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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-03-13
(45)【発行日】2024-03-22
(54)【発明の名称】膵癌細胞浸潤転移阻害剤
(51)【国際特許分類】
A61K 31/713 20060101AFI20240314BHJP
A61P 35/04 20060101ALI20240314BHJP
A61P 1/18 20060101ALI20240314BHJP
A61K 9/14 20060101ALI20240314BHJP
【ＦＩ】
A61K31/713 ZNA
A61P35/04
A61P1/18
A61K9/14
【請求項の数】
4
(21)【出願番号】P 2019157249
(22)【出願日】2019-08-29
(65)【公開番号】P2021031484
(43)【公開日】2021-03-01
【審査請求日】2022-08-24
(73)【特許権者】
【識別番号】504174180
【氏名又は名称】国立大学法人高知大学
(74)【代理人】
【識別番号】110002837
【氏名又は名称】弁理士法人アスフィ国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】谷内 恵介
【審査官】柴原 直司
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１６－２１４２３９（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１５－２２７２９２（ＪＰ，Ａ）
【文献】Oncotarget，2017年，8, [60]，p.101130-101145
【文献】Mol. Oncol.，2018年11月15日，13, [2]，p.212-227
【文献】Cancer Biomark.，2015年，15, [5]，p.575-581
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ４５／００
Ａ６１Ｋ ３１／００－３１／８０
Ａ６１Ｐ ３５／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＫＨ型スプライシング調節タンパク質ＲＮＡおよび／またはＫＨ型スプライシング調節タンパク質結合性ｓｎｏＲＮＡをノックダウンする化合物を有効成分として含み、上記ＫＨ型スプライシング調節タンパク質ＲＮＡをノックダウンする化合物が、上記ＫＨ型スプライシング調節タンパク質ＲＮＡに結合するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡであり、
上記ＫＨ型スプライシング調節タンパク質結合性ｓｎｏＲＮＡをノックダウンする化合物が、上記ＫＨ型スプライシング調節タンパク質結合性ｓｎｏＲＮＡである、ＳＮＯＲＡ１８またはＳＮＯＲＡ２２に結合するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡであることを特徴とする膵癌細胞浸潤転移阻害剤。
【請求項2】
上記化合物が、上記ＫＨ型スプライシング調節タンパク質結合性ｓｎｏＲＮＡに対するｓｉＲＮＡである請求項１に記載の膵癌細胞浸潤転移阻害剤。
【請求項3】
上記化合物を含むナノ粒子を含む請求項１または２に記載の膵癌細胞浸潤転移阻害剤。
【請求項4】
上記ＫＨ型スプライシング調節タンパク質結合性ｓｎｏＲＮＡがＳＮＯＲＡ１８である請求項１～３のいずれかに記載の膵癌細胞浸潤転移阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、膵癌細胞の浸潤や転移を有効に抑制できる膵癌細胞浸潤転移阻害剤に関するものである。
【背景技術】
【0002】
「腫瘍」とは異常に増殖した細胞を指し、その異常増殖の原因が消失あるいは取り除かれても細胞の増殖が持続する状態をいう。腫瘍の中でも良性腫瘍は腫瘍の増殖が遅く、転移はしない。よって、一般的には切除すれば問題は無く、たとえ切除せずに放置しておいても命に別状はないといえる。一方、悪性腫瘍、即ちがんは、良性腫瘍とは異なり急速に増殖する上に、リンパ節や他の臓器に転移して増殖する。よって、例えば外科的手術により除去しても、僅かにでも残留したがん細胞や、既にリンパ節や他の臓器に転移していたがん細胞が再び増殖を開始することがある。よって、がんはいったん治療が終了した後の予後が悪く、各がんにおいては５年後生存率が調査されており、一般的に、治療によりがんが消失したとされてから５年経過後までに再発がない場合がようやく治癒と見なされる。
【0003】
膵癌は、がんの中で最も予後が悪いといわれている。その原因としては、膵臓が後腹膜臓器であるために早期発見が困難であることに加え、膵癌細胞の運動性が極めて高いため、例えば２ｃｍ以下の小さながんであっても、周囲の血管、胆管、神経などへすぐに浸潤し、また、近くのリンパ節に転移したり、肝臓などへ遠隔転移したりすることが挙げられる。
【0004】
上記のとおり、がんが悪性の腫瘍である所以は、特に他組織へ浸潤や転移することにあり、浸潤転移さえしなければ予後も良好なものになると考えられる。本発明者は、特に浸潤転移し易く予後の悪い膵癌の細胞の浸潤転移機構につき研究を進めてきた。
【0005】
例えば本発明者は、ヒトインスリン様成長因子２ｍＲＮＡ結合タンパク質３（ＩＧＦ２ＢＰ３）が膵癌細胞の浸潤転移に大きく関わっており、その部分ペプチドが膵癌細胞浸潤転移抑制ワクチンの有効成分として使用できること（特許文献１）や、膵癌細胞の細胞膜突起中のＩＧＦ２ＢＰ３に結合する特定のｍＲＮＡの翻訳を阻害するＲＮＡが膵癌細胞浸潤転移阻害剤の有効成分として使用できること（特許文献２）を見出している。また、膵癌細胞の細胞膜突起に集積するＲＮＡであって、エクソソームにより膵癌細胞外へ放出されるもの（特許文献３）や、膵癌細胞の細胞膜突起に集積する特定の糖タンパク質（特許文献４）が膵癌マーカーとして用いられ得ることを見出している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【文献】特開２０１５－２２７２９２号公報
【文献】国際公開第２０１６／００２８４４号パンフレット
【文献】特開２０１６－２１４２３９号公報
【文献】国際公開第２０１７／０９８９１５号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
上述したように、本発明者は膵癌細胞の浸潤転移機構やその阻害方法などにつき研究を続けているが、ある統計では、膵癌はがんで死亡したケースの中で４番目に多いがんであり、有効な治療手段が依然として切望されている。
そこで本発明は、膵癌細胞の浸潤や転移を有効に抑制できる膵癌細胞浸潤転移阻害剤を提供することを目的とする。
そこで本発明は、膵癌細胞の浸潤や転移を有効に抑制できる膵癌細胞浸潤転移阻害剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、ＫＨ型スプライシング調節タンパク質が膵癌細胞の浸潤転移に関与しており、ＫＨ型スプライシング調節タンパク質ＲＮＡおよび／またはＫＨ型スプライシング調節タンパク質に結合するｓｎｏＲＮＡをノックダウンすることにより膵癌細胞の浸潤転移を有効に抑制できることを見出して、本発明を完成した。
以下、本発明を示す。
以下、本発明を示す。
【0009】
［１］ ＫＨ型スプライシング調節タンパク質ＲＮＡおよび／またはＫＨ型スプライシング調節タンパク質結合性ｓｎｏＲＮＡをノックダウンする化合物を有効成分として含むことを特徴とする膵癌細胞浸潤転移阻害剤。
［２］ 上記化合物が、上記ＫＨ型スプライシング調節タンパク質結合性ｓｎｏＲＮＡに対するｓｉＲＮＡである上記［１］に記載の膵癌細胞浸潤転移阻害剤。
［３］ 上記化合物を含むナノ粒子を含む上記［１］または［２］に記載の膵癌細胞浸潤転移阻害剤。
［４］ 上記ＫＨ型スプライシング調節タンパク質結合性ｓｎｏＲＮＡが、ＳＮＯＲＡ１８およびＳＮＯＲＡ２２の少なくとも一方である上記［１］～［３］のいずれかに記載の膵癌細胞浸潤転移阻害剤。
［５］ 上記ＫＨ型スプライシング調節タンパク質結合性ｓｎｏＲＮＡがＳＮＯＲＡ１８である上記［１］～［３］のいずれかに記載の膵癌細胞浸潤転移阻害剤。
［２］ 上記化合物が、上記ＫＨ型スプライシング調節タンパク質結合性ｓｎｏＲＮＡに対するｓｉＲＮＡである上記［１］に記載の膵癌細胞浸潤転移阻害剤。
［３］ 上記化合物を含むナノ粒子を含む上記［１］または［２］に記載の膵癌細胞浸潤転移阻害剤。
［４］ 上記ＫＨ型スプライシング調節タンパク質結合性ｓｎｏＲＮＡが、ＳＮＯＲＡ１８およびＳＮＯＲＡ２２の少なくとも一方である上記［１］～［３］のいずれかに記載の膵癌細胞浸潤転移阻害剤。
［５］ 上記ＫＨ型スプライシング調節タンパク質結合性ｓｎｏＲＮＡがＳＮＯＲＡ１８である上記［１］～［３］のいずれかに記載の膵癌細胞浸潤転移阻害剤。
【発明の効果】
【0010】
本発明に係るＫＨ型スプライシング調節タンパク質（ＫＨＳＲＰ）は、従来、核内でのスプライシングや細胞質内でのｍＲＮＡの局在化と分解など、様々な細胞プロセスに関与するＲＮＡ結合性タンパク質であることが知られていたが、この度、本発明者は、ＫＨＳＲＰが膵癌細胞の細胞膜突起（葉状仮足）中にも局在し、膵癌細胞の運動性に関与していることを明らかにし、更にＫＨＳＲＰ自体のＲＮＡまたはＫＨＳＲＰ結合性ｓｎｏＲＮＡをノックダウンすることにより膵癌細胞の浸潤転移を抑制できることを見出した。よって本発明は、膵癌細胞の浸潤転移を抑制できるものとして、非常に有用なものである。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図2】図２は、ＫＨＳＲＰ－ｓｉＲＮＡ Ｓ２－０１３株細胞（ｓｉＫＨ－１とｓｉＫＨ－２）とコントロールｓｉＲＮＡ Ｓ２－０１３株細胞（Ｓｃｒ－１とＳｃｒ－２）のトランスウェル運動性アッセイおよびマトリゲル浸潤アッセイの結果を示すグラフである。
【図4】図４は、ヒト膵癌細胞Ｓ２－０１３株におけるＫＨＳＲＰ、ＳＮＯＲＡ１８、ＳＮＯＲＡ２２、ユビキチンＣ ｍＲＮＡの存在部分を示す蛍光標識写真である。矢印は、細胞膜突起中にＫＨＳＲＰと結合して局在するＳＮＯＲＡ１８とＳＮＯＲＡ２２を示す。
【図5】図５は、ＫＨＳＲＰのｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡを導入したＳ２－０１３株細胞（ｓｉＫＨ－１）とコントロールｓｉＲＮＡ Ｓ２－０１３株細胞（Ｓｃｒ－１）の共焦点顕微鏡写真である。矢印は、内部にアクチンが重合している細胞膜突起を示す。
【図6】図６は、ｍｙｃタグＫＨＳＲＰ回復コンストラクトまたはモックコントロールベクターをコントロールｓｉＲＮＡ細胞またはＫＨＳＲＰ－ｓｉＲＮＡ細胞に導入したＳ２－０１３株細胞で細胞膜突起を有するものを計数した結果を示すグラフである。
【図7】図７は、コントロールｓｉＲＮＡを導入したＳ２－０１３株細胞（Ｓｃｒ）と、ＳＮＯＲＡ１８ ｓｉＲＮＡを導入したＳ２－０１３株細胞（ｓｉ－ｓｎｏｒａ１８）の共焦点顕微鏡写真である。矢印は、内部にアクチンが重合している細胞膜突起を示す。
【図8】図８は、コントロールｓｉＲＮＡを導入したＳ２－０１３株細胞（Ｓｃｒ）と、ＳＮＯＲＡ２２ ｓｉＲＮＡを導入したＳ２－０１３株細胞（ｓｉ－ｓｎｏｒａ２２）の共焦点顕微鏡写真である。矢印は、内部にアクチンが重合している細胞膜突起を示す。
【図9】図９は、コントロールｓｉＲＮＡを導入したＳ２－０１３株細胞、ＳＮＯＲＡ１８ ｓｉＲＮＡを導入したＳ２－０１３株細胞、およびＳＮＯＲＡ２２ ｓｉＲＮＡを導入したＳ２－０１３株細胞で細胞膜突起を有するものを計数した結果を示すグラフである。
【図10】図１０は、コントロールｓｉＲＮＡを導入したＳ２－０１３株細胞およびＰＡＮＣ－１株細胞、ＳＮＯＲＡ１８ ｓｉＲＮＡを導入したＳ２－０１３株細胞およびＰＡＮＣ－１株細胞、並びにＳＮＯＲＡ２２ ｓｉＲＮＡを導入したＳ２－０１３株細胞およびＰＡＮＣ－１株細胞のトランスウェル運動性アッセイの結果を示すグラフである。
【図11】図１１は、コントロールｓｉＲＮＡを導入したＳ２－０１３株細胞およびＰＡＮＣ－１株細胞、ＳＮＯＲＡ１８ ｓｉＲＮＡを導入したＳ２－０１３株細胞およびＰＡＮＣ－１株細胞、並びにＳＮＯＲＡ２２ ｓｉＲＮＡを導入したＳ２－０１３株細胞およびＰＡＮＣ－１株細胞のマトリゲル浸潤アッセイの結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0012】
本発明に係る膵癌細胞浸潤転移阻害剤は、ＫＨ型スプライシング調節タンパク質ＲＮＡおよび／またはＫＨ型スプライシング調節タンパク質結合性ｓｎｏＲＮＡをノックダウンする化合物を有効成分として含む。
【0013】
ＫＨ型スプライシング調節タンパク質（ＫＨＳＲＰ：ＫＨ－ｔｙｐｅ Ｓｐｌｉｃｉｎｇ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ）は、ｍＲＮＡのＡＵ－ｒｉｃｈ ｅｌｅｍｅｎｔ（ＡＲＥ）を認識する４つの隣接するＫ ｈｏｍｏｌｏｇｙ（ＫＨ）モチーフを含む一本鎖核酸結合性タンパク質であり、核内や細胞質顆粒中に存在し、ｍＲＮＡのスプライシング、編集、局在、分解などに関与することが知られている。本発明者は、ＫＨＳＲＰが膵癌細胞の細胞膜突起中にも局在し、膵癌細胞の浸潤転移を促進することを見出し、更にＫＨＳＲＰ自体のＲＮＡおよび／またはＫＨＳＲＰに結合するｓｎｏＲＮＡをノックダウンすることにより膵癌細胞の浸潤転移を抑制できることを見出した。
【0014】
ＫＨＳＲＰのアミノ酸配列を配列番号１に、ＫＨＳＲＰの遺伝子の塩基配列を配列番号２に示す。配列番号２の塩基配列中、第１１１～第２２４６位がコーディング領域である。
【0015】
ＫＨＳＲＰ ＲＮＡをノックダウンする化合物は、ＫＨＳＲＰをノックダウンできるものであれば特に制限されないが、例えば、ＫＨＳＲＰ ＲＮＡの一部に結合するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡが挙げられる。ＫＨＳＲＰ ＲＮＡに結合するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡは、ＫＨＳＲＰ ＲＮＡの切断を誘導する。これらＲＮＡは、細胞内に導入されても染色体内に組み込まれず変異を起こさないことから比較的安全である。また、ｓｉＲＮＡは化学合成が比較的容易であり、二本鎖状態では安定である。
【0016】
ｓｉＲＮＡは、標的ＲＮＡの部分塩基配列と相同なセンスＲＮＡと、当該センスＲＮＡとハイブリダイズ可能なアンチセンスＲＮＡがハイブリダイズした２１～２３塩基対の二本鎖ＲＮＡであり、通常、３’末端はＯＨのままである一方で５’末端がリン酸化され、３’末端側は１塩基以上、４塩基以下突出していてもよい。ｓｉＲＮＡには特異的なタンパク質が結合し、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ－Ｉｎｄｕｃｅｄ－Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ－Ｃｏｍｐｌｅｘ）と呼ばれる複合体が形成される。ＲＩＳＣはセンスＲＮＡの塩基配列との相同配列を有するＲＮＡを認識して結合し、ＲＮａｓｅＩＩＩ様の酵素活性によりＲＮＡを切断する。
【0017】
ｓｈＲＮＡは一本鎖ＲＮＡからなり、標的ＲＮＡの部分塩基配列と相同なセンスＲＮＡ領域と、当該センスＲＮＡとハイブリダイズ可能なアンチセンスＲＮＡ領域が環状構造を示すリンカーＲＮＡにより結合されており、全体としてヘアピン状の構造を有する。ｓｈＲＮＡは３’末端が１塩基以上、４塩基以下突出していてもよく、また、当該３’突出末端はＤＮＡで構成されていてもよい。ｓｈＲＮＡは、細胞内で分解され、ｓｉＲＮＡと同様にＲＮＡ干渉を引き起こす。
【0018】
ＫＨＳＲＰ ＲＮＡをノックダウンするための標的配列は、ＲＮＡｉにより有効にノックダウンされるものであれば特に制限されないが、例えば、配列番号３～６８の塩基配列のＫＨＳＲＰ ＲＮＡを挙げることができる。なお、配列番号３～６８の塩基配列は、ＫＨＳＲＰ遺伝子の２１ｎｔの塩基配列に加えて、２ｎｔのｏｖｅｒｈａｎｇ配列を含んでいる。配列番号３～６８の塩基配列は、特に制限されないが、ＫＨＳＲＰ ＲＮＡをノックダウンするためのｓｉＲＮＡのセンス鎖に含まれていることが好ましい。ＫＨＳＲＰ ＲＮＡをノックダウンする化合物は、１種のみ用いてもよいが、２種以上を組み合わせて用いることが好ましい。
【0019】
ＫＨＳＲＰ結合性ＲＮＡは、膵癌細胞の細胞質の顆粒、特にプロセッシングボディ（Ｐ－ｂｏｄｙ）において、ＫＨＳＲＰに結合しているＲＮＡをいう。Ｐ－ｂｏｄｙは細胞質に特徴的にみられる粒子様のＲＮＡ－タンパク質複合体で、多くのＲＮＡ代謝の場となっている。その構成タンパク質は細胞や種によっても大きく異なり、ＲＮＡの貯蔵や分解などいろいろな機能を果たす可能性がある。例えば，マイクロＲＮＡによる翻訳抑制や，ポリＡの短縮によるＲＮＡの分化の場としても機能している。構成するタンパク質によって機能が変わりうる場所ともいえる（実験医学，２００９年２月号，Ｖｏｌ．２７，Ｎｏ．３）。
【0020】
ｓｎｏＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｎｕｃｌｅｏｌａｒ ＲＮＡ，核小体低分子ＲＮＡ）は、ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡの一種であり、タンパク質と複合体を形成してｓｎｏＲＮＰ（ｓｍａｌｌ ｎｕｃｌｅｏｌａｒ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ）として機能し、ｒＲＮＡの修飾やプロセシングに関与する。ＫＨＳＲＰ結合性ＲＮＡであるｓｎｏＲＮＡとしては、例えばＳＣＡＲＮＡ２１、ＳＮＯＲＡ３８、ＳＮＯＲＡ２５、ＳＮＯＲＡ１８、ＳＮＯＲＡ２２、ＳＮＯＲＡ１４Ｂ、ＳＮＯＲＡ７１Ｂ、ＳＮＯＲＡ７１Ｄ、ＳＮＯＲＤ９７等が挙げられ、ＳＮＯＲＡ１８およびＳＮＯＲＡ２２から選択される少なくとも一方が好ましく、ＳＮＯＲＡ１８のノックダウンにより膵癌細胞の後腹膜浸潤が顕著に抑制されることからＳＮＯＲＡ１８が特に好ましい。
【0021】
ＫＨＳＲＰ結合性ｓｎｏＲＮＡをノックダウンする化合物は、ＫＨＳＲＰ結合性ｓｎｏＲＮＡをノックダウンできるものであれば特に制限されないが、例えば、標的ｓｎｏＲＮＡに結合するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡが挙げられる。但し、ｍｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの３’非翻訳領域に結合して翻訳を阻害するものであり、ｓｎｏＲＮＡはｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡであるので、上記化合物はｍｉＲＮＡでないことが好ましい。
【0022】
ＫＨＳＲＰ結合性ｓｎｏＲＮＡの中で、例えばＳＮＯＲＡ１８は配列番号６９の塩基配列を有し、ＳＮＯＲＡ２２は配列番号７０の塩基配列を有する。ＲＮＡ干渉の標的となる塩基対数は２１～２３塩基対であることから、これら塩基配列の中から２１～２３塩基対を標的として選択すればよい。特に、ＳＮＯＲＡ１８に対するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡとしては配列番号７１～７４を有するものが好ましく、ＳＮＯＲＡ２２に対するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡとしては配列番号７５～７８を有するものが好ましい。これら好適塩基配列は、センス鎖の塩基配列でもアンチセンス鎖の塩基配列であってもよい。
【0023】
（１）アンチセンス鎖の５’末端がＡまたはＵであり、（２）センス鎖の５’末端がＧまたはＣであり、且つ（３）アンチセンス鎖の５’末端部の７塩基中の４塩基以上はＡまたはＵであるＲＮＡが、ＲＮＡ干渉効果が高いものとして知られている。本発明で使用するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡは、かかる塩基配列を有するものであってもよいし、有さないものであってもよい。
【0024】
ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡは、標的ＲＮＡをノックダウンすることができるものである限り、その一部または全部が天然のヌクレオチドではなく、天然のデオキシヌクレオチドや非天然ヌクレオチドで構成されているものであってもよい。かかるｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡは、ヌクレアーゼ耐性が改善される他、ノックダウン活性自体が改善されることもある。非天然ヌクレオチドとしては、例えば、天然のヌクレオチドの２’位水酸基が、メトキシ基などのＣ1-6アルコキシ基、メトキシメトキシ基などのＣ1-6アルコキシ－Ｃ1-6アルコキシ基、フルオロ基などのハロゲノ基で置換されているものや、２’，４’－ＢＮＡ、３’－アミノ－２’，４’－ＢＮＡ、２’，４’－ＢＮＡCOC、２’，４’－ＢＮＡNC等、２’位と４’位が架橋されているもの等が挙げられる。これら変異は１種のみに限られず、例えば、置換ヌクレオチドと天然デオキシヌクレオチドを交互に配置する等、２種以上の変異を組み合わせてもよい。また、ｓｉＲＮＡが有する特徴的な構造である３’末端突出部位（ダングリングエンド）のヌクレオシドを、同様に、天然のデオキシヌクレオチドであるチミジンに置換したり、塩基部欠損ヌクレオチドや、１，３－ベンゼンジメタノールおよび２，６－ピリジンジメタノール等の芳香族化合物で置換してもよい。
【0025】
上記好適塩基配列を有するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡは、膵癌細胞においてＲＮＡ干渉作用によりＫＨＳＲＰ ＲＮＡまたはＫＨＳＲＰ結合性ｓｎｏＲＮＡの切断を促し、ＫＨＳＲＰとＫＨＳＲＰ結合性ｓｎｏＲＮＡとの結合を阻害し、延いては膵癌細胞の浸潤転移を抑制する。但し、上記好適塩基配列中に１塩基の欠失、置換もしくは付加を含む塩基配列を有するＲＮＡであっても、同様にＲＮＡ干渉作用を示す場合がある。
【0026】
本発明において「（塩基配列を）有する」とは、ＲＮＡが所定の塩基配列のみを有するか、或いは、所定の塩基配列に加え、それ以外の塩基配列を有してもよいとの意味であるが、上述したような５’末端の修飾や、３’末端における突出ＲＮＡまたは突出ＤＮＡ以外、ＲＮＡの塩基配列は実質的に所定の塩基配列と同一であることが好ましい。
【0027】
本発明に係る膵癌細胞浸潤転移阻害剤は、上記好適標的塩基配列を有するＲＮＡに加え、上記好適標的塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有するＲＮＡを含むことが好ましい。かかる二重鎖により、ＲＮＡをより安定化することができる。
【0028】
上記二重鎖は完全な相補鎖からなることが好ましいが、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする範囲で完全に相補的でなくてもよいものとする。本発明において「ストリンジェントな条件」とは、１５０ｍＭ以上、９００ｍＭ以下の塩化ナトリウム濃度、１５ｍＭ以上、９０ｍＭ以下のクエン酸ナトリウム濃度、即ち、１～６×ＳＳＣ、０．１質量％以上、０．５質量％以下のＳＳＤの水溶液中、４２℃以上、５５℃以下の温度で、５分間以上、１５分間以下、１回または２回洗浄する条件をいう。また、センス鎖の塩基配列との完全相補配列に対するアンチセンス鎖の塩基配列の相同性としては、９０％以上が好ましく、９２％以上がより好ましく、９５％以上がさらに好ましい。なお、塩基配列の相同性は、当業者であれば市販の配列解析ソフトウェアを用いて容易に決定することができる。
【0029】
本発明に係る膵癌細胞浸潤転移阻害剤の一つの態様では、上記センス鎖とアンチセンス鎖がそれぞれ独立に含まれており、これらが二本鎖ＲＮＡ、即ちｓｉＲＮＡを形成している。
【0030】
また、本発明に係る膵癌細胞浸潤転移阻害剤の別の態様では、上記センス鎖とアンチセンス鎖がリンカーＲＮＡを介して結合した一本鎖ＲＮＡが有効成分として含まれており、当該一本鎖ＲＮＡ、即ちｓｈＲＮＡはヘアピン構造を有しており、上記センス鎖とアンチセンス鎖がハイブリダイズしており、且つリンカーＲＮＡが環状構造を有する。
【0031】
上記センス鎖とアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡ、並びに、上記センス鎖、リンカーＲＮＡおよび上記アンチセンス鎖を含むｓｈＲＮＡは、化学合成してもよいし、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロ合成してもよい。
【0032】
本発明に係る膵癌細胞浸潤転移阻害剤は、上記ｓｉＲＮＡまたは上記ｓｈＲＮＡを有効成分として１種のみ含むものであってもよいし、或いは２種以上含んでいてもよいものとする。２種以上含む場合の数としては、２以上、８以下が好ましく、３以上、５以下がより好ましい。
【0033】
本発明に係る膵癌細胞浸潤転移阻害剤は、ＫＨＳＲＰ ＲＮＡまたはＫＨＳＲＰ結合性ｓｎｏＲＮＡをノックダウンするｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを有効成分として含むものであってもよいし、当該ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを発現するベクターを有効成分として含むものであってもよい。
【0034】
本発明に係る膵癌細胞浸潤転移阻害剤の剤形は、標的部位に有効成分が送達されるものであれば特に制限されず、例えば、注射剤、液剤、徐放剤とすることができる。これら製剤の溶媒としては水が好ましいが、生理食塩水、ＰＢＳ、血清アルブミン溶液を用いるなどして製剤が最終的に等張液または略等張液となるようにすることが好ましい。その他、本発明に係るＲＮＡを、直接的または間接的に葉酸へ結合させてもよい。膵癌細胞膜の表面には葉酸レセプターが高発現しているため、かかるＲＮＡ－葉酸複合体は、膵癌細胞へ選択的に送達および結合される可能性がある。また、本発明に係るＲＮＡをキトサンナノ粒子に結合させてもよい。キトサンナノ粒子は、体内へ静注投与されたｓｉＲＮＡの酵素分解を抑制する作用を有する。さらに、葉酸－キトサン複合ナノ粒子へ、本発明に係るＲＮＡを結合させることが好ましい。その他、ＰＥＧ化により血中滞留性の向上したリポソームや、ＤＤＳ担体としてアテロコラーゲン等が知られている。
【0035】
本発明に係る膵癌細胞浸潤転移阻害剤の標的部位は、膵臓のみならず、膵癌細胞が転移したリンパ節や他の臓器であってもよい。また、標的部位へ有効成分をより確実に送達するために、剤形としては注射剤が好ましい。また、リポソームや高分子ミセルなど、公知の薬剤送達技術を用いてもよい。
【0036】
本発明に係るＤＮＡは、上記ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡのセンス鎖および／もしくはアンチセンス鎖をコードする塩基配列を有することを特徴とする。更に、上記センス鎖とアンチセンス鎖を別の部位でコードするものであってもよいし、上記センス鎖、リンカーＲＮＡおよび上記アンチセンス鎖を連続してコードするものであってもよい。
【0037】
本発明に係るＤＮＡは、上記ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡのセンス鎖および／もしくはアンチセンス鎖をコードする塩基配列（遺伝子）が発現するよう、さらに、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、スプライシングドナー、アクセプターおよびポリＡなどの調節領域を含んでいてもよい。特に、上記コード領域の５’末端側にプロモーターが存在し、３’末端側に転写を終結させるためのターミネーターが連結されていることが好ましい。
【0038】
本発明に係るＤＮＡは、上述したとおり上記ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡのセンス鎖および／もしくはアンチセンス鎖をコードする塩基配列などを有するので、細胞内に導入されることにより、上記ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡのセンス鎖および／もしくはアンチセンス鎖が細胞内で産生され、ＲＮＡ干渉により標的ＲＮＡが分解される。よって、本発明に係るＤＮＡが挿入されたベクターは、膵癌細胞浸潤転移阻害剤の有効成分となり得る。
【0039】
本発明で用いるベクターは、プラスミドベクターや、無毒化したウィルスベクター、また、リポソームベクターなど公知のベクターから適宜選択すればよい。
【0040】
本発明に係るベクターは、リポフェクトアミン法など脂質を媒体とする担体輸送法、リン酸カルシウムなどの化学物質を媒介する方法、マイクロインジェクション、遺伝子中による打ち込み法、電気穿孔法など、公知方法により標的細胞内へ送達することができる。
【0041】
運動性、浸潤性および転移性の高い膵癌細胞において、細胞膜突起中にはＫＨＳＲＰと結合して集積しているＲＮＡが存在している。このＲＮＡが膵癌細胞の運動性に関与することが、本発明者の実験により確認されている。本発明においては、膵癌細胞においてＫＨＳＲＰ ＲＮＡまたはＫＨＳＲＰ結合性ｓｎｏＲＮＡをノックダウンすることにより、膵癌細胞の浸潤転移を抑制することが可能となる。
【0042】
本発明に係る膵癌細胞浸潤転移阻害剤の投与量や投与頻度は、それぞれの剤形や、患者の重篤度、年齢、性別、体重などにより適宜調整すればよい。
【実施例】
【0043】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
【0044】
実施例１： 膵癌細胞におけるＫＨＳＲＰの局在確認
ヒト膵癌（ＰＤＡＣ）のＳ２－０１３細胞株はネブラスカ大学Ｄｒ．Ｍｉｃｈａｅｌ Ｈｏｌｌｉｎｇｓｗｏｒｔｈより寄贈され、同じくＰＤＡＣのＰＡＮＣ－１細胞株はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手した。
免疫細胞化学的手法を用いて、２種類の膵癌細胞におけるＫＨＳＲＰとアクチンの局在を確認した。結果を図１に示す。図１中の矢印は、細胞膜突起中に局在するＫＨＳＲＰを示す。
図１に示される結果の通り、Ｓ２－０１３株でもＰＡＮＣ－１株でも、ＫＨＳＲＰは核内や細胞質のみならず細胞膜突起内に蓄積していることが認められた。また、細胞膜突起は重合したアクチン構造を有していた。
ヒト膵癌（ＰＤＡＣ）のＳ２－０１３細胞株はネブラスカ大学Ｄｒ．Ｍｉｃｈａｅｌ Ｈｏｌｌｉｎｇｓｗｏｒｔｈより寄贈され、同じくＰＤＡＣのＰＡＮＣ－１細胞株はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手した。
免疫細胞化学的手法を用いて、２種類の膵癌細胞におけるＫＨＳＲＰとアクチンの局在を確認した。結果を図１に示す。図１中の矢印は、細胞膜突起中に局在するＫＨＳＲＰを示す。
図１に示される結果の通り、Ｓ２－０１３株でもＰＡＮＣ－１株でも、ＫＨＳＲＰは核内や細胞質のみならず細胞膜突起内に蓄積していることが認められた。また、細胞膜突起は重合したアクチン構造を有していた。
【0045】
実施例２： 膵癌細胞の運動性と浸潤性に対するＫＨＳＲＰノックダウンの効果
（１）トランスウェル運動性アッセイとマトリゲル浸潤アッセイ
ＫＨＳＲＰが膵癌細胞の運動性と浸潤性に影響を及ぼすか否か調べた。具体的には、ＫＨＳＲＰ ｓｉＲＮＡ（「ＴＲ３１１９８４」Ｏｒｉｇｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）のベクターを用い、公知方法（ＴＡＮＩＵＣＨＩ Ｋら，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．，２０１４，５，６８３２－６８４５）に従って、ＫＨＳＲＰの発現が安定的に抑制されたＳ２－０１３株細胞を作製した。細胞は、ＫＨＳＲＰ発現の抑制がウエスタンブロット分析によって確認されたもののみ使用した。ＫＨＳＲＰの発現が抑制されたＳ２－０１３株細胞を、上記文献に記載されたトランスウェル運動性アッセイとマトリゲル浸潤アッセイに付した。２種のスクランブルコントロールＲＮＡｉ（Ｓｃｒ－１およびＳｃｒ－２）を発現させたＳ２－０１３株細胞の結果と合わせて、それぞれの結果を図２に示す。図２中、「＊」はｔ－テストにおいてコントロールに対してｐ＜０．０５で有意差があることを示す。
図２に示される結果の通り、ＫＨＳＲＰのｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡを導入したＫＨＳＲＰ－ＲＮＡｉ Ｓ２－０１３株細胞（図２中、ｓｉＫＨ－１とｓｉＫＨ－２）の運動性と浸潤性は、スクランブルコントロール細胞に比べて有意に低いことが分かった。
また、ＫＨＳＲＰをコードするｃＤＮＡを増幅するために、Ｓ２－０１３株細胞のＲＮＡを鋳型としてＲＴ－ＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物を、Ｃ－末端にｍｙｃ－ＤＤＫタグを生じるｐＣＭＶ６－Ｅｎｔｒｙベクター（Ｏｒｉｇｅｎｅ社製）に挿入した。以下、得られたベクターを「ＫＨＳＲＰ－ｐＣＭＶ６」という。ｓｉＫＨ－１およびｓｉＫＨ－２クローン細胞に、ＫＨＳＲＰ発現を回復させるため、トランスフェクション試薬（「Ｘ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥTM ＨＰ ＤＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ」Ｒｏｃｈｅ社製）を用い、ＫＨＳＲＰ－ｐＣＭＶ６を導入したｓｉＫＨ－１およびｓｉＫＨ－２クローン細胞を使って同様の実験を行ったところ、運動性と浸潤性が回復した（図示せず）。
（１）トランスウェル運動性アッセイとマトリゲル浸潤アッセイ
ＫＨＳＲＰが膵癌細胞の運動性と浸潤性に影響を及ぼすか否か調べた。具体的には、ＫＨＳＲＰ ｓｉＲＮＡ（「ＴＲ３１１９８４」Ｏｒｉｇｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）のベクターを用い、公知方法（ＴＡＮＩＵＣＨＩ Ｋら，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．，２０１４，５，６８３２－６８４５）に従って、ＫＨＳＲＰの発現が安定的に抑制されたＳ２－０１３株細胞を作製した。細胞は、ＫＨＳＲＰ発現の抑制がウエスタンブロット分析によって確認されたもののみ使用した。ＫＨＳＲＰの発現が抑制されたＳ２－０１３株細胞を、上記文献に記載されたトランスウェル運動性アッセイとマトリゲル浸潤アッセイに付した。２種のスクランブルコントロールＲＮＡｉ（Ｓｃｒ－１およびＳｃｒ－２）を発現させたＳ２－０１３株細胞の結果と合わせて、それぞれの結果を図２に示す。図２中、「＊」はｔ－テストにおいてコントロールに対してｐ＜０．０５で有意差があることを示す。
図２に示される結果の通り、ＫＨＳＲＰのｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡを導入したＫＨＳＲＰ－ＲＮＡｉ Ｓ２－０１３株細胞（図２中、ｓｉＫＨ－１とｓｉＫＨ－２）の運動性と浸潤性は、スクランブルコントロール細胞に比べて有意に低いことが分かった。
また、ＫＨＳＲＰをコードするｃＤＮＡを増幅するために、Ｓ２－０１３株細胞のＲＮＡを鋳型としてＲＴ－ＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物を、Ｃ－末端にｍｙｃ－ＤＤＫタグを生じるｐＣＭＶ６－Ｅｎｔｒｙベクター（Ｏｒｉｇｅｎｅ社製）に挿入した。以下、得られたベクターを「ＫＨＳＲＰ－ｐＣＭＶ６」という。ｓｉＫＨ－１およびｓｉＫＨ－２クローン細胞に、ＫＨＳＲＰ発現を回復させるため、トランスフェクション試薬（「Ｘ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥTM ＨＰ ＤＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ」Ｒｏｃｈｅ社製）を用い、ＫＨＳＲＰ－ｐＣＭＶ６を導入したｓｉＫＨ－１およびｓｉＫＨ－２クローン細胞を使って同様の実験を行ったところ、運動性と浸潤性が回復した（図示せず）。
【0046】
（２）ｉｎ ｖｉｖｏ実験
６週齢の免疫適格性雌ＢＡＬＢ／ｃＳｌｃ－ｎｕ／ｎｕマウスを、日本ＳＬＣ社から入手した。スクランブルコントロールＲＮＡｉクローン（Ｓｃｒ－１およびＳｃｒ－２）と、ＫＨＳＲＰをノックダウンしたＳ２－０１３株細胞（ｓｉＫＨ－１およびｓｉＫＨ－２）８．０×１０5を１０μＬのＰＢＳに懸濁させた。アベルチン（０．３７５ｇ／ｋｇ体重）を腹腔内投与することによりマウスを麻酔し、各細胞懸濁液を膵臓の頭部にゆっくり注射した。移植から４２日後にマウスを安楽死させた。後腹膜への腫瘍浸潤、および肺と肝臓への転移性病変の存在を、ヘマトキシリンおよびエオシン染色によって分析した。また、膵臓腫瘍を切除し、検査し、そして秤量した。結果を表１に示す。表中、「＊」は、フィッシャーの正確確率検定において、Ｓｃｒ－１およびＳｃｒ－２の結果に対してｐ＜０．０５で有意差があることを示す。
６週齢の免疫適格性雌ＢＡＬＢ／ｃＳｌｃ－ｎｕ／ｎｕマウスを、日本ＳＬＣ社から入手した。スクランブルコントロールＲＮＡｉクローン（Ｓｃｒ－１およびＳｃｒ－２）と、ＫＨＳＲＰをノックダウンしたＳ２－０１３株細胞（ｓｉＫＨ－１およびｓｉＫＨ－２）８．０×１０5を１０μＬのＰＢＳに懸濁させた。アベルチン（０．３７５ｇ／ｋｇ体重）を腹腔内投与することによりマウスを麻酔し、各細胞懸濁液を膵臓の頭部にゆっくり注射した。移植から４２日後にマウスを安楽死させた。後腹膜への腫瘍浸潤、および肺と肝臓への転移性病変の存在を、ヘマトキシリンおよびエオシン染色によって分析した。また、膵臓腫瘍を切除し、検査し、そして秤量した。結果を表１に示す。表中、「＊」は、フィッシャーの正確確率検定において、Ｓｃｒ－１およびＳｃｒ－２の結果に対してｐ＜０．０５で有意差があることを示す。
【0047】
【表1】
【0048】
表１に示される結果の通り、ＫＨＳＲＰがノックダウンされた膵癌細胞は、後腹膜への浸潤と肝臓および肺への転移のいずれも有意に抑制されていることが証明された。
【0049】
以上の結果より、ＫＨＳＲＰは膵癌細胞の運動性と浸潤性に重要な役割を果たしていることが示された。
【0050】
実施例３： ＫＨＳＲＰの局在位置の同定
ストレス顆粒とは、ストレス刺激に応答して一過性に形成される細胞内構造体であり、ストレスから細胞を防御する機構と考えられており、ストレス顆粒には、数種類のＲＮＡ結合タンパク質、４０Ｓサブユニットリボソームタンパク質、および翻訳開始因子が存在する（Ｌｏｒｅｎｉ Ｆら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．，２０１４，３３，２１４５－２１５６）。また、プロセシングボディ（Ｐ－ｂｏｄｙ）は細胞質に特徴的にみられる粒子様の構造で、ＲＮＡ－タンパク質の複合体であり、ＲＮＡの貯蔵や分解など、ＲＮＡ代謝の場となっている。ｍｉＲＮＡによるＲＮＡサイレンシングの代替モデルとして、Ｐ－ｂｏｄｙ内でｍＲＮＡがＲＩＳＣ（ＲＮＡ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ）と相互作用するものが報告されている（Ｌｉｕ Ｊら，Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２００５，７，７１９－７２３）。これらは、非翻訳ＲＮＡを含み、翻訳機構を除外する細胞質病巣である（Ｔｅｉｘｅｉｒａ Ｄら，Ｒｎａ，２００５，１１，３７１－３８２）。
ＫＨＳＲＰ含有顆粒がストレス顆粒（ＳＧ）かＰ－ｂｏｄｙかを調べるために、フィブロネクチン上で培養したＳ２－０１３株細胞を、抗ＫＨＳＲＰ抗体、および抗Ｇ３ＢＰ抗体（ＳＧマーカー）、または抗Ｇｅ－１／ＨＥＤＬＳ（Ｐ－ｂｏｄｙマーカー）で二重標識した。結果を図３に示す。
図３に示される結果の通り、ＫＨＳＲＰは、細胞質顆粒においてＧ３ＢＰと共存しない一方で、Ｐ－ｂｏｄｙと共局在していた。これらのデータは、Ｐ－ｂｏｄｙに局在するＫＨＳＲＰが、膵癌細胞中の特定のｍＲＮＡのレベルを調節するように機能し得ることを示している。
ストレス顆粒とは、ストレス刺激に応答して一過性に形成される細胞内構造体であり、ストレスから細胞を防御する機構と考えられており、ストレス顆粒には、数種類のＲＮＡ結合タンパク質、４０Ｓサブユニットリボソームタンパク質、および翻訳開始因子が存在する（Ｌｏｒｅｎｉ Ｆら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．，２０１４，３３，２１４５－２１５６）。また、プロセシングボディ（Ｐ－ｂｏｄｙ）は細胞質に特徴的にみられる粒子様の構造で、ＲＮＡ－タンパク質の複合体であり、ＲＮＡの貯蔵や分解など、ＲＮＡ代謝の場となっている。ｍｉＲＮＡによるＲＮＡサイレンシングの代替モデルとして、Ｐ－ｂｏｄｙ内でｍＲＮＡがＲＩＳＣ（ＲＮＡ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ）と相互作用するものが報告されている（Ｌｉｕ Ｊら，Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２００５，７，７１９－７２３）。これらは、非翻訳ＲＮＡを含み、翻訳機構を除外する細胞質病巣である（Ｔｅｉｘｅｉｒａ Ｄら，Ｒｎａ，２００５，１１，３７１－３８２）。
ＫＨＳＲＰ含有顆粒がストレス顆粒（ＳＧ）かＰ－ｂｏｄｙかを調べるために、フィブロネクチン上で培養したＳ２－０１３株細胞を、抗ＫＨＳＲＰ抗体、および抗Ｇ３ＢＰ抗体（ＳＧマーカー）、または抗Ｇｅ－１／ＨＥＤＬＳ（Ｐ－ｂｏｄｙマーカー）で二重標識した。結果を図３に示す。
図３に示される結果の通り、ＫＨＳＲＰは、細胞質顆粒においてＧ３ＢＰと共存しない一方で、Ｐ－ｂｏｄｙと共局在していた。これらのデータは、Ｐ－ｂｏｄｙに局在するＫＨＳＲＰが、膵癌細胞中の特定のｍＲＮＡのレベルを調節するように機能し得ることを示している。
【0051】
実施例４： ＫＨＳＲＰの標的転写産物の同定
ＫＨＳＲＰ含有顆粒に局在するＫＨＳＲＰ結合転写物を同定するために、抗ＫＨＳＲＰ抗体、およびフィブロネクチン上で増殖させたＳ２－０１３株細胞からの細胞抽出物を用いてＲＮＡ免疫沈降（ＲＩＰ）を行い、続いて得られた免疫沈降物中のＲＮＡを同定するための次世代配列決定を行った。ＲＩＰアッセイの結果、ウサギＩｇＧアイソタイプコントロール免疫沈降物と比較して、抗ＫＨＳＲＰ免疫沈降物中で有意に濃縮されている５０１個のＲＮＡが同定された。５０１個のＲＮＡから得られた完全な遺伝子リストを遺伝子発現オムニバスデータベース（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏ／）にアップロードした（ＧＥＯ登録番号：ＧＳＥ１２０８５３）。かなりの数のｓｎｏＲＮＡが、ＫＨＳＲＰ結合性ＲＮＡ候補のトップ１０にリストされていた（表２）。
ＫＨＳＲＰ含有顆粒に局在するＫＨＳＲＰ結合転写物を同定するために、抗ＫＨＳＲＰ抗体、およびフィブロネクチン上で増殖させたＳ２－０１３株細胞からの細胞抽出物を用いてＲＮＡ免疫沈降（ＲＩＰ）を行い、続いて得られた免疫沈降物中のＲＮＡを同定するための次世代配列決定を行った。ＲＩＰアッセイの結果、ウサギＩｇＧアイソタイプコントロール免疫沈降物と比較して、抗ＫＨＳＲＰ免疫沈降物中で有意に濃縮されている５０１個のＲＮＡが同定された。５０１個のＲＮＡから得られた完全な遺伝子リストを遺伝子発現オムニバスデータベース（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏ／）にアップロードした（ＧＥＯ登録番号：ＧＳＥ１２０８５３）。かなりの数のｓｎｏＲＮＡが、ＫＨＳＲＰ結合性ＲＮＡ候補のトップ１０にリストされていた（表２）。
【0052】
【表2】
【0053】
ＫＨＳＲＰ結合性ＲＮＡの生物学的機能性についてさらに洞察を得るために、遺伝子オントロジー（ＧＯ）分析を行い、遺伝子リストと一致するＧＯタームを同定した。このＧＯセットは、アポトーシス、ＲＮＡスプライシング、翻訳、スプライセオソームを介した核内ｍＲＮＡスプライシング、およびｍＲＮＡプロセシングを含んでいた。これらの機能に関連する任意のＧＯタームと一致したＫＨＳＲＰ結合性ｍＲＮＡを表３に列挙する。
【0054】
【表3】
【0055】
本発明者は以前に、膵癌細胞組織におけるＡＤＰ－リボシル化因子６（ＡＲＦ６）およびＲｈｏグアニンヌクレオチド交換因子４（ＡＲＨＧＥＦ４）の過剰発現が膵癌細胞の生存と相関し、それらが細胞膜突起を増加させることによって膵癌細胞の運動性および浸潤性を促進することを報告した。それに対して本研究では、ＫＨＳＲＰがｓｎｏＲＮＡと結合することが世界で初めて見出されたため、ＫＨＳＲＰ結合性ｍＲＮＡに焦点を合わせるのではなく、新規の所見であるＫＨＳＲＰ結合性ｓｎｏＲＮＡの機能を分析した。逆転写ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）を実施して、表２に記載のｓｎｏＲＮＡがＫＨＳＲＰと免疫沈降することを確認した。その結果、表２に記載の全てのｓｎｏＲＮＡが抗ＫＨＳＲＰ抗体で免疫沈降した一方で、アイソタイプ対照抗体で免疫沈降しなかった。
免疫細胞化学およびＲＮＡ蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを一緒に用い、フィブロネクチン上で培養されたＳ２－０１３株細胞の細胞質顆粒内でＳＮＯＲＡ１８およびＳＮＯＲＡ２２がＫＨＳＲＰと共局在し、これらのｓｎｏＲＮＡがＫＨＳＲＰと共局在することを示した（図４）。一方、対照ユビキチンＣ ｍＲＮＡは、フィブロネクチン上で培養したＳ２－０１３株細胞においてＫＨＳＲＰと共存しなかった（図４）。
免疫細胞化学およびＲＮＡ蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを一緒に用い、フィブロネクチン上で培養されたＳ２－０１３株細胞の細胞質顆粒内でＳＮＯＲＡ１８およびＳＮＯＲＡ２２がＫＨＳＲＰと共局在し、これらのｓｎｏＲＮＡがＫＨＳＲＰと共局在することを示した（図４）。一方、対照ユビキチンＣ ｍＲＮＡは、フィブロネクチン上で培養したＳ２－０１３株細胞においてＫＨＳＲＰと共存しなかった（図４）。
【0056】
実施例５： 細胞膜突起におけるＫＨＳＲＰの役割
フィブロネクチン上で培養したスクランブルコントロールｓｉＲＮＡを恒常的に発現するＳ２－０１３株コントロールクローン（Ｓｃｒ－１）と、ＫＨＳＲＰ特異的なｓｉＲＮＡを恒常的に発現するＫＨＳＲＰ発現抑制Ｓ２－０１３株クローン（ｓｉＫＨ－１）を共焦点顕微鏡で観察した。結果を図５に示す。図５中、矢印は、内部にアクチンが重合している細胞膜突起を示す。
図５に示される結果の通り、細胞膜突起におけるアクチン重合構造が、フィブロネクチン上で培養したＳｃｒ－１ Ｓ２－０１３株コントロール細胞よりも、ＫＨＳＲＰ発現が抑制されたｓｉＫＨ－１ Ｓ２－０１３株細胞においてより少ないことが明らかにされた。逆に重合していないアクチン構造は、Ｓｃｒ－１ Ｓ２－０１３株コントロール細胞よりも、ｓｉＫＨ－１ Ｓ２－０１３株細胞の細胞質においてより豊富であった。
モックコントロールベクター、または実施例２（１）で作製したＫＨＳＲＰ－ｐＣＭＶ６をコントロールＲＮＡｉ Ｓ２－０１３株細胞またはＫＨＳＲＰ－ＲＮＡｉ Ｓ２－０１３株細胞に一時的に導入し、４８時間後、共焦点顕微鏡で観察した。ＫＨＳＲＰ－ｐＣＭＶ６の導入により、ＫＨＳＲＰ－ＲＮＡｉ Ｓ２－０１３株細胞においても、細胞膜突起におけるアクチン重合構造が再現した（図示せず）。また、細胞膜突起を有する細胞を計数した。結果を図６に示す。
図６に示される結果の通り、細胞膜突起を有する細胞の数は、モックコントロールベクターを導入したＫＨＳＲＰ－ＲＮＡｉ Ｓ２－０１３株細胞よりも、ＫＨＳＲＰ－ｐＣＭＶ６を導入したＫＨＳＲＰ－ＲＮＡｉ Ｓ２－０１３株細胞において有意に豊富であった。
これらの結果は、ＫＨＳＲＰがアクチンの重合を誘導して細胞膜突起の形成を増加させることを示している。
フィブロネクチン上で培養したスクランブルコントロールｓｉＲＮＡを恒常的に発現するＳ２－０１３株コントロールクローン（Ｓｃｒ－１）と、ＫＨＳＲＰ特異的なｓｉＲＮＡを恒常的に発現するＫＨＳＲＰ発現抑制Ｓ２－０１３株クローン（ｓｉＫＨ－１）を共焦点顕微鏡で観察した。結果を図５に示す。図５中、矢印は、内部にアクチンが重合している細胞膜突起を示す。
図５に示される結果の通り、細胞膜突起におけるアクチン重合構造が、フィブロネクチン上で培養したＳｃｒ－１ Ｓ２－０１３株コントロール細胞よりも、ＫＨＳＲＰ発現が抑制されたｓｉＫＨ－１ Ｓ２－０１３株細胞においてより少ないことが明らかにされた。逆に重合していないアクチン構造は、Ｓｃｒ－１ Ｓ２－０１３株コントロール細胞よりも、ｓｉＫＨ－１ Ｓ２－０１３株細胞の細胞質においてより豊富であった。
モックコントロールベクター、または実施例２（１）で作製したＫＨＳＲＰ－ｐＣＭＶ６をコントロールＲＮＡｉ Ｓ２－０１３株細胞またはＫＨＳＲＰ－ＲＮＡｉ Ｓ２－０１３株細胞に一時的に導入し、４８時間後、共焦点顕微鏡で観察した。ＫＨＳＲＰ－ｐＣＭＶ６の導入により、ＫＨＳＲＰ－ＲＮＡｉ Ｓ２－０１３株細胞においても、細胞膜突起におけるアクチン重合構造が再現した（図示せず）。また、細胞膜突起を有する細胞を計数した。結果を図６に示す。
図６に示される結果の通り、細胞膜突起を有する細胞の数は、モックコントロールベクターを導入したＫＨＳＲＰ－ＲＮＡｉ Ｓ２－０１３株細胞よりも、ＫＨＳＲＰ－ｐＣＭＶ６を導入したＫＨＳＲＰ－ＲＮＡｉ Ｓ２－０１３株細胞において有意に豊富であった。
これらの結果は、ＫＨＳＲＰがアクチンの重合を誘導して細胞膜突起の形成を増加させることを示している。
【0057】
実施例６： 細胞膜突起の形成におけるＫＨＳＲＰ結合性ｓｎｏＲＮＡの役割
本発明者は、そのｍＲＮＡがＲＮＡ結合タンパク質インスリン様成長因子２ ｍＲＮＡ結合タンパク質３（ＩＧＦ２ＢＰ３）に結合しているＡＲＦ６およびＡＲＨＧＥＦ４タンパク質が細胞膜突起に蓄積し、それによって膵癌細胞における細胞膜突起形成に寄与することを以前に報告している（Ｔａｎｉｕｃｈｉ Ｋら，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．，２０１４，５，６８３２－６８４５；Ｔａｎｉｕｃｈｉ Ｋら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．，２０１８，５３，２２２４－２２４０）。
ＫＨＳＲＰ結合性ｓｎｏＲＮＡであるＳＮＯＲＡ１８およびＳＮＯＲＡ２２が細胞膜突起の誘導に関与する否かを決定するために、スクランブルドコントロールｓｉＲＮＡ、ＳＮＯＲＡ１８ ｓｉＲＮＡ、およびＳＮＯＲＡ２２ ｓｉＲＮＡで一過性にトランスフェクトしたＳ２－０１３株細胞の細胞膜突起内のアクチン重合構造を分析した。
トランスフェクションの７２時間後の半定量的ＲＴ－ＰＣＲデータに基づくと、ＳＮＯＲＡ１８およびＳＮＯＲＡ２２の発現は、ＳＮＯＲＡ１８ ｓｉＲＮＡトランスフェクトまたはＳＮＯＲＡ２２ ｓｉＲＮＡトランスフェクトＳ２－０１３株細胞よりも、スクランブルコントロールｓｉＲＮＡトランスフェクトＳ２－０１３株細胞において著しく高いことが確認された。共焦点顕微鏡による観察では、フィブロネクチン上で培養したＳ２－０１３株細胞におけるＳＮＯＲＡ１８またはＳＮＯＲＡ２２のノックダウンが、アクチン重合構造を減少させることを明らかにした（ＳＮＯＲＡ１８－ノックダウンについては図７、ＳＮＯＲＡ２２－ノックダウンについては図８）。図７および図８中、矢印は、内部にアクチンが重合している細胞膜突起を示す。
更に、フィブロネクチン上で培養したＳ２－０１３株細胞におけるＳＮＯＲＡ１８およびＳＮＯＲＡ２２のノックダウンは、細胞膜突起の形成を有意に阻害した（図９）。
これらの結果は、ノンコーディングＲＮＡであるＳＮＯＲＡ１８およびＳＮＯＲＡ２２が、膵癌細胞の細胞膜突起の形成において役割を果たすことを示している。
本発明者は、そのｍＲＮＡがＲＮＡ結合タンパク質インスリン様成長因子２ ｍＲＮＡ結合タンパク質３（ＩＧＦ２ＢＰ３）に結合しているＡＲＦ６およびＡＲＨＧＥＦ４タンパク質が細胞膜突起に蓄積し、それによって膵癌細胞における細胞膜突起形成に寄与することを以前に報告している（Ｔａｎｉｕｃｈｉ Ｋら，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．，２０１４，５，６８３２－６８４５；Ｔａｎｉｕｃｈｉ Ｋら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．，２０１８，５３，２２２４－２２４０）。
ＫＨＳＲＰ結合性ｓｎｏＲＮＡであるＳＮＯＲＡ１８およびＳＮＯＲＡ２２が細胞膜突起の誘導に関与する否かを決定するために、スクランブルドコントロールｓｉＲＮＡ、ＳＮＯＲＡ１８ ｓｉＲＮＡ、およびＳＮＯＲＡ２２ ｓｉＲＮＡで一過性にトランスフェクトしたＳ２－０１３株細胞の細胞膜突起内のアクチン重合構造を分析した。
トランスフェクションの７２時間後の半定量的ＲＴ－ＰＣＲデータに基づくと、ＳＮＯＲＡ１８およびＳＮＯＲＡ２２の発現は、ＳＮＯＲＡ１８ ｓｉＲＮＡトランスフェクトまたはＳＮＯＲＡ２２ ｓｉＲＮＡトランスフェクトＳ２－０１３株細胞よりも、スクランブルコントロールｓｉＲＮＡトランスフェクトＳ２－０１３株細胞において著しく高いことが確認された。共焦点顕微鏡による観察では、フィブロネクチン上で培養したＳ２－０１３株細胞におけるＳＮＯＲＡ１８またはＳＮＯＲＡ２２のノックダウンが、アクチン重合構造を減少させることを明らかにした（ＳＮＯＲＡ１８－ノックダウンについては図７、ＳＮＯＲＡ２２－ノックダウンについては図８）。図７および図８中、矢印は、内部にアクチンが重合している細胞膜突起を示す。
更に、フィブロネクチン上で培養したＳ２－０１３株細胞におけるＳＮＯＲＡ１８およびＳＮＯＲＡ２２のノックダウンは、細胞膜突起の形成を有意に阻害した（図９）。
これらの結果は、ノンコーディングＲＮＡであるＳＮＯＲＡ１８およびＳＮＯＲＡ２２が、膵癌細胞の細胞膜突起の形成において役割を果たすことを示している。
【0058】
実施例７： 膵癌細胞の運動性と浸潤性に対するＫＨＳＲＰ結合性ｓｎｏＲＮＡの役割
トランスウェル運動性アッセイにおいて、Ｓ２－０１３株細胞およびＰＡＮＣ－１株細胞の運動性は、スクランブルドコントロール細胞よりも、ＳＮＯＲＡ１８－ノックダウン細胞およびＳＮＯＲＡ２２－ノックダウン細胞において有意に低かった（図１０）。
マトリゲル浸潤アッセイにおいて、Ｓ２－０１３株細胞およびＰＡＮＣ－１株細胞の浸潤性は、コントロール細胞におけるよりもＳＮＯＲＡ１８－ノックダウン細胞およびＳＮＯＲＡ２２－ノックダウン細胞において有意に低かった（図１１）。
これらの結果は、ＳＮＯＲＡ１８およびＳＮＯＲＡ２２が膵癌細胞の運動性および浸潤性の促進と関連することを示している。
トランスウェル運動性アッセイにおいて、Ｓ２－０１３株細胞およびＰＡＮＣ－１株細胞の運動性は、スクランブルドコントロール細胞よりも、ＳＮＯＲＡ１８－ノックダウン細胞およびＳＮＯＲＡ２２－ノックダウン細胞において有意に低かった（図１０）。
マトリゲル浸潤アッセイにおいて、Ｓ２－０１３株細胞およびＰＡＮＣ－１株細胞の浸潤性は、コントロール細胞におけるよりもＳＮＯＲＡ１８－ノックダウン細胞およびＳＮＯＲＡ２２－ノックダウン細胞において有意に低かった（図１１）。
これらの結果は、ＳＮＯＲＡ１８およびＳＮＯＲＡ２２が膵癌細胞の運動性および浸潤性の促進と関連することを示している。
【0059】
実施例８： 膵癌モデルマウスにおけるＳＮＯＲＡ１８とＳＮＯＲＡ２２のノックダウンによる膵癌細胞の浸潤と転移に対する効果
インビボイメージング研究によれば、膵癌（ＰＤＡＣ）の同所性マウスモデル（マウス膵臓にヒト膵癌株細胞を移植したヒト膵癌浸潤・転移マウスモデル）に静脈内注射された葉酸（ＦＡ）修飾ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－キトサンオリゴ糖乳酸（ＣＯＬ）ナノ粒子を付加したｓｉＲＮＡは、マウス膵臓のＳ２－０１３株由来ＰＤＡＣ腫瘍におけるＰＤＡＣ細胞に取り込まれる（Ｔａｎｉｕｃｈｉ Ｋら，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．，２０１９，１０，２８６９－２８８６）。そこで、インビボでの浸潤性および転移に対するＳＮＯＲＡ１８およびＳＮＯＲＡ２２の効果を研究するために、ＳＮＯＲＡ１８およびＳＮＯＲＡ２２に対するｓｉＲＮＡ－ＦＡ－ＰＥＧ－ＣＯＬナノ粒子をＰＤＡＣ同所性マウスモデルに静脈内注射した。ＳＮＯＲＡ１８ ｓｉＲＮＡとしては、配列番号４の塩基配列を有するセンス鎖が相補的なアンチセンス鎖と結合した２１塩基の二本鎖ｓｉＲＮＡを用い、ＳＮＯＲＡ２２ ｓｉＲＮＡとしては、配列番号８の塩基配列を有するセンス鎖が相補的なアンチセンス鎖と結合した２１塩基の二本鎖ｓｉＲＮＡを用いた。
６週齢のヌードマウスの膵臓にヒト膵癌細胞株Ｓ２－０１３を移植した膵癌浸潤転移モデルを用いた。具体的には、第１日目にイソフルランを用いた吸入麻酔により４８匹のヌードマウスを麻酔し、開腹して膵臓を露出した。１００万個のヒト膵癌細胞株Ｓ２－０１３を０．１ｍＬのＰＢＳに懸濁し、各マウスの膵臓内に移植した。ｓｉＲＮＡはＳＮＯＲＡ１８とＳＮＯＲＡ２２に対するものと、コントロールとしてスクランブルｓｉＲＮＡを用いた。合成した各ｓｉＲＮＡを葉酸キトサンナノ粒子に付加した。ヒト膵癌細胞を移植した各群のマウスにそれぞれの葉酸キトサンナノ粒子付加ｓｉＲＮＡを１回／週の頻度で尾静脈へ投与した。マウスに全身投与されたｓｉＲＮＡは、キトサンナノ粒子によりヒト膵癌組織まで受動的に送達され、葉酸が膵癌細胞上の葉酸受容体を介して効率的なエンドサイトーシスを促すことを期待できる。合計５回のｓｉＲＮＡ静注投与を行った。Ｓ２－０１３株細胞の移植から６週間後、マウスを安楽死させ、膵癌組織、肺、および肝臓の切片をヘマトキシリン－エオシン染色し、後腹膜浸潤、腹膜播種、ならびに肝臓および肺への転移の存在を判定した。各マウスの開腹写真を図１２に、コントロールマウスの後腹膜、肺および肝臓のマトキシリン－エオシン染色写真を図１３に、また、結果を表４にまとめる。なお、表４中、「＊」は、フィッシャー直接検定において、３種類のコントロール群れであるＰＢＳ投与コントロールマウス、スクランブルコントロールｓｉＲＮＡ－ＣＯＬナノ粒子投与コントロールマウス、およびスクランブルコントロールｓｉＲＮＡ－ＦＡ－ＰＥＧ－ＣＯＬナノ粒子投与コントロールマウスに対してｐ＜０．０５で有意差があることを示す。
インビボイメージング研究によれば、膵癌（ＰＤＡＣ）の同所性マウスモデル（マウス膵臓にヒト膵癌株細胞を移植したヒト膵癌浸潤・転移マウスモデル）に静脈内注射された葉酸（ＦＡ）修飾ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－キトサンオリゴ糖乳酸（ＣＯＬ）ナノ粒子を付加したｓｉＲＮＡは、マウス膵臓のＳ２－０１３株由来ＰＤＡＣ腫瘍におけるＰＤＡＣ細胞に取り込まれる（Ｔａｎｉｕｃｈｉ Ｋら，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．，２０１９，１０，２８６９－２８８６）。そこで、インビボでの浸潤性および転移に対するＳＮＯＲＡ１８およびＳＮＯＲＡ２２の効果を研究するために、ＳＮＯＲＡ１８およびＳＮＯＲＡ２２に対するｓｉＲＮＡ－ＦＡ－ＰＥＧ－ＣＯＬナノ粒子をＰＤＡＣ同所性マウスモデルに静脈内注射した。ＳＮＯＲＡ１８ ｓｉＲＮＡとしては、配列番号４の塩基配列を有するセンス鎖が相補的なアンチセンス鎖と結合した２１塩基の二本鎖ｓｉＲＮＡを用い、ＳＮＯＲＡ２２ ｓｉＲＮＡとしては、配列番号８の塩基配列を有するセンス鎖が相補的なアンチセンス鎖と結合した２１塩基の二本鎖ｓｉＲＮＡを用いた。
６週齢のヌードマウスの膵臓にヒト膵癌細胞株Ｓ２－０１３を移植した膵癌浸潤転移モデルを用いた。具体的には、第１日目にイソフルランを用いた吸入麻酔により４８匹のヌードマウスを麻酔し、開腹して膵臓を露出した。１００万個のヒト膵癌細胞株Ｓ２－０１３を０．１ｍＬのＰＢＳに懸濁し、各マウスの膵臓内に移植した。ｓｉＲＮＡはＳＮＯＲＡ１８とＳＮＯＲＡ２２に対するものと、コントロールとしてスクランブルｓｉＲＮＡを用いた。合成した各ｓｉＲＮＡを葉酸キトサンナノ粒子に付加した。ヒト膵癌細胞を移植した各群のマウスにそれぞれの葉酸キトサンナノ粒子付加ｓｉＲＮＡを１回／週の頻度で尾静脈へ投与した。マウスに全身投与されたｓｉＲＮＡは、キトサンナノ粒子によりヒト膵癌組織まで受動的に送達され、葉酸が膵癌細胞上の葉酸受容体を介して効率的なエンドサイトーシスを促すことを期待できる。合計５回のｓｉＲＮＡ静注投与を行った。Ｓ２－０１３株細胞の移植から６週間後、マウスを安楽死させ、膵癌組織、肺、および肝臓の切片をヘマトキシリン－エオシン染色し、後腹膜浸潤、腹膜播種、ならびに肝臓および肺への転移の存在を判定した。各マウスの開腹写真を図１２に、コントロールマウスの後腹膜、肺および肝臓のマトキシリン－エオシン染色写真を図１３に、また、結果を表４にまとめる。なお、表４中、「＊」は、フィッシャー直接検定において、３種類のコントロール群れであるＰＢＳ投与コントロールマウス、スクランブルコントロールｓｉＲＮＡ－ＣＯＬナノ粒子投与コントロールマウス、およびスクランブルコントロールｓｉＲＮＡ－ＦＡ－ＰＥＧ－ＣＯＬナノ粒子投与コントロールマウスに対してｐ＜０．０５で有意差があることを示す。
【0060】
【表4】
【0061】
３種類のコントロール群の膵癌モデルマウスには、広範囲の腹膜癌腫症が７０％に見られ（図１２）、後腹膜の局所浸潤と、肺および肝臓への転移が高率で認められた（図１３）。
一方、ＳＮＯＲＡ１８およびＳＮＯＲＡ２２に対するｓｉＲＮＡ－ＦＡ－ＰＥＧ－ＣＯＬナノ粒子を投与した膵癌モデルマウスでは、対照群と比較して、後腹膜浸潤および肺転移が有意に阻害されており、特にＳＮＯＲＡ１８に対するｓｉＲＮＡ－ＦＡ－ＰＥＧ－ＣＯＬナノ粒子は、後腹膜浸潤を強く阻害した（表４）。
一方、ＳＮＯＲＡ１８およびＳＮＯＲＡ２２に対するｓｉＲＮＡ－ＦＡ－ＰＥＧ－ＣＯＬナノ粒子を投与した膵癌モデルマウスでは、対照群と比較して、後腹膜浸潤および肺転移が有意に阻害されており、特にＳＮＯＲＡ１８に対するｓｉＲＮＡ－ＦＡ－ＰＥＧ－ＣＯＬナノ粒子は、後腹膜浸潤を強く阻害した（表４）。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【配列表】