胞の種類等に応じ、希釈して用いてもよい（例えば、１／４ＰＢＳ、１／２ＭＳ培地）。また、緩衝液及び培地のｐＨについても、対象とする植物及び細胞の種類等に応じて適宜調整することができるが、例えばｐＨ５～８、好ましくはｐＨ５．５～７である。
【0057】
溶液中のゲノム編集酵素の濃度としては、対象とする植物及び細胞等により適宜調整され得るが、通常１～１００μｇ／ｍｌであり、好ましくは１０～５０μｇ／ｍｌである。
【0058】
（２価以上の金属カチオン）
本発明において、上述のようにプラズマ処理をした植物細胞と、当該細胞にゲノム編集酵素等を導入させるための、ゲノム編集酵素等との接触は、２価以上の金属カチオンの存在下で行なわれる。
本発明において、上述のようにプラズマ処理をした植物細胞と、当該細胞にゲノム編集酵素等を導入させるための、ゲノム編集酵素等との接触は、２価以上の金属カチオンの存在下で行なわれる。
【0059】
本発明にかかる２価以上の金属カチオン（多価金属カチオン）としては、例えば、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｂａ２＋、Ｃｕ２＋及びＮｉ２＋等の２価金属カチオン；Ａｌ３＋等の３価金属カチオン；Ｃｒ６＋等の４価以上の金属カチオンが挙げられる。これらの中でも、２価金属カチオンが好ましく、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｂａ２＋がより好ましい。
【0060】
また、前述のように、植物細胞と物質との接触を溶液中にて行なう場合には、前記溶液中の多価金属カチオン濃度は、通常１～１００ｍＭであり、好ましくは２～５０ｍＭ、より好ましくは３～３０ｍＭ、さらに好ましくは５～２５ｍＭ、より好ましくは１０～２０ｍＭである。さらに、多価金属カチオンのカウンターアニオンとしては、後述の実施例に示すとおり、特に制限はないが、例えば、Ｃｌ－、ＳＯ４
２－、ＮＯ３
－が挙げられる。
【0061】
（ゲノム編集）
本発明においては、ゲノム編集酵素等が導入された植物細胞から植物体を再生させることにより、ＤＮＡが編集された植物を生産することができる。組織培養により植物の組織を再分化させて個体を得る方法としては、本技術分野において確立された方法を利用することができる（形質転換プロトコール［植物編］ 田部井豊・編 化学同人 ｐｐ．３４０－３４７（２０１２））。こうして一旦、植物体が得られれば、該植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることが可能である。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、株、カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。
本発明においては、ゲノム編集酵素等が導入された植物細胞から植物体を再生させることにより、ＤＮＡが編集された植物を生産することができる。組織培養により植物の組織を再分化させて個体を得る方法としては、本技術分野において確立された方法を利用することができる（形質転換プロトコール［植物編］ 田部井豊・編 化学同人 ｐｐ．３４０－３４７（２０１２））。こうして一旦、植物体が得られれば、該植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることが可能である。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、株、カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。
【0062】
（ゲノム編集用キット）
本発明においては、上述の方法において用いられるキットを提供することもできる。かかるキットは、２価以上の金属カチオンを含有する溶液の他、下記物質のいずれかを適宜含み得るものである。
（１）ゲノム編集酵素
（２）ゲノム編集酵素がＣａｓタンパク質である場合には、ガイドＲＮＡ、又はそれを発現するベクター
（３）プラズマ発生装置
さらに、本発明のキットには、上述の導入方法等を示した説明書が含まれる。
本発明においては、上述の方法において用いられるキットを提供することもできる。かかるキットは、２価以上の金属カチオンを含有する溶液の他、下記物質のいずれかを適宜含み得るものである。
（１）ゲノム編集酵素
（２）ゲノム編集酵素がＣａｓタンパク質である場合には、ガイドＲＮＡ、又はそれを発現するベクター
（３）プラズマ発生装置
さらに、本発明のキットには、上述の導入方法等を示した説明書が含まれる。
【実施例】
【0063】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。また本実施例は、下記方法を用いて行なった。
【0064】
＜Ｃａｓ９タンパク質＞
Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）遺伝子が挿入されているｐＰＵＲＥベクター（以下「ｐＰＵＲＥ－ＳｐＣａｓ９」とも称する）を用いて調製した。なお、このベクターは、東京大学 濡木理先生より分譲していただいたものであり、Ｃ末にＳＶ４０の核局在化シグナル（ＮＬＳ）、ＴＥＶプロテアーゼ認識配列及びヒスチジンタグが融合してあるＳｐＣａｓ９タンパク質（ＳｐＣａｓ９－ＮＬＳ－ＴＥＶ－Ｈｉｓ６、配列番号：１）をコードする。
Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）遺伝子が挿入されているｐＰＵＲＥベクター（以下「ｐＰＵＲＥ－ＳｐＣａｓ９」とも称する）を用いて調製した。なお、このベクターは、東京大学 濡木理先生より分譲していただいたものであり、Ｃ末にＳＶ４０の核局在化シグナル（ＮＬＳ）、ＴＥＶプロテアーゼ認識配列及びヒスチジンタグが融合してあるＳｐＣａｓ９タンパク質（ＳｐＣａｓ９－ＮＬＳ－ＴＥＶ－Ｈｉｓ６、配列番号：１）をコードする。
【0065】
前記ＳｐＣａｓ９タンパク質の調製において、より具体的には先ず、ｐＰＵＲＥ－ＳｐＣａｓ９を導入し、大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社より購入）を形質転換した。得られた形質転換体を、ＬＢ培地を用いて３７℃で培養し、ＯＤ６００が０．６の時点で０．１ｍＭ イソプロピル β－Ｄ－１－チオガラクトピラノシドを培地に添加し、前記ＳｐＣａｓ９タンパク質の発現誘導を行なった。その後２０℃で１２時間培養後、集菌した。集菌した菌体は、１Ｌの菌体に対し１００ｍｌの破砕バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ８．０，５００ｍＭ ＮａＣｌ，２５ｍＭ イミダゾール）に懸濁し、超音波による破砕処理に供した。得られた破砕溶液を遠心分離にかけ、その上清を、ＨｉＴｒａｐキレーテングＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社より購入）にアプライした。カラムを破砕バッファーにより洗浄後、溶出バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ８．０，５００ｍＭ ＮａＣｌ，５００ｍＭ イミダゾール）を通し、前記ＳｐＣａｓ９タンパク質を溶出した。粗精製されたＳｐＣａｓ９タンパク質を、ゲルろ過バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ８．０，３００ｍＭ ＮａＣｌ）により平衡化されたＨｉＬｏａｄ ２６／６０ セファデックス２００ｐｇ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社より購入）にアプライし、前記ＳｐＣａｓ９タンパク質が含まれるピーク画分を集め、ＶｉｖａＳｐｉｎ（登録商標） Ｔｕｒｂｏ １５，５０Ｋ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社より購入）を用いた限外ろ過により、約４ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度になるまで濃縮し、－８０℃にて保存した。
【0066】
＜ｓｇＲＮＡ＞
ｓｇＲＮＡ（Ｌ－（Ｉ－ＳｃｅＩ）－ＵＣに対するｓｇＲＮＡ、及びｐＢＩ１２１－ｓＧＦＰ－ｗＴＡＬＥＮ－ＥＬＵＣに対するｓｇＲＮＡ）は、タカラバイオ株式会社製のキット Ｇｕｉｄｅ－ｉｔＴＭ ｓｇＲＮＡ インビトロ転写及びスクリーニングシステムも用い、その添付の説明書の記載に従って調製した。
ｓｇＲＮＡ（Ｌ－（Ｉ－ＳｃｅＩ）－ＵＣに対するｓｇＲＮＡ、及びｐＢＩ１２１－ｓＧＦＰ－ｗＴＡＬＥＮ－ＥＬＵＣに対するｓｇＲＮＡ）は、タカラバイオ株式会社製のキット Ｇｕｉｄｅ－ｉｔＴＭ ｓｇＲＮＡ インビトロ転写及びスクリーニングシステムも用い、その添付の説明書の記載に従って調製した。
【0067】
具体的には先ず、Ｔ７プロモーター領域、各標的配列特異的ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ、及びスキャホールドテンプレートに相同的な配列を含む、下記フォワードプライマー（Ｉ－ＳｃｅＩ ＬＵＣ Ｇｕｉｄｅ ｉｔ及びＦＰ－Ｗｘ－ＬＵＣ Ｇｕｉｄｅ ｉｔ）を各々設計し、それらを化学合成した。
（Ｉ－ＳｃｅＩ ＬＵＣ Ｇｕｉｄｅ ｉｔ）
５’ＴＧＣＧＧＣＣＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＴＡＣＡＡＴＧＡＴＡＧＧＧＡＴＡＡＣＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡ３’（配列番号：２）
（ＧＦＰ－Ｗｘ－ＬＵＣ Ｇｕｉｄｅ ｉｔ）
５’ＴＧＣＧＧＣＣＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＴＴＡＴＡＡＧＣＡＣＡＴＡＴＣＧＣＡＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡ３’（配列番号：３）。
（Ｉ－ＳｃｅＩ ＬＵＣ Ｇｕｉｄｅ ｉｔ）
５’ＴＧＣＧＧＣＣＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＴＡＣＡＡＴＧＡＴＡＧＧＧＡＴＡＡＣＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡ３’（配列番号：２）
（ＧＦＰ－Ｗｘ－ＬＵＣ Ｇｕｉｄｅ ｉｔ）
５’ＴＧＣＧＧＣＣＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＴＴＡＴＡＡＧＣＡＣＡＴＡＴＣＧＣＡＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡ３’（配列番号：３）。
【0068】
次に、下記スキャホールドテンプレート（ｔｒａｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ、Ｇｕｉｄｅ－ｉｔ ｓｃａｆｆｏｌｄ ｔｅｍｐｌａｔｅ）を鋳型とし、前記各フォワードプライマーを用いたＰＣＲにて、インビトロ転写用の鋳型ＤＮＡ（Ｔ７プロモーター領域、各標的配列特異的ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ、及びｔｒａｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡを含むＤＮＡ）を作製した。
（Ｇｕｉｄｅ－ｉｔ ｓｃａｆｆｏｌｄ ｔｅｍｐｌａｔｅ）
５’ＧＣＡＣＣＧＡＣＴＣＧＧＴＧＣＣＡＣＴＴＴＴＴＣＡＡＧＴＴＧＡＴＡＡＣＧＧＡＣＴＡＧＣＣＴＴＡＴＴＴＴＡＡＣＴＴＧＣＴＡＴＴＴＣＴＡＧＣＴＣＴＡＡＡＡＣ３’（配列番号：４）。
（Ｇｕｉｄｅ－ｉｔ ｓｃａｆｆｏｌｄ ｔｅｍｐｌａｔｅ）
５’ＧＣＡＣＣＧＡＣＴＣＧＧＴＧＣＣＡＣＴＴＴＴＴＣＡＡＧＴＴＧＡＴＡＡＣＧＧＡＣＴＡＧＣＣＴＴＡＴＴＴＴＡＡＣＴＴＧＣＴＡＴＴＴＣＴＡＧＣＴＣＴＡＡＡＡＣ３’（配列番号：４）。
【0069】
そして、前記各鋳型ＤＮＡ及びＴＯＹＯＢＯ社製のＳｃｒｉｐｔＭＡＸ（登録商標） Ｔｈｅｒｍｏ Ｔ７転写キットを用い、各ｓｇＲＮＡを調製した。
【0070】
＜Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ複合体＞
１ｘＮＥＢ３バッファーに、前記ＳｐＣａｓ９タンパク質及びｓｇＲＮＡを質量比５：１になるように添加して、氷上で３０分インキュベートし、これらの複合体を形成させた。
１ｘＮＥＢ３バッファーに、前記ＳｐＣａｓ９タンパク質及びｓｇＲＮＡを質量比５：１になるように添加して、氷上で３０分インキュベートし、これらの複合体を形成させた。
【0071】
（プラズマ処理）
プラズマ処理は、Ｔａｋａｍａｔｓｕ Ｔ，Ｈｉｒａｉ Ｈ，Ｓａｓａｋｉ Ｒ，Ｍｉｙａｈａｒａ Ｈ，Ｏｋｉｎｏ Ａ （２０１３）「大気ダメージフリーマルチガスプラズマジェット源を用いた、ポリイミドフィルムの表面親水化」ＩＥＥＥ Ｔｒａｎｓ．Ｐｌａｓｍａ Ｓｃｉ ４１：１１９－１２５、及び、Ｏｓｈｉｔａ Ｔ，Ｋａｗａｎｏ Ｈ，Ｔａｋａｍａｔｓｕ Ｔ，Ｍｉｙａｈａｒａ Ｈ，Ｏｋｉｎｏ Ａ （２０１５）「温度制御可能な大気プラズマ源」ＩＥＥＥ Ｔｒａｎｓ Ｓｃｉ４３：１９８７－１９９２に記載の方法に沿って行った。
プラズマ処理は、Ｔａｋａｍａｔｓｕ Ｔ，Ｈｉｒａｉ Ｈ，Ｓａｓａｋｉ Ｒ，Ｍｉｙａｈａｒａ Ｈ，Ｏｋｉｎｏ Ａ （２０１３）「大気ダメージフリーマルチガスプラズマジェット源を用いた、ポリイミドフィルムの表面親水化」ＩＥＥＥ Ｔｒａｎｓ．Ｐｌａｓｍａ Ｓｃｉ ４１：１１９－１２５、及び、Ｏｓｈｉｔａ Ｔ，Ｋａｗａｎｏ Ｈ，Ｔａｋａｍａｔｓｕ Ｔ，Ｍｉｙａｈａｒａ Ｈ，Ｏｋｉｎｏ Ａ （２０１５）「温度制御可能な大気プラズマ源」ＩＥＥＥ Ｔｒａｎｓ Ｓｃｉ４３：１９８７－１９９２に記載の方法に沿って行った。
【0072】
より具体的には、図１に示すとおり、プラズマ発生装置（株式会社プラズマコンセプト東京社製、ダメージフリーマルチガスプラズマジェット（ダメージフリープラズマ（日本登録商標第５４０９０７３号）、マルチガスプラズマ（（日本登録商標５４３２５８５号）、製品番号：ＰＣＴ－ＤＦＭＪ０２））の装置本体を接地し、装置本体より、所定の高電圧をプラズマ発生部の内部高圧電極を供給した。所定の高電圧とは、１０～３０ｋＨｚ及び最大９ｋＶの変調された交流電圧であり、こうした電力がプラズマ発生部に供給され、グロー放電を発生させ、さらに二酸化炭素又は窒素をガス種として、５Ｌ／分の流速にて１ｍｍ穴に通すことにより、安定した大気圧プラズマを生成した。
【0073】
なお、このようにして生成されたプラズマの温度（プラズマ照射口から５ｍｍの所の温度）は、熱電対測定の結果、５０℃以下であった。より低温（約１５～３０℃）のプラズマを生成するため、液体窒素を用いた気体冷却装置により気体を冷却した。
【0074】
そして、後述のとおり、植物組織直上５ｍｍの所に照射口を設置し、プラズマ処理を直接５秒間施した。その後、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ複合体又はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む下記導入用培地又はリン酸緩衝生理食塩水（１／４ ＰＢＳ）を、当該植物組織に接触させた。
【0075】
＜Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ導入用溶液＞
１～２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＭｇＳＯ４、又は他の２価のカチオン（ＭｎＣｌ２、ＺｎＣｌ２、ＣａＣｌ２、ＢａＣｌ２）を１０ｍＭとなるように加えた、１／２ ＭＳ液体培地［１／２袋／ＬのＭｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ ｐｌａｎｔ ｓａｌｔ ｍｉｘｔｕｒｅ（Ｗａｋｏ社製），ｐＨ５．８］又は１／４ ＰＢＳに、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡあるいはＢＳＡを、それぞれタンパク質量が５０μｇ／ｍｌとなるように添加し、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ導入用培地を調製した。
１～２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＭｇＳＯ４、又は他の２価のカチオン（ＭｎＣｌ２、ＺｎＣｌ２、ＣａＣｌ２、ＢａＣｌ２）を１０ｍＭとなるように加えた、１／２ ＭＳ液体培地［１／２袋／ＬのＭｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ ｐｌａｎｔ ｓａｌｔ ｍｉｘｔｕｒｅ（Ｗａｋｏ社製），ｐＨ５．８］又は１／４ ＰＢＳに、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡあるいはＢＳＡを、それぞれタンパク質量が５０μｇ／ｍｌとなるように添加し、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ導入用培地を調製した。
【0076】
＜イネカルス＞
Ｌ－（Ｉ－ＳｃｅＩ）－ＵＣ及びＮＰＴＩＩ発現コンストラクトを有するバイナリーベクター（以下「ｐＺＫ－Ｌ－Ｉ－ＳｃｅＩ－ＵＣ」とも称する。配列番号：５に記載のＤＮＡ配列からなる）にて形質転換したアグロバクテリウムを調製した。そして、Ｓａｉｋａ ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．（２０１２）：６７－７４に記載の方法に基づいて、前記アグロバクテリウムをイネカルスに感染させ、Ｇ４１８により、形質転換カルスを選抜した。
Ｌ－（Ｉ－ＳｃｅＩ）－ＵＣ及びＮＰＴＩＩ発現コンストラクトを有するバイナリーベクター（以下「ｐＺＫ－Ｌ－Ｉ－ＳｃｅＩ－ＵＣ」とも称する。配列番号：５に記載のＤＮＡ配列からなる）にて形質転換したアグロバクテリウムを調製した。そして、Ｓａｉｋａ ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．（２０１２）：６７－７４に記載の方法に基づいて、前記アグロバクテリウムをイネカルスに感染させ、Ｇ４１８により、形質転換カルスを選抜した。
【0077】
なお、Ｌ－（Ｉ－ＳｃｅＩ）－ＵＣにおいては、図２に示すとおり、ルシフェラーゼ遺伝子の開始コドン直後に、Ｉ－ＳｃｅＩの認識配列が挿入されており、また当該認識配列には前記開始コドンと読み取り枠の合った終止コドンが存在している。そのため、このレポーター遺伝子は通常ルシフェラーゼタンパク質を発現させることができない。一方、前記認識配列が、それを認識するＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ（図３ 参照）によって切断され、フレームシフトが生じるように修復（ゲノム編集）された場合、１塩基欠失、２塩基挿入等により、ルシフェラーゼタンパク質の発現が可能となる。
【0078】
＜イネカルスへのプラズマ処理とゲノム編集＞
レポーター遺伝子系（Ｌ－（Ｉ－ＳｃｅＩ）－ＵＣ）を発現するイネカルスを、クリーンベンチ内で、ＣＯ２プラズマ又はＮ２プラズマを５秒間照射した。そして、前記プラズマ照射後のイネカルスを、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ導入用溶液に浸し、室温で１日置いた後、各ウェルに２．５ｍｌ Ｎ６ｄゲルライト培地が入っている１２ウェルプレートに移して、明１６時間、暗８時間、２８℃の人工気象器で２～５日間培養した。なお、Ｎ６ｄゲルライト培地は、ＮＡＡ ０．１ｍｇ／Ｌ、ショ糖 ３０ｇ／Ｌ、ゲルライト ４ｇ／Ｌを含むＮ６ｄ培地［１ｘＣｈｕ（Ｎ６９）ｍｅｄｉｕｍ ｓａｌｔ ｍｉｘｔｕｒｅ，Ｗａｋｏ社製 １袋／Ｌ），グリシン ２ｍｇ／Ｌ、ニコチン酸 ０．５ｍｇ／Ｌ、塩酸ピリドキシン ０．５ｍｇ／Ｌ、塩酸チアミン １ｍｇ／Ｌ、Ｌ－プロリン ２．８７８ｇ／Ｌ、カザミノ酸 ０．３ｇ／Ｌ，ｐＨ５．８）である。
レポーター遺伝子系（Ｌ－（Ｉ－ＳｃｅＩ）－ＵＣ）を発現するイネカルスを、クリーンベンチ内で、ＣＯ２プラズマ又はＮ２プラズマを５秒間照射した。そして、前記プラズマ照射後のイネカルスを、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ導入用溶液に浸し、室温で１日置いた後、各ウェルに２．５ｍｌ Ｎ６ｄゲルライト培地が入っている１２ウェルプレートに移して、明１６時間、暗８時間、２８℃の人工気象器で２～５日間培養した。なお、Ｎ６ｄゲルライト培地は、ＮＡＡ ０．１ｍｇ／Ｌ、ショ糖 ３０ｇ／Ｌ、ゲルライト ４ｇ／Ｌを含むＮ６ｄ培地［１ｘＣｈｕ（Ｎ６９）ｍｅｄｉｕｍ ｓａｌｔ ｍｉｘｔｕｒｅ，Ｗａｋｏ社製 １袋／Ｌ），グリシン ２ｍｇ／Ｌ、ニコチン酸 ０．５ｍｇ／Ｌ、塩酸ピリドキシン ０．５ｍｇ／Ｌ、塩酸チアミン １ｍｇ／Ｌ、Ｌ－プロリン ２．８７８ｇ／Ｌ、カザミノ酸 ０．３ｇ／Ｌ，ｐＨ５．８）である。
【0079】
＜タバコの葉＞
タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ｃｖ．Ｓａｍｓｕｎ ＮＮ）は、その種子を土に播種し、２５℃、明１６時間／暗８時間サイクル下で栽培した。そして、播種後４～８週間の葉（成熟葉）に、Ｍｉｔｓｕｈａｒａ ｅｔ ａｌ.Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９９６）３７：４９－５９及びＨｏｒｓｃｈ ｅｔ ａｌ.Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８５）２２７：１２２９－１２３１に記載の方法にて、ｐＢＩ１２１－ｓＧＦＰ－ｗＴＡＬＥＮ－ＥＬＵＣを導入し、形質転換体を作出した。
タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ｃｖ．Ｓａｍｓｕｎ ＮＮ）は、その種子を土に播種し、２５℃、明１６時間／暗８時間サイクル下で栽培した。そして、播種後４～８週間の葉（成熟葉）に、Ｍｉｔｓｕｈａｒａ ｅｔ ａｌ.Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９９６）３７：４９－５９及びＨｏｒｓｃｈ ｅｔ ａｌ.Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８５）２２７：１２２９－１２３１に記載の方法にて、ｐＢＩ１２１－ｓＧＦＰ－ｗＴＡＬＥＮ－ＥＬＵＣを導入し、形質転換体を作出した。
【0080】
ｐＢＩ１２１－ｓＧＦＰ－ｗＴＡＬＥＮ－ＥＬＵＣが有するレポーター遺伝子系（ｐｓＧＦＰ－ｗＴＡＬＥＮ－ＥＬＵＣ（配列番号：１１に記載のＤＮＡ配列からなる）においては、緑色蛍光タンパク質（ｓＧＦＰ）とルシフェラーゼ遺伝子（ＥＬＵＣ）とが、スペーサー領域を介して配置されている、スペーサー領域には一部改変したイネのＷａｘｙ遺伝子の断片が挿入されており、かつ、ｓＧＦＰ遺伝子のコード領域とＥＬＵＣ遺伝子のコード領域の読み取り枠があえて異なるように配置されている。そのため、図６に示すとおり、スペーサー配列部分において終止コドンが出現するため、このレポーター遺伝子系から転写されたｍＲＮＡからの翻訳は、ｓＧＦＰ遺伝子部分を翻訳したところで終結し、ルシフェラーゼタンパク質は発現しない。一方、スペーサー領域が、それを認識するＣａｓ９／ｓｇＲＮＡによって切断され、フレームシフトが生じるように修復（ゲノム編集）された場合、１塩基欠失、２塩基挿入等により、ルシフェラーゼタンパク質の発現が可能となる。
【0081】
＜タバコ葉へのプラズマ処理＞
プラズマ照射のために、前記タバコの葉を７０％エタノール、１％次亜塩素酸ナトリウムで表面殺菌したのち、約１．５～２ｃｍの四角片になるようペーパータオル上で切断し、１／２ ＭＳ寒天プレートに並べ、室温で１日置いた。この葉にＣＯ２プラズマ又はＮ２プラズマを５秒間照射した。そして、前記プラズマ照射後のタバコの葉を、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ導入用溶液に浸し、室温で１日置いたのち、３０ｇ ショ糖及び５０μｇ／ｍｌ カナマイシンを含むカルス形成培地［１ｘＭｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ（ＭＳ）、１ｘＭＳビタミン（０．１μｇ／ｍｌ 塩酸チアミン，０．５μｇ／ｍｌ ピリドキシン塩酸塩，０．５μｇ／ｍｌ ニコチンアミド，２μｇ／ｍｌ グリシン，１００μｇ／ｍｌ ｍｙｏ－イノシトール），０．１μｇ／ｍｌ α－ナフタレン酢酸，１μｇ／ｍｌ ６－ベンジルアミノプリン，８．５ｇ／Ｌアガー，ｐＨ８．５］上に並べ、２８℃、１６時間明期／８時間暗期サイクル下に２日間置いた。１枚の葉を４つに切り分けて、再び３０ｇ ショ糖を含むカルス形成培地に並べ、２８℃、１６時間明期／８時間暗期サイクル下に３日間置いた。
プラズマ照射のために、前記タバコの葉を７０％エタノール、１％次亜塩素酸ナトリウムで表面殺菌したのち、約１．５～２ｃｍの四角片になるようペーパータオル上で切断し、１／２ ＭＳ寒天プレートに並べ、室温で１日置いた。この葉にＣＯ２プラズマ又はＮ２プラズマを５秒間照射した。そして、前記プラズマ照射後のタバコの葉を、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ導入用溶液に浸し、室温で１日置いたのち、３０ｇ ショ糖及び５０μｇ／ｍｌ カナマイシンを含むカルス形成培地［１ｘＭｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ（ＭＳ）、１ｘＭＳビタミン（０．１μｇ／ｍｌ 塩酸チアミン，０．５μｇ／ｍｌ ピリドキシン塩酸塩，０．５μｇ／ｍｌ ニコチンアミド，２μｇ／ｍｌ グリシン，１００μｇ／ｍｌ ｍｙｏ－イノシトール），０．１μｇ／ｍｌ α－ナフタレン酢酸，１μｇ／ｍｌ ６－ベンジルアミノプリン，８．５ｇ／Ｌアガー，ｐＨ８．５］上に並べ、２８℃、１６時間明期／８時間暗期サイクル下に２日間置いた。１枚の葉を４つに切り分けて、再び３０ｇ ショ糖を含むカルス形成培地に並べ、２８℃、１６時間明期／８時間暗期サイクル下に３日間置いた。
【0082】
＜ゲノム編集の判定＞
ゲノム編集された組織の選別はルシフェラーゼ活性を指標に行なった。具体的には、１ｍＭ ルシフェリンを含むリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を各組織にスプレーし、化学発光検出システム（富士写真フィルム社製、ＬＡＳ－３０００）でルシフェラーゼ活性を検出した。
ゲノム編集された組織の選別はルシフェラーゼ活性を指標に行なった。具体的には、１ｍＭ ルシフェリンを含むリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を各組織にスプレーし、化学発光検出システム（富士写真フィルム社製、ＬＡＳ－３０００）でルシフェラーゼ活性を検出した。
【0083】
（実施例１） イネカルスへのプラズマによるＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ複合体の導入
図２に示すレポーター遺伝子が導入されたイネカルスに、プラズマを照射することによって、図３に示すＣａｓ９タンパク質とｓｇＲＮＡとの複合体を導入し、ゲノム編集の検出を試みた。
図２に示すレポーター遺伝子が導入されたイネカルスに、プラズマを照射することによって、図３に示すＣａｓ９タンパク質とｓｇＲＮＡとの複合体を導入し、ゲノム編集の検出を試みた。
【0084】
その結果、図４に示すとおり、従前のプラズマ処理による物質導入法（特許文献１に記載の方法）では、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ複合体導入によるゲノム編集を検出することができなかった（図４の上から３段目の３写真 参照のほど）。一方、プラズマ照射後に１０ｍＭ Ｍｇ２＋添加１／４ ＰＢＳ又は１／２ＭＳ培地にて、イネカルスとＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ複合体とを接触させた結果、ゲノム編集が効率良く生じ得ることが明らかとなった（図４の上から１段目の３写真 参照のほど）。
【0085】
また図５に示すとおり、Ｍｇ２＋に対する対イオンの種類（Ｃｌ－、ＳＯ４
２－）を変更しても、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ複合体との接触における培地に、Ｍｇ２＋（１～２０ｍＭ）を添加させていれば、ゲノム編集が可能であることも明らかとなった。さらに、ＭｇＣｌ２の添加濃度が高い方が陰性対照との差が明確となる傾向にあった。
【0086】
なお、図には示さないが、プラズマ照射後、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ導入用溶液に浸した後、ニュートラルレッド染色による生死判定を行なった結果、前記溶液中へのＭｇ２＋添加の有無に関わらず、イネカルスの生存が確認され、障害をもたらすことなく、ゲノム編集を生じさせることができることが明らかとなった。
【0087】
（実施例２） タバコの葉へのプラズマによるＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ複合体の導入
図６に示すレポーター遺伝子が導入されたタバコの葉に、プラズマを照射することによって、Ｃａｓ９タンパク質とｓｇＲＮＡとの複合体を導入し、図７に示す方法にて、ゲノム編集の検出を試みた。
図６に示すレポーター遺伝子が導入されたタバコの葉に、プラズマを照射することによって、Ｃａｓ９タンパク質とｓｇＲＮＡとの複合体を導入し、図７に示す方法にて、ゲノム編集の検出を試みた。
【0088】
その結果、図８に示すとおり、前述のイネカルス同様、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ複合体との接触における培地に、Ｍｇ２＋（１～２０ｍＭ）を添加させていれば、Ｍｇ２＋に対する対イオンの種類（Ｃｌ－、ＳＯ４
２－）に係らず、タバコの葉においてもゲノム編集が可能であることも明らかとなった。
【0089】
さらに、Ｍｇ２＋以外の２価の金属カチオン（Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｂａ２＋）であっても、プラズマ処理によるゲノム編集が可能であることも明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【0090】
以上説明したように、本発明によれば、Ｃａｓタンパク質等のゲノム編集酵素を、プラズマ処理により、植物細胞に導入し、ゲノム編集を生じさせることが可能となる。また本発明によれば、植物細胞に、その由来とする植物及び組織の種類を問わず、障害をもたらすことなく、ゲノム編集酵素を簡便に導入し、ゲノム編集を生じさせることが可能となる。
【0091】
したがって、本発明の方法によれば、ゲノム編集を通して、単に内在性遺伝子に変異が導入され、外来遺伝子を保持しない新たな細胞や品種を、効率良く作成することが可能となる。植物細胞等の表現型の変化により、変異が導入された内在性遺伝子の機能を解析できるため、基礎研究において非常に有用である。また、ゲノム編集により新たな機能が付加された植物細胞は、バイオマス、機能性食材、医薬品材料等の生産・開発の場としても非常に有用であるため、本発明は、様々な産業用途においても多大な貢献をもたらすものである。
【符号の説明】
【0092】
１…プラズマ発生装置、２…ガス供給部、３…電力供給部、４…ガス冷却装置、５…プラズマ、６…試料。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】