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特許7456989デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療における抗ＦＬＴ－１抗体
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-03-18
(45)【発行日】2024-03-27
(54)【発明の名称】デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療における抗ＦＬＴ－１抗体
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20240319BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20240319BHJP
A61P 15/00 20060101ALI20240319BHJP
A61P 13/12 20060101ALI20240319BHJP
A61P 21/00 20060101ALI20240319BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240319BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240319BHJP
C12N 15/63 20060101ALN20240319BHJP
C12P 21/08 20060101ALN20240319BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13 ZNA
C07K16/28
A61P15/00
A61P13/12
A61P21/00
A61P43/00 105
A61K39/395 N
C12N15/63 Z
C12P21/08
【請求項の数】
22
(21)【出願番号】P 2021200631
(22)【出願日】2021-12-10
(62)【分割の表示】P 2017552899の分割
【原出願日】2016-04-07
(65)【公開番号】P2022040124
(43)【公開日】2022-03-10
【審査請求日】2021-12-10
(31)【優先権主張番号】62/144,251
(32)【優先日】2015-04-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/307,645
(32)【優先日】2016-03-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】000002934
【氏名又は名称】武田薬品工業株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】デニス キーフ
(72)【発明者】
【氏名】ハンス デ ハールド
(72)【発明者】
【氏名】ナタリー デ ヨング
(72)【発明者】
【氏名】ソフィ ガブリエルス
【審査官】伊達 利奈
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１４／１１７１６０（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号８３のアミノ酸配列を含む軽鎖および配列番号７０のアミノ酸配列を含む重鎖を含む抗Ｆｌｔ－１抗体と、ヒトＦｌｔ－１結合に関して競合する単離抗体またはその抗原結合断片であって、前記単離抗体またはその抗原結合断片が、（ａ）配列番号７６と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号７１と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖であって、前記単離抗体が、配列番号２１のアミノ酸配列によって定義される可変軽鎖（ＶＬ）ＣＤＲ１、配列番号２４のアミノ酸配列によって定義されるＶＬ ＣＤＲ２、配列番号３２のアミノ酸配列によって定義されるＶＬ ＣＤＲ３、配列番号３のアミノ酸配列によって定義される可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列によって定義されるＶＨ ＣＤＲ２、および配列番号１７のアミノ酸配列によって定義されるＶＨ ＣＤＲ３を含む、重鎖および軽鎖、
（ｂ）配列番号８５と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号７２と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖であって、前記単離抗体が、配列番号２１のアミノ酸配列によって定義されるＶＬ ＣＤＲ１、配列番号２４のアミノ酸配列によって定義されるＶＬ ＣＤＲ２、配列番号２７のアミノ酸配列によって定義されるＶＬ ＣＤＲ３、配列番号２のアミノ酸配列によって定義されるＶＨ ＣＤＲ１、配列番号７のアミノ酸配列によって定義されるＶＨ ＣＤＲ２、および配列番号１７のアミノ酸配列によって定義されるＶＨ ＣＤＲ３を含む、重鎖および軽鎖、
（ｃ）配列番号８４と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号７１と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖であって、前記単離抗体が、配列番号２１のアミノ酸配列によって定義されるＶＬ ＣＤＲ１、配列番号２４のアミノ酸配列によって定義されるＶＬ ＣＤＲ２、配列番号２６のアミノ酸配列によって定義されるＶＬ ＣＤＲ３、配列番号３のアミノ酸配列で定義されるＶＨ ＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列によって定義されるＶＨ ＣＤＲ２、および配列番号１７のアミノ酸配列によって定義されるＶＨ ＣＤＲ３を含む、重鎖および軽鎖、または
（ｄ）配列番号８６と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号７３と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖であって、前記単離抗体が、配列番号２１のアミノ酸配列によって定義されるＶＬ ＣＤＲ１、配列番号２４のアミノ酸配列によって定義されるＶＬ ＣＤＲ２、配列番号２８のアミノ酸配列によって定義されるＶＬ ＣＤＲ３、配列番号２のアミノ酸配列によって定義されるＶＨ ＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸配列によって定義されるＶＨ ＣＤＲ２、および配列番号１７のアミノ酸配列によって定義されるＶＨ ＣＤＲ３を含む、重鎖および軽鎖、
を含み、前記単離抗体またはその抗原結合断片が、ヒトＦｌｔ－１に結合する、単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項2】
前記単離抗体またはその抗原結合断片が、配列番号９０の１３９～１４８位、１３９～１５３位、１７８～２０６位、１９９～２０４位、および１２８～１３８位に対応するアミノ酸配列を含むペプチドまたは断片を認識する、請求項１に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項3】
前記単離抗体またはその抗原結合断片が、配列番号９５および配列番号９６のアミノ酸配列を含むペプチドを認識する、請求項２に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項4】
前記単離抗体またはその抗原結合断片が、ＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、ＳｃＦｖ、二重特異性抗体、三重特異性抗体、および四重特異性抗体からなる群から選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項5】
前記単離抗体またはその抗原結合断片がＩｇＧである、請求項４に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項6】
前記単離抗体またはその抗原結合断片がＩｇＧｌである、請求項５に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項7】
前記単離抗体またはその抗原結合断片がモノクローナル抗体である、請求項１～６のいずれか一項に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項8】
前記単離抗体がヒト化モノクローナル抗体である、請求項７に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項9】
前記ヒト化モノクローナル抗体がヒトＦｃ領域を含む、請求項８に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項10】
前記Ｆｃ領域が、前記単離抗体のインビボ半減期が延長されるように、前記Ｆｃ領域とＦｃＲｎ受容体との間の結合親和性を高める１つまたはそれ以上の変異を含む、請求項９に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項11】
前記Ｆｃ領域が、ヒトＩｇＧｌのＬｅｕ２３４、Ｌｅｕ２３５、および／またはＧｌｙ２３７に対応する位置で１つまたはそれ以上の変異を含む、請求項１０に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項12】
前記単離抗体またはその抗原結合断片が、（ａ）配列番号７６のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号７１のアミノ酸配列を含む重鎖；
（ｂ）配列番号８５のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号７２のアミノ酸配列を含む重鎖；
（ｃ）配列番号８４のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号７１のアミノ酸配列を含む重鎖；または
（ｄ）配列番号８６のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号７３のアミノ酸配列を含む重鎖
を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項13】
前記単離抗体またはその抗原結合断片が、ＶＥＧＦ Ｒ２および／またはＶＥＧＦ Ｒ３に結合しない、請求項１～１２のいずれか一項に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項14】
前記単離抗体またはその抗原結合断片が、約０．５×１０－９Ｍを超える親和性でヒトＦｌｔ－１に結合する、請求項１～１３のいずれか一項に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項15】
前記親和性が表面プラズモン共鳴アッセイで測定される、請求項１４に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項16】
前記親和性がＢＩＡＣＯＲＥアッセイで測定される、請求項１５に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項17】
前記単離抗体またはその抗原結合断片が、Ｆｌｔ－１受容体におけるＶＥＧＦの結合および／または活性を阻害する、請求項１～１６のいずれか一項に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項18】
前記単離抗体またはその抗原結合断片が、競合アッセイにおけるＶＥＧＦのヒトＦｌｔ－１との結合の阻害に関して、約２５ｐＭ未満のＩＣ５０によって特徴づけられる、請求項１７に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項19】
前記単離抗体またはその抗原結合断片が、バイオアッセイにおいて、前記単離抗体またはその抗原結合断片の非存在下でのＶＥＧＦ－Ｒ２のリン酸化レベルに対して、約９０％を超えるＶＥＧＦ－Ｒ２のリン酸化の救済を提供する、請求項１～１８のいずれか一項に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項20】
前記バイオアッセイが、ｓＦｌｔ－１および前記単離抗体またはその抗原結合断片の存在下で、ＶＥＧＦによって刺激されるヒト主要静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を含む、請求項１９に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項21】
Ｆｌｔ－１介在性の疾患、障害、または病態を治療するための、請求項１～２０のいずれか一項に記載の単離抗体またはその抗原結合断片を含む組成物であって、前記Ｆｌｔ－１介在性の疾患、障害、または病態が、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、気管支肺異形成症、子癇前症、または慢性腎疾患である、組成物。
【請求項22】
請求項１～２０のいずれか一項に記載の単離抗体またはその抗原結合断片と、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願
本出願は、２０１５年４月７日出願の米国特許仮出願第６２／１４４，２５１号、及び２０１６年３月１４日出願の米国特許仮出願第６２／３０７，６４５号に対する優先権を主張するものであり、そのそれぞれの開示は本明細書に参照により取り込まれる。
本出願は、２０１５年４月７日出願の米国特許仮出願第６２／１４４，２５１号、及び２０１６年３月１４日出願の米国特許仮出願第６２／３０７，６４５号に対する優先権を主張するものであり、そのそれぞれの開示は本明細書に参照により取り込まれる。
【背景技術】
【0002】
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、約１：３６００で男児出生に影響を及ぼし、全世界で約５０，０００人の罹患個人がいる、Ｘ連鎖劣性疾患である。前記疾患は筋肉の進行性の衰弱を特徴とし、罹患児童は１３歳になる頃には車椅子生活者になる。罹患個人は通常３歳で症状を示し、このような個人の平均生存期間は２５歳と３０歳の間である。横隔膜衰弱による呼吸不全及び心筋症が一般的な死因である。
【0003】
ＤＭＤは、ジストロフィン遺伝子の突然変異によって生じる。ジストロフィン遺伝子はＸ染色体に存在し、タンパク質ジストロフィンをコードしている。ジストロフィンタンパク質は、筋線維の収縮機構（アクチン－ミオシン複合体）を周囲の細胞外マトリックスにジストログリカン複合体により接続する役割を果たす。ジストロフィン遺伝子の突然変異は、ジストロフィンタンパク質及び異常な筋線維膜機能の変質または欠如をもたらす。男性及び女性の両方がジストロフィン遺伝子の突然変異をもたらすことができるが、女性がＤＭＤに罹患するのは稀である。
【0004】
ＤＭＤの１つの特徴は、罹患した組織の虚血である。虚血は組織もしくは臓器への血液供給の制限または減少であり、細胞代謝に必要な酸素及び栄養分の不足を引き起こす。虚血は一般的に、組織または臓器への損傷またはその機能不全をもたらす血管の収縮または閉塞によって生じる。虚血の治療は、罹患した組織または臓器に血流量を増加させるために行われる。
【0005】
現在、ＤＭＤに対する治療法はない。いくつかの治療手段は、遺伝子治療及び副腎皮質ホルモン投与を含んで検討されてきたが、ＤＭＤ患者のための代替物の必要性が依然として存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明はとりわけ、抗Ｆｌｔ－１抗体治療に基づいて、筋ジストロフィー、特にデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）及び／またはベッカー型筋ジストロフィーを治療するための改善された方法及び組成物を提供する。下記の実施例に記載されるように、本発明はある程度は、ＶＥＧＦ及び他のリガンドがＦｌｔ－１受容体と結合するのを抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片が阻止することができ、それによってＶＥＧＦ受容体と結合するのに利用可能なＶＥＧＦ及び／または他のリガンドの量を増加させるという発見に基づく。増大したＶＥＧＦの有効性は、筋肉への増加した血流量を備えた血管新生を促進して機能的虚血と闘い、ＤＭＤの構造及び機能的特徴の改善をもたらす。実際に本実施例に示すように、抗Ｆｌｔ－１抗体の投与が筋病理の程度を改善する（例えば、改良した血管新生、減少した線維症、減少した壊死）ことを、本発明の発明者は立証した。したがって本発明は、ＤＭＤの治療のための安全かつ効果的な抗体を用いた治療法を提供する。
【0007】
一態様で本発明は、配列番号１９～配列番号２１のいずれか一つに少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列によって定義される可変軽（ＶＬ）鎖ＣＤＲ１、配列番号２２～配列番号２４のいずれか一つに少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列によって定義されるＶＬ ＣＤＲ２、配列番号２５～配列番号３４のいずれか一つに少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列によって定義されるＶＬ ＣＤＲ３、配列番号１～配列番号４のいずれか一つに少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列によって定義される可変重（ＶＨ）鎖ＣＤＲ１、配列番号５～配列番号１４のいずれか一つに少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列によって定義されるＶＨ ＣＤＲ２、及び配列番号１５～配列番号１８のいずれか一つに少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列によって定義されるＶＨ ＣＤＲ３からなる群から選択される、１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むヒトＦｌｔ－１に特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【0008】
いくつかの実施形態において、１つ以上のＣＤＲは、配列番号２５～配列番号３４のいずれか一つに少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列によって定義されるＶＬ ＣＤＲ３、及び配列番号１５～配列番号１８のいずれか一つに少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列によって定義されるＶＨ ＣＤＲ３を含む。
【0009】
別の実施形態において、１つ以上のＣＤＲは、配列番号１９～配列番号２１のいずれか一つに少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列によって定義されるＶＬ ＣＤＲ１、配列番号２２～配列番号２４のいずれか一つに少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列によって定義されるＶＬ ＣＤＲ２、及び配列番号２５～配列番号３４のいずれか一つに少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列によって定義されるＶＬ ＣＤＲ３を含む。特定の実施形態において、ＶＬ鎖は、それぞれ配列番号１９、配列番号２２及び配列番号２５のアミノ酸配列によって定義されるＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２ならびにＶＬ ＣＤＲ３を含む。更に別の実施形態において、ＶＬ鎖は、それぞれ配列番号２０、配列番号２３及び配列番号２５のアミノ酸配列によって定義されるＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２ならびにＶＬ ＣＤＲ３を含む。別の実施形態において、ＶＬ鎖は、それぞれ配列番号２１及び配列番号２４のアミノ酸配列によって定義されるＶＬ ＣＤＲ１ならびにＶＬ ＣＤＲ２、ならびに配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３または配列番号３４のアミノ酸配列によって定義されるＶＬ ＣＤＲ３を含む。特定の実施形態において、ＶＬ鎖は、それぞれ配列番号２１、配列番号２４及び配列番号３２のアミノ酸配列によって定義されるＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２ならびにＶＬ ＣＤＲ３を含む。
【0010】
他の実施形態において、１つ以上のＣＤＲは、配列番号１～配列番号４のいずれか一つに少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列によって定義されるＶＨ ＣＤＲ１、配列番号５～配列番号１４のいずれか一つに少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列によって定義されるＶＨ ＣＤＲ２、及び配列番号１５～配列番号１８のいずれか一つに少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列によって定義されるＶＨ ＣＤＲ３を含む。特定の実施形態において、ＶＨ鎖は、それぞれ配列番号１、配列番号５及び配列番号１５のアミノ酸配列によって定義されるＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２ならびにＶＨ ＣＤＲ３を含む。別の実施形態において、ＶＨ鎖は、それぞれ配列番号２、配列番号６及び配列番号１６のアミノ酸配列によって定義されるＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２ならびにＶＨ ＣＤＲ３を含む。更に別の実施形態において、ＶＨ鎖は、それぞれ配列番号２、配列番号１０及び配列番号１８のアミノ酸配列によって定義されるＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２ならびにＶＨ ＣＤＲ３を含む。別の実施形態において、ＶＨ鎖は、それぞれ配列番号２及び配列番号１７のアミノ酸配列によって定義されるＶＨ ＣＤＲ１ならびにＶＨ ＣＤＲ３、ならびに配列番号７、配列番号８、配列番号１３または配列番号１４のアミノ酸配列によって定義されるＶＨ ＣＤＲ２を含む。別の実施形態において、ＶＨ鎖は、それぞれ配列番号３及び配列番号１７のアミノ酸配列によって定義されるＶＨ
ＣＤＲ１ならびにＶＨ ＣＤＲ３、ならびに配列番号９、配列番号１１または配列番号１２のアミノ酸配列によって定義されるＶＨ ＣＤＲ２を含む。更に別の実施形態において、ＶＨ鎖は、それぞれ配列番号４、配列番号９及び配列番号１７のアミノ酸配列によって定義されるＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２ならびにＶＨ ＣＤＲ３を含む。特定の実施形態において、ＶＨ鎖は、それぞれ配列番号３、配列番号１２及び配列番号１７のアミノ酸配列によって定義されるＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２ならびにＶＨ ＣＤＲ３を含む。
ＣＤＲ１ならびにＶＨ ＣＤＲ３、ならびに配列番号９、配列番号１１または配列番号１２のアミノ酸配列によって定義されるＶＨ ＣＤＲ２を含む。更に別の実施形態において、ＶＨ鎖は、それぞれ配列番号４、配列番号９及び配列番号１７のアミノ酸配列によって定義されるＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２ならびにＶＨ ＣＤＲ３を含む。特定の実施形態において、ＶＨ鎖は、それぞれ配列番号３、配列番号１２及び配列番号１７のアミノ酸配列によって定義されるＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２ならびにＶＨ ＣＤＲ３を含む。
【0011】
別の態様で本発明は、（ｉ）配列番号４９～配列番号６１のいずれか一つに少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、軽鎖可変（ＶＬ）領域、及び／または（ｉｉ）配列番号３５～配列番号４８のいずれか一つに少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、重鎖可変（ＶＨ）領域、を含むヒトＦｌｔ－１に特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片を提供する。特定の実施形態において、ＶＬ領域は配列番号６０のアミノ酸配列を含み、及びＶＨ領域は配列番号４５のアミノ酸配列を含む。
【0012】
いくつかの実施形態において、抗体は、配列番号８７～配列番号８９のいずれか一つに少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、重鎖定常領域を更に含む。
【0013】
別の態様で本発明は、（ｉ）配列番号７５～配列番号８６のいずれか一つに少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖、及び／または（ｉｉ）配列番号６２～配列番号７４のいずれか一つに少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖を含む、ヒトＦｌｔ－１に特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片を提供する。特定の実施形態において、軽鎖は配列番号７６のアミノ酸配列を含み、及び重鎖は配列番号７１のアミノ酸配列を含む。
【0014】
別の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、ＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、ＳｃＦｖ、二重特異性抗体、三重特異性抗体及び四重特異性抗体からなる群から選択される。一実施形態において、抗体またはその抗原結合断片はＩｇＧである。別の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片はＩｇＧ１である。更に別の実施形態においては、抗体またはその抗原結合断片は、モノクローナル抗体である。特定の実施形態において、抗体は、ヒト化モノクローナル抗体である。更に別の実施形態においては、ヒト化モノクローナル抗体は、ヒトＦｃ領域を含有する。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、抗体のｉｎ ｖｉｖｏ半減期が長くなるように、Ｆｃ領域とＦｃＲｎ受容体の間の結合親和性を強化する、１つ以上の突然変異を含む。別の実施形態では、Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧｌのＬｅｕ２３４、Ｌｅｕ２３５及び／またはＧｌｙ２３７に対応する位置において、１つ以上の突然変異を含む。
【0015】
一実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、ＶＥＧＦ Ｒ２及び／またはＶＥＧＦ Ｒ３と結合しない。別の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、マウスまたはサルＦｌｔ－１と結合しない。
【0016】
別の態様で本発明は、配列番号９０の位置１３９～１４８、位置１３９～１５３、位置１７８～２０６、位置１９９～２０４及び位置１２８～１３８に対応するアミノ酸配列を含む、ペプチドもしくはこれらの断片を認識する、単離された抗体またはその抗原結合断片を提供する。一実施形態において、ペプチドは、配列番号９０の位置１３０～１３８、位置１４１～１４８、位置１４１～１５３及び位置１９３～２０６に対応するアミノ酸配列からなる。
【0017】
別の態様で本発明は、任意の抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片と競う、単離された抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【0018】
別の態様で本発明は、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【0019】
更に別の態様では、本発明は、本発明の抗体またはその抗原結合断片のＣＤＲ、ＶＬ領域、ＶＨ領域、軽鎖及び／または重鎖をコードするポリヌクレオチドを提供する。一実施形態において、本発明は、ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。更に別の実施形態においては、本発明は、ポリヌクレオチドまたは発現ベクターを含む、宿主細胞を提供する。特定の実施形態において、本発明は、宿主細胞を培養することを含むヒトＦｌｔ－１に特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片の製造方法を提供する。別の実施形態では、ハイブリドーマ細胞は、抗体またはその抗原結合断片を生成する。
【0020】
別の態様において、本発明は、治療を必要とする対象に、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片を投与することを含む、Ｆｌｔ－１介在性疾患、障害または病態を治療する方法を提供する。特定の実施形態において、Ｆｌｔ－１介在性疾患、障害または病態は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、気管支肺異形成症、子癇前症または慢性腎疾患である。
【0021】
別の態様において、本発明はデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）の治療方法を提供し、前記方法は、ＤＭＤの少なくとも１つの症状または特徴が、強度、重症度もしくは頻度において減少されるように、または発症を遅延させるように、ＤＭＤを患っている対象またはＤＭＤに罹患しやすい対象に、有効量の抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片を投与することを含む。一実施形態では、本方法は、対象に１つ以上の追加の治療薬を投与することを含む。特定の実施形態において、追加の治療薬は、プレドニゾン、デフラザコート、フォリスタチン、ＲＮＡ調節療法、エキソンスキッピング療法及び遺伝子治療からなる群から選択される。
【0022】
一実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は非経口的に投与される。いくつかの実施形態では、非経口投与は、静脈内、皮内、髄腔内、吸入、経皮（局所）、眼球内、筋肉内、皮下及び／または経粘膜投与から選択される。特定の実施形態では、非経口投与は静脈内投与である。更に別の実施形態では、非経口投与は皮下投与である。
【0023】
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、毎日、週２回、毎週または毎月投与される。特定の実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は週２回投与される。
【0024】
別の実施形態では、有効量の抗体またはその抗原結合断片は、約１ｍｇ／ｋｇ～５０ｍｇ／ｋｇの投与量である。特定の実施形態において、投与量は、約１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇである。
【0025】
一実施形態において、抗体またはその抗原結合断片の投与は、対照と比較して、減少した線維症及び／または壊死をもたらす。別の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片の投与は、対照と比較して、対象の筋肉の改善した血管新生をもたらす。別の実施形態では、改善した血管新生は、筋病理の増加した血流量、血清の増大したＶＥＧＦレベル、血清の低下したクレアチンキナーゼ（ＣＫ）濃度、ＩＨＣによる増加したＣＤ３１スコア、及び／または血清の減少したｓＦｌｔ－１レベルに反映される。更に別の実施形態においては、抗体またはその抗原結合断片は、対照と比較して、改善した筋機能をもたらす。更に別の実施形態においては、改善した筋機能は、改善した筋力及び／または疲労に対する耐性に反映される。
【0026】
別の態様において、本発明は、治療を必要とする対象に、有効量の抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片を投与することを含む、組織の線維症を治療する方法を提供する。
【0027】
本明細書に記載の本教示は、添付図面と共に読む場合、種々の例示的実施形態の以下の説明からより完全に理解される。以下に述べる図面は単に例示目的のためであり、いかなる場合であっても本教示の範囲を制限することを意図していないと理解すべきである。
特定の実施形態において、例えば、以下が提供される：
（項目１）
配列番号１９～配列番号２１のいずれか一つに少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列によって定義される可変軽（ＶＬ）鎖ＣＤＲ１、
配列番号２２～配列番号２４のいずれか一つに少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列によって定義されるＶＬ ＣＤＲ２、
配列番号２５～配列番号３４のいずれか一つに少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列によって定義されるＶＬ ＣＤＲ３、
配列番号１～配列番号４のいずれか一つに少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列によって定義される可変重（ＶＨ）鎖ＣＤＲ１、
配列番号５～配列番号１４のいずれか一つに少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列によって定義されるＶＨ ＣＤＲ２、
配列番号１５～配列番号１８のいずれか一つに少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列によって定義されるＶＨ ＣＤＲ３、
からなる群から選択される、１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むヒトＦｌｔ－１に特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片。
（項目２）
前記１つ以上のＣＤＲが、配列番号２５～配列番号３４のいずれか一つに少なくとも８０％の同一性を有する前記アミノ酸配列によって定義される前記ＶＬ ＣＤＲ３、及び配列番号１５～配列番号１８のいずれか一つに少なくとも８０％の同一性を有する前記アミノ酸配列によって定義される前記ＶＨ ＣＤＲ３を含む、項目１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
（項目３）
前記１つ以上のＣＤＲが、配列番号１９～配列番号２１のいずれか一つに少なくとも８０％の同一性を有する前記アミノ酸配列によって定義される前記ＶＬ ＣＤＲ１、配列番号２２～配列番号２４のいずれか一つに少なくとも８０％の同一性を有する前記アミノ酸配列によって定義される前記ＶＬ ＣＤＲ２、及び配列番号２５～配列番号３４のいずれか一つに少なくとも８０％の同一性を有する前記アミノ酸配列によって定義される前記ＶＬ ＣＤＲ３を含む、項目１または２に記載の抗体またはその抗原結合断片。
（項目４）
前記１つ以上のＣＤＲが、配列番号１～配列番号４のいずれか一つに少なくとも８０％の同一性を有する前記アミノ酸配列によって定義される前記ＶＨ ＣＤＲ１、配列番号５～配列番号１４のいずれか一つに少なくとも８０％の同一性を有する前記アミノ酸配列によって定義される前記ＶＨ ＣＤＲ２、及び配列番号１５～配列番号１８のいずれか一つに少なくとも８０％の同一性を有する前記アミノ酸配列によって定義される前記ＶＨ ＣＤＲ３を含む、先行項目のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
（項目５）
それぞれ配列番号１９、配列番号２２及び配列番号２５のアミノ酸配列によって定義される前記ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２ならびにＶＬ ＣＤＲ３を含む、ＶＬ鎖を含む、先行項目のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
（項目６）
それぞれ配列番号２０、配列番号２３及び配列番号２５のアミノ酸配列によって定義される前記ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２ならびにＶＬ ＣＤＲ３を含む、ＶＬ鎖を含む、項目１～４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
（項目７）
それぞれ配列番号２１及び配列番号２４のアミノ酸配列によって定義される前記ＶＬ ＣＤＲ１ならびにＶＬ ＣＤＲ２、ならびに配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３または配列番号３４のアミノ酸配列によって定義される前記ＶＬ ＣＤＲ３を含む、ＶＬ鎖を含む、項目１～４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
（項目８）
前記ＶＬ鎖は、それぞれ配列番号２１、配列番号２４及び配列番号３２のアミノ酸配列によって定義される前記ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２ならびにＶＬ ＣＤＲ３を含む、項目１～４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
（項目９）
それぞれ配列番号１、配列番号５及び配列番号１５のアミノ酸配列によって定義される前記ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２ならびにＶＨ ＣＤＲ３を含む、ＶＨ鎖を含む、先行項目のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
（項目１０）
それぞれ配列番号２、配列番号６及び配列番号１６のアミノ酸配列によって定義される前記ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２ならびにＶＨ ＣＤＲ３を含む、ＶＨ鎖を含む、項目１～８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
（項目１１）
それぞれ配列番号２、配列番号１０及び配列番号１８のアミノ酸配列によって定義される前記ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２ならびにＶＨ ＣＤＲ３を含む、ＶＨ鎖を含む、項目１～８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
（項目１２）
それぞれ配列番号２及び配列番号１７のアミノ酸配列によって定義される前記ＶＨ ＣＤＲ１ならびに前記ＶＨ ＣＤＲ３、ならびに配列番号７、配列番号８、配列番号１３または配列番号１４のアミノ酸配列によって定義される前記ＶＨ ＣＤＲ２を含む、ＶＨ鎖を含む、項目１～８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
（項目１３）
それぞれ配列番号３及び配列番号１７のアミノ酸配列によって定義される前記ＶＨ ＣＤＲ１ならびに前記ＶＨ ＣＤＲ３、ならびに配列番号９、配列番号１１または配列番号１２のアミノ酸配列によって定義される前記ＶＨ ＣＤＲ２を含む、ＶＨ鎖を含む、項目１～８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
（項目１４）
それぞれ配列番号４、配列番号９及び配列番号１７のアミノ酸配列によって定義される前記ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２ならびにＶＨ ＣＤＲ３を含む、ＶＨ鎖を含む、項目１～８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
（項目１５）
それぞれ配列番号３、配列番号１２及び配列番号１７のアミノ酸配列によって定義される前記ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２ならびにＶＨ ＣＤＲ３を含む、ＶＨ鎖を含む、項目１～８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
（項目１６）
（ｉ）配列番号４９～配列番号６１のいずれか一つに少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、軽鎖可変（ＶＬ）領域、及び／または（ｉｉ）配列番号３５～配列番号４８のいずれか一つに少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、重鎖可変（ＶＨ）領域、を含む、ヒトＦｌｔ－１に特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片。
（項目１７）
前記ＶＬ領域が配列番号６０のアミノ酸配列を含み、及び前記ＶＨ領域が配列番号４５のアミノ酸配列を含む、項目１６に記載の抗体またはその抗原結合断片。
（項目１８）
前記抗体が、配列番号８７～配列番号８９のいずれか一つに少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、重鎖定常領域を更に含む、先行項目のいずれか一項に記載の抗体。
（項目１９）
（ｉ）配列番号７５～配列番号８６のいずれか一つに少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖、及び／または（ｉｉ）配列番号６２～配列番号７４のいずれか一つに少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖、を含む、ヒトＦｌｔ－１に特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片。
（項目２０）
前記軽鎖が配列番号７６のアミノ酸配列を含み、及び前記重鎖が配列番号７１のアミノ酸配列を含む、項目１９に記載の抗体またはその抗原結合断片。
（項目２１）
前記抗体またはその抗原結合断片が、ＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、二重特異性抗体、三重特異性抗体及び四重特異性抗体からなる群から選択される、先行項目のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
（項目２２）
前記抗体またはその抗原結合断片がＩｇＧである、項目２１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
（項目２３）
前記抗体またはその抗原結合断片がＩｇＧ１である、項目２２に記載の抗体またはその抗原結合断片。
（項目２４）
前記抗体またはその抗原結合断片がモノクローナル抗体である、先行項目のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
（項目２５）
前記抗体がヒト化モノクローナル抗体である、先行項目のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
（項目２６）
前記ヒト化モノクローナル抗体がヒトＦｃ領域を含有する、項目２５に記載の抗体またはその抗原結合断片。
（項目２７）
前記抗体のｉｎ ｖｉｖｏ半減期が長くなるように、前記Ｆｃ領域とＦｃＲｎ受容体の間の結合親和性を強化する１つ以上の突然変異を、前記Ｆｃ領域が含む、項目２６に記載の抗体またはその抗原結合断片。
（項目２８）
前記Ｆｃ領域が、ヒトＩｇＧｌのＬｅｕ２３４、Ｌｅｕ２３５及び／またはＧｌｙ２３７に対応する位置において、１つ以上の突然変異を含む、先行項目のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
（項目２９）
前記抗体またはその抗原結合断片がＶＥＧＦ Ｒ２及び／またはＶＥＧＦ Ｒ３と結合しない、先行項目のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
（項目３０）
前記抗体またはその抗原結合断片がマウスまたはサルＦｌｔ－１と結合しない、先行項目のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
（項目３１）
配列番号９０の位置１３９～１４８、位置１３９～１５３、位置１７８～２０６、位置１９９～２０４及び位置１２８～１３８に対応するアミノ酸配列を含む、ペプチドもしくはその断片を認識する、単離した抗体またはその抗原結合断片。
（項目３２）
前記ペプチドが、配列番号９０の位置１３０～１３８、位置１４１～１４８、位置１４１～１５３及び位置１９３～２０６に対応する前記アミノ酸配列からなる、項目３１に記載の単離した抗体またはその抗原結合断片。
（項目３３）
先行項目のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片と競う、単離した抗体またはその抗原結合断片。
（項目３４）
先行項目のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片、及び薬学的に許容できる担体、を含む医薬組成物。
（項目３５）
項目１～３３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片のＣＤＲ、ＶＬ領域、ＶＨ領域、軽鎖及び／または重鎖をコードするポリヌクレオチド。
（項目３６）
項目３５に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
（項目３７）
項目３５に記載のポリヌクレオチド、及び項目３６に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
（項目３８）
項目３７に記載の宿主細胞を培養することを含む、ヒトＦｌｔ－１に特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片を製造する方法。
（項目３９）
項目１～３３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片を生成する、ハイブリドーマ細胞。
（項目４０）
治療を必要とする対象に、項目１～３３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片を投与することを含む、Ｆｌｔ－１介在性疾患、障害または病態を治療する方法。（項目４１）
前記Ｆｌｔ－１介在性疾患、障害または病態が、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、子癇前症または慢性腎疾患である、項目４０に記載の方法。（項目４２）
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）を治療する方法であって、前記方法が、
ＤＭＤの少なくとも１つの症状または特徴が強度、重症度もしくは頻度において減少されるように、または発症を遅延させるように、ＤＭＤを患っている対象またはＤＭＤに罹患しやすい対象に、項目１～３５のいずれか一項に記載の有効量の抗体またはその抗原結合断片を投与することを含む、前記方法。
（項目４３）
前記方法が、前記対象に１つ以上の追加の治療薬を投与することを含む、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
前記１つ以上の追加の治療薬が、プレドニゾン、デフラザコート、フォリスタチン、ＲＮＡ調節療法、エキソンスキッピング療法及び遺伝子治療からなる群から選択される、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
前記抗体またはその抗原結合断片が非経口的に投与される、項目４２～４４のいずれか一項に記載の方法。
（項目４６）
前記非経口投与が、静脈内、皮内、髄腔内、吸入、経皮（局所）、眼球内、筋肉内、皮下及び／または経粘膜投与から選択される、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
前記非経口投与が静脈内投与である、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
前記非経口投与が皮下投与である、項目４６に記載の方法。
（項目４９）
前記抗体またはその抗原結合断片が、毎日、週２回、毎週または毎月投与される、項目４２～４８のいずれか一項に記載の方法。
（項目５０）
前記抗体またはその抗原結合断片が週２回投与される、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
前記抗体またはその抗原結合断片の前記有効量が、約１ｍｇ／ｋｇ～５０ｍｇ／ｋｇの投与量である、項目４２～４８のいずれか一項に記載の方法。
（項目５２）
前記投与量が約１ｍｇ／ｋｇである、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
前記投与量が約３ｍｇ／ｋｇである、項目５１に記載の方法。
（項目５４）
前記投与量が約１０ｍｇ／ｋｇである、項目５１に記載の方法。
（項目５５）
前記抗体またはその抗原結合断片の前記投与が、対照と比較して減少した線維症及び／または壊死をもたらす、項目４２～５４のいずれか一項に記載の方法。
（項目５６）
前記抗体またはその抗原結合断片の前記投与が、対照と比較して前記対象の筋肉の改善した血管新生をもたらす、項目４２～５４のいずれか一項に記載の方法。
（項目５７）
前記改善した血管新生が、筋病理の増加した血流量、血清の増大したＶＥＧＦレベル、血清の低下したクレアチンキナーゼ（ＣＫ）濃度、ＩＨＣによる増加したＣＤ３１スコア、及び／または血清の減少したｓＦｌｔ－１レベルに反映される、項目５６に記載の方法。
（項目５８）
前記抗体またはその抗原結合断片の前記投与が、対照と比較して改善した筋機能をもたらす、項目４２～５４のいずれか一項に記載の方法。
（項目５９）
前記改善した筋機能が、改善した筋力及び／または疲労に対する耐性に反映される、項目５８に記載の方法。
（項目６０）
治療を必要とする対象に、有効量の項目１～３３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片を投与することを含む、組織の線維症を治療する方法。
特定の実施形態において、例えば、以下が提供される：
（項目１）
配列番号１９～配列番号２１のいずれか一つに少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列によって定義される可変軽（ＶＬ）鎖ＣＤＲ１、
配列番号２２～配列番号２４のいずれか一つに少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列によって定義されるＶＬ ＣＤＲ２、
配列番号２５～配列番号３４のいずれか一つに少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列によって定義されるＶＬ ＣＤＲ３、
配列番号１～配列番号４のいずれか一つに少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列によって定義される可変重（ＶＨ）鎖ＣＤＲ１、
配列番号５～配列番号１４のいずれか一つに少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列によって定義されるＶＨ ＣＤＲ２、
配列番号１５～配列番号１８のいずれか一つに少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列によって定義されるＶＨ ＣＤＲ３、
からなる群から選択される、１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むヒトＦｌｔ－１に特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片。
（項目２）
前記１つ以上のＣＤＲが、配列番号２５～配列番号３４のいずれか一つに少なくとも８０％の同一性を有する前記アミノ酸配列によって定義される前記ＶＬ ＣＤＲ３、及び配列番号１５～配列番号１８のいずれか一つに少なくとも８０％の同一性を有する前記アミノ酸配列によって定義される前記ＶＨ ＣＤＲ３を含む、項目１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
（項目３）
前記１つ以上のＣＤＲが、配列番号１９～配列番号２１のいずれか一つに少なくとも８０％の同一性を有する前記アミノ酸配列によって定義される前記ＶＬ ＣＤＲ１、配列番号２２～配列番号２４のいずれか一つに少なくとも８０％の同一性を有する前記アミノ酸配列によって定義される前記ＶＬ ＣＤＲ２、及び配列番号２５～配列番号３４のいずれか一つに少なくとも８０％の同一性を有する前記アミノ酸配列によって定義される前記ＶＬ ＣＤＲ３を含む、項目１または２に記載の抗体またはその抗原結合断片。
（項目４）
前記１つ以上のＣＤＲが、配列番号１～配列番号４のいずれか一つに少なくとも８０％の同一性を有する前記アミノ酸配列によって定義される前記ＶＨ ＣＤＲ１、配列番号５～配列番号１４のいずれか一つに少なくとも８０％の同一性を有する前記アミノ酸配列によって定義される前記ＶＨ ＣＤＲ２、及び配列番号１５～配列番号１８のいずれか一つに少なくとも８０％の同一性を有する前記アミノ酸配列によって定義される前記ＶＨ ＣＤＲ３を含む、先行項目のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
（項目５）
それぞれ配列番号１９、配列番号２２及び配列番号２５のアミノ酸配列によって定義される前記ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２ならびにＶＬ ＣＤＲ３を含む、ＶＬ鎖を含む、先行項目のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
（項目６）
それぞれ配列番号２０、配列番号２３及び配列番号２５のアミノ酸配列によって定義される前記ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２ならびにＶＬ ＣＤＲ３を含む、ＶＬ鎖を含む、項目１～４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
（項目７）
それぞれ配列番号２１及び配列番号２４のアミノ酸配列によって定義される前記ＶＬ ＣＤＲ１ならびにＶＬ ＣＤＲ２、ならびに配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３または配列番号３４のアミノ酸配列によって定義される前記ＶＬ ＣＤＲ３を含む、ＶＬ鎖を含む、項目１～４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
（項目８）
前記ＶＬ鎖は、それぞれ配列番号２１、配列番号２４及び配列番号３２のアミノ酸配列によって定義される前記ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２ならびにＶＬ ＣＤＲ３を含む、項目１～４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
（項目９）
それぞれ配列番号１、配列番号５及び配列番号１５のアミノ酸配列によって定義される前記ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２ならびにＶＨ ＣＤＲ３を含む、ＶＨ鎖を含む、先行項目のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
（項目１０）
それぞれ配列番号２、配列番号６及び配列番号１６のアミノ酸配列によって定義される前記ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２ならびにＶＨ ＣＤＲ３を含む、ＶＨ鎖を含む、項目１～８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
（項目１１）
それぞれ配列番号２、配列番号１０及び配列番号１８のアミノ酸配列によって定義される前記ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２ならびにＶＨ ＣＤＲ３を含む、ＶＨ鎖を含む、項目１～８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
（項目１２）
それぞれ配列番号２及び配列番号１７のアミノ酸配列によって定義される前記ＶＨ ＣＤＲ１ならびに前記ＶＨ ＣＤＲ３、ならびに配列番号７、配列番号８、配列番号１３または配列番号１４のアミノ酸配列によって定義される前記ＶＨ ＣＤＲ２を含む、ＶＨ鎖を含む、項目１～８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
（項目１３）
それぞれ配列番号３及び配列番号１７のアミノ酸配列によって定義される前記ＶＨ ＣＤＲ１ならびに前記ＶＨ ＣＤＲ３、ならびに配列番号９、配列番号１１または配列番号１２のアミノ酸配列によって定義される前記ＶＨ ＣＤＲ２を含む、ＶＨ鎖を含む、項目１～８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
（項目１４）
それぞれ配列番号４、配列番号９及び配列番号１７のアミノ酸配列によって定義される前記ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２ならびにＶＨ ＣＤＲ３を含む、ＶＨ鎖を含む、項目１～８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
（項目１５）
それぞれ配列番号３、配列番号１２及び配列番号１７のアミノ酸配列によって定義される前記ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２ならびにＶＨ ＣＤＲ３を含む、ＶＨ鎖を含む、項目１～８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
（項目１６）
（ｉ）配列番号４９～配列番号６１のいずれか一つに少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、軽鎖可変（ＶＬ）領域、及び／または（ｉｉ）配列番号３５～配列番号４８のいずれか一つに少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、重鎖可変（ＶＨ）領域、を含む、ヒトＦｌｔ－１に特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片。
（項目１７）
前記ＶＬ領域が配列番号６０のアミノ酸配列を含み、及び前記ＶＨ領域が配列番号４５のアミノ酸配列を含む、項目１６に記載の抗体またはその抗原結合断片。
（項目１８）
前記抗体が、配列番号８７～配列番号８９のいずれか一つに少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、重鎖定常領域を更に含む、先行項目のいずれか一項に記載の抗体。
（項目１９）
（ｉ）配列番号７５～配列番号８６のいずれか一つに少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖、及び／または（ｉｉ）配列番号６２～配列番号７４のいずれか一つに少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖、を含む、ヒトＦｌｔ－１に特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片。
（項目２０）
前記軽鎖が配列番号７６のアミノ酸配列を含み、及び前記重鎖が配列番号７１のアミノ酸配列を含む、項目１９に記載の抗体またはその抗原結合断片。
（項目２１）
前記抗体またはその抗原結合断片が、ＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、二重特異性抗体、三重特異性抗体及び四重特異性抗体からなる群から選択される、先行項目のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
（項目２２）
前記抗体またはその抗原結合断片がＩｇＧである、項目２１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
（項目２３）
前記抗体またはその抗原結合断片がＩｇＧ１である、項目２２に記載の抗体またはその抗原結合断片。
（項目２４）
前記抗体またはその抗原結合断片がモノクローナル抗体である、先行項目のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
（項目２５）
前記抗体がヒト化モノクローナル抗体である、先行項目のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
（項目２６）
前記ヒト化モノクローナル抗体がヒトＦｃ領域を含有する、項目２５に記載の抗体またはその抗原結合断片。
（項目２７）
前記抗体のｉｎ ｖｉｖｏ半減期が長くなるように、前記Ｆｃ領域とＦｃＲｎ受容体の間の結合親和性を強化する１つ以上の突然変異を、前記Ｆｃ領域が含む、項目２６に記載の抗体またはその抗原結合断片。
（項目２８）
前記Ｆｃ領域が、ヒトＩｇＧｌのＬｅｕ２３４、Ｌｅｕ２３５及び／またはＧｌｙ２３７に対応する位置において、１つ以上の突然変異を含む、先行項目のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
（項目２９）
前記抗体またはその抗原結合断片がＶＥＧＦ Ｒ２及び／またはＶＥＧＦ Ｒ３と結合しない、先行項目のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
（項目３０）
前記抗体またはその抗原結合断片がマウスまたはサルＦｌｔ－１と結合しない、先行項目のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
（項目３１）
配列番号９０の位置１３９～１４８、位置１３９～１５３、位置１７８～２０６、位置１９９～２０４及び位置１２８～１３８に対応するアミノ酸配列を含む、ペプチドもしくはその断片を認識する、単離した抗体またはその抗原結合断片。
（項目３２）
前記ペプチドが、配列番号９０の位置１３０～１３８、位置１４１～１４８、位置１４１～１５３及び位置１９３～２０６に対応する前記アミノ酸配列からなる、項目３１に記載の単離した抗体またはその抗原結合断片。
（項目３３）
先行項目のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片と競う、単離した抗体またはその抗原結合断片。
（項目３４）
先行項目のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片、及び薬学的に許容できる担体、を含む医薬組成物。
（項目３５）
項目１～３３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片のＣＤＲ、ＶＬ領域、ＶＨ領域、軽鎖及び／または重鎖をコードするポリヌクレオチド。
（項目３６）
項目３５に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
（項目３７）
項目３５に記載のポリヌクレオチド、及び項目３６に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
（項目３８）
項目３７に記載の宿主細胞を培養することを含む、ヒトＦｌｔ－１に特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片を製造する方法。
（項目３９）
項目１～３３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片を生成する、ハイブリドーマ細胞。
（項目４０）
治療を必要とする対象に、項目１～３３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片を投与することを含む、Ｆｌｔ－１介在性疾患、障害または病態を治療する方法。（項目４１）
前記Ｆｌｔ－１介在性疾患、障害または病態が、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、子癇前症または慢性腎疾患である、項目４０に記載の方法。（項目４２）
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）を治療する方法であって、前記方法が、
ＤＭＤの少なくとも１つの症状または特徴が強度、重症度もしくは頻度において減少されるように、または発症を遅延させるように、ＤＭＤを患っている対象またはＤＭＤに罹患しやすい対象に、項目１～３５のいずれか一項に記載の有効量の抗体またはその抗原結合断片を投与することを含む、前記方法。
（項目４３）
前記方法が、前記対象に１つ以上の追加の治療薬を投与することを含む、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
前記１つ以上の追加の治療薬が、プレドニゾン、デフラザコート、フォリスタチン、ＲＮＡ調節療法、エキソンスキッピング療法及び遺伝子治療からなる群から選択される、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
前記抗体またはその抗原結合断片が非経口的に投与される、項目４２～４４のいずれか一項に記載の方法。
（項目４６）
前記非経口投与が、静脈内、皮内、髄腔内、吸入、経皮（局所）、眼球内、筋肉内、皮下及び／または経粘膜投与から選択される、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
前記非経口投与が静脈内投与である、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
前記非経口投与が皮下投与である、項目４６に記載の方法。
（項目４９）
前記抗体またはその抗原結合断片が、毎日、週２回、毎週または毎月投与される、項目４２～４８のいずれか一項に記載の方法。
（項目５０）
前記抗体またはその抗原結合断片が週２回投与される、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
前記抗体またはその抗原結合断片の前記有効量が、約１ｍｇ／ｋｇ～５０ｍｇ／ｋｇの投与量である、項目４２～４８のいずれか一項に記載の方法。
（項目５２）
前記投与量が約１ｍｇ／ｋｇである、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
前記投与量が約３ｍｇ／ｋｇである、項目５１に記載の方法。
（項目５４）
前記投与量が約１０ｍｇ／ｋｇである、項目５１に記載の方法。
（項目５５）
前記抗体またはその抗原結合断片の前記投与が、対照と比較して減少した線維症及び／または壊死をもたらす、項目４２～５４のいずれか一項に記載の方法。
（項目５６）
前記抗体またはその抗原結合断片の前記投与が、対照と比較して前記対象の筋肉の改善した血管新生をもたらす、項目４２～５４のいずれか一項に記載の方法。
（項目５７）
前記改善した血管新生が、筋病理の増加した血流量、血清の増大したＶＥＧＦレベル、血清の低下したクレアチンキナーゼ（ＣＫ）濃度、ＩＨＣによる増加したＣＤ３１スコア、及び／または血清の減少したｓＦｌｔ－１レベルに反映される、項目５６に記載の方法。
（項目５８）
前記抗体またはその抗原結合断片の前記投与が、対照と比較して改善した筋機能をもたらす、項目４２～５４のいずれか一項に記載の方法。
（項目５９）
前記改善した筋機能が、改善した筋力及び／または疲労に対する耐性に反映される、項目５８に記載の方法。
（項目６０）
治療を必要とする対象に、有効量の項目１～３３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片を投与することを含む、組織の線維症を治療する方法。
【図面の簡単な説明】
【0028】
【図1A】マウスに抗体を１０ｍｇ／ｋｇの投与量で静脈内投与した後、抗Ｆｌｔ－１抗体１３Ｂ４の消失を表す例示的な結果を示す。
【図1B】マウスに抗体を１０ｍｇ／ｋｇの投与量で静脈内投与した後、抗Ｆｌｔ－１抗体１０Ｇ１２の消失を表す例示的な結果を示す。
【図2A】抗Ｆｌｔ－１抗体の最高血清中濃度を表す例示的な結果を示す。
【図2B】抗Ｆｌｔ－１抗体の最低血清中濃度を表す例示的な結果を示す。
【図3】抗Ｆｌｔ－１抗体（１３Ｂ４または１０Ｇ１２）、アイソタイプ対照抗体、市販の抗体（Ａｎｇｉｏ）または溶媒単独を、ｍｄｘマウスに投与した後の、血清中の遊離可溶性Ｆｌｔ－１（ｓＦｌｔ－１）濃度の減少を表す例示的な結果を示す。
【図4】抗Ｆｌｔ－１抗体（１３Ｂ４または１０Ｇ１２）、アイソタイプ対照抗体、市販の抗体（Ａｎｇｉｏ）または溶媒単独を、ｍｄｘマウスに投与した後の、ＶＥＧＦの血清中濃度の増加を表す例示的な結果を示す。
【図5】図５Ａ～５Ｄは、抗Ｆｌｔ－１抗体（１３Ｂ４または１０Ｇ１２）、アイソタイプ対照抗体または市販の抗体（Ａｎｇｉｏ）を投与したｍｄｘマウスの横隔膜筋から得た組織切片のＣＤ３１染色の例示的な結果を示す。
【図6A】横隔膜筋から得た組織切片のすべての着色領域の割合として、ＣＤ３１陽性領域の定量の例示的な結果を示す。
【図6B】前脛骨（ＴＡ）筋から得た組織切片のすべての着色領域の割合として、ＣＤ３１陽性領域の定量の例示的な結果を示す。図６Ｂは、抗Ｆｌｔ－１抗体を投与したｍｄｘマウスの前脛骨（ＴＡ）筋から得た組織切片のすべての着色領域の割合として、ＣＤ３１陽性領域の定量の例示的な結果を示す。
【図7】ＥＬＩＳＡアッセイによって、組換えｓＦｌｔ－１への抗Ｆｌｔ－１抗体の結合を表す例示的な結果を示す。
【図8】競合的ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、抗Ｆｌｔ－１抗体によるＶＥＧＦへのｓＦｌｔ－１の結合の阻害を表す例示的な結果を示す。
【図9】抗Ｆｌｔ－１抗体によるＶＥＧＦ Ｒ２のリン酸化の救済を表す例示的な結果を示す。ヒト主要静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）は、ｓＦｌｔ－１及び抗Ｆｌｔ－１抗体の存在下でＶＥＧＦで処置されて、ＶＥＧＦ Ｒ２のリン酸化のレベルが判定された。救済％は、ＨＵＶＥＣがＶＥＧＦ及びｓＦｌｔ－１だけで処置された場合（すなわち、抗Ｆｌｔ－１抗体はない）のＶＥＧＦ Ｒ２のリン酸化のレベルと比較したＶＥＧＦ Ｒ２のリン酸化のレベルを示す。
【図10】競合的ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、抗Ｆｌｔ－１抗体によるＶＥＧＦへの可溶なＦｌｔ－１の結合の阻害を表す例示的な結果を示す。
【図11】マウスに抗Ｆｌｔ－１抗体を１０ｍｇ／ｋｇの投与量で静脈内投与した後、６７２時間における血清からの抗Ｆｌｔ－１抗体の消失を表す例示的な結果を示す。
【図13A】抗体投与後、２５６時間の経時変化で、マウスの横隔膜、脛骨及び腓腹筋における、抗Ｆｌｔ－１抗体２７Ｈ９、１３Ｂ４ならびに２１Ｂ３の例示的な体内分布を示す。
【図13B】抗体投与後、２５６時間の経時変化で、マウスの横隔膜、脛骨及び腓腹筋における、抗Ｆｌｔ－１抗体２７Ｈ９、１３Ｂ４ならびに２１Ｂ３の例示的な体内分布を示す。
【図13C】抗体投与後、２５６時間の経時変化で、マウスの横隔膜、脛骨及び腓腹筋における、抗Ｆｌｔ－１抗体２７Ｈ９、１３Ｂ４ならびに２１Ｂ３の例示的な体内分布を示す。
【図14A】最大曝露での最高抗Ｆｌｔ－１抗体２１Ｂ３濃度を表す例示的な結果を示す。
【図14B】最低抗Ｆｌｔ－１抗体２１Ｂ３濃度を表す例示的な結果を示す。
【図15】ｍｄｘマウスへの抗Ｆｌｔ－１抗体２１Ｂ３の投与後、遊離ｓＦｌｔ－１を表す例示的な結果を示す。
【図16】ｍｄｘマウスへの抗Ｆｌｔ－１抗体２１Ｂ３の投与後、ＶＥＧＦ濃度を表す例示的な結果を示す。
【図18】抗Ｆｌｔ－１抗体２１Ｂ３またはアイソタイプ対照抗体を投与したｍｄｘマウスの横隔膜筋から得た組織切片の正規化したＣＤ３１の陽性割合の定量の例示的な結果を示す。
【図20】抗Ｆｌｔ－１抗体２１Ｂ３またはアイソタイプ対照抗体を投与したｍｄｘマウスの前脛骨筋から得た組織切片の正規化したＣＤ３１の陽性割合の定量の例示的な結果を示す。
【図21A】脱グリコシルした２１Ｂ３抗体の分子量を判定するための逆相液体クロマトグラフィー／質量分析（ＲＰ－ＬＣ／ＭＳ）分析の例示的な結果を示す。
【図21B】重鎖のグリコシル化パターンの分析の例示的な結果を示す。
【図22A】抗Ｆｌｔ－１抗体による、ＶＥＧＦ Ｒ２のリン酸化の救済を表す例示的な結果を示す。ヒト主要静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）は、ｓＦｌｔ－１及び抗Ｆｌｔ－１抗体の存在下でＶＥＧＦで処置されて、ＶＥＧＦ Ｒ２のリン酸化のレベルが判定された。救済％は、ＨＵＶＥＣがＶＥＧＦ及びｓＦｌｔ－１だけで処置された場合（すなわち、抗Ｆｌｔ－１抗体はない）のＶＥＧＦ Ｒ２のリン酸化のレベルと比較したＶＥＧＦ Ｒ２のリン酸化のレベルを示す。
【図22B】抗Ｆｌｔ－１抗体による、ＶＥＧＦ Ｒ２のリン酸化の救済を表す例示的な結果を示す。ヒト主要静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）は、ｓＦｌｔ－１及び抗Ｆｌｔ－１抗体の存在下でＶＥＧＦで処置されて、ＶＥＧＦ Ｒ２のリン酸化のレベルが判定された。救済％は、ＨＵＶＥＣがＶＥＧＦ及びｓＦｌｔ－１だけで処置された場合（すなわち、抗Ｆｌｔ－１抗体はない）のＶＥＧＦ Ｒ２のリン酸化のレベルと比較したＶＥＧＦ Ｒ２のリン酸化のレベルを示す。
【図23】ＥＬＩＳＡアッセイによって、組換えｓＦｌｔ－１への抗Ｆｌｔ－１抗体の結合を表す例示的な結果を示す。
【図24】ｍｄｘマウスにおける遊離抗Ｆｌｔ－１抗体２１Ｂ３及びアイソタイプ対照抗体の血清中濃度を表す例示的な結果を示す。
【図25】抗Ｆｌｔ－１抗体２１Ｂ３またはアイソタイプ対照抗体のいずれかで処置したｍｄｘマウスの遊離ｓＦｌｔ－１の血清中濃度を表す例示的な結果を示す。
【図26】抗Ｆｌｔ－１抗体２１Ｂ３またはアイソタイプ対照抗体のいずれかで処置したｍｄｘマウスのＶＥＧＦの血清中濃度を表す例示的な結果を示す。
【図27】図２７Ａ～２７Ｈは、６週間（２７Ａ～２７Ｄ）または１２週間（２７Ｅ～２７Ｈ）、抗Ｆｌｔ－１抗体２１Ｂ３または溶媒対照を投与したｍｄｘマウスの横隔膜筋から得た組織切片のＣＤ３１染色の例示的な結果を示す。
【図28】図２８Ａ～２８Ｈは、６週間（２８Ａ～２８Ｄ）または１２週間（２８Ｅ～２８Ｈ）、抗Ｆｌｔ－１抗体２１Ｂ３または溶媒対照を投与したｍｄｘマウスの腓腹筋から得た組織切片のＣＤ３１染色の例示的な結果を示す。
【図29】図２９Ａ～２９Ｈは、６週間（２９Ａ～２９Ｄ）または１２週間（２９Ｅ～２９Ｈ）、抗Ｆｌｔ－１抗体２１Ｂ３または溶媒対照を投与したｍｄｘマウスの脛骨筋から得た組織切片のＣＤ３１染色の例示的な結果を示す。
【図30A】６週間または１２週間、抗Ｆｌｔ－１抗体２１Ｂ３または溶媒対照抗体を投与したｍｄｘマウスの横隔膜筋、腓腹筋及び脛骨筋から得た組織切片のＣＤ３１染色の陽性％の定量の例示的な結果を示す。
【図30B】６週間または１２週間、抗Ｆｌｔ－１抗体２１Ｂ３または溶媒対照抗体を投与したｍｄｘマウスの横隔膜筋、腓腹筋及び脛骨筋から得た組織切片のＣＤ３１染色の陽性％の定量の例示的な結果を示す。
【図30C】６週間または１２週間、抗Ｆｌｔ－１抗体２１Ｂ３または溶媒対照抗体を投与したｍｄｘマウスの横隔膜筋、腓腹筋及び脛骨筋から得た組織切片のＣＤ３１染色の陽性％の定量の例示的な結果を示す。
【図31】図３１Ａ～３１Ｈは、６週間（３１Ａ～３１Ｄ）または１２週間（３１Ｅ～３１Ｈ）、抗Ｆｌｔ－１抗体２１Ｂ３または溶媒対照を投与したｍｄｘマウスの横隔膜筋から得た組織切片のＩ型コラーゲン免疫組織化学的染色の例示的な結果を示す。
【図32】図３２Ａ～３２Ｈは、６週間（３２Ａ～３２Ｄ）または１２週間（３２Ｅ～３２Ｈ）、抗Ｆｌｔ－１抗体２１Ｂ３または溶媒対照を投与したｍｄｘマウスの腓腹筋から得た組織切片のＩ型コラーゲン免疫組織化学的染色の例示的な結果を示す。
【図33】図３３Ａ～３３Ｈは、６週間（３３Ａ～３３Ｄ）または１２週間（３３Ｅ～３３Ｈ）、抗Ｆｌｔ－１抗体２１Ｂ３または溶媒対照を投与したｍｄｘマウスの脛骨筋から得た組織切片のＩ型コラーゲン免疫組織化学的染色の例示的な結果を示す。
【図34A】６週間または１２週間、抗Ｆｌｔ－１抗体２１Ｂ３または溶媒対照抗体を投与したｍｄｘマウスの横隔膜筋、腓腹筋及び脛骨筋から得た組織切片のＩ型コラーゲン染色の陽性％の定量の例示的な結果を示す。
【図34B】６週間または１２週間、抗Ｆｌｔ－１抗体２１Ｂ３または溶媒対照抗体を投与したｍｄｘマウスの横隔膜筋、腓腹筋及び脛骨筋から得た組織切片のＩ型コラーゲン染色の陽性％の定量の例示的な結果を示す。
【図34C】６週間または１２週間、抗Ｆｌｔ－１抗体２１Ｂ３または溶媒対照抗体を投与したｍｄｘマウスの横隔膜筋、腓腹筋及び脛骨筋から得た組織切片のＩ型コラーゲン染色の陽性％の定量の例示的な結果を示す。
【図36-1】図３６は、ヒトｓＦｌｔ－１単独の水素／重水素交換をヒトｓＦｌｔ－１及び抗Ｆｌｔ－１抗体（２１Ｂ３）混合物のそれと比較する差次的ヒートマップを表す例示的な結果を示す。灰色：重水素保護なし、青：Ｆａｂ結合時の重水素保護。
【図36-2】図３６は、ヒトｓＦｌｔ－１単独の水素／重水素交換をヒトｓＦｌｔ－１及び抗Ｆｌｔ－１抗体（２１Ｂ３）混合物のそれと比較する差次的ヒートマップを表す例示的な結果を示す。灰色：重水素保護なし、青：Ｆａｂ結合時の重水素保護。
【図36-3】図３６は、ヒトｓＦｌｔ－１単独の水素／重水素交換をヒトｓＦｌｔ－１及び抗Ｆｌｔ－１抗体（２１Ｂ３）混合物のそれと比較する差次的ヒートマップを表す例示的な結果を示す。灰色：重水素保護なし、青：Ｆａｂ結合時の重水素保護。
【図37-1】図３７は、ヒトｓＦｌｔ－１単独の水素／重水素交換をヒトｓＦｌｔ－１及び抗Ｆｌｔ－１抗体（２１Ｃ６）混合物のそれと比較する差次的ヒートマップを表す例示的な結果を示す。灰色：重水素保護なし、青：Ｆａｂ結合時の重水素保護。
【図37-2】図３７は、ヒトｓＦｌｔ－１単独の水素／重水素交換をヒトｓＦｌｔ－１及び抗Ｆｌｔ－１抗体（２１Ｃ６）混合物のそれと比較する差次的ヒートマップを表す例示的な結果を示す。灰色：重水素保護なし、青：Ｆａｂ結合時の重水素保護。
【図37-3】図３７は、ヒトｓＦｌｔ－１単独の水素／重水素交換をヒトｓＦｌｔ－１及び抗Ｆｌｔ－１抗体（２１Ｃ６）混合物のそれと比較する差次的ヒートマップを表す例示的な結果を示す。灰色：重水素保護なし、青：Ｆａｂ結合時の重水素保護。
【図38A】エピトープ領域からアミノ酸残基を含有する同定したペプチドについてのＭＳ／ＭＳスペクトルを表す例示的な結果を示す。
【図38B】エピトープ領域からアミノ酸残基を含有する同定したペプチドについてのＭＳ／ＭＳスペクトルを表す例示的な結果を示す。
【図38C】エピトープ領域からアミノ酸残基を含有する同定したペプチドについてのＭＳ／ＭＳスペクトルを表す例示的な結果を示す。
【図38D】エピトープ領域からアミノ酸残基を含有する同定したペプチドについてのＭＳ／ＭＳスペクトルを表す例示的な結果を示す。
【図38E】エピトープ領域からアミノ酸残基を含有する同定したペプチドについてのＭＳ／ＭＳスペクトルを表す例示的な結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0029】
定義
本発明をより容易に理解するために、特定の用語を最初に以下に定義する。以下の用語及び他の用語についての追加の定義は、本明細書を通して記載する。
本発明をより容易に理解するために、特定の用語を最初に以下に定義する。以下の用語及び他の用語についての追加の定義は、本明細書を通して記載する。
【0030】
親和性：当該分野において周知のように「親和性」とは、特定のリガンドがそのパートナーと結合する際の堅固さの程度である。いくつかの実施形態では、リガンドまたはパートナーはＦｌｔ－１である。いくつかの実施形態では、リガンドまたはパートナーは可溶なＦｌｔ－１である。いくつかの実施形態では、リガンドまたはパートナーは組換えＦｌｔ－１である。特定の実施形態では、リガンドまたはパートナーはヒトｓＦｌｔ－１である。特定の実施形態では、リガンドまたはパートナーは組換えｓＦｌｔ－１である。他の実施形態では、リガンドまたはパートナーは抗Ｆｌｔ－１抗体である。親和性は様々な方法で測定することができる。いくつかの実施形態では、親和性は定量的アッセイで測定される。いくつかのこのような実施形態において、結合パートナーの濃度は、生理学的条件を模倣するようにリガンド濃度を上回って固定できる。代替的にまたは追加的に、いくつかの実施形態において、結合パートナー濃度及び／またはリガンド濃度は変化できる。いくつかのこのような実施形態において、親和性は、同様の条件下にて（例えば、濃度）、参照と比較することができる。
【0031】
親和性成熟（または、親和性成熟抗体）：本明細書で使用する場合「親和性成熟」または「親和性成熟抗体」という用語は、変質（複数可）を有さない親抗体と比較して、抗原についての抗体の親和性に改善をもたらす、その１つ以上のＣＤＲにおける１つ以上のその変質を有する抗体を意味する。いくつかの実施形態では、親和性成熟抗体は、標的抗原に関してナノモル濃度の親和性またはピコモル濃度の親和性さえも有する。親和性成熟抗体は、当該分野において周知の種々の手法の任意のものにより産生され得る。Ｍａｒｋｓ
ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０：７７９－７８３（１９９２）に、ＶＨ及びＶＬドメインシャッフリングによる親和性成熟が記載されている。ＣＤＲ及び／またはフレームワーク残基のランダム突然変異誘発は、Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ９１：３８０９－３８１３（１９９４）、Ｓｃｈｉｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ１６９：１４７－１５５（１９９５）、Ｙｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：１９９４－２００４（１９９５）、Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４（７）：３３１０－９（１９９５）、及び、Ｈａｗｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９－８９６（１９９２）に記載されている。
ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０：７７９－７８３（１９９２）に、ＶＨ及びＶＬドメインシャッフリングによる親和性成熟が記載されている。ＣＤＲ及び／またはフレームワーク残基のランダム突然変異誘発は、Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ９１：３８０９－３８１３（１９９４）、Ｓｃｈｉｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ１６９：１４７－１５５（１９９５）、Ｙｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：１９９４－２００４（１９９５）、Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４（７）：３３１０－９（１９９５）、及び、Ｈａｗｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９－８９６（１９９２）に記載されている。
【0032】
回復：本明細書で使用する場合「回復」という用語は、対象の状態の予防、軽減もしくは緩和、または状態の改善を意味する。回復は、疾患病態の完全な回復または完全な予防を含むが、必要とはしない。
【0033】
動物：本明細書で使用する場合「動物」という用語は、動物界に属する任意のものを指す。いくつかの実施形態では、「動物」は、任意の発達段階におけるヒトを指す。いくつかの実施形態では、「動物」は、任意の発達段階における非ヒト動物を指す。特定の実施形態では、非ヒト動物は哺乳動物（例えば、げっ歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、及び／またはブタ）である。いくつかの実施形態では、動物には、哺乳動物、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類、及び／または寄生虫類が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、動物は、遺伝子導入動物、遺伝子操作した動物、及び／またはクローンであり得る。
【0034】
抗体：本明細書で使用する場合「抗体」という用語は、自然の、または全面的にもしくは部分的に合成的に作成した、任意の免疫グロブリンを指す。特異的結合能力を維持するすべてのその誘導体も、その用語に含まれる。前記用語は、免疫グロブリン結合ドメインと相同である、または大部分は相同である結合ドメインを有する、任意のタンパク質も対象とする。このようなタンパク質は、自然源に由来できる、または部分的にもしくは全面的に合成的に作成することができる。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであり得る。抗体は、ヒトアイソタイプ：ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥのいずれかを含む、任意の免疫グロブリンアイソタイプのメンバーでもあり得る。特定の実施形態で、抗体は、ＩｇＧの免疫グロブリンクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３など）のメンバーであり得る。いくつかの実施形態では、抗体はヒト抗体であり得る。いくつかの実施形態では、抗体はヒト化抗体であり得る。
【0035】
当業者に周知のように、自然に生成する抗体は通常、４つのポリペプチド鎖、ジスルフィド結合により相互接続する２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖からなる。各重鎖及び軽鎖は、可変領域（それぞれＨＣＶＲ、ＶＨまたはＶＨ及びＬＣＶＲ、ＶＬまたはＶＬとして本明細書で略記される）及び定常領域からなる。重鎖の定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン（及び所望によりＩｇＭ及びＩｇＥの場合ＣＨ４ドメイン）を含む。軽鎖の定常領域は、１つのドメインＣＬからなる。ＶＨ及びＶＬ領域が、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性領域を更に含み、それはフレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存された領域が散在する。各ＶＨ及びＶＬは３つのＣＤＲ及び４つのＦＲからなり、以下の順序ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４でアミノ末端からカルボキシ末端まで配置される。重鎖及び軽鎖の結合領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は免疫グロブリンの宿主組織または因子への結合を媒介でき、それは免疫系（例えば、エフェクター細胞）の種々の細胞及び旧来の補体系の第１成分（Ｃｌｑ）を含む。
【0036】
抗原結合部分：本明細書で使用する場合「抗原結合部分」または「抗原結合断片」という用語は、抗原（例えば、Ｆｌｔ－１）と特異的に結合する能力を保持する、抗体の１つ以上の断片または部分を意味する。抗原結合部分の例としては、（ｉ）ＶＨ、ＶＬ、ＣＨ１及びＣＬドメインからなる一価の断片である、Ｆａｂ断片、（ｉｉ）ヒンジ領域中ジスルフィド架橋で結合した２つのＦａｂ断片を含む２価の断片であるＦ（ａｂ’）２断片、（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＨ及びＶＬドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）単一可変ドメインを含むｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ３４１：５４４－５４６）、（ｖｉ）単離相補性決定領域（ＣＤＲ）、（ｖｉｉ）ヒンジ領域の部分を持つ本質的にＦａｂであるＦａｂ’断片、（ｖｉｉｉ）単一可変ドメイン及び２つの定常領域を含む、重鎖可変領域であるナノボディが、挙げられる。更に、Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶＬ及びＶＨは別々の遺伝子によりコードされているが、それらは、組換え法を用いてそれらを単一のタンパク質鎖として作製できる合成リンカーにより結合でき、この鎖中でＶＬ及びＶＨ領域が対となって１価の分子を形成する（単一鎖のＦｖ（ｓｃＦｖ）として周知。例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３－４２６、及びＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５８７９－５８８３参照）。抗体の抗原結合断片は、所望により単鎖の抗体断片を含むことができる。代替的にまたは追加的に、抗体の抗原結合断片は、例えばジスルフィド結合によって結合される複数の鎖を含むことができる。抗体の抗原結合断片は、所望により多分子複合体を含むことができる。機能性抗体断片は通常少なくとも約５０のアミノ酸を含み、及びより一般的には少なくとも約２００のアミノ酸を含む。
【0037】
いくつかの実施形態では、親抗体のように、それが同じ抗原と結合する断片である親抗体の十分な配列を、抗体断片は含む。いくつかの実施形態において、断片は、親抗体に相当する親和性を有する抗原と結合して及び／または抗原との結合において親抗体と競う。
【0038】
「抗体断片」という用語が生成のいかなる特定の状態も意味せず、かつ限定されていないことを、当業者は理解するであろう。抗体断片は任意の適切な方法を用いることにより調製することができ、それは完全な抗体の開裂、化学合成及び組換え体生成を含むが、これらに限定されない。断片は、完全抗体と同様に使用するためスクリーニングされる。
【0039】
およそまたは約：本明細書で使用する場合、１つ以上の目的とする値に適用される「およそ」または「約」という用語は、記載された参照値に類似する値を指す。特定の実施形態では、用語「およそ」または「約」は、特に明記しない限りまたは文脈から明白でない限り、記載された参照値のいずれかの方向（超または未満）において、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ未満内に入る値の範囲を指す（このような数値が可能性のある値の１００％を超える場合を除く）。
【0040】
と関連する：その用語が本明細書で使用される場合、１つのものの存在、レベル及び／または形状が他のものと相関していれば、２つの事象または実体は互いと「関連する」。例えば、特定の実体の存在、レベル及び／または形状が特定の疾患、障害または病態の発現率及び／またはそれに対する感染性と相関する場合（例えば、関連集団全体で）、その特定の実体（例えば、ポリペプチド）はその疾患、障害または病態と関連していると考慮される。いくつかの実施形態では、直接または間接的に相互作用する場合、２つ以上の実体は互いに物理的に「関連」しており、その結果、それらは互いに物理的な近接しており、その状態に留まる。いくつかの実施形態では、互いに物理的に関連する２つ以上の実体は、互いに共有結合される。いくつかの実施形態において、互いに物理的に関連する２つ以上の実体は、互いに共有結合されていないが、例えば水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、磁気及びこれらの組み合わせによって、非共有結合的に関連している。
【0041】
担体または希釈剤：本明細書で使用する場合「担体」及び「希釈剤」という用語は、医薬製剤の調製のために有用な薬学的に許容される（例えば、ヒトへの投与において安全かつ非毒性）担体または希釈剤を指す。例示的な希釈剤としては、滅菌水、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、滅菌生理食塩水、リンゲル溶液、またはデキストロース溶液が挙げられる。
【0042】
ＣＤＲ：本明細書で使用する場合、抗体の可変領域内の相補性決定領域を意味する。重鎖及び軽鎖の可変領域のそれぞれには、３つのＣＤＲが存在しており、可変領域のそれぞれについて、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３と名付けられる。「ＣＤＲのセット」または「ＣＤＲセット」は、抗原と結合可能な単一の可変領域、または抗原と結合可能な同種の重鎖及び軽鎖の可変領域のＣＤＲのいずれかにおいて生じる、３つまたは６つのＣＤＲの群を意味する。特定のシステムは、ＣＤＲ境界（例えば、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａなど）を定めるために、当該技術分野において確立されている。当業者はこれらのシステム間の及びこれらのシステムの中の違いを認識しており、特許請求された発明を理解して、実施するのに必要とする範囲でＣＤＲ境界を理解できる。
【0043】
キメラ抗体：本明細書で使用する場合、そのアミノ酸配列が、第１種中に見出されるＶＨ及びＶＬ領域配列、ならびに第１種と異なる第２種中に見出される定常領域配列を含む、抗体を意味する。多くの実施形態において、キメラ抗体は、ヒト定常領域に結合するマウスＶＨ及びＶＬ領域を有する。いくつかの実施形態では、非ヒト定常領域（例えば、マウス定常領域）に結合するヒトＶＨ及びＶＬ領域を有する抗体は、「リバースキメラ抗体」と呼ばれる。
【0044】
投与剤形：本明細書で使用する場合「投与剤形」及び「単位投与剤形」という用語は、治療を受ける患者のための治療用タンパク質（例えば、抗体）の物理的に個別の単位を意味する。各単位は、所望の治療効果を生成するために計算された活性物質の所定量を含む。しかし、組成物の全投与量は、健全な医学的判断の範囲内で、担当医師によって決定されることを理解されたい。
【0045】
機能不全：本発明で使用する場合「機能不全」という用語は、異常な機能を意味する。分子（例えば、タンパク質）の機能不全は、このような分子と関連する活動の増加または減少によって生じることがあり得る。分子の機能不全は、分子と直接的もしくは間接的に相互作用するまたはそれを調整する、分子自体または他の分子に関連した欠陥によって生じることがあり得る。
【0046】
エピトープ：本明細書で使用する場合、免疫グロブリン（例えば、抗体、その抗体断片、受容体）結合成分によって特に認識される、任意の部分を含む。いくつかの実施形態では、エピトープは、抗原上の複数の化学原子または基からなる。いくつかの実施形態では、このような化学原子または基は、抗原が関連する３次元構造をとるとき、表面に露出する。いくつかの実施形態では、このような化学原子または基は、抗原がこのような構造をとるとき、間隙を介して互いに物理的に近い。いくつかの実施形態では、少なくともいくつかのそのような化学原子及び群は、抗原が他の構造（例えば、線形化）をとるとき、互いから物理的に分離される。
【0047】
Ｆｃ領域：本明細書で使用する場合「Ｆｃ領域」という用語は、２つの「Ｆｃポリペプチド」の二量体を指し、各「Ｆｃポリペプチド」は、第１の定常領域の免疫グロブリンドメインを除く、抗体の定常領域を含む。いくつかの実施形態では、「Ｆｃ領域」は、１つ以上のジスルフィド結合、化学リンカーまたはペプチドリンカーにより結合した２つのＦｃポリペプチドを含む。「Ｆｃポリペプチド」は、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＧの最後の２つの定常領域免疫グロブリンドメイン、ならびにＩｇＥ及びＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリンドメインを指し、これらの領域に対するＮ末端の可撓性ヒンジの一部または全体を含むこともできる。ＩｇＧにおいて、「Ｆｃポリペプチド」は、免疫グロブリンドメインＣガンマ２（Ｃγ２）及びＣガンマ３（Ｃγ３）、ならびにＣガンマ１（Ｃγ１）とＣγ２の間のヒンジの下部を含む。Ｆｃポリペプチドの境界は変化できるが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃポリペプチドは、そのカルボキシル末端に対してＴ２２３またはＣ２２６またはＰ２３０から開始する残基を含むように、通常定義され、番号付けはＫａｂａｔらのＥＵインデックスに従う（１９９１，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ９１－３２４２，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ，ＶＡ）。ＩｇＡにおいて、Ｆｃポリペプチドは、免疫グロブリンドメインＣアルファ２（Ｃα２）及びＣアルファ３（Ｃα３）、ならびにＣアルファ１（Ｃα１）とＣα２の間のヒンジの下部を含む。Ｆｃ領域は、ＩＶＩＧなどの自然源から合成される、組換えされる、または生成されることができる。
【0048】
フレームワークまたはフレームワーク領域：本明細書で使用する場合、ＣＤＲを除いた可変領域の配列を意味する。ＣＤＲ配列が異系統により決定され得るため、同様にフレームワーク配列もそれに相応して種々の解釈の対象である。６つのＣＤＲは、重鎖及び軽鎖上のフレームワーク領域を、各鎖上において４つのサブ領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）に分割する。その中で、ＣＤＲ１はＦＲ１とＦＲ２との間に位置し、ＣＤＲ２はＦＲ２とＦＲ３との間に位置し、ＣＤＲ３はＦＲ３とＦＲ４との間に位置する。特定のサブ領域をＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３またはＦＲ４として特定することなく、他のものにより言及されるフレームワーク領域は、単鎖の天然由来の免疫グロブリン鎖の可変領域内の組み合わせられたＦＲを表す。本明細書で使用する場合、ＦＲは４つのサブ領域の１つを表す。例えばＦＲ１は、可変領域のアミノ末端及びＣＤＲ１に関する５’に最も近い第１のフレームワーク領域を表し、ＦＲは、フレームワーク領域を構築する２つ以上のサブ領域を表す。
【0049】
半減期：本明細書で使用する場合「半減期」という用語は、タンパク質濃度または活性などの量が、期間の開始時に測定されたその値の半分まで低下するのに必要な時間である。
【0050】
高親和性：本明細書で使用する場合「高親和性」という用語は、ＩｇＧ型抗体を言及するとき、Ｆｌｔ－１ドメインにおいて、１０－８Ｍ以下、より好ましくは１０－９Ｍ以下、更により好ましくは１０－１０Ｍ以下のＫＤを有する抗体を指す。しかし「高親和性」結合は、他の抗体アイソタイプにおいて異なり得る。例えばＩｇＭアイソタイプにおける「高親和性」結合とは、１０－７Ｍ以下、より好ましくは１０－８Ｍ以下、更により好ましくは１０－９Ｍ以下のＫＤを有する抗体を指す。
【0051】
ヒト抗体：本明細書で使用する場合、ヒト免疫グロブリン配列から生成した（またはアセンブリされた）可変領域及び定常領域を有する、抗体を含むことを意図する。いくつかの実施形態では、例えば１つ以上のＣＤＲ、特にＣＤＲ３において、そのアミノ酸配列が、ヒト生殖系の免疫グロブリン配列によりコードされない残基またはエレメントを含んでも（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏランダムもしくは部位特異的突然変異誘発、またはｉｎ ｖｉｖｏ体細胞突然変異により（最初から）導入され得る配列変異などを含んでも）、抗体（または抗体成分）は「ヒト」であるとみなされ得る。
【0052】
ヒトモノクローナル抗体：本明細書で使用する場合、フレームワーク及びＣＤＲ領域がヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する、単一の結合特異性を示す抗体を指すことを意図する。一実施形態において、不死化細胞に融合したヒト重鎖導入遺伝子及び軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する、トランスジェニック非ヒト動物（例えば、トランスジェニックマウス）から得られたＢ細胞を含む、ハイブリドーマによってヒトモノクローナル抗体は作成される。
【0053】
ヒト化：当該分野において周知のように「ヒト化」という用語は、アミノ酸配列が、非ヒト種（例えば、マウス、ラマ）において生じる参照抗体からのＶＨ及びＶＬ領域の配列を含むが、それらをより「ヒト様」、すなわちヒト生殖系の可変配列により類似するようにすることを意図した前記参照抗体に対するそれらの配列における修飾も含む、抗体（または抗体成分）を意味するのに一般的に使用される。いくつかの実施形態では、「ヒト化」抗体（または、抗体成分）は、目的の抗原に免疫特異的に結合し、ヒト抗体のそれと同じアミノ酸配列を実質的に有するフレームワーク（ＦＲ）領域、及び非ヒト抗体（例えば、マウス、ラマ）のそれと同じアミノ酸配列を実質的に有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有するものである。ヒト化抗体は、少なくとも１つ、通常は２つの可変ドメイン（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦａｂＣ、Ｆｖ）のすべてを実質的に含み、ＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にすべては非ヒト免疫グロブリン（すなわち、ドナー免疫グロブリン）のＣＤＲ領域に対応し、フレームワーク領域のすべてまたは実質的にすべてはヒト免疫グロブリン共通配列のフレームワーク領域である。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は、少なくとも一部の免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）、通常はヒト免疫グロブリンの定常領域のそれも含む。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は、軽鎖及び少なくとも重鎖の可変ドメインの両方を含む。抗体は、重鎖の定常領域のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、及び所望によりＣＨ４領域も含み得る。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は、ヒト化ＶＬ領域のみを含む。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は、ヒト化ＶＨ領域のみを含む。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は、ヒト化ＶＨ及びＶＬ領域を含む。
【0054】
肥大：本明細書で使用する場合「肥大」という用語は、器官または組織の構成細胞の拡大に起因する、器官または組織の体積の増加を指す。
【0055】
改善する、増加させる、または減少させる：本明細書で使用する場合、用語「改善する」「増加させる」もしくは「低下させる」または文法上の等価物は、ベースライン測定、例えば本明細書に記載の処置の開始前の同じ個体における測定、または本明細書に記載の処置を行わない対照個体（または複数の対照個体）における測定に対する値を示す。「対照個体」は、治療を受けている個体と同じ形態の疾患に苦しむ個体であり、（治療を受けている個体と対照個体（複数可）の疾患のステージを確実に比較できるように）治療を受けている個体とほぼ同じ年齢である。
【0056】
阻害：本明細書で使用する場合「阻害」「阻害する」及び「阻害すること」という用語は、目的のタンパク質もしくは遺伝子の活性及び／または発現を減らす、または低減する工程ならびに方法を指す。通常、タンパク質または遺伝子を阻害することは、本明細書に記載するまたは当業者が認識する１つ以上の方法によって測定した際、タンパク質または遺伝子の少なくとも１０％以上、例えば２０％、３０％、４０％もしくは５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上の発現もしくは関連する活性の低減、または１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍以上の発現もしくは関連する活性の低下を意味する。
【0057】
Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ：本明細書で使用する場合「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」という用語は、多細胞生物内よりはむしろ人工的な環境、例えば試験管内または反応容器内、細胞培養中などで起こる事象を指す。
【0058】
Ｉｎ Ｖｉｖｏ：本明細書で使用する場合「ｉｎ ｖｉｖｏ」という用語は、ヒト及び非ヒト動物などの多細胞生物内で発生する事象を指す。細胞ベースのシステムとの関係においては、前記用語は、生細胞内で（例えば、インビトロ系とは対照的に）発生する事象を指すよう使用され得る。
【0059】
単離された抗体：本明細書で使用する場合「単離された抗体」という用語は、異なる抗原特異性（例えば、Ｆｌｔ－１と特異的に結合する単離された抗体）を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指すことを意図する。更に、単離された抗体は、他の細胞材料及び／または化学薬品を実質的に含まなくてもよい。
【0060】
Ｋａ：本明細書で使用する場合、特定の抗体－抗原相互作用の結合速度を指し、本明細書で使用する場合「Ｋｄ」という用語は、特定の抗体－抗原相互作用の解離速度を指すことを意図する。本明細書で使用する場合「ＫＤ」という用語は解離定数を指すことを意図しており、それはＫｄ対Ｋａの比（すなわち、Ｋｄ／Ｋａ）から得られて、モル濃度（Ｍ）として表される。抗体におけるＫＤ値は、当該技術分野において十分に確立されている方法を使用して決定することができる。抗体のＫＤを決定するための好ましい方法は、表面プラズモン共鳴を用いる、好ましくはバイオセンサーシステム（例えばＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）システム）を用いることによる。
【0061】
軽鎖の再シャッフル：本明細書で使用する場合「軽鎖の再シャッフル」という用語は、重鎖配列が一定に保たれ、及び軽鎖配列のライブラリが生成される、親和性成熟ステップを指すことを意図する。軽鎖ライブラリは重鎖に対してスクリーニングされて、改善された結合親和性を備える抗体を識別する。改善された結合親和性は、ナノモルまたはピコモルの範囲内であり得る。
【0062】
モノクローナル抗体：本明細書で使用する場合「モノクローナル抗体」という用語は、単一分子組成物の抗体分子の調製を指すことを意図する。モノクローナル抗体組成物は、特定エピトープの単一の結合特異性及び親和性を示す。
【0063】
薬学的に許容される：本明細書で使用する場合「薬学的に許容される」という用語は、健全な医学的判断の範囲内で、妥当な利益／リスク比に見合う、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を有さずに、ヒト及び動物の組織と接触して使用するのに好適な物質を指す。
【0064】
ポリペプチド：本明細書で使用する場合「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合を介して結合されたアミノ酸の連続的な鎖を指す。前記用語は、任意の長さのアミノ酸鎖を指すよう使用されるが、当業者であれば、この用語が長大な鎖に限定されるものではなく、ペプチド結合を介して結合される２つのアミノ酸を含む最小の鎖を指すこともできることを理解するであろう。当業者には周知のように、ポリペプチドは加工及び／または修飾され得る。
【0065】
予防する：本明細書で使用する場合「予防する」または「予防」という用語は、疾患、障害及び／または病態の発生に関連して使用される場合、疾患、障害及び／または病態を発症するリスクを減少させることを指す。「リスク」の定義を参照のこと。
【0066】
タンパク質：本明細書で使用する場合「タンパク質」という用語は、個別単位として機能する１つ以上のポリペプチドを指す。単一のポリペプチドが別個に機能する単位であり、別個の機能する単位を形成するために、他のポリペプチドとの永久的または一時的な物理的結合を必要としないならば、用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は同じ意味で使用され得る。別個の機能的単位が、互いに物理的に結合する２つ以上のポリペプチドからなる際、用語「タンパク質」は、物理的にカップリングされて、別個の単位として一緒に機能する複数のポリペプチドを指す。
【0067】
リスク：文脈から理解されるように、疾患、障害及び／または病態の「リスク」は、特定の個体が疾患、障害及び／または病態（例えば、ＤＭＤ）を発症する可能性を含む。いくつかの実施形態では、リスクは百分率として表される。いくつかの実施形態では、リスクは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０％から最大１００％である。いくつかの実施形態では、リスクは、参照試料または参照試料の群に関連するリスクに対するリスクとして表される。いくつかの実施形態では、参照試料または参照試料の群は、疾患、障害、病態及び／または事象（例えば、ＤＭＤ）の既知のリスクを有する。いくつかの実施形態では、参照試料または参照試料の群は、特定の個体と比較できる個体から得られる。いくつかの実施形態では、相対的リスクは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上である。
【0068】
選択結合性：本明細書で使用する場合「選択結合性」「選択的に結合する」「特異的結合」または「特異的に結合する」は、結合部分及び標的に関して、標的でない実体ではなく、標的に対する結合部分の優先的結合を指す。ある程度の非特異的結合は、結合部分と非標的の間に発生する場合がある。いくつかの実施形態では、結合部分と標的の間の結合が、結合部分と非標的の結合と比較して２倍超、５倍超、１０倍超または１００倍超の場合、結合部分は標的と選択的に結合する。いくつかの実施形態では、結合親和性が約１０－５Ｍ未満、約１０－６Ｍ未満、約１０－７Ｍ未満、約１０－８Ｍ未満、または約１０－９Ｍ未満の場合、結合部分は標的と選択的に結合する。
【0069】
横紋筋：本明細書で使用する場合「横紋筋」という用語は、顕微鏡を用いると横紋状の外観をもたらす筋組織の細胞内収縮性単位、サルコメアの規則的配列を有する多核性筋組織で、随意制御下にあるものを指す。通常、横紋筋は、心筋、骨格筋及び鰓弓筋であり得る。
【0070】
平滑筋：本明細書で使用される用語「平滑筋」は、単元性及び多元性筋を含む不随意に制御される非横紋筋を指す。
【0071】
対象：本明細書で使用する場合「対象」という用語は、ヒトまたは任意の非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマまたは霊長類）を指す。ヒトは、出生前及び出生後の状態を含む。多くの実施形態では、対象はヒトである。対象は患者であることができ、前記患者は、疾患の診断または処置のために医療提供者を受診するヒトを意味する。「対象」という用語は、本明細書において「個体」または「患者」と区別なく使用される。対象は、疾患または障害を罹患し得る、または患いやすいが、疾患または障害の徴候を示しても、示さなくてもよい。
【0072】
実質的に：本明細書で使用する場合「実質的に」という用語は、目的の特徴もしくは特性の全体的もしくはほぼ全体的な範囲または程度を示す、質的な条件を指す。生物学的分野における当業者であれば、生物学的及び化学的現象は、完結することならびに／もしくは完結まで進むことがあるにしてもごく稀であること、または絶対的結果を成し遂げるもしくは回避することがあるとしてもごく稀であることを理解するであろう。したがって用語「実質的に」は、多くの生物学的及び化学的現象において固有の潜在的な完結性の欠如をとらえるために本明細書で使用される。
【0073】
実質的に相同性：語句「実質的に相同性」は、本明細書ではアミノ酸または核酸配列間の比較を指すために使用される。当業者であれば理解されるように、２つの配列は、それらが対応する位置において相同の残基を含有する場合、一般的に「実質的に相同性」であるとみなされる。相同の残基は、同一残基であり得る。あるいは相同の残基は、適切に類似した構造的及び／または機能的特徴を有する非同一残基であり得る。例えば当業者には周知であるように、特定のアミノ酸は通常「疎水性」もしくは「親水性」アミノ酸として、及び／または「極性」もしくは「非極性」側鎖を有するものとして分類される。１つのアミノ酸による同一のタイプの別のものの置換は、多くの場合「相同な」置換とみなされ得る。
【0074】
当該技術分野において周知であるように、アミノ酸または核酸配列は、ヌクレオチド配列についてはＢＬＡＳＴＮ、ならびにアミノ酸配列についてはＢＬＡＳＴＰ、ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ及びＰＳＩ－ＢＬＡＳＴなどの市販のコンピュータプログラム中で利用可能なものを含む、種々のアルゴリズムのいずれかを用いて比較され得る。例示のこのようなプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．，ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５（３）：４０３－４１０，１９９０、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．，“Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ：ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ”，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２，１９９７、Ｂａｘｅｖａｎｉｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗｉｌｅｙ，１９９８、及びＭｉｓｅｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．，（ｅｄｓ．），Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３２），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，１９９９に記載されている。相同配列を同定することに加えて、上述のプログラムは通常、相同性の程度の表示を提供する。いくつかの実施形態では、２つの配列は、それらの対応する残基の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上が、残基の関連する並びにわたって相同である場合、実質的に相同であるとみなされる。いくつかの実施形態では、関連する並びは完全な配列である。いくつかの実施形態では、関連する並びは、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００個以上の残基である。
【0075】
実質的な同一性：語句「実質的な同一性」は、アミノ酸または核酸配列間の比較を指すために本明細書で使用される。当業者であれば理解するように、２つの配列は、それらが対応する位置で同一の残基を含有する場合、一般的に「実質的に同一性」であるとみなされる。当該技術分野において周知であるように、アミノ酸または核酸配列は、ヌクレオチド配列についてはＢＬＡＳＴＮ、ならびにアミノ酸配列についてはＢＬＡＳＴＰ、ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ及びＰＳＩ－ＢＬＡＳＴなどの市販のコンピュータプログラム中で利用可能なものを含む、種々のアルゴリズムのいずれかを用いて比較され得る。例示のこのようなプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５（３）：４０３－４１０，１９９０、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２，１９９７、Ｂａｘｅｖａｎｉｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗｉｌｅｙ，１９９８、及びＭｉｓｅｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．，（ｅｄｓ．），Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３２），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，１９９９に記載されている。同一配列を同定することに加えて、上述のプログラムは通常、同一性の程度の表示を提供する。いくつかの実施形態では、２つの配列は、それらの対応する残基の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上が、残基の関連のある並びにわたって同一である場合、実質的に同一であるとみなされる。いくつかの実施形態では、関連する並びは完全な配列である。いくつかの実施形態では、関連する並びは、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００個以上の残基である。
【0076】
表面プラズモン共鳴：本明細書で使用する場合、例えばＢｉａｃｏｒｅシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ ａｎｄ Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）を使用することによってなどバイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化の検出による、リアルタイムの特異的結合の相互作用の分析を可能にする、光学現象を指す。更なる説明については、Ｊｏｎｓｓｏｎ，Ｕ．，ｅｔ
ａｌ．（１９９３）Ａｎｎ．Ｂｉｏｌ．Ｃｌｉｎ．５１：１９－２６、Ｊｏｎｓｓｏｎ，Ｕ．，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１１：６２０－６２７、Ｊｏｈｎｓｓｏｎ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．８：１２５－１３１、及びＪｏｈｎｎｓｏｎ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８：２６８－２７７を参照のこと。
ａｌ．（１９９３）Ａｎｎ．Ｂｉｏｌ．Ｃｌｉｎ．５１：１９－２６、Ｊｏｎｓｓｏｎ，Ｕ．，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１１：６２０－６２７、Ｊｏｈｎｓｓｏｎ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．８：１２５－１３１、及びＪｏｈｎｎｓｏｎ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８：２６８－２７７を参照のこと。
【0077】
患う：疾患、障害及び／または病態を「患う」個体は、疾患、障害及び／または病態、例えばＤＭＤの１つ以上の徴候により診断されている、またはその徴候を示す。
【0078】
患いやすい：疾患、障害及び／または病態を「患いやすい」個体は、疾患、障害及び／または病態を診断されていない。いくつかの実施形態では、疾患、障害及び／または病態を患いやすい個体は、疾患、障害及び／または病態の徴候を示していなくてもよい。いくつかの実施形態では、疾患、障害、病態または事象（例えば、ＤＭＤ）を患いやすい個体は、以下（１）疾患、障害及び／または病態の発症に関連する遺伝子突然変異、（２）疾患、障害及び／または病態の発症に関連する遺伝子多型、（３）疾患、障害及び／または病態に関連するタンパク質の発現及び／または活性の増加及び／または減少、（４）疾患、障害、病態及び／または事象の発症に関連する習慣及び／または生活様式、（５）移植を行ったことがあること、移植を行う予定があること、または移植を必要としていること、のうちの１つ以上によって特徴付けられ得る。いくつかの実施形態では、疾患、障害及び／または病態を患いやすい個体は、疾患、障害及び／または病態を発症する。いくつかの実施形態では、疾患、障害及び／または病態を患いやすい個体は、疾患、障害及び／または病態を発症しない。
【0079】
標的組織：本明細書で使用する場合「標的組織」という用語は、ＤＭＤなどの治療されることになる疾患に罹患している任意の組織を指す。いくつかの実施形態では、標的組織は、筋消耗、骨格変形、心筋症、筋虚血、認知障害及び呼吸機能の障害を含むがこれらに限定されない疾患に関連する病変、症状または特徴を表す組織を含む。いくつかの実施形態において、標的組織は、平滑筋、横紋筋または心筋である。
【0080】
治療に有効な量：本明細書で使用する場合、治療薬の「治療に有効な量」という用語は、疾患、障害及び／または病態を患う対象または、疾患、障害及び／または病態を患いやすい対象に投与されるとき、疾患、障害及び／または病態の症状（複数可）の発症を治療、診断、予防及び／または遅延するのに十分な量を意味する。治療に有効な量は通常、少なくとも１つの単位用量を含む投与レジメンによって投与されることを、当業者であれば理解するであろう。
【0081】
治療：本明細書で使用する場合「治療する」「治療」または「治療すること」という用語は、特定の疾患、障害及び／または病態、例えばＤＭＤの１つ以上の症状もしくは特徴を部分的にもしくは完全に緩和し、改善し、軽減し、抑制し、予防し、その発症を遅延し、その重篤度を減少させ、及び／またはその発症率を減少させるために用いられる任意の方法を指す。治療は、疾患に関連する病状を発達させるリスクを減少させる目的で、疾患の徴候を示さない対象及び／または疾患の初期徴候のみを示す対象に適用され得る。
【0082】
詳細な説明
本発明はとりわけ、筋ジストロフィーの治療のための治療薬として、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片の使用に基づいて、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）及び／またはベッカー型筋ジストロフィーを含む筋ジストロフィーを治療するための方法及び組成物を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、ＤＭＤの少なくとも１つの症状または特徴が強度、重症度もしくは頻度において減少するように、またはその発症が遅延するように、ＤＭＤを患っているまたはそれを患いやすい個体に、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片の治療に有効な量を投与することを含む、ＤＭＤを治療する方法を提供する。
本発明はとりわけ、筋ジストロフィーの治療のための治療薬として、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片の使用に基づいて、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）及び／またはベッカー型筋ジストロフィーを含む筋ジストロフィーを治療するための方法及び組成物を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、ＤＭＤの少なくとも１つの症状または特徴が強度、重症度もしくは頻度において減少するように、またはその発症が遅延するように、ＤＭＤを患っているまたはそれを患いやすい個体に、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片の治療に有効な量を投与することを含む、ＤＭＤを治療する方法を提供する。
【0083】
本発明の種々の態様は、下記の項において詳細に説明される。項の使用は、本発明を限定することを意味しない。各項は、本発明の任意の態様に適用し得る。本出願では特に明記しない限り、「または」の使用は「及び／または」を意味する。
【0084】
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）
ＤＭＤは、体全体にわたる進行性の筋肉の低下及び筋肉関連機能の喪失によって特徴付けられる疾患である。本発明は、筋肉の低下を遅くする、遅延させるまたは防止する、筋肉を再生する、ならびに線維症、炎症ならびにＤＭＤ及び種々の筋組織における他の筋ジストロフィーに関連する他の症状または特徴を後退させる、排除する、遅延させる、予防するまたは最小化するための、方法及び組成物を提供することが企図される。
ＤＭＤは、体全体にわたる進行性の筋肉の低下及び筋肉関連機能の喪失によって特徴付けられる疾患である。本発明は、筋肉の低下を遅くする、遅延させるまたは防止する、筋肉を再生する、ならびに線維症、炎症ならびにＤＭＤ及び種々の筋組織における他の筋ジストロフィーに関連する他の症状または特徴を後退させる、排除する、遅延させる、予防するまたは最小化するための、方法及び組成物を提供することが企図される。
【0085】
筋組織
動物には２つの主要なタイプの筋組織、横紋筋及び平滑筋が存在する。本明細書で使用する場合「横紋筋」という用語は、連続するサルコメアを含有する筋組織を指す。横紋筋は、随意制御下にあり、骨格に付着する傾向がある。横紋筋は身体の随意運動を可能にし、四頭筋、腓腹筋、二頭筋、三頭筋、僧帽筋、三角筋及び他多数を含有する、主要な筋肉群を含む。横紋筋は非常に長い傾向があり、多くの横紋筋は独立して機能することができる。しかしいくつかの横紋筋は、口、肛門、心臓及び食道の上部にあるものを含めて、骨格に付着しない。
動物には２つの主要なタイプの筋組織、横紋筋及び平滑筋が存在する。本明細書で使用する場合「横紋筋」という用語は、連続するサルコメアを含有する筋組織を指す。横紋筋は、随意制御下にあり、骨格に付着する傾向がある。横紋筋は身体の随意運動を可能にし、四頭筋、腓腹筋、二頭筋、三頭筋、僧帽筋、三角筋及び他多数を含有する、主要な筋肉群を含む。横紋筋は非常に長い傾向があり、多くの横紋筋は独立して機能することができる。しかしいくつかの横紋筋は、口、肛門、心臓及び食道の上部にあるものを含めて、骨格に付着しない。
【0086】
一方で平滑筋は、非常に異なる構造を有する。別個の骨格付着部分を有する一連の長い筋肉というよりは、平滑筋は、平滑筋細胞間の機械的結合を有する連続シート内に構築される傾向にある。平滑筋は多くの場合、中空器官の壁内に位置し、通常、随意制御下にはない。特定の器官の内側を覆っている平滑筋は、同一の荷重を支持し、同時に収縮せねばならない。平滑筋は少なくともある程度は、運動及び／または位置もしくは圧力の変化によって引き起こされる中空器官上の荷重における変化を処理するよう機能する。この二元的役割は、平滑筋が横紋筋のように収縮することが可能であるべきのみならず、持続する荷重に対して器官の寸法を維持するために、平滑筋が持続して収縮可能でなければならないことを意味する。平滑筋の例は、血管、細気管支、膀胱及び直腸などの胃腸管の内側を覆っているものである。
【0087】
筋肉の強度は、筋肉の細胞の数及びサイズ、ならびにそれらの解剖学的配置に依存する。新しい筋原線維の合成（肥大）及び／またはより多くの筋細胞の形成（肥厚化）のいずれかによる筋線維の直径の増加は、筋肉の力生成能力を増加させる。
【0088】
筋肉は、位置または機能によって分類され得る。いくつかの実施形態では、Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片は、１つ以上の顔の筋肉、１つ以上の咀嚼のための筋肉、１つ以上の舌及び頸部の筋肉、１つ以上の胸部の筋肉、１つ以上の肩帯及び腕の筋肉、１つ以上の腕及び肩の筋肉、１つ以上の腹側及び背側前腕の筋肉、１つ以上の手の筋肉、１つ以上の脊柱起立筋、１つ以上の骨盤帯及び脚の筋肉、ならびに／または１つ以上の前脚及び足の筋肉を標的とする。
【0089】
いくつかの実施形態では、顔の筋肉としては、毛様体筋、瞳孔散大筋、虹彩括約筋などの内眼筋、耳介、側頭頭頂筋、アブミ骨筋、鼓膜張筋などの耳筋、鼻根筋、鼻筋、鼻孔開大筋、鼻中隔下制筋、上唇尾翼挙筋などの鼻筋、口角挙筋、口角下制筋、口輪筋、頬筋、大頬骨筋及び小頬骨筋、広頸筋、上唇挙筋、下唇下制筋、笑筋、オトガイ筋、ならびに／または皺眉筋などの口の筋肉が挙げられるが、これらに限定されない。
【0090】
いくつかの実施形態では、咀嚼の筋肉としては、咬筋、側頭筋、内側翼突筋、外側翼突筋が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、舌及び頚の筋肉としては、オトガイ舌筋、茎突舌筋、口蓋舌筋、舌骨舌筋、顎二腹筋、茎突舌骨筋、顎舌骨筋、オトガイ舌骨筋、肩甲舌骨筋、胸骨舌骨筋、胸骨甲状筋、甲状舌骨筋、胸鎖乳突筋、前斜角筋、中斜角筋、及び／または後斜角筋が挙げられるが、これらに限定されない。
【0091】
いくつかの実施形態では、胸部、胸帯及び腕部の筋肉としては、鎖骨下筋、大胸筋、小胸筋、腹直筋、外腹斜筋、内腹斜筋、腹横筋、横隔膜、外肋間筋、内肋間筋、前鋸筋、僧帽筋、肩甲挙筋、大菱形筋、小菱形筋、広背筋、三角筋、肩甲下筋、棘上筋、棘下筋、大円筋、小円筋、及び／または烏口腕筋が挙げられるが、これらに限定されない。
【0092】
いくつかの実施形態では、腕及び肩の筋肉としては、上腕二頭筋長頭、上腕二頭筋短頭、上腕三頭筋長頭、上腕三頭筋外側頭、上腕三頭筋内側頭、肘筋、円回内筋、回外筋、及び／または上腕筋が挙げられるが、これらに限定されない。
【0093】
いくつかの実施形態では、腹側及び背側前腕筋としては、腕橈骨筋、橈側手根屈筋、尺側手根屈筋、長掌筋、尺側手根伸筋、長橈側手根伸筋、短橈側手根伸筋、指伸筋、小指伸筋が挙げられるが、これらに限定されない。
【0094】
いくつかの実施形態では、手の筋肉としては、母指球筋、短母指外転筋、短母指屈筋、母指対立筋、小指球筋、小指外転筋、短小指屈筋、小指対立筋、掌側骨間筋、背側骨間筋、及び／または虫様筋などの手の内筋が挙げられるが、これらに限定されない。
【0095】
いくつかの実施形態では、脊柱起立筋としては、頸部筋肉、棘筋、最長筋、及び／または腸肋筋が挙げられるが、これらに限定されない。
【0096】
いくつかの実施形態では、骨盤帯及び脚部の筋肉としては、大腰筋、腸骨筋、大腿方形筋、長内転筋、短内転筋、大内転筋、薄筋、縫工筋、大腿直筋、外側広筋、内側広筋、中間広筋などの大腿四頭筋、腓腹筋、長腓側（腓骨）筋、ヒラメ筋、大臀筋、中臀筋、小臀筋、膝屈曲筋：大腿二頭筋長頭、膝屈曲筋：大腿二頭筋短頭、膝屈折筋：半腱様筋、膝屈曲筋：半膜様筋、大腿筋膜張筋、恥骨筋、及び／または前脛骨筋が挙げられるが、これらに限定されない。
【0097】
いくつかの実施形態では、前脚及び足の筋肉としては、長指伸筋、長母指伸筋、短腓骨筋、足底筋、後脛骨筋、長母指屈筋、短指伸筋、短母指伸筋、母指外転筋、短母指屈筋、小指外転筋、短小指屈筋、小指対立筋、短指伸筋、足の虫様筋、足底方形筋もしくは副趾屈筋、短指屈筋、背側骨間筋、及び／または底側骨間筋が挙げられるが、これらに限定されない。
【0098】
例示的な筋肉標的を表１にまとめる。
【表1-1】
【表1-2】
【表1-3】
【0099】
筋ジストロフィー
筋ジストロフィーは、虚弱かつ障害性の運動に至る筋肉の変性を引き起こす一群の遺伝性疾患である。すべての筋ジストロフィーの主要な特徴は、これらが本質的に進行性であることである。筋ジストロフィーとしては、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー、エメリー－ドレーフス型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、ならびに筋強直性ジストロフィー１型の先天的な型を含む筋強直性ジストロフィー１型及び２型が挙げられるが、これらに限定されない。一部の筋肉またはすべての筋肉が罹患している筋ジストロフィーのタイプによって、症状は異なり得る。筋ジストロフィーの例示的な症状としては、筋肉運動技能の発達の遅延、１つ以上の筋群の使用の難しさ、嚥下、発語もしくは飲食の難しさ、よだれ落ち、眼瞼下垂、頻繁な転倒、筋もしくは筋群の成人としての強度の低下、筋サイズの低下、身体の虚弱もしくは変更された生体力学に起因する歩行障害、及び／または認知機能障害もしくは行動障害／精神遅滞が挙げられる。
筋ジストロフィーは、虚弱かつ障害性の運動に至る筋肉の変性を引き起こす一群の遺伝性疾患である。すべての筋ジストロフィーの主要な特徴は、これらが本質的に進行性であることである。筋ジストロフィーとしては、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー、エメリー－ドレーフス型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、ならびに筋強直性ジストロフィー１型の先天的な型を含む筋強直性ジストロフィー１型及び２型が挙げられるが、これらに限定されない。一部の筋肉またはすべての筋肉が罹患している筋ジストロフィーのタイプによって、症状は異なり得る。筋ジストロフィーの例示的な症状としては、筋肉運動技能の発達の遅延、１つ以上の筋群の使用の難しさ、嚥下、発語もしくは飲食の難しさ、よだれ落ち、眼瞼下垂、頻繁な転倒、筋もしくは筋群の成人としての強度の低下、筋サイズの低下、身体の虚弱もしくは変更された生体力学に起因する歩行障害、及び／または認知機能障害もしくは行動障害／精神遅滞が挙げられる。
【0100】
筋ジストロフィーのための既知の治療法はないが、対症療法及び疾患修飾治療法の両方を含むいくつかの支持療法が使用されている。コルチコステロイド、ＡＣＥ阻害剤、アンギオテンシン受容体拮抗剤、理学療法、装着装具、車椅子、またはＡＤＬならびに肺機能のための他の補助的医療装置が、筋ジストロフィーにおいて通常使用される。筋強直性ジストロフィーでは、心不整脈からの突然死を予防するために、心臓ペースメーカーが使用される。筋強直症（弛緩不能）の症状を改善する抗筋強直剤はメキシレチンを含み、場合によってはフェニトイン、プロカインアミド及びキニーネを含む。
【0101】
デュシェンヌ型筋ジストロフィー
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は筋ジストロフィーのＸ連鎖劣性遺伝型であり、結果として筋肉変性及び最終的に死をもたらす。ＤＭＤは、近位筋力の低下、異常歩行、腓腹（下腿）筋の肥大、及びクレアチンキナーゼの上昇によって特徴付けられる。多くのＤＭＤ患者は５歳頃に診断され、この時点で症状／徴候が通常はより明白になる。罹患した個体は通常、１０～１３歳頃に歩行できなくなり、呼吸器合併症及び心筋症のために、２０代の半ばから後半にまたはその前に死亡する。
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は筋ジストロフィーのＸ連鎖劣性遺伝型であり、結果として筋肉変性及び最終的に死をもたらす。ＤＭＤは、近位筋力の低下、異常歩行、腓腹（下腿）筋の肥大、及びクレアチンキナーゼの上昇によって特徴付けられる。多くのＤＭＤ患者は５歳頃に診断され、この時点で症状／徴候が通常はより明白になる。罹患した個体は通常、１０～１３歳頃に歩行できなくなり、呼吸器合併症及び心筋症のために、２０代の半ばから後半にまたはその前に死亡する。
【0102】
ＤＭＤに罹患した個人では、血清クレアチンキナーゼ濃度は、非罹患の個人と比較して１０倍超増加し得る。いくつかの実施形態では、提供される組成物を罹患した個人に投与することは、治療前のベースラインレベルと比較して、減少した血清クレアチンキナーゼ濃度をもたらす。通常ベースラインレベルは、治療の直前に測定される。いくつかの実施形態では、提供される組成物を投与することは、治療直前のベースライン血清クレアチンキナーゼ濃度と比較して、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％減少した血清クレアチンキナーゼ濃度をもたらす。いくつかの実施形態では、提供される組成物を投与することは、約３５００ＩＵ／Ｌ未満、３０００ＩＵ／Ｌ、２５００ＩＵ／Ｌ、２０００ＩＵ／Ｌ、１５００ＩＵ／Ｌ、１０００ＩＵ／Ｌ、７５０ＩＵ／Ｌ、５００ＩＵ／Ｌ、２５０ＩＵ／Ｌ、１００ＩＵ／Ｌ、９０ＩＵ／Ｌ、８０ＩＵ／Ｌ、７０ＩＵ／Ｌまたは６０ＩＵ／Ｌまで減少した血清クレアチンキナーゼ濃度をもたらす。いくつかの実施形態では、提供される組成物を投与することは、治療されない対象の血清クレアチンキナーゼ濃度と比較して、減少した血清クレアチンキナーゼ濃度をもたらす。
【0103】
疾患ＤＭＤは、細胞膜のジストログリカン複合体（ＤＧＣ）に構造的安定性を提供する筋組織内の重要な構造成分であるタンパク質ジストロフィンをコードする、ヒトＸ染色体上に位置するジストロフィン遺伝子における、突然変異によって引き起こされる。ジストロフィンは、内部細胞質のアクチンフィラメントネットワーク及び細胞外マトリックスを連結し、筋線維に物理的な強度を提供する。したがって、ジストロフィンの変質または不在は、異常な筋線維膜の引裂き及び筋線維の壊死をもたらす。男女共に突然変異を保有し得るが、女性が、疾患の重度の徴候を示すことは稀である。
【0104】
ＤＭＤの主な症状は通常は、随意筋が最初に冒されることを伴い、特に股、骨盤領域、大腿、肩の筋肉及び下腿筋を冒す、筋消耗に関連する筋力低下である。筋力低下は、腕、頸部及び他の領域でも生じる。下腿は多くの場合腫大する。徴候及び症状は、通常６歳前に現れ、乳児期という早期に現れる場合もある。心筋症は、通常１８歳の後、ＤＭＤの個人に生じる。他の身体的症状としては、自分自身で歩行するための能力の遅延、歩行、足踏み、または走ることの進行性の困難、ならびに歩行する能力の最終的な喪失（通常、１２歳まで）、頻繁な転倒、疲労感、運動機能（走ること、ホッピング、ジャンプ）の困難、臀部屈筋の短縮に至る腰椎前弯の増加、アキレス腱及び膝屈曲筋の機能障害、結合組織の線維症、筋線維変形、脂肪及び結合組織による筋線維の置換えによって引き起こされる舌筋及び下腿筋の偽肥大（腫大）、神経行動障害（例えば、ＡＤＨＤ）、学習障害（失読症）、ならびに特定の認知機能（特に、短期言語性記憶）における非進行性の低下のより高いリスク、骨格変形（場合によっては脊柱側弯症を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0105】
ＤＭＤに見られる筋肉の変化は、結合組織の増加、すなわち線維症の発現を伴い、ならびに機械的、体液性及び／または細胞性因子を含有する反応または修復工程からもたらされる。機能的なジストロフィンの欠乏は筋線維膜の不安定性をもたらし、その結果、細胞は機械的剪断力に対する耐性がより少なくなり、組織破壊をもたらす電解質を過剰流入する傾向がある。ＤＭＤの筋組織が損傷を受けると、回復は増殖する衛星細胞の能力により制限される。これにより、壊死、炎症、線維症及び脂肪細胞置換となる。結合組織の増加は、疾患過程の早期に、各筋細胞を鞘で覆い筋繊維鞘（すなわち筋内膜）のを覆う疎性結合組織が観察可能な筋肉損傷の前に増加するために生じる。膠原性結合組織の増加は、罹患した筋細胞への栄養分の供給に悪影響を及ぼし、歩行運動の筋力及びその損失の年齢に二次的に影響を及ぼす、ＤＭＤの筋肉病理の要因である。
【0106】
いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片のｉｎ ｖｉｖｏ投与は、筋組織の線維症を減少させる。いくつかの実施形態では、筋肉は骨格筋である。特定の実施形態において、筋肉は、心筋、横隔膜筋、腓腹筋及び／または前脛骨（ＴＡ）筋である。いくつかの実施形態では、減少した線維症は減少したコラーゲン染色により示される。いくつかの実施形態において、前記コラーゲンはＩ型コラーゲンである。いくつかの実施形態では、減少した線維症は、例えば抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片を投与したマウスの筋肉のコラーゲン陽性領域％を測定することによって判定できる。例えば、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片を投与したマウスの横隔膜筋のコラーゲン陽性領域％は、全組織領域の少なくとも約３．０％、約３．５％、約４．０％、約４．５％、約５．０％、約５．５％、約６．０％、約６．５％、約７．０％、約７．５％、約８．０％、約８．５％または約９．０％であり得る。特定の実施形態において、抗Ｆｌｔ－１抗体を投与したマウスの横隔膜筋のコラーゲン陽性領域％は、アイソタイプ対照抗体を投与したマウスの横隔膜筋のコラーゲン陽性領域％より著しく低いことがあり得る。
【0107】
いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片のｉｎ ｖｉｖｏ投与は、筋組織の壊死を減少させる。いくつかの実施形態では、筋肉は骨格筋である。特定の実施形態において、筋肉は、心筋、横隔膜筋、腓腹筋及び／または前脛骨（ＴＡ）筋である。いくつかの実施形態では、減少した壊死は、例えば抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片を投与したマウスの筋肉の壊死陽性領域％を測定することによって判定できる。例えば、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片を投与したマウスの横隔膜筋の壊死陽性領域％は、全組織領域の少なくとも約０．５％、約０．４５％、約０．４％、約０．３５％、約０．３％、約０．２５％、約０．２％、約０．１５％、約０．１％、約０．０５％または約０．０２５％であり得る。特定の実施形態において、抗Ｆｌｔ－１抗体を投与したマウスの腓腹筋の壊死陽性領域％は、アイソタイプ対照抗体を投与したマウスの腓腹筋の壊死陽性領域％より著しく低いことがあり得る。
【0108】
いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片のｉｎ ｖｉｖｏ投与は、増加した筋力及び／または疲労に対する耐性になる。
【0109】
Ｆｌｔ－１受容体
血管内皮増殖因子受容体１（ＶＥＧＦＲ－１）またはＦｌｔ－１としても既知のＦｌｔ－１受容体は、ＦＬＴ１遺伝子によってコードされて、内皮細胞及び単球細胞膜で発現する受容体である。シグナルグリコプロテインの血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の群は、胚形成及び生後の発育中、血管新生の強力なプロモータとして作用する。具体的には、ＶＥＧＦ－ＡリガンドとＶＥＧＦ受容体の結合は、血管透過性を促進して、更に内皮細胞の遊走、増殖及び生存を惹起することを示しており、新しく形成された内皮細胞は、新しい脈管構造の基本構造を提供する。血管新生のためのドミナントＶＥＧＦシグナル分子（ＶＥＧＦ－Ａ）は、ＶＥＧＦ受容体－１（ＶＥＧＦＲ－ｌ、別名Ｆｌｔ－１）及びＶＥＧＦ受容体－２（ＶＥＧＦＲ－２、別名Ｆｌｋ－１）を通してその信号を仲介する。Ｆｌｔ－１（ｓＦｌｔ－１）の可溶性形態も存在するが、細胞内シグナル伝達ドメインを欠いており、したがってＶＥＧＦ－Ａまたはそれに結合する他のリガンドを隔離することにより制御能力で役割を果たすだけであると考えられている。細胞内シグナル伝達経路に連結されていないＦｌｔ－１結合部位を含有するｓＦｌｔ－１及び他の分子は「おとり受容体」と呼ばれる。Ｆｌｔ－１及びＦｌｋ－１受容体は細胞外ＶＥＧＦ－Ａ結合ドメイン及び細胞内チロシンキナーゼドメインを含有し、両方とも血管芽細胞及び内皮細胞系譜の発達段階及び組織再生中に、発現を示す。Ｆｌｔ－１は、Ｆｌｋ－１と比較してＶＥＧＦ－Ａ（Ｋｄ約２－１０ｐＭ）について約１０倍超の結合親和性を有するが、より弱いチロシンキナーゼ活性は、ＶＥＧＦ－ＡのＦｌｔ－１への結合後の血管新生シグナル伝達がＶＥＧＦ－ＡのＦｌｋ－１への結合から生じるものに比べて比較的弱いことを示す。したがってホモ接合型Ｆｌｔ－１遺伝子ノックアウトマウスは、内皮細胞過剰産生及び血管組織崩壊から胎児期で死ぬ。逆に、ホモ接合型Ｆｌｋ－１遺伝子ノックアウトマウスは、胚形成中の卵黄嚢血島形成の不足のため、器質化血管の発現の障害が原因で死ぬ。Ｆｌｔ－１及びＦｌｋ－１受容体の両方は正常な発育のために必要とされている。しかし、ＶＥＧＦ－Ａ濃度の選択的増大は、Ｆｌｋ－１受容体へのより大きな結合を可能にさせることができ、毛細血管密度を上昇させて、筋肉の再生、線維症及び炎症の減少、ならびに種々の筋組織のＤＭＤ及び他の筋ジストロフィーと関連した症状及び特徴の緩和を容易にする、血管新生促進効果を誘発できる。
血管内皮増殖因子受容体１（ＶＥＧＦＲ－１）またはＦｌｔ－１としても既知のＦｌｔ－１受容体は、ＦＬＴ１遺伝子によってコードされて、内皮細胞及び単球細胞膜で発現する受容体である。シグナルグリコプロテインの血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の群は、胚形成及び生後の発育中、血管新生の強力なプロモータとして作用する。具体的には、ＶＥＧＦ－ＡリガンドとＶＥＧＦ受容体の結合は、血管透過性を促進して、更に内皮細胞の遊走、増殖及び生存を惹起することを示しており、新しく形成された内皮細胞は、新しい脈管構造の基本構造を提供する。血管新生のためのドミナントＶＥＧＦシグナル分子（ＶＥＧＦ－Ａ）は、ＶＥＧＦ受容体－１（ＶＥＧＦＲ－ｌ、別名Ｆｌｔ－１）及びＶＥＧＦ受容体－２（ＶＥＧＦＲ－２、別名Ｆｌｋ－１）を通してその信号を仲介する。Ｆｌｔ－１（ｓＦｌｔ－１）の可溶性形態も存在するが、細胞内シグナル伝達ドメインを欠いており、したがってＶＥＧＦ－Ａまたはそれに結合する他のリガンドを隔離することにより制御能力で役割を果たすだけであると考えられている。細胞内シグナル伝達経路に連結されていないＦｌｔ－１結合部位を含有するｓＦｌｔ－１及び他の分子は「おとり受容体」と呼ばれる。Ｆｌｔ－１及びＦｌｋ－１受容体は細胞外ＶＥＧＦ－Ａ結合ドメイン及び細胞内チロシンキナーゼドメインを含有し、両方とも血管芽細胞及び内皮細胞系譜の発達段階及び組織再生中に、発現を示す。Ｆｌｔ－１は、Ｆｌｋ－１と比較してＶＥＧＦ－Ａ（Ｋｄ約２－１０ｐＭ）について約１０倍超の結合親和性を有するが、より弱いチロシンキナーゼ活性は、ＶＥＧＦ－ＡのＦｌｔ－１への結合後の血管新生シグナル伝達がＶＥＧＦ－ＡのＦｌｋ－１への結合から生じるものに比べて比較的弱いことを示す。したがってホモ接合型Ｆｌｔ－１遺伝子ノックアウトマウスは、内皮細胞過剰産生及び血管組織崩壊から胎児期で死ぬ。逆に、ホモ接合型Ｆｌｋ－１遺伝子ノックアウトマウスは、胚形成中の卵黄嚢血島形成の不足のため、器質化血管の発現の障害が原因で死ぬ。Ｆｌｔ－１及びＦｌｋ－１受容体の両方は正常な発育のために必要とされている。しかし、ＶＥＧＦ－Ａ濃度の選択的増大は、Ｆｌｋ－１受容体へのより大きな結合を可能にさせることができ、毛細血管密度を上昇させて、筋肉の再生、線維症及び炎症の減少、ならびに種々の筋組織のＤＭＤ及び他の筋ジストロフィーと関連した症状及び特徴の緩和を容易にする、血管新生促進効果を誘発できる。
【0110】
本明細書で使用する場合「Ｆｌｔ－１受容体」という用語は、可溶性及び膜結合性の両方のＦｌｔ－１受容体またはその機能的断片を指す。
【0111】
抗Ｆｌｔ－１抗体
本明細書で使用する場合「抗Ｆｌｔ－１抗体」という用語は、Ｆｌｔ－１受容体（例えば、可溶性または膜結合性Ｆｌｔ－１受容体）に結合する任意の抗体またはその抗原結合断片を指す。いくつかの実施形態において、高親和性でＦｌｔ－１受容体に結合する抗Ｆｌｔ－１抗体を作成する。理論に束縛されるものではないが、抗Ｆｌｔ－１抗体のＦｌｔ－１受容体への結合は、１つ以上の内在性リガンドがＦｌｔ－１に結合するのを阻害して、それによってより大量の利用可能なリガンドが、Ｆｌｋ－１受容体などの他のＶＥＧＦ受容体と関連するのを可能にすると考えられている。増大したＶＥＧＦの有効性は、筋肉への増加した血流量を備えた血管新生を促進して機能的虚血と闘い、ＤＭＤの構造及び機能的特徴の改善をもたらす。いくつかの実施形態では、抗体のＦｌｔ－１受容体への結合は、他のＶＥＧＦ受容体に結合できるＶＥＧＦの量を増加させる。
本明細書で使用する場合「抗Ｆｌｔ－１抗体」という用語は、Ｆｌｔ－１受容体（例えば、可溶性または膜結合性Ｆｌｔ－１受容体）に結合する任意の抗体またはその抗原結合断片を指す。いくつかの実施形態において、高親和性でＦｌｔ－１受容体に結合する抗Ｆｌｔ－１抗体を作成する。理論に束縛されるものではないが、抗Ｆｌｔ－１抗体のＦｌｔ－１受容体への結合は、１つ以上の内在性リガンドがＦｌｔ－１に結合するのを阻害して、それによってより大量の利用可能なリガンドが、Ｆｌｋ－１受容体などの他のＶＥＧＦ受容体と関連するのを可能にすると考えられている。増大したＶＥＧＦの有効性は、筋肉への増加した血流量を備えた血管新生を促進して機能的虚血と闘い、ＤＭＤの構造及び機能的特徴の改善をもたらす。いくつかの実施形態では、抗体のＦｌｔ－１受容体への結合は、他のＶＥＧＦ受容体に結合できるＶＥＧＦの量を増加させる。
【0112】
いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片は、表２に提供する配列を含む。
【表2-1】
【表2-2】
【表2-3】
【表2-4】
【表2-5】
【表2-6】
【表2-7】
【表2-8】
【表2-9】
【表2-10】
【表2-11】
【表2-12】
【表2-13】
【表2-14】
【0113】
いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１９～配列番号２１のいずれか一つに少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％の同一性を有するアミノ酸配列によって定義されるＶＬ ＣＤＲ１、配列番号２２～配列番号２４のいずれか一つに少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％の同一性を有するアミノ酸配列によって定義されるＶＬ ＣＤＲ２、配列番号２５～配列番号３４のいずれか一つに少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％の同一性を有するアミノ酸配列によって定義されるＶＬ ＣＤＲ３、配列番号１～配列番号４のいずれか一つに少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％の同一性を有するアミノ酸配列によって定義されるＶＨ鎖ＣＤＲ１、配列番号５～配列番号１４のいずれか一つに少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％の同一性を有するアミノ酸配列によって定義されるＶＨ ＣＤＲ２、及び配列番号１５～配列番号１８のいずれか一つに少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％の同一性を有するアミノ酸配列によって定義されるＶＨ ＣＤＲ３からなる群から選択される、１つ以上の相補的決定領域（ＣＤＲ）を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬ ＣＤＲ３は配列番号２５ではない。いくつかの実施形態では、ＶＨ ＣＤＲ３は配列番号１５ではない。
【0114】
いくつかの実施形態において、１つ以上のＣＤＲは、配列番号２５～配列番号３４のいずれか一つに少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％の同一性を有するアミノ酸配列によって定義されるＶＬ ＣＤＲ３、及び配列番号１５～配列番号１８のいずれか一つに少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％の同一性を有するアミノ酸配列によって定義されるＶＨ ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬ ＣＤＲ３は配列番号２５ではない。いくつかの実施形態では、ＶＨ ＣＤＲ３は配列番号１５ではない。
【0115】
いくつかの実施形態において、１つ以上のＣＤＲは、配列番号１９～配列番号２１のいずれか一つに少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％の同一性を有するアミノ酸配列によって定義されるＶＬ ＣＤＲ１、配列番号２２～配列番号２４のいずれか一つに少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％の同一性を有するアミノ酸配列によって定義されるＶＬ ＣＤＲ２、及び配列番号２５～配列番号３４のいずれか一つに少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％の同一性を有するアミノ酸配列によって定義されるＶＬ ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬ ＣＤＲ３は配列番号２５ではない。
【0116】
いくつかの実施形態において、１つ以上のＣＤＲは、配列番号１～配列番号４のいずれか一つに少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％の同一性を有するアミノ酸配列によって定義されるＶＨ ＣＤＲ１、配列番号５～配列番号１４のいずれか一つに少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％の同一性を有するアミノ酸配列によって定義されるＶＨ ＣＤＲ２、及び配列番号１５～配列番号１８のいずれか一つに少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％の同一性を有するアミノ酸配列によって定義されるＶＨ ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨ ＣＤＲ３は配列番号１５ではない。
【0117】
いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片は、それぞれ配列番号１９、配列番号２２及び配列番号２５のアミノ酸配列によって定義されるＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２ならびにＶＬ ＣＤＲ３を含む、ＶＬ鎖を含む。別の実施形態において、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片は、それぞれ配列番号２０、配列番号２３及び配列番号２５のアミノ酸配列によって定義されるＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２ならびにＶＬ ＣＤＲ３を含む、ＶＬ鎖を含む。更に別の実施形態において、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片は、それぞれ配列番号２１及び配列番号２４のアミノ酸配列によって定義されるＶＬ ＣＤＲ１ならびにＶＬ ＣＤＲ２、ならびに配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３または配列番号３４のアミノ酸配列によって定義されるＶＬ ＣＤＲ３を含む、ＶＬ鎖を含む。特定の実施形態において、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２１のアミノ酸配列によって定義されるＶＬ ＣＤＲ１、配列番号２４のアミノ酸配列によって定義されるＶＬ ＣＤＲ２、及び配列番号３２のアミノ酸配列によって定義されるＶＬ ＣＤＲ３を含む、ＶＬ鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬ ＣＤＲ３は配列番号２５ではない。
【0118】
別の実施形態では、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片は、それぞれ配列番号１、配列番号５及び配列番号１５のアミノ酸配列によって定義されるＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ
ＣＤＲ２ならびにＶＨ ＣＤＲ３を含む、ＶＨ鎖を含む。別の実施形態において、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片は、それぞれ配列番号２、配列番号６及び配列番号１６のアミノ酸配列によって定義されるＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２ならびにＶＨ ＣＤＲ３を含む、ＶＨ鎖を含む。別の実施形態において、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片は、それぞれ配列番号２、配列番号１０及び配列番号１８のアミノ酸配列によって定義されるＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２ならびにＶＨ ＣＤＲ３を含む、ＶＨ鎖を含む。別の実施形態において、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片は、それぞれ配列番号２及び配列番号１７のアミノ酸配列によって定義されるＶＨ ＣＤＲ１ならびにＶＨ ＣＤＲ３、ならびに配列番号７、配列番号８、配列番号１３または配列番号１４のアミノ酸配列によって定義されるＶＨ ＣＤＲ２を含む、ＶＨ鎖を含む。別の実施形態において、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片は、それぞれ配列番号３及び配列番号１７のアミノ酸配列によって定義されるＶＨ ＣＤＲ１ならびにＶＨ ＣＤＲ３、ならびに配列番号９、配列番号１１または配列番号１２のアミノ酸配列によって定義されるＶＨ
ＣＤＲ２を含む、ＶＨ鎖を含む。別の実施形態において、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片は、それぞれ配列番号４、配列番号９及び配列番号１７のアミノ酸配列によって定義されるＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２ならびにＶＨ ＣＤＲ３を含む、ＶＨ鎖を含む。特定の実施形態において、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３のアミノ酸配列によって定義されるＶＨ ＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列によって定義されるＶＨ ＣＤＲ２、及び配列番号１７のアミノ酸配列によって定義されるＶＨ ＣＤＲ３を含む、ＶＨ鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨ ＣＤＲ３は配列番号１５ではない。
ＣＤＲ２ならびにＶＨ ＣＤＲ３を含む、ＶＨ鎖を含む。別の実施形態において、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片は、それぞれ配列番号２、配列番号６及び配列番号１６のアミノ酸配列によって定義されるＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２ならびにＶＨ ＣＤＲ３を含む、ＶＨ鎖を含む。別の実施形態において、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片は、それぞれ配列番号２、配列番号１０及び配列番号１８のアミノ酸配列によって定義されるＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２ならびにＶＨ ＣＤＲ３を含む、ＶＨ鎖を含む。別の実施形態において、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片は、それぞれ配列番号２及び配列番号１７のアミノ酸配列によって定義されるＶＨ ＣＤＲ１ならびにＶＨ ＣＤＲ３、ならびに配列番号７、配列番号８、配列番号１３または配列番号１４のアミノ酸配列によって定義されるＶＨ ＣＤＲ２を含む、ＶＨ鎖を含む。別の実施形態において、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片は、それぞれ配列番号３及び配列番号１７のアミノ酸配列によって定義されるＶＨ ＣＤＲ１ならびにＶＨ ＣＤＲ３、ならびに配列番号９、配列番号１１または配列番号１２のアミノ酸配列によって定義されるＶＨ
ＣＤＲ２を含む、ＶＨ鎖を含む。別の実施形態において、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片は、それぞれ配列番号４、配列番号９及び配列番号１７のアミノ酸配列によって定義されるＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２ならびにＶＨ ＣＤＲ３を含む、ＶＨ鎖を含む。特定の実施形態において、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３のアミノ酸配列によって定義されるＶＨ ＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列によって定義されるＶＨ ＣＤＲ２、及び配列番号１７のアミノ酸配列によって定義されるＶＨ ＣＤＲ３を含む、ＶＨ鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨ ＣＤＲ３は配列番号１５ではない。
【0119】
別の実施形態では、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片は、配列番号４９～配列番号６１のいずれか一つに少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ＶＬ領域、及び／または配列番号３５～配列番号４８のいずれか一つに少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖ＶＨ領域を含む。特定の実施形態において、ＶＬ領域は配列番号６０のアミノ酸配列を含み、及びＶＨ領域は配列番号４５のアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、抗体は、配列番号８７～配列番号８９のいずれか一つに少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、重鎖定常領域を更に含む。いくつかの実施形態では、ＶＬ領域は配列番号４９または配列番号５０ではない。いくつかの実施形態では、ＶＨ領域は配列番号３５または配列番号３６ではない。
【0120】
別の実施形態では、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片は、配列番号７５～配列番号８６のいずれか一つに少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖、及び／または配列番号６２～配列番号７４のいずれか一つに少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖を含む。特定の実施形態において、軽鎖は配列番号７６のアミノ酸配列を含み、及び重鎖領域は配列番号７１のアミノ酸配列を含む。
【0121】
いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片の重鎖は、アミノ酸配列
ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳＥＬＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＳＡＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＷＳＧＤＳＴＹＹＡＥＳＶＫＧＲＦＴＩＦＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＳＷＡＴＰＩＥＳＬＹＹＹＧＳＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＸ（配列番号１０８）を含む。いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片の重鎖は、アミノ酸配列
ＥＬＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＳＡＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＷＳＧＤＳＴＹＹＡＥＳＶＫＧＲＦＴＩＦＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＳＷＡＴＰＩＥＳＬＹＹＹＧＳＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号１０９）を含む。
ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳＥＬＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＳＡＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＷＳＧＤＳＴＹＹＡＥＳＶＫＧＲＦＴＩＦＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＳＷＡＴＰＩＥＳＬＹＹＹＧＳＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＸ（配列番号１０８）を含む。いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片の重鎖は、アミノ酸配列
ＥＬＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＳＡＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＷＳＧＤＳＴＹＹＡＥＳＶＫＧＲＦＴＩＦＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＳＷＡＴＰＩＥＳＬＹＹＹＧＳＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号１０９）を含む。
【0122】
いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片の軽鎖は、アミノ酸配列
ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳＳＹＥＬＴＱＰＬＳＶＳＶＡＬＲＱＡＡＫＩＴＣＧＧＮＮＩＧＳＱＴＡＱＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＶＬＶＩＹＡＮＮＲＲＰＳＧＩＰＥＲＦＳＧＳＫＳＧＮＴＡＴＬＴＩＳＲＡＱＡＧＤＥＡＤＹＹＣＱＶＷＤＡＳＴＱＡＩＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＦＰＰＳＳＥＥＬＱＡＮＫＡＴＬＶＣＬＩＳＤＦＹＰＧＡＶＴＶＡＷＫＡＤＳＳＰＶＫＡＧＶＥＴＴＴＰＳＫＱＳＮＮＫＹＡＡＳＳＹＬＳＬＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳＹＳＣＱＶＴＨＥＧＳＴＶＥＫＴＶＡＰＴＥＣＳＸ（配列番号１１０）を含む。
ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳＳＹＥＬＴＱＰＬＳＶＳＶＡＬＲＱＡＡＫＩＴＣＧＧＮＮＩＧＳＱＴＡＱＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＶＬＶＩＹＡＮＮＲＲＰＳＧＩＰＥＲＦＳＧＳＫＳＧＮＴＡＴＬＴＩＳＲＡＱＡＧＤＥＡＤＹＹＣＱＶＷＤＡＳＴＱＡＩＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＦＰＰＳＳＥＥＬＱＡＮＫＡＴＬＶＣＬＩＳＤＦＹＰＧＡＶＴＶＡＷＫＡＤＳＳＰＶＫＡＧＶＥＴＴＴＰＳＫＱＳＮＮＫＹＡＡＳＳＹＬＳＬＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳＹＳＣＱＶＴＨＥＧＳＴＶＥＫＴＶＡＰＴＥＣＳＸ（配列番号１１０）を含む。
【0123】
いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１０８または配列番号１０９の重鎖、及び配列番号１１０または配列番号７６の軽鎖を含む。
【0124】
いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片は、約１０－７Ｍ超、約０．５×１０－７Ｍ超、約１０－８Ｍ超、約０．５×１０－８Ｍ超、約１０－９Ｍ超、約０．５×１０－９Ｍ超、約１０－１０Ｍ超、約０．５×１０－１０Ｍ超、約１０－１１Ｍ超、約０．５×１０－１１Ｍ超、約１０－１２Ｍ超、または約０．５×１０－１２Ｍ超の親和性でヒトＦｌｔ－１と結合する。他の実施形態において、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片は、約１０－７Ｍ超、約０．５×１０－７Ｍ超、約１０－８Ｍ超、約０．５×１０－８Ｍ超、約１０－９Ｍ超、約０．５×１０－９Ｍ超、約１０－１０Ｍ超、約０．５×１０－１０Ｍ超、約１０－１１Ｍ超、約０．５×１０－１１Ｍ超、約１０－１２Ｍ超、または約０．５×１０－１２Ｍ超の親和性でマウスＦｌｔ－１と結合する。Ｆｌｔ－１抗体の親和性は、例えばＢＩＡＣＯＲＥアッセイなどの表面プラズモン共鳴アッセイで測定することができる。
【0125】
いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片は、ヒトＦｌｔ－１との競合アッセイにおいて、約５００ｐＭ未満、約４００ｐＭ未満、約３００ｐＭ未満、約２００ｐＭ未満、約１００ｐＭ未満、約５０ｐＭ未満、約２５ｐＭ未満、約１０ｐＭ未満、約５ｐＭ未満または約１ｐＭ未満のＩＣ５０を特徴とする。いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片は、マウスＦｌｔ－１との競合アッセイにおいて、約５００ｐＭ未満、約４００ｐＭ未満、約３００ｐＭ未満、約２００ｐＭ未満、約１００ｐＭ未満、約５０ｐＭ未満、約２５ｐＭ未満、約１０ｐＭ未満、約５ｐＭ未満または約１ｐＭ未満のＩＣ５０を特徴とする。
【0126】
いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片は、Ｆｌｔ－１受容体でのＶＥＧＦの結合及び／または活動を阻害する。いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片は、競合アッセイにおけるＶＥＧＦのヒトＦｌｔ－１との結合の阻害に関して、約５００ｐＭ未満、約４００ｐＭ未満、約３００ｐＭ未満、約２００ｐＭ未満、約１００ｐＭ未満、約５０ｐＭ未満、約２５ｐＭ未満、約１０ｐＭ未満、約５ｐＭ未満または約１ｐＭ未満のＩＣ５０を特徴とする。
【0127】
いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片は、可溶性Ｆｌｔ－１に対するＶＥＧＦの結合と競合する及び／またはそれを阻害する。他の実施形態において、前記競合及び／または阻害は、用量依存的である。特定の実施形態において、Ｆｌｔ－１に対するＶＥＧＦの結合の阻害は、ＶＥＧＦ Ｒ２の増大したリン酸化をもたらす。理論に束縛されるものではないが、Ｆｌｔ－１に対する抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片の結合は、Ｆｌｔ－１に対するＶＥＧＦの結合を阻害する。結合しなかったＶＥＧＦは、ＶＥＧＦ Ｒ２に結合し、これはＶＥＧＦ Ｒ２のリン酸化を測定することによって示され得る。特定の実施形態において、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片は、用量依存的にＶＥＧＦ Ｒ２のリン酸化を救済する。例えばＶＥＧＦ Ｒ２のリン酸化は、少なくとも約１００％、約９５％、約９０％、約８５％、約８０％、約７５％、約７０％、約６５％、約６０％、約５５％、約５０％、約４５％、約４０％、約３５％、約３０％、約２５％、約２０％、約１５％、約１０％または約５％救済され得る。
【0128】
いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片は、バイオアッセイにおいて、約９５％超、約９０％超、約８５％超、約８０％超、約７５％超、約７０％超、約６５％超、約６０％超、約５５％超、約５０％超、約４５％超、約４０％超、約３５％超、約３０％超、約２５％超、約２０％超、約１５％超または約１０％超の救済を提供する。特定の実施形態において、前記バイオアッセイは、ｓＦｌｔ－１及び抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片の存在下で、ＶＥＧＦによって刺激されるヒト主要静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を含む。細胞のＶＥＧＦ誘発性活性化は、ＶＥＧＦ Ｒ２受容体のリン酸化状態を判定することによって試験できる。データは、ｓＦｌｔ－１のみの存在下で（例えば、抗Ｆｌｔ－１抗体なしで）、ＶＥＧＦ Ｒ２受容体のリン酸化に対して、ＶＥＧＦ Ｒ２受容体のリン酸化の救済％として表され得る。
【0129】
いくつかの実施形態では、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片は、約２００時間超、約１５０時間超、約１００時間超、約９５時間超、約９０時間超、約８５時間超、約８０時間超、約７５時間超、約７０時間超、約６５時間超、約６０時間超、約５５時間超、約５０時間超または約４５時間超、及びその範囲の半減期を有する。いくつかの実施形態では、半減期はマウスで測定される。
【0130】
いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片は、約４００ｕｇ／ｍＬ超、３７５ｕｇ／ｍＬ超、約３５０ｕｇ／ｍＬ超、約３２５ｕｇ／ｍＬ超、約３００ｕｇ／ｍＬ超、約２７５ｕｇ／ｍＬ超、約２５０ｕｇ／ｍＬ超、約２２５ｕｇ／ｍＬ超、約２００ｕｇ／ｍＬ超、約１７５ｕｇ／ｍＬ超、約１５０ｕｇ／ｍＬ超、約１２５ｕｇ／ｍＬ超、約１００ｕｇ／ｍＬ超、約７５ｕｇ／ｍＬ超または約５０ｕｇ／ｍＬ超、及びその範囲の最大血清中濃度を有する。いくつかの実施形態において、最大血清中濃度はマウスで測定される。
【0131】
いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片は選択的にＦｌｔ－１に結合して、他のＶＥＧＦ受容体には最小の結合を有する、またはその結合は強くはない。いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片は選択的にＦｌｔ－１に結合して、ＶＥＧＦ Ｒ２（Ｆｌｋ－１）及び／またはＶＥＧＦ Ｒ３（Ｆｌｔ－４）には最小の結合を有する、またはその結合は強くはない。
【0132】
いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片は、ヒトＦｌｔ－１に結合するとき、約１×１０－３Ｍ－１秒－１超、約１×１０－４Ｍ－１秒－１超、約１×１０－５Ｍ－１秒－１超、約１×１０－６Ｍ－１秒－１超、または約１×１０－７Ｍ－１秒－１超のｋａを有する。
【0133】
いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片は、ヒトＦｌｔ－１に結合するとき、約１×１０－３秒－１超、約１×１０－４秒－１超、約１×１０－５秒－１超、または約１×１０－６秒－１超のｋｄを有する。
【0134】
いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片は、ヒトＦｌｔ－１に結合するとき、約１×１０－８Ｍ超、約１×１０－９Ｍ超、約１×１０－１０Ｍ超、約１×１０－１１Ｍ超、または約１×１０－１２Ｍ超のＫＤを有する。
【0135】
いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片は、可溶性Ｆｌｔ－１に結合する。特定の実施形態において、前記結合は投与量に依存しており、抗体またはその抗原結合断片の濃度が高ければ、より大量の可溶性Ｆｌｔ－１に結合する。
【0136】
いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片は、約９９％超、約９８％超、約９７％超、約９６％超、約９５％超、約９４％超、約９３％超、約９２％超、約９１％超、約９０％超または約８０％超のヒト識別％を有する。
【0137】
いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片は、約９９％超、約９８％超、約９７％超、約９６％超、約９５％超、約９４％超、約９３％超、約９２％超、約９１％超、約９０％超または約８０％超のヒト相同性％を有する。
【0138】
いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片は、Ｆｌｔ－１タンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、Ｆｌｔ－１タンパク質は組換えタンパク質、例えば組換えｓＦｌｔ－１である。特定の実施形態では、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片は、ヒトＦｌｔ－１アイソフォーム１（ＮＰ＿００２０１０．２ ＧＩ：１５６１０４８７６、配列番号９０）に結合する（表１３）。別の実施形態では、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片は、ヒトＦｌｔ－１アイソフォームＸ１（ＸＰ＿０１１５３３１６．１ ＧＩ：７６７９７７５１１、配列番号９１）に結合する。別の実施形態では、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片は、ヒトＦｌｔ－１アイソフォーム２前駆体（ＮＰ＿００１１５３３９２．１ ＧＩ：２２９８９２２２０、配列番号９２）に結合する。更に別の実施形態では、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片は、ヒトＦｌｔ－１アイソフォーム３前駆体（ＮＰ＿００１１５３５０２．１ ＧＩ：２２９８９２３００、配列番号９３）に結合する。別の実施形態では、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片は、ヒトＦｌｔ－１アイソフォーム４前駆体（ＮＰ＿００１１５３５０３．１ ＧＩ：２２９８９２３０２、配列番号９４）に結合する。
【0139】
いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片は、Ｆｌｔ－１タンパク質の特定のエピトープに結合する。例えば抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合部分は、表３に示すようにアミノ酸配列に結合する。
【表3】
【0140】
いくつかの実施形態では、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片のｉｎ ｖｉｖｏ投与は、少なくとも約７００ｕｇ／ｍＬ、少なくとも約６５０ｕｇ／ｍＬ、少なくとも約６００ｕｇ／ｍＬ、少なくとも約５５０ｕｇ／ｍＬ、少なくとも約５００ｕｇ／ｍＬ、少なくとも約４５０ｕｇ／ｍＬ、少なくとも約４００ｕｇ／ｍＬ、少なくとも約３５０ｕｇ／ｍＬ、少なくとも約３００ｕｇ／ｍＬ、少なくとも約２５０ｕｇ／ｍＬ、少なくとも約２００ｕｇ／ｍＬ、少なくとも約１５０ｕｇ／ｍＬ、少なくとも約１００ｕｇ、少なくとも約５０ｕｇ／ｍＬ、少なくとも約４０ｕｇ／ｍＬ、少なくとも約３０ｕｇ／ｍＬ、少なくとも約２０ｕｇ／ｍＬ、少なくとも約１０ｕｇ／ｍＬまたは少なくとも約５ｕｇ／ｍＬ、及びその範囲の最高血清中抗体濃度になる。いくつかの実施形態では、最高血清中抗体濃度は投与量に依存している。
【0141】
いくつかの実施形態では、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片のｉｎ ｖｉｖｏ投与は、少なくとも約４５０ｕｇ／ｍＬ、少なくとも約４００ｕｇ／ｍＬ、少なくとも約３５０ｕｇ／ｍＬ、少なくとも約３００ｕｇ／ｍＬ、少なくとも約２５０ｕｇ／ｍＬ、少なくとも約２００ｕｇ／ｍＬ、少なくとも約１５０ｕｇ／ｍＬ、少なくとも約１００ｕｇ、少なくとも約５０ｕｇ／ｍＬまたは少なくとも約２５ｕｇ／ｍＬ、及びその範囲の最低血清中抗体濃度になる。いくつかの実施形態では、最低血清中抗体濃度は投与量に依存している。
【0142】
いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片のｉｎ ｖｉｖｏ投与は、ベースライン濃度と比較して、または溶媒のみを投与した対象の濃度と比較して、可溶性Ｆｌｔ－１の減少した血清中濃度になる。通常ベースライン濃度は、投与の直前に測定される。いくつかの実施形態では、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片の投与は、投与直前の可溶性Ｆｌｔ－１のベースライン血清中濃度と比較して、少なくとも約９５％、約９０％、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％、約４０％、約３０％、約２０％または約１０％の可溶性Ｆｌｔ－１の減少した血清中濃度になる。いくつかの実施形態では、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片の投与は、約４０００ｐｇ／ｍＬ未満、約３５００ｐｇ／ｍＬ、約３０００ｐｇ／ｍＬ、約２５００ｐｇ／ｍＬ、約２０００ｐｇ／ｍＬ、約１７５０ｐｇ／ｍＬ、約１５００ｐｇ／ｍＬ、約１２５０ｐｇ／ｍＬ、約１０００ｐｇ／ｍＬ、約９００ｐｇ／ｍＬ、約８００ｐｇ／ｍＬ、約７００ｐｇ／ｍＬ、約６００ｐｇ／ｍＬ、約５００ｐｇ／ｍＬ、約４５０ｐｇ／ｍＬ、約４００ｐｇ／ｍＬ、約３５０ｐｇ／ｍＬ、約３００ｐｇ／ｍＬ、約２５０ｐｇ／ｍＬ、約２００ｐｇ／ｍＬ、約１５０ｐｇ／ｍＬ、約１００ｐｇ／ｍＬ、約５０ｐｇ／ｍＬまたは約１０ｐｇ／ｍＬ、及びその範囲の可溶性Ｆｌｔ－１の減少した血清中濃度になる。いくつかの実施形態では、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片の投与は、抗体またはその抗原結合断片を投与されない対象の可溶性Ｆｌｔ－１の血清中濃度と比較して、可溶性Ｆｌｔ－１の減少した血清中濃度になる。いくつかの実施形態では、可溶性Ｆｌｔ－１の減少した血清中濃度は、投与量に依存している。
【0143】
いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片のｉｎ ｖｉｖｏ投与は、ベースライン濃度と比較して、または溶媒のみを投与した対象の濃度と比較して、ＶＥＧＦの増加した血清中濃度になる。通常ベースライン濃度は、治療の直前に測定される。いくつかの実施形態では、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片の投与は、投与直前のＶＥＧＦのベースライン血清中濃度と比較して、少なくとも約９５％、約９０％、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％、約４０％、約３０％、約２０％または約１０％のＶＥＧＦの増加した血清中濃度になる。いくつかの実施形態では、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片の投与は、約５００ｐｇ／ｍＬ超、約４５０ｐｇ／ｍＬ、約４００ｐｇ／ｍＬ、約３５０ｐｇ／ｍＬ、約３００ｐｇ／ｍＬ、約２５０ｐｇ／ｍＬ、約２００ｐｇ／ｍＬ、約１５０ｐｇ／ｍＬ、約１００ｐｇ／ｍＬ、約５０ｐｇ／ｍＬまたは約２５ｐｇ／ｍＬ、及びその範囲のＶＥＧＦの増加した血清中濃度になる。いくつかの実施形態では、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片の投与は、治療していない対象のＶＥＧＦの血清中濃度と比較して、ＶＥＧＦの増加した血清中濃度になる。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦの増加した血清中濃度は、投与量に依存している。
【0144】
いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片のｉｎ ｖｉｖｏ投与は、筋組織の増加した血管新生になる。いくつかの実施形態では、筋肉は骨格筋である。特定の実施形態において、筋肉は、横隔膜筋、腓腹筋及び／または前脛骨（ＴＡ）筋である。いくつかの実施形態では、増加した血管新生は、内皮細胞マーカー、例えばＣＤ３１の増大したＣＤ３１染色によって示される。いくつかの実施形態では、増大した染色は、例えば抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片を投与したマウスの筋肉のＣＤ３１陽性領域％を測定することによって判定できる。例えば、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片を投与したマウスの横隔膜筋のＣＤ３１陽性領域％は、全組織領域の少なくとも約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１．０％、約１．１％、約１．２％、約１．３％、約１．４％、約１．５％、約１．６％、約１．７％、約１．８％、約１．９％、約２．０％、約２．１％、約２．２％、約２．３％、約２．４％または約２．５％であり得る。更なる例において、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片を投与したマウスのＴＡ筋のＣＤ３１陽性領域％は、全組織領域の少なくとも約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％または約１．０％であり得る。特定の実施形態において、抗Ｆｌｔ－１抗体を投与したマウスの横隔膜筋またはＴＡ筋のＣＤ３１陽性領域％は、アイソタイプ対照抗体を投与したマウスの横隔膜筋またはＴＡ筋のＣＤ３１陽性領域％より著しく高いことがあり得る。
【0145】
いくつかの実施形態では、内皮細胞マーカーの増大した染色は、例えば抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片を投与したマウスの筋肉の正規化ＣＤ３１陽性％を測定することによって測定できる。特定の実施形態において、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片を投与したマウスの筋肉の増加したＣＤ３１染色は、アイソタイプ対照抗体を投与したマウスの筋肉で測定したＣＤ３１染色と比較したものである。例えば、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片を投与したマウスの横隔膜筋の正規化ＣＤ３１陽性％は、少なくとも約２００％、約１９０％、約１８０％、約１７０％、約１６０％、約１５０％、約１４０％、約１３０％、約１２０％または約１１０％であり得る。更なる実施例において、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片を投与したマウスのＴＡ筋の正規化ＣＤ３１陽性％は、少なくとも約３００％、約２９０％、約２８０％、約２７０％、約２６０％、約２５０％、約２４０％、約２３０％、約２２０％、約２１０％、約２００％、約１９０％、約１８０％、約１７０％、約１６０％、約１５０％、約１４０％、約１３０％、約１２０％または約１１０％、及びその範囲であり得る。
【0146】
いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片は、選択的にヒトＦｌｔ－１に結合して、他の哺乳動物のＦｌｔ－１受容体には最小の結合を有する、またはその結合は強くはない（例えば、１０－７Ｍまたは１０－６Ｍ未満の結合親和性で）。いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片は選択的にヒトＦｌｔ－１に結合して、サルＦｌｔ－１に結合しない。いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片は選択的にヒトＦｌｔ－１に結合して、マウスＦｌｔ－１に結合しない。
【0147】
いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片は、ヒトＦｌｔ－１及びサルＦｌｔ－１に結合する。いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片は、カニクイザルＦｌｔ－１に結合する。いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片は、ヒトＦｌｔ－１及びマウスＦｌｔ－１に結合する。
【0148】
いくつかの実施形態では、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片は、ＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、ＳｃＦｖ、二重特異性抗体、三重特異性抗体及び四重特異性抗体からなる群から選択される。
【0149】
いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片は、ＩｇＧである。いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片は、ＩｇＧ１である。
【0150】
遺伝子操作した定常領域
いくつかの実施形態では、好適な抗Ｆｌｔ－１抗体は、ＦｃＲｎ受容体に結合するＦｃドメインまたはその一部分を含有する。非限定的な例として、好適なＦｃドメインは、ＩｇＧなどの免疫グロブリンサブクラス由来であり得る。いくつかの実施形態では、好適なＦｃドメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４由来である。特に好適なＦｃドメインは、ヒトまたはヒト化抗体由来のものを含む。
いくつかの実施形態では、好適な抗Ｆｌｔ－１抗体は、ＦｃＲｎ受容体に結合するＦｃドメインまたはその一部分を含有する。非限定的な例として、好適なＦｃドメインは、ＩｇＧなどの免疫グロブリンサブクラス由来であり得る。いくつかの実施形態では、好適なＦｃドメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４由来である。特に好適なＦｃドメインは、ヒトまたはヒト化抗体由来のものを含む。
【0151】
ＦｃドメインとＦｃＲｎ受容体の間の改善された結合は、長期の血清半減期をもたらすことが企図される。したがって、いくつかの実施形態では、好適なＦｃドメイン（配列番号１０４）は、ＦｃＲｎへの結合の改善に導く１つ以上のアミノ酸突然変異を含む。ＦｃＲｎへの結合の改善をもたらすＦｃドメイン内の種々の突然変異は当該技術分野において周知であり、本発明の実施に適応することができる。いくつかの実施形態において、好適なＦｃドメインは、ヒトＩｇＧ１のＬｅｕ２３４、Ｌｅｒ２３５、Ｇｌｙ２３７、Ｔｈｒ２５０、Ｍｅｔ２５２、Ｓｅｒ２５４、Ｔｈｒ２５６、Ｔｈｒ３０７、Ｇｌｕ３８０、Ｍｅｔ４２８、Ｈｉｓ４３３及び／またはＡｓｎ４３４に対応する１つ以上の位置において１つ以上の突然変異を含む。
【0152】
Ｆｃドメインのいくつかの突然変異は、ＩｇＧとＦｃＲｎ受容体の結合の減少をもたらして、それによってエフェクター機能を阻害する。いくつかの実施形態において、好適なＦｃドメイン（配列番号１０４）は、ヒトＩｇＧ１のＬｅｕ２３４、Ｌｅｒ２３５及びＧｌｙ２３７に対応する１つ以上の位置において１つ以上の突然変異を含む。特定の実施形態において、Ｌｅｕ２３４はＡｌａに変異する。別の実施形態では、Ｌｅｕ２３５はＡｌａに変異する。更に別の実施形態では、Ｇｌｙ２３７はＡｌａに変異する。
【0153】
いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片はスペーサーを含有する、及び／または別の実体に連結する。いくつかの実施形態において、リンカーまたはスペーサーは
（配列番号１０５）（ＧＡＧリンカー）に少なくとも５０％（例えば、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一の配列を含む。いくつかの実施形態において、リンカーまたはスペーサーは
（配列番号１０６）（ＧＡＧ２リンカー）に少なくとも５０％（例えば、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一の配列を含む。いくつかの実施形態において、リンカーまたはスペーサーは
（配列番号１０７）（ＧＡＧ３リンカー）に少なくとも５０％（例えば、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一の配列を含む。
【化1】
（配列番号１０５）（ＧＡＧリンカー）に少なくとも５０％（例えば、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一の配列を含む。いくつかの実施形態において、リンカーまたはスペーサーは
【化2】
（配列番号１０６）（ＧＡＧ２リンカー）に少なくとも５０％（例えば、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一の配列を含む。いくつかの実施形態において、リンカーまたはスペーサーは
【化3】
（配列番号１０７）（ＧＡＧ３リンカー）に少なくとも５０％（例えば、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一の配列を含む。
【0154】
抗Ｆｌｔ－１抗体及び抗原結合断片の作成
本発明の好適な組換え抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片は、任意の利用可能な方法によって産生されることができる。例えば組換え抗Ｆｌｔ－１抗体または抗原結合断片は、組換え抗Ｆｌｔ－１抗体または抗原結合断片をコードする核酸を発現するよう操作された宿主細胞系を利用することによって組換え的に産生され得る。
本発明の好適な組換え抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片は、任意の利用可能な方法によって産生されることができる。例えば組換え抗Ｆｌｔ－１抗体または抗原結合断片は、組換え抗Ｆｌｔ－１抗体または抗原結合断片をコードする核酸を発現するよう操作された宿主細胞系を利用することによって組換え的に産生され得る。
【0155】
したがって本発明は、本明細書に記載の種々のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を更に提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載の抗Ｆｌｔ－１抗体重鎖または軽鎖アミノ酸配列、例えば配列番号６２～８６または配列番号１０８～１１０のいずれか一つをコードするポリヌクレオチド配列を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載の抗Ｆｌｔ－１抗体重鎖または軽鎖アミノ酸配列、例えば配列番号３５～６１のいずれか一つの可変領域をコードするポリヌクレオチド配列を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載の抗Ｆｌｔ－１抗体重鎖または軽鎖アミノ酸配列、例えば配列番号１～３４のいずれか一つのＣＤＲ領域をコードするポリヌクレオチド配列を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載の抗Ｆｌｔ－１抗体定常領域アミノ酸配列、例えば配列番号８７～８９のいずれか一つをコードするポリヌクレオチド配列を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載の抗Ｆｌｔ－１抗体Ｆｃ領域アミノ酸配列、例えば配列番号１０４をコードするポリヌクレオチド配列を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載の抗Ｆｌｔ－１抗体リンカーアミノ酸配列、例えば配列番号１０５～１０７をコードするポリヌクレオチド配列を提供する。
【0156】
いくつかの実施形態では、抗Ｆｌｔ－１抗体重鎖、軽鎖、可変領域、ＣＤＲ領域、Ｆｃ領域またはリンカー領域アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列は、シグナルペプチドをコードする配列を更に含む。非限定的な例として、好適なシグナルペプチドは、アミノ酸配列ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳ（配列番号：１１１）を含む。
【0157】
本明細書に記載の種々のポリヌクレオチド配列は、組換え抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片の発現において種々のベクター系で具現化され得る。
【0158】
抗体が組換え的に産生される場合、任意の発現系を使用することができる。少しではあるが例を挙げれば、既知の発現系は、例えば卵子、バキュロウイルス、植物、酵母または哺乳動物細胞を含む。
【0159】
いくつかの実施形態では、本発明に好適な組換え抗Ｆｌｔ－１抗体または抗原結合断片は、哺乳動物細胞中で産生される。本発明に従って使用できる哺乳動物細胞の非限定例は、ＢＡＬＢ／ｃマウス骨髄腫株（ＮＳＯ／ｌ、ＥＣＡＣＣ番号：８５１１０５０３）、ヒト網膜芽細胞（ＰＥＲ．Ｃ６、ＣｒｕＣｅｌｌ、Ｌｅｉｄｅｎ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、及びＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系（ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）を含む。
【0160】
いくつかの実施形態では、本発明は、ヒト細胞から産生される組換え抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、ＣＨＯ細胞から産生される組換え抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【0161】
本発明の抗体を含有する医薬品組成物
本発明は、本発明に従った治療的活性成分（例えば、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片）と共に１つ以上の薬学的に許容される担体または賦形剤を含む、医薬組成物を更に提供する。このような医薬組成物は所望により、１つ以上の追加の治療的活性物質を含むことができる。
本発明は、本発明に従った治療的活性成分（例えば、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片）と共に１つ以上の薬学的に許容される担体または賦形剤を含む、医薬組成物を更に提供する。このような医薬組成物は所望により、１つ以上の追加の治療的活性物質を含むことができる。
【0162】
本明細書にて提供される医薬組成物の説明は、ヒトへの倫理的投与に好適な医薬組成物を主に目的としているが、このような組成物が一般的に、あらゆる種類の動物への投与に適していることは当業者なら理解するであろう。組成物を種々の動物への投与に好適にするため、ヒトへの投与に好適な医薬組成物の改変は十分に理解されており、通常の知識を有する獣医薬理学者はもし必要ならば、このような改変を単に通常の実験で設計及び／または実施することができる。
【0163】
本明細書に記載の医薬組成物の製剤は、薬理学の当該技術分野において周知または以後開発された任意の方法により調製され得る。広くはこのような調製法は、希釈剤または別の賦形剤もしくは担体及び／または１つ以上の他の補助成分と、活性成分を調和させるステップ、次いで必要に応じて及び／または望ましくは、生成物を所望の単回投与単位または多回投与単位に成形及び／または包装するステップを含む。
【0164】
本発明に従う医薬組成物は、バルク状態で、単回単位用量及び／または複数の単回単位用量として調製、包装及び／または販売され得る。本明細書で使用する場合「単位用量」は、所定量の活性成分を含む医薬組成物の個々の量である。活性成分の量は一般的には、対象に投与されるであろう活性成分の用量、及び／またはこのような用量の都合の良い分量、例えばこのような用量の１／２もしくは１／３に等しい。
【0165】
本発明による医薬組成物における活性成分、薬学的に許容される賦形剤または担体及び／または任意の追加成分の相対量は、処置される対象の同一性、大きさ及び／または病態に応じて、ならびに組成物が投与される経路に応じて変動する。例として前記組成物は、０．１％と１００％（ｗ／ｗ）の間で活性成分を含み得る。
【0166】
医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤または担体を追加的に含むことができ、それは本明細書で使用する場合、所望の特定の投与剤形に適するように、あらゆる溶媒、分散媒、希釈剤または他の液体溶媒、分散または懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、保存剤、固体結合剤、滑沢剤などを含む。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ， ２００６、参照により本明細書に組み込まれる）に、医薬組成物を配合するのに使用される種々の賦形剤及びそれを調製するための周知の技術が開示されている。例えば任意の望ましくない生物学的効果を生じることにより、またはそれ以外に有害な方法で医薬組成物の任意の他の成分（複数可）と相互作用することにより、任意の従来の賦形剤媒体または担体が、物質またはその誘導体と不適合である場合を除いて、その使用は本発明の範囲内にあることが企図される。
【0167】
いくつかの実施形態において、薬学的に許容される賦形剤または担体は、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％純粋である。いくつかの実施形態において、賦形剤または担体は、ヒトに対して使用するために、及び獣医学使用のために承認される。いくつかの実施形態において、賦形剤または担体は、米国食品医薬品局に承認される。いくつかの実施形態において、賦形剤及び担体は医薬品グレードである。いくつかの実施形態において、賦形剤または担体は、米国薬局方（ＵＳＰ）、欧州薬局方（ＥＰ）、英国薬局方及び／または国際薬局方の基準を満たす。
【0168】
医薬品組成物の製造に使用する薬学的に許容される賦形剤または担体は、不活性希釈剤、分散剤及び／または造粒剤、界面活性剤及び／または乳化剤、崩壊剤、結合剤、防腐剤、緩衝剤、滑沢剤及び／または油を含むが、これらに限定されない。このような賦形剤または担体は所望により、医薬組成物に含まれることができる。賦形剤または担体（例えばカカオバター及び座剤用ワックス、着色剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤及び／または香料）は、配合者の判断に従って組成物中に存在できる。
【0169】
好適な薬学的に許容される賦形剤または担体には、水、塩溶液（例えばＮａＣｌ）、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、アルコール、グリセロール、エタノール、アラビアゴム、植物油、ベンジルアルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、炭水化物（例えばラクトース、アミロースまたはデンプン）、糖類（例えばマンニトール、スクロースなど）、デキストロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、芳香油、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなど、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。医薬品は所望する場合、活性化合物と有害に反応しない、またはその活性を妨げない補助剤（例えば、滑沢剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響する塩、緩衝剤、着色剤、香味剤及び／または芳香物質など）と混合することができる。好ましい実施形態において、静脈内投与に好適な水溶性担体が使用される。
【0170】
好適な医薬組成物または薬剤は所望する場合、少量の湿潤剤または乳化剤またはｐＨ緩衝剤も含有できる。組成物は、溶液、懸濁液、エマルション、錠剤、丸剤、カプセル、徐放性製剤、または粉剤であり得る。組成物は、トリグリセリドなどの従来の結合剤または担体と共に座剤として調製することもできる。経口製剤は、例えば医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準担体を含むことができる。
【0171】
医薬組成物または薬剤は、ヒトに投与するのに適合した医薬組成物として常法に従って製剤化することができる。例えばいくつかの実施形態において、静脈内投与用の組成物は通常、無菌の等張性緩衝剤の水溶液である。必要に応じて組成物は更に、可溶化剤及び局所麻酔剤を含んで注射の部位で痛みを緩和し得る。一般的に成分は、別途に供給される、または例えば活性剤の量を示すアンプルもしくはサシェなどの気密封止した容器にて凍結乾燥粉末もしくは水を含まない濃縮物として、単位投与形態で一緒に混合される。組成物が注入により投与される場合、無菌の医薬品グレードの水、生理食塩水またはデキストロース／水を含有する輸液瓶でそれを調剤することができる。組成物が注射で投与される場合、投与する前に成分が混合され得るように無菌の注射用水または生理食塩水のアンプルを提供することができる。
【0172】
医薬品の配合及び／または製造の一般的事項は、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２１ｓｔ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５に見出すことができる（参照により本明細書に組み込まれる）。
【0173】
投与経路
本明細書に記載の抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片（または本明細書に記載の抗Ｆｌｔ－１抗体もしくはその抗原結合断片を含有する組成物もしくは薬剤）は、任意の適切な経路によって投与される。いくつかの実施形態では、抗Ｆｌｔ－１抗体もしくは抗原結合断片タンパク質、またはこれを含有する医薬組成物は、非経口的に投与される。非経口投与は、静脈内投与、皮内投与、髄腔内投与、吸入投与、経皮（局所）投与、眼球内投与、筋肉内投与、皮下投与、筋肉内投与及び／または経粘膜投与であり得る。いくつかの実施形態では、抗Ｆｌｔ－１抗体もしくはその抗原結合断片、またはこれを含有する医薬組成物は、皮下に投与される。本明細書で使用する場合「皮下組織」という用語は、皮膚のすぐ下の疎性の不規則な結合組織の層として定義される。例えば皮下投与は、大腿部、腹部、臀部または肩甲骨部を含む領域内に組成物を注射することによって実施することができるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、抗Ｆｌｔ－１抗体もしくはその抗原結合断片、またはこれを含有する医薬組成物は、静脈内に投与される。いくつかの実施形態では、抗Ｆｌｔ－１抗体もしくはその抗原結合断片、またはこれを含有する医薬組成物は、経口投与される。所望する場合、２つ以上の経路を同時に使用することができる。
本明細書に記載の抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片（または本明細書に記載の抗Ｆｌｔ－１抗体もしくはその抗原結合断片を含有する組成物もしくは薬剤）は、任意の適切な経路によって投与される。いくつかの実施形態では、抗Ｆｌｔ－１抗体もしくは抗原結合断片タンパク質、またはこれを含有する医薬組成物は、非経口的に投与される。非経口投与は、静脈内投与、皮内投与、髄腔内投与、吸入投与、経皮（局所）投与、眼球内投与、筋肉内投与、皮下投与、筋肉内投与及び／または経粘膜投与であり得る。いくつかの実施形態では、抗Ｆｌｔ－１抗体もしくはその抗原結合断片、またはこれを含有する医薬組成物は、皮下に投与される。本明細書で使用する場合「皮下組織」という用語は、皮膚のすぐ下の疎性の不規則な結合組織の層として定義される。例えば皮下投与は、大腿部、腹部、臀部または肩甲骨部を含む領域内に組成物を注射することによって実施することができるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、抗Ｆｌｔ－１抗体もしくはその抗原結合断片、またはこれを含有する医薬組成物は、静脈内に投与される。いくつかの実施形態では、抗Ｆｌｔ－１抗体もしくはその抗原結合断片、またはこれを含有する医薬組成物は、経口投与される。所望する場合、２つ以上の経路を同時に使用することができる。
【0174】
いくつかの実施形態では、投与は個体に局所的効果のみをもたらすが、他の実施形態では、個体の複数の部分にわたる効果、例えば全身的効果をもたらす。通常投与は、心筋、横紋筋及び平滑筋を含む腎臓、肝臓、脳、脊髄、腸管、目、肺、脾臓、心臓を含む１つ以上の標的組織に、抗Ｆｌｔ－１抗体または抗原結合断片の送達をもたらすが、これらに限定されない。
【0175】
いくつかの実施形態では、横紋筋は、三頭筋、前脛骨、ヒラメ筋、腓腹筋、四頭筋及び横隔膜からなる群から選択される。
【0176】
いくつかの実施形態において、平滑筋は、血管、細気管支、膀胱及び直腸などの胃腸管の内側を覆っている筋肉である。
【0177】
投与形態及び投与レジメン
いくつかの実施形態では、組成物は、特定の所望の転帰に（例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィーなどの筋ジストロフィーを治療するまたはそのリスクを減少させることに）関連付けられている、治療に有効な量で及び／または投与レジメンに従って投与される。
いくつかの実施形態では、組成物は、特定の所望の転帰に（例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィーなどの筋ジストロフィーを治療するまたはそのリスクを減少させることに）関連付けられている、治療に有効な量で及び／または投与レジメンに従って投与される。
【0178】
本発明に従って投与される特定の投与量または量は、例えば所望の転帰の性質及び／または程度に、投与の経路及び／またはタイミングの詳細に、及び／または１つ以上の特性（例えば体重、年齢、既往歴、遺伝的特徴、生活習慣パラメータ、心臓欠陥の重症度及び／または心臓欠陥のリスクのレベルなど、またはこれらの組み合わせ）に依存して変化し得る。このような投与量または量は、当業者によって決定されることができる。いくつかの実施形態では、適切な投与量または量は標準臨床技術に従って決定される。代替的にまたは追加的に、いくつかの実施形態では、適切な投与量または量は、投与される望ましいまたは最適な投与量範囲または量を特定する助けとなるために、１つ以上のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏアッセイの使用により決定される。
【0179】
様々な実施形態では、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片は、治療に有効な量で投与される。一般的に治療に有効な量は、対象にとって意味のある効果（例えば、根底にある疾患または病態を治療すること、調節すること、治癒すること、予防すること及び／または緩和すること）を達成するのに十分である。いくつかの特定の実施形態では、投与される適切な投与量または量は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたは動物モデル試験系由来の用量反応曲線から推定され得る。
【0180】
いくつかの実施形態では、提供される組成物は、医薬製剤として提供される。いくつかの実施形態では、医薬製剤は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーなどの筋ジストロフィーの発生率またはリスクの低下の達成に相関性がある投与レジメンに従う投与のための単位用量の量である、またはその量を含む。
【0181】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗Ｆｌｔ－１抗体または抗原結合断片を含む製剤は、単回投与量として投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗Ｆｌｔ－１抗体または抗原結合断片を含む製剤は、規則的な間隔で投与される。本明細書で使用する場合「間隔」での投与は、治療に有効な量が定期的に（１回投与量とは区別されて）投与されることを示す。間隔は、標準臨床技術によって決定され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗Ｆｌｔ－１抗体または抗原結合断片を含む製剤は、隔月、毎月、月２回、３週間毎、隔週、毎週、週２回、週３回、毎日、１日２回、または６時間毎に投与される。１つの個体に対する投与間隔は、一定の間隔である必要はないが、個体の必要性に応じて時間経過とともに変更することができる。特定の実施形態において、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片は週２回投与される。
【0182】
本明細書で使用する場合「隔月」という用語は２か月につき１回（すなわち２か月毎に１回）の投与を意味し、用語「毎月」は１か月につき１回の投与を意味し、用語「３週間毎」は３週間につき１回（すなわち３週間毎に１回）の投与を意味し、用語「隔週」は２週間につき１回（すなわち２週間毎に１回）の投与を意味し、用語「毎週」は１週間につき１回の投与を意味し、用語「毎日」は１日につき１回の投与を意味する。
【0183】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗Ｆｌｔ－１抗体または抗原結合断片を含む製剤は、規則的な間隔で無期限に投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗Ｆｌｔ－１抗体または抗原結合断片を含む製剤は、規則的な間隔で所定の期間、投与される。
【0184】
本明細書に記載されるように「治療に有効な量」という用語は、本発明の医薬組成物に含有される治療剤の総量に基づいて主に決定される。治療に有効な量は一般に、複数の単位用量を含む投与レジメンで投与される。特定の組成物については、治療に有効な量（及び／または有効な投与レジメンの範囲内での適切な単位用量）は、例えば投与経路、他の医薬品との組み合わせに応じて変化し得る。
【0185】
いくつかの実施形態では、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片は、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇの範囲の投与量で投与される。他の実施形態において、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片は、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約３ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約１．０ｍｇ／ｋｇ～約４０ｍｇ／ｋｇ、約１．０ｍｇ／ｋｇ～約３０ｍｇ／ｋｇ、約１．０ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇ、約１．０ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約１．０ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約１．０ｍｇ／ｋｇ～約３ｍｇ／ｋｇの範囲の投与量で投与される。特定の実施形態では、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片は、約１．０ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇまたは約２０ｍｇ／ｋｇの投与量で投与される。
【0186】
いくつかの実施形態では、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片の投与は、少なくとも１つのＤＭＤの徴候もしくは症状の強度、重篤度もしくは頻度を低減する、またはその発症を遅延させる。いくつかの実施形態では、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片の投与は、筋消耗、骨格変形、心筋症、筋虚血、認知障害及び呼吸機能の障害からなる群から選択される、少なくとも１つのＤＭＤの徴候もしくは症状の強度、重篤度もしくは頻度を低減する、またはその発症を遅延させる。
【0187】
いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片の投与は、６分の歩行試験、定量的筋力試験、定期運動能力試験、Ｂｒｏｏｋｅ及びＶｉｇｎｏｓの肢機能スケール、肺機能試験（努力性肺活量、１秒間努力呼気容量、最大呼気流量、最大吸気圧及び最大呼気圧）、健康関連の生活の質、膝及び肘屈筋、肘伸筋、肩の外転、握力、仰向けからの起き上がり時間、Ｎｏｒｔｈ Ｓｔａｒｔ Ａｍｂｕｌａｔｏｒｙ評価、１０メートル歩行／走行計測、Ｅｇｅｎ－Ｋｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎスケール、Ｇｏｗｅｒｓスコア、Ｈａｍｍｅｒｓｍｉｔｈ運動能力、握力筋力、可動域、角度測定、過炭酸症、乳児及び幼児の発育のＮａｙｌｅｙスケール及び／または介護者負担スケールによって測定されるように、臨床転帰を改善する。
【0188】
併用療法
いくつかの実施形態では、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片は、１つ以上の追加の治療薬と組み合わせて投与される。一実施形態において、追加の治療薬はコルチコステロイド、例えばプレドニゾンである。別の実施形態では、追加の治療薬はグルココルチコイド、例えばデフラザコートである。別の実施形態では、追加の治療薬は、フォリスタチンまたはその組換えタンパク質である。別の実施形態では、追加の治療薬はＲＮＡ調節療法である。ＲＮＡ調節療法は、エキソンスキッピング療法または遺伝子治療であり得る。ＲＮＡ調節療法は、例えば、Ｄｒｉｓｐｅｒｓｅｎ、ＰＲＯ０４４、ＰＲＯ０４５、Ｅｔｅｐｌｉｒｓｅｎ（ＡＶＩ－４６５８）、ＳＲＰ－４０５３、ＳＲＰ－４０４５、ＳＲＰ－４０５０、ＳＲＰ－４０４４、ＳＲＰ－４０５２、ＳＲＰ－４０５５またはＳＲＰ－４００８であり得る。いくつかの実施形態において、追加の治療薬は現在、筋ジストロフィーの治療のために使用される。他の実施形態において、追加の治療薬は、他の疾患または障害を治療するためにも使用することができる。いくつかの実施形態では、既知の治療薬（複数可）は、その標準的なまたは承認された投与レジメン及び／またはスケジュールに従って投与される。いくつかの実施形態では、既知の治療薬（複数可）は、その標準的なまたは承認された投与レジメン及び／またはスケジュールと比較した場合、変更されているレジメンに従って投与される。いくつかの実施形態では、このような変更されたレジメンは、１つ以上の単位用量が量で変更されている（例えば、減少または増加されている）という点で、及び／または投与が頻度で変更されている点で（例えば、単位投与量間の１つ以上の間隔が広げられ、結果的により低い頻度をもたらす、または間隔が狭められ、結果的により高い頻度をもたらすという点で）、標準的なまたは承認された投与レジメンとは異なる。
いくつかの実施形態では、抗Ｆｌｔ－１抗体またはその抗原結合断片は、１つ以上の追加の治療薬と組み合わせて投与される。一実施形態において、追加の治療薬はコルチコステロイド、例えばプレドニゾンである。別の実施形態では、追加の治療薬はグルココルチコイド、例えばデフラザコートである。別の実施形態では、追加の治療薬は、フォリスタチンまたはその組換えタンパク質である。別の実施形態では、追加の治療薬はＲＮＡ調節療法である。ＲＮＡ調節療法は、エキソンスキッピング療法または遺伝子治療であり得る。ＲＮＡ調節療法は、例えば、Ｄｒｉｓｐｅｒｓｅｎ、ＰＲＯ０４４、ＰＲＯ０４５、Ｅｔｅｐｌｉｒｓｅｎ（ＡＶＩ－４６５８）、ＳＲＰ－４０５３、ＳＲＰ－４０４５、ＳＲＰ－４０５０、ＳＲＰ－４０４４、ＳＲＰ－４０５２、ＳＲＰ－４０５５またはＳＲＰ－４００８であり得る。いくつかの実施形態において、追加の治療薬は現在、筋ジストロフィーの治療のために使用される。他の実施形態において、追加の治療薬は、他の疾患または障害を治療するためにも使用することができる。いくつかの実施形態では、既知の治療薬（複数可）は、その標準的なまたは承認された投与レジメン及び／またはスケジュールに従って投与される。いくつかの実施形態では、既知の治療薬（複数可）は、その標準的なまたは承認された投与レジメン及び／またはスケジュールと比較した場合、変更されているレジメンに従って投与される。いくつかの実施形態では、このような変更されたレジメンは、１つ以上の単位用量が量で変更されている（例えば、減少または増加されている）という点で、及び／または投与が頻度で変更されている点で（例えば、単位投与量間の１つ以上の間隔が広げられ、結果的により低い頻度をもたらす、または間隔が狭められ、結果的により高い頻度をもたらすという点で）、標準的なまたは承認された投与レジメンとは異なる。
【実施例】
【0189】
実施例１。高親和性抗Ｆｌｔ－１抗体の生成及び特性評価
抗体の生成
モノクローナル抗体は、ラマモノクローナル抗体方法を用いた可溶性Ｆｌｔ－１に対して作成された。簡潔に説明すると、ラマは組換えヒト可溶性Ｆｌｔ－１（ＡＢＣＡＭから購入）により免疫感作して、血清を収集した。
抗体の生成
モノクローナル抗体は、ラマモノクローナル抗体方法を用いた可溶性Ｆｌｔ－１に対して作成された。簡潔に説明すると、ラマは組換えヒト可溶性Ｆｌｔ－１（ＡＢＣＡＭから購入）により免疫感作して、血清を収集した。
【0190】
抗体の特性評価
ヒト及びマウスＦｌｔ－１と結合した抗体は、１）ＶＨファミリー、２）Ｆｌｔ－１に対する親和性、３）ＩＣ５０、４）Ｂｉａｃｏｒｅアッセイによる解離速度スクリーニング、５）カニクイザルＦｌｔ－１に対する交差反応性、及び６）ＶＥＧＦ Ｒ２及びＶＥＧＦ Ｒ３への結合について更に特性決定した。ヒトＦｌｔ－１（ｈＦｌ－１）及びマウスＦｌｔ－１（ｍＦｌｔ－１）に対する候補抗体は、表４に示すように特性評価された。
ヒト及びマウスＦｌｔ－１と結合した抗体は、１）ＶＨファミリー、２）Ｆｌｔ－１に対する親和性、３）ＩＣ５０、４）Ｂｉａｃｏｒｅアッセイによる解離速度スクリーニング、５）カニクイザルＦｌｔ－１に対する交差反応性、及び６）ＶＥＧＦ Ｒ２及びＶＥＧＦ Ｒ３への結合について更に特性決定した。ヒトＦｌｔ－１（ｈＦｌ－１）及びマウスＦｌｔ－１（ｍＦｌｔ－１）に対する候補抗体は、表４に示すように特性評価された。
【表4】
【0191】
抗体１３Ｂ４及び１０Ｇ１２の薬物動態学的特性は、各抗体１０ｍｇ／ｋｇの静脈内投与によりマウスで試験した（表５）。データは抗体１０Ｇ１２が２８８時間過ぎても検出できず、その一方で抗体１３Ｂ４は６７２時間で検出できることを示した（図１Ａ～図１Ｂ）。
【表5】
【0192】
抗体のｉｎ ｖｉｖｏ有効性
Ｍｄｘマウス（すなわち、デュシェンヌ型筋ジストロフィーのマウスモデル）を、生後４週間から開始して、週２回１か月間、静脈内投与によって抗体１３Ｂ４または抗体１０Ｇ１２のいずれか２０ｍｇ／ｋｇで処置した。対照マウスは、溶媒のみ、Ｆｌｔ－１と結合しないアイソタイプ対照抗体だけ、またはＦｌｔ－１として既知の市販の抗Ｆｌｔ－１抗体：ＶＥＧＦアンタゴニスト（Ａｎｇｉｏ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｅ、カタログ番号ＡＰ－ＭＡＢ０７０２）で処置した。最低曝露点で血清中抗体濃度を評価するために、５回目の静脈内投与の４日後に血液を収集した。最大曝露点で血清中抗体濃度を評価するために、最後の投与の２４時間後に血液を収集した。抗体１３Ｂ４及び１０Ｇ１２の最高及び最低濃度を、図２Ａ及び図２Ｂに示す。血液中の遊離抗体１３Ｂ４及び遊離抗体１０Ｇ１２の濃度は、最大及び最低曝露時点の両方で、アイソタイプ対照抗体及び市販の対照抗体より高かった。
Ｍｄｘマウス（すなわち、デュシェンヌ型筋ジストロフィーのマウスモデル）を、生後４週間から開始して、週２回１か月間、静脈内投与によって抗体１３Ｂ４または抗体１０Ｇ１２のいずれか２０ｍｇ／ｋｇで処置した。対照マウスは、溶媒のみ、Ｆｌｔ－１と結合しないアイソタイプ対照抗体だけ、またはＦｌｔ－１として既知の市販の抗Ｆｌｔ－１抗体：ＶＥＧＦアンタゴニスト（Ａｎｇｉｏ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｅ、カタログ番号ＡＰ－ＭＡＢ０７０２）で処置した。最低曝露点で血清中抗体濃度を評価するために、５回目の静脈内投与の４日後に血液を収集した。最大曝露点で血清中抗体濃度を評価するために、最後の投与の２４時間後に血液を収集した。抗体１３Ｂ４及び１０Ｇ１２の最高及び最低濃度を、図２Ａ及び図２Ｂに示す。血液中の遊離抗体１３Ｂ４及び遊離抗体１０Ｇ１２の濃度は、最大及び最低曝露時点の両方で、アイソタイプ対照抗体及び市販の対照抗体より高かった。
【0193】
血清中遊離ｓＦｌｔ－１濃度及びＶＥＧＦ濃度を評価するために、５回目の静脈内投与後の２４時間後及び屠殺前に、血液を収集した。抗体１３Ｂ４及び抗体１０Ｇ１２、ならびに市販の対照抗体の投与は、アイソタイプ対照抗体と比較して、ｓＦｌｔ－１の血清中濃度を著しく低下させた（ｐ＜０．０００１）（図３）。抗体１３Ｂ４及び抗体１０Ｇ１２の投与は、アイソタイプ対照抗体と比較して、ＶＥＧＦの血清中濃度を著しく増加させた（ｐ＜０．００１）（図４）。市販の対照抗体の投与も、アイソタイプ対照抗体と比較して、ＶＥＧＦの血中濃度を著しく増加させた（ｐ＜０．０５）（図４）。
【0194】
組織病理学的検査
マウスは３０日の処置期間の終了時に屠殺され、横隔膜筋及び前脛骨（ＴＡ）筋を収集して、抗Ｆｌｔ－１抗体が骨格筋の血管新生を誘発したか判定するために切断した。筋肉切片を内皮細胞マーカーＣＤ３１で染色した。毛細血管密度の著しい増大は、アイソタイプ対照抗体で処置したマウスの横隔膜と比較して、抗体１３Ｂ４、１０Ｇ１２または市販の対照抗体で処置したマウスの横隔膜で見られた（図５Ａ～図５Ｄ）。データは、図６Ａ～図６Ｂに示すように自動定量的イメージングソフトウェアを使用して定量化された。アイソタイプ対照抗体で処置したマウスの横隔膜と比較して、市販の対照抗体（ｐ＜０．０５）、抗体１３Ｂ４（ｐ＜０．０１）及び抗体１０Ｇ１２（ｐ＜０．０００１）で処置したマウスの横隔膜のＣＤ３１陽性領域で著しい増大が見られた。アイソタイプ対照抗体で処置したマウスの前脛骨筋と比較して、抗体１０Ｇ１２（ｐ＜０．０１）で処置したマウスの前脛骨（ＴＡ）筋のＣＤ３１陽性領域での著しい増大も、示された。
マウスは３０日の処置期間の終了時に屠殺され、横隔膜筋及び前脛骨（ＴＡ）筋を収集して、抗Ｆｌｔ－１抗体が骨格筋の血管新生を誘発したか判定するために切断した。筋肉切片を内皮細胞マーカーＣＤ３１で染色した。毛細血管密度の著しい増大は、アイソタイプ対照抗体で処置したマウスの横隔膜と比較して、抗体１３Ｂ４、１０Ｇ１２または市販の対照抗体で処置したマウスの横隔膜で見られた（図５Ａ～図５Ｄ）。データは、図６Ａ～図６Ｂに示すように自動定量的イメージングソフトウェアを使用して定量化された。アイソタイプ対照抗体で処置したマウスの横隔膜と比較して、市販の対照抗体（ｐ＜０．０５）、抗体１３Ｂ４（ｐ＜０．０１）及び抗体１０Ｇ１２（ｐ＜０．０００１）で処置したマウスの横隔膜のＣＤ３１陽性領域で著しい増大が見られた。アイソタイプ対照抗体で処置したマウスの前脛骨筋と比較して、抗体１０Ｇ１２（ｐ＜０．０１）で処置したマウスの前脛骨（ＴＡ）筋のＣＤ３１陽性領域での著しい増大も、示された。
【0195】
ｍｄｘマウスに対するＦｌｔ－１抗体（例えば１０Ｇ１２及び１３Ｂ４）の投与が、内皮細胞増殖の著しい増加、ならびに血清中可溶性Ｆｌｔ－１の減少及び血清中ＶＥＧＦ濃度の増加になることを、この実験は示した。これらの抗体は、ｐＭ範囲のＦｌｔ－１標的における結合親和性（表４を参照）、１００ｐＭ未満のＦｌｔ－１結合におけるＩＣ５０（表４を参照）、及びバイオアッセイのＶＥＧＦシグナル伝達の５０％超の救済を示した。
【0196】
実施例２。高親和性抗Ｆｌｔ－１抗体の生成及び特性評価
追加の抗Ｆｌｔ－１モノクローナル抗体は、上述のとおり作製された。これらの抗体は、ｓＦｌｔ－１抗原に対する結合親和性（ＥＬＩＳＡ及びＢｉａｃｏｒｅによって）、ｓＦｌｔ－ｌ：ＶＥＧＦ競合ＥＬＩＳＡにおけるＶＥＧＦについての競合、及び細胞系アッセイでの性能を更に特性評価した。
追加の抗Ｆｌｔ－１モノクローナル抗体は、上述のとおり作製された。これらの抗体は、ｓＦｌｔ－１抗原に対する結合親和性（ＥＬＩＳＡ及びＢｉａｃｏｒｅによって）、ｓＦｌｔ－ｌ：ＶＥＧＦ競合ＥＬＩＳＡにおけるＶＥＧＦについての競合、及び細胞系アッセイでの性能を更に特性評価した。
【0197】
抗体の特性評価－標的との結合
モノクローナル抗Ｆｌｔ－１抗体を、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて組換えｓＦｌｔ－１抗原との結合について分析した（図７）。すべての抗体は、結合において投与量依存的な増加を示した。マウス及びヒトＦｌｔ－１抗原に対する抗Ｆｌｔ－１抗体の結合親和性は、表面プラズモン共鳴方法論（すなわち、Ｂｉａｃｏｒｅ）で測定した（表６）。抗体は、ナノモル範囲でヒトＦｌｔ－１と結合し、抗体１１Ａ１１がヒトＦｌｔ－１に対して最も高い結合親和性を示した。抗体がＶＥＧＦ Ｒ２またはＶＥＧＦ Ｒ３と交差反応しなかった（表６）が、すべての抗体はカニクイザルＦｌｔ－１と交差反応したことも、Ｂｉａｃｏｒｅ分析は示した。
モノクローナル抗Ｆｌｔ－１抗体を、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて組換えｓＦｌｔ－１抗原との結合について分析した（図７）。すべての抗体は、結合において投与量依存的な増加を示した。マウス及びヒトＦｌｔ－１抗原に対する抗Ｆｌｔ－１抗体の結合親和性は、表面プラズモン共鳴方法論（すなわち、Ｂｉａｃｏｒｅ）で測定した（表６）。抗体は、ナノモル範囲でヒトＦｌｔ－１と結合し、抗体１１Ａ１１がヒトＦｌｔ－１に対して最も高い結合親和性を示した。抗体がＶＥＧＦ Ｒ２またはＶＥＧＦ Ｒ３と交差反応しなかった（表６）が、すべての抗体はカニクイザルＦｌｔ－１と交差反応したことも、Ｂｉａｃｏｒｅ分析は示した。
【表6】
【0198】
抗体の特性評価－競合作用／拮抗作用
抗体の効力を推定するために、抗体を、ヒトｓＦｌｔ－１及びＶＥＧＦを用いた競合ＥＬＩＳＡで分析した。試験した抗体濃度は、０．１ｍｇ／ｍＬ～１０，０００ｎｇ／ｍＬの範囲であった。市販の抗Ｆｌｔ－１抗体を、対照として使用した。１１Ａ１１を除き、すべての抗体は、ｓＦｌｔ－１へのＶＥＧＦの結合を阻止することができた（図８）。
抗体の効力を推定するために、抗体を、ヒトｓＦｌｔ－１及びＶＥＧＦを用いた競合ＥＬＩＳＡで分析した。試験した抗体濃度は、０．１ｍｇ／ｍＬ～１０，０００ｎｇ／ｍＬの範囲であった。市販の抗Ｆｌｔ－１抗体を、対照として使用した。１１Ａ１１を除き、すべての抗体は、ｓＦｌｔ－１へのＶＥＧＦの結合を阻止することができた（図８）。
【0199】
抗体の特性評価－細胞系アッセイ
ヒト主要静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）は、ｓＦｌｔ－１及びモノクローナル抗体０２Ｇ０７、１１Ａ１１及び１３Ｂ４の存在下で、ＶＥＧＦによって刺激された。細胞のＶＥＧＦ誘発性活性化は、ＶＥＧＦ Ｒ２受容体のリン酸化状態を判定することによって試験した。データは、ｓＦｌｔ－１のみの存在下で（例えば、抗Ｆｌｔ－１抗体なしで）、ＶＥＧＦ Ｒ２受容体のリン酸化に対して、ＶＥＧＦ Ｒ２受容体のリン酸化の救済％として表した。モノクローナル抗体は、可溶性Ｆｌｔ－１に拮抗することにより、細胞の活性化（すなわちリン酸化）を救済した。
ヒト主要静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）は、ｓＦｌｔ－１及びモノクローナル抗体０２Ｇ０７、１１Ａ１１及び１３Ｂ４の存在下で、ＶＥＧＦによって刺激された。細胞のＶＥＧＦ誘発性活性化は、ＶＥＧＦ Ｒ２受容体のリン酸化状態を判定することによって試験した。データは、ｓＦｌｔ－１のみの存在下で（例えば、抗Ｆｌｔ－１抗体なしで）、ＶＥＧＦ Ｒ２受容体のリン酸化に対して、ＶＥＧＦ Ｒ２受容体のリン酸化の救済％として表した。モノクローナル抗体は、可溶性Ｆｌｔ－１に拮抗することにより、細胞の活性化（すなわちリン酸化）を救済した。
【0200】
実施例３。軽鎖シャッフルによって生成した、高親和性抗Ｆｌｔ－１抗体の特性評価
実施例２に記載の抗体１８Ｂ６、１１Ａ１１及び１３Ｂ４の軽鎖シャッフルを、候補抗体の親和性及び効力を増加させるために実施した。
実施例２に記載の抗体１８Ｂ６、１１Ａ１１及び１３Ｂ４の軽鎖シャッフルを、候補抗体の親和性及び効力を増加させるために実施した。
【0201】
抗体の特性評価－標的との結合
得られた抗体は、Ｆｌｔ－１抗原に対する増大した親和性を示した。例えば抗体２１Ｃ６のＫＤは、親抗体１１Ａ１１より約１０倍増加した。同様に抗体２１Ｂ３のＫＤは、親抗体１３Ｂ４より約５倍増加した（表７）。
得られた抗体は、Ｆｌｔ－１抗原に対する増大した親和性を示した。例えば抗体２１Ｃ６のＫＤは、親抗体１１Ａ１１より約１０倍増加した。同様に抗体２１Ｂ３のＫＤは、親抗体１３Ｂ４より約５倍増加した（表７）。
【表7】
【0202】
抗体の特性評価－競合作用／拮抗作用
軽鎖シャッフル後、抗体の効力を推定するために、抗体を、ヒトｓＦｌｔ－１及びＶＥＧＦを用いた競合ＥＬＩＳＡで分析した。試験した抗体濃度は、０．２ｍｇ／ｍＬ～２００ｎｇ／ｍＬの範囲であった。ｓＦｌｔ－１に競合的に結合する親抗体１３Ｂ４の能力を、軽鎖シャッフルによって生成した抗体のものと比較した。すべての抗体は、最も有効な競合者であるクローン２１Ｂ３によるヒトｓＦｌｔ－１へのＶＥＧＦの結合の用量依存的な阻害を示した（図１０）。
軽鎖シャッフル後、抗体の効力を推定するために、抗体を、ヒトｓＦｌｔ－１及びＶＥＧＦを用いた競合ＥＬＩＳＡで分析した。試験した抗体濃度は、０．２ｍｇ／ｍＬ～２００ｎｇ／ｍＬの範囲であった。ｓＦｌｔ－１に競合的に結合する親抗体１３Ｂ４の能力を、軽鎖シャッフルによって生成した抗体のものと比較した。すべての抗体は、最も有効な競合者であるクローン２１Ｂ３によるヒトｓＦｌｔ－１へのＶＥＧＦの結合の用量依存的な阻害を示した（図１０）。
【0203】
ｉｎ ｖｉｖｏ有効性
軽鎖シャッフルした抗体の血清半減期及び薬物動態学的特性を判定するために、それぞれＩ１２５で標識した、軽鎖シャッフルした抗体２７Ｈ９及び２１Ｂ３ならびに親抗体１３Ｂ４の単回投与量１０ｍｇ／ｋｇをマウスに投与した。血清を０．０８３、０．２５、０．５、１、４、８及び２４時間、ならびに３、５、７、１４、２１及び２８日目に収集して、抗体の血清中濃度を確定した。血清半減期は、親抗体と比較して、軽鎖シャッフルした抗体で減少した（図１１）。しかし軽鎖シャッフルした抗体は、親と比較して、改善した薬力学的特性を示した。例えば抗体２７Ｈ９は、０．０８３時間で最大濃度２２２．４μｇ／ｍＬに達したのに対して、親抗体１３Ｂ４は０．５時間で最大濃度２１７μｇ／ｍＬに達した（表８）。
軽鎖シャッフルした抗体の血清半減期及び薬物動態学的特性を判定するために、それぞれＩ１２５で標識した、軽鎖シャッフルした抗体２７Ｈ９及び２１Ｂ３ならびに親抗体１３Ｂ４の単回投与量１０ｍｇ／ｋｇをマウスに投与した。血清を０．０８３、０．２５、０．５、１、４、８及び２４時間、ならびに３、５、７、１４、２１及び２８日目に収集して、抗体の血清中濃度を確定した。血清半減期は、親抗体と比較して、軽鎖シャッフルした抗体で減少した（図１１）。しかし軽鎖シャッフルした抗体は、親と比較して、改善した薬力学的特性を示した。例えば抗体２７Ｈ９は、０．０８３時間で最大濃度２２２．４μｇ／ｍＬに達したのに対して、親抗体１３Ｂ４は０．５時間で最大濃度２１７μｇ／ｍＬに達した（表８）。
【表8】
【0204】
組織病理学的検査
軽鎖がシャッフルされたか、及び親抗体が内皮細胞増殖を誘発できるか判定するために、ｍｄｘマウスを、静脈内投与によって４週間隔週で２０ｍｇ／ｋｇの抗体で処置した。マウスは処置期間の終了時に屠殺され、横隔膜筋及び前脛骨筋を収集して、抗体が骨格筋の血管新生を誘発したか判定するために切断した。筋肉切片を内皮細胞マーカーＣＤ３１で染色した。横隔膜の毛細血管密度の著しい増大は、アイソタイプ対照抗体で処置したマウスの横隔膜と比較して、抗体１３Ｂ４及び２１Ｂ３で処置したマウスで見られた（図１２Ａ～図１２Ｃ）。更に、アイソタイプ対照抗体で処置したマウスの前脛骨筋と比較して、軽鎖シャッフルした抗体２１Ｂ３で処置したマウスの前脛骨筋の毛細血管密度の著しい増大もあった（図１２Ｄ～図１２Ｆ）。
軽鎖がシャッフルされたか、及び親抗体が内皮細胞増殖を誘発できるか判定するために、ｍｄｘマウスを、静脈内投与によって４週間隔週で２０ｍｇ／ｋｇの抗体で処置した。マウスは処置期間の終了時に屠殺され、横隔膜筋及び前脛骨筋を収集して、抗体が骨格筋の血管新生を誘発したか判定するために切断した。筋肉切片を内皮細胞マーカーＣＤ３１で染色した。横隔膜の毛細血管密度の著しい増大は、アイソタイプ対照抗体で処置したマウスの横隔膜と比較して、抗体１３Ｂ４及び２１Ｂ３で処置したマウスで見られた（図１２Ａ～図１２Ｃ）。更に、アイソタイプ対照抗体で処置したマウスの前脛骨筋と比較して、軽鎖シャッフルした抗体２１Ｂ３で処置したマウスの前脛骨筋の毛細血管密度の著しい増大もあった（図１２Ｄ～図１２Ｆ）。
【0205】
横隔膜、脛骨及び腓腹筋における抗体２７Ｈ９、１３Ｂ４ならびに２１Ｂ３の体内分布を、１２５Ｉで標識した抗体を使用して判定した。横隔膜は、経時的にすべての抗体において最も高い曝露を示した（図１３Ａ～図１３Ｃ）。
【0206】
ｍｄｘマウスに対するＦｌｔ－１抗体（すなわち１３Ｂ４及び２１Ｂ３）の投与が、内皮細胞増殖の著しい増加になることを、これらの実験は示した。
【0207】
実施例４。高親和性抗Ｆｌｔ－１抗体２１Ｂ３のｉｎ ｖｉｖｏ有効性
Ｍｄｘマウスを、生後４週間から開始して、週２回１か月間、静脈内投与によって抗体２１Ｂ３の１、３、１０もしくは２０ｍｇ／ｋｇ、またはアイソタイプ対照抗体の２０ｍｇ／ｋｇで処置した。最低曝露点で血清中抗体濃度を評価するために、５回目の静脈内投与の４日後に血液を収集した。最大曝露点で血液中抗体濃度を評価するために、最後の投与の２４時間後に血液を収集した。抗体２１Ｂ３及びアイソタイプ対照抗体の最高及び最低血清中濃度を、図１４Ａ及び図１４Ｂに示す。抗体２１Ｂ３の最大及び最低濃度は用量依存的であり、アイソタイプ対照抗体より高かった。
Ｍｄｘマウスを、生後４週間から開始して、週２回１か月間、静脈内投与によって抗体２１Ｂ３の１、３、１０もしくは２０ｍｇ／ｋｇ、またはアイソタイプ対照抗体の２０ｍｇ／ｋｇで処置した。最低曝露点で血清中抗体濃度を評価するために、５回目の静脈内投与の４日後に血液を収集した。最大曝露点で血液中抗体濃度を評価するために、最後の投与の２４時間後に血液を収集した。抗体２１Ｂ３及びアイソタイプ対照抗体の最高及び最低血清中濃度を、図１４Ａ及び図１４Ｂに示す。抗体２１Ｂ３の最大及び最低濃度は用量依存的であり、アイソタイプ対照抗体より高かった。
【0208】
遊離ｓＦｌｔ－１の血清中濃度を評価するために、血液を、０、１４及び２８日目に収集した。抗体２１Ｂ３の投与は、血清中遊離ｓＦｌｔ－１濃度の用量依存的減少を誘発した。前記反応は、１４日目及び２８日目の両方で見られるように、１０及び２０ｍｇ／ｋｇの用量でより持続的だった。しかし統計学的に有意な減少は、溶媒のみで処置したマウスの遊離ｓＦｌｔ－１と比較して、３、１０及び２０ｍｇ／ｋｇの投与量での遊離ｓＦｌｔ－１濃度で観察された（図１５）。
【0209】
ＶＥＧＦの血清中濃度を評価するために、血液を、０、１４及び２８日目に収集した。抗体２１Ｂ３の投与は、血清中ＶＥＧＦ濃度の用量依存的増加を誘発した。遊離ｓＦｌｔ－１について観察されたように、前記反応は、１０及び２０ｍｇ／ｋｇの用量で、ならびに１４日目及び２８日目の両方でより持続的だった。事実、血清中ＶＥＧＦの統計学的に有意な増加は、溶媒のみで処置したマウスの血清中ＶＥＧＦ濃度と比較して、抗体２１Ｂ３の１０及び２０ｍｇ／ｋｇの投与量で観察された（図１６）。
【0210】
組織病理学的検査
マウスは３０日の処置期間の終了時に屠殺され、横隔膜筋及び前脛骨筋を収集して、抗Ｆｌｔ－１抗体が骨格筋の血管新生を誘発したか判定するために切断した。筋肉切片を内皮細胞マーカーＣＤ３１で染色した。抗体２１Ｂ３で処置したマウスの横隔膜筋の毛細血管密度の著しい増大は、アイソタイプ対照抗体で処置したマウスの横隔膜筋の毛細血管密度と比較して、見られた（図１７Ａ～図１７Ｅ）。データは、図１８に示すように自動定量的イメージングソフトウェアを使用して定量化された。アイソタイプ対照抗体で処置したマウスの横隔膜のＣＤ３１陽性領域と比較して、１０ｍｇ／ｋｇまたは２０ｍｇ／ｋｇ（ｐ＜０．０００１）で処置したマウスの横隔膜筋のＣＤ３１陽性領域で著しい増大があった。
マウスは３０日の処置期間の終了時に屠殺され、横隔膜筋及び前脛骨筋を収集して、抗Ｆｌｔ－１抗体が骨格筋の血管新生を誘発したか判定するために切断した。筋肉切片を内皮細胞マーカーＣＤ３１で染色した。抗体２１Ｂ３で処置したマウスの横隔膜筋の毛細血管密度の著しい増大は、アイソタイプ対照抗体で処置したマウスの横隔膜筋の毛細血管密度と比較して、見られた（図１７Ａ～図１７Ｅ）。データは、図１８に示すように自動定量的イメージングソフトウェアを使用して定量化された。アイソタイプ対照抗体で処置したマウスの横隔膜のＣＤ３１陽性領域と比較して、１０ｍｇ／ｋｇまたは２０ｍｇ／ｋｇ（ｐ＜０．０００１）で処置したマウスの横隔膜筋のＣＤ３１陽性領域で著しい増大があった。
【0211】
前脛骨筋の毛細血管密度の著しい増大も、アイソタイプ対照抗体で処置したマウスの前脛骨筋と比較して、抗体２１Ｂ３で処置したマウスで見られた（図１９Ａ～図１９Ｅ）。データは、図２０に示すように自動定量的イメージングソフトウェアを使用して定量化された。アイソタイプ対照抗体で処置したマウスの前脛骨筋のＣＤ３１陽性領域と比較して、１０ｍｇ／ｋｇまたは２０ｍｇ／ｋｇ（ｐ＜０．０００１）で処置したマウスの前脛骨筋のＣＤ３１陽性領域で著しい増大があった。
【0212】
ＲＰ－ＬＣ／ＭＳ特性評価
脱グリコシルした２１Ｂ３抗体の分子量を、逆相液体クロマトグラフィー／質量分析（ＲＰ－ＬＣ／ＭＳ）によって測定した（図２１Ａ）。還元反応の後、軽鎖及び重鎖の分子量を測定した。重鎖のグリコシル化パターンも測定した（図２１Ｂ）。
脱グリコシルした２１Ｂ３抗体の分子量を、逆相液体クロマトグラフィー／質量分析（ＲＰ－ＬＣ／ＭＳ）によって測定した（図２１Ａ）。還元反応の後、軽鎖及び重鎖の分子量を測定した。重鎖のグリコシル化パターンも測定した（図２１Ｂ）。
【0213】
ｍｄｘマウスに対するＦｌｔ－１抗体（すなわち２１Ｂ３）の投与が、内皮細胞増殖の著しい増加、ならびに血清中可溶性Ｆｌｔ－１の減少及び血清中ＶＥＧＦ濃度の増加になることを、これらの結果は示した。
【0214】
実施例５。ヒト化高親和性抗Ｆｌｔ－１抗体の特性評価
実施例３に記載されている軽鎖シャッフルした抗体を、ＣＤＲ領域及びまたはＦｃエフェクター領域に配列変異を導入するために更に改質した。これらの抗体を、結合特性を判定するために表面プラズモン共鳴方法（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ）により評価した（表９）。抗体２７Ｈ９ ＮＧ／ＮＡ ＡＡＡは、Ｆｌｔ－１に対する約２倍の減少した結合親和性を示した。
実施例３に記載されている軽鎖シャッフルした抗体を、ＣＤＲ領域及びまたはＦｃエフェクター領域に配列変異を導入するために更に改質した。これらの抗体を、結合特性を判定するために表面プラズモン共鳴方法（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ）により評価した（表９）。抗体２７Ｈ９ ＮＧ／ＮＡ ＡＡＡは、Ｆｌｔ－１に対する約２倍の減少した結合親和性を示した。
【表9-1】
【表9-2】
【0215】
抗体を、ｓＦｌｔ－１に拮抗することにより細胞活性化を救済する能力についても、細胞系アッセイで評価した。ヒト主要静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）は、ｓＦｌｔ－１及びモノクローナル抗体の存在下で、ＶＥＧＦによって刺激された。細胞のＶＥＧＦ誘発性活性化は、ＶＥＧＦ Ｒ２受容体のリン酸化状態を判定することによって試験した。モノクローナル抗体は、可溶性Ｆｌｔ－１に拮抗することにより、細胞の活性化（すなわちリン酸化）を救済し（図２２Ａ）、及び抗体２７Ｈ９ ＮＧ／ＮＡ ＡＡＡ（ＮＡ＋ＡＡＡ）は、非変異の親抗体（ｗｔ）と比較して同等の能力を有した。
【0216】
実施例６。抗体最適化
最も近いヒトＶＨ及びＶＬ生殖細胞系配列を同定し、ならびにフレームワーク領域内の異なる残基及びＣＤＲ内の酸化／異性化部位を同定するために、候補抗体を分析した。ヒト及び野生型残基を含有するＦａｂライブラリが構築されて、ヒト定常ドメインに融合した。Ｆａｂを同一または親抗体（２１Ｂ３）より高い解離速度（すなわち、親和性を失わない）と識別するために、ファージディスプレイを適用した。所望の解離速度を有するＦａｂを配列決定して、ヒト生殖系配列と比較し、最も高い同一性（例えば、ＶＨ＋ＶＬ同一性＞９５％）及び相同性（例えば、相同性＞９６％）を有するものを、ヒトモノクローナル抗体への転換のために選択した。Ｆａｂは、不必要なアミノ酸についても分析される。表１０は、最高９７．６％のヒト同一性及び９８．８％の相同性を有するいくつかのクローンとのヒト同一性パーセントによって順位付けしたＦａｂを提供する。
最も近いヒトＶＨ及びＶＬ生殖細胞系配列を同定し、ならびにフレームワーク領域内の異なる残基及びＣＤＲ内の酸化／異性化部位を同定するために、候補抗体を分析した。ヒト及び野生型残基を含有するＦａｂライブラリが構築されて、ヒト定常ドメインに融合した。Ｆａｂを同一または親抗体（２１Ｂ３）より高い解離速度（すなわち、親和性を失わない）と識別するために、ファージディスプレイを適用した。所望の解離速度を有するＦａｂを配列決定して、ヒト生殖系配列と比較し、最も高い同一性（例えば、ＶＨ＋ＶＬ同一性＞９５％）及び相同性（例えば、相同性＞９６％）を有するものを、ヒトモノクローナル抗体への転換のために選択した。Ｆａｂは、不必要なアミノ酸についても分析される。表１０は、最高９７．６％のヒト同一性及び９８．８％の相同性を有するいくつかのクローンとのヒト同一性パーセントによって順位付けしたＦａｂを提供する。
【表10】
【0217】
実施例７。抗Ｆｌｔ－１モノクローナル抗体の特性評価
モノクローナル抗体の熱耐性を、Ｂｉａｃｏｒｅ方法を使用して分析した。１００μｇ／ｍＬの濃度で、各モノクローナル抗体を、異なる温度にてリン酸緩衝生理食塩水中で１時間インキュベートした。１時間のインキュベート後、抗体をゆっくり２時間かけて２５℃に冷却して、それから４℃にて一晩インキュベートした。それから機能性抗体の割合を、ＢｉｏｃｏｒｅによってヒトＦｌｔ－１への結合を判定することで測定した（表１１を参照）。野生型抗体における熱耐性は、以前の実験と一致した。しかし、２７Ｈ６ ＤＧ／ＤＡクローンを除いて、ＶＨまたはＶＬ領域の突然変異は、約２℃融解温度を低下させた。Ｆｃ領域のＡＡＡ突然変異は、抗体の熱耐性に影響を及ぼさなかった。
モノクローナル抗体の熱耐性を、Ｂｉａｃｏｒｅ方法を使用して分析した。１００μｇ／ｍＬの濃度で、各モノクローナル抗体を、異なる温度にてリン酸緩衝生理食塩水中で１時間インキュベートした。１時間のインキュベート後、抗体をゆっくり２時間かけて２５℃に冷却して、それから４℃にて一晩インキュベートした。それから機能性抗体の割合を、ＢｉｏｃｏｒｅによってヒトＦｌｔ－１への結合を判定することで測定した（表１１を参照）。野生型抗体における熱耐性は、以前の実験と一致した。しかし、２７Ｈ６ ＤＧ／ＤＡクローンを除いて、ＶＨまたはＶＬ領域の突然変異は、約２℃融解温度を低下させた。Ｆｃ領域のＡＡＡ突然変異は、抗体の熱耐性に影響を及ぼさなかった。
【表11-1】
【表11-2】
【0218】
ヒト化クローンの結合親和性をＢｉａｃｏｒｅにて分析した（表１２）。ＶＥＧＦ：ｓＦｌｔ－１細胞系アッセイのＶＥＧＦシグナル伝達を救済する能力を、抗体２７Ｈ４、２７Ｈ６及び２７Ｈ９について測定した（図２２Ｂ）。簡潔に言うと、ヒト主要静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）は、ｓＦｌｔ－１及びモノクローナル抗体２７Ｈ４、２７Ｈ６及び２７Ｈ９の存在下で、ＶＥＧＦによって刺激された。細胞のＶＥＧＦ誘発性活性化は、ＶＥＧＦ Ｒ２受容体のリン酸化状態を判定することによって試験した。データは、ｓＦｌｔ－１のみの存在下で（例えば、抗Ｆｌｔ－１抗体なしで）、ＶＥＧＦ Ｒ２受容体のリン酸化に対して、ＶＥＧＦ Ｒ２受容体のリン酸化の救済％として表した。ＶＥＧＦ及びｓＦｌｔ－１の結合に拮抗する能力（図２３）は、ＥＬＩＳＡによって抗体２７Ｈ４、２７Ｈ６及び２７Ｈ９について測定された。
【表12】
【0219】
実施例８。筋病理における抗Ｆｌｔ－１抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ試験
Ｍｄｘマウスを、生後３週間から開始して、週２回６または１２週間、静脈内投与によって抗Ｆｌｔ－１抗体２１Ｂ３の１、３、１０もしくは１０ｍｇ／ｋｇ、またはＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体の１０ｍｇ／ｋｇで処置した。
Ｍｄｘマウスを、生後３週間から開始して、週２回６または１２週間、静脈内投与によって抗Ｆｌｔ－１抗体２１Ｂ３の１、３、１０もしくは１０ｍｇ／ｋｇ、またはＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体の１０ｍｇ／ｋｇで処置した。
【0220】
遊離抗体濃度の血清中レベルを評価するために、２、４、７及び１０週目の静脈内投与の４日後に、血液をマウスから収集した。屠殺試料は、最後の投与の２４時間後に収集した（図２４）。１０ｍｇ／ｋｇの投与量で、アイソタイプ対照抗体を投与したマウスの遊離抗体の血清中濃度と比較して、遊離抗体の血清中濃度の統計学的な有意差がすべての時点であった。３ｍｇ／ｋｇの投与量で、アイソタイプ対照抗体を投与したマウスの遊離抗体の血清中濃度と比較して、遊離抗体の血清中濃度の統計学的な有意差が４、７及び１０週目ならびに屠殺時点であった。１ｍｇ／ｋｇの投与量で、アイソタイプ対照抗体を投与したマウスの遊離抗体の血清中濃度と比較して、遊離抗体の血清中濃度の統計学的な有意差が屠殺時点であった。
【0221】
遊離ｓＦｌｔ－１の血清中濃度を評価するために、２、４、７及び１０週目の静脈内投与の４日後に、血液をマウスから収集した。屠殺試料は、最後の投与の２４時間後に収集した（図２５）。１０ｍｇ／ｋｇの投与量で、アイソタイプ対照抗体を投与したマウスの遊離ｓＦｌｔ－１の血清中濃度と比較して、遊離ｓＦｌｔ－１の血清中濃度の統計学的な有意差がすべての時点であった。３ｍｇ／ｋｇの投与量で、アイソタイプ対照抗体を投与したマウスの遊離ｓＦｌｔ－１の血清中濃度と比較して、遊離ｓＦｌｔ－１の血清中濃度の統計学的な有意差が４、７及び１０週目ならびに屠殺時点であった。１ｍｇ／ｋｇの投与量で、アイソタイプ対照抗体を投与したマウスの遊離ｓＦｌｔ－１の血清中濃度と比較して、遊離ｓＦｌｔ－１の血清中濃度の統計学的な有意差が屠殺時点であった。
【0222】
ＶＥＧＦの血清中濃度を評価するために、２、４、７及び１０週目の静脈内投与の４日後に、血液をマウスから収集した。屠殺試料は、最後の投与の２４時間後に収集した（図２６）。抗体２１Ｂ３の投与は、血清中ＶＥＧＦ濃度の用量依存的増加を誘発した。１０ｍｇ／ｋｇの投与量で、アイソタイプ対照抗体を投与したマウスのＶＥＧＦの血清中濃度と比較して、ＶＥＧＦの血清中濃度の統計学的な有意差がすべての時点であった。３ｍｇ／ｋｇの投与量で、アイソタイプ対照抗体を投与したマウスのＶＥＧＦの血清中濃度と比較して、ＶＥＧＦの血清中濃度の統計学的な有意差が７週目及び屠殺時点であった。１ｍｇ／ｋｇの投与量で、アイソタイプ対照抗体を投与したマウスのＶＥＧＦの血清中濃度と比較して、ＶＥＧＦの血清中濃度の統計学的な有意差が屠殺時点であった。
【0223】
組織病理学的検査
マウスは処置期間の６及び１２週目に屠殺され、横隔膜筋、腓腹筋及び前脛骨筋を収集して、抗Ｆｌｔ－１抗体による処置が血管新生を誘発して、骨格筋の線維症及び壊死を防いだか判定するために切断した。
マウスは処置期間の６及び１２週目に屠殺され、横隔膜筋、腓腹筋及び前脛骨筋を収集して、抗Ｆｌｔ－１抗体による処置が血管新生を誘発して、骨格筋の線維症及び壊死を防いだか判定するために切断した。
【0224】
血管新生
筋肉切片を内皮細胞マーカーＣＤ３１で染色した（図２７Ａ～図２７Ｈ、図２８Ａ～図２８Ｈ及び図２９Ａ～図２９Ｈ）。毛細血管密度の著しい増大は、アイソタイプ対照抗体で処置したマウスの筋肉と比較して、抗体２１Ｂ３で処置したマウスの試験したすべての筋肉群で見られた。データは、自動定量的イメージングソフトウェアを使用して定量化された。アイソタイプ対照抗体で処置したマウスの横隔膜筋のＣＤ３１陽性領域と比較して、抗体２１Ｂ３の３ｍｇ／ｋｇ（ｐ＜０．０１）及び１０ｍｇ／ｋｇ（ｐ＜０．０００１）で処置したマウスの横隔膜筋の６及び１２週目にてＣＤ３１陽性領域で統計学的に有意な増大があった。アイソタイプ対照抗体で処置したマウスの腓腹筋のＣＤ３１陽性領域と比較して、抗体２１Ｂ３の１０ｍｇ／ｋｇ（ｐ＜０．０５）で処置したマウスの腓腹筋の６及び１２週目にてＣＤ３１陽性領域で統計学的に有意な増大があった。アイソタイプ対照抗体で処置したマウスの前脛骨筋のＣＤ３１陽性領域と比較して、抗体２１Ｂ３の３ｍｇ／ｋｇで処置したマウスの６週目（ｐ＜０．０５）及び１２週目（ｐ＜０．０００１）にて、ならびに抗体２１Ｂ３の１０ｍｇ／ｋｇ（ｐ＜０．０００１）で処置したマウスの６週目及び１２週目にて、前脛骨筋のＣＤ３１陽性領域で統計学的に有意な増大があった。（図３０Ａ～図３０Ｃ）。
筋肉切片を内皮細胞マーカーＣＤ３１で染色した（図２７Ａ～図２７Ｈ、図２８Ａ～図２８Ｈ及び図２９Ａ～図２９Ｈ）。毛細血管密度の著しい増大は、アイソタイプ対照抗体で処置したマウスの筋肉と比較して、抗体２１Ｂ３で処置したマウスの試験したすべての筋肉群で見られた。データは、自動定量的イメージングソフトウェアを使用して定量化された。アイソタイプ対照抗体で処置したマウスの横隔膜筋のＣＤ３１陽性領域と比較して、抗体２１Ｂ３の３ｍｇ／ｋｇ（ｐ＜０．０１）及び１０ｍｇ／ｋｇ（ｐ＜０．０００１）で処置したマウスの横隔膜筋の６及び１２週目にてＣＤ３１陽性領域で統計学的に有意な増大があった。アイソタイプ対照抗体で処置したマウスの腓腹筋のＣＤ３１陽性領域と比較して、抗体２１Ｂ３の１０ｍｇ／ｋｇ（ｐ＜０．０５）で処置したマウスの腓腹筋の６及び１２週目にてＣＤ３１陽性領域で統計学的に有意な増大があった。アイソタイプ対照抗体で処置したマウスの前脛骨筋のＣＤ３１陽性領域と比較して、抗体２１Ｂ３の３ｍｇ／ｋｇで処置したマウスの６週目（ｐ＜０．０５）及び１２週目（ｐ＜０．０００１）にて、ならびに抗体２１Ｂ３の１０ｍｇ／ｋｇ（ｐ＜０．０００１）で処置したマウスの６週目及び１２週目にて、前脛骨筋のＣＤ３１陽性領域で統計学的に有意な増大があった。（図３０Ａ～図３０Ｃ）。
【0225】
線維症
筋肉切片を更にＩ型コラーゲンについて免疫組織化学によって染色した（図３１Ａ～図３１Ｈ、図３２Ａ～図３２Ｈ及び図３３Ａ～図３３Ｈ）。Ｉ型コラーゲン染色の著しい減少は、アイソタイプ対照抗体で処置したマウスの横隔膜筋及び腓腹筋と比較して、抗体２１Ｂ３で処置したマウスの横隔膜筋及び腓腹筋で見られた。アイソタイプ対照抗体で処置したマウスの横隔膜筋のＩ型コラーゲン染色と比較して、抗体２１Ｂ３の１ｍｇ／ｋｇ（ｐ＜０．０００１）、３ｍｇ／ｋｇ（ｐ＜０．００１）及び１０ｍｇ／ｋｇ（ｐ＜０．０００１）で処置したマウスの横隔膜筋の１２週目にて、Ｉ型コラーゲン染色で統計学的に有意な減少があった。アイソタイプ対照抗体で処置したマウスの腓腹筋のＩ型コラーゲン染色と比較して、抗体２１Ｂ３の１ｍｇ／ｋｇ（ｐ＜０．０１）、３ｍｇ／ｋｇ（ｐ＜０．０５）及び１０ｍｇ／ｋｇ（ｐ＜０．００１）で処置したマウスの腓腹筋の１２週目にて、Ｉ型コラーゲン染色で統計学的に有意な減少があった。（図３４Ａ～図３４Ｃ）。
筋肉切片を更にＩ型コラーゲンについて免疫組織化学によって染色した（図３１Ａ～図３１Ｈ、図３２Ａ～図３２Ｈ及び図３３Ａ～図３３Ｈ）。Ｉ型コラーゲン染色の著しい減少は、アイソタイプ対照抗体で処置したマウスの横隔膜筋及び腓腹筋と比較して、抗体２１Ｂ３で処置したマウスの横隔膜筋及び腓腹筋で見られた。アイソタイプ対照抗体で処置したマウスの横隔膜筋のＩ型コラーゲン染色と比較して、抗体２１Ｂ３の１ｍｇ／ｋｇ（ｐ＜０．０００１）、３ｍｇ／ｋｇ（ｐ＜０．００１）及び１０ｍｇ／ｋｇ（ｐ＜０．０００１）で処置したマウスの横隔膜筋の１２週目にて、Ｉ型コラーゲン染色で統計学的に有意な減少があった。アイソタイプ対照抗体で処置したマウスの腓腹筋のＩ型コラーゲン染色と比較して、抗体２１Ｂ３の１ｍｇ／ｋｇ（ｐ＜０．０１）、３ｍｇ／ｋｇ（ｐ＜０．０５）及び１０ｍｇ／ｋｇ（ｐ＜０．００１）で処置したマウスの腓腹筋の１２週目にて、Ｉ型コラーゲン染色で統計学的に有意な減少があった。（図３４Ａ～図３４Ｃ）。
【0226】
壊死
抗体２１Ｂ３で処置したマウスの腓腹筋中に存在する壊死の割合は、アイソタイプ対照抗体で処置したマウスの腓腹筋中に存在する壊死の割合と比較して判定した。壊死が改善する傾向が見られた（図３５Ａ～図３５Ｂ）。
抗体２１Ｂ３で処置したマウスの腓腹筋中に存在する壊死の割合は、アイソタイプ対照抗体で処置したマウスの腓腹筋中に存在する壊死の割合と比較して判定した。壊死が改善する傾向が見られた（図３５Ａ～図３５Ｂ）。
【0227】
実施例９。抗Ｆｌｔ－１抗体２１Ｂ３及び２１Ｃ６に標的とされるヒトｓＦｌｔ－１のエピトープのマッピング
抗ヒトｓＦｌｔ－１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）２１Ｂ３及び２１Ｃ６によって標的とされるヒトｓＦｌｔ－１のペプチドレベルでのエピトープは、水素重水素交換（ＨＤＸ）質量分析によって確定された。
抗ヒトｓＦｌｔ－１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）２１Ｂ３及び２１Ｃ６によって標的とされるヒトｓＦｌｔ－１のペプチドレベルでのエピトープは、水素重水素交換（ＨＤＸ）質量分析によって確定された。
【0228】
ペプシン消化及びＬＣ－ＭＳ
ペプシン消化において、１０μｇのｓＦｌｔ－１、またはｓＦｌｔ－１と抗体（２１Ｂ３）の混合物（１０μｇ：２０μｇ）、またはｓＦｌｔ－１と抗体（２１Ｃ６）の混合物（１０μｇ：２０μｇ）を、０．３６５ＭのＴＣＥＰ及び１．７Ｍの塩酸グアニジン酸（ｐＨ２．５）中で変性させた。混合物にオンラインペプシン消化を行い、得られたペプチドを、ＭｉｃｒｏＴＯＦ－Ｑ２質量分析計（Ｂｒｕｋｅｒ）に連結するＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣからなるＵＰＬＣ－ＭＳシステムを使用して分析した。ペプチドは、５～２８．５％溶媒Ｂ（アセトニトリル中０．１％ギ酸）から１９分の勾配による５０ｍｍ×１ｍｍＣ８カラムで分離した。溶媒Ａは、水中０．１％ギ酸である。溶媒混合弁、注入弁、Ｃ８カラム及びすべての接続ステンレス鋼管を、０℃に維持した冷却した循環水浴に浸した。ペプチド同定は、ＭａｓｃｏｔでｓＦｌｔ－１配列に対してＭＳ／ＭＳデータを検索することによって行った。前駆体及び生成イオンにおける質量許容差は、それぞれ０．１Ｄａ及び０．２Ｄａであった。
ペプシン消化において、１０μｇのｓＦｌｔ－１、またはｓＦｌｔ－１と抗体（２１Ｂ３）の混合物（１０μｇ：２０μｇ）、またはｓＦｌｔ－１と抗体（２１Ｃ６）の混合物（１０μｇ：２０μｇ）を、０．３６５ＭのＴＣＥＰ及び１．７Ｍの塩酸グアニジン酸（ｐＨ２．５）中で変性させた。混合物にオンラインペプシン消化を行い、得られたペプチドを、ＭｉｃｒｏＴＯＦ－Ｑ２質量分析計（Ｂｒｕｋｅｒ）に連結するＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣからなるＵＰＬＣ－ＭＳシステムを使用して分析した。ペプチドは、５～２８．５％溶媒Ｂ（アセトニトリル中０．１％ギ酸）から１９分の勾配による５０ｍｍ×１ｍｍＣ８カラムで分離した。溶媒Ａは、水中０．１％ギ酸である。溶媒混合弁、注入弁、Ｃ８カラム及びすべての接続ステンレス鋼管を、０℃に維持した冷却した循環水浴に浸した。ペプチド同定は、ＭａｓｃｏｔでｓＦｌｔ－１配列に対してＭＳ／ＭＳデータを検索することによって行った。前駆体及び生成イオンにおける質量許容差は、それぞれ０．１Ｄａ及び０．２Ｄａであった。
【0229】
脱グリコシル処理
２００μｇのヒトｓＦｌｔ－１組換え型タンパク質を、１０μｌのＰＮＧａｓｅＦによって３７℃にて４時間インキュベートした。
２００μｇのヒトｓＦｌｔ－１組換え型タンパク質を、１０μｌのＰＮＧａｓｅＦによって３７℃にて４時間インキュベートした。
【0230】
Ｆａｂの調製
Ｆａｂを、パパイン消化及びＰｉｅｒｃｅ Ｆａｂ調製キットを使用するタンパク質Ａ捕捉により、２つの抗ｓＦｌｔ－１ ｍＡｂ（２１Ｂ３及び２１Ｃ６）から調製した。
Ｆａｂを、パパイン消化及びＰｉｅｒｃｅ Ｆａｂ調製キットを使用するタンパク質Ａ捕捉により、２つの抗ｓＦｌｔ－１ ｍＡｂ（２１Ｂ３及び２１Ｃ６）から調製した。
【0231】
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
ＳＥＣの天然または脱グリコシルしたヒトｓＦｌｔ－１のいずれかと２つの抗ヒトｓＦｌｔ－１ ｍＡｂ（２１Ｂ３及び２１Ｃ６）の間の結合を確認するために、１０μｇのｓＦｌｔ－１（天然または脱グリコシルのいずれか）を、４０μｇの抗ｓＦｌｔ－１ ｍＡｂと混合した。移動位相及びタンパク質を２８０ｎｍでモニタする際、天然または脱グリコシルしたｓＦｌｔ－１単独、抗ｓＦｌｔ－１ ｍＡｂ単独または複合体を、ＰＢＳと共に０．３５ｍｌ／分の流量でＳＥＣカラムに注入した。抗ｓＦｌｔ－１ ｍＡｂ（２１Ｂ３及び２１Ｃ６）から生成したＦａｂ及び抗ｓＦｌｔ－１ ＦａｂとｓＦｌｔ－１の間の結合も、ＳＥＣを使用して評価した。
ＳＥＣの天然または脱グリコシルしたヒトｓＦｌｔ－１のいずれかと２つの抗ヒトｓＦｌｔ－１ ｍＡｂ（２１Ｂ３及び２１Ｃ６）の間の結合を確認するために、１０μｇのｓＦｌｔ－１（天然または脱グリコシルのいずれか）を、４０μｇの抗ｓＦｌｔ－１ ｍＡｂと混合した。移動位相及びタンパク質を２８０ｎｍでモニタする際、天然または脱グリコシルしたｓＦｌｔ－１単独、抗ｓＦｌｔ－１ ｍＡｂ単独または複合体を、ＰＢＳと共に０．３５ｍｌ／分の流量でＳＥＣカラムに注入した。抗ｓＦｌｔ－１ ｍＡｂ（２１Ｂ３及び２１Ｃ６）から生成したＦａｂ及び抗ｓＦｌｔ－１ ＦａｂとｓＦｌｔ－１の間の結合も、ＳＥＣを使用して評価した。
【0232】
ＨＤＸ
１０μＬのヒトｓＦｌｔ－１（１０μｇ）、またはｓＦｌｔ－１とｍＡｂ（２１Ｂ３）の混合物（１０μｇ：２０μｇ）、またはｓＦｌｔ－１とｍＡｂ（２１Ｃ６）の混合物（１０μｇ：２０μｇ）を、０秒、３０秒、２分、１０分、１時間または４時間、９０μＬの酸化重水素で標識した緩衝剤（ｐＨ７．４の５０ｍＭのリン酸塩、１００ｍＭの塩化ナトリウム）でインキュベートした。重水素交換を、最終的なｐＨ２．５にて１００μＬの３．４Ｍの塩酸グアニジン、０．７３ＭのＴＣＥＰ緩衝剤を添加することによってクエンチして、それから上述のペプシン消化及びＬＣ－ＭＳ分析を行った。質量スペクトルは、ＭＳのみのモードで記録した。未加工のＭＳデータを、ＨＤＥｘａｍｉｎｅｒソフトウェア（Ｓｉｅｒｒａ Ａｎａｌｙｔｉｃｓ、ＣＡ）を使用して処理した。重水素濃度を、重水素化されたペプチドとその天然型（ｔ０）の間の平均質量差を使用して計算した。
１０μＬのヒトｓＦｌｔ－１（１０μｇ）、またはｓＦｌｔ－１とｍＡｂ（２１Ｂ３）の混合物（１０μｇ：２０μｇ）、またはｓＦｌｔ－１とｍＡｂ（２１Ｃ６）の混合物（１０μｇ：２０μｇ）を、０秒、３０秒、２分、１０分、１時間または４時間、９０μＬの酸化重水素で標識した緩衝剤（ｐＨ７．４の５０ｍＭのリン酸塩、１００ｍＭの塩化ナトリウム）でインキュベートした。重水素交換を、最終的なｐＨ２．５にて１００μＬの３．４Ｍの塩酸グアニジン、０．７３ＭのＴＣＥＰ緩衝剤を添加することによってクエンチして、それから上述のペプシン消化及びＬＣ－ＭＳ分析を行った。質量スペクトルは、ＭＳのみのモードで記録した。未加工のＭＳデータを、ＨＤＥｘａｍｉｎｅｒソフトウェア（Ｓｉｅｒｒａ Ａｎａｌｙｔｉｃｓ、ＣＡ）を使用して処理した。重水素濃度を、重水素化されたペプチドとその天然型（ｔ０）の間の平均質量差を使用して計算した。
【0233】
結果
グリカン除去がヒトｓＦｌｔ－１の抗体への結合を変えないことを検証するために、天然型及び脱グリコシルしたｓＦｌｔ－１タンパク質を、抗ヒトｓＦｌｔ－１ ＩｇＧ（２１Ｂ３及び２１Ｃ６）と混合して、複合体形成をサイズ排除クロマトグラフィーでモニタした。天然型ヒトｓＦｌｔ－１が２つの抗ヒトｓＦｌｔ－１ ＩｇＧ（２１Ｂ３及び２１Ｃ６）に完全に結合する一方で、脱グリコシルしたヒトｓＦｌｔ－１が抗ヒトｓＦｌｔ－１ ｍＡｂ（２１Ｂ３）に不完全に結合する、または抗ヒトｓＦｌｔ－１ ｍＡｂ（２１Ｃ６）に結合しないことを、データは証明し、脱グリコシルはヒトｓＦｌｔ－１と抗体の間の相互作用を乱すことを示した。したがって天然型ヒトｓＦｌｔ－１は、ＨＤ交換実験を実施するために選択された。不均質なグリコシル化及び１２つのＮ－結合型グリコシル化部位の高度の複雑性が原因で、不良な配列包括度は、天然型ヒトｓＦｌｔ－１において最初に達成された。配列包括度を改善するために、各グリコシル化部位のグリカン質量を同定して、高い配列包括度（８５．２％）を天然型ヒトｓＦｌｔ－１において達成した。
グリカン除去がヒトｓＦｌｔ－１の抗体への結合を変えないことを検証するために、天然型及び脱グリコシルしたｓＦｌｔ－１タンパク質を、抗ヒトｓＦｌｔ－１ ＩｇＧ（２１Ｂ３及び２１Ｃ６）と混合して、複合体形成をサイズ排除クロマトグラフィーでモニタした。天然型ヒトｓＦｌｔ－１が２つの抗ヒトｓＦｌｔ－１ ＩｇＧ（２１Ｂ３及び２１Ｃ６）に完全に結合する一方で、脱グリコシルしたヒトｓＦｌｔ－１が抗ヒトｓＦｌｔ－１ ｍＡｂ（２１Ｂ３）に不完全に結合する、または抗ヒトｓＦｌｔ－１ ｍＡｂ（２１Ｃ６）に結合しないことを、データは証明し、脱グリコシルはヒトｓＦｌｔ－１と抗体の間の相互作用を乱すことを示した。したがって天然型ヒトｓＦｌｔ－１は、ＨＤ交換実験を実施するために選択された。不均質なグリコシル化及び１２つのＮ－結合型グリコシル化部位の高度の複雑性が原因で、不良な配列包括度は、天然型ヒトｓＦｌｔ－１において最初に達成された。配列包括度を改善するために、各グリコシル化部位のグリカン質量を同定して、高い配列包括度（８５．２％）を天然型ヒトｓＦｌｔ－１において達成した。
【0234】
天然型ヒトｓＦｌｔ－１を、酸化重水素のみにおいて、または抗ヒトｓＦｌｔ－１ ｍＡｂ（２１Ｂ３）もしくは抗ヒトｓＦｌｔ－１ ｍＡｂ（２１Ｃ６）のいずれかとの複合体でインキュベートした。重水素交換を、０秒、３０秒、２分、１０分、６０分及び２４０分間、室温にて実施した。交換反応を低ｐＨでクエンチして、タンパク質をペプシンで消化した。同定したペプチドの重水素濃度を、ＬＣ－ＭＳ上の質量シフトからモニタした。すべてのペプチドについて交換時間の重水素蓄積曲線を記入した。大部分のヒトｓＦｌｔ－１ペプチドが、抗ヒトｓＦｌｔ－１ ｍＡｂ（２１Ｂ３及び２１Ｃ６）を含む及びそれを含まない、同一または類似した重水素濃度を示した一方で、いくつかのペプチド部分は、ｍＡｂ ２１Ｂ３またはｍＡｂ ２１Ｃ６結合における著しく減少した重水素取り込みを有した。残基１１７～１２９（配列番号９０のアミノ酸１４１～１５３に対応）及び１６９～１８２（配列番号９０のアミノ酸１９３～２０６に対応）は、抗ヒトｓＦｌｔ－１ ｍＡｂ ２１Ｂ３との結合の際、強力な重水素保護を受けたが、一方で残基１０６～１１４（配列番号９０のアミノ酸１３０～１３８に対応）及び１１７～１２４（配列番号９０のアミノ酸１４１～１４８に対応）は抗ヒトｓＦｌｔ－１ ｍＡｂ ２１Ｃ６との結合の際、強力な重水素保護を受けた。これらの強く保護された領域は、抗ヒトｓＦｌｔ－１ ｍＡｂ（２１Ｂ３及び２１Ｃ６）においてエピトープペプチドとして割り当てられており、図３６及び図３７に示す差示的なヒートマップにおいて青で強調された。エピトープ領域からアミノ酸残基を含有する同定したペプチドについてのＭＳ／ＭＳスペクトルを、図３８Ａ～図３８Ｅに示す。ペプチド１１５～１２４は配列番号９０のアミノ酸１３９～１４８に対応し、ペプチド１１５～１２９は配列番号９０のアミノ酸１３９～１５３に対応し、ペプチド１５４～１８２は配列番号９０のアミノ酸１７８～２０６に対応し、ペプチド１７５～１８０は配列番号９０のアミノ酸１１９～２０４に対応し、及びペプチド１０４～１１４は配列番号９０のアミノ酸１２８～１３８に対応する。
【0235】
結論
８５．２％の配列包括度が、ヒトｓＦｌｔ－１において得られた。残基１１７～１２９及び１６９～１８０は、抗ヒトｓＦｌｔ－１ ｍＡｂ ２１Ｂ３との結合の際、強力な重水素保護を受けたが、一方で残基１０６～１１４及び１１７～１２４は、抗ヒトｓＦｌｔ－１ ｍＡｂ ２１Ｃ６との結合の際、強力な重水素保護を受けた。これらの強く保護された領域は、対応する抗ヒトｓＦｌｔ－１ ｍＡｂにおいてエピトープペプチドとして割り当てられた。
８５．２％の配列包括度が、ヒトｓＦｌｔ－１において得られた。残基１１７～１２９及び１６９～１８０は、抗ヒトｓＦｌｔ－１ ｍＡｂ ２１Ｂ３との結合の際、強力な重水素保護を受けたが、一方で残基１０６～１１４及び１１７～１２４は、抗ヒトｓＦｌｔ－１ ｍＡｂ ２１Ｃ６との結合の際、強力な重水素保護を受けた。これらの強く保護された領域は、対応する抗ヒトｓＦｌｔ－１ ｍＡｂにおいてエピトープペプチドとして割り当てられた。
【0236】
等価物及び範囲
当業者は、一般的な実験のみを使用して、本明細書に記載の本発明の具体的な実施形態の多数の等価物を認識する、または確認することができる。本発明の範囲は、上述の発明の詳細な説明に限定することを意図するものではなく、むしろ以下の特許請求の範囲に記載されているものである。
当業者は、一般的な実験のみを使用して、本明細書に記載の本発明の具体的な実施形態の多数の等価物を認識する、または確認することができる。本発明の範囲は、上述の発明の詳細な説明に限定することを意図するものではなく、むしろ以下の特許請求の範囲に記載されているものである。
【表13-1】
【表13-2】
【表13-3】
【表13-4】
【表13-5】
【表14】
【図1A】
【図1B】
【図2A】
【図2B】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13A】
【図13B】
【図13C】
【図14A】
【図14B】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21A】
【図21B】
【図22A】
【図22B】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30A】
【図30B】
【図30C】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34A】
【図34B】
【図34C】
【図35】
【図36-1】
【図36-2】
【図36-3】
【図37-1】
【図37-2】
【図37-3】
【図38A】
【図38B】
【図38C】
【図38D】
【図38E】
【配列表】