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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-03-14
(45)【発行日】2024-03-25
(54)【発明の名称】分子送達用粒子を特徴づけるための方法
(51)【国際特許分類】
G01N 21/41 20060101AFI20240315BHJP
C12N 15/864 20060101ALI20240315BHJP
C12N 15/869 20060101ALI20240315BHJP
C12N 15/867 20060101ALI20240315BHJP
C12N 15/86 20060101ALI20240315BHJP
C12N 15/861 20060101ALI20240315BHJP
C12N 15/88 20060101ALI20240315BHJP
G01N 21/33 20060101ALI20240315BHJP
【ＦＩ】
G01N21/41 Z
C12N15/864 100Z
C12N15/869 Z
C12N15/867 Z
C12N15/86 Z
C12N15/861 Z
C12N15/88 Z
G01N21/33
【請求項の数】
16
(21)【出願番号】P 2022563446
(86)(22)【出願日】2022-03-24
(86)【国際出願番号】 JP2022014106
(87)【国際公開番号】W WO2022224697
(87)【国際公開日】2022-10-27
【審査請求日】2022-10-31
(31)【優先権主張番号】P 2021070724
(32)【優先日】2021-04-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）令和２年度、国立研究開発法人日本医療研究開発機構、「再生医療・遺伝子治療の産業化に向けた基盤技術開発事業／遺伝子治療製造技術開発」「遺伝子・細胞治療用ベクター新規大量製造技術開発における高度分析拠点及び技術開発取り纏め」委託研究開発、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】504176911
【氏名又は名称】国立大学法人大阪大学
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100106518
【弁理士】
【氏名又は名称】松谷 道子
(74)【代理人】
【識別番号】100138911
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻井 陽子
(74)【代理人】
【識別番号】100165892
【弁理士】
【氏名又は名称】坂田 啓司
(72)【発明者】
【氏名】内山 進
(72)【発明者】
【氏名】丸野 孝浩
(72)【発明者】
【氏名】鳥巣 哲生
【審査官】田中 洋介
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１８－５０５６９５（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００２－０８６１５５（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０２０－１６１４７５（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０２１／００８２５４１（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特許第４６８６７１４（ＪＰ，Ｂ２）
【文献】特表２０１１－５２４４４９（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開平０３－１０６９３１（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２００８／０２９９５４５（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特開平１０－０８２７７４（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１４－０１００５３（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２００７／１２９６６７（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ ２１／００－２１／９５８
Ｇ０１Ｎ １５／００－１５／１４９２
Ｃ１２Ｎ ７／００－７／０８
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＳＴＣｈｉｎａ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
分子送達用粒子を特徴づける方法であって、第１粒子及び第２粒子を含む分子送達用粒子を含有する溶液を、光測定を伴う遠心分離に供して、前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれの前記溶液の屈折率ｎの変化である屈折率増分（δｎ）を決定し、
前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれの前記屈折率増分（δｎ）を、濃度あたりの屈折率変化値である比屈折率変化値（ｄｎ／ｄｃ）で割りつけることによりグラム濃度をそれぞれ得て、さらにそれぞれの分子量で割りつけることにより、前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれのモル濃度を決定することを含み、
前記分子送達用粒子が第３粒子をさらに含んでいてよく、
前記第１粒子が第１外被及び第１送達分子を有し、前記第２粒子が第２外被を有し、及び前記第３粒子が第３外被及び第３送達分子を有する、方法。
【請求項2】
前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれの吸光度と、前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれの前記モル濃度とに基づいて、前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれのモル吸光係数を決定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれの前記吸光度が、前記分子送達用粒子を複数の測定波長での光測定を伴う遠心分離に供することで、前記複数の測定波長の各測定波長について決定される、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記第１粒子の前記モル吸光係数から、前記第２粒子の前記モル吸光係数を差し引いて、前記第１送達分子のモル吸光係数を、前記複数の測定波長の各測定波長について決定することを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記第２粒子の前記モル吸光係数と、前記第１送達分子の前記モル吸光係数とが一致する等吸収点を特定し、及び前記等吸収点での第１粒子及び第２粒子それぞれの吸光度を用いて、前記第１粒子と前記第２粒子との量比を決定することを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記複数の測定波長が、少なくとも３種の測定波長を含む、請求項３～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれの前記分子量が、前記光測定を伴う遠心分離にて決定される、請求項1～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記分子送達用粒子が前記第３粒子を含み、前記第３粒子の分子量が、前記光測定を伴う遠心分離にて決定される、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記分子送達用粒子が前記第３粒子を含み、前記分子送達用粒子の光測定を伴う遠心分離により、前記第３粒子の吸光度を、前記複数の測定波長の各測定波長について決定し、及び
前記第２粒子の前記モル吸光係数と前記第１送達分子の前記モル吸光係数との、前記第３粒子の前記吸光度に対する寄与度を決定することを含む、請求項３～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記寄与度に基づいて、前記第３粒子の構成割合を決定すること、及び／又は前記第３外被及び前記第３送達分子それぞれの濃度を決定することをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記量比が、第１閾値を超える場合に、前記分子送達用粒子が所定の品質があると判定することを含む、請求項５に記載の方法、或いは前記第１粒子の前記モル濃度、前記第２粒子の前記モル濃度、前記第３外被の前記濃度、及び前記第３送達分子の前記濃度に基づいて、前記分子送達用粒子に対する、前記第１粒子又は前記第２粒子の量比を決定し、及び前記量比が、第１閾値を超える場合に、前記分子送達用粒子が所定の品質があると判定することを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記分子送達用粒子が、ウイルス粒子、リポソーム、アルブミン粒子、ミセル又はポリ乳酸・グリコール酸共重合体粒子である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記ウイルス粒子が、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、センダイウイルス、ステルスウイルス、レンチウイルス、又はレトロウイルスである、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記分子送達用粒子がウイルス粒子であり、前記第１外被、前記第２外被及び前記第３外被がそれぞれカプシドを含み、
前記第１送達分子が第１ポリヌクレオチドを含み、
前記第３送達分子が第３ポリヌクレオチドを含み、及び
前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれの前記分子量が、前記光測定を伴う遠心分離にて決定される、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
前記分子送達用粒子が前記第３粒子を含み、前記第３粒子の分子量が、前記光測定を伴う遠心分離にて決定される、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
コンピュータの制御部にロードされることにより、前記コンピュータに、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法を実行させる、プログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、分子送達用粒子を特徴づけるための方法を提供する。本発明はまた、分子送達用粒子を特徴づけるための方法を実行するプログラムを提供する。
【背景技術】
【0002】
治療用化合物、遺伝子及び栄養素を含む種々の分子を送達するための粒子は、薬物送達システムを含む様々な技術分野で利用されている。薬物送達システム（ＤＤＳ）は、薬物を効率的に目的とする部位に送り届けることを目的とした技術である。ＤＤＳに利用される薬物キャリアには、リン脂質二重層で構成される脂質カプセルであるリポソーム、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びポリ乳酸（ＰＬＡ）から構成されたミセル、及びポリ乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡとも称される）で構成される粒子が挙げられる。遺伝子治療の分野では、遺伝子のキャリアとしてウイルスベクターが利用されている。
【0003】
組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、遺伝子治療のための有望なプラットフォームとなっている。約４．７ｋｂの一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ゲノムを含むＡＡＶベクターの製造工程において、ｓｓＤＮＡを含まないウイルス粒子（中空粒子）及び不完全なｓｓＤＮＡを含むウイルス粒子（中間粒子）の混入を回避することは困難である。
【0004】
陰イオン交換クロマトグラフィー又は超遠心分析（ＡＵＣ）が、ＡＡＶベクターの特性評価のために、特に中空粒子と完全なｓｓＤＮＡゲノムを含む粒子（完全粒子）の比率の評価のために用いられている。クロマトグラフィー分析では少量（１０１０ｖｇ２以下）で短時間に評価を行うことができるが、中空粒子と完全粒子の良好な分離及び定量には、カラム、移動相及び溶出条件を含む分析条件の最適化が必要であり、煩雑である。電子顕微鏡では、中空粒子及び完全粒子を高倍率で直接観察し、数えることができる。しかし、視野内の粒子を評価することは可能であるが、系の全体像を評価することは事実上困難である。
【0005】
超遠心分析沈降速度法（ＳＶ－ＡＵＣ）は、溶液中の高分子のサイズ分布を特徴付けるための強力な技術である。ＡＵＣ分析、特に計算方法の最近の進歩は、不均一な混合物の沈降過程をモデル化し、溶液中の沈降係数の分布を定量化することを可能にした。ＡＵＣ分析は、カラムとの相互作用やネガティブ染色のような化学修飾を伴わずに行われる。また、測定後に試料の大部分を回収することが可能である。超遠心分析沈降速度法を用いた組換えウイルス粒子を特徴づけるための方法が知られている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【文献】特開２０１８－５０５６９５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
ＡＡＶベクターベースの製剤において中空粒子及び中間粒子が含まれると、その製剤の全体的な治療効果を低下させ、望ましくない免疫応答を引き起こす可能性がある。また、ＡＡＶベクター凝集体のような他の成分も、ＡＡＶベクターベースの製剤に含まれ得る。ＡＡＶベクターの粒子関連不純物を正確かつ信頼性の高い方法で解析することが必要とされる。しかしながら、従来の方法では組換えウイルス粒子の特徴づけが不十分であった。本開示は、組換えウイルス粒子について、超遠心分析沈降速度法を用いて、従来の方法では達成し得なかった特徴づけを可能とする新規方法を提供することを１つの目的とする。
【0008】
本開示は、分子量を決定することを含む分子送達用粒子を特徴づける新規方法を提供することを１つの目的とする。本開示は、モル濃度を決定することを含む分子送達用粒子を特徴づける新規方法を提供することを１つの目的とする。本開示は、モル吸光係数を決定することを含む分子送達用粒子を特徴づける新規方法を提供することを１つの目的とする。
【0009】
本開示は、量比を決定することを含む分子送達用粒子を特徴づける新規方法を提供することを１つの目的とする。本開示は、モル吸光係数を用いず、等吸収点での測定に基づいて量比を決定することを含む分子送達用粒子を特徴づける新規方法を提供することを１つの目的とする。
【0010】
本開示は、第３粒子の吸光度に対する寄与度を決定することを含む分子送達用粒子を特徴づける新規方法を提供することを１つの目的とする。本開示は、品質を判定することを含む分子送達用粒子を特徴づける新規方法を提供することを１つの目的とする。
【0011】
本開示は、前記した分子送達用粒子を特徴づけるための方法を実行する新規プログラムを提供することを１つの目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0012】
本開示は、以下の分子送達用粒子を特徴づける方法、前記方法を実行するためのプログラム、第１粒子のモル吸光係数を決定する方法、及び所定鎖長のポリヌクレオチドのモル吸光係数を決定する方法を提供する：
［項１］
分子送達用粒子を特徴づける方法であって、
第１粒子及び第２粒子を含む分子送達用粒子を、光測定を伴う粒子分離に供して、前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれの屈折率増分を決定し、及び
前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれの前記屈折率増分と、分子量と、比屈折率変化値とに基づいて、前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれのモル濃度を決定することを含む、方法。
［項２］
前記分子送達用粒子を、複数の測定波長での光測定を伴う粒子分離に供して、前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれの吸光度を、前記複数の測定波長の各測定波長について決定し、及び
前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれの前記吸光度と、前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれの前記モル濃度とに基づいて、前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれのモル吸光係数を、前記各測定波長について決定することを含む、項１に記載の方法。
［項３］
前記第１粒子が第１外被及び第１送達分子を有し、及び前記第２粒子が第２外被を有し、
前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれの前記吸光度と、前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれの前記モル濃度とに基づいて、前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれのモル吸光係数を各測定波長について決定し、及び
前記第１粒子の前記モル吸光係数から、前記第２粒子の前記モル吸光係数を差し引いて、前記第１送達分子のモル吸光係数を、各測定波長について決定することを含む、項２に記載の方法。
［項４］
前記第２粒子の前記モル吸光係数と、前記第１送達分子の前記モル吸光係数とが一致する等吸収点を特定し、及び
前記等吸収点での第１粒子及び第２粒子それぞれの吸光度を用いて、前記第１粒子と前記第２粒子との量比を決定することを含む、項３に記載の方法。
［項５］
分子送達用粒子を特徴づける方法であって、
第１粒子及び第２粒子を含む分子送達用粒子を、第１粒子及び第２粒子それぞれのモル吸光係数を決定した測定波長での光測定を伴う粒子分離に供して、前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれの吸光度を決定し、及び
前記第１粒子と前記第２粒子それぞれの前記吸光度と、決定された前記第１粒子及び第２粒子それぞれのモル吸光係数を用いて、前記第１粒子と前記第２粒子との量比を決定することを含む、方法。
［項６］
分子送達用粒子を特徴づける方法であって、
第１粒子及び第２粒子を含む分子送達用粒子を、等吸収点での光測定を伴う粒子分離に供して、前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれの吸光度を決定し、及び
前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれの前記吸光度を用いて、前記第１粒子と前記第２粒子との量比を決定することを含む、方法。
［項７］
前記分子送達用粒子が第３粒子をさらに含み、前記第３粒子が第３外被を有し且つ第３送達分子を有していてよく、
前記分子送達用粒子の光測定を伴う粒子分離により、前記第３粒子の吸光度を、前記各測定波長について決定し、及び
前記第２粒子の前記モル吸光係数と前記第１送達分子の前記モル吸光係数との、前記第３粒子の前記吸光度に対する寄与度を決定することを含む、項３～５のいずれか一項に記載の方法。
［項８］
前記寄与度に基づいて、第３粒子の構成割合を決定すること、及び／又は前記第３外被及び前記第３送達分子それぞれの濃度を決定することをさらに含む、項７に記載の方法。
［項９］
前記量比が、第１閾値を超える場合に、前記分子送達用粒子が所定の品質があると判定することを含む、項４～６のいずれか一項に記載の方法、或いは
前記第１粒子の前記モル濃度、前記第２粒子の前記モル濃度、前記第３外被の前記濃度、及び前記第３送達分子の前記濃度に基づいて、前記分子送達用粒子に対する、前記第１粒子又は前記第２粒子の量比を決定し、及び前記量比が、第１閾値を超える場合に、前記分子送達用粒子が所定の品質があると判定することを含む、項８に記載の方法。
［項１０］
分子送達用粒子を特徴づける方法であって、
分子送達用粒子を、第１測定波長及び第２測定波長での光測定を伴う粒子分離に供して、前記分子送達用粒子の吸光度を、前記第１測定波長及び第２測定波長それぞれについて決定し、及び
前記第１測定波長での前記分子送達用粒子の前記吸光度と、前記第２測定波長での前記分子送達用粒子の前記吸光度とから吸光度比を決定することを含む、方法。
［項１１］
前記粒子分離が、遠心分離、クロマトグラフィー、又はフィールド・フロー・フラクショネーションである、項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
［項１２］
分子送達用粒子を特徴づける方法であって、
前記分子送達用粒子と溶媒を含む第１溶液を、光測定を伴う遠心分離に供して、第１溶液中の前記分子送達用粒子の沈降係数を決定し、
前記分子送達用粒子と同位体標識溶媒を含む第２溶液を、光測定を伴う遠心分離に供して、第２溶液中の前記分子送達用粒子の沈降係数を決定し、
第１溶液中の前記分子送達用粒子の前記沈降係数と、第２溶液中の前記分子送達用粒子の前記沈降係数とに基づいて、前記分子送達用粒子の偏比容を決定し、及び
第１溶液中での前記分子送達用粒子の前記沈降係数と、第２溶液中での前記分子送達用粒子の前記沈降係数と、前記分子送達用粒子の前記偏比容とに基づいて、前記分子送達用粒子の分子量を決定することを含む、方法。
［項１３］
前記分子送達用粒子が、ウイルス粒子、リポソーム、アルブミン粒子、ミセル又はポリ乳酸・グリコール酸共重合体粒子である、項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
［項１４］
前記ウイルス粒子が、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、センダイウイルス、ステルスウイルス、レンチウイルス、又はレトロウイルスである、項１３に記載の方法。
［項１５］
コンピュータの制御部にロードされることにより、前記コンピュータに、項１～１４のいずれか一項に記載の方法を実行させる、プログラム。
［項１６］
第１粒子のモル吸光係数を決定する方法であって、
前記第１粒子が、第１外被及び第１鎖長の第１ポリヌクレオチドを含み、
所定鎖長の第２ポリヌクレオチドのモル吸光係数を、前記所定鎖長の値で除して、一ヌクレオチドあたりの平均モル吸光係数を算出し、
前記一ヌクレオチドあたりの平均モル吸光係数に、前記第１鎖長の値を乗じて、前記第１ポリヌクレオチドのモル吸光係数を算出し、
前記第１外被のモル吸光係数と、前記第１ポリヌクレオチドの前記モル吸光係数とをあわせて、前記第１粒子のモル吸光係数を決定することを含む、方法。
［項１７］
所定鎖長のポリヌクレオチドのモル吸光係数を決定する方法であって、
前記ポリヌクレオチドを含む分子送達用粒子を所定の測定波長で測定する場合に、前記所定の測定波長と同一又は相当する以下の表に記載のいずれか一つの波長における一ヌクレオチドあたりの平均モル吸光係数に、前記所定鎖長の値を乗じて、前記いずれか一つの波長における前記ポリヌクレオチドのモル吸光係数を決定することを含む、方法。
［項１］
分子送達用粒子を特徴づける方法であって、
第１粒子及び第２粒子を含む分子送達用粒子を、光測定を伴う粒子分離に供して、前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれの屈折率増分を決定し、及び
前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれの前記屈折率増分と、分子量と、比屈折率変化値とに基づいて、前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれのモル濃度を決定することを含む、方法。
［項２］
前記分子送達用粒子を、複数の測定波長での光測定を伴う粒子分離に供して、前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれの吸光度を、前記複数の測定波長の各測定波長について決定し、及び
前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれの前記吸光度と、前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれの前記モル濃度とに基づいて、前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれのモル吸光係数を、前記各測定波長について決定することを含む、項１に記載の方法。
［項３］
前記第１粒子が第１外被及び第１送達分子を有し、及び前記第２粒子が第２外被を有し、
前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれの前記吸光度と、前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれの前記モル濃度とに基づいて、前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれのモル吸光係数を各測定波長について決定し、及び
前記第１粒子の前記モル吸光係数から、前記第２粒子の前記モル吸光係数を差し引いて、前記第１送達分子のモル吸光係数を、各測定波長について決定することを含む、項２に記載の方法。
［項４］
前記第２粒子の前記モル吸光係数と、前記第１送達分子の前記モル吸光係数とが一致する等吸収点を特定し、及び
前記等吸収点での第１粒子及び第２粒子それぞれの吸光度を用いて、前記第１粒子と前記第２粒子との量比を決定することを含む、項３に記載の方法。
［項５］
分子送達用粒子を特徴づける方法であって、
第１粒子及び第２粒子を含む分子送達用粒子を、第１粒子及び第２粒子それぞれのモル吸光係数を決定した測定波長での光測定を伴う粒子分離に供して、前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれの吸光度を決定し、及び
前記第１粒子と前記第２粒子それぞれの前記吸光度と、決定された前記第１粒子及び第２粒子それぞれのモル吸光係数を用いて、前記第１粒子と前記第２粒子との量比を決定することを含む、方法。
［項６］
分子送達用粒子を特徴づける方法であって、
第１粒子及び第２粒子を含む分子送達用粒子を、等吸収点での光測定を伴う粒子分離に供して、前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれの吸光度を決定し、及び
前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれの前記吸光度を用いて、前記第１粒子と前記第２粒子との量比を決定することを含む、方法。
［項７］
前記分子送達用粒子が第３粒子をさらに含み、前記第３粒子が第３外被を有し且つ第３送達分子を有していてよく、
前記分子送達用粒子の光測定を伴う粒子分離により、前記第３粒子の吸光度を、前記各測定波長について決定し、及び
前記第２粒子の前記モル吸光係数と前記第１送達分子の前記モル吸光係数との、前記第３粒子の前記吸光度に対する寄与度を決定することを含む、項３～５のいずれか一項に記載の方法。
［項８］
前記寄与度に基づいて、第３粒子の構成割合を決定すること、及び／又は前記第３外被及び前記第３送達分子それぞれの濃度を決定することをさらに含む、項７に記載の方法。
［項９］
前記量比が、第１閾値を超える場合に、前記分子送達用粒子が所定の品質があると判定することを含む、項４～６のいずれか一項に記載の方法、或いは
前記第１粒子の前記モル濃度、前記第２粒子の前記モル濃度、前記第３外被の前記濃度、及び前記第３送達分子の前記濃度に基づいて、前記分子送達用粒子に対する、前記第１粒子又は前記第２粒子の量比を決定し、及び前記量比が、第１閾値を超える場合に、前記分子送達用粒子が所定の品質があると判定することを含む、項８に記載の方法。
［項１０］
分子送達用粒子を特徴づける方法であって、
分子送達用粒子を、第１測定波長及び第２測定波長での光測定を伴う粒子分離に供して、前記分子送達用粒子の吸光度を、前記第１測定波長及び第２測定波長それぞれについて決定し、及び
前記第１測定波長での前記分子送達用粒子の前記吸光度と、前記第２測定波長での前記分子送達用粒子の前記吸光度とから吸光度比を決定することを含む、方法。
［項１１］
前記粒子分離が、遠心分離、クロマトグラフィー、又はフィールド・フロー・フラクショネーションである、項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
［項１２］
分子送達用粒子を特徴づける方法であって、
前記分子送達用粒子と溶媒を含む第１溶液を、光測定を伴う遠心分離に供して、第１溶液中の前記分子送達用粒子の沈降係数を決定し、
前記分子送達用粒子と同位体標識溶媒を含む第２溶液を、光測定を伴う遠心分離に供して、第２溶液中の前記分子送達用粒子の沈降係数を決定し、
第１溶液中の前記分子送達用粒子の前記沈降係数と、第２溶液中の前記分子送達用粒子の前記沈降係数とに基づいて、前記分子送達用粒子の偏比容を決定し、及び
第１溶液中での前記分子送達用粒子の前記沈降係数と、第２溶液中での前記分子送達用粒子の前記沈降係数と、前記分子送達用粒子の前記偏比容とに基づいて、前記分子送達用粒子の分子量を決定することを含む、方法。
［項１３］
前記分子送達用粒子が、ウイルス粒子、リポソーム、アルブミン粒子、ミセル又はポリ乳酸・グリコール酸共重合体粒子である、項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
［項１４］
前記ウイルス粒子が、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、センダイウイルス、ステルスウイルス、レンチウイルス、又はレトロウイルスである、項１３に記載の方法。
［項１５］
コンピュータの制御部にロードされることにより、前記コンピュータに、項１～１４のいずれか一項に記載の方法を実行させる、プログラム。
［項１６］
第１粒子のモル吸光係数を決定する方法であって、
前記第１粒子が、第１外被及び第１鎖長の第１ポリヌクレオチドを含み、
所定鎖長の第２ポリヌクレオチドのモル吸光係数を、前記所定鎖長の値で除して、一ヌクレオチドあたりの平均モル吸光係数を算出し、
前記一ヌクレオチドあたりの平均モル吸光係数に、前記第１鎖長の値を乗じて、前記第１ポリヌクレオチドのモル吸光係数を算出し、
前記第１外被のモル吸光係数と、前記第１ポリヌクレオチドの前記モル吸光係数とをあわせて、前記第１粒子のモル吸光係数を決定することを含む、方法。
［項１７］
所定鎖長のポリヌクレオチドのモル吸光係数を決定する方法であって、
前記ポリヌクレオチドを含む分子送達用粒子を所定の測定波長で測定する場合に、前記所定の測定波長と同一又は相当する以下の表に記載のいずれか一つの波長における一ヌクレオチドあたりの平均モル吸光係数に、前記所定鎖長の値を乗じて、前記いずれか一つの波長における前記ポリヌクレオチドのモル吸光係数を決定することを含む、方法。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】図１Ａは、密度コントラストＳＶ－ＡＵＣ実験におけるＡＡＶ５－ＥＰ（左）とＡＡＶ５－ＦＰ（右）の沈降係数分布の重ね合わせ図である。黒線、赤線、青線は、Ｈ２
１８Ｏを含む緩衝液の０％、３２．５％、６５％での分布を示した。分布は、計算された密度と粘度に加えて、実験で決定された各成分の偏比容を用いて規格化した。図１Ｂ（左）は、密度コントラストＳＶ－ＡＵＣ実験から得られた流体力学的パラメータと計算された分子量を示す表である。図１Ｂ（右）は、各緩衝液条件で偏比容を変えて得られた沈降係数の残差二乗和のプロットを示す図である。
【図2】図２Ａは、２３０ｎｍでの吸光度に基づく時間依存的なセル内濃度分布を示す図である。図２Ｂは、２６０ｎｍでの吸光度に基づく時間依存的なセル内濃度分布を示す図である。図２Ｃは、２８０ｎｍでの吸光度に基づく時間依存的なセル内濃度分布を示す図である。図２Ｄは、屈折率に基づく時間依存的なセル内濃度分布の図である。
【図3】図３Ａは、２３０ｎｍでの吸光度測定に基づくＡＡＶ５サンプルの沈降係数分布図である。図３Ｂは、２６０ｎｍでの吸光度測定に基づくＡＡＶ５サンプルの沈降係数分布図である。図３Ｃは、２８０ｎｍでの吸光度測定に基づくＡＡＶ５サンプルの沈降係数分布図である。
【図6】図６は、紫外吸光光度計で測定したＡ２６０／Ａ２８０と、ＳＶ－ＡＵＣによる干渉検出系を用いた純度との相関関係を示す図である。各試料の純度は、干渉検出により得た結果を基に算出した。Ａ２６０／Ａ２８０は、ＳＶ－ＡＵＣ実験前のＵＶスペクトル測定から得た。黒丸、白丸、白三角、黒三角はそれぞれＡＡＶ１－ＦＰ、ＡＡＶ２－ＦＰ、ＡＡＶ５－ＦＰ、ＡＡＶ６－ＦＰを表す。また、各血清型ＡＡＶ１－ＦＰ、ＡＡＶ２－ＦＰ、ＡＡＶ５－ＦＰ、ＡＡＶ６－ＦＰそれぞれの完全粒子と中空粒子のＡ２６０／Ａ２８０が通る線を黒点線、灰色破線、黒破線、灰色点線にて示した。明らかな相関関係は、本研究で試験したサンプルでは見られなかった。
【図7】図７は、ＡＡＶ－ＥＰのモル吸光係数スペクトル及びｓｓＤＮＡのモル吸光係数スペクトルを示す図である。ＡＡＶ－ＥＰモル吸光係数スペクトルとｓｓＤＮＡモル吸光係数スペクトルとの交点は、等吸収点（２３９ｎｍ）を示す（矢印）。
【図9】図９Ａは、ＡＡＶ５－ＥＰ及びＡＡＶ５－ＦＰのＡＵＣ実験で決定された分子量、偏比容及びｆ／ｆ０（＝１．３２）を用いて計算した、ｎｃａｐｓｉｄｅとｎｓｓＤＮＡとの各組合せについての分子量、偏比容、ｓ値及びヌクレオチドの数の計算値をまとめた表である。２量体及びトライアングル三量体のｆ／ｆ０は、文献（Ｄｅ Ｌａ Ｔｏｒｒｅ ＪＧ，Ｂｌｏｏｍｆｉｅｌｄ ＶＡ．Ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｘ，ｒｉｇｉｄ，ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｑ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ．１９８１；１４（１）：８１－１３９．）に従って計算したｓ値とＡＵＣ実験で決定された分子量を用いたＳＥＤＦＩＴによって算出した。図９Ｂは、それぞれの会合状態についてのヌクレオチドの数とｓ値との間の相関を示すグラフである。図９Ｂのプロットは、図９Ａで得られた値を用いた。図９Ｃは、カプシド内に内包されたヌクレオチド数と沈降係数との相関関係を示す散布図である。白色マークと灰色マークとは、ロットが異なるサンプルであることを示す。
【発明を実施するための形態】
【0014】
（定義）
本明細書において「分子送達用粒子」は、分子を送達できる外被を有する小さな物体を意味する。分子送達用粒子の粒子サイズは、例えば、５ｎｍ～１０，０００ｎｍ、１０ｎｍ～５，０００μｍ、２０ｎｍ～１，０００ｎｍ、又は３０ｎｍ～５００ｎｍであってよい。分子送達用粒子は、例えばウイルス粒子、リポソーム、アルブミン粒子、ミセル又はポリ乳酸・グリコール酸共重合体（「ＰＬＧＡ」とも称される）粒子であってよい。分子送達用粒子は、ドラッグデリバリーシステムに利用することができる。分子送達用粒子がウイルス粒子である場合、例えば遺伝子治療又はウイルスベクターワクチンとして利用することができる。ウイルスは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、センダイウイルス、ステルスウイルス、レンチウイルス、又はレトロウイルスであってよい。分子送達用粒子は、公知の方法に従って調製することができる。１つの例において、分子送達用粒子は組換えウイルス粒子であってよい。組換えウイルス粒子は、遺伝子工学を用いて人工的に調製することができる。分子送達用粒子は、遺伝子工学を用いて製造されたウイルス粒子であってよく、培養細胞または卵で製造されたウイルス粒子であってもよい。
本明細書において「分子送達用粒子」は、分子を送達できる外被を有する小さな物体を意味する。分子送達用粒子の粒子サイズは、例えば、５ｎｍ～１０，０００ｎｍ、１０ｎｍ～５，０００μｍ、２０ｎｍ～１，０００ｎｍ、又は３０ｎｍ～５００ｎｍであってよい。分子送達用粒子は、例えばウイルス粒子、リポソーム、アルブミン粒子、ミセル又はポリ乳酸・グリコール酸共重合体（「ＰＬＧＡ」とも称される）粒子であってよい。分子送達用粒子は、ドラッグデリバリーシステムに利用することができる。分子送達用粒子がウイルス粒子である場合、例えば遺伝子治療又はウイルスベクターワクチンとして利用することができる。ウイルスは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、センダイウイルス、ステルスウイルス、レンチウイルス、又はレトロウイルスであってよい。分子送達用粒子は、公知の方法に従って調製することができる。１つの例において、分子送達用粒子は組換えウイルス粒子であってよい。組換えウイルス粒子は、遺伝子工学を用いて人工的に調製することができる。分子送達用粒子は、遺伝子工学を用いて製造されたウイルス粒子であってよく、培養細胞または卵で製造されたウイルス粒子であってもよい。
【0015】
本明細書において「外被」は、粒子の内部と外部とを隔てる構造体を意味する。外被は、例えばタンパク質又は脂質などの高分子を含む。分子送達用粒子は、例えば外被と、前記外被によって画定される内部空間とを含んでよい。分子送達用粒子は、例えば外被を含み、内部空間を含まなくてもよい。ウイルス粒子又はアルブミン粒子の外被は、例えば実質的にタンパク質から構成される。ウイルス粒子の外被は、例えばタンパク質で構成されるカプシドを含み、場合によりエンベロープをさらに含む。ウイルス粒子がアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子である場合、その外被は、３種類のカプシドタンパク質であるＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３を所定の比率で含むカプシドを含む。リポソームの外被は、例えば実質的に脂質から構成された脂質二重層を含んでよい。リポソームの外被は、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で修飾された脂質二重層を含んでよい。ミセルの外被は、例えば実質的に親水性部分と疎水性部分を有する化合物を含む。ＰＬＧＡ粒子の外被は、例えば実質的に所定の比率の乳酸とグリコール酸とを含む。
【0016】
分子送達用粒子において、外被は、例えば実質的に同一の組成を含む。１つの例において、分子送達用粒子が、第１粒子及び第２粒子を含み、前記第１粒子が第１外被及び第１送達分子を有し、前記第２粒子が第２外被を有する場合、前記第１外被と前記第２外被は、実質的に同一の組成で構成される。分子送達用粒子がウイルス粒子である場合、第１ウイルス粒子の第１外被及び第２ウイルス粒子の第２外被はそれぞれ、実質的に同一のタンパク質で構成される。ウイルス粒子がＡＡＶ粒子である場合、第１ＡＡＶ粒子の第１外被と第２ＡＡＶ粒子の第２外被はそれぞれ、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３を含む実質的に同一のタンパク質で構成される。分子送達用粒子がリポソームである場合、第１リポソームの第１外被と第２リポソームの第２外被はそれぞれ、実質的に同一の脂質成分で構成される脂質二重層を含む。本明細書において「実質的に同一の組成」は、主要な成分が同一であることを意味する。１つの例において、実質的に同一のタンパク質は、第１ポリペプチドを主要な成分として含んでよい。１つの例において、実質的に同一のタンパク質は、所定の割合の第１ポリペプチド及び第２ポリペプチドを主要な成分として含んでよい。１つの例において、実質的に同一の脂質は、所定の割合の第１脂肪酸と第２脂肪酸を主要な成分として含んでよい。
【0017】
分子送達用粒子は、例えば外被表面に、外被中に、又は外被の内部に、送達される分子（本明細書において「送達分子」ともいう）を含んでよい。本明細書において、分子送達用粒子の文脈で用いられる「送達分子」は、例えばポリヌクレオチド、ポリペプチド、タンパク質、糖タンパク質、脂質、有機化合物又は放射性物質、若しくはそれらの組合せであってよい。ポリヌクレオチドは、例えばＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子であってよい。ＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子は、例えば一本鎖又は二本鎖であってよい。ポリペプチドは、例えば天然アミノ酸又は非天然アミノ酸、もしくはそれらの組合せで構成されていてよい。ポリペプチドは、例えば酵素又は抗体であってよい。ポリヌクレオチド又はポリペプチドは、例えば化学修飾されていてよい。有機化合物は、例えば抗がん剤としての利用される薬物であってよい。有機化合物は、例えば栄養素として利用されるものであってよい。放射性物質は、例えば塩化ストロンチウム及び塩化ラジウムであってよい。送達分子は外被であってもよい。
【0018】
分子送達用粒子は、例えば２タイプ以上の粒子（例えば第１粒子及び第２粒子）を含んでよい。分子送達用粒子がウイルス粒子の場合、ウイルス粒子は、例えば、第１粒子として外被であるカプシド及びそのゲノムＤＮＡ分子を含む完全ウイルス粒子、及び第２粒子としてカプシドを含むがゲノムＤＮＡ分子を含まないカプシド粒子（本明細書において「中空粒子」とも称する）を含んでよい。分子送達用粒子に含まれる２以上のタイプの粒子の組合せは、目的に応じて適宜設定することができる。１つの例において、完全ウイルス粒子を第１粒子とし、カプシド粒子を第２粒子とし、さらにその他のウイルス粒子（例えば完全ウイルス粒子の２量体、カプシド粒子の２量体、完全ウイルス粒子とカプシド粒子の２量体、又はウイルス粒子の凝集体、もしくはそれらの混合物）を第３粒子としてよい。例えば、第３粒子が完全ウイルス粒子とカプシド粒子の２量体である場合、第３粒子は、２個のカプシドを含む第３外被及び１個のゲノムＤＮＡを含む第３送達分子を含む。他の例において、カプシド粒子を第１粒子とし、完全ウイルス粒子を第２粒子とし、及びその他のウイルス粒子を第３粒子としてよい。
【0019】
上記例では、ウイルス粒子のタイプについて説明したが、粒子のタイプはそれらに限定されない。例えば、分子送達用粒子がリポソームである場合、リポソームは、外被である脂質二重層及びカプセル化された分子を含む完全粒子を第１粒子として、脂質二重層を含むが前記分子を含まない中空粒子を第２粒子として含んでよい。他の例において、リポソームは、完全粒子を第１粒子として、中空粒子を第２粒子として、その他の粒子（例えばリポソームの凝集体）を第３粒子として含んでよい。分子送達用粒子がアルブミン粒子である場合、アルブミン粒子は、第１の分子量を有する粒子を第１粒子として、第２の分子量を有する粒子を第２粒子として含んでよい。
【0020】
分子送達用粒子は、例えば、動物の体内の所定の場所に分子を送達するために用いることができる。動物は、例えば爬虫類、鳥類又は哺乳動物であってよい。哺乳動物は、例えばヒト又はヒト以外の哺乳動物であってよい。ヒト以外の哺乳動物は、例えばマウスなどの齧歯類、チンパンジーなどの非ヒト霊長類、ウシなどの偶蹄目、ウマなどの奇蹄目、又はイヌ及びネコなどの愛玩動物であってよい。１つの実施形態において、哺乳動物は非ヒト霊長類又はヒトである。所定の場所は、例えば動物の臓器又は細胞であってよい。所定の臓器は、例えば心臓、肺、肝臓、胃、膵臓又は腎臓であってよい。所定の細胞は、例えば正常な細胞又は異常な細胞であってよい。正常な細胞は、例えば心筋細胞、肝細胞又は血球細胞であってよい。異常な細胞は、例えばがん細胞であってよい。
【0021】
分子送達用粒子の分子量は、例えば静的光散乱法、動的光散乱法及び遠心分離法と動的光散乱法との組合せなどの公知の方法を利用して測定することができる。また、分子送達用粒子の分子量は、公知の値であってよく、又は理論的に算出した値であってよい。例えば、粒子がＡＡＶ粒子である場合、ＡＡＶ粒子のカプシドの分子量は、３種の構造タンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３）それぞれのアミノ酸組成と、それら構造タンパク質の比率に基づいて算出することができる。組換えＡＡＶは、例えば所定の目的を奏するように改変されたゲノムＲＮＡを含む。改変されたゲノムＲＮＡ分子の分子量は、設計したヌクレオチド配列に基づいて算出することができる。組換えＡＡＶの分子量は、カプシドの分子量とゲノムＲＮＡ分子の分子量とを足し合わせることで算出することができる。他の例において、分子送達用粒子の分子量は、例えば、公知の分子量を決定する方法、又は本明細書に開示した方法（例えば後述する“分子量を決定することを含む分子送達用粒子を特徴づける方法”）に従って決定することができる。
【0022】
本明細書において「光測定」は、測定対象に光を照射して、前記測定対象からの光シグナルを記録した光学データを取得できる方法を意味する。光測定は、光測定手段によって実施することができる。光測定手段は、例えば発光装置と、光検出装置と、光学データを記録し、且つ出力できる装置とを含んでよい。発光装置は、例えば、目的に応じて１種又は複数の波長の光を発することができる。発光装置は、例えば発光ダイオード、レーザー光、キセノンランプ及びハロゲンランプなどの光源、及び場合により所定の波長を分光するための分光器又は所定の波長を透過もしくは反射させる光学フィルターを含む。光検出装置は、例えば光電子増倍管、シリコンフォトダイオード又はアバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）、もしくはそれらの組合せを含んでよい。光検出装置は、例えば干渉計、示差屈折率検出器（ＲＩＤ）、分光光度計又は吸光度計、もしくはそれらの組合せを含んでよい。光学データを記録し、且つ出力できる装置は、例えばハードディスクドライブ（ＨＤＤ）又はソリッドステートドライブ（ＳＳＤ）であってよい。光測定手段は、光検出装置と発光装置と光学データの記録及び出力ができる装置とが一体となった１ユニットの装置、又はそれらが分離した複数ユニットの装置であってよい。そのような１ユニットの装置又は複数ユニットの装置は、商業的に入手可能である。
【0023】
光測定に用いられる波長は、例えば分子送達用粒子に応じて設定することができる。光測定に用いられる波長は、例えば分子送達用粒子を構成する外被成分又は送達される分子の極大吸光波長及び／又はその周辺の波長を用いてよい。光測定では、目的に応じて、１種又は複数の測定波長の光が用いられてよい。光測定では、例えば１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種又は１１種以上の波長の光が用いられてよい。１つの例において、光測定では、５種、７種、９種、１１種又は１３種の波長の光が用いられる。１つの例において、光測定では、９種、１１種又は１３種の波長の光が用いられる。
【0024】
本明細書において「光学データ」は、測定対象に光を照射して測定された光シグナルの記録を含む情報を意味する。光学データは、例えば、透過光、散乱光、反射光、吸収、屈折率又は吸光度、もしくはそれらの組合せに関するデータを含む。１つの例において、光学データは、吸光度に関するデータ（本明細書において「吸光度データ」という）及び屈折率に関するデータ（本明細書において「屈折率データ」という）を含む。屈折率データは、例えば干渉計を用いて得ることができる。吸光度データは、例えば吸光度計を用いて得ることができる。光測定が所定の時間間隔で所定回数、行われる場合、光学データは、測定時間の情報及び所定回数分のデータを含んでよい。光測定が複数の測定波長を用いて行われる場合、光学データは、前記複数の測定波長のうちの各波長についての光学データを含んでよい。
【0025】
本明細書において「粒子分離」は、２タイプ以上の粒子を含む粒子集団から、各タイプの粒子を区別可能にする方法を意味する。粒子分離は、例えば粒子の特性に基づいて、２タイプ以上の粒子を含む粒子集団から、各タイプの粒子分布におけるピークを区別可能にする方法であってよい。粒子分離は、例えばクロマトグラフィー（例えばイオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー又はアフィニティークロマトグラフィー、もしくはそれらの組合せ）、遠心分離法又はフィールド・フロー・フラクショネーション（ＦＦＦ）であってよい。本明細書において超遠心分離法は１０，０００Ｇ以上の加速度を生み出す遠心分離法である。粒子分離は、１つのタイプの粒子を含む粒子集団、２つのタイプの粒子を含む粒子集団、又は３タイプ以上の粒子を含む粒子集団に適用することができる。１つの例において、粒子分離により区別可能に分離された粒子群のうち、数の多い順に第１粒子、第２粒子などとしてよい。他の例において、粒子分離により区別可能に分離された粒子群のうち、所定の沈降係数などの物理量付近の値を示す粒子を第１粒子としてよい。分子送達用粒子は、粒子分離の方法に適した溶媒中に溶解又は分散される。分子送達用粒子を含有する溶液又は分散液が、光測定を伴う粒子分離に供される。粒子分離は、粒子分離手段を用いて実施することができる。粒子分離手段は、例えば遠心分離装置又はクロマトグラフィー装置（例えばＨＰＬＣ）であってよい。１つの実施形態において、粒子分離は遠心分離である。１つの実施形態において、粒子分離はクロマトグラフィーである。１つの実施形態において、粒子分離はＦＦＦである。
【0026】
「光測定を伴う粒子分離」は、粒子分離中に又は粒子分離後に光測定を行うことを含む。１つの例において、分子送達用粒子を遠心分離に供する場合、遠心分離中の分子送達用粒子に対して光測定を行ってよい。１つの例において、分子送達用粒子をクロマトグラフィーに供する場合、クロマトグラフィーにより分画された分子送達用粒子を含む液滴または分割された溶液に対して光測定を行ってよい。後述する“分子量を決定することを含む分子送達用粒子を特徴づける方法”の文脈で用いられる「光測定を伴う遠心分離」は、１つのタイプの粒子を含む分子送達用粒子を、遠心分離中に光測定することを含む。
【0027】
光測定を伴う粒子分離は、光測定手段を備えた粒子分離手段を用いて実施することができる。光測定手段を備えた粒子分離手段は、例えば粒子分離手段と光測定手段とが一体となった１ユニットの装置であってよく、粒子分離手段と光測定手段とが分離した２ユニット又は３ユニット以上の装置であってもよい。光測定手段を備えた粒子分離手段では、粒子分離手段にて分子送達用粒子がそのタイプに分離されている間に、あるいは分離された後に、光測定手段を用いて光学データが取得されてよい。光測定を伴う粒子分離は、例えば光測定を伴う遠心分離又はクロマトグラフィーであってよい。
【0028】
粒子分離の文脈で用いられる「粒子の特性」は、例えばモル吸光係数、拡散係数、沈降係数、又はバルク特性（例えば粒子サイズ、形状、分子量、密度又は偏比容）、もしくはそれらの組合せであってよい。粒子の特性は、光測定を伴う粒子分離に分子送達用粒子を供して得られる光学データ（例えば屈折率データ又は吸光度データ、もしくはそれらの組合せ）から直接的に又は間接的に得ることができる。粒子分離が遠心分離である場合、溶液中の粒子は遠心力が負荷される遠心方向に向かって沈降し、溶液中に粒子が存在しなくなった領域と存在する領域との間に移動境界面が生じる。この移動境界面の形状及び時間変化は、粒子の沈降係数及び拡散係数を反映する。粒子の沈降係数及び拡散係数から、公知の関係式を用いて、例えば式（３）を用いて粒子の分子量を算出することができる。移動境界面に関する情報は、例えば屈折率データ及び吸光度データに含まれる。他の例において、屈折率データから粒子のモル濃度を得ることができる。他の例において、屈折率データ及び吸光度データから粒子のモル吸光係数を得ることができる。
【0029】
本明細書において「屈折率増分」は、分子送達用粒子を含む溶液の屈折率ｎの変化を示す。１つの例において、屈折率増分は、本明細書に開示した方法により、分子送達用粒子に含まれる粒子のタイプごとに決定される。１つの例において、屈折率増分は、分子送達用粒子に含まれる１つの粒子タイプ及びその他の粒子タイプの混合物について決定される。
【0030】
本明細書において「比屈折率変化値」は、分子送達用粒子を含む溶液の粒子濃度ｃの変化に対する屈折率ｎの変化の割合を意味し、例えば微分係数ｄｎ／ｄｃで表される。１つの例において、比屈折率変化値は、本明細書に開示した方法により、分子送達用粒子に含まれる粒子のタイプごとに決定される。１つの例において、比屈折率変化値は、分子送達用粒子に含まれる１つの粒子タイプ及びその他の粒子タイプの混合物について決定される。
【0031】
本明細書において「吸光度」は、測定光が分子送達用粒子を通過した際に、光の強度が減弱した程度を示す値である。１つの例において、吸光度分は、本明細書に開示した方法により、分子送達用粒子に含まれる粒子のタイプごとに決定される。１つの例において、吸光度は、分子送達用粒子に含まれる１つの粒子タイプ及びその他の粒子タイプの混合物について決定される。
【0032】
本明細書において「モル濃度」は、単位体積の溶液中の分子送達用粒子の濃度を示す値である。１つの例において、モル濃度は、本明細書に開示した方法により、分子送達用粒子に含まれる粒子のタイプごとに決定される。１つの例において、モル濃度は、分子送達用粒子に含まれる１つの粒子タイプ及びその他の粒子タイプの混合物について決定される。
【0033】
本明細書において「偏比容」は１グラムの分子送達用粒子を多量の溶媒に溶かしたときの溶液の容積増加である。偏比容は、ほぼ密度の逆数に相当する。１つの例において、偏比容は、本明細書に開示した方法により、分子送達用粒子に含まれる粒子のタイプごとに決定される。１つの例において、偏比容は、分子送達用粒子に含まれる１つの粒子タイプ及びその他の粒子タイプの混合物について決定される。
【0034】
本明細書において「モル吸光係数」は、光路１ｃｍあたりの１Ｍ溶液の光学濃度である。１つの例において、モル吸光係数は、本明細書に開示した方法により、分子送達用粒子に含まれる粒子の成分ごとに決定される。例えば、分子送達用粒子が第１粒子及び第２粒子を含み、前記第１粒子が第１外被及び第１送達分子を有し、第２粒子が第２外被を有する場合、モル吸光係数は、第１外被、第２外被及び第１送達分子について決定される。
【0035】
本明細書において「等吸収点」は、目的とする２種以上の物質が同じの吸光度又はモル吸光係数を示す光の波長を意味する。１つの例において、分子送達用粒子が第１粒子及び第２粒子を含み、前記第１粒子が第１外被及び第１送達分子を含み、第２粒子が第２外被を有する場合、等吸収点は、第１送達分子のモル吸光係数と第２外被のモル吸光係数とが一致する波長であってよい。１つの例において、等吸収点は、本明細書に開示した方法により、特定することができる。具体的には、等吸収点は、例えば、前記第１粒子及び前記第２粒子を含む前記分子送達用粒子を、本明細書に開示した光測定を伴う粒子分離に供し、前記第１送達分子及び前記第２粒子それぞれのモル吸光係数を複数の測定波長にて決定し、前記複数の測定波長での前記第１送達分子のモル吸光係数の近似曲線と、前記複数の測定波長での前記第２粒子のモル吸光係数の近似曲線との交点を特定することによって、決定することができる。
【0036】
本明細書において「量比」は、所定の物質の量に対する他の物質の量の割合を示す。１つの例において、分子送達用粒子が第１粒子及び第２粒子を含む場合、量比は、第１粒子の量に対する第２粒子の量の比あってよい。１つの例において、量比は、第１粒子の数に対する第２粒子の数の比であってよい。１つの例において、量比は、分子送達用粒子に含まれる１つの粒子タイプに対する他の粒子タイプの混合物の数の比であってよい。１つの例において、量比は、分子送達用粒子が第１粒子、第２粒子及び第３粒子を含む場合、分子送達用粒子の量（第１粒子の量＋第２粒子の量＋第３粒子の量）に対する第１粒子の量の百分率（％）であってよい。
【0037】
後述する第１溶液の文脈で用いられる「溶媒」は、分子送達用粒子に適合する溶媒であれば特に制限なく用いることができる。前記溶媒は、例えば軽水（Ｈ２Ｏ）であってよい。後述する第２溶液の文脈で用いられる「同位体標識溶媒」は、前記溶媒と同一の化学式を有するが、１つ又は複数の元素が対応する元素の同位体で置換されている。前記同位体は、例えば非放射性同位体又は放射性同位体であってよく、好ましくは非放射性同位体である。同位体での置換は、例えば水素原子１Ｈを重水素原子２Ｈに交換すること、又は酸素原子１６Ｏを１８Ｏに交換することであってよい。前記溶媒が軽水（Ｈ２Ｏ）である場合、同位体標識溶媒はＨ２
１８Ｏであってよい。第１溶液は、前記溶媒に加えて、同位体標識溶媒を第１比率でさらに含んでもよい。溶媒に対する同位体標識溶媒の第１比率（同位体標識溶媒：溶媒）は、例えば０：１００であってよく、または１０：９０であってもよい。第２溶液は、前記同位体標識溶媒に加えて、溶媒を第２比率でさらに含んでもよい。第１比率と第２比率とは異なる。溶媒に対する同位体標識溶媒の第１比率（同位体標識溶媒：溶媒）は、例えば３５：６５であってよく、または６０：４０であってよい。第１溶液及び第２溶液は、リン酸若しくはその塩などの緩衝剤、塩化ナトリウムなどの無機塩類をさらに含んでいてよい。
【0038】
分子量を決定することを含む分子送達用粒子を特徴づける方法
本発明の１つの態様は、分子量を決定することを含む分子送達用粒子を特徴づける方法を提供する。１つの実施形態において、前記方法は、分子送達用粒子と溶媒とを含む第１溶液を、光測定を伴う遠心分離に供して、第１溶液中の前記分子送達用粒子の沈降係数を決定すること；及び分子送達用粒子と同位体標識溶媒とを含む第２溶液を、光測定を伴う遠心分離に供して、第２溶液中の前記分子送達用粒子の沈降係数を決定することを含む。
本発明の１つの態様は、分子量を決定することを含む分子送達用粒子を特徴づける方法を提供する。１つの実施形態において、前記方法は、分子送達用粒子と溶媒とを含む第１溶液を、光測定を伴う遠心分離に供して、第１溶液中の前記分子送達用粒子の沈降係数を決定すること；及び分子送達用粒子と同位体標識溶媒とを含む第２溶液を、光測定を伴う遠心分離に供して、第２溶液中の前記分子送達用粒子の沈降係数を決定することを含む。
【0039】
第１溶液中の分子送達用粒子の沈降係数を決定する工程と、第２溶液中の分子送達用粒子の沈降係数を決定する工程とは、同時に実施されてもよく、順次に実施されてもよい。１つの実施形態において、前記２つの工程は同時に実施される。
【0040】
分子送達用粒子と溶媒とを含む第１溶液を、光測定を伴う遠心分離に供することで、第１溶液の光学データ（例えば吸光度データを含む）が得られる。前記光学データから、実施例に記載の方法に従って、第１溶液中の前記分子送達用粒子の沈降係数が決定される。具体的には、前記光学データから、例えば商業的に利用可能なプログラム（例えばプログラムＧＵＳＳＩ又はＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ）を用いて、第１溶液中の前記分子送達用粒子の沈降係数分布を得て、公知のモデル式（例えばプログラムＳＥＤＦＩＴのｃ（ｓ）分布モデル）をグローバルフィットさせることで、第１溶液中の前記分子送達用粒子の沈降係数が決定される。同様にして、分子送達用粒子と同位体標識溶媒とを含む第２溶液を、光測定を伴う遠心分離に供することで、第２溶液の光学データ（例えば吸光度データを含む）が得られ、前記光学データから、第２溶液中の前記分子送達用粒子の沈降係数が決定される。
【0041】
本方法により決定された沈降係数は、例えば分子送達用粒子がウイルス粒子である場合、分子送達用粒子の分子量、摩擦係数比（ｆ／ｆ０）、偏比容、溶媒密度及び溶媒粘度から計算された沈降係数と比較することができる。摩擦係数、溶媒密度及び溶媒粘度から、沈降係数を算出する方法は公知であり、例えばAnalytical Ultracentrifugation Instrumentation, Software, and Applicationsを参照することができる。
【0042】
分子量を決定することを含む分子送達用粒子を特徴づける方法は、第１溶液中での分子送達用粒子の前記沈降係数と、第２溶液中での分子送達用粒子の前記沈降係数とに基づいて、前記分子送達用粒子の偏比容を決定する工程をさらに含む。分子送達用粒子の偏比容は、実施例に記載されている方法に従って決定することができる。具体的には、第１溶液及び第２溶液中の分子送達用粒子の沈降プロファイル（例えば図２に示される時間依存的なセル内濃度分布）に、公知のモデル式（例えばＳＥＤＰＨＡＴの“Ｈｙｂｒｉｄ Ｇｌｏｂａｌ Ｄｉｓｃｒｅｔｅ Ｓｐｅｃｉｅｓ Ｇｌｏｂａｌ Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ”モデル）をグローバルにフィットさせて、偏比容が決定される。
【0043】
分子送達用粒子が中空粒子である場合、中空粒子の偏比容は、アミノ酸組成から算出される分子量及びプログラムＳＥＤＮＴＥＲＰを用いて得ることができる。分子送達用粒子が完全粒子である場合、完全粒子の偏比容は、式１を用いて算出することができる。
【0044】
分子量を決定することを含む分子送達用粒子を特徴づける方法は、第１溶液中での前記分子送達用粒子の前記沈降係数と、第２溶液中での前記分子送達用粒子の前記沈降係数と、前記分子送達用粒子の前記偏比容とに基づいて、前記分子送達用粒子の分子量を決定する工程をさらに含む。沈降係数及び偏比容に基づいて分子量を決定する方法は、公知であり、例えば蛋白質科学会アーカイブ，１，ｅ０４３（２００８）（http://www.pssj.jp/archives/protocol/measurement/XLA_01/XLA_01.html）及びAnalytical Ultracentrifugation Instrumentation, Software, and Applicationsを参照することができる。具体的には、分子送達用粒子の分子量は、粒子の沈降係数及び偏比容を以下の数式に代入することで算出することができる。
式中、ｓは粒子の沈降係数であり、Ｍは粒子の分子量であり、ｖｂａｒは粒子の偏比容であり、ρは溶媒密度であり、Ｎはアボガドロ数であり、ｆは摩擦係数である。摩擦係数ｆは以下の数式から算出することができる。
ηは溶媒粘度であり、Ｒｓは粒径である。粒径Ｒｓは以下の数式から算出することができる。
【数1】
【数2】
【数3】
【0045】
１つの実施形態において、分子送達用粒子を特徴づける方法は、光測定を伴う遠心分離によって得られた分子送達用粒子と溶媒とを含む第１溶液の光学データ（吸光度データを含む）から、第１溶液中の前記分子送達用粒子の沈降係数を決定し、光測定を伴う遠心分離によって得られた分子送達用粒子と同位体標識溶媒とを含む第２溶液の光学データ（吸光度データを含む）から、第２溶液中の前記分子送達用粒子の沈降係数を決定し、第１溶液中の前記分子送達用粒子の前記沈降係数と、第２溶液中の前記分子送達用粒子の前記沈降係数とに基づいて、前記分子送達用粒子の偏比容を決定し、及び第１溶液中での前記分子送達用粒子の前記沈降係数と、第２溶液中での前記分子送達用粒子の前記沈降係数と、前記分子送達用粒子の前記偏比容とに基づいて、前記分子送達用粒子の分子量を決定することを含む。
【0046】
本態様における分子量を決定する方法によると、分子量が未知の分子送達用粒子、理論的に分子量の算出が難しい分子送達用粒子（例えば、天然由来の不活化ウイルスや弱毒化ウイルス、ｍＲＮＡを脂質に内包した脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）等）であっても分子量を決定することができる。また、本実施形態における分子量を決定する方法によると、光測定を伴う遠心分離において、他の粒子の特性と併せて分子量を決定することができる。
【0047】
分子量を決定することを含む分子送達用粒子を特徴づける方法における光測定では、例えば１種または複数の測定波長を用いて、分子送達用粒子の吸光度に関するデータ、場合により他の光学データが取得される。前記光測定では、例えば１種の波長が用いられてよい。前記方法に係る光測定を伴う遠心分離には、例えば超遠心分析装置ＯＰＴＩＭＡ（ベックマン・コールター、米国）を用いることができる。
【0048】
モル濃度を決定することを含む分子送達用粒子を特徴づける方法
本発明の１つの態様は、モル濃度を決定することを含む分子送達用粒子を特徴づける方法を提供する。１つの実施形態において、前記方法は、第１粒子及び第２粒子を含む分子送達用粒子を、光測定を伴う粒子分離に供して、前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれの屈折率増分を決定すること；及び、前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれの前記屈折率増分と、分子量と、比屈折率変化値とに基づいて、前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれのモル濃度を決定することを含む。
本発明の１つの態様は、モル濃度を決定することを含む分子送達用粒子を特徴づける方法を提供する。１つの実施形態において、前記方法は、第１粒子及び第２粒子を含む分子送達用粒子を、光測定を伴う粒子分離に供して、前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれの屈折率増分を決定すること；及び、前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれの前記屈折率増分と、分子量と、比屈折率変化値とに基づいて、前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれのモル濃度を決定することを含む。
【0049】
第１粒子及び第２粒子を含む分子送達用粒子を、光測定を伴う粒子分離に供することで、前記分子送達用粒子についての光学データ（例えば屈折率データを含む）が得られ、第１粒子と第２粒子とが区別できるように分離される。前記光学データは、第１粒子及び第２粒子それぞれの屈折率増分に関する情報を含む。前記光学データから、例えば実施例に記載の方法に従って、前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれの屈折率増分を決定することができる。具体的には、前記光学データから、例えば、プログラムＳＥＤＦＩＴにて解析することで、前記分子送達用粒子の沈降係数分布又は溶出成分のピーク面積を得て、商業的もしくは無料で利用可能なプログラム（例えばＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ又はプログラムＧＵＳＳＩ）を用いて、第１粒子及び第２粒子それぞれの屈折率増分を決定することができる。沈降係数分布は、例えば光測定を伴う遠心分離により得ることができる。溶出成分のピーク面積は、例えば光測定を伴うクロマトグラフィーにより得ることができる。
【0050】
モル濃度を決定する工程では、第１粒子及び第２粒子それぞれについての屈折率増分（δｄ）を、濃度あたりの屈折率変化値である比屈折率変化値（ｄｎ／ｄｃ）で割り付けることによりグラム濃度をそれぞれ得て、さらにそれぞれの分子量で割りつけることにより、前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれのモル濃度を決定することができる。
【0051】
第１粒子及び第２粒子それぞれの比屈折率変化値（ｄｎ／ｄｃ）は、例えば、実施例に記載の方法又は公知の方法に従って、決定することができる。具体的には、粒子のアミノ酸組成からＳＥＤＦＩＴを用いて決定することができる。または、第１粒子及び第２粒子それぞれの比屈折率変化値は、公知の値を用いてもよい。例えば、リン脂質及び脂質の比屈折率変化値は、Optical characterization of liposomes by right-angle light scattering and turbidity'' Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes 1467, 1, 219-226 (2000)に記載の値を用いることができる。また、リン脂質又は脂質などの成分の比屈折率変化は、タンパク質の比屈折率変化とほぼ同じ値となることから、タンパク質について決定された比屈折率変化値を用いることができる。
【0052】
第１粒子及び第２粒子それぞれのモル濃度は、例えば前記した“分子量を決定することを含む分子送達用粒子を特徴づける方法”に従って決定した分子量を用いて、又は場合により第１粒子及び第２粒子の組成から理論的に推定される分子量を用いて、決定することができる。
【0053】
１つの実施形態において、モル濃度を決定することを含む分子送達用粒子を特徴づける方法は、光測定を伴う粒子分離によって得られた前記分子送達用粒子の屈折率データから、前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれの屈折率増分を決定すること；及び前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれの前記屈折率増分と、分子量と、比屈折率変化値に基づいて、前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれのモル濃度を決定することを含む。
【0054】
前記した実施形態では、第１粒子及び第２粒子を含む分子送達用粒子を例示したが、本態様に用いられる分子送達用粒子はこれに限定されない。本態様に用いられる分子送達用粒子は、３つのタイプの粒子（例えば第１粒子、第２粒子、及び第３粒子）または４つ以上のタイプの粒子を含んでいてもよい。
【0055】
１つの実施形態において、前記第１粒子は第１外被及び第１送達分子を含み、前記第２粒子は第２外被を含む。１つの例において、前記第２外被は、前記第１外被の組成と実質的に同一の組成を含む。１つの例において、前記第２粒子は、送達分子を含まない。１つの実施形態において、前記第１粒子は第１外被及び第１送達分子を含み、前記第２粒子は、前記第１外被の組成と実質的に同一の組成で構成される第２外被を含むが、送達分子は含まない。１つの例において、分子送達用粒子が、第３粒子を含む場合、前記第３粒子は、前記第１外被の組成と実質的に同一の組成で構成される第３外被を含み、第１送達分子と実質的に同一組成の第３送達分子を含む。１つの例において、分子送達用粒子がウイルス粒子である場合、第１ウイルス粒子は、第１外被としてカプシドを含み、第１送達分子として所定の鎖長の第１ポリヌクレオチドを含む。この例において、第２ウイルス粒子は、第２外被として前記カプシドを含むが、送達分子としてのポリヌクレオチドを含まない。この例において、第３ウイルス粒子は、例えば、第３外被として前記カプシドを含むが、第３送達分子として第１ポリヌクレオチドの鎖長よりも短い鎖長の第３ポリヌクレオチドを含んでよい。他の例において、第３ウイルス粒子は、例えばウイルス粒子の凝集体であってよく、前記ウイルス粒子の凝集体は、例えば、第３外被として３つの前記カプシドを含み、第３送達分子として第１ポリヌクレオチドの鎖長よりも長い総鎖長の第３ポリヌクレオチドを含んでよい。
【0056】
前記方法における光測定では、例えば１種または複数の測定波長を用いて、分子送達用粒子の屈折率に関するデータ、場合により他の光学データが取得される。前記光測定では、例えば１種の波長が用いられてよい。前記方法に係る光測定を伴う遠心分離には、例えば超遠心分析装置ＯＰＴＩＭＡ（ベックマン・コールター、米国）を用いることができる。
【0057】
モル吸光係数を決定することを含む分子送達用粒子を特徴づける方法
本発明の１つの態様は、モル吸光係数を決定することを含む分子送達用粒子を特徴づける方法を提供する。１つの実施形態において、前記方法は、第１粒子及び第２粒子を含む分子送達用粒子を、複数の測定波長での光測定を伴う粒子分離に供して、前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれの吸光度を、前記複数の測定波長の各測定波長について決定すること；及び前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれの前記吸光度と、前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれの前記モル濃度とに基づいて、前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれのモル吸光係数を、前記各測定波長について決定することを含む。
本発明の１つの態様は、モル吸光係数を決定することを含む分子送達用粒子を特徴づける方法を提供する。１つの実施形態において、前記方法は、第１粒子及び第２粒子を含む分子送達用粒子を、複数の測定波長での光測定を伴う粒子分離に供して、前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれの吸光度を、前記複数の測定波長の各測定波長について決定すること；及び前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれの前記吸光度と、前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれの前記モル濃度とに基づいて、前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれのモル吸光係数を、前記各測定波長について決定することを含む。
【0058】
第１粒子及び第２粒子を含む分子送達用粒子を、複数の測定波長での光測定を伴う粒子分離に供することで、前記分子送達用粒子についての光学データ（例えば吸光度データを含む）が得られ、第１粒子と第２粒子とが区別できるように分離される。前記光学データは、各測定波長について第１粒子及び第２粒子それぞれの吸光度に関する情報を含む。前記光学データから、実施例に記載の方法に従って、第１粒子及び第２粒子それぞれの吸光度が各測定波長について決定される。具体的には、前記光学データのうちある測定波長の光学データから、例えば商業的に利用可能なプログラム（例えばプログラムＧＵＳＳＩ）を用いて、前記分子送達用粒子の沈降係数分布を得て、公知のモデル式（例えばプログラムＳＥＤＦＩＴのｃ（ｓ）分布モデル）をグローバルフィットさせることで、その測定波長における第１粒子及び第２粒子の吸光度がそれぞれ決定される。決定された第１粒子及び第２粒子それぞれの吸光度は、沈降係数分布において観察される第１粒子及び第２粒子それぞれに対応するピークのピーク面積に相当する。他の測定波長の光学データについても、同様に処理することで、用いた複数の測定波長について、第１粒子及び第２粒子の吸光度がそれぞれ決定される。
【0059】
モル吸光係数を決定する工程で用いられる第１粒子及び第２粒子それぞれのモル濃度は、前記した“モル濃度を決定することを含む分子送達用粒子を特徴づける方法”を用いて得ることができる。この工程は、ある測定波長での第１粒子の吸光度を、前記第１粒子のモル濃度とで割りつけることで、その波長での第１粒子のモル吸光係数を得ることができる。同様にして、その測定波長での第２粒子の吸光度を、前記第２粒子のモル濃度で割りつけることで、その波長での第２粒子のモル吸光係数を得ることができる。他の測定波長の光学データについても、同様に処理することで、用いた複数の測定波長について、第１粒子及び第２粒子のモル吸光係数がそれぞれ決定される。
【0060】
１つの実施形態において、モル吸光係数を決定することを含む分子送達用粒子を特徴づける方法は、第１粒子及び第２粒子を含む分子送達用粒子を、光測定を伴う粒子分離に供して、前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれの屈折率増分を特定の波長について決定すること；前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれの吸光度を複数の測定波長について決定すること；前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれの前記屈折率増分と、分子量と、比屈折率変化値とに基づいて、前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれのモル濃度を決定すること；及び前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれの前記吸光度と、前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれの前記モル濃度とに基づいて、前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれのモル吸光係数を、前記各測定波長について決定することを含む。前記実施形態において、屈折率増分を決定するための光測定を伴う粒子分離と、吸光度を決定するための光測定を伴う粒子分離とは、同時に実施されてもよく、順次に実施されてもよい。１つの実施形態において、前記２つの光測定を伴う粒子分離は同時に実施される。
【0061】
１つの実施形態において、モル吸光係数を決定することを含む分子送達用粒子を特徴づける方法は、光測定を伴う粒子分離によって得られた前記分子送達用粒子の屈折率データから、前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれの屈折率増分を決定すること；前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれの前記屈折率増分と、分子量と、比屈折率変化値とに基づいて、前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれのモル濃度を決定すること；複数の測定波長での光測定を伴う粒子分離によって得られた分子送達用粒子の吸光度データから、前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれの吸光度を、前記複数の測定波長の各測定波長について決定すること；及び前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれの前記吸光度と、前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれの前記モル濃度とに基づいて、前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれのモル吸光係数を、前記各測定波長について決定することを含む。前記屈折率データ及び前記吸光度データは、１つの光学データに格納されていてもよく、２つの異なる光学データにそれぞれ格納されていてよい。１つの実施形態において、前記２つのデータは、１つの光学データに格納されている。
【0062】
前記した実施形態では、第１粒子及び第２粒子を含む分子送達用粒子を例示したが、本態様に用いられる分子送達用粒子はこれに限定されない。本態様に用いられる分子送達用粒子は、３つのタイプの粒子（例えば第１粒子、第２粒子、及び第３粒子）または４つ以上のタイプの粒子を含んでいてもよい。
【0063】
前記方法における光測定では、複数の測定波長を用いて、分子送達用粒子の吸光度に関するデータ、場合により他の光学データが取得される。前記光測定では、例えば２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１１種又は１２種以上の波長の光が用いられてよい。１つの例において、光測定では、５種、７種、９種、１１種又は１３種の波長の光が用いられる。他の例では、９種、１１種又は１３種の波長の光が用いられる。前記方法に係る光測定を伴う遠心分離には、例えば超遠心分析装置ＯＰＴＩＭＡ（ベックマン・コールター、米国）を用いることができる。
【0064】
第１送達分子のモル吸光係数を決定することを含む分子送達用粒子を特徴づける方法
本発明の１つの態様は、第１送達分子のモル吸光係数を決定することを含む分子送達用粒子を特徴づける方法を提供する。前記方法では、第１粒子及び第２粒子を含み、前記第１粒子が第１外被及び第１送達分子を有し、及び前記第２粒子が第２外被を有する、分子送達用粒子を用いることができる。１つの例において、前記第１粒子は第１外被及び第１送達分子を含み、前記第２粒子は、前記第１外被と実質的に同一組成の第２外被を含むが、送達分子を含まない。前記方法は、前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれの前記吸光度と、前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれのモル濃度とに基づいて、前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれのモル吸光係数を各測定波長について決定すること；及び前記第１粒子の前記モル吸光係数から、前記第２粒子の前記モル吸光係数を差し引いて、前記第１送達分子のモル吸光係数を、各測定波長について決定することを含む。第１粒子及び第２粒子それぞれのモル濃度は、前記した“モル濃度を決定することを含む分子送達用粒子を特徴づける方法”に従って決定することができる。第１粒子及び第２粒子それぞれのモル吸光係数は、前記した“モル吸光係数を決定することを含む分子送達用粒子を特徴づける方法”に従って決定することができる。
本発明の１つの態様は、第１送達分子のモル吸光係数を決定することを含む分子送達用粒子を特徴づける方法を提供する。前記方法では、第１粒子及び第２粒子を含み、前記第１粒子が第１外被及び第１送達分子を有し、及び前記第２粒子が第２外被を有する、分子送達用粒子を用いることができる。１つの例において、前記第１粒子は第１外被及び第１送達分子を含み、前記第２粒子は、前記第１外被と実質的に同一組成の第２外被を含むが、送達分子を含まない。前記方法は、前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれの前記吸光度と、前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれのモル濃度とに基づいて、前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれのモル吸光係数を各測定波長について決定すること；及び前記第１粒子の前記モル吸光係数から、前記第２粒子の前記モル吸光係数を差し引いて、前記第１送達分子のモル吸光係数を、各測定波長について決定することを含む。第１粒子及び第２粒子それぞれのモル濃度は、前記した“モル濃度を決定することを含む分子送達用粒子を特徴づける方法”に従って決定することができる。第１粒子及び第２粒子それぞれのモル吸光係数は、前記した“モル吸光係数を決定することを含む分子送達用粒子を特徴づける方法”に従って決定することができる。
【0065】
前記第１粒子及び前記第２粒子はそれぞれ、実質的に同一組成の第１外被及び第２外被を含む。実質的に同一組成の外被は、例えば、タンパク質性（例えばカプシドタンパク質又はアルブミン）の外被、脂質二重層の外被、又は高分子（例えばＰＥＧ又はＰＬＧＡ）の外被であってよい。各粒子の外被は、好ましくは同一組成で、且つ同一のサイズである。前記外被の１つの例として、分子送達用粒子がウイルス粒子である場合、外被は実質的に同一のタンパク質性のカプシドであり、実質的に同一のサイズ（例えばカプシド単量体）である。１つの例において、前記第１粒子は第１送達分子を含み、前記第２粒子は送達分子を含まない。第１送達分子は、例えば分子送達用粒子がウイルス粒子である場合、核酸（例えばＤＮＡ又はＲＮＡ）を送達分子としてよい。前記例では、分子送達用粒子としてウイルス粒子を例示したが、分子送達用粒子はこれに限定されない。例えば、分子送達用粒子がリポソームである場合、第１送達分子は薬物成分（例えば抗がん剤）又は栄養素を送達分子として含んでよい。
【0066】
具体的には、前記方法は、第１粒子及び第２粒子を含む分子送達用粒子に対して、前記した“モル濃度を決定することを含む分子送達用粒子を特徴づける方法”及び“モル吸光係数を決定することを含む分子送達用粒子を特徴づける方法”を行うことで、前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれのモル濃度及びモル吸光係数を各測定波長について決定することを含む。次いで、ある測定波長について決定した第１粒子（第１外被及び第１送達分子を有する）のモル吸光係数から、その測定波長について決定した第２粒子（第２外被を有する）のモル吸光係数を差し引くことで、その測定波長での第１送達分子のモル吸光係数を得ることができる。他の測定波長についても同様に処理することで、用いた複数の測定波長それぞれについて、第１送達分子のモル吸光係数が決定される。
【0067】
より具体的には、前記方法は、第１粒子及び第２粒子を含む分子送達用粒子を、複数の測定波長での光測定を伴う粒子分離に供して、前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれの屈折率増分及び吸光度を、前記複数の測定波長の各測定波長についてそれぞれ決定することを含む。次いで、前記方法は、決定した前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれの前記屈折率増分と、分子量と、比屈折率変化値とに基づいて、前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれのモル濃度を決定することを含む。さらに、前記方法は、前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれの前記吸光度と、前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれの前記モル濃度とに基づいて、前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれのモル吸光係数を、前記各測定波長について決定することを含む。加えて、前記方法は、前記第１粒子の前記モル吸光係数から、前記第２粒子の前記モル吸光係数を差し引いて、前記第１送達分子のモル吸光係数を、各測定波長について決定することを含む。前記した屈折率増分及び吸光度を決定するための光測定を伴う粒子分離は、同時に実施されてもよく、順次に実施されてもよい。１つの実施形態において、前記した光測定を伴う粒子分離は、同時に実施される。
【0068】
１つの実施形態において、第１粒子がカプシドとゲノムＤＮＡを有する完全ウイルス粒子であり、第２粒子がカプシドを有する中空ウイルス粒子である場合、前記方法に基づいて、完全ウイルス粒子のモル吸光係数から、中空ウイルス粒子のモル吸光係数を差し引くことで、ゲノムＤＮＡのモル吸光係数を決定することができる。前記した実施形態では、完全ウイルス粒子及び中空ウイルス粒子を分子送達用粒子として用いたが、第１粒子及び第２粒子は、これらに限定されない。他の例において、外被としての脂質二重層及びそれにカプセル化された薬物を含む完全リポソーム粒子、及び脂質二重層を含むが薬物を含まない中空リポソーム粒子を分子送達用粒子として用いることができる。
【0069】
１つの実施形態において、第１送達分子のモル吸光係数を決定することを含む分子送達用粒子を特徴づける方法は、前記第１粒子が第１外被及び第１送達分子を有し、及び前記第２粒子が第２外被を有し、複数の測定波長での光測定を伴う粒子分離によって得られた分子送達用粒子の光学データ（例えば吸光度データ及び屈折率データを含む）から、前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれの屈折率増分及び吸光度を、前記複数の測定波長の各測定波長についてそれぞれ決定すること；前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれの前記屈折率増分と、分子量と、比屈折率変化値とに基づいて、前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれのモル濃度を決定すること；前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれの前記吸光度と、前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれの前記モル濃度とに基づいて、前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれのモル吸光係数を、前記各測定波長について決定すること；及び前記第１粒子の前記モル吸光係数から、前記第２粒子の前記モル吸光係数を差し引いて、前記第１送達分子のモル吸光係数を、各測定波長について決定することを含む。
【0070】
前記した実施形態では、第１粒子及び第２粒子を含む分子送達用粒子を例示したが、本態様に用いられる分子送達用粒子はこれに限定されない。本態様に用いられる分子送達用粒子は、３つのタイプの粒子（例えば第１粒子、第２粒子、及び第３粒子）または４つ以上のタイプの粒子を含んでいてもよい。
【0071】
量比を決定することを含む分子送達用粒子を特徴づける方法
本発明の１つの態様は、量比を決定することを含む分子送達用粒子を特徴づける方法を提供する。前記方法では、第１粒子及び第２粒子を含み、前記第１粒子が第１外被及び第１送達分子を有し、及び前記第２粒子が第２外被を有する、分子送達用粒子を用いることができる。１つの例において、前記第２粒子は、送達分子を含まない。
（１）等吸収点を決定して、量比を決定することを含む分子送達用粒子を特徴づける方法
１つの実施形態に係る前記方法は、第２粒子のモル吸光係数と、第１送達分子のモル吸光係数とが一致する等吸収点を特定すること；及び前記等吸収点での第１粒子及び第２粒子それぞれの吸光度を用いて、前記第１粒子と前記第２粒子との量比を決定することを含む。第２粒子及び第１送達分子それぞれのモル吸光係数は、前記した“第１送達分子のモル吸光係数を決定することを含む分子送達用粒子を特徴づける方法”に従って決定することができる。等吸収点での第１粒子及び第２粒子それぞれの吸光度は、実施例に記載した方法又は前記した“モル吸光係数を決定することを含む分子送達用粒子を特徴づける方法”のうちの“吸光度を決定する工程”に従って決定することができる。本実施形態において、等吸収点を特定するために用いた分子送達用粒子と、量比の決定に用いられる分子送達用粒子とは、同一であってもよく、異なっていてもよい。異なる分子送達用粒子である場合、量比の決定に用いられる分子送達用粒子は、例えば、等吸収点を特定するために用いた分子送達用粒子と実質的に同一組成の外被及び送達分子を含むが、未知の比率で第１粒子及び第２粒子を含む。
本発明の１つの態様は、量比を決定することを含む分子送達用粒子を特徴づける方法を提供する。前記方法では、第１粒子及び第２粒子を含み、前記第１粒子が第１外被及び第１送達分子を有し、及び前記第２粒子が第２外被を有する、分子送達用粒子を用いることができる。１つの例において、前記第２粒子は、送達分子を含まない。
（１）等吸収点を決定して、量比を決定することを含む分子送達用粒子を特徴づける方法
１つの実施形態に係る前記方法は、第２粒子のモル吸光係数と、第１送達分子のモル吸光係数とが一致する等吸収点を特定すること；及び前記等吸収点での第１粒子及び第２粒子それぞれの吸光度を用いて、前記第１粒子と前記第２粒子との量比を決定することを含む。第２粒子及び第１送達分子それぞれのモル吸光係数は、前記した“第１送達分子のモル吸光係数を決定することを含む分子送達用粒子を特徴づける方法”に従って決定することができる。等吸収点での第１粒子及び第２粒子それぞれの吸光度は、実施例に記載した方法又は前記した“モル吸光係数を決定することを含む分子送達用粒子を特徴づける方法”のうちの“吸光度を決定する工程”に従って決定することができる。本実施形態において、等吸収点を特定するために用いた分子送達用粒子と、量比の決定に用いられる分子送達用粒子とは、同一であってもよく、異なっていてもよい。異なる分子送達用粒子である場合、量比の決定に用いられる分子送達用粒子は、例えば、等吸収点を特定するために用いた分子送達用粒子と実質的に同一組成の外被及び送達分子を含むが、未知の比率で第１粒子及び第２粒子を含む。
【0072】
等吸収点は、例えば、複数の測定波長での第２粒子のモル吸光係数の近似曲線と、複数の測定波長での第１送達分子のモル吸光係数の近似曲線との交点の波長としてよい。一例において、複数の測定波長での第２粒子のモル吸光係数を、横軸を測定波長とし、縦軸をモル吸光係数としたグラフにプロットして散布図を得て、その散布図中の各モル吸光係数に対応するプロットの第２粒子に関する近似曲線を得る。同様にして、複数の測定波長での第１送達分子のモル吸光係数の散布図を得て、その散布図中の各モル吸光係数に対応するプロットの第１送達分子に関する近似曲線を得る。前記第２粒子に関する近似曲線と、前記第１送達分子に関する近似曲線との交点を特定し、その交点の波長を等吸収点とすることができる。
【0073】
第１粒子と第２粒子との量比は、例えば第１粒子がカプシドとゲノムＤＮＡとを含む完全ウイルス粒子であり、第２粒子がカプシドを含むがゲノムＤＮＡを含まない中空ウイルス粒子である場合、以下の式を用いて、完全ウイルス粒子の数と、中空ウイルス粒子の数の比を算出することができる。本方法で得られる量比は、相対的な濃度比ではなく、ウイルス粒子の数の比（絶対的な比）である点が特徴である。
ここで、Ｎｅｍｐｔｙ及びＮｆｕｌｌはそれぞれ中空ウイルス粒子及び完全ウイルス粒子の粒子数を示し、Ａｒｅａｅｍｐｔｙ及びＡｒｅａｆｕｌｌ（＝Ａｒｅａｅｍｐｔｙ＋ＡｒｅａＤＮＡ）はそれぞれ、沈降係数分布における完全ウイルス粒子に対応するピークの面積及び中空ウイルス粒子に対応するピーク面積を示す。
【数4】
ここで、Ｎｅｍｐｔｙ及びＮｆｕｌｌはそれぞれ中空ウイルス粒子及び完全ウイルス粒子の粒子数を示し、Ａｒｅａｅｍｐｔｙ及びＡｒｅａｆｕｌｌ（＝Ａｒｅａｅｍｐｔｙ＋ＡｒｅａＤＮＡ）はそれぞれ、沈降係数分布における完全ウイルス粒子に対応するピークの面積及び中空ウイルス粒子に対応するピーク面積を示す。
【0074】
上記例では、第１粒子と第２粒子の量比は、第１粒子としての完全ウイルス粒子及び第２粒子としての中空ウイルス粒子を用いて算出したが、これら以外の粒子についても前記量比を算出できる。例えば、分子送達用粒子がリポソームの場合、外被の分子量と送達分子の分子量とから、前記数式中の分子に記載の定数「２」を適宜変更したうえで、外被としての脂質二重層及びそれにカプセル化された薬物を含む完全リポソーム粒子を第１粒子とし、及び脂質二重層を含むが薬物を含まない中空リポソーム粒子を第２粒子として、変更した前記数式を用いて、それらの量比を算出することができる。例えば、前記した“分子量を決定することを含む分子送達用粒子を特徴づける方法”に従って、送達分子及び外被を含む完全粒子と、送達分子を含まない外被で構成される中空粒子の分子量を決定し、完全粒子に含まれる送達分子の分子量が、設計した一分子又は所望の一分子の分子量に相当すれば、「２」と設定し、その分子量が設計した二分子又は所望の二分子の分子量に相当すれば、「３」と設定することができる。
【0075】
（２）等吸収点にて、量比を決定することを含む分子送達用粒子を特徴づける方法
特定の分子送達用粒子について、等吸収点が決定されると、その特定の分子送達用粒子と実質的に同一組成の外被及び送達分子を含む分子送達用粒子については、モル吸光係数を用いることなく、前記等吸収点での光測定を伴う粒子分離によって、その分子送達用粒子中の第１粒子と第２粒子との量比を決定することができる。特定の分子送達用粒子は、等吸収点を決定するために用いられた分子送達用粒子と同一であってもよく、異なっていてもよい。異なる分子送達用粒子である場合、量比が決定される第１粒子及び第２粒子を含む分子送達用粒子は、例えば、等吸収点を特定するために用いられた分子送達用粒子と実質的に同一組成の外被及び送達分子を含むが、未知の比率で第１粒子及び第２粒子を含む。
特定の分子送達用粒子について、等吸収点が決定されると、その特定の分子送達用粒子と実質的に同一組成の外被及び送達分子を含む分子送達用粒子については、モル吸光係数を用いることなく、前記等吸収点での光測定を伴う粒子分離によって、その分子送達用粒子中の第１粒子と第２粒子との量比を決定することができる。特定の分子送達用粒子は、等吸収点を決定するために用いられた分子送達用粒子と同一であってもよく、異なっていてもよい。異なる分子送達用粒子である場合、量比が決定される第１粒子及び第２粒子を含む分子送達用粒子は、例えば、等吸収点を特定するために用いられた分子送達用粒子と実質的に同一組成の外被及び送達分子を含むが、未知の比率で第１粒子及び第２粒子を含む。
【0076】
従って、本発明の１つの態様は、モル吸光係数を用いない、量比を決定することを含む分子送達用粒子を特徴づける方法を提供する。具体的には、前記方法は、第１粒子及び第２粒子を含む分子送達用粒子を、等吸収点での光測定を伴う粒子分離に供して、前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれの吸光度を決定すること；及び前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれの前記吸光度を用いて、前記第１粒子と前記第２粒子との量比を決定することを含む。前記方法の各ステップは、上記した方法の対応するステップについてした説明及び実施形態が適宜適応される。
【0077】
１つの実施形態は、第１粒子及び第２粒子を含む分子送達用粒子を特徴づける方法は、等吸収点での光測定を伴う粒子分離によって得られた分子送達用粒子の吸光度データから、前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれの吸光度を決定すること；及び前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれの前記吸光度を用いて、前記第１粒子と前記第２粒子との量比を決定することを含む。
【0078】
（３）粒子のモル吸光係数を決定した測定波長にて、量比を決定することを含む分子送達用粒子を特徴づける方法
特定の測定波長にて特定の分子送達用粒子について、モル吸光係数が決定されると、その特定の分子送達用粒子と実質的に同一組成の外被及び送達分子を含む分子送達用粒子については、その特定の測定波長での光測定を伴う粒子分離により、その分子送達用粒子中の第１粒子及び第２粒子それぞれの吸光度を決定することで、第１粒子と第２粒子との量比を決定することができる。特定の分子送達用粒子は、特定の測定波長でのモル吸光係数を決定するために用いられた分子送達用粒子と同一であってもよく、異なっていてもよい。異なる分子送達用粒子である場合、特定の分子送達用粒子は、特定の測定波長でのモル吸光係数を決定するために用いられた分子送達用粒子と実質的に同一組成の外被及び送達分子を含むが、未知の比率で第１粒子及び第２粒子を含む。
特定の測定波長にて特定の分子送達用粒子について、モル吸光係数が決定されると、その特定の分子送達用粒子と実質的に同一組成の外被及び送達分子を含む分子送達用粒子については、その特定の測定波長での光測定を伴う粒子分離により、その分子送達用粒子中の第１粒子及び第２粒子それぞれの吸光度を決定することで、第１粒子と第２粒子との量比を決定することができる。特定の分子送達用粒子は、特定の測定波長でのモル吸光係数を決定するために用いられた分子送達用粒子と同一であってもよく、異なっていてもよい。異なる分子送達用粒子である場合、特定の分子送達用粒子は、特定の測定波長でのモル吸光係数を決定するために用いられた分子送達用粒子と実質的に同一組成の外被及び送達分子を含むが、未知の比率で第１粒子及び第２粒子を含む。
【0079】
従って、本発明の１つの態様は、粒子のモル吸光係数を決定した測定波長にて、量比を決定することを含む分子送達用粒子を特徴づける方法を提供する。具体的には、前記方法は、第１粒子及び第２粒子を含む分子送達用粒子を、第１粒子及び第２粒子それぞれのモル吸光係数を決定した測定波長での光測定を伴う粒子分離に供して、前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれの吸光度を決定すること；及び前記第１粒子と前記第２粒子それぞれの前記吸光度と、決定された前記第１粒子及び第２粒子それぞれのモル吸光係数を用いて、前記第１粒子と前記第２粒子との量比を決定することを含む。この実施形態における量比の決定は、例えば、吸光度に関する沈降係数分布における前記第１粒子に対応するピーク面積を、前記第１粒子のモル吸光係数で割り付けることで、前記第１粒子のモル濃度が得られる。同様にして得られた前記第２粒子のモル濃度と前記第１粒子の前記モル濃度とから、前記第１粒子と前記第２粒子との量比を決定することができる。１つの実施形態において、予めモル吸光係数が決定された第１粒子及び第２粒子と、量比が決定される第１粒子及び第２粒子とは、それぞれ実質的に同一組成又は同一組成の外被及び送達分子を含む。
【0080】
１つの実施形態は、第１粒子及び第２粒子を含む分子送達用粒子を特徴づける方法は、前記第１粒子及び第２粒子それぞれのモル吸光係数を決定した測定波長での光測定を伴う粒子分離によって得られた分子送達用粒子の吸光度データから、前記第１粒子及び前記第２粒子それぞれの吸光度を決定すること；及び前記第１粒子と前記第２粒子それぞれの前記吸光度と、決定された前記第１粒子及び第２粒子それぞれのモル吸光係数を用いて、前記第１粒子と前記第２粒子との量比を決定することを含む。
【0081】
前記した実施形態では、第１粒子及び第２粒子を含む分子送達用粒子を例示したが、本態様に用いられる分子送達用粒子はこれに限定されない。本態様に用いられる分子送達用粒子は、３つのタイプの粒子（例えば第１粒子、第２粒子、及び第３粒子）または４つ以上のタイプの粒子を含んでいてもよい。
【0082】
前記した方法は、分子送達用粒子の品質管理に用いることができる。１つの例において、本方法は、遺伝子治療用の分子送達用粒子である組換えウイルス粒子の品質を管理するために用いることができる。具体的には、組換えウイルス粒子には、所定のゲノムを含む所望のウイルス粒子の他に、所定のゲノムを含まない所望しないウイルス粒子が含まれる場合がある。本方法を用いて、全ウイルス粒子の数に対する所望のウイルス粒子又は所望しないウイルス粒子の数の比を決定することで、その組換えウイルス粒子の品質を管理することができる。
【0083】
第３粒子の吸光度に対する寄与度を決定することを含む分子送達用粒子を特徴づける方法
本発明の１つの態様は、第３粒子の吸光度に対する寄与度を決定することを含む分子送達用粒子を特徴づける方法を提供する。前記方法では、第１粒子、第２粒子及び第３粒子を含む、分子送達用粒子を用いることができる。前記第３送達分子は、第３外被を有し、且つ第３送達分子を有していてもよく有していなくてもよい。前記方法は、前記分子送達用粒子の複数の測定波長での光測定を伴う粒子分離により、前記第３粒子の吸光度を、前記各測定波長について決定すること；及び前記第２粒子の前記モル吸光係数と前記第１送達分子の前記モル吸光係数との、前記第３粒子の前記吸光度に対する寄与度を決定することを含む。第３粒子の吸光度を決定するための光測定を伴う粒子分離と、屈折率増分を決定するための光測定を伴う粒子分離と、吸光度を決定するための光測定を伴う粒子分離とは、同時に実施されてもよく、順次に実施されてもよい。１つの実施形態において、前記３つの光測定を伴う粒子分離は同時に実施される。
本発明の１つの態様は、第３粒子の吸光度に対する寄与度を決定することを含む分子送達用粒子を特徴づける方法を提供する。前記方法では、第１粒子、第２粒子及び第３粒子を含む、分子送達用粒子を用いることができる。前記第３送達分子は、第３外被を有し、且つ第３送達分子を有していてもよく有していなくてもよい。前記方法は、前記分子送達用粒子の複数の測定波長での光測定を伴う粒子分離により、前記第３粒子の吸光度を、前記各測定波長について決定すること；及び前記第２粒子の前記モル吸光係数と前記第１送達分子の前記モル吸光係数との、前記第３粒子の前記吸光度に対する寄与度を決定することを含む。第３粒子の吸光度を決定するための光測定を伴う粒子分離と、屈折率増分を決定するための光測定を伴う粒子分離と、吸光度を決定するための光測定を伴う粒子分離とは、同時に実施されてもよく、順次に実施されてもよい。１つの実施形態において、前記３つの光測定を伴う粒子分離は同時に実施される。
【0084】
前記第１粒子、前記第２粒子及び前記第３粒子はそれぞれ、例えば実質的に同一組成の第１外被、第２外被及び第３外被を含む。実質的に同一組成の外被は、例えば、タンパク質性（例えばカプシドタンパク質又はアルブミン）の外被、脂質二重層の外被、又は高分子（例えばＰＥＧ又はＰＬＧＡ）の外被であってよい。各粒子の外被は、例えば実質的に同一組成で、且つ実質的に同一のサイズであってよい。前記外被の１つの例として、分子送達用粒子がウイルス粒子である場合、外被は実質的に同一のタンパク質性のカプシドであり、同一のサイズ（例えばカプシド単量体）である。前記外被の他の例として、分子送達用粒子がウイルス粒子である場合、外被は同一のタンパク質性のカプシドであり、３つのタイプの粒子のうちの２つのタイプが同一サイズの外被（例えばカプシド単量体）を有し、残りの１つのタイプが異なるサイズの外被（例えば凝集体）を有してもよい。前記例では、分子送達用粒子としてウイルス粒子を例示したが、分子送達用粒子はこれに限定されない。分子送達用粒子がリポソームである場合、その外被は同一組成の脂質二重層であり、そのサイズは略同一（例えば１つのピークで示される粒径分布）であってよい。
【0085】
１つの例において、前記第１粒子、及び前記第３粒子は、例えば実質的に同一組成の第１送達分子及び第３送達分子を含んでよい。実質的に同一組成の送達分子は、例えばポリヌクレオチド、ポリペプチド、有機化合物又は放射性物質、若しくはそれらの組合せであってよい。分子送達用粒子がウイルス粒子である場合、送達分子はポリヌクレオチドである。１つの例において、第１粒子は、所望のサイズのポリヌクレオチドを含み、第３粒子は所望のサイズより小さいポリヌクレオチド（例えば所望のポリヌクレオチドの断片）又は大きいポリヌクレオチド（例えば所望のポリヌクレオチドの凝集体）を含んでよい。前記例では、第１送達分子と実質的に同一組成の第３送達分子を例示したが、本態様に用いられる第３送達分子はこれに限定されない。１つの例において、本態様に用いられる第３粒子は、第１送達分子と異なる組成（例えば分子の種類が異なる分子）の第３送達分子を含んでもよい。この例において、第３送達分子の波長依存的なモル吸光係数は、公知の方法にて決定することができる。
【0086】
各測定波長での第３粒子の吸光度は、例えば第１粒子、第２粒子及び第３粒子を含む分子送達用粒子を、複数の測定波長での光測定を伴う粒子分離に供することで得られた前記分子送達用粒子についての光学データ（例えば吸光度データを含む）から、実施例に記載の方法又は“モル吸光係数を決定することを含む分子送達用粒子を特徴づける方法”における“吸光度を決定する工程”に関する説明に従って、決定することができる。従って、第３粒子の濃度を決定することを含む分子送達用粒子を特徴づける方法は、分子送達用粒子についての光学データ（例えば吸光度データを含む）から、第３粒子の吸光度を、各測定波長について決定することを含む。
【0087】
第３粒子（第３外被及び第３送達分子を有し得る）の吸光度に対する、第２粒子（第２外被を有する）のモル吸光係数と第１成分のモル吸光係数の寄与度は、実施例に記載の方法に従って決定することができる。具体的には、第３粒子の吸光度は、第３外被と同一組成の第２粒子（第２外被）のモル吸光係数に寄与度αを乗じた値に、第３送達分子と同一組成の第３送達分子のモル吸光係数に寄与度βを乗じた値を加えた合計値であるから、各測定波長での第３粒子の吸光度について、各測定波長での第２粒子のモル吸光係数と第１送達分子のモル吸光係数とを用いて重回帰分析することで、寄与度α及びβを決定することができる。
【0088】
１つの実施形態において、第３粒子の吸光度に対する寄与度を決定することを含む分子送達用粒子を特徴づける方法は、吸光度データから、前記第３粒子の吸光度を、各測定波長について決定すること、及び第２粒子のモル吸光係数と第１送達分子のモル吸光係数との、第３粒子の前記吸光度に対する寄与度を決定することを含む。
【0089】
１つの実施形態において、第３粒子の吸光度に対する寄与度を決定することを含む分子送達用粒子を特徴づける方法は、前記寄与度（α及びβ）に基づいて、第３送達分子の構成割合を決定することをさらに含んでよい。１つの例において、第３粒子（第３外被及び第３送達分子を有し得る）における、第２外被と同一組成の第３外被に対する、第３送達分子の構成割合（＝β／α）を算出することができる。他の例において、前記第３粒子（第３外被及び第３送達分子を有する）における第３外被の割合（＝α／（α＋β））又は第３送達分子の割合（＝β／（α＋β））を算出することができる。
【0090】
１つの実施形態において、第３粒子の吸光度に対する寄与度を決定することを含む分子送達用粒子を特徴づける方法は、前記寄与度に基づいて、第３外被及び第３送達分子それぞれのモル濃度を決定することをさらに含んでよい。第３外被及び第３送達分子それぞれの濃度は、実施例に記載の方法に従って決定することができる。具体的には、第３粒子における第３外被の濃度は、外被（空粒子）のモル吸光係数にその寄与度αを乗じて第３粒子のピーク面積（第３粒子の吸光度）に占める外被のピーク面積（外被の吸光度）を得て、得られた外被のピーク面積を、外被（空粒子）のモル吸光係数で割りつけ、光測定の際の光路長を換算することによって、第３外被の濃度を得ることができる。同様にして、第３粒子における第３送達分子の濃度は、送達分子（完全粒子に含まれる送達分子）のモル吸光係数にその寄与度βを乗じて第３粒子のピーク面積（第３粒子の吸光度）に占める送達分子のピーク面積（送達分子の吸光度）を得て、得られた送達分子のピーク面積を、送達分子（完全粒子に含まれる送達分子）のモル吸光係数で割りつけ、光測定の際の光路長を換算することによって、第３送達分子の濃度を得ることができる。
【0091】
１つの実施形態において、第３粒子の吸光度に対する寄与度を決定することを含む分子送達用粒子を特徴づける方法は、第３粒子に対応するピークにおける第３外被の含量に対する第３送達分子の含量の比（＝［第３送達分子の含量］／［第３外被の含量］）を決定することをさらに含んでよい。第３外被の含量に対する第３送達分子の含量は、前記した実施形態に従って得られる第３送達分子の濃度を、第３外被の濃度で割り付けることによって得ることができる。
【0092】
１つの実施形態において、第３粒子の吸光度に対する寄与度を決定することを含む分子送達用粒子を特徴づける方法は、分子送達用粒子が組み換えウイルス粒子であり、送達分子がポリヌクレオチドである場合、完全粒子に含まれるポリヌクレオチドの長さに対する、第３粒子に含まれるポリヌクレオチドの長さの比（＝［第３粒子のポリヌクレオチドの長さ］／［完全粒子のポリヌクレオチドの長さ］）を決定することをさらに含んでよい。完全粒子に含まれるポリヌクレオチドの長さに対する、第３粒子に含まれるポリヌクレオチドの長さの比は、寄与度β及びカプシド（空粒子）の濃度（Ｃｃａｐｓｉｄ）を、式１３及び式１４に用いて算出することができる。
【0093】
前記した実施形態では、第１粒子、第２粒子及び第３粒子を含む分子送達用粒子を例示したが、本態様に用いられる分子送達用粒子はこれに限定されない。本態様に用いられる分子送達用粒子は、４つのタイプの粒子（例えば第１粒子、第２粒子、第３粒子、及び第４粒子）または５つ以上のタイプの粒子を含んでいてもよい。
【0094】
品質を判定することを含む分子送達用粒子を特徴づける方法
本発明の１つの態様は、品質を判定することを含む分子送達用粒子を特徴づける方法を提供する。１つの実施形態において、前記方法は、第１粒子と第２粒子との量比に基づいて、分子送達用粒子が所定の品質があると判定することを含む。前記方法では、第１粒子及び第２粒子を含み、前記第１粒子が第１外被及び第１送達分子を有し、及び前記第２粒子が第２外被を有する、分子送達用粒子を用いることができる。第１粒子と第２粒子との量比は、前記した“量比を決定することを含む分子送達用粒子を特徴づける方法”に従って、決定することができる。
本発明の１つの態様は、品質を判定することを含む分子送達用粒子を特徴づける方法を提供する。１つの実施形態において、前記方法は、第１粒子と第２粒子との量比に基づいて、分子送達用粒子が所定の品質があると判定することを含む。前記方法では、第１粒子及び第２粒子を含み、前記第１粒子が第１外被及び第１送達分子を有し、及び前記第２粒子が第２外被を有する、分子送達用粒子を用いることができる。第１粒子と第２粒子との量比は、前記した“量比を決定することを含む分子送達用粒子を特徴づける方法”に従って、決定することができる。
【0095】
分子送達用粒子の品質は、前記第１粒子と第２粒子との量比が、所定の閾値を超えるか否かにより判定される。閾値は、本態様における分子送達用粒子の用途などの事情に応じて適宜設定される。１つの例において、第１粒子と第２粒子との量比（好ましくは百分率）が閾値を超える場合、第１粒子及び第２粒子を含む分子送達用粒子は、所定の品質があると判定される。所定の品質は、分子送達用粒子を用いる用途に応じて、適宜設定される。前記した判定の表現として、“所定の品質がある”が例示されたが、本体の判定の表現はこれに限定されない。判定は、例えば“品質が高い”であってよい。
【0096】
１つの例において、分子送達用粒子が遺伝子治療用の組換えウイルス粒子であり、第１ウイルス粒子が第１外被であるカプシド及び第１送達分子である所望サイズのＤＮＡを有し、及び第２ウイルス粒子が前記カプシドを第２外被として有し、且つＤＮＡを有しない場合、第１ウイルス粒子及び第２ウイルス粒子を含む組換えウイルス粒子の数に対する、所望の第１ウイルス粒子の数の百分率が、第１閾値（例えば９５％）を超える場合に、所定の品質があると判定される。前記例において、前記組換えウイルス粒子の数に対する、所望の第１ウイルス粒子の数の百分率が、前記第１閾値以下である場合、所定の品質を満たさないと判定される。他の例において、前記組換えウイルス粒子の数に対する、所望の第２ウイルス粒子の数の百分率が、第１閾値（例えば９５％）を超える場合に、所定の品質があると判定される。前記例において、前記組換えウイルス粒子の数に対する、所望の第２ウイルス粒子の数の百分率が、前記第１閾値以下である場合、所定の品質を満たさないと判定される。
【0097】
前記した例では、１つの閾値（例えば第１閾値）を用いる場合を例示したが、本実施形態に用いられる閾値の数は１つに限定されない。１つの例において、閾値は、２つの閾値（例えば第１閾値、及び前記第１閾値よりも高い値の第２閾値）を含んでよい。１つの例において、第１粒子及び第２粒子を含む分子送達用粒子の数に対する、所望の第２粒子の数の割合が、第１閾値を超えており、かつ第２閾値以下である場合、その分子送達用粒子は所定の品質があると判定される。この例において、前記した割合が、第２閾値を越えている場合、その分子送達用粒子は優れた品質を有すると判定される。
【0098】
１つの実施形態において、品質を判定することを含む分子送達用粒子を特徴づける方法は、第１粒子、第２粒子及び第３粒子（第３外被及び第３送達分子を有する）を含む分子送達用粒子について、前記第１粒子のモル濃度、前記第２粒子のモル濃度、前記第３外被の濃度、及び前記第３送達分子の濃度に基づいて、前記分子送達用粒子に対する、前記第１粒子又は前記第２粒子の量比を決定すること、及び前記量比が、第１閾値を超える場合に、前記送達用粒子が所定の品質があると判定することを含む。第１粒子のモル濃度、及び第２粒子のモル濃度は、前記した“モル濃度を決定することを含む分子送達用粒子を特徴づける方法”に従って、決定することができる。第３外被の濃度、及び第３送達分子の濃度は、前記した“第３粒子の吸光度に対する寄与度を決定することを含む分子送達用粒子を特徴づける方法”に従って、決定された寄与度に基づいて決定することができる。１つの例において、第３外被の濃度と、第３送達分子の濃度とを併せて、第３粒子の濃度とすることができる。従って、１つの実施形態に係る品質を判定することを含む分子送達用粒子を特徴づける方法は、第１粒子のモル濃度、第２粒子のモル濃度、第３粒子の濃度に基づいて、それらの粒子を含む分子送達用粒子に対する、第１粒子又は第２粒子の量比を決定し、及び前記量比が、第１閾値を超える場合に、前記分子送達用粒子が所定の品質があると判定することを含む。本体の他の実施形態についてした閾値及び判定の表現についての説明は、本実施形態に適宜提供される。
【0099】
１つの例において、分子送達用粒子が遺伝子治療用の組換えウイルス粒子であり、第１ウイルス粒子が第１外被であるカプシド及び第１送達分子である所望サイズのＤＮＡを有し、第２ウイルス粒子が前記カプシドを第２外被として有し、且つＤＮＡを有さず、及び第３粒子が第３外被であるカプシド及び第３送達分子としてＤＮＡ（例えば所望サイズのＤＮＡ断片又は前記ＤＮＡの凝集体）を有する場合、第１ウイルス粒子、第２ウイルス粒子及び第３ウイルス粒子を含む組換えウイルス粒子の数に対する、所望の第１ウイルス粒子の数の百分率が、第１閾値（例えば９５％）を超える場合に、所定の品質があると判定される。前記例において、前記組換えウイルス粒子の数に対する、望ましくない第２ウイルス粒子の数の百分率が、前記第１閾値よりも小さい値の第２閾値（例えば５％）以下である場合、優れた品質を有すると判定される。他の例において、前記組換えウイルス粒子の数に対する、望ましくない第２ウイルス粒子と第３ウイルス粒子の合計数の百分率が、第１閾値よりも小さい値の第３閾値（例えば３％）以下である場合、優れた品質を有すると判定される。前記例において、前記組換えウイルス粒子の数に対する、所望の第１ウイルス粒子の数の百分率が、前記第１閾値以下であり、且つ前記第３閾値以上である場合、所定の品質を満たさないと判定される。
【0100】
前記した実施形態では、第１粒子及び第２粒子を含む分子送達用粒子又は第３粒子を更に含む分子送達用粒子を例示したが、本態様に用いられる分子送達用粒子はこれに限定されない。本態様に用いられる分子送達用粒子は、４つのタイプの粒子（例えば第１粒子、第２粒子、第３粒子及び第４粒子）または５つ以上のタイプの粒子を含んでいてもよい。
【0101】
吸光度比を決定することを含む分子送達用粒子を特徴づける方法
本発明の１つの態様は、吸光度比を決定することを含む分子送達用粒子を特徴づける方法を提供する。前記方法は、分子送達用粒子を、第１測定波長及び第２測定波長での光測定を伴う粒子分離に供して、前記分子送達用粒子の吸光度を、前記第１測定波長及び第２測定波長それぞれについて決定すること；及び前記第１測定波長での前記分子送達用粒子の前記吸光度と、前記第２測定波長での前記分子送達用粒子の前記吸光度とから吸光度比を決定することを含む。
本発明の１つの態様は、吸光度比を決定することを含む分子送達用粒子を特徴づける方法を提供する。前記方法は、分子送達用粒子を、第１測定波長及び第２測定波長での光測定を伴う粒子分離に供して、前記分子送達用粒子の吸光度を、前記第１測定波長及び第２測定波長それぞれについて決定すること；及び前記第１測定波長での前記分子送達用粒子の前記吸光度と、前記第２測定波長での前記分子送達用粒子の前記吸光度とから吸光度比を決定することを含む。
【0102】
前記方法における“吸光度を決定する工程”は、前記した“モル吸光係数を決定することを含む分子送達用粒子を特徴づける方法”のうちの“吸光度を決定する工程”と同様にして実施することができる。具体的には、分子送達用粒子を、第１測定波長及び第２測定波長での光測定を伴う粒子分離に供することで、前記分子送達用粒子についての光学データ（例えば吸光度データを含む）が得られる。前記光学データは、第１測定波長及び第２測定波長それぞれについて分子送達用粒子の吸光度に関する情報を含む。前記光学データから、実施例に記載の方法又は“モル吸光係数を決定することを含む分子送達用粒子を特徴づける方法”における“吸光度を決定する工程”に関する説明に従って、分子送達用粒子の吸光度が第１測定波長及び第２測定波長それぞれについて決定される。例えば、決定された第１測定波長での前記分子送達用粒子の吸光度を、決定された第２測定波長での前記分子送達用粒子の吸光度を割り付けることで、吸光度比を算出することができる。
【0103】
１つの例において、分子送達用粒子が組換えウイルス粒子であり、第１粒子として完全ウイルス粒子及び第２粒子として中空ウイルス粒子を含む場合、前記分子送達用粒子を２６０ｎｍ及び２８０ｎｍでの光測定を伴う粒子分離に供して、完全ウイルス粒子及び中空ウイルス粒子の吸光度を２６０ｎｍ及び２８０ｎｍそれぞれについて決定すること；及び前記２６０ｎｍでの前記完全ウイルス粒子及び前記中空ウイルス粒子の吸光度（Ａ２６０）を、２８０ｎｍでの前記完全ウイルス粒子及び前記中空ウイルス粒子の吸光度（Ａ２８０）でそれぞれ割り付けることで、前記完全ウイルス粒子及び中空ウイルス粒子それぞれの吸光度比（＝Ａ２６０／Ａ２８０）を決定することを含む。この例で得られた吸光度比は、分子送達用粒子に含まれる第１粒子及び第２粒子それぞれの純度を示す。従って、吸光度比を決定することを含む分子送達用粒子を特徴づける方法は、分子送達用粒子の純度を判定する方法として利用できる。上記した例では、分子送達用粒子として組換えウイルス粒子を例示したが、前記方法に利用できる分子送達用粒子は、これに限定されない。分子送達用粒子は、例えばリポソーム、アルブミン粒子、ミセル又はＰＬＧＡ粒子であってよい。方法で用いる測定波長は、測定対象の外被又は送達される分子の吸収極大を考慮して、当業者により適宜設定される。
【0104】
１つの実施形態において、吸光度比を決定することを含む分子送達用粒子を特徴づける方法は、光測定を伴う遠心分離によって得られた分子送達用粒子の光学データ（吸光度データを含む）から、前記分子送達用粒子の吸光度を、前記第１測定波長及び第２測定波長それぞれについて決定すること；及び前記第１測定波長の前記吸光度と、前記第２測定波長での前記吸光度とから吸光度比を決定することを含む。
【0105】
１つの実施形態において、分子送達用粒子を特徴づける方法は、第１測定波長及び第２測定波長での光測定を伴う粒子分離によって得られた分子送達用粒子の吸光度データから、前記分子送達用粒子の吸光度を、前記第１測定波長及び前記第２測定波長それぞれについて決定すること；及び前記第１測定波長の前記吸光度と、前記第２測定波長での前記吸光度とから吸光度比を決定することを含む。
【0106】
第１粒子のモル吸光係数を決定する方法
本発明の１つの態様は、第１粒子のモル吸光係数を決定する方法を提供する。前記方法では、第１粒子は、第１外被及び第１鎖長の第１ポリヌクレオチドを含む。前記方法は、第２ポリヌクレオチドのモル吸光係数を、その鎖長に対応する値で除して、一ヌクレオチドあたりの平均モル吸光係数を算出すること；及び前記第１外被のモル吸光係数と、前記第１ポリヌクレオチドの前記モル吸光係数とを足しあわせて、前記第１粒子のモル吸光係数を決定することを含む。第２ポリヌクレオチドが５００ヌクレオチド長である場合、その鎖長に対応する値は「５００」である。前記方法は、所定鎖長の第２ポリヌクレオチドのモル吸光係数を、前記所定鎖長の値で除して、一ヌクレオチドあたりの平均モル吸光係数を算出すること；及び前記第１外被のモル吸光係数と、前記第１ポリヌクレオチドの前記モル吸光係数とを足しあわせて、前記第１粒子のモル吸光係数を決定することを含む。
本発明の１つの態様は、第１粒子のモル吸光係数を決定する方法を提供する。前記方法では、第１粒子は、第１外被及び第１鎖長の第１ポリヌクレオチドを含む。前記方法は、第２ポリヌクレオチドのモル吸光係数を、その鎖長に対応する値で除して、一ヌクレオチドあたりの平均モル吸光係数を算出すること；及び前記第１外被のモル吸光係数と、前記第１ポリヌクレオチドの前記モル吸光係数とを足しあわせて、前記第１粒子のモル吸光係数を決定することを含む。第２ポリヌクレオチドが５００ヌクレオチド長である場合、その鎖長に対応する値は「５００」である。前記方法は、所定鎖長の第２ポリヌクレオチドのモル吸光係数を、前記所定鎖長の値で除して、一ヌクレオチドあたりの平均モル吸光係数を算出すること；及び前記第１外被のモル吸光係数と、前記第１ポリヌクレオチドの前記モル吸光係数とを足しあわせて、前記第１粒子のモル吸光係数を決定することを含む。
【0107】
本態様に用いられる第２ポリヌクレオチドは、所定の鎖長となるように設計されている。第２ポリヌクレオチドは、例えば、公知のポリヌクレオチド合成方法、ＰＣＲ、又は遺伝子工学技術、若しくはそれらの組み合わせを用いて調製することができる。本態様に用いられる第１ポリヌクレオチドは、第１鎖長となるように設計される。第１鎖長は、第２ポリヌクレオチドの所定鎖長と同じであってよく、異なってよい。１つの実施形態において、第１鎖長は、第２ポリヌクレオチドの所定鎖長とは異なる。第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子であってよい。ＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子は一本鎖又は二本鎖であってよい。第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドの鎖長は、特に限定されない。１つの例において、第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドは、５００～１０，０００ヌクレオチド長、１，０００～８，０００ヌクレオチド長、２，０００～６，０００ヌクレオチド長のポリヌクレオチドであってよい。
【0108】
前記第２ポリヌクレオチドのモル吸光係数は、例えば、“第１送達分子のモル吸光係数を決定することを含む分子送達用粒子を特徴づける方法”によって決定することができる。１つの例において、第２ポリヌクレオチドのモル吸光係数は、前記第１外被と実質的に同一組成であって、実質的に同一サイズの第２外被と、第２ポリヌクレオチドを含む第２粒子と、前記第１外被と実質的に同一組成であって、実質的に同一サイズの第３外被を含む第３粒子とを含む分子送達用粒子について、“第１送達分子のモル吸光係数を決定することを含む分子送達用粒子を特徴づける方法”を実施することで決定することができる。この工程で、第２外被のモル吸光係数も決定される。上記のようにして決定された第２ポリヌクレオチドの吸光係数を、その鎖長に対応する値で除することで、一ヌクレオチドあたりの平均モル吸光係数を算出することができる。算出した一ヌクレオチドあたりの平均モル吸光に、第１鎖長の値を乗じて、第１ポリヌクレオチドのモル吸光係数を算出することができる。第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドのいずれか一方が一本鎖ポリヌクレオチドであり、他方が二本鎖ポリヌクレオチドである場合、一本鎖ポリヌクレオチドのモル吸光係数を２倍にして０．９を乗じて得た値を、二本鎖ポリヌクレオチドのモル吸光係数とすることができる。これは、淡色効果によって、二本鎖ＤＮＡ分子のモル吸光係数が、それを構成する２つの一本鎖ＤＮＡ分子それぞれのモル吸光係数の合計値より約１０％低下するためである。
【0109】
上記した“第１送達分子のモル吸光係数を決定することを含む分子送達用粒子を特徴づける方法”でそのモル吸光係数が決定された第２外被は、第１外被と実質的に同一組成であって、実質的に同一サイズであるから、第２外被のモル吸光係数を、第１外被のモル吸光係数とすることができる。この第１外被のモル吸光係数と、以上で算出された第１ポリヌクレオチドのモル吸光係数とを足し合わせて、第１粒子のモル吸光係数を決定することができる。
【0110】
１つの例において、第２粒子は、設計されたゲノムＤＮＡ分子及びカプシドを含む組換えウイルス粒子であってよく、第１粒子は、遺伝子治療のために設計され、前記ゲノムＤＮＡ分子と異なる鎖長のＤＮＡ分子及び前記カプシドを含む組換えウイルス粒子であってよい。前記例では、組換えウイルス粒子が例示されたが、本態様に用いられる粒子は、これに限定されない。１つの例において、第２粒子は、設計されたＤＮＡ分子及び脂質二重層を含むリポソームであってよく、第１粒子は、遺伝子治療のために設計され、前記ＤＮＡ分子と異なる鎖長のＤＮＡ分子及び脂質二重層を含むリポソームであってよい。
【0111】
所定鎖長のポリヌクレオチドのモル吸光係数を決定する方法
本発明の１つの態様は、所定鎖長のポリヌクレオチドのモル吸光係数を決定する方法を提供する。前記方法は、前記ポリヌクレオチドを含む分子送達用粒子を所定の測定波長で測定する場合に、前記所定の測定波長と同一又は相当する以下の表に記載のいずれか一つの波長における一ヌクレオチドあたりの平均モル吸光係数に、前記所定鎖長の値を乗じて、前記いずれか一つの波長における前記ポリヌクレオチドのモル吸光係数を決定することを含む。
本発明の１つの態様は、所定鎖長のポリヌクレオチドのモル吸光係数を決定する方法を提供する。前記方法は、前記ポリヌクレオチドを含む分子送達用粒子を所定の測定波長で測定する場合に、前記所定の測定波長と同一又は相当する以下の表に記載のいずれか一つの波長における一ヌクレオチドあたりの平均モル吸光係数に、前記所定鎖長の値を乗じて、前記いずれか一つの波長における前記ポリヌクレオチドのモル吸光係数を決定することを含む。
【表1】
【0112】
所定鎖長のポリヌクレオチドのモル吸光係数を決定する方法は、例えば、前記した“品質を判定することを含む分子送達用粒子を特徴づける方法”のように、前記ポリヌクレオチドを含む分子送達粒子を、所定の測定波長で前記分子送達用粒子の吸光度を測定することで、その品質を判定する場合に用いることができる。本態様に係る用語「所定の測定波長」は、２２０～３２０ｎｍのいずれか一つの波長である。１つの例において、所定の測定波長は、例えば２２０～３１０ｎｍ、２２０～３００ｎｍ、または２２０～２９０ｎｍのいずれか一つの波長であってよい。本明細書に記載の用語「所定の測定波長に相当する波長」は、前記表に示された波長のうち、所定の測定波長に最も近い波長を意味する。所定の測定波長に最も近い波長が２つある場合、所定の測手波長に相当する波長は、その２つの波長のうち、短波長側の波長である。１つの例において、所定の測定波長が２２０～２３２．５ｎｍのいずれか一つの波長である場合、所定の測定波長に相当する波長は、前記表に示された波長のうち、前記所定の測定波長に最も近い２３０ｎｍである。１つの例において、所定の測定波長が２３２．５ｎｍである場合、前記表に示された波長のうち、所定の測定波長に最も近い波長は、２３０ｎｍおよび２３５ｎｍの２つの波長がある。前記例において、所定の測定波長（即ち２３２．５ｎｍ）に相当する波長は、２つの波長のうち、短波長側の波長２３０ｎｍである。
【0113】
１つの例において、１，０００ヌクレオチド長のポリヌクレオチドの波長２８０ｎｍにおけるモル吸光係数は、５．０６×１０－４［×１０７Ｌ ｍｏｌ－１ ｃｍ－１］に鎖長の値１，０００を乗じて得られた値５．０６×１０－１［×１０７Ｌ ｍｏｌ－１ ｃｍ－１］となる。
【0114】
上記した表に示される各波長における一ヌクレオチドあたりのモル吸光係数は、所定の鎖長の一本鎖ＤＮＡのモル吸光係数から得られた値である。１つの例において、所定鎖長のポリヌクレオチドが二本鎖ＤＮＡである場合、前記所定鎖長の二本鎖ＤＮＡ分子のモル吸光係数は、上記した表に示された一ヌクレオチドあたりの平均モル吸光係数に所定鎖長の値を乗じて得た値を２倍にして０．９を乗じて得た値である。１つの例において、所定鎖長のポリヌクレオチドが一本鎖ＲＮＡである場合、前記所定鎖長の一本鎖ＲＮＡ分子のモル吸光係数は、上記した表に示された一ヌクレオチドあたりの平均モル吸光係数に所定鎖長の値を乗じて得た値である。これは、ＤＮＡの平均モル吸光係数と、ＲＮＡの平均モル吸光係数とは、ほぼ等しいためである。
【0115】
本開示により提供される用語及び実施形態の説明は、特に言及がない限り、本開示により提供する態様及び実施形態の間で適宜適用される。
【0116】
以下、具体的な実施例を記載するが、それらは本発明の好ましい実施形態を示すものであり、添付する特許請求の範囲に記載の発明をいかようにも限定するものではない。
【0117】
［実施例］
［材料および方法］
試料
完全なベクターゲノムを含むアデノ随伴ウイルス血清５型（ＡＡＶ５）ベクター（完全粒子、ＡＡＶ５－ＦＰ）及び前記ベクターゲノムを含まないＡＡＶ５ベクター（中空粒子、ＡＡＶ５－ＥＰ）は、次世代バイオ医薬品製造技術研究組合（東京）により提供された。１８Ｏ水（Ｈ２ １８Ｏ）は、大陽日酸株式会社（東京）より、９８％に濃縮されたものを購入した。ＰＢＳのストック溶液（×１０）はＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社（米国）から購入した。ポロキサマー１８８（欧州薬局方標準物質）はＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社（米国）から購入した。その他の試薬は富士フイルム和光純薬株式会社（大阪）から購入した。
［材料および方法］
試料
完全なベクターゲノムを含むアデノ随伴ウイルス血清５型（ＡＡＶ５）ベクター（完全粒子、ＡＡＶ５－ＦＰ）及び前記ベクターゲノムを含まないＡＡＶ５ベクター（中空粒子、ＡＡＶ５－ＥＰ）は、次世代バイオ医薬品製造技術研究組合（東京）により提供された。１８Ｏ水（Ｈ２ １８Ｏ）は、大陽日酸株式会社（東京）より、９８％に濃縮されたものを購入した。ＰＢＳのストック溶液（×１０）はＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社（米国）から購入した。ポロキサマー１８８（欧州薬局方標準物質）はＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社（米国）から購入した。その他の試薬は富士フイルム和光純薬株式会社（大阪）から購入した。
【0118】
サンプル調製
密度コントラスト超遠心分析沈降速度法（ＳＶ－ＡＵＣ）の実験については、最終的にＡＡＶ５－ＥＰは２８０ｎｍで０．９５、ＡＡＶ５－ＦＰは２６０ｎｍで０．７５の光路長１ｃｍでの吸光度にまで３０ｋＤａのフィルターメンブレン（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＳ）を備えたＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ０．５を用いて濃縮した。濃縮したサンプルを溶媒又はＨ２ １８Ｏを含む溶媒で希釈して１．２ｃｍ光路長で約０．３の吸光度を有する０、３２．５及び６５％Ｈ２ １８Ｏを含むサンプル溶液を調製した。他のＳＶ－ＡＵＣ実験については、各ＡＡＶストック溶液を濃縮又は希釈して、１．２ｃｍの光路長で約０．３の吸光度を有する試験溶液を調製した。
密度コントラスト超遠心分析沈降速度法（ＳＶ－ＡＵＣ）の実験については、最終的にＡＡＶ５－ＥＰは２８０ｎｍで０．９５、ＡＡＶ５－ＦＰは２６０ｎｍで０．７５の光路長１ｃｍでの吸光度にまで３０ｋＤａのフィルターメンブレン（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＳ）を備えたＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ０．５を用いて濃縮した。濃縮したサンプルを溶媒又はＨ２ １８Ｏを含む溶媒で希釈して１．２ｃｍ光路長で約０．３の吸光度を有する０、３２．５及び６５％Ｈ２ １８Ｏを含むサンプル溶液を調製した。他のＳＶ－ＡＵＣ実験については、各ＡＡＶストック溶液を濃縮又は希釈して、１．２ｃｍの光路長で約０．３の吸光度を有する試験溶液を調製した。
【0119】
ＵＶスペクトル測定
ＵＶ測定は、ＵＶ－１９００ ＵＶ－ＶＩＳ分光光度計（島津製作所製）を用いて行った。
ＵＶ測定は、ＵＶ－１９００ ＵＶ－ＶＩＳ分光光度計（島津製作所製）を用いて行った。
【0120】
計算
分子量の計算
プログラムＳＥＤＮＴＥＲＰ（Ｌａｕｅ，Ｍ．Ｔ．Ｃｏｍｐｕｔｅｒ－ａｉｄｅｄ ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｄａｔａ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ａｎａｌ Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｏｌｙｍ Ｓｃｉ １９９２；９０－１２５．）を用いて、ＡＡＶ－ＥＰの分子量を算出した。具体的には、ＡＡＶのカプシドを構成する３種類の構造タンパク質であるＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３のアミノ酸組成から各構造タンパク質の分子量を算出した。ＡＡＶ－ＥＰが、構造タンパク質ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３を５：５：５０の割合で含むと仮定して、ＡＡＶ－ＥＰの分子量を算出した。ｓｓＤＮＡの分子量は、設計されたＤＮＡ配列に基づいて８０１５０７．６Ｄａと計算された。
分子量の計算
プログラムＳＥＤＮＴＥＲＰ（Ｌａｕｅ，Ｍ．Ｔ．Ｃｏｍｐｕｔｅｒ－ａｉｄｅｄ ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｄａｔａ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ａｎａｌ Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｏｌｙｍ Ｓｃｉ １９９２；９０－１２５．）を用いて、ＡＡＶ－ＥＰの分子量を算出した。具体的には、ＡＡＶのカプシドを構成する３種類の構造タンパク質であるＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３のアミノ酸組成から各構造タンパク質の分子量を算出した。ＡＡＶ－ＥＰが、構造タンパク質ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３を５：５：５０の割合で含むと仮定して、ＡＡＶ－ＥＰの分子量を算出した。ｓｓＤＮＡの分子量は、設計されたＤＮＡ配列に基づいて８０１５０７．６Ｄａと計算された。
【0121】
偏比容の計算
ＡＡＶ－ＥＰの偏比容は、プログラムＳＥＤＮＴＥＲＰ（Ｌａｕｅ，Ｍ．Ｔ．Ｃｏｍｐｕｔｅｒ－ａｉｄｅｄ ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｄａｔａ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ａｎａｌ Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｏｌｙｍ Ｓｃｉ １９９２；９０－１２５．）を用いてそれらのアミノ酸組成から得た。ＡＡＶ－ＦＰの偏比容は、以下の式を用いて算出した。
ここで、ｖｂａｒＡＡＶ－ＦＰ、ｖｂａｒＡＡＶ－ＥＰ及びｖｂａｒｓｓＤＮＡはそれぞれＡＡＶ－ＦＰ、ＡＡＶ－ＥＰ及びｓｓＤＮＡの偏比容（ｃｍ３ ｇ－１）である。ＭｗＡＡＶ－ＦＰ、ＭｗＡＡＶ－ＥＰ、及びＭｗｓｓＤＮＡは、それぞれＡＡＶ－ＦＰ、ＡＡＶ－ＥＰ、及びｓｓＤＮＡの偏比容（ｃｍ３ ｇ－１）である。ｖｂａｒｓｓＤＮＡは、先行研究（Ｄｕｒｃｈｓｃｈｌａｇ Ｈ．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐａｒｔｉａｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｖｏｌｕｍｅ ｏｆ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｃｏｌｌｏｉｄ Ｐｏｌｙｍ Ｓｃｉ １９８９；２６７：１１３９－１１５０．）で報告されている０．５４ｃｍ３ ｇ－１を用いた。
ＡＡＶ－ＥＰの偏比容は、プログラムＳＥＤＮＴＥＲＰ（Ｌａｕｅ，Ｍ．Ｔ．Ｃｏｍｐｕｔｅｒ－ａｉｄｅｄ ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｄａｔａ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ａｎａｌ Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｏｌｙｍ Ｓｃｉ １９９２；９０－１２５．）を用いてそれらのアミノ酸組成から得た。ＡＡＶ－ＦＰの偏比容は、以下の式を用いて算出した。
ここで、ｖｂａｒＡＡＶ－ＦＰ、ｖｂａｒＡＡＶ－ＥＰ及びｖｂａｒｓｓＤＮＡはそれぞれＡＡＶ－ＦＰ、ＡＡＶ－ＥＰ及びｓｓＤＮＡの偏比容（ｃｍ３ ｇ－１）である。ＭｗＡＡＶ－ＦＰ、ＭｗＡＡＶ－ＥＰ、及びＭｗｓｓＤＮＡは、それぞれＡＡＶ－ＦＰ、ＡＡＶ－ＥＰ、及びｓｓＤＮＡの偏比容（ｃｍ３ ｇ－１）である。ｖｂａｒｓｓＤＮＡは、先行研究（Ｄｕｒｃｈｓｃｈｌａｇ Ｈ．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐａｒｔｉａｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｖｏｌｕｍｅ ｏｆ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｃｏｌｌｏｉｄ Ｐｏｌｙｍ Ｓｃｉ １９８９；２６７：１１３９－１１５０．）で報告されている０．５４ｃｍ３ ｇ－１を用いた。
【0122】
比屈折率変化値（ｄｎ／ｄｃ）計算
ＡＡＶ－ＥＰの比屈折率変化値は、ＳＥＤＦＩＴ（Ｓｃｈｕｃｋ Ｐ．Ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｎｏｎｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｌｆ－ａｓｓｏｃｉａｔｉｎｇ ｓｏｌｕｔｅｓ ｕｓｉｎｇ ｎｕｍｅｒｉｃａｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｌａｍｍ ｅｑｕａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ １９９８；７５：１５０３－１５１２）プログラムを用いてアミノ酸組成から計算した。ＡＡＶ－ＦＰのｄｎ／ｄｃは、以下の式を用いて算出した。
ここで、ｄｎ／ｄｃＡＡＶ－ＦＰ、ｄｎ／ｄｃＡＡＶ－ＥＰ及びｄｎ／ｄｃｓｓＤＮＡはそれぞれＡＡＶ－ＦＰ、ＡＡＶ－ＥＰ及びｓｓＤＮＡの比屈折率変化値（ｍＬ ｇ－１）である。ｓｓＤＮＡのｄｎ／ｄｃは先行研究（Ｄａｖｉｓ ＴＭ，Ｗｉｌｓｏｎ ＷＤ．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ ｉｎｄｅｘ ｉｎｃｒｅｍｅｎｔｓ ｏｆ ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｄａｔａ．Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２０００；２８４：３４８－３５３．）で報告されているように０．２１ｍＬ ｇ－１とした。
ＡＡＶ－ＥＰの比屈折率変化値は、ＳＥＤＦＩＴ（Ｓｃｈｕｃｋ Ｐ．Ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｎｏｎｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｌｆ－ａｓｓｏｃｉａｔｉｎｇ ｓｏｌｕｔｅｓ ｕｓｉｎｇ ｎｕｍｅｒｉｃａｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｌａｍｍ ｅｑｕａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ １９９８；７５：１５０３－１５１２）プログラムを用いてアミノ酸組成から計算した。ＡＡＶ－ＦＰのｄｎ／ｄｃは、以下の式を用いて算出した。
ここで、ｄｎ／ｄｃＡＡＶ－ＦＰ、ｄｎ／ｄｃＡＡＶ－ＥＰ及びｄｎ／ｄｃｓｓＤＮＡはそれぞれＡＡＶ－ＦＰ、ＡＡＶ－ＥＰ及びｓｓＤＮＡの比屈折率変化値（ｍＬ ｇ－１）である。ｓｓＤＮＡのｄｎ／ｄｃは先行研究（Ｄａｖｉｓ ＴＭ，Ｗｉｌｓｏｎ ＷＤ．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ ｉｎｄｅｘ ｉｎｃｒｅｍｅｎｔｓ ｏｆ ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｄａｔａ．Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２０００；２８４：３４８－３５３．）で報告されているように０．２１ｍＬ ｇ－１とした。
【0123】
拡散係数、摩擦係数、ストークス半径の計算
ＡＡＶ－ＦＰ及びＡＡＶ－ＥＰの拡散係数は、Ｓｖｅｄｂｅｒｇ式を用いて計算した。
ここで、ｓは沈降係数（Ｓ）、Ｄは拡散係数（ｃｍ２ ｓｅｃ－１）、Ｍは分子量（ｇ ｍｏｌ－１）、ｖｂａｒは（ｃｍ３／ｇ）、ρ０は溶媒密度（ｇ ｍＬ－１）、Ｒは気体定数（８．３１４Ｊ Ｋ－１）、Ｔは絶対温度（Ｋ）である。ＡＡＶ－ＦＰ及びＡＡＶ－ＥＰのストークス半径は、ストークス－アインシュタイン方程式を用いて計算した。
ここで、Ｄは拡散係数（ｃｍ２／ｓｅｃ）、ｋＢはボルツマン定数（１．３８×１０－２３Ｊ／Ｋ）、Ｔは絶対温度（Ｋ）、η０は溶媒粘度、Ｒｓはストークス半径（ｍ）である。ＡＡＶ－ＦＰ及びＡＡＶ－ＥＰの摩擦係数は、以下の式を用いて算出した
ここで、Ｄは拡散係数（ｃｍ２／ｓｅｃ）、Ｒは気体定数（８．３１４Ｊ／Ｋ）、Ｔは絶対温度（Ｋ）、ＮＡはアボガドロ数（６．０２×１０２３ｍｏｌ－１）、ｆは摩擦係数（ｇ ｓｅｃ－１）である。
ＡＡＶ－ＦＰ及びＡＡＶ－ＥＰの拡散係数は、Ｓｖｅｄｂｅｒｇ式を用いて計算した。
ここで、ｓは沈降係数（Ｓ）、Ｄは拡散係数（ｃｍ２ ｓｅｃ－１）、Ｍは分子量（ｇ ｍｏｌ－１）、ｖｂａｒは（ｃｍ３／ｇ）、ρ０は溶媒密度（ｇ ｍＬ－１）、Ｒは気体定数（８．３１４Ｊ Ｋ－１）、Ｔは絶対温度（Ｋ）である。ＡＡＶ－ＦＰ及びＡＡＶ－ＥＰのストークス半径は、ストークス－アインシュタイン方程式を用いて計算した。
ここで、Ｄは拡散係数（ｃｍ２／ｓｅｃ）、ｋＢはボルツマン定数（１．３８×１０－２３Ｊ／Ｋ）、Ｔは絶対温度（Ｋ）、η０は溶媒粘度、Ｒｓはストークス半径（ｍ）である。ＡＡＶ－ＦＰ及びＡＡＶ－ＥＰの摩擦係数は、以下の式を用いて算出した
ここで、Ｄは拡散係数（ｃｍ２／ｓｅｃ）、Ｒは気体定数（８．３１４Ｊ／Ｋ）、Ｔは絶対温度（Ｋ）、ＮＡはアボガドロ数（６．０２×１０２３ｍｏｌ－１）、ｆは摩擦係数（ｇ ｓｅｃ－１）である。
【0124】
沈降係数、慣性半径、摩擦比の計算
ＡＡＶ５の原子座標（ＰＤＢコード：３ｎｔｔ）から、ＨＹＤＲＯＰＲＯ（Ｏｒｔｅｇａ Ａ，Ａｍｏｒｏｓ Ｄ，Ｇａｒｃｉａ Ｄｅ Ｌａ Ｔｏｒｒｅ Ｊ．Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｒｉｇｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ａｔｏｍｉｃ－ ａｎｄ ｒｅｓｉｄｕｅ－ｌｅｖｅｌ ｍｏｄｅｌｓ．Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ ２０１１；１０１：８９２－８９８．）プログラムを用いてＡＡＶ５－ＥＰの沈降係数と半径を求めた。
ＡＡＶ５の原子座標（ＰＤＢコード：３ｎｔｔ）から、ＨＹＤＲＯＰＲＯ（Ｏｒｔｅｇａ Ａ，Ａｍｏｒｏｓ Ｄ，Ｇａｒｃｉａ Ｄｅ Ｌａ Ｔｏｒｒｅ Ｊ．Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｒｉｇｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ａｔｏｍｉｃ－ ａｎｄ ｒｅｓｉｄｕｅ－ｌｅｖｅｌ ｍｏｄｅｌｓ．Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ ２０１１；１０１：８９２－８９８．）プログラムを用いてＡＡＶ５－ＥＰの沈降係数と半径を求めた。
【0125】
超遠心分析沈降速度法（ＳＶ－ＡＵＣ）
ＳＶ－ＡＵＣ実験は、ＡＡＶ５－ＦＰ及びＡＡＶ５－ＥＰを溶媒（０．００１ｗ／ｖ％ポロキサマー１８８のＰＢＳ（ｐＨ７．４））又は種々の濃度のＨ２ １８Ｏを含む溶媒に溶解したものを用いて行った。サファイアウインドウと１２ｍｍのダブルセクターセンターピースを備えた測定セルのサンプルセクターに３９０μＬのサンプルをそれぞれ充填し、各測定セルのリファレンスセクターに４００μＬの溶媒を充填した。サンプルセクター及びリファレンスセクターの光路長はそれぞれ１．２ｃｍである。前記測定セルを超遠心分析装置ＯＰＴＩＭＡ（ベックマン・コールター、米国）にセットし、温度２０℃、１０，０００ｒｐｍにてＳＶ－ＡＵＣに供した。
ＳＶ－ＡＵＣ実験は、ＡＡＶ５－ＦＰ及びＡＡＶ５－ＥＰを溶媒（０．００１ｗ／ｖ％ポロキサマー１８８のＰＢＳ（ｐＨ７．４））又は種々の濃度のＨ２ １８Ｏを含む溶媒に溶解したものを用いて行った。サファイアウインドウと１２ｍｍのダブルセクターセンターピースを備えた測定セルのサンプルセクターに３９０μＬのサンプルをそれぞれ充填し、各測定セルのリファレンスセクターに４００μＬの溶媒を充填した。サンプルセクター及びリファレンスセクターの光路長はそれぞれ１．２ｃｍである。前記測定セルを超遠心分析装置ＯＰＴＩＭＡ（ベックマン・コールター、米国）にセットし、温度２０℃、１０，０００ｒｐｍにてＳＶ－ＡＵＣに供した。
【0126】
ＵＶ検出については、Ｈ２
１８Ｏを含まないサンプルについては、２３０ｎｍから２８０ｎｍの範囲で５ｎｍごとに測定波長を設定した。Ｈ２
１８Ｏを含むサンプルについては、ＡＡＶ－ＦＰとＡＡＶ－ＥＰの両方について２３０ｎｍで検出を行った。データは、１０μｍの半径方向の増分で遅延なく取得した。遠心分離中の測定セル内の時間依存的な沈降挙動は、同一の測定セルを３分間隔で多波長を用いてスキャンする紫外線（ＵＶ）及び２分間隔で干渉（ＩＦ）検出システムにて測定することによって得た。多波長の検出システムを用いるＳＶ－ＡＵＣをＭＷ－ＳＡ－ＡＵＣとも称する。ＵＶ検出システム及びＩＦ検出システムにて測定することによって、吸光度データ及び屈折率データがそれぞれ得られる。
【0127】
ＳＶ－ＡＵＣのデータ解析
ＳＶ－ＡＵＣで取得したデータは、プログラムＳＥＤＦＩＴ（バージョン１６．２ｂ）（Ｓｃｈｕｃｋ Ｐ．Ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｎｏｎｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｌｆ－ａｓｓｏｃｉａｔｉｎｇ ｓｏｌｕｔｅｓ ｕｓｉｎｇ ｎｕｍｅｒｉｃａｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｌａｍｍ ｅｑｕａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ １９９８；７５：１５０３－１５１２）のｃ（ｓ）分布モデルを用いて、摩擦比、メニスカス、時間非依存ノイズ、半径非依存ノイズをフィッティングし、０．６８の正則化レベルを用いて解析した。沈降係数範囲は０～２５０Ｓで、５００の分解能で評価した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の密度及び粘度は、それぞれ１．００５００ｇ ｍＬ－１及び１．０１７１ｃＰであった。
ＳＶ－ＡＵＣで取得したデータは、プログラムＳＥＤＦＩＴ（バージョン１６．２ｂ）（Ｓｃｈｕｃｋ Ｐ．Ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｎｏｎｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｌｆ－ａｓｓｏｃｉａｔｉｎｇ ｓｏｌｕｔｅｓ ｕｓｉｎｇ ｎｕｍｅｒｉｃａｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｌａｍｍ ｅｑｕａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ １９９８；７５：１５０３－１５１２）のｃ（ｓ）分布モデルを用いて、摩擦比、メニスカス、時間非依存ノイズ、半径非依存ノイズをフィッティングし、０．６８の正則化レベルを用いて解析した。沈降係数範囲は０～２５０Ｓで、５００の分解能で評価した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の密度及び粘度は、それぞれ１．００５００ｇ ｍＬ－１及び１．０１７１ｃＰであった。
【0128】
３２．５％及び６５％Ｈ２
１８Ｏを含む緩衝液の密度及び粘度は、文献（Ｂｒｏｗｎ ＰＨ，Ｂａｌｂｏ Ａ，Ｚｈａｏ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｃｏｎｔｒａｓｔ Ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｖｅｌｏｃｉｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐａｒｔｉａｌ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｖｏｌｕｍｅｓ．６．Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ ２０１１．ＤＯＩ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００２６２２１．）に記載されている値から得られた以下の式を用いて計算した。
ここで、ＦＨ２ １８ＯはＨ２ １８Ｏの分率、ρ０はＰＢＳの密度（ｇ ｍＬ－１）、η０はＰＢＳの粘度（ｃＰ）である。サンプルの偏比容は初期値として０．６８ｃｍ３／ｇとした。偏比容を見積もるため、Ｂｒｏｗｎら（Ｂｒｏｗｎ ＰＨ，Ｂａｌｂｏ Ａ，Ｚｈａｏ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｃｏｎｔｒａｓｔ Ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｖｅｌｏｃｉｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐａｒｔｉａｌ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｖｏｌｕｍｅｓ．６．Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ ２０１１．ＤＯＩ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００２６２２１．）によって述べられているように、ＳＥＤＰＨＡＴの“Ｈｙｂｒｉｄ Ｇｌｏｂａｌ Ｄｉｓｃｒｅｔｅ Ｓｐｅｃｉｅｓ Ｇｌｏｂａｌ Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ”モデルを用いて様々な密度の溶液中のＡＡＶ５－ＥＰ又はＡＡＶ５－ＦＰの沈降プロファイルは、グローバルにフィットさせた。得られた偏比容を用いて、沈降係数分布を定義した。そして、各成分の沈降係数と摩擦係数比（ｆ／ｆ０）から分子量を計算した。ｃ（ｓ）分布の図は、プログラムＧＵＳＳＩ（Ｂｒａｕｔｉｇａｍ ＣＡ．Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ－Ｑｕａｌｉｔｙ Ｉｌｌｕｓｔｒａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ Ｄａｔａ．１ｓｔ ｅｄ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｉｎｃ．．Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ ２０１５．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｂｓ．ｍｉｅ．２０１５．０５．００１．）を用いて作成した。本研究で得られた沈降係数は、標準条件（ｓ２０，ｗ）に規格化した値として報告した。
ここで、ＦＨ２ １８ＯはＨ２ １８Ｏの分率、ρ０はＰＢＳの密度（ｇ ｍＬ－１）、η０はＰＢＳの粘度（ｃＰ）である。サンプルの偏比容は初期値として０．６８ｃｍ３／ｇとした。偏比容を見積もるため、Ｂｒｏｗｎら（Ｂｒｏｗｎ ＰＨ，Ｂａｌｂｏ Ａ，Ｚｈａｏ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｃｏｎｔｒａｓｔ Ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｖｅｌｏｃｉｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐａｒｔｉａｌ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｖｏｌｕｍｅｓ．６．Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ ２０１１．ＤＯＩ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００２６２２１．）によって述べられているように、ＳＥＤＰＨＡＴの“Ｈｙｂｒｉｄ Ｇｌｏｂａｌ Ｄｉｓｃｒｅｔｅ Ｓｐｅｃｉｅｓ Ｇｌｏｂａｌ Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ”モデルを用いて様々な密度の溶液中のＡＡＶ５－ＥＰ又はＡＡＶ５－ＦＰの沈降プロファイルは、グローバルにフィットさせた。得られた偏比容を用いて、沈降係数分布を定義した。そして、各成分の沈降係数と摩擦係数比（ｆ／ｆ０）から分子量を計算した。ｃ（ｓ）分布の図は、プログラムＧＵＳＳＩ（Ｂｒａｕｔｉｇａｍ ＣＡ．Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ－Ｑｕａｌｉｔｙ Ｉｌｌｕｓｔｒａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ Ｄａｔａ．１ｓｔ ｅｄ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｉｎｃ．．Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ ２０１５．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｂｓ．ｍｉｅ．２０１５．０５．００１．）を用いて作成した。本研究で得られた沈降係数は、標準条件（ｓ２０，ｗ）に規格化した値として報告した。
【0129】
ＡＡＶ－ＦＰ及びＡＡＶ－ＥＰの波長対ピーク面積プロットの特性評価
ＡＡＶ－ＦＰ及びＡＡＶ－ＥＰの各測定波長におけるピーク面積Ａｓ（λ）は、それぞれＡＡＶ－ＦＰ及びＡＡＶ－ＥＰ試料のＣ（ｓ）分布におけるメインピークを積分して求めた。
ＡＡＶ－ＦＰ及びＡＡＶ－ＥＰの各測定波長におけるピーク面積Ａｓ（λ）は、それぞれＡＡＶ－ＦＰ及びＡＡＶ－ＥＰ試料のＣ（ｓ）分布におけるメインピークを積分して求めた。
【0130】
モル吸光係数の決定
各波長におけるＡＡＶ５－ＦＰ、ＡＡＶ５－ＥＰ及びその他のＡＡＶ５－ＦＰのモル吸光係数は、以下の式を用いて決定した。
ここで、εはモル吸光係数（Ｌ ｍｏｌ－１ｃｍ－１）を示し、ｄｎ／ｄｃは比屈折率変化値（ｍＬ ｇ－１）を示し、Ｍｗは分子量（ｋｇ ｍｏｌ－１）を示し、ΔＪはフリンジ変位を示し、及びλＩＦは干渉シグナルの波長（ｃｍ）を示す。各波長におけるｓｓＤＮＡのモル吸光係数は、ＡＡＶ５－ＦＰの値からＡＡＶ５－ＥＰの値を差し引いて推定した。本実施例ではカプシドに内包されたＤＮＡ配列は他のＡＡＶ血清型に共通して設計されているため、各波長における他の血清型のＡＡＶ－ＥＰのモル吸光係数はＡＡＶ－ＦＰの値からｓｓＤＮＡの値を差し引いて算出した。
各波長におけるＡＡＶ５－ＦＰ、ＡＡＶ５－ＥＰ及びその他のＡＡＶ５－ＦＰのモル吸光係数は、以下の式を用いて決定した。
ここで、εはモル吸光係数（Ｌ ｍｏｌ－１ｃｍ－１）を示し、ｄｎ／ｄｃは比屈折率変化値（ｍＬ ｇ－１）を示し、Ｍｗは分子量（ｋｇ ｍｏｌ－１）を示し、ΔＪはフリンジ変位を示し、及びλＩＦは干渉シグナルの波長（ｃｍ）を示す。各波長におけるｓｓＤＮＡのモル吸光係数は、ＡＡＶ５－ＦＰの値からＡＡＶ５－ＥＰの値を差し引いて推定した。本実施例ではカプシドに内包されたＤＮＡ配列は他のＡＡＶ血清型に共通して設計されているため、各波長における他の血清型のＡＡＶ－ＥＰのモル吸光係数はＡＡＶ－ＦＰの値からｓｓＤＮＡの値を差し引いて算出した。
【0131】
上記のようにして得られた各測定波長でのｓｓＤＮＡのモル吸光係数を、以下の表にまとめる。
本実施例で用いたｓｓＤＮＡの鎖長は２５９９ヌクレオチド長であった。各測定波長でのｓｓＤＮＡのモル吸光係数を、ｓｓＤＮＡの鎖長の値２，５９９で除して、一ヌクレオチドあたりの平均モル吸光係数を算出した。各測定波長についての一ヌクレオチドあたりの平均モル吸光係数は、上記した表の１番右の列の括弧内に示す。ここで得られた一ヌクレオチドあたりの平均モル吸光係数を用いれば、所定の鎖長のポリヌクレオチドのモル吸光係数を算出することができる。
【表2】
【0132】
ＳＶ－ＡＵＣによる中間粒子／凝集体の同定
沈降係数分布において完全粒子と中空粒子のピーク間の領域で観察される中間粒子、又は完全粒子より沈降係数が大きい領域で観察される凝集体の同定では、１１種の測定波長に対する各ＡＡＶ－ＦＰ及びｓｓＤＮＡのモル吸光係数のプロットを用いて重回帰分析を行い、後述する係数（α及びβ）を求めた。
ここで、Ａｏｂｓは観測された中間粒子又は凝集体に対応するピークの面積を示し、Ａｒｅａｃａｐｓｉｄ及びＡｒｅａｓｓＤＮＡはそれぞれ式１０及び式１１に基づいて計算されたウイルス粒子のカプシド（＝ＡＡＶ－ＥＰ）及びｓｓＤＮＡのピーク面積を示し、εｃａｐｓｉｄ及びεｓｓＤＮＡはそれぞれウイルス完全粒子のカプシド（＝ＡＡＶ－ＥＰ）及びｓｓＤＮＡのモル吸光係数（Ｌ ｍｏｌ－１ｃｍ－１）を示す。ここでカプシドの濃度をＣｃａｐｓｉｄ、未知粒子におけるカプシドとｓｓＤＮＡの数をそれぞれｎｃａｐｓｉｄとｎｓｓＤＮＡとすると、αとβは下記のようになる。
完全粒子の場合、ｎｃａｐｓｉｄとｎｓｓＤＮＡは両方とも１となり、カプシド１つに全長の半分の鎖長のｓｓＤＮＡが入っている中間粒子の場合にはｎｃａｐｓｉｄは１、ｎｓｓＤＮＡは０．５となる。また、完全粒子が２つ会合した凝集体の場合にはｎｃａｐｓｉｄは２、ｎｓｓＤＮＡは２、完全粒子と中空粒子が１つずつ会合した凝集体の場合にはｎｃａｐｓｉｄは２、ｎｓｓＤＮＡは１となる。
沈降係数分布において完全粒子と中空粒子のピーク間の領域で観察される中間粒子、又は完全粒子より沈降係数が大きい領域で観察される凝集体の同定では、１１種の測定波長に対する各ＡＡＶ－ＦＰ及びｓｓＤＮＡのモル吸光係数のプロットを用いて重回帰分析を行い、後述する係数（α及びβ）を求めた。
ここで、Ａｏｂｓは観測された中間粒子又は凝集体に対応するピークの面積を示し、Ａｒｅａｃａｐｓｉｄ及びＡｒｅａｓｓＤＮＡはそれぞれ式１０及び式１１に基づいて計算されたウイルス粒子のカプシド（＝ＡＡＶ－ＥＰ）及びｓｓＤＮＡのピーク面積を示し、εｃａｐｓｉｄ及びεｓｓＤＮＡはそれぞれウイルス完全粒子のカプシド（＝ＡＡＶ－ＥＰ）及びｓｓＤＮＡのモル吸光係数（Ｌ ｍｏｌ－１ｃｍ－１）を示す。ここでカプシドの濃度をＣｃａｐｓｉｄ、未知粒子におけるカプシドとｓｓＤＮＡの数をそれぞれｎｃａｐｓｉｄとｎｓｓＤＮＡとすると、αとβは下記のようになる。
完全粒子の場合、ｎｃａｐｓｉｄとｎｓｓＤＮＡは両方とも１となり、カプシド１つに全長の半分の鎖長のｓｓＤＮＡが入っている中間粒子の場合にはｎｃａｐｓｉｄは１、ｎｓｓＤＮＡは０．５となる。また、完全粒子が２つ会合した凝集体の場合にはｎｃａｐｓｉｄは２、ｎｓｓＤＮＡは２、完全粒子と中空粒子が１つずつ会合した凝集体の場合にはｎｃａｐｓｉｄは２、ｎｓｓＤＮＡは１となる。
【0133】
中間粒子又は凝集体に内包されたヌクレオチドの鎖長は、以下の式を用いて算出される。
ここで、Ｎｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅは中間粒子又は凝集体に内包されたヌクレオチドの鎖長を示し、ＮＡＡＶ－ＦＰは完全粒子に内包されたヌクレオチドの鎖長を示す。
ここで、Ｎｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅは中間粒子又は凝集体に内包されたヌクレオチドの鎖長を示し、ＮＡＡＶ－ＦＰは完全粒子に内包されたヌクレオチドの鎖長を示す。
【0134】
ＳＶ－ＡＵＣ実験における最適測定波長の選択
式９で表される係数（α及びβ）を決定するための測定波長数の最小化及び最適化の可能性を評価するために、２波長での検出から得られたデータを用いて両係数を算出し、１１波長での検出から得られたデータを用いた場合と比較した。さらに、選択された３つの波長（２３０ｎｍ、２６０ｎｍ及び２８０ｎｍ）での検出に由来するデータを用いた重回帰分析を行った。
式９で表される係数（α及びβ）を決定するための測定波長数の最小化及び最適化の可能性を評価するために、２波長での検出から得られたデータを用いて両係数を算出し、１１波長での検出から得られたデータを用いた場合と比較した。さらに、選択された３つの波長（２３０ｎｍ、２６０ｎｍ及び２８０ｎｍ）での検出に由来するデータを用いた重回帰分析を行った。
【0135】
［結果］
ＡＡＶサンプル中の成分の特性評価
ＡＡＶ－５－ＥＰ及びＡＡＶ５－ＦＰの偏比容を決定するために、Ｈ２Ｏ及びＨ２ １８Ｏの濃度を変化させて異なる密度の緩衝液を用いたＳＶ－ＡＵＣ実験を行った（図１２の１．１及び１．２）。ＡＡＶ５－ＥＰでは、ＳＥＤＰＨＡＴを用いた主成分へのグローバルフィットの結果として得られた偏比容は０．７２２ｃｍ３ ｇ－１であった。予想通り、この値は計算値（０．７１８ｃｍ３ ｇ－１）とよく一致している。沈降係数の分布を図１（Ａ）に示した。ｆ／ｆ０、溶媒密度、溶媒粘度を用いて計算した主成分（６７．３Ｓ）の分子量は３６９５．９ｋＤａであり、計算値（３７０５．５ｋＤａ）とよく一致している。ＡＡＶ５－ＦＰについては、主成分へのＳＥＤＰＨＡＴを用いたグローバルフィットの結果として得られた偏比容は０．６８６ｃｍ３ｇ－１であり、計算値（０．６８７ｃｍ３ ｇ－１）とよく一致していた。主成分（９３．７Ｓ）の分子量は、ｆ／ｆ０、溶媒密度、溶媒粘度、偏比容を用いて計算した結果、４９１４．２ｋＤａであり、これは、ＳＶ－ＡＵＣからの分子量の典型的な誤差の範囲内でＦＰの分子量（４５０７．０ｋＤａ）の計算値に対応する。得られたパラメータを図１（Ｂ）にまとめた。以上の結果から、６７．３Ｓ及び９３．７Ｓの成分は、それぞれＡＡＶ５の中空粒子及び完全粒子であると結論づけた。
ＡＡＶサンプル中の成分の特性評価
ＡＡＶ－５－ＥＰ及びＡＡＶ５－ＦＰの偏比容を決定するために、Ｈ２Ｏ及びＨ２ １８Ｏの濃度を変化させて異なる密度の緩衝液を用いたＳＶ－ＡＵＣ実験を行った（図１２の１．１及び１．２）。ＡＡＶ５－ＥＰでは、ＳＥＤＰＨＡＴを用いた主成分へのグローバルフィットの結果として得られた偏比容は０．７２２ｃｍ３ ｇ－１であった。予想通り、この値は計算値（０．７１８ｃｍ３ ｇ－１）とよく一致している。沈降係数の分布を図１（Ａ）に示した。ｆ／ｆ０、溶媒密度、溶媒粘度を用いて計算した主成分（６７．３Ｓ）の分子量は３６９５．９ｋＤａであり、計算値（３７０５．５ｋＤａ）とよく一致している。ＡＡＶ５－ＦＰについては、主成分へのＳＥＤＰＨＡＴを用いたグローバルフィットの結果として得られた偏比容は０．６８６ｃｍ３ｇ－１であり、計算値（０．６８７ｃｍ３ ｇ－１）とよく一致していた。主成分（９３．７Ｓ）の分子量は、ｆ／ｆ０、溶媒密度、溶媒粘度、偏比容を用いて計算した結果、４９１４．２ｋＤａであり、これは、ＳＶ－ＡＵＣからの分子量の典型的な誤差の範囲内でＦＰの分子量（４５０７．０ｋＤａ）の計算値に対応する。得られたパラメータを図１（Ｂ）にまとめた。以上の結果から、６７．３Ｓ及び９３．７Ｓの成分は、それぞれＡＡＶ５の中空粒子及び完全粒子であると結論づけた。
【0136】
偏比容とｆ／ｆ
０
の実験値と三次元座標からの計算値との比較
ＳＶ－ＡＵＣから実験的に決定されたｓ値、分子量、偏比容から、Ｓｖｅｄｂｅｒｇの式（式３）を用いて、ＡＡＶ５－ＥＰのＤ値を１．５４×１０－７ｃｍ２ ｓｅｃ－１、ＡＡＶ５－ＦＰのＤ値を１．４６×１０－７ｃｍ２ ｓｅｃ－１と推定した。その結果、ｆ値はＡＡＶ－ＥＰで２．６２×１０－７ｇ ｓｅｃ－１、ＡＡＶ５－ＦＰで２．７８×１０－７ｇ ｓｅｃ－１と計算され、ストークス半径はＡＡＶ５－ＥＰで１３．７ｎｍ、ＡＡＶ５－ＦＰで１４．５ｎｍとなった。ＳＶ－ＡＵＣとの偏差を考慮すると、その差は重要ではないと結論づけられる。ＡＡＶ５－ＥＰとＡＡＶ５－ＦＰの流体力学的挙動が類似していることは、動的光散乱法の観測結果と一致しており、ＡＡＶ５－ＥＰとＡＡＶ５－ＦＰのストークス半径が類似していることがわかった。また、ＡＡＶ５－ＥＰとＡＡＶ５－ＦＰのｆ値が一致していることから、ＡＡＶ５－ＥＰもＡＡＶ５－ＦＰと同様に、溶液中での並進拡散の際に水分子との摩擦を発生させていることが示唆された。
ＳＶ－ＡＵＣから実験的に決定されたｓ値、分子量、偏比容から、Ｓｖｅｄｂｅｒｇの式（式３）を用いて、ＡＡＶ５－ＥＰのＤ値を１．５４×１０－７ｃｍ２ ｓｅｃ－１、ＡＡＶ５－ＦＰのＤ値を１．４６×１０－７ｃｍ２ ｓｅｃ－１と推定した。その結果、ｆ値はＡＡＶ－ＥＰで２．６２×１０－７ｇ ｓｅｃ－１、ＡＡＶ５－ＦＰで２．７８×１０－７ｇ ｓｅｃ－１と計算され、ストークス半径はＡＡＶ５－ＥＰで１３．７ｎｍ、ＡＡＶ５－ＦＰで１４．５ｎｍとなった。ＳＶ－ＡＵＣとの偏差を考慮すると、その差は重要ではないと結論づけられる。ＡＡＶ５－ＥＰとＡＡＶ５－ＦＰの流体力学的挙動が類似していることは、動的光散乱法の観測結果と一致しており、ＡＡＶ５－ＥＰとＡＡＶ５－ＦＰのストークス半径が類似していることがわかった。また、ＡＡＶ５－ＥＰとＡＡＶ５－ＦＰのｆ値が一致していることから、ＡＡＶ５－ＥＰもＡＡＶ５－ＦＰと同様に、溶液中での並進拡散の際に水分子との摩擦を発生させていることが示唆された。
【0137】
近年の生物物理学ソフトウェア（Ｏｒｔｅｇａ Ａ，Ａｍｏｒｏｓ Ｄ，Ｇａｒｃｉａ Ｄｅ Ｌａ Ｔｏｒｒｅ Ｊ．Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｒｉｇｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ａｔｏｍｉｃ－ ａｎｄ ｒｅｓｉｄｕｅ－ｌｅｖｅｌ ｍｏｄｅｌｓ．Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ ２０１１；１０１：８９２－８９８．及びＲｏｃｃｏ Ｍ，Ｂｙｒｏｎ Ｏ．Ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ ａｎｄ Ｉｔｓ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ＡＵＣ．１ｓｔ ｅｄ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｉｎｃ．．Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ ２０１５．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｂｓ．ｍｉｅ．２０１５．０４．０１０．）の開発により、タンパク質、タンパク質複合体、ウイルス粒子の三次元座標から流体力学的パラメータを計算できるようになった。
【0138】
ＨｙｄｒｏＰＲＯ（Ｏｒｔｅｇａ Ａ，Ａｍｏｒｏｓ Ｄ，Ｇａｒｃｉａ Ｄｅ Ｌａ Ｔｏｒｒｅ Ｊ．Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｒｉｇｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ａｔｏｍｉｃ－ ａｎｄ ｒｅｓｉｄｕｅ－ｌｅｖｅｌ ｍｏｄｅｌｓ．Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ ２０１１；１０１：８９２-８９８．）プログラムを用いて座標から計算したＡＡＶ５－ＥＰの沈降係数は６５．７Ｓ（ｓ２０，ｗ＝６７．７Ｓ）であり、これは実験で得られた値（６７．３Ｓ）とよく一致している。
【0139】
ＡＡＶ５－ＥＰとＡＡＶ５－ＦＰのｆ／ｆ０値は明らかに異なっており、ＡＡＶ５－ＥＰでは１．３５、ＡＡＶ５－ＦＰでは１．２４であったが、これらの実験的なｓ値は先の研究で報告されているＴ＝１ウイルスカプシドの値であるｆ／ｆ０＝１．３に近い値であった（Ｃａｓｔｏｎ ＪＲ，Ｇｈａｂｒｉａｌ ＳＡ，Ｊｉａｎｇ Ｄ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ ｖｉｒｕｓ：Ａ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ ｖｉｒｕｓ ｗｉｔｈ ａ ｇｅｎｕｉｎｅ Ｔ＝１ ｃａｐｓｉｄ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２００３；３３１：４１７－４３１．及びＧｏｍｅｚ－Ｂｌａｎｃｏ Ｊ，Ｌｕｑｕｅ Ｄ，Ｇｏｎｚａｌｅｚ ＪＭ，ｅｔ ａｌ．Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ ｎｉｔｓｃｈｋｅｉ Ｖｉｒｕｓ １ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｓｈｏｗｓ ｔｈａｔ ｔｈｅ Ｃａｐｓｉｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｃｈｒｙｓｏｖｉｒｕｓｅｓ Ｉｓ ａ Ｄｕｐｌｉｃａｔｅｄ Ｈｅｌｉｘ－Ｒｉｃｈ Ｆｏｌｄ Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｉｎ Ｆｕｎｇａｌ Ｄｏｕｂｌｅ－Ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ Ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ２０１２；８６：８３１４－８３１８．）。ｆ０値は球状で未加水状態の粒子の摩擦係数であるため、ｆ／ｆ０が１．０にならないことに注意が必要である。
【0140】
ＳＶ－ＡＵＣからのＡＡＶ５－ＥＰ粒子及びＡＡＶ５－ＦＰ粒子のＵＶ吸収の波長依存性の決定
ＡＡＶ５－ＥＰ及びＡＡＶ５－ＦＰの各測定波長におけるｃ（ｓ）分布の総ピーク面積の波長依存性は、紫外分光光度計を用いて測定したＡＡＶ５－ＥＰ及びＡＡＶ５－ＦＰの紫外スペクトルと完全に重なった。このように、ＳＶ－ＡＵＣ ｃ（ｓ）分析による各成分の吸収スペクトルの取得に成功したことが示された。
ＡＡＶ５－ＥＰ及びＡＡＶ５－ＦＰの各測定波長におけるｃ（ｓ）分布の総ピーク面積の波長依存性は、紫外分光光度計を用いて測定したＡＡＶ５－ＥＰ及びＡＡＶ５－ＦＰの紫外スペクトルと完全に重なった。このように、ＳＶ－ＡＵＣ ｃ（ｓ）分析による各成分の吸収スペクトルの取得に成功したことが示された。
【0141】
（１）ＡＡＶ５サンプルの多波長での吸光度データ及び屈折率データ
ＡＡＶ５－ＦＰベクター及びＡＡＶ５－ＥＰベクターがそれぞれトランスフェクトされた宿主細胞から、ＡＡＶ５－ＦＰ（完全粒子）及びＡＡＶ５－ＥＰ（中空粒子）をそれぞれ産生させて精製した。精製したＡＡＶ５－ＥＰを光路長１ｃｍで２８０ｎｍの吸光度にて０．９５まで３０ｋＤａのフィルターメンブレン（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＳ）を備えたＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ０．５を用いて濃縮した。同様に、回収したＡＡＶ５－ＦＰを２６０ｎｍの吸光度にて０．７５まで濃縮した。ＡＡＶ５－ＥＰに対するＡＡＶ５－ＦＰの粒子数の比（＝［ＡＡＶ５－ＥＰの粒子数］／［ＡＡＶ５－ＦＰの粒子数］）が１．２となるように混合し、ＰＢＳ中のＡＡＶ５サンプルを調製した。
ＡＡＶ５－ＦＰベクター及びＡＡＶ５－ＥＰベクターがそれぞれトランスフェクトされた宿主細胞から、ＡＡＶ５－ＦＰ（完全粒子）及びＡＡＶ５－ＥＰ（中空粒子）をそれぞれ産生させて精製した。精製したＡＡＶ５－ＥＰを光路長１ｃｍで２８０ｎｍの吸光度にて０．９５まで３０ｋＤａのフィルターメンブレン（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＳ）を備えたＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ０．５を用いて濃縮した。同様に、回収したＡＡＶ５－ＦＰを２６０ｎｍの吸光度にて０．７５まで濃縮した。ＡＡＶ５－ＥＰに対するＡＡＶ５－ＦＰの粒子数の比（＝［ＡＡＶ５－ＥＰの粒子数］／［ＡＡＶ５－ＦＰの粒子数］）が１．２となるように混合し、ＰＢＳ中のＡＡＶ５サンプルを調製した。
【0142】
調製したＡＡＶ５サンプルを測定セルに充填し、密度コントラスト超遠心分析沈降速度法（ＳＶ－ＡＵＣ）に供した。遠心分離中の測定セル内の時間依存的な沈降挙動は、１１種の測定波長（２３０ｎｍ、２３５ｎｍ、２４０ｎｍ、２４５ｎｍ、２５０ｎｍ、２５５ｎｍ、２６０ｎｍ、２７０ｎｍ、２７５ｎｍ、２８０ｎｍ）でスキャンする紫外線（ＵＶ）及び干渉（ＩＦ）検出システムで測定することによって取得した（図１２の２．１）。図２は、１１種の測定波長のうち、タンパク質又は核酸の特性を反映する波長、すなわちペプチド結合吸収領域（２３０ｎｍ付近）、核酸吸収領域（２６０ｎｍ付近）及び芳香族アミノ酸吸収領域（２８０ｎｍ付近）の測定波長から得られた時間依存的な沈降挙動の測定結果を示す。
【0143】
（２）沈降挙動解析によるＡＡＶ５サンプルの沈降係数分布
“ＳＶ－ＡＵＣのデータ解析”の項目に記載した解析方法に従い、前記ＵＶ検出システムでの測定によって得られた吸光度データから沈降係数Ｃ（ｓ）の分布をそれぞれ得た（図１２の２．２）。図３Ａ～Ｃは、測定波長２３０ｎｍ、２６０ｎｍ及び２８０ｎｍでの沈降係数分布を示す。同様にして、前記干渉検出システムでの測定によって得られた屈折率データから沈降係数分布を得た（図４）。
“ＳＶ－ＡＵＣのデータ解析”の項目に記載した解析方法に従い、前記ＵＶ検出システムでの測定によって得られた吸光度データから沈降係数Ｃ（ｓ）の分布をそれぞれ得た（図１２の２．２）。図３Ａ～Ｃは、測定波長２３０ｎｍ、２６０ｎｍ及び２８０ｎｍでの沈降係数分布を示す。同様にして、前記干渉検出システムでの測定によって得られた屈折率データから沈降係数分布を得た（図４）。
【0144】
図３Ａは、主として沈降係数が６７．３Ｓのピークと、沈降係数が９７．３Ｓのピークとを示す。ＡＡＶ５－ＥＰ（中空粒子）単独のサンプルについて、本実施例と同様にして沈降係数分布を得たところ、主として６７．３ｓのピークが観察された。また、ＡＡＶ５－ＦＰ（完全粒子）単独のサンプルについて沈降係数分布を得たところ、主として９７．３Ｓのピークが観察された。これらの結果は、図３Ａで観察された２つの主たるピークがＡＡＶ５－ＥＰ及びＡＡＶ５－ＦＰに対応するピークであることを示す。本実施例は、ＡＡＶ５－ＥＰとＡＡＶ５－ＦＰとの混合物であるＡＡＶ５サンプルを遠心力場での沈降させることにより、ＡＡＶ５－ＥＰとＡＡＶ５－ＦＰとをそれぞれ分離して特定可能であることを示す。
【0145】
図３Ａ～Ｃは、ＡＡＶ５－ＦＰ及びＡＡＶ５－ＥＰのピークの沈降係数が２３０ｎｍ、２６０ｎｍ及び２８０ｎｍのように異なる測定波長であっても同じ値となることを示す。図３Ａ～Ｃ及び図４は、ＡＡＶ５－ＦＰ及びＡＡＶ５－ＥＰのピークの沈降係数がＵＶ検出システム及びＩＦ検出システムのように異なる検出システムであっても対応する値となることを示す。
【0146】
（３）屈折率データに基づくＡＡＶ５－ＦＰ及びＡＡＶ５－ＥＰそれぞれのウイルス粒子の濃度
ＡＡＶ５－ＦＰ及びＡＡＶ５－ＥＰそれぞれについての屈折率増分（δｎ）を、それぞれの濃度あたりの比屈折率変化値（ｄｎ／ｄｃ）で割りつけて、ＡＡＶ５－ＦＰ及びＡＡＶ５－ＥＰそれぞれのグラム濃度を得て、さらにそれぞれの分子量で割り付けることにより、各ウイルス粒子のモル濃度を決定した（図１２の２．４）。
ＡＡＶ５－ＦＰ及びＡＡＶ５－ＥＰそれぞれについての屈折率増分（δｎ）を、それぞれの濃度あたりの比屈折率変化値（ｄｎ／ｄｃ）で割りつけて、ＡＡＶ５－ＦＰ及びＡＡＶ５－ＥＰそれぞれのグラム濃度を得て、さらにそれぞれの分子量で割り付けることにより、各ウイルス粒子のモル濃度を決定した（図１２の２．４）。
【0147】
（４）吸光度データに基づくＡＡＶ５－ＦＰ及びＡＡＶ５－ＥＰそれぞれの吸光度スペクトル
特定の測定波長での沈降係数分布におけるＡＡＶ５－ＦＰに対応するピークの面積を算出することで、その測定波長でのＡＡＶ５－ＦＰの吸光度を得た（図１２の２．３）。同様にして、各測定波長でのＡＡＶ５－ＦＰの吸光度を得た。得られた吸光度（ピーク面積）を測定波長に対してプロットすることで、吸光度スペクトルを得た（図５Ａ、左縦軸）。同様にして、ＡＡＶ５－ＥＰの吸光度スペクトルを得た（図５Ｂ、左縦軸）。
特定の測定波長での沈降係数分布におけるＡＡＶ５－ＦＰに対応するピークの面積を算出することで、その測定波長でのＡＡＶ５－ＦＰの吸光度を得た（図１２の２．３）。同様にして、各測定波長でのＡＡＶ５－ＦＰの吸光度を得た。得られた吸光度（ピーク面積）を測定波長に対してプロットすることで、吸光度スペクトルを得た（図５Ａ、左縦軸）。同様にして、ＡＡＶ５－ＥＰの吸光度スペクトルを得た（図５Ｂ、左縦軸）。
【0148】
上記で得た各測定波長でのＡＡＶ５－ＦＰの吸光度を上記のステップ（３）で得た各測定波長でのＡＡＶ５－ＦＰ粒子のウイルス粒子濃度で割りつけることで、各測定波長でのＡＡＶ５－ＦＰの吸光係数を算出した。算出した吸光係数を各測定波長に対してプロットすることで、吸光係数スペクトルを得た（図５Ａ、右縦軸）。同様にして、ＡＡＶ５－ＥＰの吸光係数スペクトルを得た（図５Ｂ、右縦軸）。
【0149】
ＡＡＶサンプルのＳＶ－ＡＵＣとＡ２６０／Ａ２８０比の純度評価の比較
Ａ２６０／Ａ２８０は、ウイルス純度の評価に一般的に使用されている。同様に、ＡＡＶサンプルについて、Ｓｏｍｍｅｒらは、このパラメータを用いて全粒子中の完全粒子の割合を推定する方法を提案している（Ｓｏｍｍｅｒ ＪＭ，Ｓｍｉｔｈ ＰＨ，Ｐａｒｔｈａｓａｒａｔｈｙ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｎｄ ｅｍｐｔｙ ｃａｐｓｉｄｓ ｂｙ ｏｐｔｉｃａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２００３；７：１２２－１２８．）。これはＵＶ測定に基づいて純度を決定するという単純な方法であるが、他の先行研究（Ｄｏｂｎｉｋ Ｄ，Ｋｏｇｏｖｓｅｋ Ｐ，Ｊａｋｏｍｉｎ Ｔ，ｅｔ ａｌ．Ａｃｃｕｒａｔｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｆｒｏｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ；１０．Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ２０１９．ＤＯＩ：１０．３３８９／ｆｍｉｃｂ．２０１９．０１５７０．、Ｌｏｃｋ Ｍ，Ａｌｖｉｒａ ＭＲ，Ｗｉｌｓｏｎ ＪＭ．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ８ ｖｅｃｔｏｒｓ ｂｙ ｉｏｎ－ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１２；２３：５６－６４．、及びＬｏｃｋ Ｍ，Ａｌｖｉｒａ ＭＲ，Ｃｈｅｎ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｓｔｒａｎｄｅｄ．２０１４；１２５：１１５－１２５．）で指摘されているように、この方法は高純度のサンプルを必要とし、完全粒子及び中空粒子以外の分子（例えば、ＤＮＡ不純物やタンパク質汚染物質）が含まれている場合、Ａ２６０／Ａ２８０から純度を推定することは困難である。
Ａ２６０／Ａ２８０は、ウイルス純度の評価に一般的に使用されている。同様に、ＡＡＶサンプルについて、Ｓｏｍｍｅｒらは、このパラメータを用いて全粒子中の完全粒子の割合を推定する方法を提案している（Ｓｏｍｍｅｒ ＪＭ，Ｓｍｉｔｈ ＰＨ，Ｐａｒｔｈａｓａｒａｔｈｙ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｎｄ ｅｍｐｔｙ ｃａｐｓｉｄｓ ｂｙ ｏｐｔｉｃａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２００３；７：１２２－１２８．）。これはＵＶ測定に基づいて純度を決定するという単純な方法であるが、他の先行研究（Ｄｏｂｎｉｋ Ｄ，Ｋｏｇｏｖｓｅｋ Ｐ，Ｊａｋｏｍｉｎ Ｔ，ｅｔ ａｌ．Ａｃｃｕｒａｔｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｆｒｏｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ；１０．Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ２０１９．ＤＯＩ：１０．３３８９／ｆｍｉｃｂ．２０１９．０１５７０．、Ｌｏｃｋ Ｍ，Ａｌｖｉｒａ ＭＲ，Ｗｉｌｓｏｎ ＪＭ．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ８ ｖｅｃｔｏｒｓ ｂｙ ｉｏｎ－ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１２；２３：５６－６４．、及びＬｏｃｋ Ｍ，Ａｌｖｉｒａ ＭＲ，Ｃｈｅｎ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｓｔｒａｎｄｅｄ．２０１４；１２５：１１５－１２５．）で指摘されているように、この方法は高純度のサンプルを必要とし、完全粒子及び中空粒子以外の分子（例えば、ＤＮＡ不純物やタンパク質汚染物質）が含まれている場合、Ａ２６０／Ａ２８０から純度を推定することは困難である。
【0150】
本実施例のＳＶ－ＡＵＣでは、ＡＡＶ５－ＥＰ粒子及びＡＡＶ５－ＦＰ粒子のＡ２６０とＡ２８０の比（Ａ２６０／Ａ２８０）はそれぞれ０．５８及び１．２７であった。この値は、ＡＵＣ実験前に紫外分光光度計を用いて観察したサンプル全体のＡＡＶ５－ＦＰのＡ２６０／Ａ２８０の比（Ａ２６０／Ａ２８０＝１．２８）に近い値であったが、わずかに小さい値であった。また、他の血清型（ＡＡＶ１、ＡＡＶ２及びＡＡＶ６）についても、約９０％の完全粒子を含むサンプルを分析した。その結果、紫外吸光光度計で測定したＡ２６０／Ａ２８０とＳＶ－ＡＵＣによる干渉検出系を用いた純度との相関性は低かった（図６）。これらの結果は、中空粒子及び完全粒子以外の未知の成分を含む試料の純度を紫外線吸収測定で推定することの難しさを示す。これに対して、ＳＶ－ＡＵＣでは遠心力場での沈降により高い溶質分離が可能であるため、ＡＡＶ試料の純度判定の精度が高いと言える。
【0151】
（５）中空粒子及びゲノムＤＮＡそれぞれのモル吸光係数スペクトル
“モル吸光係数の決定”の項目に記載した方法に従って、各測定波長におけるＡＡＶ５－ＦＰ及びＡＡＶ５－ＥＰそれぞれのモル吸光係数を算出した（図１２の２．５）。算出したＡＡＶ５－ＥＰのモル吸光係数を各測定波長に対してプロットして、ＡＡＶ５－ＥＰのモル吸光係数スペクトルを得た（図７、〇）。
“モル吸光係数の決定”の項目に記載した方法に従って、各測定波長におけるＡＡＶ５－ＦＰ及びＡＡＶ５－ＥＰそれぞれのモル吸光係数を算出した（図１２の２．５）。算出したＡＡＶ５－ＥＰのモル吸光係数を各測定波長に対してプロットして、ＡＡＶ５－ＥＰのモル吸光係数スペクトルを得た（図７、〇）。
【0152】
ＡＡＶ５－ＦＰは、ウイルス粒子のカプシド（ＡＡＶ５－ＥＰ）とゲノムである一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）とを含む。各測定波長におけるＡＡＶ５のゲノムＤＮＡのモル吸光係数は、ＡＡＶ５－ＦＰのモル吸光係数からＡＡＶ５－ＥＰのモル吸光係数を差し引くことで推定した。推定したｓｓＤＮＡのモル吸光係数を各測定波長に対してプロットして、ｓｓＤＮＡのモル吸光係数スペクトルを得た（図７、△）。
【0153】
（６）ＡＡＶ５のカプシドとｓｓＤＮＡとの等吸収点
ウイルス粒子のカプシド（ＡＡＶ５－ＥＰ）とゲノムであるｓｓＤＮＡとの等吸収点は、ＡＡＶ５－ＥＰのモル吸光係数スペクトルとｓｓＤＮＡのモル吸光係数スペクトルとの交点から得ることができ、その値は２３９ｎｍであった（図７及び図１２の２．６）。
ウイルス粒子のカプシド（ＡＡＶ５－ＥＰ）とゲノムであるｓｓＤＮＡとの等吸収点は、ＡＡＶ５－ＥＰのモル吸光係数スペクトルとｓｓＤＮＡのモル吸光係数スペクトルとの交点から得ることができ、その値は２３９ｎｍであった（図７及び図１２の２．６）。
【0154】
等吸収点では、ウイルス粒子のカプシドのモル吸光係数とゲノムであるｓｓＤＮＡのモル吸光係数とは等しくなるため（εｃａｐｓｉｄ＝εｓｓＤＮＡ）、ウイルス粒子のカプシド及びゲノムＤＮＡから成るＡＡＶ５－ＦＰと、ウイルス粒子のカプシド（ＡＡＶ５－ＥＰ）との混合物中のそれぞれの吸光度（ＡｒｅａＡＡＶｆｕｌｌ及びＡｒｅａＡＡＶｅｍｐｔｙ）を算出し、以下の式を用いることで、ＡＡＶ５－ＦＰ及びＡＡＶ５－ＥＰのモル吸光係数を算出することなく、ＡＡＶ５－ＦＰのウイルス粒子とＡＡＶ５－ＥＰのウイルス粒子との比率（粒子数の比）を決定することが可能となる。
ここで、ＮＡＡＶｅｍｐｔｙ及びＮＡＡＶｆｕｌｌはそれぞれＡＡＶ－ＥＰ及びＡＡＶ－ＦＰの粒子数を示し、ＡｒｅａＡＡＶｅｍｐｔｙ（＝Ａｒｅａｃａｐｓｉｄ）及びＡｒｅａＡＡＶｆｕｌｌ（＝Ａｒｅａｃａｐｓｉｄ＋ＡｒｅａｓｓＤＮＡ）はそれぞれ、沈降係数分布におけるＡＡＶ５－ＥＰに対応するピークの面積及びＡＡＶ－ＦＰに対応するピーク面積を示す。
ここで、ＮＡＡＶｅｍｐｔｙ及びＮＡＡＶｆｕｌｌはそれぞれＡＡＶ－ＥＰ及びＡＡＶ－ＦＰの粒子数を示し、ＡｒｅａＡＡＶｅｍｐｔｙ（＝Ａｒｅａｃａｐｓｉｄ）及びＡｒｅａＡＡＶｆｕｌｌ（＝Ａｒｅａｃａｐｓｉｄ＋ＡｒｅａｓｓＤＮＡ）はそれぞれ、沈降係数分布におけるＡＡＶ５－ＥＰに対応するピークの面積及びＡＡＶ－ＦＰに対応するピーク面積を示す。
【0155】
（７）ＡＡＶ５サンプル中のＡＡＶ５－ＦＰとＡＡＶ５－ＥＰとの量比
上記のステップ（６）で得られた等吸収点（＝波長２３９ｎｍ）を用いて、モル吸光係数を用いることなく、ＡＡＶ５－ＥＰとＡＡＶ５－ＦＰとのウイルス粒子の数の比を決定する（図１２の３．１及び３．２）。具体的には、等吸収点でＡＡＶ５サンプルを測定して吸光度データを取得し（部分的にステップ（１）に対応する）、前記吸光度データから沈降係数Ｃ（ｓ）の分布を得て、ＡＡＶ５－ＦＰに対応するピーク及びＡＡＶ５－ＥＰに対応するピークをそれぞれ特定し（部分的にステップ（２）に対応する）、各ピークの面積からＡＡＶ５－ＦＰの吸光度及びＡＡＶ５－ＥＰの吸光度を得ることで（部分的にステップ（４）に対応する）、ＡＡＶ５サンプル中のＡＡＶ５－ＦＰとＡＡＶ５－ＥＰとのウイルス粒子の数の絶対的な量比を得ることができる（図８）。図８は、ＡＡＶ５－ＦＰに対するＡＡＶ５－ＥＰの粒子数の比が１．２となるように混合したＡＡＶ５サンプル中のＡＡＶ５－ＦＰとＡＡＶ５－ＥＰとの比が実際に１．２となったことを示す。このように、本実施例は、等吸収点を利用することで、等吸収点以外の波長で吸光度データを取得することも、干渉データを取得することも、モル吸光係数を算出することもなく、ＡＡＶ５－ＥＰとＡＡＶ５－ＦＰとのウイルス粒子数の比を決定することができることを示す。
上記のステップ（６）で得られた等吸収点（＝波長２３９ｎｍ）を用いて、モル吸光係数を用いることなく、ＡＡＶ５－ＥＰとＡＡＶ５－ＦＰとのウイルス粒子の数の比を決定する（図１２の３．１及び３．２）。具体的には、等吸収点でＡＡＶ５サンプルを測定して吸光度データを取得し（部分的にステップ（１）に対応する）、前記吸光度データから沈降係数Ｃ（ｓ）の分布を得て、ＡＡＶ５－ＦＰに対応するピーク及びＡＡＶ５－ＥＰに対応するピークをそれぞれ特定し（部分的にステップ（２）に対応する）、各ピークの面積からＡＡＶ５－ＦＰの吸光度及びＡＡＶ５－ＥＰの吸光度を得ることで（部分的にステップ（４）に対応する）、ＡＡＶ５サンプル中のＡＡＶ５－ＦＰとＡＡＶ５－ＥＰとのウイルス粒子の数の絶対的な量比を得ることができる（図８）。図８は、ＡＡＶ５－ＦＰに対するＡＡＶ５－ＥＰの粒子数の比が１．２となるように混合したＡＡＶ５サンプル中のＡＡＶ５－ＦＰとＡＡＶ５－ＥＰとの比が実際に１．２となったことを示す。このように、本実施例は、等吸収点を利用することで、等吸収点以外の波長で吸光度データを取得することも、干渉データを取得することも、モル吸光係数を算出することもなく、ＡＡＶ５－ＥＰとＡＡＶ５－ＦＰとのウイルス粒子数の比を決定することができることを示す。
【0156】
ＳＶ－ＡＵＣで得られた吸光度データに基づいて沈降係数分布を作成した場合に、中空粒子に対応する沈降係数６７．３Ｓのピークと完全粒子に対応する沈降係数９７．３Ｓのピークとの間の範囲７０Ｓ～９０Ｓにピークが観察されることがある。この範囲に観察されるピークは、ＡＡＶ５のカプシド内部にゲノムＤＮＡ断片を含む中間粒子に対応すると考えられる。加えて、完全粒子に対するピークよりも大きい範囲１１０Ｓ～１２０Ｓにピークが観察されることがある。この範囲に観察されるピークは、ＡＡＶ５－ＦＰを含む凝集体に対応すると考えられる。以下では、上記したステップ（５）で得られたＡＡＶ５－ＥＰ及びｓｓＤＮＡの吸光係数スペクトルを用いて、中間粒子及び凝集体の同定を試みた。
【0157】
（８）ＡＡＶ５－ＦＰ及びＡＡＶ５－ＥＰ以外の成分（中間粒子及び／又は凝集体）の吸光度スペクトル
上記したステップ（４）と同様にして、各測定波長での沈降係数分布における中間粒子に対応する沈降係数のピークの面積を算出することで、各測定波長での中間粒子の吸光度を得た（図１２の４．２）。得られた吸光度を測定波長に対してプロットすることで、中間粒子の吸光度スペクトルを得た。同様にして、各測定波長での凝集体の吸光度を得て、それらを測定波長に対してプロットすることで、凝集体の吸光度スペクトルを得た。
上記したステップ（４）と同様にして、各測定波長での沈降係数分布における中間粒子に対応する沈降係数のピークの面積を算出することで、各測定波長での中間粒子の吸光度を得た（図１２の４．２）。得られた吸光度を測定波長に対してプロットすることで、中間粒子の吸光度スペクトルを得た。同様にして、各測定波長での凝集体の吸光度を得て、それらを測定波長に対してプロットすることで、凝集体の吸光度スペクトルを得た。
【0158】
（９）中間粒子及び／又は凝集体に内包されたｓｓＤＮＡ塩基数
上記のステップ（８）で得られた中間粒子の吸光度スペクトルに対して、上記のステップ（５）で得られたｓｓＤＮＡのモル吸光係数スペクトル及びＡＡＶ５－ＥＰ（ウイルス粒子のカプシド）のモル吸光係数スペクトルを用いて式９に基づいた重回帰分析を行った（図１２の４．３）。重回帰分析の結果、式９中のα及びβが決定された。決定されたα及びβをそれぞれ式１０及び式１１に用いることで、ウイルス粒子のカプシドのピーク面積及びｓｓＤＮＡのピーク面積が得られた。得られたウイルス粒子のカプシド（＝ＡＡＶ－ＥＰ）のピーク面積を、そのモル吸光係数及び光路長の値（１．２）で割ることによって、中間粒子に対応するピーク中のウイルス粒子のカプシドの濃度を算出した。同様にして、得られたｓｓＤＮＡのピーク面積から、中間粒子に対応するピーク中のｓｓＤＮＡの濃度を算出した。このようにして、中間粒子に対応するピーク中のｓｓＤＮＡ塩基数を得ることができる（図１２の４．４）。ｓｓＤＮＡの塩基数が得られれば、塩基の平均分子量（３００Ｍ．Ｗ．）を乗じることで、ｓｓＤＮＡの重量（ｍｇ）を算出することができる。また、算出されたｓｓＤＮＡ濃度を算出されたウイルス粒子のカプシドの濃度で割ることによって、中間粒子に対応するピークにおけるウイルス粒子のカプシド塩基数に対するｓｓＤＮＡ塩基数の比（＝［ｓｓＤＮＡ塩基数］／［カプシド塩基数］）を得ることもできる（図１２の４．４）。中間粒子に対応するピークに含まれるウイルス粒子の各カプシドがそれぞれ１本のｓｓＤＮＡを含む場合、ウイルス粒子のカプシド塩基数に対するｓｓＤＮＡ塩基数の比は、中間粒子に対応するピーク中の中間粒子が含むｓｓＤＮＡ断片の平均のヌクレオチド長の完全なゲノムｓｓＤＮＡのヌクレオチド長に対する比（＝［ｓｓＤＮＡ断片のヌクレオチド長］／［完全なゲノムｓｓＤＮＡのヌクレオチド長］）に対応する。
上記のステップ（８）で得られた中間粒子の吸光度スペクトルに対して、上記のステップ（５）で得られたｓｓＤＮＡのモル吸光係数スペクトル及びＡＡＶ５－ＥＰ（ウイルス粒子のカプシド）のモル吸光係数スペクトルを用いて式９に基づいた重回帰分析を行った（図１２の４．３）。重回帰分析の結果、式９中のα及びβが決定された。決定されたα及びβをそれぞれ式１０及び式１１に用いることで、ウイルス粒子のカプシドのピーク面積及びｓｓＤＮＡのピーク面積が得られた。得られたウイルス粒子のカプシド（＝ＡＡＶ－ＥＰ）のピーク面積を、そのモル吸光係数及び光路長の値（１．２）で割ることによって、中間粒子に対応するピーク中のウイルス粒子のカプシドの濃度を算出した。同様にして、得られたｓｓＤＮＡのピーク面積から、中間粒子に対応するピーク中のｓｓＤＮＡの濃度を算出した。このようにして、中間粒子に対応するピーク中のｓｓＤＮＡ塩基数を得ることができる（図１２の４．４）。ｓｓＤＮＡの塩基数が得られれば、塩基の平均分子量（３００Ｍ．Ｗ．）を乗じることで、ｓｓＤＮＡの重量（ｍｇ）を算出することができる。また、算出されたｓｓＤＮＡ濃度を算出されたウイルス粒子のカプシドの濃度で割ることによって、中間粒子に対応するピークにおけるウイルス粒子のカプシド塩基数に対するｓｓＤＮＡ塩基数の比（＝［ｓｓＤＮＡ塩基数］／［カプシド塩基数］）を得ることもできる（図１２の４．４）。中間粒子に対応するピークに含まれるウイルス粒子の各カプシドがそれぞれ１本のｓｓＤＮＡを含む場合、ウイルス粒子のカプシド塩基数に対するｓｓＤＮＡ塩基数の比は、中間粒子に対応するピーク中の中間粒子が含むｓｓＤＮＡ断片の平均のヌクレオチド長の完全なゲノムｓｓＤＮＡのヌクレオチド長に対する比（＝［ｓｓＤＮＡ断片のヌクレオチド長］／［完全なゲノムｓｓＤＮＡのヌクレオチド長］）に対応する。
【0159】
中間粒子について記載したステップ（９）と同様にして、上記のステップ（８）で得られた凝集体の吸光度スペクトルから、凝集体に対応するピーク中のｓｓＤＮＡ塩基数、及び凝集体に対応するピークにおけるウイルス粒子のカプシド塩基数に対するｓｓＤＮＡ塩基数の比を得ることができる（図１２の４．４）。
【0160】
カプシド（＝ＡＡＶ－ＥＰ）の数（ｎｃａｐｓｉｄｅ）とｓｓＤＮＡの数（ｎｓｓＤＮＡ）との各組合せについての分子量、偏比容、ｓ値及びヌクレオチドの数を算出した（図１２の１．３）。前記分子量、偏比容、ｓ値及びヌクレオチドの数は、ＡＡＶ５－ＥＰ及びＡＡＶ５－ＦＰを用いたＡＵＣ実験で決定された分子量、偏比容及びｆ／ｆ０（＝１．３２）を用いて計算した（図９Ａ）。また、カプシドまたは核酸の分子数から、沈降係数を推定した（図９Ａ）。沈降係数の推定のために、６０個のウイルスタンパク質から構成されるカプシドを１に規格化し、完全粒子（＝ＡＡＶ－ＦＰ）に含まれる核酸の鎖長を１に規格化した。沈降係数は、分子量、偏比容、及び分子の摩擦係数から算出できるため、これらのパラメータの値を仮定すれば沈降係数を推定することができる。ｓｓＤＮＡの数（ｎｓｓＤＮＡ）を０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０に設定し、カプシドの数（ｎｃａｐｓｉｄ）を１．０、２．０、３．０に設定して、それらの各組合せについて沈降係数を推定した（図９Ａ）。この推定値は、実験値であるカプシドと核酸の比（図１２の４．３）と比較することで、沈降係数分布において観察される未知の粒子タイプ（例えば凝集体）に対応し得るピークについて、その粒子タイプにおけるカプシド及び／又はｓｓＤＮＡの構成割合を算出することができる。
【0161】
ヌクレオチドの数（又はｓｓＤＮＡの塩基数）での推定した沈降係数を、横軸を沈降系巣とし、縦軸をヌクレオチドの数としたグラフにプロットして散布図を得た（図９Ｂ)。図９Ｂは、沈降係数６５～９５Ｓに観察される粒子タイプはカプシド単量体＋ｓｓＤＮＡ（完全粒子）であることを示唆し、９５～１２０Ｓに観察される粒子タイプはカプシド単量体＋ｓｓＤＮＡ（完全粒子）又はカプシド二量体＋ｓｓＤＮＡであることを示唆し、１２０～１４０Ｓに観察される粒子タイプはカプシド二量体＋ｓｓＤＮＡ又はカプシド三量体＋ｓｓＤＮＡであることを示唆し、１４０～１６０Ｓに観察される粒子タイプはカプシド三量体＋ｓｓＤＮＡであることを示唆する。
【0162】
図９Ｂから理解されるように、複数種類の粒子の会合状態が存在し得る沈降係数の範囲（例えば９５Ｓ以上）では、沈降係数の値からｓｓＤＮＡの数に対するカプシドの数の絶対的な比を決定することは、通常、できない。また、多波長超遠心分析でも、取得される沈降係数のピーク面積をプロットしたスペクトル分解だけではｓｓＤＮＡに対するカプシドのモル比は決定することができるが、核酸の数に対するカプシドの数の絶対的な比（カプシドと核酸の化学量論）を決定することができない。そこで、上述したｓｓＤＮＡの塩基数と沈降係数との関係を示す散布図（図９Ｂ）と、多波長超遠心分析により取得される不純物（例えばカプシドの凝集体、遊離核酸、タンパク質）ついてのピーク面積プロットに対するスペクトル分解から得られる核酸塩基数（図９Ｃ及び図１２の４．３）とを組みわせて、不純物の同定を行う。これにより、複数種類の粒子の会合状態が存在し得る沈降係数の範囲であっても、ｓｓＤＮＡの数に対するカプシドの数の比を決定することが可能となる。実際、１１５Ｓ付近に観察された粒子タイプ（図９Ｃ）は、カプシド単量体に１分子以上のｓｓＤＮＡが含まれる粒子タイプではなく、中間粒子－中間粒子からなる二量体又は中間粒子－完全粒子からなる二量体であると決定された。
【0163】
さらに、式１４を用いて、中空粒子（ＡＡＶ５－ＥＰ）、中間粒子、完全粒子（ＡＡＶ５－ＦＰ）及び凝集体に対応するピークに含まれるヌクレオチドの数を、それぞれ算出した（図１２の４．５）。算出したヌクレオチドの数を、各ピークの沈降係数に対してプロットした（図９Ｃ）。ＡＡＶの沈降係数と内包されたヌクレオチドの数との間には良好な相関関係があることが知られている（Ｂｕｒｎｈａｍ Ｂ，Ｎａｓｓ Ｓ，Ｋｏｎｇ Ｅ，ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ ａｓ ａｎ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１５；２６：２２８－２４２．、及びＮａｓｓ ＳＡ，Ｍａｔｔｉｎｇｌｙ ＭＡ，Ｗｏｏｄｃｏｃｋ ＤＡ，ｅｔ ａｌ．Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＡＡＶ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｉｎｇ Ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ － Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ ２０１８；９：３３－４６．）。図９Ｃで示されるように、本実施例で算出されたＡＡＶ５（図９Ｃ、△及び▲）の中空粒子、中間粒子及び完全粒子における沈降係数と内包されたヌクレオチドの数との関係は、既報の相関関係（図９Ｃ、破線）と整合した。この結果は、本実施例で用いたＳＶ－ＡＵＣ解析方法が適切であることを示す。
【0164】
ＡＡＶ５の他の血清型であるＡＡＶ１、ＡＡＶ２及びＡＡＶ６について、ＡＡＶの沈降係数と内包されたヌクレオチドの数との関係を調べた。図９Ｃで示されるように、ＡＡＶ５だけでなく、ＡＡＶ１（○及び●）、ＡＡＶ２（□及び■）及びＡＡＶ６（◇）についても、本実施例の解析手法で算出された中空粒子、中間粒子及び完全粒子における沈降係数と内包されたヌクレオチドの数との関係は、既報の相関関係と整合した。これらの結果は、本実施例で用いたＳＶ－ＡＵＣ解析手法が、ＡＡＶの血清型に関係なく、適切であることを示す。
【0165】
沈降係数１１０Ｓ～１２０Ｓの範囲にあるウイルス粒子群については、沈降係数とヌクレオチド数との間に明確な相関関係は確認されなかった（図９Ｃ）。この結果は、１１０Ｓ～１２０Ｓの範囲の沈降係数を示したウイルス粒子群が、２分子以上のｓｓＤＮＡを含むＡＡＶモノマー（例えばｓｓＤＮＡダイマー）ではないことを示唆する。これらの粒子群は、Ｇａｒｃｉａら（Ｄｅ Ｌａ Ｔｏｒｒｅ ＪＧ，Ｂｌｏｏｍｆｉｅｌｄ ＶＡ．Ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｘ，ｒｉｇｉｄ，ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｑ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ １９８１；１４：８１－１３９．）によって与えられた沈降係数とオリゴマー状態との関係を記述する式を用いて計算されたＡＡＶサンプルの沈降係数がＥＰ－ＥＰ二量体では９７Ｓ、ＦＰ－ＦＰ二量体では１３６Ｓ、ＦＰの線形三量体では１６５Ｓ又はＦＰの三角形三量体では１７５Ｓであることを考慮すると、均質な二量体集合体（中空粒子－中空粒子、完全粒子－完全粒子、又は中間粒子－中間粒子）又は不均質な二量体集合体（例えば、中空粒子－中間粒子、中空粒子－完全粒子、中間粒子－完全粒子のようなもの）であると推測される。
【0166】
本実施例で用いた重回帰分析とＳＶ－ＡＵＣとの組合せによる解析アプローチが、カプシドと核酸の比率を直接決定することを可能にし、且つ１１０Ｓ～１２０Ｓの範囲にあるウイルス粒子群がどのようなウイルス粒子であるかを推測することを可能性にし得る有用な方法であることが、本実施例で示された。本実施例で用いた方法によれば、ＳＶ－ＡＵＣによって分離して検出できる成分であれば、中空粒子、中間粒子、完全粒子及び凝集体だけでなく、ゲノムｓｓＤＮＡ又は中空粒子の凝集体であってもそれらを特徴づけることができる。
【0167】
上記のステップ（９）で行った重回帰分析に適切な測定波長を検討した。いくつかのｓｓＤＮＡ分率の２種の波長検出で得られたデータを用いて、式９に示す偏回帰係数（カプシドに関するα及びｓｓＤＮＡに関するβ）を算出した。算出された係数を１１波長検出法に由来するデータを用いた場合と比較した。その結果、ｓｓＤＮＡの０．２５～０．６分率の範囲では１１波長検出法から得られたデータを用いて算出した係数とよく一致した（図１０Ｂ、○及び●）。ｓｓＤＮＡ分率が０．７以上になると、αの残差増加が観察された（図１０Ｂ、○）。この結果は、未知の中間体粒子中のｓｓＤＮＡ含有量を決定するには、３種以上の波長検出を用いることが好ましいことを示す。
【0168】
このような検討を行うことで、測定波長選択の妥当性を評価できる。例えば、タンパク質又は核酸の特性を反映する波長、即ちペプチド結合吸収領域（２３０ｎｍ付近）、核酸吸収領域（２６０ｎｍ付近）、芳香族アミノ酸吸収領域（２８０ｎｍ付近）からそれぞれ３つの波長を選択することで、比較的高い精度で偏回帰係数を決定できることが分かる（図１０Ｂ、×及び＋）。
【0169】
上述したとおり、本実施の形態では、ＳＶ－ＡＵＣにて取得されたデータがプログラムＳＥＤＦＩＴによって処理された後、その処理結果に基づいて各種の解析が行われている。この解析を自動的又は半自動的に実行するためのコンピュータプログラムがあると便宜である。例えば、ＳＥＤＦＩＴにより得られた沈降係数分布が入力された場合に、その沈降係数分布を用いて、上記ステップ（３）～（９）の少なくとも一部を自動的に実行したり、ユーザの指示を受けながら半自動的に実行したりするコンピュータプログラムが想定される。なお、このコンピュータプログラムがＳＥＤＦＩＴと同様の機能を有することにより、ＳＥＤＦＩＴを介さずに上記の各種の解析を行ってもよい。
【0170】
上記のコンピュータプログラムは、処理結果に基づいて、図１～図１０に示されるような各種のグラフを作成し、これを表示装置に表示させる機能を有する。これにより、ユーザは、処理結果を視覚的に容易に確認することができる。
【0171】
また、上記のコンピュータプログラムは、処理結果を、他の処理結果と識別可能にして記憶装置に記憶させる機能を有する。この場合、当該コンピュータプログラムは、記憶装置に記憶されている処理結果の中から特定の複数の処理結果を抽出し、それらの処理結果に係る上記の各種のグラフを対応づけて表示装置に表示させることなどが可能になる。これにより、ユーザは、各サンプルの処理結果を比較したり、同一のサンプルについて処理結果の経時的な変化を確認したりすることができる。
【0172】
なお、上記のコンピュータプログラムは、ＳＶ－ＡＵＣとは別装置であるパーソナルコンピュータ及びタブレット端末などの情報処理装置にインストールされて使用されることが想定される。ただし、当該コンピュータプログラムがＳＶ－ＡＵＣにインストールされて使用されてもよい。
【0173】
図１１は、上記実施の形態の方法を実行する装置（コンピュータ）１のブロック図である。
【0174】
装置１は、制御部（プロセッサ）２、入力部３、表示部４、および記憶部５を備える。制御部２は、演算処理および装置全体の制御を行う。入力部３は、装置１に対する入力データを生成する若しくは受け取る部位であり、例えば、キーボード、マウス、タッチパネル等により構成される。表示部４は、制御部２による処理結果等を表示する部位であり、例えば、液晶ディスプレイ、有機ＥＬディスプレイ、プラズマディスプレイ等により構成される。記憶部５は、制御部（プロセッサ）２で稼働するプログラムや本実施形態の方法を実行するために必要なパラメータデータ等が記録されている。これらの制御部２、入力部３、および表示部４は、図示しない適切なバスにより相互に接続されている。装置１は、デスクトップパソコン、ノートパソコン、ワークステーション、又はタブレット端末のような情報処理装置で構成される。
【0175】
制御部２は、例えば、ソフトウェアと協働して所定の機能を実現するＣＰＵ（Central Processing Unit)又はＭＰＵ(Micro Processing Unit）を含む。制御部２は、記憶部５に格納されたデータやプログラムを読み出して制御部２にロードされることにより、装置１に上記実施形態の方法を実行させる。制御部２にロードされるプログラムは、所定の通信規格にしたがい通信を行う通信部等から提供されてもよいし、可搬性を有する記録媒体（コンピュータ可読媒体）に格納されていてもよい。
【0176】
制御部２は、入力データとして前述の各種光学データを取得し、上記実施の形態の方法に示す各処理を実行し、出力データとして前述のモル濃度、モル吸光係数、量比、寄与度、構成割合、濃度、吸光度比、分子量等を算出し、又は品質の判定を提示し、表示部４に表示させる。即ち、上記のコンピュータプログラムは、処理結果に基づいて、図１～図１０に示されるような各種のグラフを作成し、これを表示部４に表示させる機能を有する。これにより、ユーザは、処理結果を視覚的に容易に確認することができる。
【0177】
また、上記のコンピュータプログラムは、処理結果を、他の処理結果と識別可能にして記憶部５に記憶させる機能を有する。この場合、当該コンピュータプログラムは、記憶部５に記憶されている処理結果の中から特定の複数の処理結果を抽出し、それらの処理結果に係る上記の各種のグラフを対応づけて表示部４に表示させることなどが可能になる。これにより、ユーザは、各サンプルの処理結果を比較したり、同一のサンプルについて処理結果の経時的な変化を確認したりすることができる。
【0178】
なお、上記のコンピュータプログラムは、ＳＶ－ＡＵＣとは別装置であるパーソナルコンピュータ及びタブレット端末などの情報処理装置にインストールされて使用されてもよい。また、当該コンピュータプログラムがＳＶ－ＡＵＣにインストールされて使用されてもよい。
【符号の説明】
【0179】
１ 装置（コンピュータ）
２ 制御部（プロセッサ）
３ 入力部
４ 表示部
５ 記憶部
２ 制御部（プロセッサ）
３ 入力部
４ 表示部
５ 記憶部
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】