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特許7464199藻類、暗所における藻類の生育を改善する方法、暗所における生育が改善した藻類の製造方法、暗所活性型クリプトクロム、及び暗所活性型クリプトクロムをコードするポリヌクレオチド
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-04-01
(45)【発行日】2024-04-09
(54)【発明の名称】藻類、暗所における藻類の生育を改善する方法、暗所における生育が改善した藻類の製造方法、暗所活性型クリプトクロム、及び暗所活性型クリプトクロムをコードするポリヌクレオチド
(51)【国際特許分類】
C12N 15/31 20060101AFI20240402BHJP
C12N 1/13 20060101ALI20240402BHJP
C12N 1/12 20060101ALI20240402BHJP
C07K 14/405 20060101ALI20240402BHJP
【ＦＩ】
C12N15/31 ZNA
C12N1/13
C12N1/12 A
C07K14/405
【請求項の数】
11
(21)【出願番号】P 2023538687
(86)(22)【出願日】2023-01-27
(86)【国際出願番号】 JP2023002568
(87)【国際公開番号】W WO2023145850
(87)【国際公開日】2023-08-03
【審査請求日】2023-06-22
(31)【優先権主張番号】P 2022011181
(32)【優先日】2022-01-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】000002886
【氏名又は名称】ＤＩＣ株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100161207
【弁理士】
【氏名又は名称】西澤 和純
(74)【代理人】
【識別番号】100215935
【弁理士】
【氏名又は名称】阿部 茂輝
(74)【代理人】
【識別番号】100189337
【弁理士】
【氏名又は名称】宮本 龍
(74)【代理人】
【識別番号】100188673
【弁理士】
【氏名又は名称】成田 友紀
(72)【発明者】
【氏名】日比 敬太
(72)【発明者】
【氏名】中村 浩正
【審査官】市島 洋介
(56)【参考文献】
【文献】Mol. Plant，2012年，Vol. 5, No. 1，pp.85-97
【文献】Plant Physiol.，2017年，Vol. 174，pp.185-201
【文献】Plant Signal. Behav.，2013年，Vol. 8, Issue 2, e22870
【文献】J. Plant Physiol.，2017年，Vol. 217，pp.4-14
【文献】SpringerPlus，2015年，4: 559
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １／００－７／０８
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
暗所で活性化が維持される暗所活性型クリプトクロムを有する、藻類であって、
前記暗所活性型クリプトクロムは、野生型の暗所不活性型クリプトクロムのアミノ酸配列と比較して、フラビンアデニンジヌクレオチド結合ドメインに変異を有し、且つ前記変異は、下記式（１）で表されるアミノ酸配列における８番目のグリシン残基が、アルギニン残基又はリジン残基に置換された変異である、
藻類。
ＬＸＺＸＷＸＸＧＸＸＸＪ （１）
［式中、Ｌはロイシン残基、Ｗはトリプトファン残基、Ｇはグリシン残基、Ｚは疎水性アミノ酸残基若しくは極性無電荷アミノ酸残基、Ｊは疎水性アミノ酸残基、Ｘは任意のアミノ酸残基を表す。］
【請求項2】
前記暗所活性型クリプトクロムを有しない同種の藻類と比較して、暗所において高い生育速度を有する、請求項１に記載の藻類。
【請求項3】
前記暗所活性型クリプトクロムを有しない同種の藻類と比較して、暗所における最大到達藻密度が高い、請求項１に記載の藻類。
【請求項4】
前記暗所活性型クリプトクロムのアミノ酸配列は、前記野生型の暗所不活性型クリプトクロムのアミノ酸配列と比較して、９０％以上の配列同一性を有する、請求項１に記載の藻類。
【請求項5】
前記藻類が、単細胞藻類である、請求項１～４のいずれか一項に記載の藻類。
【請求項6】
藻類に、暗所活性型クリプトクロムをコードするポリヌクレオチドを導入することを含み、前記暗所活性型クリプトクロムは、野生型の暗所不活性型クリプトクロムのアミノ酸配列と比較して、フラビンアデニンジヌクレオチド結合ドメインに変異を有し、且つ前記変異は、下記式（１）で表されるアミノ酸配列における８番目のグリシン残基が、アルギニン残基又はリジン残基に置換された変異である、
暗所における藻類の生育を改善する方法。
ＬＸＺＸＷＸＸＧＸＸＸＪ （１）
［式中、Ｌはロイシン残基、Ｗはトリプトファン残基、Ｇはグリシン残基、Ｚは疎水性アミノ酸残基若しくは極性無電荷アミノ酸残基、Ｊは疎水性アミノ酸残基、Ｘは任意のアミノ酸残基を表す。］
【請求項7】
前記暗所活性型クリプトクロムのアミノ酸配列は、前記野生型の暗所不活性型クリプトクロムのアミノ酸配列と比較して、９０％以上の配列同一性を有する、請求項６に記載の暗所における藻類の生育を改善する方法。
【請求項8】
藻類に、暗所活性型クリプトクロムをコードするポリヌクレオチドを導入することを含み、前記暗所活性型クリプトクロムは、野生型の暗所不活性型クリプトクロムのアミノ酸配列と比較して、フラビンアデニンジヌクレオチド結合ドメインに変異を有し、且つ前記変異は、下記式（１）で表されるアミノ酸配列における８番目のグリシン残基が、アルギニン残基又はリジン残基に置換された変異である、
暗所における生育が改善した藻類の製造方法。
ＬＸＺＸＷＸＸＧＸＸＸＪ （１）
［式中、Ｌはロイシン残基、Ｗはトリプトファン残基、Ｇはグリシン残基、Ｚは疎水性アミノ酸残基若しくは極性無電荷アミノ酸残基、Ｊは疎水性アミノ酸残基、Ｘは任意のアミノ酸残基を表す。］
【請求項9】
前記暗所活性型クリプトクロムのアミノ酸配列は、前記野生型の暗所不活性型クリプトクロムのアミノ酸配列と比較して、９０％以上の配列同一性を有する、請求項８に記載の暗所における生育が改善した藻類の製造方法。
【請求項10】
下記（ａ）～（ｃ）からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、暗所で活性化が維持される暗所活性型クリプトクロム：（ａ）配列番号１２、１４、３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、６２、６５、６８、７１、７４、又は７７に記載のアミノ酸配列において、下記式（１）で表されるアミノ酸配列の８番目のグリシン残基がアルギニン残基又はリジン残基に置換されている、アミノ酸配列、
ＬＸＺＸＷＸＸＧＸＸＸＪ （１）
［式中、Ｌはロイシン残基、Ｗはトリプトファン残基、Ｇはグリシン残基、Ｚは疎水性アミノ酸残基若しくは極性無電荷アミノ酸残基、Ｊは疎水性アミノ酸残基、Ｘは任意のアミノ酸残基を表す。］；
（ｂ）配列番号１２、１４、３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、６２、６５、６８、７１、７４、又は７７に記載のアミノ酸配列において、１個又は複数個のアミノ酸が変異されたアミノ酸配列であって、且つ前記変異が前記式（１）で表されるアミノ酸配列の８番目のグリシン残基をアルギニン残基又はリジン残基に置換する変異を含む、アミノ酸配列；及び
（ｃ）配列番号１２、１４、３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、６２、６５、６８、７１、７４、又は７７に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、前記式（１）で表されるアミノ酸配列の８番目のグリシン残基がアルギニン残基又はリジン残基に置換されている、アミノ酸配列。
【請求項11】
請求項１０に記載の暗所活性型クリプトクロムをコードするポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、藻類、暗所における藻類の生育を改善する方法、暗所における生育が改善した藻類の製造方法、暗所活性型クリプトクロム、及び暗所活性型クリプトクロムをコードするポリヌクレオチドに関する。
本願は、２０２２年１月２７日に、日本に出願された特願２０２２－０１１１８１号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
本願は、２０２２年１月２７日に、日本に出願された特願２０２２－０１１１８１号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【0002】
クリプトクロムは、真核生物で広く保存されている青色光受容体タンパク質である。クリプトクロムは、植物では、光形態形成、及び概日リズム等の調節に関与することが知られている。クリプトクロムは、青色光の受光により活性化し、光環境に適応した応答反応を制御する役割を担っている。シロイヌナズナでは、クリプトクロム１（ＣＲＹ１）のフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）結合サイトの１アミノ酸置換により、暗所でも光形態形成表現型（ｐｈｏｔｏｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）を示すようになったことが報告されている（非特許文献１）。
【0003】
近年、藻類を利用して有用物質を生産する試みが行われている。工業的に藻類を利用するためには、暗所で、大規模に藻類を培養できることが望ましい。しかしながら、藻類は、通常、光独立栄養的に生育し、暗所での従属栄養的な生育できなかったり、暗所での従属栄養的な生育が遅かったりする場合が多い。
シアニディオシゾン・メロラエ（Ｃｙａｎｉｄｉｏｓｃｈｙｚｏｎ ｍｅｒｏｌａｅ）は、通常、絶対独立栄養性であるが、従属栄養的に生育する株が報告されている（非特許文献２、３）。しかしながら、これらの株は、従属栄養培養での最大到達藻密度が低く、継代により生育速度がさらに遅くなることが報告されている。
シアニディオシゾン・メロラエ（Ｃｙａｎｉｄｉｏｓｃｈｙｚｏｎ ｍｅｒｏｌａｅ）は、通常、絶対独立栄養性であるが、従属栄養的に生育する株が報告されている（非特許文献２、３）。しかしながら、これらの株は、従属栄養培養での最大到達藻密度が低く、継代により生育速度がさらに遅くなることが報告されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【文献】Nan-Nan Gu, Yan-Chun Zhang, Hong-Quan Yang. Substitution of a conserved glycine in the PHR domain of Arabidopsis cryptochrome 1 confers a constitutive light response. Mol Plant. 2012 Jan;5(1):85-97.
【文献】Takashi Moriyama, Natsumi Mori, and Naoki Sato. Activation of oxidative carbon metabolism by nutritional enrichment by photosynthesis and exogenous organic compounds in the red alga Cyanidioschyzon merolae: evidence for heterotrophic growth. SpringerPlus (2015) 4:559.
【文献】Takashi Moriyama, Natsumi Mori, Noriko Nagata, and Naoki Sato. Selective loss of photosystem I and formation of tubular thylakoids in heterotrophka11y grown red alga Cyanidioschyzon merolae. Photosynthesis Research (2019) 140, 275-287.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
藻類の工業的利用のためには、藻類が、暗所でも良好に生育できることが望ましい。暗所での生育が不良な藻類について、暗所での生育を改善できれば、それらの藻類も工業的に利用しやすくなる。
【0006】
そこで、本発明は、暗所における生育が改善された藻類、暗所における藻類の生育を改善する方法、暗所における生育が改善した藻類の製造方法、暗所活性型クリプトクロム、及び暗所活性型クリプトクロムをコードするポリヌクレオチドを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明は、以下の態様を含む。
［１］暗所で活性化が維持される暗所活性型クリプトクロムを有する、藻類。
［２］前記暗所活性型クリプトクロムを有しない同種の藻類と比較して、暗所において高い生育速度を有する、［１］に記載の藻類。
［３］前記暗所活性型クリプトクロムを有しない同種の藻類と比較して、暗所における最大到達藻密度が高い、［１］又は［２］に記載の藻類。
［４］前記暗所活性型クリプトクロムのアミノ酸配列は、暗所で不活性化する暗所不活性型クリプトクロムのアミノ酸配列と比較して、フラビンアデニンジヌクレオチド結合ドメインに変異を有する、［１］～［３］のいずれか１つに記載の藻類。
［５］前記暗所不活性型クリプトクロムの前記フラビンアデニンジヌクレオチド結合ドメインが、下記式（１）で表されるアミノ酸配列を含む、［４］に記載の藻類。
ＬＸＺＸＷＸＸＧＸＸＸＪ （１）
［式中、Ｌはロイシン残基、Ｗはトリプトファン残基、Ｇはグリシン残基、Ｚは疎水性アミノ酸残基若しくは極性無電荷アミノ酸残基、Ｊは疎水性アミノ酸残基、Ｘは任意のアミノ酸残基を表す。］
［６］前記暗所活性型クリプトクロムのアミノ酸配列は、前記暗所不活性型クリプトクロムのアミノ酸配列と比較して、前記式（１）で表されるアミノ酸配列に変異を有する、［５］に記載の藻類。
［７］前記暗所活性型クリプトクロムは、前記式（１）で表されるアミノ酸配列における８番目のグリシン残基が、塩基性アミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む、［６］に記載の藻類。
［８］前記藻類が、単細胞藻類である、［１］～［７］のいずれか１つに記載の藻類。
［９］藻類に、暗所活性型クリプトクロムをコードするポリヌクレオチドを導入することを含む、暗所における藻類の生育を改善する方法。
［１０］藻類に、暗所活性型クリプトクロムをコードするポリヌクレオチドを導入することを含む、暗所における生育が改善した藻類の製造方法。
［１１］下記（ａ）～（ｃ）からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、暗所で活性化が維持される暗所活性型クリプトクロム：
（ａ）配列番号１２、１４、３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、６２、６５、６８、７１、７４、又は７７に記載のアミノ酸配列において、下記式（１）で表されるアミノ酸配列の８番目のグリシン残基が塩基性アミノ酸残基に置換されている、アミノ酸配列、
ＬＸＺＸＷＸＸＧＸＸＸＪ （１）
［式中、Ｌはロイシン残基、Ｗはトリプトファン残基、Ｇはグリシン残基、Ｚは疎水性アミノ酸残基若しくは極性無電荷アミノ酸残基、Ｊは疎水性アミノ酸残基、Ｘは任意のアミノ酸残基を表す。］；
（ｂ）配列番号１２、１４、３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、６２、６５、６８、７１、７４、又は７７に記載のアミノ酸配列において、１個又は複数個のアミノ酸が変異されたアミノ酸配列であって、且つ前記変異が前記式（１）で表されるアミノ酸配列の８番目のグリシン残基を塩基性アミノ酸残基に置換する変異を含む、アミノ酸配列；及び
（ｃ）配列番号１２、１４、３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、６２、６５、６８、７１、７４、又は７７に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、且つ前記式（１）で表されるアミノ酸配列の８番目のグリシン残基が塩基性アミノ酸残基に置換されている、アミノ酸配列。
［１２］［１１］に記載の暗所活性型クリプトクロムをコードするポリヌクレオチド。
［１］暗所で活性化が維持される暗所活性型クリプトクロムを有する、藻類。
［２］前記暗所活性型クリプトクロムを有しない同種の藻類と比較して、暗所において高い生育速度を有する、［１］に記載の藻類。
［３］前記暗所活性型クリプトクロムを有しない同種の藻類と比較して、暗所における最大到達藻密度が高い、［１］又は［２］に記載の藻類。
［４］前記暗所活性型クリプトクロムのアミノ酸配列は、暗所で不活性化する暗所不活性型クリプトクロムのアミノ酸配列と比較して、フラビンアデニンジヌクレオチド結合ドメインに変異を有する、［１］～［３］のいずれか１つに記載の藻類。
［５］前記暗所不活性型クリプトクロムの前記フラビンアデニンジヌクレオチド結合ドメインが、下記式（１）で表されるアミノ酸配列を含む、［４］に記載の藻類。
ＬＸＺＸＷＸＸＧＸＸＸＪ （１）
［式中、Ｌはロイシン残基、Ｗはトリプトファン残基、Ｇはグリシン残基、Ｚは疎水性アミノ酸残基若しくは極性無電荷アミノ酸残基、Ｊは疎水性アミノ酸残基、Ｘは任意のアミノ酸残基を表す。］
［６］前記暗所活性型クリプトクロムのアミノ酸配列は、前記暗所不活性型クリプトクロムのアミノ酸配列と比較して、前記式（１）で表されるアミノ酸配列に変異を有する、［５］に記載の藻類。
［７］前記暗所活性型クリプトクロムは、前記式（１）で表されるアミノ酸配列における８番目のグリシン残基が、塩基性アミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む、［６］に記載の藻類。
［８］前記藻類が、単細胞藻類である、［１］～［７］のいずれか１つに記載の藻類。
［９］藻類に、暗所活性型クリプトクロムをコードするポリヌクレオチドを導入することを含む、暗所における藻類の生育を改善する方法。
［１０］藻類に、暗所活性型クリプトクロムをコードするポリヌクレオチドを導入することを含む、暗所における生育が改善した藻類の製造方法。
［１１］下記（ａ）～（ｃ）からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、暗所で活性化が維持される暗所活性型クリプトクロム：
（ａ）配列番号１２、１４、３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、６２、６５、６８、７１、７４、又は７７に記載のアミノ酸配列において、下記式（１）で表されるアミノ酸配列の８番目のグリシン残基が塩基性アミノ酸残基に置換されている、アミノ酸配列、
ＬＸＺＸＷＸＸＧＸＸＸＪ （１）
［式中、Ｌはロイシン残基、Ｗはトリプトファン残基、Ｇはグリシン残基、Ｚは疎水性アミノ酸残基若しくは極性無電荷アミノ酸残基、Ｊは疎水性アミノ酸残基、Ｘは任意のアミノ酸残基を表す。］；
（ｂ）配列番号１２、１４、３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、６２、６５、６８、７１、７４、又は７７に記載のアミノ酸配列において、１個又は複数個のアミノ酸が変異されたアミノ酸配列であって、且つ前記変異が前記式（１）で表されるアミノ酸配列の８番目のグリシン残基を塩基性アミノ酸残基に置換する変異を含む、アミノ酸配列；及び
（ｃ）配列番号１２、１４、３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、６２、６５、６８、７１、７４、又は７７に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、且つ前記式（１）で表されるアミノ酸配列の８番目のグリシン残基が塩基性アミノ酸残基に置換されている、アミノ酸配列。
［１２］［１１］に記載の暗所活性型クリプトクロムをコードするポリヌクレオチド。
【発明の効果】
【0008】
本発明によれば、暗所における生育が改善された藻類、暗所における藻類の生育を改善する方法、暗所における生育が改善した藻類の製造方法、暗所活性型クリプトクロム、及び暗所活性型クリプトクロムをコードするポリヌクレオチドが提供される。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1】Ｃ．ｍｅｌｏｒａｅのＣＲＹ候補及びシロイヌナズナＣＲＹ１において、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａによりアライメントした結果を示す。「ＬＸＺＸＷＸＸＧＸＸＸＪ」モチーフ付近のアミノ酸配列を示した。「＊」は全ての解析配列で一致するアミノ酸残基を示し、「：」は一部の解析配列で一致するアミノ酸残基を示し、「．」は解析配列間でアミノ酸ファミリーが一致するアミノ酸残基を示す（図５～８でも同様）。
【図2A】Ｃ．ｍｅｒｏｌａｅに、ＣＹＭＥ＿ＣＭＭ０７６Ｃ（Ｇ４１９Ｒ）遺伝子を導入するための形質転換用直鎖状ＤＮＡベクターの構造を示す。
【図2B】Ｃ．ｍｅｒｏｌａｅに、ＣＹＭＥ＿ＣＭＱ４５３Ｃ（Ｇ５７２Ｒ）遺伝子を導入するための形質転換用直鎖状ＤＮＡベクターの構造を示す。
【図3】ＣＭＭ０７６Ｃ（Ｇ４１９Ｒ）導入株、及びＣＭＱ４５３Ｃ（Ｇ５７２Ｒ）導入株において、暗所での従属栄養的な生育を評価した結果を示す。
【図4】ＣＭＭ０７６Ｃ（Ｇ４１９Ｒ）導入株、及びＣＭＱ４５３Ｃ（Ｇ５７２Ｒ）導入株において、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ解析により、導入タンパク質の発現を確認した結果を示す。
【図5】Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓのＣＲＹ候補及びシロイヌナズナＣＲＹ１のアライメント結果を示す。
【図6】Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｇａｄｉｔａｎａのＣＲＹ候補及びシロイヌナズナＣＲＹ１のアライメント結果を示す。
【図7】Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍのＣＲＹ候補及びシロイヌナズナＣＲＹ１のアライメント結果を示す。
【図8】Ｄｉａｃｒｏｎｅｍａ ｌｕｔｈｅｒｉのＣＲＹ候補及びシロイヌナズナＣＲＹ１のアライメント結果を示す。
【図9】Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｍｕｅｌｌｅｒｉのＣＲＹ候補及びシロイヌナズナＣＲＹ１のアライメント結果を示す。
【図10】Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｇｒａｃｉｌｉｓのＣＲＹ候補及びシロイヌナズナＣＲＹ１のアライメント結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0010】
「を含む」（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）という用語は、対象となる構成要素以外の構成要素を含んでいてもよいことを意味する。「からなる」（ｃｏｎｓｉｓｔ ｏｆ）という用語は、対象となる構成要素以外の構成要素を含まないことを意味する。「から本質的になる」（ｃｏｎｓｉｓｔ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）という用語は、対象となる構成要素以外の構成要素を特別な機能を発揮する態様（発明の効果を完全に喪失させる態様など）では含まないことを意味する。本明細書において、「を含む」（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）と記載する場合、「からなる」（ｃｏｎｓｉｓｔ ｏｆ）態様、及び「から本質的になる」（ｃｏｎｓｉｓｔ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）態様を包含する。
【0011】
タンパク質、ペプチド、ポリヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、ベクター、細胞、及び藻類は、単離されたものであり得る。「単離された」とは、天然状態又は他の成分から分離された状態を意味する。「単離された」ものは、他の成分を実質的に含まないものであり得る。「他の成分を実質的に含まない」とは、単離された成分に含まれる他の成分の含有量が無視できる程度であることを意味する。単離された成分に含まれる他の成分の含有量は、例えば、１０質量％以下、５質量％以下、４質量％以下、３質量％以下、２質量％以下、１質量％以下、０．５質量％以下、又は０．１質量％以下であり得る。本明細書に記載されるタンパク質、ペプチド、ポリヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、ベクター、及び細胞は、単離されたタンパク質、単離されたペプチド、単離されたポリヌクレオチド（単離されたＤＮＡ、単離されたＲＮＡ）、単離されたベクター、単離された細胞、及び単離された藻類であり得る。
【0012】
ヌクレオチド配列は、特に明示しない限り、一般的に認められている１文字コードで記載される。特に明示しない限り、ヌクレオチド配列は、５’側から３’側に向かって記載される。ヌクレオチド残基は、単に、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、又はウラシル等、あるいはそれらの１文字コードで記載される場合がある。
【0013】
アミノ酸配列は、特に明示しない限り、一般的に認められている１文字コード又は３文字コードで記載される。特に明示しない限り、アミノ酸配列は、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって記載される。
特定のアミノ酸配列に含まれる特定のアミノ酸残基は、アミノ酸残基の１文字コード及びＮ末端からの位置により表記される場合がある。例えば、配列番号１６に記載のアミノ酸配列における、Ｎ末端から４１９番目のグリシン残基は、「Ｇ４１９」と表記される。
特定のアミノ酸配列に含まれる特定のアミノ酸残基の置換は、置換前のアミノ酸残基の１文字コード、Ｎ末端からの位置、及び置換後のアミノ酸残基の１文字コードにより表記される場合がある。例えば、配列番号１６に記載のアミノ酸配列における、Ｎ末端から４１９番目のグリシン残基のアルギニン残基への置換は、「Ｇ４１９Ｒ」と表記される。
特定のアミノ酸配列に含まれる特定のアミノ酸残基は、アミノ酸残基の１文字コード及びＮ末端からの位置により表記される場合がある。例えば、配列番号１６に記載のアミノ酸配列における、Ｎ末端から４１９番目のグリシン残基は、「Ｇ４１９」と表記される。
特定のアミノ酸配列に含まれる特定のアミノ酸残基の置換は、置換前のアミノ酸残基の１文字コード、Ｎ末端からの位置、及び置換後のアミノ酸残基の１文字コードにより表記される場合がある。例えば、配列番号１６に記載のアミノ酸配列における、Ｎ末端から４１９番目のグリシン残基のアルギニン残基への置換は、「Ｇ４１９Ｒ」と表記される。
【0014】
「遺伝子」は、特定のタンパク質をコードする少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドを指す。遺伝子は、エクソン及びイントロンの両方を含み得る。
【0015】
塩基配列どうし又はアミノ酸配列どうしの配列同一性（又は相同性）は、２つの塩基配列又はアミノ酸配列を、対応する塩基又はアミノ酸が最も多く一致するように、挿入及び欠失に当たる部分にギャップを入れながら並置し、得られたアライメント中のギャップを除く、塩基配列全体又はアミノ酸配列全体に対する一致した塩基又はアミノ酸の割合として求められる。塩基配列又はアミノ酸配列どうしの配列同一性は、当該技術分野で公知の各種相同性検索ソフトウェアを用いて求めることができる。塩基配列の配列同一性の値は、例えば、公知の相同性検索ソフトウェアＢＬＡＳＴＮにより得られたアライメントを元にした計算によって得ることができる。アミノ酸配列の配列同一性の値は、例えば、公知の相同性検索ソフトウェアＢＬＡＳＴＰにより得られたアライメントを元にした計算によって得ることができる。
【0016】
「光独立栄養培養」とは、光存在下（明所）、有機物非存在下での培養を意味する。
「従属栄養培養」とは、暗所、有機物存在下での培養を意味する。
「混合栄養培養」とは、光存在下（明所）、有機物存在下での培養を意味する。
「光独立栄養的な生育」とは、光存在下、有機物非存在下での藻類の生育を意味する。光独立栄養的な生育は、光独立栄養培養における藻類の生育であってもよい。
「従属栄養的な生育」とは、暗所、有機物存在下での藻類の生育を意味する。従属栄養的な生育は、従属栄養培養における藻類の生育であってもよい。
「混合栄養的な生育」とは、光存在下、有機物存在下での藻類の生育を意味する。混合栄養的な生育は、混合栄養培養における藻類の生育であってもよい。
「従属栄養培養」とは、暗所、有機物存在下での培養を意味する。
「混合栄養培養」とは、光存在下（明所）、有機物存在下での培養を意味する。
「光独立栄養的な生育」とは、光存在下、有機物非存在下での藻類の生育を意味する。光独立栄養的な生育は、光独立栄養培養における藻類の生育であってもよい。
「従属栄養的な生育」とは、暗所、有機物存在下での藻類の生育を意味する。従属栄養的な生育は、従属栄養培養における藻類の生育であってもよい。
「混合栄養的な生育」とは、光存在下、有機物存在下での藻類の生育を意味する。混合栄養的な生育は、混合栄養培養における藻類の生育であってもよい。
【0017】
「最大到達藻密度」とは、藻類の培養において、藻類の生育が停止したときの藻密度又は藻類の生育の過程で達成された最大の藻密度を意味する。最大到達藻密度は、藻類が増殖し、静止期に達したときの藻密度であってもよい。
「野生型」は、自然界に存在する生物、遺伝子、又はタンパク質等を意味する。野生型の藻類（野生株）は、自然界に存在する藻類を意味する。野生型遺伝子は、野生型の生物が有する遺伝子を意味する。野生型タンパク質は、野生型の生物が有するタンパク質であり、野生型遺伝子から発現される。
「野生型」は、自然界に存在する生物、遺伝子、又はタンパク質等を意味する。野生型の藻類（野生株）は、自然界に存在する藻類を意味する。野生型遺伝子は、野生型の生物が有する遺伝子を意味する。野生型タンパク質は、野生型の生物が有するタンパク質であり、野生型遺伝子から発現される。
【0018】
＜藻類＞
本発明の第１の態様は、暗所で活性化が維持される暗所活性型クリプトクロムを有する、藻類である。
本発明の第１の態様は、暗所で活性化が維持される暗所活性型クリプトクロムを有する、藻類である。
【0019】
（藻類）
本実施形態における藻類の種類は、特に限定されない。藻類としては、紅藻、褐藻、緑藻、珪藻、黄緑藻、渦鞭毛藻、真正眼点藻、ハプト藻等が挙げられる。藻類は、単細胞でもよく、多細胞でもよいが、単細胞藻類が好ましい。藻類は、細胞群体を形成するものも好ましい。藻類は、野生型がクリプトクロムを有することが好ましい。藻類は、野生型が、従属栄養的に生育できないか、従属栄養的な生育能力が低いものが好ましい。藻類の「従属栄養的な生育能力が低い」場合の具体例としては、例えば、光独立栄養培養での生育速度と比較して、従属栄養培養での生育速度が遅いこと；光独立栄養培養における最大到達藻密度と比較して、従属栄養培養における最大到達藻密度が低いこと；及び光独立栄養培養で継代した後の生育速度と比較して、従属栄養培養で継代した後の生育速度が遅いこと、等が挙げられる。
本実施形態における藻類の種類は、特に限定されない。藻類としては、紅藻、褐藻、緑藻、珪藻、黄緑藻、渦鞭毛藻、真正眼点藻、ハプト藻等が挙げられる。藻類は、単細胞でもよく、多細胞でもよいが、単細胞藻類が好ましい。藻類は、細胞群体を形成するものも好ましい。藻類は、野生型がクリプトクロムを有することが好ましい。藻類は、野生型が、従属栄養的に生育できないか、従属栄養的な生育能力が低いものが好ましい。藻類の「従属栄養的な生育能力が低い」場合の具体例としては、例えば、光独立栄養培養での生育速度と比較して、従属栄養培養での生育速度が遅いこと；光独立栄養培養における最大到達藻密度と比較して、従属栄養培養における最大到達藻密度が低いこと；及び光独立栄養培養で継代した後の生育速度と比較して、従属栄養培養で継代した後の生育速度が遅いこと、等が挙げられる。
【0020】
一実施形態において、藻類は、単細胞紅藻、緑藻、真正眼点藻、珪藻、又はハプト藻である。
【0021】
単細胞紅藻としては、例えば、イデユコゴメ綱（Ｃｙａｎｉｄｉｏｐｈｙｃｅａｅ）、ベニミドロ綱（Ｓｔｙｌｏｎｅｍａｔｏｐｈｙｃｅａｅ）、チノリモ綱（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｏｐｈｙｃｅａｅ）、及びロデラ綱（Ｒｈｏｄｅｌｌｏｐｈｙｃｅａｅ）が挙げられる。イデユコゴメ綱（Ｃｙａｎｉｄｉｏｐｈｙｃｅａｅ）としては、シアニディオシゾン属（Ｃｙａｎｉｄｉｏｓｃｈｙｚｏｎ）、シアニジウム属（Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ）、及びガルディエリア属（Ｇａｌｄｉｅｒｉａ）が挙げられる。一実施形態において、藻類は、シアニディオシゾン・メロラエ（Ｃｙａｎｉｄｉｏｓｃｈｙｚｏｎ ｍｅｒｏｌａｅ）である。
【0022】
緑藻としては、緑藻綱（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｃｅａｅ）が挙げられる。緑藻綱としては、ヘマトコッカス属（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ）、クラミドモナス属（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）、ゴニウム属（Ｇｏｎｉｕｍ）、パンドリナ属（Ｐａｎｄｏｒｉｎａ）、ボルボックス属（Ｖｏｌｖｏｘ）、ドゥナリエラ属（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）等が挙げられる。緑藻の具体例としては、ヘマトコッカス・プルビアリス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）が挙げられる。
真正眼点藻としては、真正眼点藻綱（Ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｐｈｙｃｅａｅ）が挙げられる。真正眼点藻綱としては、ナンノクロロプシス属（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）、マイクロクロロプシス属（Ｍｉｃｒｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）、モノドプシス属（Ｍｏｎｏｄｏｐｓｉｓ）、ビスケリア属（Ｖｉｓｃｈｅｒｉａ）、クロロボトリス属（Ｃｈｌｏｒｏｂｏｔｒｙｓ）、ゴニオクロリス属（Ｇｏｎｉｏｃｈｌｏｒｉｓ）等が挙げられる。真正眼点藻の具体例としては、ナンノクロロプシス・ガディタナ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｇａｄｉｔａｎａ）が挙げられる。
珪藻としては、珪藻綱（Ｂａｃｉｌｌａｒｉｏｐｈｙｃｅａｅ）が挙げられる。珪藻綱としては、フェオダクチラム属（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ）、シネドラ属（Ｓｙｎｅｄｒａ）、アステリオネラ属（Ａｓｔｅｒｉｏｎｅｌｌａ）、キクロテラ属（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ）、メロシラ属（Ｍｅｌｏｓｉｒａ）、キートセロス属（Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ）、タラシオシラ属（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ）、レプトシリンドルス属（Ｌｅｐｔｏｃｙｌｉｎｄｒｕｓ）、ニッチア属（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ）、シリンドロテカ属（Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ）、ユーカンピア属（Ｅｕｃａｍｐｉａ）、オドンテラ属（Ｏｄｏｎｔｅｌｌａ）等が挙げられる。珪藻の具体例としては、フェオダクチラム・トリコルヌタム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）が挙げられる。
ハプト藻としては、ハプト藻綱（Ｈａｐｔｏｐｈｙｃｅａｅ）が挙げられる。ハプト藻綱としては、パブロバ亜綱（Ｐａｖｌｏｖｏｐｈｙｃｉｄａｅ）、プリムネシウム亜綱（Ｐｒｙｍｎｅｓｉｏｐｈｙｃｉｄａｅ）が挙げられる。パブロバ亜綱としては、ディアクロネマ属（Ｄｉａｃｒｏｎｅｍａ）、パブロバ属（Ｐａｖｌｏｖａ）、エクサンテマクリシス属（Ｅｘａｎｔｈｅｍａｃｈｒｙｓｉｓ）等が挙げられる。ハプト藻の具体例としては、ディアクロネマ・ルテリ（Ｄｉａｃｒｏｎｅｍａ ｌｕｔｈｅｒｉ）が挙げられる。
真正眼点藻としては、真正眼点藻綱（Ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｐｈｙｃｅａｅ）が挙げられる。真正眼点藻綱としては、ナンノクロロプシス属（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）、マイクロクロロプシス属（Ｍｉｃｒｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）、モノドプシス属（Ｍｏｎｏｄｏｐｓｉｓ）、ビスケリア属（Ｖｉｓｃｈｅｒｉａ）、クロロボトリス属（Ｃｈｌｏｒｏｂｏｔｒｙｓ）、ゴニオクロリス属（Ｇｏｎｉｏｃｈｌｏｒｉｓ）等が挙げられる。真正眼点藻の具体例としては、ナンノクロロプシス・ガディタナ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｇａｄｉｔａｎａ）が挙げられる。
珪藻としては、珪藻綱（Ｂａｃｉｌｌａｒｉｏｐｈｙｃｅａｅ）が挙げられる。珪藻綱としては、フェオダクチラム属（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ）、シネドラ属（Ｓｙｎｅｄｒａ）、アステリオネラ属（Ａｓｔｅｒｉｏｎｅｌｌａ）、キクロテラ属（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ）、メロシラ属（Ｍｅｌｏｓｉｒａ）、キートセロス属（Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ）、タラシオシラ属（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ）、レプトシリンドルス属（Ｌｅｐｔｏｃｙｌｉｎｄｒｕｓ）、ニッチア属（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ）、シリンドロテカ属（Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ）、ユーカンピア属（Ｅｕｃａｍｐｉａ）、オドンテラ属（Ｏｄｏｎｔｅｌｌａ）等が挙げられる。珪藻の具体例としては、フェオダクチラム・トリコルヌタム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）が挙げられる。
ハプト藻としては、ハプト藻綱（Ｈａｐｔｏｐｈｙｃｅａｅ）が挙げられる。ハプト藻綱としては、パブロバ亜綱（Ｐａｖｌｏｖｏｐｈｙｃｉｄａｅ）、プリムネシウム亜綱（Ｐｒｙｍｎｅｓｉｏｐｈｙｃｉｄａｅ）が挙げられる。パブロバ亜綱としては、ディアクロネマ属（Ｄｉａｃｒｏｎｅｍａ）、パブロバ属（Ｐａｖｌｏｖａ）、エクサンテマクリシス属（Ｅｘａｎｔｈｅｍａｃｈｒｙｓｉｓ）等が挙げられる。ハプト藻の具体例としては、ディアクロネマ・ルテリ（Ｄｉａｃｒｏｎｅｍａ ｌｕｔｈｅｒｉ）が挙げられる。
【0023】
（暗所活性型クリプトクロム）
「暗所活性型クリプトクロム」とは、暗所で活性が維持されるクリプトクロムを意味する。クリプトクロムは、青色光受容体であり、青色光を受光して活性化する。活性化したクリプトクロムは、遺伝子発現を直接又は間接的に制御して、光応答を誘導する。暗所活性型クリプトクロムは、暗所でも、活性化が維持され、青色光受光時と同様の光応答を誘導する。暗所活性型クリプトクロムは、藻類では、暗所における従属栄養的な生育を向上させる機能を有する。
具体的には、暗所活性型クリプトクロムを有する藻類は、暗所活性型クリプトクロムを有しない同種の藻類と比較して、暗所における従属栄養的な生育が改善する。より具体的には、暗所活性型クリプトクロムを有する藻類は、暗所活性型クリプトクロムを有しない同種の藻類と比較して、暗所において高い生育速度を有する。あるいは、暗所活性型クリプトクロムを有する藻類は、暗所活性型クリプトクロムを有しない同種の藻類と比較して、暗所における最大到達藻密度が高くなる。あるいは、暗所活性型クリプトクロムを有する藻類は、暗所における従属栄養培養において、継代を行っても継代後の生育速度が低下しない。
「暗所活性型クリプトクロム」とは、暗所で活性が維持されるクリプトクロムを意味する。クリプトクロムは、青色光受容体であり、青色光を受光して活性化する。活性化したクリプトクロムは、遺伝子発現を直接又は間接的に制御して、光応答を誘導する。暗所活性型クリプトクロムは、暗所でも、活性化が維持され、青色光受光時と同様の光応答を誘導する。暗所活性型クリプトクロムは、藻類では、暗所における従属栄養的な生育を向上させる機能を有する。
具体的には、暗所活性型クリプトクロムを有する藻類は、暗所活性型クリプトクロムを有しない同種の藻類と比較して、暗所における従属栄養的な生育が改善する。より具体的には、暗所活性型クリプトクロムを有する藻類は、暗所活性型クリプトクロムを有しない同種の藻類と比較して、暗所において高い生育速度を有する。あるいは、暗所活性型クリプトクロムを有する藻類は、暗所活性型クリプトクロムを有しない同種の藻類と比較して、暗所における最大到達藻密度が高くなる。あるいは、暗所活性型クリプトクロムを有する藻類は、暗所における従属栄養培養において、継代を行っても継代後の生育速度が低下しない。
【0024】
「暗所活性型クリプトクロムを有しない同種の藻類」とは、対象となる暗所活性型クリプトクロムを有する藻類と、分類学的な種が同じ藻類であって、且つ暗所活性型クリプトクロムを有しない藻類を意味する。一実施形態において、「暗所活性型クリプトクロムを有しない同種の藻類」は、対象となる暗所活性型クリプトクロム遺伝子を有する藻類と、実質的に同じ遺伝的背景を有する。「実質的に同じ遺伝的背景を有する」とは、暗所活性型クリプトクロム遺伝子（あるいは暗所活性型クリプトクロム遺伝子とマーカー遺伝子）以外のゲノム配列が、実質的に同じであることを意味する。藻類が後述の暗所不活性型クリプトクロムを有する場合、「実質的に同じ遺伝的背景を有する」とは、暗所活性型クリプトクロム遺伝子及び暗所不活性型クリプトクロム遺伝子（あるいは暗所活性型クリプトクロム遺伝子、暗所不活性型クリプトクロム遺伝子、及びマーカー遺伝子）以外のゲノム配列が、実質的に同じであることを意味してもよい。実質的に同じであるゲノム配列どうしは、例えば、９９％以上、９９．９％以上、９９．９９％以上、又は９９．９９９９％以上の配列同一性を有する。
【0025】
暗所活性型クリプトクロムを有する藻類が、暗所活性型クリプトクロムを有さない藻類に暗所活性型クリプトクロム遺伝子を導入して作製された形質転換体である場合、「暗所活性型クリプトクロムを有しない同種の藻類」は、当該遺伝子導入の対象となった親株（野生株）であってもよい。例えば、Ｃ．ｍｅｒｏｌａｅ ＮＥＩＳ－１８０４株に、暗所活性型クリプトクロム遺伝子を導入して、暗所活性型クリプトクロムを有する藻類を作製した場合、「暗所活性型クリプトクロムを有しない同種の藻類」は、Ｃ．ｍｅｒｏｌａｅ ＮＥＩＳ－１８０４株であってもよい。
【0026】
一実施形態において、暗所活性型クリプトクロムは、暗所で不活性化する暗所不活性型クリプトクロムと比較して、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）結合ドメインに変異を有する。「暗所不活性型クリプトクロム」は、野生型クリプトクロムであってもよい。一実施形態において、暗所不活性型クリプトクロムは、植物型クリプトクロムである。暗所不活性型クリプトクロムのＦＡＤ結合ドメインは、公知のタンパク質ドメインデータベースを利用したドメイン検索により、特定することができる。タンパク質ドメインデータベースとしては、例えば、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＥＭＢＬ－ＥＢＩ）が提供するＰｆａｍ等が挙げられる。
暗所不活性型クリプトクロムのＦＡＤ結合ドメインは、下記式（１）で表されるアミノ酸配列を含むことが好ましい。
ＬＸＺＸＷＸＸＧＸＸＸＪ （１）
［式中、Ｌはロイシン残基、Ｗはトリプトファン残基、Ｇはグリシン残基、Ｚは疎水性アミノ酸残基若しくは極性無電荷アミノ酸残基、Ｊは疎水性アミノ酸残基、Ｘは任意のアミノ酸残基を表す。］
暗所不活性型クリプトクロムのＦＡＤ結合ドメインは、下記式（１）で表されるアミノ酸配列を含むことが好ましい。
ＬＸＺＸＷＸＸＧＸＸＸＪ （１）
［式中、Ｌはロイシン残基、Ｗはトリプトファン残基、Ｇはグリシン残基、Ｚは疎水性アミノ酸残基若しくは極性無電荷アミノ酸残基、Ｊは疎水性アミノ酸残基、Ｘは任意のアミノ酸残基を表す。］
【0027】
式（１）中、Ｚは疎水性アミノ酸残基若しくは極性無電荷アミノ酸残基を表す。疎水性アミノ酸残基としては、ロイシン残基、イソロイシン残基、フェニルアラニン残基、トリプトファン残基、バリン残基、メチオニン残基、システイン残基、チロシン残基、アラニン残基が挙げられる。Ｚにおける疎水性アミノ酸残基としては、ロイシン残基、イソロイシン残基、フェニルアラニン残基、バリン残基、又はメチオニン残基が好ましく、ロイシン残基、イソロイシン残基、又はバリン残基がより好ましい。
極性無電荷アミノ酸残基としては、セリン残基、スレオニン残基、システイン残基、アスパラギン残基、グルタミン残基が挙げられる。Ｚにおける極性無電荷アミノ酸残基としては、グルタミン残基が好ましい。
Ｚとしては、疎水性アミノ酸残基又はグルタミン残基が好ましく、ロイシン残基、イソロイシン残基、バリン残基、メチオニン残基、又はグルタミン残基がさらに好ましく、ロイシン残基、イソロイシン残基、バリン残基、又はグルタミン残基が特に好ましい。
極性無電荷アミノ酸残基としては、セリン残基、スレオニン残基、システイン残基、アスパラギン残基、グルタミン残基が挙げられる。Ｚにおける極性無電荷アミノ酸残基としては、グルタミン残基が好ましい。
Ｚとしては、疎水性アミノ酸残基又はグルタミン残基が好ましく、ロイシン残基、イソロイシン残基、バリン残基、メチオニン残基、又はグルタミン残基がさらに好ましく、ロイシン残基、イソロイシン残基、バリン残基、又はグルタミン残基が特に好ましい。
【0028】
式（１）中、Ｊは疎水性アミノ酸残基を表す。疎水性アミノ酸残基としては、ロイシン残基、イソロイシン残基、フェニルアラニン残基、トリプトファン残基、バリン残基、メチオニン残基、システイン残基、チロシン残基、アラニン残基が挙げられる。Ｊにおける疎水性アミノ酸残基としては、ロイシン残基、イソロイシン残基、フェニルアラニン残基、バリン残基、メチオニン残基、又はチロシン残基が好ましく、ロイシン残基、イソロイシン残基、フェニルアラニン残基、又はチロシン残基がより好ましい。
【0029】
式（１）中、Ｘは任意のアミノ酸残基を表す。式（１）中のＸを、Ｎ末端側から順に、Ｘ１～Ｘ７とすると、式（１）は、以下のように表すことができる。
ＬＸ１ＺＸ２ＷＸ３Ｘ４ＧＸ５Ｘ６Ｘ７Ｊ （１）’
ＬＸ１ＺＸ２ＷＸ３Ｘ４ＧＸ５Ｘ６Ｘ７Ｊ （１）’
【0030】
Ｘ１は、疎水性アミノ酸残基、塩基性アミノ酸残基、又はグリシン残基が好ましい。疎水性アミノ酸残基としては、ロイシン残基、トリプトファン残基、又はチロシン残基が好ましい。塩基性アミノ酸残基としては、アルギニン残基、又はヒスチジン残基が好ましい。Ｘ１としては、ロイシン残基、トリプトファン残基、チロシン残基、アルギニン残基、ヒスチジン残基、又はグリシン残基が好ましい。
【0031】
Ｘ２は、プロリン残基、セリン残基、アスパラギン酸残基、又はアルギニン残基が好ましく、プロリン残基、セリン残基、又はアスパラギン酸残基がより好ましく、プロリン残基又はセリン残基がさらに好ましく、プロリン残基が特に好ましい。
【0032】
Ｘ３は、親水性アミノ酸残基が好ましい。親水性アミノ酸残基としては、極性無電荷アミノ酸残基、塩基性アミノ酸残基、酸性アミノ酸残基が挙げられる。Ｘ３における極性無電荷アミノ酸残基としては、グルタミン残基又はスレオニン残基が好ましく、グルタミン残基がより好ましい。Ｘ３における塩基性アミノ酸残基としては、アルギニン残基又はリジン残基が好ましい。酸性アミノ酸残基としては、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基が挙げられる。Ｘ３における酸性アミノ酸残基としては、グルタミン酸残基が好ましい。Ｘ３としては、グルタミン残基、スレオニン残基、グルタミン酸残基、アルギニン残基、又はリジン残基が好ましい。
【0033】
Ｘ４は、疎水性アミノ酸残基、酸性アミノ酸残基、又は塩基性アミノ酸残基が好ましい。Ｘ４における疎水性アミノ酸残基としては、イソロイシン残基、トリプトファン残基、又はアラニン残基が好ましい。Ｘ４における酸性アミノ酸残基としては、グルタミン酸残基、又はアスパラギン酸残基が好ましい。Ｘ４における塩基性アミノ酸残基としては、ヒスチジン残基、又はリジン残基が好ましい。Ｘ４としては、イソロイシン残基、トリプトファン残基、アラニン残基、グルタミン酸残基、アスパラギン酸残基ヒスチジン残基、又はリジン残基が好ましい。
【0034】
Ｘ５は、疎水性アミノ酸残基、又は酸性アミノ酸残基が好ましい。Ｘ５における疎水性アミノ酸残基としては、アラニン残基、ロイシン残基、又はメチオニン残基が好ましい。Ｘ５における酸性アミノ酸残基としては、グルタミン酸残基が好ましい。Ｘ５としては、アラニン残基、ロイシン残基、メチオニン残基、又はグルタミン酸残基が好ましい。
【0035】
Ｘ６は、塩基性アミノ酸残基、極性無電荷アミノ酸残基、酸性アミノ酸残基、又はアラニン残基が好ましい。Ｘ６における塩基性アミノ酸残基としては、アルギニン残基、又はリジン残基が好ましい。Ｘ６における極性無電荷アミノ酸残基としては、スレオニン残基、又はグルタミン残基が好ましい。Ｘ６における酸性アミノ酸残基としては、グルタミン酸残基が好ましい。Ｘ６としては、アルギニン残基、リジン残基、スレオニン残基、グルタミン残基、グルタミン酸残基、又はアラニン残基が好ましい。
【0036】
Ｘ７は、疎水性アミノ酸残基、極性無電荷アミノ酸残基、又は塩基性アミノ酸残基が好ましい。Ｘ７における疎水性アミノ酸残基としては、フェニルアラニン残基、バリン残基、トリプトファン残基、又はチロシン残基が好ましい。Ｘ７における極性無電荷アミノ酸残基としては、システイン残基が好ましい。Ｘ７における塩基性アミノ酸残基としては、ヒスチジン残基が好ましい。Ｘ７としては、フェニルアラニン残基、バリン残基、トリプトファン残基、チロシン残基、システイン残基、又はヒスチジン残基が好ましい。
【0037】
式（１）で表されるアミノ酸配列は、下記式（２）で表されるアミノ酸配列（配列番号２）が好ましく、下記式（３）で表されるアミノ酸配列（配列番号３）がより好ましい。
ＬＸＪＰＷＸＸＧＸＸＸＪ （２）
ＬＸＪＰＷＸＸＧＸＸＡＸＪ （３）
［式中、Ｌはロイシン残基、Ｐはプロリン残基、Ｗはトリプトファン残基、Ｇはグリシン残基、Ｊは疎水性アミノ酸残基、ＸＡは塩基性アミノ酸残基、Ｘは任意のアミノ酸残基を表す。］
ＬＸＪＰＷＸＸＧＸＸＸＪ （２）
ＬＸＪＰＷＸＸＧＸＸＡＸＪ （３）
［式中、Ｌはロイシン残基、Ｐはプロリン残基、Ｗはトリプトファン残基、Ｇはグリシン残基、Ｊは疎水性アミノ酸残基、ＸＡは塩基性アミノ酸残基、Ｘは任意のアミノ酸残基を表す。］
【0038】
式（１）で表されるアミノ酸配列の具体例としては、配列番号７、８、３５、３８、４１、４４、４７、５０、５３、６３、６６、６９、７２、７５、又は７８に記載のアミノ酸配列が挙げられる。配列番号７に記載のアミノ酸配列は、Ｃ．ｍｅｒｏｌａｅのクリプトクロム（ＣＹＭＥ＿ＣＭＭ０７６Ｃ）が含むアミノ酸配列である。配列番号８に記載のアミノ酸配列は、Ｃ．ｍｅｒｏｌａｅのクリプトクロム（ＣＹＭＥ＿ＣＭＱ４５３Ｃ）が含むアミノ酸配列である。配列番号３５に記載のアミノ酸配列は、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｕｓｔｒｉｓのＱＮＬ１０７３７．１が含むアミノ酸配列である。配列番号３８に記載のアミノ酸配列は、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｇａｄｉｔａｎａのＥＷＭ２３８９３が含むアミノ酸配列である。配列番号４１に記載のアミノ酸配列は、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｇａｄｉｔａｎａのＸＰ＿００５８５２６３７が含むアミノ酸配列である。配列番号４４に記載のアミノ酸配列は、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍのＸＰ＿００２１７９３７９が含むアミノ酸配列である。配列番号４７に記載のアミノ酸配列は、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍのＸＰ＿００２１８００９５が含むアミノ酸配列である。配列番号５０に記載のアミノ酸配列は、Ｄｉａｃｒｏｎｅｍａ ｌｕｔｈｅｒｉのＫＡＧ８４５８１８８が含むアミノ酸配列である。配列番号５３に記載のアミノ酸配列は、Ｄｉａｃｒｏｎｅｍａ ｌｕｔｈｅｒｉのＫＡＧ８４６３４０２が含むアミノ酸配列である。配列番号６３に記載のアミノ酸配列は、Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｍｕｅｌｌｅｒｉのＧＥＮＥ１が含むアミノ酸配列である。配列番号６６に記載のアミノ酸配列は、Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｍｕｅｌｌｅｒｉのＧＥＮＥ２が含むアミノ酸配列である。配列番号６９に記載のアミノ酸配列は、Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｍｕｅｌｌｅｒｉのＧＥＮＥ３が含むアミノ酸配列である。配列番号７２に記載のアミノ酸配列は、Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｇｒａｃｉｌｉｓのＧＥＮＥ５が含むアミノ酸配列である。配列番号７５に記載のアミノ酸配列は、Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｇｒａｃｉｌｉｓのＧＥＮＥ６が含むアミノ酸配列である。配列番号７８に記載のアミノ酸配列は、Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｇｒａｃｉｌｉｓのＧＥＮＥ７が含むアミノ酸配列である。
ＬＬＬＰＷＱＩＧＡＲＣＬ（配列番号７）
ＬＬＩＰＷＱＨＧＬＲＦＬ（配列番号８）
ＬＬＬＰＷＱＷＧＬＫＨＹ（配列番号３５）
ＬＷＱＳＷＥＥＧＡＲＶＦ（配列番号３８）
ＬＷＱＳＷＥＥＧＡＲＶＦ（配列番号４１）
ＬＲＶＤＷＴＫＧＡＥＷＦ（配列番号４４）
ＬＷＱＳＷＥＤＧＡＴＶＦ（配列番号４７）
ＬＬＶＤＷＲＨＧＡＲＷＦ（配列番号５０）
ＬＹＶＲＷＥＥＧＡＡＶＦ（配列番号５３）
ＬＷＱＳＷＥＫＧＡＥＨＦ（配列番号６３）
ＬＧＬＳＷＫＤＧＭＱＨＦ（配列番号６６）
ＬＨＬＤＷＲＡＧＡＥＷＦ（配列番号６９）
ＬＷＱＳＷＥＫＧＡＥＨＦ（配列番号７２）
ＬＬＩＤＷＲＷＧＥＡＹＦ（配列番号７５）
ＬＧＬＳＷＫＤＧＭＱＨＦ（配列番号７８）
ＬＬＬＰＷＱＩＧＡＲＣＬ（配列番号７）
ＬＬＩＰＷＱＨＧＬＲＦＬ（配列番号８）
ＬＬＬＰＷＱＷＧＬＫＨＹ（配列番号３５）
ＬＷＱＳＷＥＥＧＡＲＶＦ（配列番号３８）
ＬＷＱＳＷＥＥＧＡＲＶＦ（配列番号４１）
ＬＲＶＤＷＴＫＧＡＥＷＦ（配列番号４４）
ＬＷＱＳＷＥＤＧＡＴＶＦ（配列番号４７）
ＬＬＶＤＷＲＨＧＡＲＷＦ（配列番号５０）
ＬＹＶＲＷＥＥＧＡＡＶＦ（配列番号５３）
ＬＷＱＳＷＥＫＧＡＥＨＦ（配列番号６３）
ＬＧＬＳＷＫＤＧＭＱＨＦ（配列番号６６）
ＬＨＬＤＷＲＡＧＡＥＷＦ（配列番号６９）
ＬＷＱＳＷＥＫＧＡＥＨＦ（配列番号７２）
ＬＬＩＤＷＲＷＧＥＡＹＦ（配列番号７５）
ＬＧＬＳＷＫＤＧＭＱＨＦ（配列番号７８）
【0039】
暗所活性型クリプトクロムは、暗所不活性型クリプトクロムの式（１）で表されるアミノ酸配列中に変異を有することが好ましい。変異されるアミノ酸残基としては、例えば、式（１）で表されるアミノ酸配列の１番目のロイシン残基（Ｌ）、５番目のトリプトファン残基（Ｗ）、８番目のグリシン残基（Ｇ）、１２番目のロイシン残基（Ｌ）等が挙げられる。変異されるアミノ酸残基としては、式（１）で表されるアミノ酸配列における８番目のグリシン残基（Ｇ）が好ましい。変異は、他のアミノ酸残基への置換が好ましい。
暗所活性型クリプトクロムは、暗所不活性型クリプトクロムの式（１）で表されるアミノ酸配列における８番目のグリシン残基（Ｇ）が、他のアミノ酸残基に置換されたものであることが好ましい。式（１）で表されるアミノ酸配列における８番目のグリシン残基（Ｇ）は、塩基性アミノ酸残基に置換されることが好ましい。塩基性アミノ酸残基としては、アルギニン残基（Ｒ）、リジン残基（Ｋ）、及びヒスチジン残基（Ｈ）が挙げられる。式（１）で表されるアミノ酸配列における８番目のグリシン残基（Ｇ）は、アルギニン残基（Ｒ）又はリジン残基（Ｋ）に置換されることが好ましく、アルギニン残基（Ｒ）に置換されることがより好ましい。
暗所活性型クリプトクロムは、暗所不活性型クリプトクロムの式（１）で表されるアミノ酸配列における８番目のグリシン残基（Ｇ）が、他のアミノ酸残基に置換されたものであることが好ましい。式（１）で表されるアミノ酸配列における８番目のグリシン残基（Ｇ）は、塩基性アミノ酸残基に置換されることが好ましい。塩基性アミノ酸残基としては、アルギニン残基（Ｒ）、リジン残基（Ｋ）、及びヒスチジン残基（Ｈ）が挙げられる。式（１）で表されるアミノ酸配列における８番目のグリシン残基（Ｇ）は、アルギニン残基（Ｒ）又はリジン残基（Ｋ）に置換されることが好ましく、アルギニン残基（Ｒ）に置換されることがより好ましい。
【0040】
暗所活性型クリプトクロムは、下記式（４）で表されるアミノ酸配列を含むことが好ましく、下記式（５）で表されるアミノ酸配列を含むことがより好ましく、下記式（６）で表されるアミノ酸配列を含むことがさらに好ましい。下記式（４）～（６）中、８番目のＸＡは、アルギニン残基又はリジン残基が好ましく、アルギニン残基がより好ましい。下記式（４）～（６）中、Ｚ、Ｊ及び各Ｘの好ましい例は、上記式（１）と同様である。
ＬＸＺＸＷＸＸＸＡＸＸＸＪ （４）
ＬＸＪＰＷＸＸＸＡＸＸＸＪ （５）
ＬＸＪＰＷＸＸＸＡＸＸＡＸＪ （６）
［式中、Ｌはロイシン残基、Ｐはプロリン残基、Ｗはトリプトファン残基、Ｇはグリシン残基、Ｚは疎水性アミノ酸残基若しくは極性無電荷アミノ酸残基、Ｊは疎水性アミノ酸残基、ＸＡは塩基性アミノ酸残基、Ｘは任意のアミノ酸残基を表す。］
ＬＸＺＸＷＸＸＸＡＸＸＸＪ （４）
ＬＸＪＰＷＸＸＸＡＸＸＸＪ （５）
ＬＸＪＰＷＸＸＸＡＸＸＡＸＪ （６）
［式中、Ｌはロイシン残基、Ｐはプロリン残基、Ｗはトリプトファン残基、Ｇはグリシン残基、Ｚは疎水性アミノ酸残基若しくは極性無電荷アミノ酸残基、Ｊは疎水性アミノ酸残基、ＸＡは塩基性アミノ酸残基、Ｘは任意のアミノ酸残基を表す。］
【0041】
暗所活性型クリプトクロムは、配列番号９、１０、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、７９、８０、８１、８２、８３、又は８４に記載のアミノ酸配列を含むことが好ましい。
ＬＬＬＰＷＱＩＲＡＲＣＬ（配列番号９）
ＬＬＩＰＷＱＨＲＬＲＦＬ（配列番号１０）
ＬＬＬＰＷＱＷＲＬＫＨＹ（配列番号５４）
ＬＷＱＳＷＥＥＲＡＲＶＦ（配列番号５５）
ＬＷＱＳＷＥＥＲＡＲＶＦ（配列番号５６）
ＬＲＶＤＷＴＫＲＡＥＷＦ（配列番号５７）
ＬＷＱＳＷＥＤＲＡＴＶＦ（配列番号５８）
ＬＬＶＤＷＲＨＲＡＲＷＦ（配列番号５９）
ＬＹＶＲＷＥＥＲＡＡＶＦ（配列番号６０）
ＬＷＱＳＷＥＫＲＡＥＨＦ（配列番号７９）
ＬＧＬＳＷＫＤＲＭＱＨＦ（配列番号８０）
ＬＨＬＤＷＲＡＲＡＥＷＦ（配列番号８１）
ＬＷＱＳＷＥＫＲＡＥＨＦ（配列番号８２）
ＬＬＩＤＷＲＷＲＥＡＹＦ（配列番号８３）
ＬＧＬＳＷＫＤＲＭＱＨＦ（配列番号８４）
ＬＬＬＰＷＱＩＲＡＲＣＬ（配列番号９）
ＬＬＩＰＷＱＨＲＬＲＦＬ（配列番号１０）
ＬＬＬＰＷＱＷＲＬＫＨＹ（配列番号５４）
ＬＷＱＳＷＥＥＲＡＲＶＦ（配列番号５５）
ＬＷＱＳＷＥＥＲＡＲＶＦ（配列番号５６）
ＬＲＶＤＷＴＫＲＡＥＷＦ（配列番号５７）
ＬＷＱＳＷＥＤＲＡＴＶＦ（配列番号５８）
ＬＬＶＤＷＲＨＲＡＲＷＦ（配列番号５９）
ＬＹＶＲＷＥＥＲＡＡＶＦ（配列番号６０）
ＬＷＱＳＷＥＫＲＡＥＨＦ（配列番号７９）
ＬＧＬＳＷＫＤＲＭＱＨＦ（配列番号８０）
ＬＨＬＤＷＲＡＲＡＥＷＦ（配列番号８１）
ＬＷＱＳＷＥＫＲＡＥＨＦ（配列番号８２）
ＬＬＩＤＷＲＷＲＥＡＹＦ（配列番号８３）
ＬＧＬＳＷＫＤＲＭＱＨＦ（配列番号８４）
【0042】
暗所活性型クリプトクロムの具体例としては、下記（ａ）～（ｃ）からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドが挙げられる。
（ａ）配列番号１２、１４、３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、６２、６５、６８、７１、７４、又は７７に記載のアミノ酸配列において、下記式（１）で表されるアミノ酸配列の８番目のグリシン残基が塩基性アミノ酸残基に置換されている、アミノ酸配列、
ＬＸＺＸＷＸＸＧＸＸＸＪ （１）
［式中、Ｌはロイシン残基、Ｗはトリプトファン残基、Ｇはグリシン残基、Ｚは疎水性アミノ酸残基若しくは極性無電荷アミノ酸残基、Ｊは疎水性アミノ酸残基、Ｘは任意のアミノ酸残基を表す。］；
（ｂ）配列番号１２、１４、３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、６２、６５、６８、７１、７４、又は７７に記載のアミノ酸配列において、１個又は複数個のアミノ酸が変異されたアミノ酸配列であって、且つ前記変異が前記式（１）で表されるアミノ酸配列の８番目のグリシン残基を塩基性アミノ酸残基に置換する変異を含む、アミノ酸配列；及び
（ｃ）配列番号１２、１４、３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、６２、６５、６８、７１、７４、又は７７に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、且つ前記式（１）で表されるアミノ酸配列の８番目のグリシン残基が塩基性アミノ酸残基に置換されている、アミノ酸配列。
（ａ）配列番号１２、１４、３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、６２、６５、６８、７１、７４、又は７７に記載のアミノ酸配列において、下記式（１）で表されるアミノ酸配列の８番目のグリシン残基が塩基性アミノ酸残基に置換されている、アミノ酸配列、
ＬＸＺＸＷＸＸＧＸＸＸＪ （１）
［式中、Ｌはロイシン残基、Ｗはトリプトファン残基、Ｇはグリシン残基、Ｚは疎水性アミノ酸残基若しくは極性無電荷アミノ酸残基、Ｊは疎水性アミノ酸残基、Ｘは任意のアミノ酸残基を表す。］；
（ｂ）配列番号１２、１４、３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、６２、６５、６８、７１、７４、又は７７に記載のアミノ酸配列において、１個又は複数個のアミノ酸が変異されたアミノ酸配列であって、且つ前記変異が前記式（１）で表されるアミノ酸配列の８番目のグリシン残基を塩基性アミノ酸残基に置換する変異を含む、アミノ酸配列；及び
（ｃ）配列番号１２、１４、３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、６２、６５、６８、７１、７４、又は７７に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、且つ前記式（１）で表されるアミノ酸配列の８番目のグリシン残基が塩基性アミノ酸残基に置換されている、アミノ酸配列。
【0043】
前記（ｂ）において、「複数個」としては、２～２０個、２～１５個、２～１０個、２～９個、２～８個、２～７個、２～６個、２～５個、２～４個、２～３個、又は２個が挙げられる。
前記（ｃ）において、配列同一性は、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上であってもよい。
前記（ｂ）のアミノ酸配列は、配列番号１２、１４、３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、６２、６５、６８、７１、７４、又は７７に記載のアミノ酸配列において、１個又は複数個のアミノ酸が変異されたアミノ酸配列であって、且つ前記式（４）で表されるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列であることが好ましい。前記（ｃ）のアミノ酸配列は配列番号１２、１４、３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、６２、６５、６８、７１、７４、又は７７に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、且つ前記式（４）で表されるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列であることが好ましい。前記式（４）で表されるアミノ酸配列は、前記式（５）で表されるアミノ酸配列であることが好ましく、前記式（６）で表されるアミノ酸配列であることが好ましい。
前記（ｃ）において、配列同一性は、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上であってもよい。
前記（ｂ）のアミノ酸配列は、配列番号１２、１４、３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、６２、６５、６８、７１、７４、又は７７に記載のアミノ酸配列において、１個又は複数個のアミノ酸が変異されたアミノ酸配列であって、且つ前記式（４）で表されるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列であることが好ましい。前記（ｃ）のアミノ酸配列は配列番号１２、１４、３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、６２、６５、６８、７１、７４、又は７７に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、且つ前記式（４）で表されるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列であることが好ましい。前記式（４）で表されるアミノ酸配列は、前記式（５）で表されるアミノ酸配列であることが好ましく、前記式（６）で表されるアミノ酸配列であることが好ましい。
【0044】
暗所活性型クリプトクロムは、暗所不活性型クリプトクロムと比較して、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）のクリプトクロムＣＲＹ１（以下、「シロイヌナズナＣＲＹ１」という）（配列番号３２）とアライメントしたとき、シロイヌナズナＣＲＹ１の３８０番目のグリシン残基（Ｇ３８０）に対応するアミノ酸残基が、塩基性アミノ酸残基に変異されていてもよい。塩基性アミノ酸としては、アルギニン残基又リジン残基が好ましく、アルギニン残基がより好ましい。
暗所活性型クリプトクロムの具体例としては、配列番号１６又は１８に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドが挙げられる。
暗所活性型クリプトクロムの具体例としては、配列番号１６又は１８に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドが挙げられる。
【0045】
≪暗所活性型クリプトクロム遺伝子の取得方法≫
暗所活性型クリプトクロムを有する藻類は、暗所活性型クリプトクロムを発現する暗所活性型クリプトクロム遺伝子を有する。暗所活性型クリプトクロム遺伝子は、野生型クリプトクロム遺伝子に、暗所活性型クリプトクロムを発現するような変異を導入することにより取得してもよい。野生型クリプトクロム遺伝子は、公知のものを用いてもよく、所望の藻類において新たに同定してもよい。公知の野生型クリプトクロム遺伝子は、例えば、遺伝子データベース（ＧｅｎＢａｎｋ、Ｕｎｉｐｒｏｔ等）に登録されたものを用いてもよい。
暗所活性型クリプトクロムを有する藻類は、暗所活性型クリプトクロムを発現する暗所活性型クリプトクロム遺伝子を有する。暗所活性型クリプトクロム遺伝子は、野生型クリプトクロム遺伝子に、暗所活性型クリプトクロムを発現するような変異を導入することにより取得してもよい。野生型クリプトクロム遺伝子は、公知のものを用いてもよく、所望の藻類において新たに同定してもよい。公知の野生型クリプトクロム遺伝子は、例えば、遺伝子データベース（ＧｅｎＢａｎｋ、Ｕｎｉｐｒｏｔ等）に登録されたものを用いてもよい。
【0046】
野生型クリプトクロム遺伝子を新たに同定する場合、同定方法は特に限定されず、公知の方法を用いることができる。例えば、既存の野生型クリプトクロムのアミノ酸配列をクエリーとして、タンパク質配列データベース（例えば、Ｎｏｎ－ｒｅｄｕｎｄａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅデータベース）に対して、相同性検索を行ってもよい。相同性検索は、例えば、ＢＬＡＳＴＰを用いて行うことができる。相同性検索の結果、例えば、クエリーとして用いた野生型クリプトクロムのアミノ酸配列に対して、２０％以上、２１％以上、２２％以上、２３％以上、２４％以上、２５％以上、２６％以上、２７％以上、２８％以上、２９％以上、又は３０％以上の相同性を示すタンパク質配列を、クリプトクロム候補配列として取得してもよい。既存の野生型クリプトクロムとしては、例えば、シロイヌナズナＣＲＹ１（配列番号３２）、Ｃ．ｍｅｒｏｌａｅのＣＹＭＥ＿ＣＭＭ０７６Ｃ（配列番号１２）、Ｃ．ｍｅｒｏｌａｅのＣＹＭＥ＿ＣＭＱ４５３Ｃ（配列番号１４）、Ｈ．ｌａｃｕｓｔｒｉｓのＱＮＬ１０７３７．１（配列番号３４）等が挙げられる。野生型クリプトクロムと相同性を示すタンパク質をコードする遺伝子を、野生型クリプトクロム候補遺伝子として取得することができる。
【0047】
所望の藻類において、ゲノム解読が十分に行われていない場合には、公知の方法によりゲノム解読を行い、ゲノム配列を取得してもよい。ゲノム解読は、例えば、次世代シーケンサーを用いて行うことができる。取得したゲノム配列に対して、既存の野生型クリプトクロムの遺伝子配列をクエリーとして、相同性検索を行うことにより、野生型クリプトクロム候補遺伝子を取得することができる。相同性検索は、例えば、ＢＬＡＳＴＮを用いて行うことができる。あるいは、ゲノム配列からＯＲＦを推定し、前記ＯＲＦにコードされるタンパク質のアミノ酸配列を取得してもよい。当該アミノ酸配列に対して、上記と同様に、既存の野生型クリプトクロムのアミノ酸配列をクエリーとして、相同性検索を行うことにより、野生型クリプトクロム候補配列を取得することができる。当該アミノ酸配列をコードするＯＲＦを、野生型クリプトクロム候補遺伝子として取得することができる。
【0048】
あるいは、所望の藻類のｃＤＮＡライブラリーを作製し、クリプトクロム候補遺伝子を探索してもよい。例えば、既存の野生型クリプトクロムの全長ｃＤＮＡ又はその部分断片をプローブとして用いて、所望の藻類のｃＤＮＡライブラリーを探索してもよい。プローブとハイブリダイズしたｃＤＮＡを、クリプトクロム候補遺伝子のｃＤＮＡとして取得することができる。プローブ用のクリプトクロムｃＤＮＡとしては、例えば、シロイヌナズナＣＲＹ１のｃＤＮＡ（配列番号３１）、ＣＹＭＥ＿ＣＭＭ０７６ＣのｃＤＮＡ（配列番号１１）、Ｃ．ｍｅｒｏｌａｅのＣＹＭＥ＿ＣＭＱ４５３ＣのｃＤＮＡ（配列番号１３）、Ｈ．ｌａｃｕｓｔｒｉｓのＱＮＬ１０７３７．１のｃＤＮＡ（配列番号３３）等が挙げられる。
あるいは、既存の野生型クリプトクロムのアミノ酸配列から、ディジェネレートプライマーを設計し、所望の藻類のｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、ディジェネレートＰＣＲを行ってもよい。ディジェネレートＰＣＲにより増幅された核酸断片の配列解析を行うことにより、クリプトクロム候補遺伝子の部分配列を得ることができる。次いで、得られた部分配列からインバースプライマーを設計し、ｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、インバースＰＣＲを行ってもよい。これにより、野生型クリプトクロム候補遺伝子のｃＤＮＡ全長配列を得ることができる。
取得した野生型クリプトクロム候補遺伝子のｃＤＮＡ配列が不完全である場合には、５’ＲＡＣＥ法及び３’ＲＡＣＥ法等を利用して、完全長のｃＤＮＡ配列を取得してもよい。
あるいは、既存の野生型クリプトクロムのアミノ酸配列から、ディジェネレートプライマーを設計し、所望の藻類のｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、ディジェネレートＰＣＲを行ってもよい。ディジェネレートＰＣＲにより増幅された核酸断片の配列解析を行うことにより、クリプトクロム候補遺伝子の部分配列を得ることができる。次いで、得られた部分配列からインバースプライマーを設計し、ｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、インバースＰＣＲを行ってもよい。これにより、野生型クリプトクロム候補遺伝子のｃＤＮＡ全長配列を得ることができる。
取得した野生型クリプトクロム候補遺伝子のｃＤＮＡ配列が不完全である場合には、５’ＲＡＣＥ法及び３’ＲＡＣＥ法等を利用して、完全長のｃＤＮＡ配列を取得してもよい。
【0049】
所望の藻類の野生型クリプトクロム候補遺伝子を取得した後、当該候補遺伝子がコードするタンパク質（候補タンパク質）についてドメイン検索を行ってもよい。タンパク質ドメイン検索は、例えば、公知のタンパク質ドメインデータベース（Ｐｆａｍ等）を利用して行うことができる。タンパク質ドメイン検索の結果、ＦＡＤ結合ドメインを有さないタンパク質をコードする候補遺伝子は、野生型クリプトクロム候補遺伝子から除外してもよい。
【0050】
シロイヌナズナのＣＲＹ１のアミノ酸配列（配列番号３２）とのアライメントを行い、シロイヌナズナＣＲＹ１の３５９番目のアスパラギン酸残基（Ｄ３５９）及び３６３番目のバリン残基（Ｖ３６３）に対応するアミノ酸残基がヒスチジン残基であるタンパク質は、フォトリアーゼである可能性が高い。そのため、そのようなタンパク質をコードする候補遺伝子は、野生型クリプトクロム候補遺伝子から除外してもよい。アライメントには、ＢＬＡＳＴＰ、又はＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ等を用いることができる。
【0051】
所望の藻類から複数の候補遺伝子が単離された場合、それらの候補遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列について、系統解析を行い、既存の野生型クリプトクロムとより近縁のタンパク質をコードする候補遺伝子を野生型クリプトクロム遺伝子として選択してもよい。既存の野生型クリプトクロムとしては、シロイヌナズナＣＲＹ１、Ｃ．ｍｅｒｏｌａｅのＣＹＭＥ＿ＣＭＭ０７６Ｃ及びＣＹＭＥ＿ＣＭＱ４５３Ｃ、並びにＨ．ｌａｃｕｓｔｒｉｓのＱＮＬ１０７３７．１等が挙げられる。
【0052】
前記式（１）で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする候補遺伝子を、クリプトクロム遺伝子として選択してもよい。前記式（１）で表されるアミノ酸配列は、前記式（２）で表されるアミノ酸配列が好ましく、前記式（３）で表されるアミノ酸配列がより好ましい。
【0053】
シロイヌナズナのＣＲＹ１のアミノ酸配列（配列番号３２）とのアライメントを行い、シロイヌナズナＣＲＹ１の３８０番目のグリシン残基（Ｇ３８０）に対応するアミノ酸残基がグリシン残基であるタンパク質をコードする候補遺伝子を、野生型クリプトクロム遺伝子として選択してもよい。
【0054】
取得した野生型クリプトクロム遺伝子に対して、暗所活性型クリプトクロムを発現するような変異を導入することにより、暗所活性型クリプトクロム遺伝子を取得することができる。変異の導入は、公知の方法を用いて行うことができる。変異の導入方法としては、例えば、所望の位置に変異を導入したプライマーを用いて、インバースＰＣＲを行う方法等が挙げられる。変異の導入には、市販の変異導入キットを用いてもよい。
変異の導入箇所としては、上記で挙げた箇所が挙げられる。変異導入箇所としては、ＦＡＤ結合ドメインが好ましく、前記式（１）で表されるアミノ酸配列がより好ましく、前記式（１）で表されるアミノ酸配列における８番目のグリシン残基がさらに好ましい。変異導入箇所は、シロイヌナズナのＣＲＹ１のアミノ酸配列（配列番号３２）とアライメントしたとき、シロイヌナズナＣＲＹ１の３８０番目のグリシン残基（Ｇ３８０）に対応するアミノ酸残基であってもよい。
変異の導入箇所としては、上記で挙げた箇所が挙げられる。変異導入箇所としては、ＦＡＤ結合ドメインが好ましく、前記式（１）で表されるアミノ酸配列がより好ましく、前記式（１）で表されるアミノ酸配列における８番目のグリシン残基がさらに好ましい。変異導入箇所は、シロイヌナズナのＣＲＹ１のアミノ酸配列（配列番号３２）とアライメントしたとき、シロイヌナズナＣＲＹ１の３８０番目のグリシン残基（Ｇ３８０）に対応するアミノ酸残基であってもよい。
【0055】
取得した遺伝子が暗所活性型クリプトクロムを発現することは、当該遺伝子を藻類に導入し、暗所で従属栄養培養することにより、確認することができる。遺伝子が暗所活性型クリプトクロムを発現する場合には、当該遺伝子を導入していない元の藻類と比較して、暗所での従属栄養的な生育が改善する。従属栄養的な生育の改善としては、例えば、従属栄養培養における生育速度の向上、従属栄養培養における最大到達藻密度の向上、及び従属栄養培養における植え継ぎ後の生育速度の向上、等が挙げられる。
暗所活性型クリプトクロムを発現するように改変された藻類は、同じ条件下で従属栄養培養したとき、元の藻類と比較して、１．２倍以上、１．５倍以上、１．８倍以上、２倍以上、２．２倍以上、２．５倍以上、２．７倍以上、３倍以上、３．２倍以上、３．５倍以上、３．７倍以上、４倍以上、４．２倍以上、４．５倍以上、４．７倍以上、又は５倍以上の比増殖速度を有してもよい。
暗所活性型クリプトクロムを発現するように改変された藻類は、同じ条件下で従属栄養培養したとき、元の藻類と比較して、１．２倍以上、１．５倍以上、１．８倍以上、２倍以上、２．２倍以上、２．５倍以上、２．７倍以上、３倍以上、３．２倍以上、３．５倍以上、３．７倍以上、４倍以上、４．２倍以上、４．５倍以上、４．７倍以上、又は５倍以上の最大到達藻密度を有してもよい。
暗所活性型クリプトクロムを発現するように改変された藻類は、同じ条件下の従属栄養培養で植え継ぎを行ったとき、植え継ぎ後の比増殖速度が、元の藻類と比較して、１．２倍以上、１．５倍以上、１．８倍以上、２倍以上、２．２倍以上、２．５倍以上、２．７倍以上、３倍以上、３．２倍以上、３．５倍以上、３．７倍以上、４倍以上、４．２倍以上、４．５倍以上、４．７倍以上、又は５倍以上であってもよい。
暗所活性型クリプトクロムを発現するように改変された藻類は、同じ条件下で従属栄養培養したとき、元の藻類と比較して、１．２倍以上、１．５倍以上、１．８倍以上、２倍以上、２．２倍以上、２．５倍以上、２．７倍以上、３倍以上、３．２倍以上、３．５倍以上、３．７倍以上、４倍以上、４．２倍以上、４．５倍以上、４．７倍以上、又は５倍以上の比増殖速度を有してもよい。
暗所活性型クリプトクロムを発現するように改変された藻類は、同じ条件下で従属栄養培養したとき、元の藻類と比較して、１．２倍以上、１．５倍以上、１．８倍以上、２倍以上、２．２倍以上、２．５倍以上、２．７倍以上、３倍以上、３．２倍以上、３．５倍以上、３．７倍以上、４倍以上、４．２倍以上、４．５倍以上、４．７倍以上、又は５倍以上の最大到達藻密度を有してもよい。
暗所活性型クリプトクロムを発現するように改変された藻類は、同じ条件下の従属栄養培養で植え継ぎを行ったとき、植え継ぎ後の比増殖速度が、元の藻類と比較して、１．２倍以上、１．５倍以上、１．８倍以上、２倍以上、２．２倍以上、２．５倍以上、２．７倍以上、３倍以上、３．２倍以上、３．５倍以上、３．７倍以上、４倍以上、４．２倍以上、４．５倍以上、４．７倍以上、又は５倍以上であってもよい。
【0056】
上記のように、暗所活性型クリプトクロムを発現することが確認された遺伝子を、暗所活性型クリプトクロム遺伝子として取得することができる。前記暗所活性型クリプトクロム遺伝子を藻類に導入することにより、暗所活性型クリプトクロムを有する藻類を取得することができる。
【0057】
本実施形態の藻類は、藻類の種類に応じて、適宜培地を選択して培養することができる。本実施形態の藻類は、例えば、公知の藻類用培地を用いて、培養することができる。培地としては、例えば、窒素源、リン源、及び微量元素（亜鉛、ホウ素、コバルト、銅、マンガン、モリブデン、鉄など）等を含む無機塩培地が例示される。窒素源としては、アンモニウム塩、硝酸塩、亜硝酸塩等が挙げられ、リン源としては、リン酸塩等が挙げられる。そのような無機塩培地としては、例えば、Ｇｒｏｓｓ培地、２×Ａｌｌｅｎ培地（Allen MB. Arch. Microbiol. 1959 32: 270-277.）、Ｍ－Ａｌｌｅｎ培地（Minoda A et al. Plant Cell Physiol. 2004 45: 667-71.）、ＭＡ２培地（Ohnuma M et al. Plant Cell Physiol. 2008 Jan;49(1):117-20.）、改変Ｍ－Ａｌｌｅｎ培地等が挙げられるが、これらに限定されない。
従属栄養培養を行う場合には、上記のような無機塩培地に、有機炭素源を添加すればよい。有機炭素源としては、例えば、糖アルコール、糖、アミノ酸等が挙げられる。糖アルコールとしては、例えば、グリセロールが挙げられる。糖としては、例えば、グルコース、マンノース、フルクトース、スクロース、マルトース、ラクトース糖が挙げられる。培地中の有機炭素源の濃度としては、例えば、０．１～１０％（ｗ／ｖ）又は０．１～１０％（ｖ／ｖ）が挙げられる。
従属栄養培養を行う場合には、上記のような無機塩培地に、有機炭素源を添加すればよい。有機炭素源としては、例えば、糖アルコール、糖、アミノ酸等が挙げられる。糖アルコールとしては、例えば、グリセロールが挙げられる。糖としては、例えば、グルコース、マンノース、フルクトース、スクロース、マルトース、ラクトース糖が挙げられる。培地中の有機炭素源の濃度としては、例えば、０．１～１０％（ｗ／ｖ）又は０．１～１０％（ｖ／ｖ）が挙げられる。
【0058】
本実施形態の藻類の培養条件は、特に限定されず、藻類の種類に応じて、適宜選択することができる。培養条件としては、例えば、ｐＨ１～８、温度１０～５０℃、及びＣＯ２濃度０．３～３％等が挙げられる。
培養条件は、上記例示したものに限定されず、藻類の種類に応じて適宜選択可能である。例えば、藻類がイデユコゴメ綱である場合、ｐＨ条件としては、ｐＨ１．０～６．０が挙げられ、ｐＨ１．０～５．０が好ましく、ｐＨ１．０～３．０がより好ましい。温度条件としては、１５～５０℃が挙げられ、３０～５０℃が好ましく、３５～５０℃がより好ましい。独立栄養培養又は混合栄養培養を行う場合、光強度としては、５～２０００μｍｏｌ／ｍ２ｓが挙げられ、５～１５００μｍｏｌ／ｍ２ｓが好ましい。独立栄養培養又は混合栄養培養を行う場合、連続光で藻類を培養してもよく、明暗周期（１０Ｌ：１４Ｄなど）を設けて藻類を培養してもよい。従属栄養培養では、暗所で藻類を培養すればよい。
培養条件は、上記例示したものに限定されず、藻類の種類に応じて適宜選択可能である。例えば、藻類がイデユコゴメ綱である場合、ｐＨ条件としては、ｐＨ１．０～６．０が挙げられ、ｐＨ１．０～５．０が好ましく、ｐＨ１．０～３．０がより好ましい。温度条件としては、１５～５０℃が挙げられ、３０～５０℃が好ましく、３５～５０℃がより好ましい。独立栄養培養又は混合栄養培養を行う場合、光強度としては、５～２０００μｍｏｌ／ｍ２ｓが挙げられ、５～１５００μｍｏｌ／ｍ２ｓが好ましい。独立栄養培養又は混合栄養培養を行う場合、連続光で藻類を培養してもよく、明暗周期（１０Ｌ：１４Ｄなど）を設けて藻類を培養してもよい。従属栄養培養では、暗所で藻類を培養すればよい。
【0059】
本実施形態の藻類は、暗所活性型クリプトクロムを有するため、暗所不活性型クリプトクロムしか有さない藻類と比較して、暗所における従属栄養的な生育が改善されている。そのため、暗所でも、効率よく、高密度に培養することができる。このような性質を有するため、産業利用に適していると考えられる。
【0060】
＜暗所における藻類の生育を改善する方法＞
本発明の第２の態様は、藻類に、暗所活性型クリプトクロムをコードするポリヌクレオチドを導入することを含む、暗所における藻類の生育を改善する方法である。
本発明の第２の態様は、藻類に、暗所活性型クリプトクロムをコードするポリヌクレオチドを導入することを含む、暗所における藻類の生育を改善する方法である。
【0061】
（藻類）
藻類は、特に限定されず、任意の藻類を用いることができる。藻類としては、前記＜藻類＞の項で挙げた藻類と同様のものが挙げられる。
藻類は、特に限定されず、任意の藻類を用いることができる。藻類としては、前記＜藻類＞の項で挙げた藻類と同様のものが挙げられる。
【0062】
（暗所活性型クリプトクロムをコードするポリヌクレオチド）
暗所活性型クリプトクロムをコードするポリヌクレオチドは、暗所活性型クリプトクロムをコードするヌクレオチド配列（暗所活性型クリプトクロムコード配列）を含むものであれば、特に限定されない。暗所活性型クリプトクロムをコードするポリヌクレオチドは、暗所活性型クリプトクロム遺伝子を含むポリヌクレオチドである。暗所活性型クリプトクロムをコードするポリヌクレオチドは、暗所活性型クリプトクロム遺伝子を含むポリヌクレオチドである。暗所活性型クリプトクロム遺伝子は、上記＜藻類＞で記載した方法により、取得することができる。暗所活性型クリプトクロム遺伝子の具体例としては、配列番号１５又は１７に記載のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。
暗所活性型クリプトクロムをコードするポリヌクレオチドは、暗所活性型クリプトクロムをコードするヌクレオチド配列（暗所活性型クリプトクロムコード配列）を含むものであれば、特に限定されない。暗所活性型クリプトクロムをコードするポリヌクレオチドは、暗所活性型クリプトクロム遺伝子を含むポリヌクレオチドである。暗所活性型クリプトクロムをコードするポリヌクレオチドは、暗所活性型クリプトクロム遺伝子を含むポリヌクレオチドである。暗所活性型クリプトクロム遺伝子は、上記＜藻類＞で記載した方法により、取得することができる。暗所活性型クリプトクロム遺伝子の具体例としては、配列番号１５又は１７に記載のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。
【0063】
暗所活性型クリプトクロムをコードするポリヌクレオチドは、暗所活性型クリプトクロム遺伝子（暗所活性型クリプトクロムコード配列）に加えて、他の配列を有してもよい。他の配列としては、例えば、暗所活性型クリプトクロム遺伝子の発現を制御する配列等が挙げられる。暗所活性型クリプトクロム遺伝子の発現制御配列としては、例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリＡ付加シグナル、ターミネーター等が挙げられるが、これらに限定されない。
【0064】
暗所活性型クリプトクロム遺伝子は、任意のプロモーターに機能的に連結されてもよい。「機能的に連結」とは、第一の塩基配列が第二の塩基配列に十分に近くに配置され、第一の塩基配列が第二の塩基配列に影響を及ぼし得ることを意味する。例えば、遺伝子がプロモーターに機能的に連結するとは、遺伝子がプロモーターの制御下で発現するように連結されていることを意味する。プロモーターは、藻類の種類に応じて、当該藻類細胞で機能し得るものを適宜選択することができる。プロモーターは、野生型クリプトクロム遺伝子のプロモーターであってもよく、他の遺伝子のプロモーターであってもよい。他の遺伝子のプロモーターとしては、例えば、ＡＰＣＣプロモーター、ＣＰＣＣプロモーター、Ｃａｔａｌａｓｅプロモーター、ＥＦ１αプロモーター等が挙げられるが、これらに限定されない。プロモーターは、他の生物（例えば、他種の藻類）のプロモーターであってもよい。
【0065】
暗所活性型クリプトクロム遺伝子の３’末端には任意のターミネーターが連結されてもよい。ターミネーターは、藻類の種類に応じて、当該藻類細胞で機能し得るものを適宜選択することができる。ターミネーターは、野生型クリプトクロム遺伝子のターミネーターであってもよく、他の遺伝子のターミネーターであってもよい。他の遺伝子のターミネーターとしては、ＡＰＣＣターミネーター、ＣＰＣＣターミネーター、Ｃａｔａｌａｓｅターミネーター、ＥＦ１αターミネーター、β－チューブリンターミネーター、ユビキチンターミネーター等が挙げられるが、これらに限定されない。ターミネーターは、他の生物（例えば、他種の藻類）のターミネーターであってもよい。
【0066】
暗所活性型クリプトクロムをコードするポリヌクレオチドは、暗所活性型クリプトクロム遺伝子に加えて、選択マーカー遺伝子を含んでもよい。選択マーカー遺伝子としては、例えば、抗生物質耐性遺伝子、栄養要求性に関連する遺伝子、蛍光タンパク質遺伝子等が挙げられる。抗生物質耐性遺伝子としては、例えば、ブラストサイジンＳ耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子等が挙げられる。栄養要求性に関連する遺伝子としては、例えば、ＵＲＡ５．３遺伝子等が挙げられる。蛍光タンパク質遺伝子としては、例えば、ｍＶｅｎｕｓ遺伝子、ＧＦＰ遺伝子、ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子等が挙げられる。これらの選択マーカー遺伝子も、プロモーター、エンハンサー、ポリＡ付加シグナル、ターミネーター等の発現制御配列を有してもよい。マーカー遺伝子は、藻類細胞で機能し得るプロモーターに機能的に連結されてもよい。
【0067】
暗所活性型クリプトクロム遺伝子が、導入対象の藻類（ホスト藻類）以外の生物種に由来する場合、暗所活性型クリプトクロム遺伝子のヌクレオチド配列は、ホスト藻類のコドン使用頻度に基づきコドン最適化されていてもよい。コドン最適化することにより、ホスト藻類における暗所活性型クリプトクロムへの翻訳効率を向上させることができる。
【0068】
暗所活性型クリプトクロムをコードするポリヌクレオチドは、５’ホモロジーアーム及び３’ホモロジーアームを含んでもよい。５’ホモロジーアーム及び３’ホモロジーアームは、ホスト藻類において、暗所活性型クリプトクロム遺伝子を導入する標的領域のヌクレオチド配列を含む。５’ホモロジーアームは、標的領域の５’側に隣接するヌクレオチド配列を含み得る。３’ホモロジーアームは、標的領域の３’側に隣接するヌクレオチド配列を含み得る。５’ホモロジーアーム及び３’ホモロジーアームの大きさは、ホスト藻類のゲノムＤＮＡとの間で相同組換えが起こる大きさであればよく、特に限定されない。５’ホモロジーアーム及び３’ホモロジーアームは、例えば、５００～３０００ｂｐ程度とすることができる。
暗所活性型クリプトクロムをコードするポリヌクレオチドが、５’ホモロジーアーム及び３’ホモロジーアームを含む場合、暗所活性型クリプトクロム遺伝子（又は暗所活性型クリプトクロム遺伝子及びマーカー遺伝子）の５’側（上流側）に、５’ホモロジーアームを配置することができる。暗所活性型クリプトクロム遺伝子（又は暗所活性型クリプトクロム遺伝子及びマーカー遺伝子）の３’側（下流側）に、３’ホモロジーアームを配置することができる。
暗所活性型クリプトクロムをコードするポリヌクレオチドが、５’ホモロジーアーム及び３’ホモロジーアームを含む場合、暗所活性型クリプトクロム遺伝子（又は暗所活性型クリプトクロム遺伝子及びマーカー遺伝子）の５’側（上流側）に、５’ホモロジーアームを配置することができる。暗所活性型クリプトクロム遺伝子（又は暗所活性型クリプトクロム遺伝子及びマーカー遺伝子）の３’側（下流側）に、３’ホモロジーアームを配置することができる。
【0069】
（暗所活性型クリプトクロムをコードするポリヌクレオチドの導入方法）
暗所活性型クリプトクロムをコードするポリヌクレオチドを、藻類細胞に導入する方法は、特に限定されず、公知の方法を用いることができる。暗所活性型クリプトクロムをコードするポリヌクレオチドを藻類細胞に導入する方法としては、例えば、ゲノム編集を利用した方法、相同組換え法等が挙げられる。
暗所活性型クリプトクロムをコードするポリヌクレオチドを、藻類細胞に導入する方法は、特に限定されず、公知の方法を用いることができる。暗所活性型クリプトクロムをコードするポリヌクレオチドを藻類細胞に導入する方法としては、例えば、ゲノム編集を利用した方法、相同組換え法等が挙げられる。
【0070】
ゲノム編集を利用した方法としては、配列特異的エンドヌクレアーゼを含むゲノム編集システムを利用した方法が挙げられる。「配列特異的エンドヌクレアーゼを含むゲノム編集システム」とは、配列特異的エンドヌクレアーゼにより配列特異的にゲノムＤＮＡを切断し、当該切断領域に変異を誘導することができるシステムを意味する。
配列特異的エンドヌクレアーゼは、所定の配列で核酸を切断可能な酵素である。配列特異的エンドヌクレアーゼは、所定の配列で２本鎖ＤＮＡを切断可能な配列特異的エンドデオキシリボヌクレアーゼが好ましい。配列特異的エンドヌクレアーゼとしては、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（Ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ（ＺＦＮ））、ＴＡＬＥＮ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ－ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ）、及びＣａｓタンパク質等が挙げられるが、これらに限定されない。ゲノム編集システムとしては、Ｃａｓタンパク質を用いたＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ）／Ｃａｓシステムが好ましい。
配列特異的エンドヌクレアーゼは、所定の配列で核酸を切断可能な酵素である。配列特異的エンドヌクレアーゼは、所定の配列で２本鎖ＤＮＡを切断可能な配列特異的エンドデオキシリボヌクレアーゼが好ましい。配列特異的エンドヌクレアーゼとしては、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（Ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ（ＺＦＮ））、ＴＡＬＥＮ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ－ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ）、及びＣａｓタンパク質等が挙げられるが、これらに限定されない。ゲノム編集システムとしては、Ｃａｓタンパク質を用いたＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ）／Ｃａｓシステムが好ましい。
【0071】
ゲノム編集を利用する場合、配列特異的エンドヌクレアーゼにより標的領域のゲノムＤＮＡ切断した後又は配列特異的エンドヌクレアーゼと同時に、暗所活性型クリプトクロムをコードするポリヌクレオチドをドナーＤＮＡとして藻類細胞に導入することができる。ドナーＤＮＡは、５’ホモロジーアーム及び３’ホモロジーアームを含むことが好ましい。配列特異的エンドヌクレアーゼによるゲノムＤＮＡの切断後又は配列特異的エンドヌクレアーゼと同時に、ドナーＤＮＡを藻類細胞に導入することにより、相同組み換え修復（Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｒｅｐａｉｒ：ＨＤＲ）が誘導され、暗所活性型クリプトクロム遺伝子（又は暗所活性型クリプトクロム遺伝子及びマーカー遺伝子）が標的領域に組込まれる。
【0072】
相同組換え法は、相同な配列を有する２つのＤＮＡ二本鎖の間で組換えが起こる現象を利用したゲノム改変法である。相同組換え法では、ターゲティングベクターを用いることができる。ターゲティングベクターは、暗所活性型クリプトクロム遺伝子（又は暗所活性型クリプトクロム遺伝子及びマーカー遺伝子）、並びに５’ホモロジーアーム及び３’ホモロジーアームを含むことができる。ターゲティングベクターを藻類細胞に導入することで、相同組換えにより、暗所活性型クリプトクロム遺伝子（又は暗所活性型クリプトクロム遺伝子及びマーカー遺伝子）が、藻類細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれる。
【0073】
藻類細胞に導入する場合、暗所活性型クリプトクロムをコードするポリヌクレオチドは、線状ＤＮＡベクターでもよく、環状ＤＮＡベクターでもよいが、線状ＤＮＡベクターが好ましい。藻類細胞に、暗所活性型クリプトクロムをコードするポリヌクレオチドを導入する方法は、特に限定されず、公知の方法を用いることができる。導入方法としては、例えば、ポリエチレングリコール法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法等が挙げられる。
【0074】
ポリヌクレオチド導入操作後の藻類細胞を培養し、暗所活性型クリプトクロム遺伝子が導入された細胞を選択してもよい。暗所活性型クリプトクロム遺伝子と共にマーカー遺伝子を導入した場合には、マーカー遺伝子の発現に基づいて、遺伝子導入細胞を選択することができる。例えば、マーカー遺伝子が抗生物質耐性遺伝子である場合、当該抗生物質耐性遺伝子が耐性を有する抗生物質を含む培地で藻類細胞を培養することにより、暗所活性型クリプトクロム遺伝子が導入された細胞を選択することができる。例えば、マーカー遺伝子が栄養要求性を回復する遺伝子である場合、当該回復された栄養要求性成分を含有しない培地で藻類細胞を培養することにより、暗所活性型クリプトクロム遺伝子が導入された細胞を選択することができる。例えば、マーカー遺伝子が蛍光タンパク質遺伝子である場合、当該蛍光に基づいてフローサイトメトリー等を用いて藻類細胞を選択することにより、暗所活性型クリプトクロム遺伝子が導入された細胞を選択することができる。
暗所活性型クリプトクロム遺伝子が導入された細胞は、コロニーＰＣＲにより選択してもよい。コロニーＰＣＲは、暗所活性型クリプトクロム遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマーを用いて行うことができる。コロニーＰＣＲにより、ＤＮＡ断片の増幅が確認されたコロニーを選択し、当該コロニーを構成する細胞を、暗所活性型クリプトクロム遺伝子導入細胞として選択することができる。
暗所活性型クリプトクロム遺伝子が導入された細胞は、コロニーＰＣＲにより選択してもよい。コロニーＰＣＲは、暗所活性型クリプトクロム遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマーを用いて行うことができる。コロニーＰＣＲにより、ＤＮＡ断片の増幅が確認されたコロニーを選択し、当該コロニーを構成する細胞を、暗所活性型クリプトクロム遺伝子導入細胞として選択することができる。
【0075】
暗所活性型クリプトクロム遺伝子が導入された藻類は、暗所活性型クリプトクロム遺伝子の発現により、暗所活性型クリプトクロムを有するようになる。藻類は、暗所活性型クリプトクロムを有することにより、暗所における従属栄養的な生育が改善される。暗所における従属栄養的な生育の改善としては、例えば、暗所における従属栄養的な生育速度の向上、暗所での従属栄養培養における最大到達藻密度の向上、及び暗所での従属栄養培養における植え継ぎ後の生育速度の向上、等が挙げられる。
【0076】
本実施形態の方法により、暗所での藻類の従属栄養的な生育を改善することができる。従属栄養的な生育の改善は、暗所での従属栄養的な生育ができない藻類が、暗所で生育できるようになることも包含する。本実施形態の方法により、所望の藻類において、暗所での従属栄養的な生育を改善することができる。
【0077】
＜暗所における生育が改善した藻類の製造方法＞
本発明の第３の態様は、藻類に、暗所活性型クリプトクロムをコードするポリヌクレオチドを導入することを含む、暗所における生育が改善した藻類の製造方法である。
本発明の第３の態様は、藻類に、暗所活性型クリプトクロムをコードするポリヌクレオチドを導入することを含む、暗所における生育が改善した藻類の製造方法である。
【0078】
藻類は、特に限定されず、任意の藻類を用いることができる。藻類としては、上記＜藻類＞の項で挙げたものと同様のものを用いることができる。
暗所活性型クリプトクロムをコードするポリヌクレオチドは、上記＜暗所における藻類の生育を改善する方法＞の項で挙げたものと同様のものを用いることができる。暗所活性型クリプトクロムをコードするポリヌクレオチドの藻類への導入方法は、上記＜暗所における藻類の生育を改善する方法＞の項で挙げた方法と同様に行うことができる。
暗所活性型クリプトクロムをコードするポリヌクレオチドは、上記＜暗所における藻類の生育を改善する方法＞の項で挙げたものと同様のものを用いることができる。暗所活性型クリプトクロムをコードするポリヌクレオチドの藻類への導入方法は、上記＜暗所における藻類の生育を改善する方法＞の項で挙げた方法と同様に行うことができる。
【0079】
本実施形態の製造方法により、暗所における従属栄養的な生育が改善した藻類を取得することができる。暗所における従属栄養的な生育の改善としては、上記と同様のものが挙げられる。
【0080】
＜暗所活性型クリプトクロム＞
本発明の第４の態様は、下記（ａ）～（ｃ）からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、暗所で活性化が維持される暗所活性型クリプトクロムである。
（ａ）配列番号１２、１４、３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、６２、６５、６８、７１、７４、又は７７に記載のアミノ酸配列において、下記式（１）で表されるアミノ酸配列の８番目のグリシン残基が塩基性アミノ酸残基に置換されている、アミノ酸配列、
ＬＸＺＸＷＸＸＧＸＸＸＪ （１）
［式中、Ｌはロイシン残基、Ｗはトリプトファン残基、Ｇはグリシン残基、Ｚは疎水性アミノ酸残基若しくは極性無電荷アミノ酸残基、Ｊは疎水性アミノ酸残基、Ｘは任意のアミノ酸残基を表す。］；
（ｂ）配列番号１２、１４、３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、６２、６５、６８、７１、７４、又は７７に記載のアミノ酸配列において、１個又は複数個のアミノ酸残基が変異されたアミノ酸配列であって、且つ前記変異が前記式（１）で表されるアミノ酸配列の８番目のグリシン残基を塩基性アミノ酸残基に置換する変異を含む、アミノ酸配列；及び
（ｃ）配列番号１２、１４、３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、６２、６５、６８、７１、７４、又は７７に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、且つ前記式（１）で表されるアミノ酸配列の８番目のグリシン残基が塩基性アミノ酸残基に置換されている、アミノ酸配列。
本発明の第４の態様は、下記（ａ）～（ｃ）からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、暗所で活性化が維持される暗所活性型クリプトクロムである。
（ａ）配列番号１２、１４、３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、６２、６５、６８、７１、７４、又は７７に記載のアミノ酸配列において、下記式（１）で表されるアミノ酸配列の８番目のグリシン残基が塩基性アミノ酸残基に置換されている、アミノ酸配列、
ＬＸＺＸＷＸＸＧＸＸＸＪ （１）
［式中、Ｌはロイシン残基、Ｗはトリプトファン残基、Ｇはグリシン残基、Ｚは疎水性アミノ酸残基若しくは極性無電荷アミノ酸残基、Ｊは疎水性アミノ酸残基、Ｘは任意のアミノ酸残基を表す。］；
（ｂ）配列番号１２、１４、３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、６２、６５、６８、７１、７４、又は７７に記載のアミノ酸配列において、１個又は複数個のアミノ酸残基が変異されたアミノ酸配列であって、且つ前記変異が前記式（１）で表されるアミノ酸配列の８番目のグリシン残基を塩基性アミノ酸残基に置換する変異を含む、アミノ酸配列；及び
（ｃ）配列番号１２、１４、３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、６２、６５、６８、７１、７４、又は７７に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、且つ前記式（１）で表されるアミノ酸配列の８番目のグリシン残基が塩基性アミノ酸残基に置換されている、アミノ酸配列。
【0081】
塩基性アミノ酸残基は、アルギニン残基又はリジン残基が好ましく、アルギニン残基がより好ましい。
前記（ａ）のアミノ酸配列の具体例としては、配列番号１６又は１８に記載のアミノ酸配列が挙げられる。
前記（ｂ）において、「複数個」としては、２～２０個、２～１５個、２～１０個、２～９個、２～８個、２～７個、２～６個、２～５個、２～４個、２～３個、又は２個が挙げられる。「変異」は、欠失、置換、付加、及び挿入のいずれであってもよく、これらの組合せでもよい。
前記（ｃ）において、配列同一性は、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上であってもよい。
前記（ｂ）及び（ｃ）の好ましい具体例は、前記＜藻類＞の項で挙げたものと同様である。
前記（ａ）のアミノ酸配列の具体例としては、配列番号１６又は１８に記載のアミノ酸配列が挙げられる。
前記（ｂ）において、「複数個」としては、２～２０個、２～１５個、２～１０個、２～９個、２～８個、２～７個、２～６個、２～５個、２～４個、２～３個、又は２個が挙げられる。「変異」は、欠失、置換、付加、及び挿入のいずれであってもよく、これらの組合せでもよい。
前記（ｃ）において、配列同一性は、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上であってもよい。
前記（ｂ）及び（ｃ）の好ましい具体例は、前記＜藻類＞の項で挙げたものと同様である。
【0082】
＜暗所活性型クリプトクロムをコードするポリヌクレオチド＞
本発明の第５の態様は、前記第４の態様の暗所活性型クリプトクロムをコードするポリヌクレオチドである。
本実施形態のポリヌクレオチドの具体例としては、下記（ｄ）～（ｆ）からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。
（ｄ）配列番号１１、１３、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１、６１、６４、６７、７０、７３、又は７６に記載のヌクレオチド配列において、前記式（１）で表されるアミノ酸配列の８番目のグリシン残基をコードするコドンが、塩基性アミノ酸残基をコードするコドンに置換されている、ヌクレオチド配列。
（ｅ）配列番号１１、１３、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１、６１、６４、６７、７０、７３、又は７６に記載のヌクレオチド配列において、１個又は複数個のヌクレオチド残基が変異されたヌクレオチド配列であって、前記式（１）で表されるアミノ酸配列の８番目のグリシン残基が塩基性アミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、ヌクレオチド配列。
（ｆ）配列番号１１、１３、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１、６１、６４、６７、７０、７３、又は７６に記載のヌクレオチド配列に対して７０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列であって、且つ前記式（１）で表されるアミノ酸配列の８番目のグリシン残基が塩基性アミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、ヌクレオチド配列。
本発明の第５の態様は、前記第４の態様の暗所活性型クリプトクロムをコードするポリヌクレオチドである。
本実施形態のポリヌクレオチドの具体例としては、下記（ｄ）～（ｆ）からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。
（ｄ）配列番号１１、１３、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１、６１、６４、６７、７０、７３、又は７６に記載のヌクレオチド配列において、前記式（１）で表されるアミノ酸配列の８番目のグリシン残基をコードするコドンが、塩基性アミノ酸残基をコードするコドンに置換されている、ヌクレオチド配列。
（ｅ）配列番号１１、１３、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１、６１、６４、６７、７０、７３、又は７６に記載のヌクレオチド配列において、１個又は複数個のヌクレオチド残基が変異されたヌクレオチド配列であって、前記式（１）で表されるアミノ酸配列の８番目のグリシン残基が塩基性アミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、ヌクレオチド配列。
（ｆ）配列番号１１、１３、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１、６１、６４、６７、７０、７３、又は７６に記載のヌクレオチド配列に対して７０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列であって、且つ前記式（１）で表されるアミノ酸配列の８番目のグリシン残基が塩基性アミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、ヌクレオチド配列。
【0083】
本実施形態のポリヌクレオチドは、下記（ｇ）のポリヌクレオチドであってもよい。
（ｇ）配列番号１１、１３、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１、６１、６４、６７、７０、７３、又は７６に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、前記式（１）で表されるアミノ酸配列の８番目のグリシン残基が塩基性アミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、ヌクレオチド配列。
（ｇ）配列番号１１、１３、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１、６１、６４、６７、７０、７３、又は７６に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、前記式（１）で表されるアミノ酸配列の８番目のグリシン残基が塩基性アミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、ヌクレオチド配列。
【0084】
塩基性アミノ酸残基は、アルギニン残基又はリジン残基が好ましく、アルギニン残基がより好ましい。
前記（ｄ）のヌクレオチド配列の具体例としては、配列番号１１に記載のヌクレオチド配列において、１２５５～１２５７位のヌクレオチド配列が塩基性アミノ酸残基をコードするコドンに置換されたヌクレオチド配列；配列番号１３に記載のヌクレオチド配列において、１７１４～１７１６位のヌクレオチド配列が塩基性アミノ酸残基をコードするコドンに置換されたヌクレオチド配列；配列番号３３に記載のヌクレオチド配列において、１１５６～１１５８位のヌクレオチド配列が塩基性アミノ酸残基をコードするコドンに置換されたヌクレオチド配列；配列番号３６に記載のヌクレオチド配列において、１３３６～１３３８位のヌクレオチド配列が塩基性アミノ酸残基をコードするコドンに置換されたヌクレオチド配列；配列番号３９に記載のヌクレオチド配列において、１２４３～１２４５位のヌクレオチド配列が塩基性アミノ酸残基をコードするコドンに置換されたヌクレオチド配列；配列番号４２に記載のヌクレオチド配列において、１２０１～１２０３位のヌクレオチド配列が塩基性アミノ酸残基をコードするコドンに置換されたヌクレオチド配列；配列番号４５に記載のヌクレオチド配列において、１２２２～１２２４位のヌクレオチド配列が塩基性アミノ酸残基をコードするコドンに置換されたヌクレオチド配列；配列番号４８に記載のヌクレオチド配列において、１３１８～１３２０位のヌクレオチド配列が塩基性アミノ酸残基をコードするコドンに置換されたヌクレオチド配列；配列番号５１に記載のヌクレオチド配列において、１２０７～１２０９位のヌクレオチド配列が塩基性アミノ酸残基をコードするコドンに置換されたヌクレオチド配列；配列番号６１に記載のヌクレオチド配列において、２５９～２６１位のヌクレオチド配列が塩基性アミノ酸残基をコードするコドンに置換されたヌクレオチド配列；配列番号６４に記載のヌクレオチド配列において、１５７９～１５８１位のヌクレオチド配列が塩基性アミノ酸残基をコードするコドンに置換されたヌクレオチド配列；配列番号６７に記載のヌクレオチド配列において、１５６７～１５６９位のヌクレオチド配列が塩基性アミノ酸残基をコードするコドンに置換されたヌクレオチド配列；配列番号７０に記載のヌクレオチド配列において、２５９～２６１位のヌクレオチド配列が塩基性アミノ酸残基をコードするコドンに置換されたヌクレオチド配列；配列番号７３に記載のヌクレオチド配列において、１９３９～１０４１位のヌクレオチド配列が塩基性アミノ酸残基をコードするコドンに置換されたヌクレオチド配列；配列番号７６に記載のヌクレオチド配列において、１６００～１６０２位のヌクレオチド配列が塩基性アミノ酸残基をコードするコドンに置換されたヌクレオチド配列が挙げられる。例えば、配列番号１５又は１７に記載のヌクレオチド配列が挙げられる。
前記（ｅ）において、「複数個」としては、２～２０個、２～１５個、２～１０個、２～９個、２～８個、２～７個、２～６個、２～５個、２～４個、２～３個、又は２個が挙げられる。「変異」は、欠失、置換、付加、及び挿入のいずれであってもよく、これらの組合せでもよい。
前記（ｆ）において、配列同一性は、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上であってもよい。
前記（ｇ）において、「ストリンジェントな条件」とは、配列同一性が高い２個のポリヌクレオチドが、特異的にハイブリダイズ可能な条件を意味する。配列同一性が高い２個のポリヌクレオチドとは、前記２個のポリヌクレオチド間の配列同一性が、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上であることをいう。ストリンジェントな条件の具体例としては、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ－Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ ＴＨＩＲＤ ＥＤＩＴＩＯＮ（Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press）に記載の条件等が挙げられる。ストリンジェントな条件としては、例えば、６×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣの組成：３Ｍ塩化ナトリウム、０．３Ｍクエン酸溶液、ｐＨ７．０）、５×デンハルト溶液（１００×デンハルト溶液の組成：２質量％ウシ血清アルブミン、２質量％フィコール、２質量％ポリビニルピロリドン）、０．５質量％のＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡ、及び５０％フォルムアミドからなるハイブリダイゼーションバッファー中で、４２～７０℃で数時間から一晩インキュベーションを行う条件が挙げられる。インキュベーション後の洗浄に用いる洗浄バッファーとしては、例えば、０．１質量％ＳＤＳ含有１×ＳＳＣ溶液、及び０．１質量％ＳＤＳ含有０．１×ＳＳＣ溶液が挙げられる。
前記（ｅ）～（ｇ）において、「式（１）で表されるアミノ酸配列の８番目のグリシン残基が塩基性アミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列」は、前記式（４）で表されるアミノ酸配列が好ましく、前記式（５）で表されるアミノ酸配列がより好ましく、前記式（６）で表されるアミノ酸配列がさらに好ましい。
前記（ｄ）のヌクレオチド配列の具体例としては、配列番号１１に記載のヌクレオチド配列において、１２５５～１２５７位のヌクレオチド配列が塩基性アミノ酸残基をコードするコドンに置換されたヌクレオチド配列；配列番号１３に記載のヌクレオチド配列において、１７１４～１７１６位のヌクレオチド配列が塩基性アミノ酸残基をコードするコドンに置換されたヌクレオチド配列；配列番号３３に記載のヌクレオチド配列において、１１５６～１１５８位のヌクレオチド配列が塩基性アミノ酸残基をコードするコドンに置換されたヌクレオチド配列；配列番号３６に記載のヌクレオチド配列において、１３３６～１３３８位のヌクレオチド配列が塩基性アミノ酸残基をコードするコドンに置換されたヌクレオチド配列；配列番号３９に記載のヌクレオチド配列において、１２４３～１２４５位のヌクレオチド配列が塩基性アミノ酸残基をコードするコドンに置換されたヌクレオチド配列；配列番号４２に記載のヌクレオチド配列において、１２０１～１２０３位のヌクレオチド配列が塩基性アミノ酸残基をコードするコドンに置換されたヌクレオチド配列；配列番号４５に記載のヌクレオチド配列において、１２２２～１２２４位のヌクレオチド配列が塩基性アミノ酸残基をコードするコドンに置換されたヌクレオチド配列；配列番号４８に記載のヌクレオチド配列において、１３１８～１３２０位のヌクレオチド配列が塩基性アミノ酸残基をコードするコドンに置換されたヌクレオチド配列；配列番号５１に記載のヌクレオチド配列において、１２０７～１２０９位のヌクレオチド配列が塩基性アミノ酸残基をコードするコドンに置換されたヌクレオチド配列；配列番号６１に記載のヌクレオチド配列において、２５９～２６１位のヌクレオチド配列が塩基性アミノ酸残基をコードするコドンに置換されたヌクレオチド配列；配列番号６４に記載のヌクレオチド配列において、１５７９～１５８１位のヌクレオチド配列が塩基性アミノ酸残基をコードするコドンに置換されたヌクレオチド配列；配列番号６７に記載のヌクレオチド配列において、１５６７～１５６９位のヌクレオチド配列が塩基性アミノ酸残基をコードするコドンに置換されたヌクレオチド配列；配列番号７０に記載のヌクレオチド配列において、２５９～２６１位のヌクレオチド配列が塩基性アミノ酸残基をコードするコドンに置換されたヌクレオチド配列；配列番号７３に記載のヌクレオチド配列において、１９３９～１０４１位のヌクレオチド配列が塩基性アミノ酸残基をコードするコドンに置換されたヌクレオチド配列；配列番号７６に記載のヌクレオチド配列において、１６００～１６０２位のヌクレオチド配列が塩基性アミノ酸残基をコードするコドンに置換されたヌクレオチド配列が挙げられる。例えば、配列番号１５又は１７に記載のヌクレオチド配列が挙げられる。
前記（ｅ）において、「複数個」としては、２～２０個、２～１５個、２～１０個、２～９個、２～８個、２～７個、２～６個、２～５個、２～４個、２～３個、又は２個が挙げられる。「変異」は、欠失、置換、付加、及び挿入のいずれであってもよく、これらの組合せでもよい。
前記（ｆ）において、配列同一性は、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上であってもよい。
前記（ｇ）において、「ストリンジェントな条件」とは、配列同一性が高い２個のポリヌクレオチドが、特異的にハイブリダイズ可能な条件を意味する。配列同一性が高い２個のポリヌクレオチドとは、前記２個のポリヌクレオチド間の配列同一性が、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上であることをいう。ストリンジェントな条件の具体例としては、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ－Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ ＴＨＩＲＤ ＥＤＩＴＩＯＮ（Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press）に記載の条件等が挙げられる。ストリンジェントな条件としては、例えば、６×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣの組成：３Ｍ塩化ナトリウム、０．３Ｍクエン酸溶液、ｐＨ７．０）、５×デンハルト溶液（１００×デンハルト溶液の組成：２質量％ウシ血清アルブミン、２質量％フィコール、２質量％ポリビニルピロリドン）、０．５質量％のＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡ、及び５０％フォルムアミドからなるハイブリダイゼーションバッファー中で、４２～７０℃で数時間から一晩インキュベーションを行う条件が挙げられる。インキュベーション後の洗浄に用いる洗浄バッファーとしては、例えば、０．１質量％ＳＤＳ含有１×ＳＳＣ溶液、及び０．１質量％ＳＤＳ含有０．１×ＳＳＣ溶液が挙げられる。
前記（ｅ）～（ｇ）において、「式（１）で表されるアミノ酸配列の８番目のグリシン残基が塩基性アミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列」は、前記式（４）で表されるアミノ酸配列が好ましく、前記式（５）で表されるアミノ酸配列がより好ましく、前記式（６）で表されるアミノ酸配列がさらに好ましい。
【0085】
本実施形態のポリヌクレオチドは、藻類の野生型クリプトクロムの遺伝子に、変異を導入することにより取得することができる。例えば、Ｃ.ｍｅｒｏｌａｅの野生型クリプトクロム（例えば、ＣＹＭＥ＿ＣＭＭ０７６Ｃ、ＣＹＭＥ＿ＣＭＱ４５３Ｃ）の遺伝子は、後述の実施例に記載のプライマー等を用いて、Ｃ.ｍｅｒｏｌａｅのゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ等の核酸増幅法等を実施することにより、取得することができる。
【0086】
本実施形態のポリヌクレオチドを藻類に導入することにより、暗所での従属栄養的な生育が改善された藻類を得ることができる。本実施形態のポリヌクレオチドを導入する藻類としては、イデユコゴメ綱に属する藻類が好ましく、Ｃ.ｍｅｒｏｌａｅがより好ましい。
【実施例】
【0087】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【0088】
＜Ｃ．ｍｅｒｏｌａｅにおけるクリプトクロム（ＣＲＹ）候補遺伝子の探索＞
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）のＣＲＹ１遺伝子のアミノ酸配列をクエリーとして、Ｃ．ｍｅｒｏｌａｅ １０Ｄ株のゲノムデータベース（Ｄａｔａｂａｓｅ：Ｎｏｎ－ｒｅｄｕｎｄａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ、Ｏｒｇａｎｉｓｍ：Ｃ．ｍｅｒｏｌａｅ １０Ｄ株のゲノム（ｔａｘｉｄ：２８０６９９））に対して、Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＬＡＳＴ検索を行い、ＣＲＹ候補遺伝子を得た。得られたＣＲＹ候補遺伝子の全てについて、Ｃ末端領域にＣＲＹ１との相同性は認められなかった。得られたＣＲＹ候補遺伝子とＣＲＹ１とのＰｅｒｃｅｎｔ ｉｄｅｎｔｉｔｙ（配列同一性）は、２８．６％～４４．４４％であった。
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）のＣＲＹ１遺伝子のアミノ酸配列をクエリーとして、Ｃ．ｍｅｒｏｌａｅ １０Ｄ株のゲノムデータベース（Ｄａｔａｂａｓｅ：Ｎｏｎ－ｒｅｄｕｎｄａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ、Ｏｒｇａｎｉｓｍ：Ｃ．ｍｅｒｏｌａｅ １０Ｄ株のゲノム（ｔａｘｉｄ：２８０６９９））に対して、Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＬＡＳＴ検索を行い、ＣＲＹ候補遺伝子を得た。得られたＣＲＹ候補遺伝子の全てについて、Ｃ末端領域にＣＲＹ１との相同性は認められなかった。得られたＣＲＹ候補遺伝子とＣＲＹ１とのＰｅｒｃｅｎｔ ｉｄｅｎｔｉｔｙ（配列同一性）は、２８．６％～４４．４４％であった。
【0089】
ＣＲＹ候補遺伝子がコードするアミノ酸配列において、Ｐｆａｍデータベース（ＥＭＢＬ－ＥＢＩ，ＵＫ）でタンパク質ドメインを検索した。その結果に基づき、ＣＲＹ機能に必須と思われるＦＡＤ－Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎを有さない候補遺伝子を除外した。ＢＬＡＳＴ検索によるシロイヌナズナＣＲＹ１とのアライメント結果に基づいて、ＣＲＹ１のＤ３５９及びＶ３６３に対応するアミノ酸残基がヒスチジン残基である候補遺伝子は、（６－４）ＤＮＡ ｐｈｏｔｏｌｙａｓｅであると考えられるため、除外した。ＤＮＡ Ｐｈｏｔｏｌｙａｓｅは、Ｈｉｓ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ａｒｇ－Ｈｉｓ ｍｏｔｉｆを活性に必要な部位として有し（K. Hitomi et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. (2009)）、前記モチーフの２番目のヒスチジン残基、及び最後のヒスチジン残基が変異すると酵素活性がなくなることが分かっている。これらのヒスチジン残基は、シロイヌナズナＣＲＹ１の３５９番目及び３６３番目のアミノ酸残基に対応する。残ったＣＲＹ候補遺伝子がコードするアミノ酸配列では、ＣＲＹ１のＧ３８０に対応するアミノ酸残基がグリシン残基のまま保存されていた。これらのＣＲＹ候補遺伝子がコードするアミノ酸配列では、前記グリシン残基を含むモチーフとして、下記式（１）のアミノ酸配列が保存されていた。
ＬＸＺＸＷＸＸＧＸＸＸＪ （１）
［式中、Ｌはロイシン残基、Ｗはトリプトファン残基、Ｇはグリシン残基、Ｚは疎水性アミノ酸残基若しくは極性無電荷アミノ酸残基、Ｊは疎水性アミノ酸残基、Ｘは任意のアミノ酸残基を表す。］
ＬＸＺＸＷＸＸＧＸＸＸＪ （１）
［式中、Ｌはロイシン残基、Ｗはトリプトファン残基、Ｇはグリシン残基、Ｚは疎水性アミノ酸残基若しくは極性無電荷アミノ酸残基、Ｊは疎水性アミノ酸残基、Ｘは任意のアミノ酸残基を表す。］
【0090】
これらのＣＲＹ候補遺伝子から、シロイヌナズナＣＲＹ１遺伝子により近縁の候補遺伝子を選択するため、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ（ＥＭＢＬ－ＥＢＩ，ＵＫ）により、系統解析を行った。その結果、２つの最終候補遺伝子（ＣＹＭＥ＿ＣＭＭ０７６Ｃ、ＣＹＭＥ＿ＣＭＱ４５３Ｃ）を得た。ＣＹＭＥ＿ＣＭＭ０７６Ｃのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を、配列番号１１及び配列番号１２にそれぞれ示す。ＣＹＭＥ＿ＣＭＱ４５３Ｃのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を配列番号１３及び配列番号１４にそれぞれ示す。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａによるアライメント結果を図１に示す。図１には、前記式（１）のモチーフ付近のアミノ酸配列を示した。図１中、四角で囲った「Ｇ」がシロイヌナズナＣＲＹ１のＧ３８０及びこれに対応するグリシン残基である。
【0091】
＜形質転換用直鎖状ＤＮＡの調製＞
微量のＣ．ｍｅｒｏｌａｅを含んだ懸濁液をＣｒｕｄｅサンプルとし、ＫＯＤ Ｏｎｅ（登録商標） ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＫＭＭ－２０１，ＴＯＹＯＢＯ，Ｊａｐａｎ）を用いて、ＰＣＲ用サンプルを調製した。メーカー指定のプロトコルに従い、サーマルサイクラーによりＰＣＲ反応を行い、候補遺伝子（ＣＹＭＥ＿ＣＭＭ０７６Ｃ遺伝子、ＣＹＭＥ＿ＣＭＱ４５３Ｃ遺伝子）の核酸断片を増幅した。使用したプライマーの配列を以下に示す。大文字は、各遺伝子に対応する配列を示す。
ＣＹＭＥ＿ＣＭＭ０７６Ｃ
フォワードプライマー：gttccagattacgctATGTCGTCGTCGAGACG（配列番号１９）
リバースプライマー：taaatagctagtttaTCAGGGCGCGGCAC（配列番号２０）
ＣＹＭＥ＿ＣＭＱ４５３
フォワードプライマー：gttccagattacgctATGCCCGCGTATCCTC（配列番号２１）
リバースプライマー：taaatagctagtttaTCATCTGCGCTTGTCGTC（配列番号２２）
微量のＣ．ｍｅｒｏｌａｅを含んだ懸濁液をＣｒｕｄｅサンプルとし、ＫＯＤ Ｏｎｅ（登録商標） ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＫＭＭ－２０１，ＴＯＹＯＢＯ，Ｊａｐａｎ）を用いて、ＰＣＲ用サンプルを調製した。メーカー指定のプロトコルに従い、サーマルサイクラーによりＰＣＲ反応を行い、候補遺伝子（ＣＹＭＥ＿ＣＭＭ０７６Ｃ遺伝子、ＣＹＭＥ＿ＣＭＱ４５３Ｃ遺伝子）の核酸断片を増幅した。使用したプライマーの配列を以下に示す。大文字は、各遺伝子に対応する配列を示す。
ＣＹＭＥ＿ＣＭＭ０７６Ｃ
フォワードプライマー：gttccagattacgctATGTCGTCGTCGAGACG（配列番号１９）
リバースプライマー：taaatagctagtttaTCAGGGCGCGGCAC（配列番号２０）
ＣＹＭＥ＿ＣＭＱ４５３
フォワードプライマー：gttccagattacgctATGCCCGCGTATCCTC（配列番号２１）
リバースプライマー：taaatagctagtttaTCATCTGCGCTTGTCGTC（配列番号２２）
【0092】
増幅した核酸断片を精製後、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｚ９６４８Ｎ，Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて、メーカー指定のプロトコルに従って、ＰＣＲにより直鎖化したプラスミドベクターに増幅核酸断片を連結した。プラスミドは、ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ（Ａ１３６０，Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）を基に、Ｃ．ｍｅｒｏｌａｅの細胞内で、挿入遺伝子がＮ末端に３ｘＨＡタグを持ったタンパク質として発現するように改変されたものを用いた（T. Fujiwara et al., Plant Direct. 2019 Apr 8;3(4):e00134.）。ただし、選択マーカーは、ＵＲＡ遺伝子に替えて、Ｎ末端にＣｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ ｔｒａｎｓｉｔ ｐｅｐｔｉｄｅを含むＣＡＴ－ＳｓｒＡ遺伝子を用いた。
【0093】
増幅核酸断片が連結された線状プラスミドベクターを含むＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応溶液を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＳＴ０８ Ｐｒｅｍｉｕｍ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ（＃９１２８，Ｔａｋａｒａ，Ｊａｐａｎ）の形質転換を行った。形質転換後の細胞を、ＬＢ／Ａｍｐプレート上で一昼夜培養し、形質転換細胞の選抜を行った。プレート上に生じたコロニーに対し、ＫＯＤ Ｏｎｅ（登録商標） ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを用いて、前記各候補遺伝子のプライマーセットによりＣｏｌｏｎｙ ｄｉｒｅｃｔ ＰＣＲを行った。これにより、各候補遺伝子を保持するコロニーを特定した。特定されたコロニーを、ＬＢ／Ａｍｐ液体培地で一昼夜培養した。培養後、培養液から菌体を回収し、プラスミド抽出キットを用いてプラスミドを精製した。
【0094】
次に、上記で精製したプラスミドを用いて、シロイヌナズナＣＲＹ１のＧ３８０に対応するグリシン残基（ＣＹＭＥ＿ＣＭＭ０７６ＣのＧ４１９、ＣＹＭＥ＿ＣＭＱ４５３ＣのＧ５７２）をアルギニン残基に置換する変異の導入を行った。各候補遺伝子への変異の導入は、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＳＭＫ－１０１，ＴＯＹＯＢＯ，Ｊａｐａｎ）を用いて行った。変異の導入に用いたプライマーの配列を以下に示す。
ＣＹＭＥ＿ＣＭＭ０７６Ｃ
フォワードプライマー：GGCAGATCCGCGCTCGTTG（配列番号２３）
リバースプライマー：ACGGCAGGAGAAGGTACTTGG（配列番号２４）
ＣＹＭＥ＿ＣＭＱ４５３Ｃ
フォワードプライマー：GCCTCCGCTTTCTTTACGATCATG（配列番号２５）
リバースプライマー：ATGCTGCCACGGAATGAGAAG（配列番号２６）
ＣＹＭＥ＿ＣＭＭ０７６Ｃ
フォワードプライマー：GGCAGATCCGCGCTCGTTG（配列番号２３）
リバースプライマー：ACGGCAGGAGAAGGTACTTGG（配列番号２４）
ＣＹＭＥ＿ＣＭＱ４５３Ｃ
フォワードプライマー：GCCTCCGCTTTCTTTACGATCATG（配列番号２５）
リバースプライマー：ATGCTGCCACGGAATGAGAAG（配列番号２６）
【0095】
変異の導入後、プラスミド抽出キットを用いてプラスミドを精製した。精製したプラスミドをテンプレートとして、ＫＯＤ Ｏｎｅ（登録商標） ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを用いて、ＰＣＲ反応を行い、変異を導入した候補遺伝子の核酸断片を増幅した。使用したプライマーの配列を以下に示す。
フォワードプライマー：CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC（配列番号２７）
リバースプライマー：GAGCGGATAACAATTTCACACAGG（配列番号２８）
フォワードプライマー：CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC（配列番号２７）
リバースプライマー：GAGCGGATAACAATTTCACACAGG（配列番号２８）
【0096】
増幅核酸断片を、プラスミド抽出キットを用いて精製した。精製した核酸断片を形質転換用直鎖状ＤＮＡとして用いた。ＣＹＭＥ＿ＣＭＭ０７６ＣにＧ４１９Ｒの変異を導入した形質転換用直鎖状ＤＮＡの構造を図２Ａに示す。ＣＹＭＥ＿ＣＭＱ４５３ＣにＧ５７２Ｒの変異を導入した形質転換用直鎖状ＤＮＡの構造を図２Ｂに示す。ＣＹＭＥ＿ＣＭＭ０７６ＣにＧ４１９Ｒの変異を導入した変異遺伝子（ＣＭＭ０７６Ｃ（Ｇ４１９Ｒ））のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を配列番号１５及び配列番号１６にそれぞれ示す。ＣＹＭＥ＿ＣＭＱ４５３ＣにＧ５７２Ｒの変異を導入した変異遺伝子（ＣＭＱ４５３Ｃ（Ｇ５７２Ｒ））のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を配列番号１７及び配列番号１８にそれぞれ示す。
【0097】
＜Ｃ．ｍｅｒｏｌａｅの形質転換＞
ＭＡ２培地（４０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４，４ｍＭ ＭｇＳＯ４，８ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４，１ｍＭ ＣａＣｌ２，０．０３ｖ／ｖ％ Ｈ２ＳＯ４，２．８μＭ ＺｎＣｌ２，０．７μＭ ＣｏＣｌ２，３６μＭ ＭｎＣｌ２，１．３μＭ ＣｕＣｌ２，６．４μＭ Ｎａ２ＭｏＯ４，４ｍＬ／Ｌ－ｍｅｄｉｕｍ ２５０ｘ Ｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ［７９ｍＭ ＦｅＣｌ３，１０６ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ，数滴のＨ２ＳＯ４］）４０ｍＬに、ＯＤ７５０＝０．３となるようにＣ．ｍｅｒｏｌａｅ ＮＥＩＳ－１８０４株（野生株）を播種した。４０℃、６００ｍＬ／ｍｉｎ ａｉｒの通気状態で、一昼夜程度、光独立栄養的に、ＮＥＩＳ－１８０４株を培養し、ＯＤ７５０＝０．６前後となるようにした。培養液に、２０％ Ｔｗｅｅｎ－２０ １μＬを添加し、室温、２０００ｘｇで、５分間遠心分離し、上清を除去した。ペレットをＭＡ２培地に懸濁し、室温、２０００ｘｇで、再度、５分間遠心分離した。上清をマイクロピペットで除去した後、ＯＤ７５０＝１００となるように、ペレットをＭＡ２培地に懸濁した（野生株懸濁液）。
ＭＡ２培地（４０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４，４ｍＭ ＭｇＳＯ４，８ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４，１ｍＭ ＣａＣｌ２，０．０３ｖ／ｖ％ Ｈ２ＳＯ４，２．８μＭ ＺｎＣｌ２，０．７μＭ ＣｏＣｌ２，３６μＭ ＭｎＣｌ２，１．３μＭ ＣｕＣｌ２，６．４μＭ Ｎａ２ＭｏＯ４，４ｍＬ／Ｌ－ｍｅｄｉｕｍ ２５０ｘ Ｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ［７９ｍＭ ＦｅＣｌ３，１０６ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ，数滴のＨ２ＳＯ４］）４０ｍＬに、ＯＤ７５０＝０．３となるようにＣ．ｍｅｒｏｌａｅ ＮＥＩＳ－１８０４株（野生株）を播種した。４０℃、６００ｍＬ／ｍｉｎ ａｉｒの通気状態で、一昼夜程度、光独立栄養的に、ＮＥＩＳ－１８０４株を培養し、ＯＤ７５０＝０．６前後となるようにした。培養液に、２０％ Ｔｗｅｅｎ－２０ １μＬを添加し、室温、２０００ｘｇで、５分間遠心分離し、上清を除去した。ペレットをＭＡ２培地に懸濁し、室温、２０００ｘｇで、再度、５分間遠心分離した。上清をマイクロピペットで除去した後、ＯＤ７５０＝１００となるように、ペレットをＭＡ２培地に懸濁した（野生株懸濁液）。
【0098】
形質転換用直鎖状ＤＮＡ １０～１５μｇを含む溶液５０μＬに、ＰＥＧ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ６７．５μＬを添加し、混合した。ＰＥＧ Ｓｏｌｕｔｉｏｎは、０．４ｇのＰＥＧ－４０００を溶解した４５０μＬのＭＡ２培地に、８０μＬのＴＦ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ［４００ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４，４０ｍＭ ＭｇＳＯ４，０．３ｖ／ｖ％ Ｈ２ＳＯ４］を添加することにより調製した。ＰＥＧ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加した形質転換用直鎖状ＤＮＡ溶液に、野生株懸濁液を１２．５μＬ添加し、振り混ぜて混和した。混和後の懸濁液を、８ｍＬ／ウェルのＭＡ２培地を入れた６穴プレートにマイクロピペットで移し、ウェル内の培地と混和した。６穴プレート及びアネロパック・ＣＯ２（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ Ｇａｓ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｊａｐａｎ）を密閉可能な容器に入れて密閉し、４０℃、光独立栄養的に、２日間培養した。培養液を、室温、２０００ｘｇで、５分間遠心分離し、上清を除去した。ペレットを、４ｍＬ ＭＡ２培地で懸濁して、２４穴プレートに移し、２００μｇ／ｍＬとなるようにクロラムフェニコール溶液を添加した。２４穴プレート及びアネロパック・ＣＯ２を密閉可能な容器に入れて密閉し、４０℃、光独立栄養的に、２週間程度培養した。クロラムフェニコール存在下で増殖する緑色の細胞を回収し、ＭＡ２培地で３０００～３００００倍に希釈した。これを、ＭＡ２ ｇｅｌｌａｎ ｇｕｍプレートにスポットした。ＭＡ２ ｇｅｌｌａｎ ｇｕｍプレート及びアネロパウチ・ＣＯ２（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ Ｇａｓ Ｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｊａｐａｎ）を密閉可能な容器に入れて密閉し、４０℃、光独立栄養的に、２週間程度培養した。生じたコロニーの一部を４０μＬ ｄｄＨ２Ｏに懸濁した。コロニー懸濁液をテンプレートとして、ＫＯＤ Ｏｎｅ（登録商標） ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを用いて、ＰＣＲ反応を行い、目的遺伝子が導入された形質転換細胞を取得した。使用したプライマーの配列を以下に示す。
フォワードプライマー：TCTGCTCGGCTTAGTTTCGAAAG（配列番号２９）
リバースプライマー：TACCCCGATTCGATCATACGAGT（配列番号３０）
フォワードプライマー：TCTGCTCGGCTTAGTTTCGAAAG（配列番号２９）
リバースプライマー：TACCCCGATTCGATCATACGAGT（配列番号３０）
【0099】
＜形質転換株の評価＞
ＣＭＭ０７６Ｃ（Ｇ４１９Ｒ）又はＣＭＱ４５３Ｃ（Ｇ５７２Ｒ）が導入された形質転換株の暗所での従属栄養的な生育を評価した。対照として、ＮＥＩＳ－１８０４株（野生株）、ＣＹＭＥ＿ＣＭＱ４５３Ｃ（変異なし）導入株、及び組換え株例についても同様の評価を行った。組換え株例としては、ＣＹＭＥ＿ＣＭＳ４６２Ｃ（Ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ－ｔｈｙｍｉｄｙｌａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）の遺伝子をＮＥＩＳ－１８０４株に導入したものを用いた。
２５ｃｍ２細胞培養用フラスコ（ベントキャップ）に、２０ｍＬのＭＡ２培地を入れ、藻類細胞を播種した。これを、４０℃、１３０ｒｐｍ、光独立栄養的に、１週間程度培養した。形質転換株の培地には、２００μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを添加した。次いで、３％グリセロールを含むＭＡ２培地（ＭＡ２＋３％グリセロール培地）２０ｍＬが入ったフラスコに、ＯＤ７５０＝０．５となるように、培養液を植え継いだ。これを、４０℃、１３０ｒｐｍ、光照射下で、混合栄養的に、３～５日間培養した。次いで、２０ｍＬの新しいＭＡ２＋３％グリセロール培地が入ったフラスコに、ＯＤ７５０＝０．５となるように、培養液を植え継いだ。これを、４０℃、１３０ｒｐｍ、暗所で、従属栄養的に、培養した。約１週間毎に、培養液を０．５ｍＬ採取し、ＯＤ７５０を測定した。培養開始から３週間後に、２０ｍＬ ＭＡ２＋３％グリセロール培地が入ったフラスコに、ＯＤ７５０＝０．５となるように、培養液を植え継いで培養を継続した。
ＣＭＭ０７６Ｃ（Ｇ４１９Ｒ）又はＣＭＱ４５３Ｃ（Ｇ５７２Ｒ）が導入された形質転換株の暗所での従属栄養的な生育を評価した。対照として、ＮＥＩＳ－１８０４株（野生株）、ＣＹＭＥ＿ＣＭＱ４５３Ｃ（変異なし）導入株、及び組換え株例についても同様の評価を行った。組換え株例としては、ＣＹＭＥ＿ＣＭＳ４６２Ｃ（Ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ－ｔｈｙｍｉｄｙｌａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）の遺伝子をＮＥＩＳ－１８０４株に導入したものを用いた。
２５ｃｍ２細胞培養用フラスコ（ベントキャップ）に、２０ｍＬのＭＡ２培地を入れ、藻類細胞を播種した。これを、４０℃、１３０ｒｐｍ、光独立栄養的に、１週間程度培養した。形質転換株の培地には、２００μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを添加した。次いで、３％グリセロールを含むＭＡ２培地（ＭＡ２＋３％グリセロール培地）２０ｍＬが入ったフラスコに、ＯＤ７５０＝０．５となるように、培養液を植え継いだ。これを、４０℃、１３０ｒｐｍ、光照射下で、混合栄養的に、３～５日間培養した。次いで、２０ｍＬの新しいＭＡ２＋３％グリセロール培地が入ったフラスコに、ＯＤ７５０＝０．５となるように、培養液を植え継いだ。これを、４０℃、１３０ｒｐｍ、暗所で、従属栄養的に、培養した。約１週間毎に、培養液を０．５ｍＬ採取し、ＯＤ７５０を測定した。培養開始から３週間後に、２０ｍＬ ＭＡ２＋３％グリセロール培地が入ったフラスコに、ＯＤ７５０＝０．５となるように、培養液を植え継いで培養を継続した。
【0100】
結果を図３に示す。野生株及びＣＹＭＥ＿ＣＭＱ４５３Ｃ導入株では、暗所での従属栄養的な生育は遅かった。組換え株例では、従属栄養的な生育速度は、野生株と比較して若干向上したが、植え継ぎ後ほとんど増殖しなくなった。一方、ＣＭＭ０７６Ｃ（Ｇ４１９Ｒ）導入株及びＣＭＱ４５３Ｃ（Ｇ５７２Ｒ）導入株では、野生株と比較して、従属栄養的な生育速度が顕著に向上した。最大到達藻密度も顕著に向上した。ＣＭＭ０７６Ｃ（Ｇ４１９Ｒ）導入株及びＣＭＱ４５３Ｃ（Ｇ５７２Ｒ）導入株では、植え継ぎ後も、従属栄養的な生育速度が高いまま維持された。
【0101】
＜Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ解析＞
Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ解析により、ＣＭＭ０７６Ｃ（Ｇ４１９Ｒ）導入株、及びＣＭＱ４５３Ｃ（Ｇ５７２Ｒ）導入株における導入遺伝子タンパク質の発現を確認した。
Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ解析により、ＣＭＭ０７６Ｃ（Ｇ４１９Ｒ）導入株、及びＣＭＱ４５３Ｃ（Ｇ５７２Ｒ）導入株における導入遺伝子タンパク質の発現を確認した。
【0102】
２５ｃｍ２細胞培養用フラスコ（ベントキャップ）に、２０ｍＬのＭＡ２＋３％グリセロール培地を入れ、藻類細胞を播種した。これを、４０℃、１３０ｒｐｍで、混合栄養的（光照射下）又は従属栄養的（暗所）に、培養した。藻密度がＯＤ７５０～０．５となった時点で、培養液を１ｍＬ採取し、室温、４０００ｘｇで、５分間遠心分離し、上清を除去した。沈殿した藻体を１０μＬのＭｉｌｌｉＱに懸濁し、次いで、β－メルカプトエタノールを所定濃度で添加したＳＤＳ－ＰＡＧＥ Ｓａｍｐｌｅ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ，７８６－７０１）を２μＬ添加し、９５℃で、５分間加熱した。加熱後のサンプルを、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ用サンプルとして用いた。
【0103】
プレキャストゲル Ｓｕｐｅｒｃｅｐ Ａｃｅ ５－２０％（Ｗａｋｏ，１９４－１５０２１）に、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ用サンプル全量をアプライし、１５０ＣＶで９０分間泳動した。分子量マーカーには、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｄｕａｌ Ｃｏｌｏｒ Ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，＃１６１０３７４）を用いた。ＴｒａｎｓＢｌｏｔ ＴｕｒｂｏＴＭミニＰＶＤＦ転写パック（Ｂｉｏ－ｒａｄ，＃１７０４１５６）を開封し、Ｂｏｔｔｏｍ側をＰｏｗｅｒｅｄＢｌｏｔ Ａｃｅ（ＷＳＥ－４１１５，Ａｔｔｏ）のステージ上に載置した。泳動が完了したゲルを、適当な大きさに切断し、ステージ上のＰＶＤＦ膜上に載置し、ゲル上に転写パックのＴｏｐ側を載置した。ローラーで気泡を取りのぞいた後、ＰｏｗｅｒｅｄＢｌｏｔ Ａｃｅの蓋を閉め、２５ＣＶ（Ｒａｐｉｄ）で１０分間転写した。ＰＶＤＦ膜を適当なサイズに切断してプラスチック容器に入れ、ＴＢＳ－Ｔ ５ｍＬを容器に入れて、室温で５分間振とうした。ＴＢＳ－Ｔを捨て、ＰＶＤＦ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＴＯＹＯＢＯ，ＮＹＰＢＲ０１）５ｍＬを容器に入れ、室温で１時間振とうした。次いで、ＰＶＤＦ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔを捨て、ＴＢＳ－Ｔ ５ｍＬでＰＶＤＦ膜をリンスし、ＴＢＳ－Ｔ ５ｍＬを容器に入れて室温で１５分間振とうした。容器内のＴＢＳ－Ｔを入れ替え、室温で５分間振とうすることを２回繰り返した。
【0104】
Ａｎｔｉ ＨＡ抗体－ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｗａｋｏ，０１１－２１９１１）を、Ｃａｎ Ｇｅｔ Ｓｉｇｎａｌ（登録商標） Ｓｏｌｕｔｉｏｎ １（ＴＯＹＯＢＯ，ＮＫＢ－２０１）で２０００倍希釈し、抗体溶液を調製した。前記容器内のＴＢＳ－Ｔを捨て、抗体溶液１０ｍＬを容器に入れ、室温で１時間振とうし、抗体を反応させた。抗体溶液を捨て、ＴＢＳ－Ｔを５ｍＬ入れて室温で１０分間振とうした。ＴＢＳ－Ｔを入れ替え、室温で、１０分間振とうすることを２回繰り返した。イムノスター（登録商標）ゼータ（Ｗａｋｏ，２９７－７２４０３）のＳｏｌｕｔｉｏｎ ＡとＳｏｌｕｔｉｏｎ Ｂとを１：１で必要量混合した。ラップの上に混合したイムノスターゼータを滴下し、転写した側が下になるようにＰＶＤＦ膜を浸し、ＰＶＤＦ膜と液間に気泡がないように留意しながら５分間静置した。次いで、ＰＶＤＦ膜を持ち上げ、ＰＶＤＦ膜の端から紙で余分な水分を吸い取って除去した。その後、ＰＶＤＦ膜をＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳ Ｐｌｕｓ Ｉｍａｇｅ Ｌａｂ ノートＰＣ システム（Ｂｉｏ－ｒａｄ，１７０８２６５Ｊ１ＮＰＣ）のＣｈｅｍｉモードにより、化学発光を検出して撮影した。
【0105】
結果を図４に示す。ＣＭＭ０７６Ｃ（Ｇ４１９Ｒ）導入株では、１３３ｋＤａ付近にバンドが確認され、ＣＭＭ０７６Ｃ（Ｇ４１９Ｒ）の発現が確認された。ＣＭＱ４５３Ｃ（Ｇ５７２Ｒ）導入株では、１１７ｋＤａ付近にバンドが確認され、ＣＭＱ４５３Ｃ（Ｇ５７２Ｒ）の発現が確認された。ＣＭＭ０７６Ｃ（Ｇ４１９Ｒ）導入株及びＣＭＱ４５３Ｃ（Ｇ５７２Ｒ）導入株のいずれも、従属栄養培養での導入遺伝子タンパク質のシグナルと比較して、混合栄養培養での導入遺伝子タンパク質のシグナルが弱かった。これは、混合栄養培養では、他の遺伝子も活発に発現しており、全体の遺伝子発現量に対し、導入遺伝子の発現量が相対的に低くなるためと考えられた。
【0106】
＜Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓのＣＲＹ遺伝子の探索＞
ボルボックス目ヘマトコッカス科ヘマトコッカス属の藻類であるＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｕｓｔｒｉｓとも呼ばれる）のＣＲＹ遺伝子はすでに同定されている（GenBank: QNL10737.1, W. Hang et al., Protein Expression and Purification, 2020 Aug;172:105633.）。Ｐｆａｍデータベース（ＥＭＢＬ－ＥＢＩ，ＵＫ）でのタンパク質ドメイン検索の結果、Ｈ．ｐｌｕｖｉａｌｉのＣＲＹ遺伝子（ＱＮＬ１０７３７．１；配列番号３３、３４）は、ＦＡＤ－Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎを有していた。ＢＬＡＳＴ検索によるシロイヌナズナＣＲＹ１とのアライメントにおいて、ＱＮＬ１０７３７．１では、ＣＲＹ１のＤ３５９及びＶ３６３に対応するアミノ酸残基はヒスチジンではなかった。ＱＮＬ１０７３７．１では、ＣＲＹ１のＧ３８０の対応するアミノ酸残基（Ｇ３８６）は、グリシン残基のまま保存されていた（図５）。ＱＮＬ１０７３７．１では、前記式（１）のアミノ酸配列が保存されていた（ＬＬＬＰＷＱＷＧＬＫＨＹ：配列番号３５）。ＱＮＬ１０７３７．１のＧ３８６に変異を導入することで、暗所活性型ＣＲＹを取得できる。
ボルボックス目ヘマトコッカス科ヘマトコッカス属の藻類であるＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｕｓｔｒｉｓとも呼ばれる）のＣＲＹ遺伝子はすでに同定されている（GenBank: QNL10737.1, W. Hang et al., Protein Expression and Purification, 2020 Aug;172:105633.）。Ｐｆａｍデータベース（ＥＭＢＬ－ＥＢＩ，ＵＫ）でのタンパク質ドメイン検索の結果、Ｈ．ｐｌｕｖｉａｌｉのＣＲＹ遺伝子（ＱＮＬ１０７３７．１；配列番号３３、３４）は、ＦＡＤ－Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎを有していた。ＢＬＡＳＴ検索によるシロイヌナズナＣＲＹ１とのアライメントにおいて、ＱＮＬ１０７３７．１では、ＣＲＹ１のＤ３５９及びＶ３６３に対応するアミノ酸残基はヒスチジンではなかった。ＱＮＬ１０７３７．１では、ＣＲＹ１のＧ３８０の対応するアミノ酸残基（Ｇ３８６）は、グリシン残基のまま保存されていた（図５）。ＱＮＬ１０７３７．１では、前記式（１）のアミノ酸配列が保存されていた（ＬＬＬＰＷＱＷＧＬＫＨＹ：配列番号３５）。ＱＮＬ１０７３７．１のＧ３８６に変異を導入することで、暗所活性型ＣＲＹを取得できる。
【0107】
＜Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｇａｄｉｔａｎａのＣＲＹ遺伝子の探索＞
ユースティグマトス目ユースティグマトス科ナンノクロロプシス属の藻類であるＮａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｇａｄｉｔａｎａ（現Ｍｉｃｒｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｇａｄｉｔａｎａ）において、ＣＲＹ遺伝子の探索を行った。
シロイヌナズナＣＲＹ１のアミノ酸配列をクエリーとして、Ｄａｔａｂａｓｅ：Ｎｏｎ－ｒｅｄｕｎｄａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ、Ｏｒｇａｎｉｓｍ：Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｇａｄｉｔａｎａ（ｔａｘｉｄ：７２５２０）に対して、Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＬＡＳＴ検索を行い、３つのＣＲＹ候補遺伝子（ＥＷＭ２８４６７、ＥＷＭ２３８９３、ＸＰ＿００５８５２６３７、）を得た。得られたＣＲＹ候補遺伝子の全てについて、Ｃ末端領域にＣＲＹ１との相同性は認められなかった。得られたＣＲＹ候補遺伝子とＣＲＹ１とのＰｅｒｃｅｎｔ ｉｄｅｎｔｉｔｙ（配列同一性）は、２３．１％～３４．０％であった。
ユースティグマトス目ユースティグマトス科ナンノクロロプシス属の藻類であるＮａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｇａｄｉｔａｎａ（現Ｍｉｃｒｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｇａｄｉｔａｎａ）において、ＣＲＹ遺伝子の探索を行った。
シロイヌナズナＣＲＹ１のアミノ酸配列をクエリーとして、Ｄａｔａｂａｓｅ：Ｎｏｎ－ｒｅｄｕｎｄａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ、Ｏｒｇａｎｉｓｍ：Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｇａｄｉｔａｎａ（ｔａｘｉｄ：７２５２０）に対して、Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＬＡＳＴ検索を行い、３つのＣＲＹ候補遺伝子（ＥＷＭ２８４６７、ＥＷＭ２３８９３、ＸＰ＿００５８５２６３７、）を得た。得られたＣＲＹ候補遺伝子の全てについて、Ｃ末端領域にＣＲＹ１との相同性は認められなかった。得られたＣＲＹ候補遺伝子とＣＲＹ１とのＰｅｒｃｅｎｔ ｉｄｅｎｔｉｔｙ（配列同一性）は、２３．１％～３４．０％であった。
【0108】
次に、得られたＣＲＹ候補遺伝子群と、シロイヌナズナＣＲＹ１、及びＣＹＭＥ＿ＣＭＡ０４４Ｃ（ＣＲＹ－ＤＡＳＨ）とで系統解析を行った。ＥＷＭ２８４６７は、ＣＲＹ－ＤＡＳＨと近縁であり、ＣＲＹではなかった。一方、ＥＷＭ２３８９３及びＸＰ＿００５８５２６３７は、アミノ酸配列が類似しており、両者ともＤＮＡフォトリアーゼのモチーフ配列を有していた。ナンノクロロプシス属と同じ不等毛植物門（Ｏｃｈｒｏｐｈｙｔａ）では、ＤＮＡ Ｐｈｏｔｏｌｙａｓｅ活性を有しながらＣＲＹである例が報告されている（S Coesel et al., EMBO Rep. 2009 Jun;10(6):655-61.）。このことから、ＥＷＭ２３８９３及びＸＰ＿００５８５２６３７もＣＲＹのいずれか又は両方がＣＲＹであると考えられた。
【0109】
ＥＷＭ２３８９３（配列番号３６、３７）は、Ｐｆａｍデータベース（ＥＭＢＬ－ＥＢＩ，ＵＫ）でのタンパク質ドメイン検索から、ＦＡＤ－Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎを有していた。ＥＷＭ２３８９３では、ＣＲＹ１のＧ３８０の対応するアミノ酸残基（Ｇ４４６）は、グリシン残基のまま保存されていた（図６）。ＥＷＭ２３８９３では、前記式（１）のアミノ酸配列が保存されていた（ＬＷＱＳＷＥＥＧＡＲＶＦ：配列番号３８）。ＥＷＭ２３８９３のＧ４４６に変異を導入することで、暗所活性型ＣＲＹを取得できる。
【0110】
ＸＰ＿００５８５２６３７（配列番号３９、４０）は、Ｐｆａｍデータベース（ＥＭＢＬ－ＥＢＩ，ＵＫ）でのタンパク質ドメイン検索から、ＦＡＤ－Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎを有していた。ＸＰ＿００５８５２６３７では、ＣＲＹ１のＧ３８０の対応するアミノ酸残基（Ｇ４１５）は、グリシン残基のまま保存されていた（図６）。ＸＰ＿００５８５２６３７では、前記式（１）のアミノ酸配列が保存されていた（ＬＷＱＳＷＥＥＧＡＲＶＦ：配列番号４１）。ＣＲＹ１遺伝子のＧ３８０の相当するアミノ酸であるＧ４１５に変異を導入することで、暗所活性型ＣＲＹを取得できる。
【0111】
＜Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍのＣＲＹ遺伝子の探索＞
ナビキュラ目フェオダクチラム科フェオダクチラム属の藻類であるＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍにおいて、ＣＲＹ遺伝子の探索を行った。
シロイヌナズナＣＲＹ１遺伝子のアミノ酸配列をクエリーとして、Ｄａｔａｂａｓｅ：Ｎｏｎ－ｒｅｄｕｎｄａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ、Ｏｒｇａｎｉｓｍ：Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ ＣＣＡＰ １０５５／１株（ｔａｘｉｄ：５５６４８４）に対して、Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＬＡＳＴ検索を行い、ＣＲＹ候補遺伝子を得た。得られたＣＲＹ候補遺伝子の全てについて、Ｃ末端領域にＣＲＹ１との相同性は認められなかった。得られたＣＲＹ候補遺伝子とＣＲＹ１とのＰｅｒｃｅｎｔ ｉｄｅｎｔｉｔｙ（配列同一性）は、２４．１％～３９．９％であった。
ナビキュラ目フェオダクチラム科フェオダクチラム属の藻類であるＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍにおいて、ＣＲＹ遺伝子の探索を行った。
シロイヌナズナＣＲＹ１遺伝子のアミノ酸配列をクエリーとして、Ｄａｔａｂａｓｅ：Ｎｏｎ－ｒｅｄｕｎｄａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ、Ｏｒｇａｎｉｓｍ：Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ ＣＣＡＰ １０５５／１株（ｔａｘｉｄ：５５６４８４）に対して、Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＬＡＳＴ検索を行い、ＣＲＹ候補遺伝子を得た。得られたＣＲＹ候補遺伝子の全てについて、Ｃ末端領域にＣＲＹ１との相同性は認められなかった。得られたＣＲＹ候補遺伝子とＣＲＹ１とのＰｅｒｃｅｎｔ ｉｄｅｎｔｉｔｙ（配列同一性）は、２４．１％～３９．９％であった。
【0112】
次に、得られたＣＲＹ候補遺伝子群と、シロイヌナズナＣＲＹ１、及びＣＹＭＥ＿ＣＭＡ０４４Ｃ（ＣＲＹ－ＤＡＳＨ）とで系統解析を行った。ＣＲＹ候補遺伝子群のうち、ＸＰ＿００２１７９３７９が、シロイヌナズナＣＲＹ１と最も近縁であった。ＸＰ＿００２１７９３７９は、ＣＲＹ－ＤＡＳＨではなくＣＲＹに近しいとの報告がある（M. Juhas et al., FEBS.J.(2014)）。これらのことから、ＸＰ＿００２１７９３７９は、ＣＲＹ遺伝子だと結論付けた。
ＸＰ＿００２１７９３７９（配列番号４２、４３）は、Ｐｆａｍデータベース（ＥＭＢＬ－ＥＢＩ，ＵＫ）でのタンパク質ドメイン検索から、ＦＡＤ－Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎを有していた。ＢＬＡＳＴ検索によるシロイヌナズナＣＲＹ１とのアライメントにおいて、ＸＰ＿００２１７９３７９では、ＣＲＹ１のＤ３５９及びＶ３６３に対応するアミノ酸残基はヒスチジンではなかった。ＸＰ＿００２１７９３７９では、ＣＲＹ１のＧ３８０の対応するアミノ酸残基（Ｇ４０１）は、グリシン残基のまま保存されていた（図７）。ＸＰ＿００２１７９３７９では、前記式（１）のアミノ酸配列が保存されていた（ＬＲＶＤＷＴＫＧＡＥＷＦ：配列番号４４）。ＸＰ＿００５８５２６３７のＧ４０１に変異を導入することで、暗所活性型ＣＲＹを取得できる。
ＸＰ＿００２１７９３７９（配列番号４２、４３）は、Ｐｆａｍデータベース（ＥＭＢＬ－ＥＢＩ，ＵＫ）でのタンパク質ドメイン検索から、ＦＡＤ－Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎを有していた。ＢＬＡＳＴ検索によるシロイヌナズナＣＲＹ１とのアライメントにおいて、ＸＰ＿００２１７９３７９では、ＣＲＹ１のＤ３５９及びＶ３６３に対応するアミノ酸残基はヒスチジンではなかった。ＸＰ＿００２１７９３７９では、ＣＲＹ１のＧ３８０の対応するアミノ酸残基（Ｇ４０１）は、グリシン残基のまま保存されていた（図７）。ＸＰ＿００２１７９３７９では、前記式（１）のアミノ酸配列が保存されていた（ＬＲＶＤＷＴＫＧＡＥＷＦ：配列番号４４）。ＸＰ＿００５８５２６３７のＧ４０１に変異を導入することで、暗所活性型ＣＲＹを取得できる。
【0113】
上記系統解析の結果、ＸＰ＿００２１８００９５（配列番号４５、４６）は、シロイヌナズナＣＲＹ１とはやや遠縁であった。しかし、ＸＰ＿００２１８００９５は、ＰｔＣＰＦ１としてＤＮＡ Ｐｈｏｔｏｌｙａｓｅ活性を有しながら、Ａｎｉｍａｌ－ｌｉｋｅ ｃｒｙｐｔｏｃｈｒｏｍｅであると報告されている（S Coesel et al., EMBO Rep. 2009 Jun;10(6):655-61.）。ＸＰ＿００２１８００９５は、Ｐｆａｍデータベース（ＥＭＢＬ－ＥＢＩ，ＵＫ）でのタンパク質ドメイン検索から、ＦＡＤ－Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎを有していた。ＢＬＡＳＴ検索によるシロイヌナズナＣＲＹ１とのアライメントの結果、ＸＰ＿００２１８００９５は、ＣＲＹ１のＤ３５９及びＶ３６３に対応するアミノ酸残基はヒスチジンであった。ＸＰ＿００２１８００９５では、ＣＲＹ１のＧ３８０の対応するアミノ酸残基（Ｇ４０８）は、グリシン残基のまま保存されていた（図７）。ＸＰ＿００２１８００９５では、前記式（１）のアミノ酸配列が保存されていた（ＬＷＱＳＷＥＤＧＡＴＶＦ：配列番号４７）。ＸＰ＿００２１８００９５のＧ４０８に変異を導入することで、暗所活性型ＣＲＹを取得できる。
【0114】
＜Ｄｉａｃｒｏｎｅｍａ ｌｕｔｈｅｒｉのＣＲＹ遺伝子の探索＞
パブロバ目パブロバ科ディアクロネマ属の藻類であるＤｉａｃｒｏｎｅｍａ ｌｕｔｈｅｒｉ（Ｐａｖｌｏｖａ ｌｕｔｈｅｒｉとも呼ばれる）において、ＣＲＹ遺伝子の探索を行った。
シロイヌナズナＣＲＹ１のアミノ酸配列をクエリーとして、Ｄａｔａｂａｓｅ：Ｎｏｎ－ｒｅｄｕｎｄａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ、Ｏｒｇａｎｉｓｍ：Ｄｉａｃｒｏｎｅｍａ（Ｐａｖｌｏｖａ） ｌｕｔｈｅｒｉ（ｔａｘｉｄ：２０８１４９１）に対して、Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＬＡＳＴ検索を行い、ＣＲＹ候補を得た。得られたＣＲＹ候補の全てについて、Ｃ末端領域にＣＲＹ１との相同性は認められ得なかった。得られたＣＲＹ候補遺伝子とＣＲＹ１とのＰｅｒｃｅｎｔ ｉｄｅｎｔｉｔｙ（配列同一性）は、２６．９％～３６．７％であった。
パブロバ目パブロバ科ディアクロネマ属の藻類であるＤｉａｃｒｏｎｅｍａ ｌｕｔｈｅｒｉ（Ｐａｖｌｏｖａ ｌｕｔｈｅｒｉとも呼ばれる）において、ＣＲＹ遺伝子の探索を行った。
シロイヌナズナＣＲＹ１のアミノ酸配列をクエリーとして、Ｄａｔａｂａｓｅ：Ｎｏｎ－ｒｅｄｕｎｄａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ、Ｏｒｇａｎｉｓｍ：Ｄｉａｃｒｏｎｅｍａ（Ｐａｖｌｏｖａ） ｌｕｔｈｅｒｉ（ｔａｘｉｄ：２０８１４９１）に対して、Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＬＡＳＴ検索を行い、ＣＲＹ候補を得た。得られたＣＲＹ候補の全てについて、Ｃ末端領域にＣＲＹ１との相同性は認められ得なかった。得られたＣＲＹ候補遺伝子とＣＲＹ１とのＰｅｒｃｅｎｔ ｉｄｅｎｔｉｔｙ（配列同一性）は、２６．９％～３６．７％であった。
【0115】
次に、得られたＣＲＹ候補遺伝子群と、シロイヌナズナＣＲＹ１、及びＣＹＭＥ＿ＣＭＡ０４４Ｃ（ＣＲＹ－ＤＡＳＨ）とで系統解析を行った。ＫＡＧ８４６７６３８は、ＣＲＹ－ＤＡＳＨと近縁であり、ＣＲＹではなかった。ＣＲＹ候補遺伝子群のうち、ＫＡＧ８４５８１８８が、シロイヌナズナＣＲＹ１と最も近縁であった。ＫＡＧ８４６３４０２は、シロイヌナズナＣＲＹ１、及びＣＲＹ－ＤＡＳＨのどちらとも近縁ではなかった。
【0116】
ＫＡＧ８４５８１８８（配列番号４８、４９）は、Ｐｆａｍデータベース（ＥＭＢＬ－ＥＢＩ，ＵＫ）でのタンパク質ドメイン検索から、ＦＡＤ－Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎを有していた。ＢＬＡＳＴ検索によるシロイヌナズナＣＲＹ１とのアライメントにおいて、ＫＡＧ８４５８１８８では、ＣＲＹ１のＤ３５９及びＶ３６３に対応するアミノ酸残基はヒスチジンであったことから、ＤＮＡ Ｐｈｏｔｏｌｙａｓｅ活性を有していると考えられた。しかし、ＤＮＡ Ｐｈｏｔｏｌｙａｓｅ活性に重要なＨｉｓ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ａｒｇ－Ｈｉｓモチーフのうち、ＫＡＧ８４５８１８８では、２番目及び最後のヒスチジン残基は保存されていたが、最初のヒスチジン残基はアラニン残基に変異していた。そのため、ＫＡＧ８４５８１８８は、ＤＮＡ Ｐｈｏｔｏｌｙａｓｅ活性を部分的若しくは完全に失っており、第一義的な機能はＣＲＹであると考えられた。ＫＡＧ８４５８１８８では、ＣＲＹ１のＧ３８０の対応するアミノ酸残基（Ｇ４４０）は、グリシン残基のまま保存されていた（図８）。ＫＡＧ８４５８１８８では、前記式（１）のアミノ酸配列が保存されていた（ＬＬＶＤＷＲＨＧＡＲＷＦ：配列番号５０）。ＫＡＧ８４５８１８８のＧ４４０に変異を導入することで、暗所活性型ＣＲＹを取得できる。
【0117】
ＫＡＧ８４６３４０２（配列番号５１、５２）は、Ｐｆａｍデータベース（ＥＭＢＬ－ＥＢＩ，ＵＫ）でのタンパク質ドメイン検索から、ＦＡＤ－Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎを有していた。ＢＬＡＳＴ検索によるシロイヌナズナＣＲＹ１とのアライメントにおいて、ＫＡＧ８４６３４０２では、ＣＲＹ１のＤ３５９及びＶ３６３に対応するアミノ酸残基はヒスチジンであった。しかし、ディアクロネマ属と同じ不等毛植物門では、ＤＮＡ Ｐｈｏｔｏｌｙａｓｅ活性を有しながらＣＲＹである例が報告されている（S Coesel et al., EMBO Rep. 2009 Jun;10(6):655-61.）。このことから、ＫＡＧ８４６３４０２は、ＣＲＹの機能を有していることも考えられた。ＫＡＧ８４６３４０２では、ＣＲＹ１のＧ３８０の対応するアミノ酸残基（Ｇ４０３）は、グリシン残基のまま保存されていた（図８）。ＫＡＧ８４６３４０２では、前記式（１）のアミノ酸配列が保存されていた（ＬＹＶＲＷＥＥＧＡＡＶＦ：配列番号５３）。ＫＡＧ８４６３４０２のＧ４０３に変異を導入することで、暗所活性型ＣＲＹを取得できる。
【0118】
＜Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｍｕｅｌｌｅｒｉのＣＲＹ遺伝子の探索＞
キートセロス目キートセロス科キートセロス属の藻類であるＣｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｍｕｅｌｌｅｒｉにおいて、ＣＲＹ遺伝子の探索を行った。
シロイヌナズナＣＲＹ１のアミノ酸配列をクエリーとして、Ｄａｔａｂａｓｅ：ＡＳＭ１９６９３５４ｖ１ ＧｅｎＢａｎｋ ａｓｓｅｍｂｌｙ［ＧＣＡ＿０１９６９３５４５．１］、Ｏｒｇａｎｉｓｍ：Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｍｕｅｌｌｅｒｉ（ｔａｘｉｄ：２６５５２５）に対して、Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＬＡＳＴ検索を行い、ＣＲＹ候補を得た。得られたＣＲＹ候補の全てについて、Ｃ末端領域にＣＲＹ１との相同性は認められ得なかった。得られたＣＲＹ候補遺伝子とＣＲＹ１とのＰｅｒｃｅｎｔ ｉｄｅｎｔｉｔｙ（配列同一性）は、２４．２％～３８．２％であった。
キートセロス目キートセロス科キートセロス属の藻類であるＣｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｍｕｅｌｌｅｒｉにおいて、ＣＲＹ遺伝子の探索を行った。
シロイヌナズナＣＲＹ１のアミノ酸配列をクエリーとして、Ｄａｔａｂａｓｅ：ＡＳＭ１９６９３５４ｖ１ ＧｅｎＢａｎｋ ａｓｓｅｍｂｌｙ［ＧＣＡ＿０１９６９３５４５．１］、Ｏｒｇａｎｉｓｍ：Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｍｕｅｌｌｅｒｉ（ｔａｘｉｄ：２６５５２５）に対して、Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＬＡＳＴ検索を行い、ＣＲＹ候補を得た。得られたＣＲＹ候補の全てについて、Ｃ末端領域にＣＲＹ１との相同性は認められ得なかった。得られたＣＲＹ候補遺伝子とＣＲＹ１とのＰｅｒｃｅｎｔ ｉｄｅｎｔｉｔｙ（配列同一性）は、２４．２％～３８．２％であった。
【0119】
次に、得られたＣＲＹ候補遺伝子群と、シロイヌナズナＣＲＹ１、及びＣＹＭＥ＿ＣＭＡ０４４Ｃ（ＣＲＹ－ＤＡＳＨ）とで系統解析を行った。ＣＲＹ候補遺伝子群のうちＧＥＮＥ１が、シロイヌナズナＣＲＹ１と最も近縁であった。ＧＥＮＥ２、及びＧＥＮＥ３はシロイヌナズナＣＲＹ１、及びＣＲＹ－ＤＡＳＨのどちらとも近縁ではなかった。
【0120】
ＧＥＮＥ１（配列番号６１、６２）は、Ｐｆａｍデータベース（ＥＭＢＬ－ＥＢＩ，ＵＫ）でのタンパク質ドメイン検索から、ＦＡＤ－Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎを有していた。ＢＬＡＳＴ検索によるシロイヌナズナＣＲＹ１とのアライメントにおいて、ＧＥＮＥ１では、ＣＲＹ１のＤ３５９及びＶ３６３に対応するアミノ酸残基はヒスチジンであった。しかし、キートセロス属と同じ不等毛植物門では、ＤＮＡ Ｐｈｏｔｏｌｙａｓｅ活性を有しながらＣＲＹである例が報告されている（S Coesel et al., EMBO Rep. 2009 Jun;10(6):655-61.）。このことから、ＧＥＮＥ１は、ＣＲＹの機能を有していることも考えられた。ＧＥＮＥ１では、ＣＲＹ１のＧ３８０の対応するアミノ酸残基（Ｇ８７）は、グリシン残基のまま保存されていた（図９）。ＧＥＮＥ１では、前記式（１）のアミノ酸配列が保存されていた（ＬＷＱＳＷＥＫＧＡＥＨＦ：配列番号６３）。ＧＥＮＥ１のＧ８７に変異を導入することで、暗所活性型ＣＲＹを取得できる。
【0121】
ＧＥＮＥ２（配列番号６４、６５）は、Ｐｆａｍデータベース（ＥＭＢＬ－ＥＢＩ，ＵＫ）でのタンパク質ドメイン検索から、ＦＡＤ－Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎを有していた。ＧＥＮＥ２では、ＣＲＹ１のＧ３８０の対応するアミノ酸残基（Ｇ５２７）は、グリシン残基のまま保存されていた（図９）。ＧＥＮＥ２では、前記式（１）のアミノ酸配列が保存されていた（ＬＧＬＳＷＫＤＧＭＱＨＦ：配列番号６６）。ＣＲＹ１遺伝子のＧ３８０に相当するアミノ酸残基であるＧ５２７に変異を導入することで、暗所活性型ＣＲＹを取得できる。
【0122】
ＧＥＮＥ３（配列番号６７、６８）は、Ｐｆａｍデータベース（ＥＭＢＬ－ＥＢＩ，ＵＫ）でのタンパク質ドメイン検索から、ＦＡＤ－Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎを有していた。ＧＥＮＥ３では、ＣＲＹ１のＧ３８０の対応するアミノ酸残基（Ｇ５２３）は、グリシン残基のまま保存されていた（図９）。ＧＥＮＥ３では、前記式（１）のアミノ酸配列が保存されていた（ＬＨＬＤＷＲＡＧＡＥＷＦ：配列番号６９）。ＣＲＹ１遺伝子のＧ３８０に相当するアミノ酸残基であるＧ５２３に変異を導入することで、暗所活性型ＣＲＹを取得できる。
【0123】
＜Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｇｒａｃｉｌｉｓのＣＲＹ遺伝子の探索＞
キートセロス目キートセロス科キートセロス属の藻類であるＣｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｇｒａｃｉｌｉｓにおいて、ＣＲＹ遺伝子の探索を行った。
シロイヌナズナＣＲＹ１のアミノ酸配列をクエリーとして、Ｄａｔａｂａｓｅ：ＰＲＪＤＢ１２１８６、Ｏｒｇａｎｉｓｍ：Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｇｒａｃｉｌｉｓ（ｔａｘｉｄ：１８４５９２）に対して、Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＬＡＳＴ検索を行い、ＣＲＹ候補を得た。得られたＣＲＹ候補の全てについて、Ｃ末端領域にＣＲＹ１との相同性は認められ得なかった。得られたＣＲＹ候補遺伝子とＣＲＹ１とのＰｅｒｃｅｎｔ ｉｄｅｎｔｉｔｙ（配列同一性）は、２４．１％～３４．２％であった。
キートセロス目キートセロス科キートセロス属の藻類であるＣｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｇｒａｃｉｌｉｓにおいて、ＣＲＹ遺伝子の探索を行った。
シロイヌナズナＣＲＹ１のアミノ酸配列をクエリーとして、Ｄａｔａｂａｓｅ：ＰＲＪＤＢ１２１８６、Ｏｒｇａｎｉｓｍ：Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｇｒａｃｉｌｉｓ（ｔａｘｉｄ：１８４５９２）に対して、Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＬＡＳＴ検索を行い、ＣＲＹ候補を得た。得られたＣＲＹ候補の全てについて、Ｃ末端領域にＣＲＹ１との相同性は認められ得なかった。得られたＣＲＹ候補遺伝子とＣＲＹ１とのＰｅｒｃｅｎｔ ｉｄｅｎｔｉｔｙ（配列同一性）は、２４．１％～３４．２％であった。
【0124】
次に、得られたＣＲＹ候補遺伝子群と、シロイヌナズナＣＲＹ１、及びＣＹＭＥ＿ＣＭＡ０４４Ｃ（ＣＲＹ－ＤＡＳＨ）とで系統解析を行った。ＧＥＮＥ４は、ＣＲＹ－ＤＡＳＨと近縁であり、ＣＲＹではなかった。ＣＲＹ候補遺伝子群のうち、ＧＥＮＥ５が、シロイヌナズナＣＲＹ１と最も近縁であった。ＧＥＮＥ６、及びＧＥＮＥ７は、シロイヌナズナＣＲＹ１、及びＣＲＹ－ＤＡＳＨのどちらとも近縁ではなかった。
【0125】
ＧＥＮＥ５（配列番号７０、７１）は、Ｐｆａｍデータベース（ＥＭＢＬ－ＥＢＩ，ＵＫ）でのタンパク質ドメイン検索から、ＦＡＤ－Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎを有していた。ＢＬＡＳＴ検索によるシロイヌナズナＣＲＹ１とのアライメントにおいて、ＧＥＮＥ５では、ＣＲＹ１のＤ３５９及びＶ３６３に対応するアミノ酸残基はヒスチジンであった。しかし、キートセロス属と同じ不等毛植物門では、ＤＮＡ Ｐｈｏｔｏｌｙａｓｅ活性を有しながらＣＲＹである例が報告されている（S Coesel et al., EMBO Rep. 2009 Jun;10(6):655-61.）。このことから、ＧＥＮＥ５は、ＣＲＹの機能を有していることも考えられた。ＧＥＮＥ５では、ＣＲＹ１のＧ３８０の対応するアミノ酸残基（Ｇ８７）は、グリシン残基のまま保存されていた（図１０）。ＧＥＮＥ５では、前記式（１）のアミノ酸配列が保存されていた（ＬＷＱＳＷＥＫＧＡＥＨＦ：配列番号７２）。ＧＥＮＥ５のＧ８７に変異を導入することで、暗所活性型ＣＲＹを取得できる。
【0126】
ＧＥＮＥ６（配列番号７３、７４）は、Ｐｆａｍデータベース（ＥＭＢＬ－ＥＢＩ，ＵＫ）でのタンパク質ドメイン検索から、ＦＡＤ－Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎを有していた。ＧＥＮＥ６では、ＣＲＹ１のＧ３８０の対応するアミノ酸残基（Ｇ３４７）は、グリシン残基のまま保存されていた（図１０）。ＧＥＮＥ６では、前記式（１）のアミノ酸配列が保存されていた（ＬＬＩＤＷＲＷＧＥＡＹＦ：配列番号７５）。ＣＲＹ１遺伝子のＧ３８０に相当するアミノ酸残基であるＧ３４７に変異を導入することで、暗所活性型ＣＲＹを取得できる。
【0127】
ＧＥＮＥ７（配列番号７６、７７）は、Ｐｆａｍデータベース（ＥＭＢＬ－ＥＢＩ，ＵＫ）でのタンパク質ドメイン検索から、ＦＡＤ－Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎを有していた。ＧＥＮＥ７では、ＣＲＹ１のＧ３８０の対応するアミノ酸残基（Ｇ５３４）は、グリシン残基のまま保存されていた（図１０）。ＧＥＮＥ７では、前記式（１）のアミノ酸配列が保存されていた（ＬＧＬＳＷＫＤＧＭＱＨＦ：配列番号７８）。ＣＲＹ１遺伝子のＧ３８０に相当するアミノ酸残基であるＧ５３４に変異を導入することで、暗所活性型ＣＲＹを取得できる。
【0128】
以上、本発明の好ましい実施例を説明したが、本発明はこれら実施例に限定されることはない。本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、構成の付加、省略、置換、およびその他の変更が可能である。本発明は前述した説明によって限定されることはなく、添付のクレームの範囲によってのみ限定される。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【配列表】