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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-04-05
(45)【発行日】2024-04-15
(54)【発明の名称】メラノコルチン－４受容体アゴニスト
(51)【国際特許分類】
C07D 413/14 20060101AFI20240408BHJP
A61K 31/5377 20060101ALI20240408BHJP
A61P 3/04 20060101ALI20240408BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20240408BHJP
A61P 15/10 20060101ALI20240408BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20240408BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240408BHJP
【ＦＩ】
C07D413/14 CSP
A61K31/5377
A61P3/04
A61P3/10
A61P15/10
A61P29/00
A61P43/00 111
【請求項の数】
14
(21)【出願番号】P 2021575455
(86)(22)【出願日】2020-11-06
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-11-21
(86)【国際出願番号】 KR2020015462
(87)【国際公開番号】W WO2021091283
(87)【国際公開日】2021-05-14
【審査請求日】2022-03-18
(31)【優先権主張番号】10-2019-0141649
(32)【優先日】2019-11-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】500239823
【氏名又は名称】エルジー・ケム・リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100110364
【弁理士】
【氏名又は名称】実広 信哉
(74)【代理人】
【識別番号】100122161
【弁理士】
【氏名又は名称】渡部 崇
(72)【発明者】
【氏名】スン・ワン・カン
(72)【発明者】
【氏名】ヒ・ドン・パク
(72)【発明者】
【氏名】ヒ・ドン・パク
(72)【発明者】
【氏名】ス・ジン・ヨ
(72)【発明者】
【氏名】ヒュン・ソ・パク
(72)【発明者】
【氏名】ジ・ホ・ホン
(72)【発明者】
【氏名】ヘ・ウォン・アン
(72)【発明者】
【氏名】ウン・シル・チェ
【審査官】安藤 倫世
(56)【参考文献】
【文献】特表２００９－５４３７７４（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１２－５０８７３０（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００４－５２９１０５（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１５／１８２７２３（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｄ
Ａ６１Ｋ
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記式（１）【化1】
【請求項2】
Ｒ１が、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル又はｔｅｒｔ－ブチルである請求項１に記載の化合物、又はその薬学的に許容される塩。
【請求項3】
前記式（１）の化合物が、以下の群から選ばれる請求項１に記載の化合物、又はその薬学的に許容される塩：
Ｎ－（（３Ｓ，５Ｓ）－１－（（３Ｓ，４Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブチル）－４－（４－クロロフェニル）ピロリジン－３－カルボニル）－５－（モルホリン－４－カルボニル）ピロリジン－３－イル）－Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）イソブチルアミド；
Ｎ－（（３Ｓ，５Ｓ）－１－（（３Ｓ，４Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブチル）－４－（４－クロロフェニル）ピロリジン－３－カルボニル）－５－モルホリン－４－カルボニル）ピロリジン－３－イル）－Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）プロピオンアミド；及び
Ｎ－（（３Ｓ，５Ｓ）－１－（（３Ｓ，４Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブチル）－４－（４－クロロフェニル）ピロリジン－３－カルボニル）－５－（モルホリン－４－カルボニル）ピロリジン－３－イル）－Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）ピバルアミド。
【請求項4】
前記薬学的に許容される塩が、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、臭化水素酸及びヨウ化水素酸からなる群から選ばれる請求項１に記載の化合物、又はその薬学的に許容される塩。
【請求項5】
前記薬学的に許容される塩が、塩酸塩である請求項４に記載の化合物、又はその薬学的に許容される塩。
【請求項6】
請求項１～５のいずれか１項に記載の化合物、又はその薬学的に許容される塩、及び薬学的に許容される担体を含むメラノコルチン受容体アゴニスト医薬組成物。
【請求項7】
肥満の予防又は治療用である請求項６に記載のメラノコルチン受容体アゴニスト医薬組成物。
【請求項8】
糖尿の予防又は治療用である請求項６に記載のメラノコルチン受容体アゴニスト医薬組成物。
【請求項9】
炎症の予防又は治療用である請求項６に記載のメラノコルチン受容体アゴニスト医薬組成物。
【請求項10】
勃起不全症の予防又は治療用である請求項６に記載のメラノコルチン受容体アゴニスト医薬組成物。
【請求項11】
肥満の予防または治療用薬剤の調製のための請求項６に記載のメラノコルチン受容体アゴニスト医薬組成物の使用。
【請求項12】
糖尿の予防または治療用薬剤の調製のための請求項６に記載のメラノコルチン受容体アゴニスト医薬組成物の使用。
【請求項13】
炎症の予防または治療用薬剤の調製のための請求項６に記載のメラノコルチン受容体アゴニスト医薬組成物の使用。
【請求項14】
勃起不全症の予防または治療用薬剤の調製のための請求項６に記載のメラノコルチン受容体アゴニスト医薬組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、メラノコルチン受容体に対して優れたアゴニスト活性を示す化合物に関する。より詳細には、本発明は、下記式（１）
（式中、Ｒ1はＣ2－Ｃ5アルキルである）の化合物、それを有効成分として含む医薬組成物及びその使用に関するものであり、本発明の化合物は、メラノコルチン－４受容体に対して優れたアゴニスト活性を示し、特に、肥満、糖尿、炎症及び勃起不全症に対する予防又は治療に有用に使用できる。
【化1】
【背景技術】
【0002】
レプチンタンパク質は、体脂肪細胞（脂肪細胞）から分泌されるホルモンであり、体脂肪量が増えると分泌量が増える。レプチンタンパク質は、視床下部（hypothalamus）で生成される様々な神経ペプチドの機能を調節し、それによって食欲、体脂肪量及びエネルギー代謝を含む様々な生体内機能を調節する（非特許文献１）。レプチンタンパク質による食欲と体重調節のシグナル伝達は、その下流の多くの要因の調節を通じて行われる。その最も代表的なものは、メラノコルチン、ＡｇＲＰ（アグーチ関連ペプチド）及び神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）ホルモンである。
【0003】
生体内での過剰なカロリーの結果として血中のレプチンの濃度が増加すると、脳下垂体におけるプロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）タンパク質ホルモンの分泌が増加し、ＡｇＲＰとＮＰＹの生成が減少する。小さいペプチドホルモンであるα－ＭＳＨ（メラノサイト刺激ホルモン）はＰＯＭＣ神経細胞からから生成され、このホルモンは、２次神経細胞のメラノコルチン－４受容体（ＭＣ４Ｒ）アゴニストであり、最終的に食欲減退を誘導する。一方、カロリー不足によりレプチンの濃度が低下するとＭＣ４Ｒ拮抗薬（antagonist）であるＡｇＲＰの発現が増加し、ＮＰＹの発現も増加するため、再有的に食欲が増進される。つまり、レプチンの変化に応じて、α－ＭＳＨホルモンとＡｇＲＰホルモンは、ＭＣ４Ｒのアゴニストとアンタゴニストとして食欲調節に関与している。
【0004】
α－ＭＳＨホルモンは、ＭＣ４Ｒに加えて３つのＭＣＲサブタイプに結合することにより、様々な生理学的反応を誘導する。これまでに、５つのＭＣＲサブタイプが識別されている。サブタイプの中で、ＭＣ１Ｒは主に皮膚細胞で発現され、メラニン色素沈着に関与し、ＭＣ２Ｒは主に副腎で発現され、グルココルチコイドホルモンの生成に関与することが知られており、ＰＯＭＣに由来するＡＣＴＨ（副腎皮質刺激ホルモン）のがそのリガンドである。ＭＣ３ＲとＭＣ４Ｒは主に中枢神経系で発現し、食欲、エネルギー代謝及び体内の脂肪蓄積効率の調節に関与し、ＭＣ５Ｒは様々な組織で発現し、外分泌機能を調節することが知られている（非特許文献２）。特に、ＭＣ４Ｒ受容体の活性化は、食欲不振やエネルギー代謝の増加を誘導することで効果的に体重を効率的に減らす効果があり、肥満治療薬の開発における主要な作用点であることが立証された（非特許文献２、３、４及び５参照）。
【0005】
食欲と体重の制御におけるＭＣ４Ｒの役割は、主にアグーチタンパク質の異常発現の動物モデル（アグーチマウス）での実験を通じて立証された。アグーチマウスの場合、アグーチタンパク質は、遺伝的変異によって中枢神経系で高濃度に発現し、視床下部でＭＣ４Ｒの拮抗薬として作用し、肥満を誘導することが明らかになった（非特許文献６、７）。その後の研究結果では、実際のアグーチタンパク質と同様のＡｇＲＰ（アグーチ関連ペプチド）が視床下部神経で発現していることが観察されており、ＡｇＲＰはＭＣ４Ｒに対する拮抗薬として食欲調節に関与していることも分かった（非特許文献８、９）。
【0006】
生体内でのＭＣ４Ｒアゴニストであるα－ＭＳＨの動物への大脳投与は、食欲を減退させる効果が示し、ＭＣ４Ｒ拮抗薬であるＳＨＵ９１１９（ペプチド）又はＨＳ０１４（ペプチド）を治療すると、食欲増加の効果が再び観察された（非特許文献１０）。さらに、メラノタンＩＩ（ＭＴＩＩ、Ａｃ－Ｎｌｅ－ｃ［Ａｓｐ－Ｈｉｓ－ＤＰｈｅ－Ａｒｇ－Ｔｒｐ－Ｌｙｓ］－ＮＨ２）及びそれに類似したアゴニストであるＨＰ２２８を使用した動物試験において、大脳、腹腔内、又は皮下投与後、食欲抑制、体重減少、エネルギー代謝の増加効能などが確認された（非特許文献１１、１２、１３）。対照的に、代表的なＳＨＵ９１１９を動物に投与すると、顕著で持続的な飼料摂取量と体重増加が見られ、ＭＣＲアゴニストを使用して肥満を治療できるという薬理学的な証拠が得られた。ＭＴＩＩ投与中に明らかに示される食欲減退効果は、ＭＣ４ＲＫＯ（ノックアウト）マウスでは示されない。この実験結果は、食欲減退効果が主にＭＣ４Ｒの活性化によって達成されることを再び証明している（非特許文献１４）。
【0007】
中枢神経系に作用する食欲阻害剤は、これまでに開発された肥満治療として優勢であり、ほとんどの阻害剤は神経伝達物質の作用を調節する薬物である。その例には、ルアドレナリン作動薬（フェンテルミン及びマジンドール）と、セロトニン作用薬であるフルオキセチン及びシブトラミンが含まれる。しかし、前記神経伝達物質調節剤は、多数のサブタイプ受容体による食欲阻害に加えて、様々な生理学的作用に対して幅広い効果を発揮している。従って、前記調節剤は、各サブタイプに選択性に欠け、長期投与の場合に様々な副作用を伴うという大きな欠点がある。
【0008】
一方、メラノコルチンは神経伝達物質ではなく神経ペプチドであり、ＭＣ４Ｒ遺伝子ＫＯマウスではエネルギー代謝以外のすべての機能が正常であることを考えると、メラノコルチンアゴニストは、他の生理学的機能に影響を与えることなく、食欲阻害による体重減少のみを誘発することができる点で作用点としての利点がある。特に、受容体は、これまでに開発された新薬の作用点の中で最も成功したカテゴリーに属するＧ－タンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）であり、サブタイプ受容体の選択性を確保することが比較的容易であるという点で、従来の作用点とは大きく区別されている。
【0009】
このようなメラノコルチン受容体を作用点として活用する例として、特許文献１、２は、メラノコルチン受容体のアゴニストとしての化合物を開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0010】
【文献】ＷＯ ２００８／００７９３０号
【文献】ＷＯ ２０１０／０５６０２２号
【非特許文献】
【0011】
【文献】Schwartz, et al., Nature 404, 661-671 (2000)
【文献】Wikberg, et al., Pharm Res 42 (5) 393-420 (2000)
【文献】Wikberg, Eur. J. Pharmacol 375, 295-310 (1999)
【文献】Douglas et al., Eur J Pharm 450, 93-109 (2002)
【文献】O’Rahilly et al., Nature Med 10, 351-352 (2004)
【文献】Yen, TT et al., FASEB J. 8, 479-488 (1994); and Lu D., et al. Nature 371, 799-802 (1994)
【文献】Lu D., et al. Nature 371, 799-802 (1994)
【文献】Shutter, et al., Genes Dev., 11, 593-602 (1997)
【文献】Ollman, et al. Science 278, 135-138 (1997)
【文献】Kask et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 245, 90-93 (1998)
【文献】Thiele T. E., et al. Am J Physiol 274 (1 Pt 2), R248-54 (1998)
【文献】Lee M. D., et al. FASEB J 12, A552 (1998)
【文献】Murphy B., et al. J Appl Physiol 89, 273-82 (2000)
【文献】Marsh, et al., Nat Genet 21, 119-122 (1999)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0012】
本発明の目的は、メラノコルチン受容体、特にメラノコルチン－４受容体（ＭＣ４Ｒ）に対する選択的なアゴニスト活性に優れた式（１）で示される新規の化合物、その薬学的に許容される塩又は異性体を提供することである。
【0013】
本発明の別の目的は、前記式（１）で示される化合物を調製する方法を提供することである。
【0014】
本発明のさらに別の目的は、有効成分として、前記式（１）で示される化合物、その薬学的に許容される塩又は異性体を含むメラノコルチン受容体アゴニスト医薬組成物を提供することである。
【0015】
本発明のさらに別目的は、肥満、糖尿、炎症及び勃起不全症の予防又は治療のための、前記式（１）で示される化合物、その薬学的に許容される塩又は異性体の使用を提供することである。
【0016】
本発明のさらに別の目的は、前記式（１）で示される化合物、その薬学的に許容される塩又は異性体を、それを必要とするする対象に投与することを含む、肥満、糖尿、炎症及び勃起不全症の予防又は治療する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0017】
前記目的を達成するために、本発明は、下記式（１）
（式中、Ｒ1はＣ2－Ｃ5アルキルである）の化合物、又はその薬学的に許容される塩又は異性体を提供する。
【化2】
【0018】
本発明による式（１）の化合物は、薬学的に許容される塩を形成していてもよい。
【0019】
また、本発明による化合物は、不斉炭素中心と不斉軸又は不斉平面を有し得るので、シス又はトランス異性体、Ｒ又はＳ異性体、ラセミ体、ジアステレオマー混合物及び個々のジアステレオマーとして存在することができるし、これらすべての異性体及び混合物は、本発明の範囲内に含まれる。
【0020】
本明細書では、他に示さない限り、式（１）の化合物は式（１）の化合物、その薬学的に許容される塩及び異性体をすべて含むという意味で使用される。
【0021】
本発明による一実施形態では、前記式（１）のＲ1は、Ｃ2～Ｃ4アルキルである。本発明による別の実施形態では、前記式（１）のＲ1は、直鎖又は分枝状Ｃ2～Ｃ4アルキル、例えば、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル又はｔｅｒｔ－ブチルである。
【0022】
本発明による別の実施形態では、前記式（１）のＲ1は、Ｃ2又はＣ3アルキルである。本発明による別の実施形態では、前記式（１）のＲ1は直鎖又は分枝状Ｃ2又はＣ3アルキル、例えば、エチル、ｎ－プロピル又はイソプロピルである。
【0023】
本発明による別の実施形態では、前記式（１）の化合物は、下記式（２）のＮ－（（３Ｓ，５Ｓ）－１－（（３Ｓ，４Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブチル）－４－（４－クロロフェニル）ピロリジン－３－カルボニル）－５－（モルホリン－４－カルボニル）ピロリジン－３－イル）－Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）イソブチルアミドである：
【化3】
【0024】
本発明の別の実施形態では、前記式（１）の化合物は、下記式（３）のＮ－（（３Ｓ，５Ｓ）－１－（（３Ｓ，４Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブチル）－４－（４－クロロフェニル）ピロリジン－３－カルボニル）－５－（モルホリン－４－カルボニル）ピロリジン－３－イル）－Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）プロピオンアミドである：
【化4】
【0025】
本発明の別の実施形態では、前記式（１）の化合物は、下記式（４）のＮ－（（３Ｓ，５Ｓ）－１－（（３Ｓ，４Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブチル）－４－（４－クロロフェニル）ピロリジン－３－カルボニル）－５－（モルホリン－４－カルボニル）ピロリジン－３－イル）－Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）ピバルアミドである：
【化5】
【0026】
本発明による別の実施形態において、前記薬学的に許容される塩の例には、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸などの無機酸、酒石酸、ギ酸、クエン酸、酢酸、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、グルコン酸、安息香酸、乳酸、フマル酸、マレイン酸などの有機カルボン酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸又はナフタレンスルホン酸などのスルホン酸などによって形成された酸付加塩を含むが、これらに限定されない。
【0027】
本発明による別の実施形態において、前記化合物は、式（１）の化合物の薬学的に許容される塩であり、ここで、Ｒ1はエチルであり、塩は、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸などの無機酸；酒石酸、ギ酸、クエン酸、酢酸、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、グルコン酸、安息香酸、乳酸、フマル酸、マレイン酸などの有機カルボン酸；又はメタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸などのスルホン酸である。
【0028】
本発明による別の実施形態において、前記化合物、は式（１）の化合物の薬学的に許容される塩であり、ここで、Ｒ1はｎ－プロピルであり、塩は、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸などの無機酸；酒石酸、ギ酸、クエン酸、酢酸、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、グルコン酸、安息香酸、乳酸、フマル酸、マレイン酸などの有機カルボン酸；又はメタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸などのスルホン酸である。
【0029】
本発明による別の実施形態には、前記化合物は、式（１）の化合物の薬学的に許容される塩であり、ここ、でＲ1はイソプロピルであり、塩は、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸などの無機酸；酒石酸、ギ酸、クエン酸、酢酸、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、グルコン酸、安息香酸、乳酸、フマル酸、マレイン酸などの有機カルボン酸；又はメタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸などのスルホン酸である。
【0030】
本発明による別の実施形態において、前記化合物は、式（１）の化合物の薬学的に許容される塩であり、ここで、Ｒ1はｎ－ブチルであり、塩は、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸などの無機酸；酒石酸、ギ酸、クエン酸、酢酸、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、グルコン酸、安息香酸、乳酸、フマル酸、マレイン酸などの有機カルボン酸；又はメタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸などのスルホン酸である。
【0031】
本発明による別の実施形態において、前記化合物は、式（１）の化合物の薬学的に許容される塩であり、ここで、Ｒ1はイソブチルであり、塩は、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸などの無機酸；酒石酸、ギ酸、クエン酸、酢酸、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、グルコン酸、安息香酸、乳酸、フマル酸、マレイン酸などの有機カルボン酸；又はメタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸などのスルホン酸である。
【0032】
本発明による別の実施形態において、前記化合物は、式（１）の化合物の薬学的に許容される塩であり、ここで、Ｒ1はｓｅｃ－ブチルであり、塩は、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸などの無機酸；酒石酸、ギ酸、クエン酸、酢酸、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、グルコン酸、安息香酸、乳酸、フマル酸、マレイン酸などの有機カルボン酸；又はメタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸などのスルホン酸である。
【0033】
本発明による別の実施形態において、前記化合物は、式（１）の化合物の薬学的に許容される塩であり、ここで、Ｒ1はｔｅｒｔ－ブチルであり、塩は、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸などの無機酸；酒石酸、ギ酸、クエン酸、酢酸、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、グルコン酸、安息香酸、乳酸、フマル酸、マレイン酸などの有機カルボン酸；又はメタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸などのスルホン酸である。
【0034】
本発明による別の実施形態において、前記薬学的に許容される塩は塩酸塩である。
【0035】
本発明による別の実施形態では、前記式（１）の化合物は、下記式（５）のＮ－（（３Ｓ，５Ｓ）－１－（（３Ｓ，４Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブチル）－４－（４－クロロフェニル）ピロリジン－３－カルボニル）－５－（モルホリン－４－カルボニル）ピロリジン－３－イル）－Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）イソブチルアミド塩酸塩である：
【化6】
【0036】
本発明による別の実施形態では、前記式（１）の化合物は、下記式（６）のＮ－（（３Ｓ，５Ｓ）－１－（（３Ｓ，４Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブチル）－４－（４－クロロフェニル）ピロリジン－３－カルボニル）－５－モルホリン－４－カルボニル）ピロリジン－３－イル）－Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）プロピオンアミド塩酸塩である：
【化7】
【0037】
本発明による別の実施形態では、前記式（１）の化合物は、下記式（７）のＮ－（（３Ｓ，５Ｓ）－１－（（３Ｓ，４Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブチル）－４－（４－クロロフェニル）ピロリジン－３－カルボニル）－５－（モルホリン－４－カルボニル）ピロリジン－３－イル）－Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）ピバルアミド塩酸塩である：
【化8】
【0038】
本発明による別の実施形態では、前記式（５）のＮ－（（３Ｓ，５Ｓ）－１－（（３Ｓ，４Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブチル）－４－（４－クロロフェニル）ピロリジン－３－カルボニル）－５－（モルホリン－４－カルボニル）ピロリジン－３－イル）－Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）イソブチルアミド塩酸塩、前記式（６）のＮ－（（３Ｓ，５Ｓ）－１－（（３Ｓ，４Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブチル）－４－（４－クロロフェニル）ピロリジン－３－カルボニル）－５－（モルホリン－４－カルボニル）ピロリジン－３－イル）－Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）プロピオンアミド塩酸塩及び前記式（７）のＮ－（（３Ｓ，５Ｓ）－１－（（３Ｓ，４Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブチル）－４－（４－クロロフェニル）ピロリジン－３－カルボニル）－５－（モルホリン－４－カルボニル）ピロリジン－３－イル）－Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）ピバルアミド塩酸塩は、下記の反応スキーム１によって調製することができる。
（反応スキーム１）
（式中、Ｒ2は、Ｃ1－Ｃ5アルキルであり、Ｒ3は、非置換であるか、１又は２つのＣ1－Ｃ5アルキルで置換されたＣ3－Ｃ8シクロアルキルであり、Ｒ4及びＲ5は、それぞれ独立して、水素又はハロゲンである。）
（反応スキーム１）
【化9】
【0039】
本発明による式（１）の化合物は、メラノコルチン受容体、特にメラノコルチン－４受容体（ＭＣ４Ｒ）に対して優れたアゴニスト活性を示すので、本発明はまた、式（１）の化合物、又はその有効成分としての薬学的に許容される塩又は異性体を、薬学的に許容される担体と共に含むメラノコルチン受容体のアゴニスト医薬組成物を提供する。特に、本発明による組成物は、肥満、糖尿、炎症及び勃起不全症の予防又は治療において優れた効果を示すが、これらに限定されない。
【0040】
本明細書において、「担体」は、細胞又は組織への化合物の投入を容易にする化合物を意味する。
【0041】
本発明の化合物を臨床目的で投与されば場合、単回投与又は別々の投与として宿主に投与される総１日用量は、好ましくは体重１ｋｇ当たり０．０１～１０ｍｇの範囲であるが、個々の患者の特定の用量レベルは、使用される特定の化合物、患者の体重、性別、健康状態、食事、薬剤の投与時間、投与方法、排泄率、薬剤混合及び疾患の重症度などに応じて変わる可能性がある。
【0042】
本発明の化合物は、目的に応じて任意に経路で投与することができる。例えば、本発明の化合物は、注射又は経口投与によって投与することができる。
【0043】
注射用製剤は、公知技術に従って、適切な分散剤、湿潤剤又は懸濁剤を使用することによって調製することができる。
【0044】
経口投与用の固体剤形の例には、カプセル剤、錠剤、丸剤、ピル、粉末及び顆粒が含まれ、固体剤形は、本発明による式（１）の活性化合物を不活性希釈剤、潤滑剤、崩壊剤、結合剤などの１つ以上の担体と混合することによって調製することができる。
【発明の効果】
【0045】
本発明による式（１）の化合物は、メラノコルチン受容体、特にメラノコルチン－４受容体（ＭＣ４Ｒ）に対して優れたアゴニスト活性を示すので、肥満、糖尿、炎症及び勃起不全症の予防又は治療に有用に使用することができる。
【0046】
本発明による式（１）の化合物は、メラノコルチン－４受容体に対して標的効果を示し、体重減少及び食餌減少効果を示しながら、不安及び鬱病に影響を及ぼさなく、ｈＥＲＧ（human ether-a-go-go related gene）阻害や、突然変異誘発などの安全性の問題に副作用を与えることなく投与することができる。また、本発明による式（１）の化合物は、細胞毒性及び肝臓毒性がないため、安全に投与することができる。
【発明を実施するための形態】
【0047】
以下、本発明について、製造例及び実施例を通じてより詳細に説明する。しかし、これらの例は例示に過ぎず、本発明の範囲はそれに限定されない。
【0048】
製造例１：メチル（２Ｓ，４Ｓ）－４－（Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）イソブチルアミド）ピロリジン－２－カルボキシレート塩酸塩の調製
【化10】
【0049】
以下の工程Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥにより、表題化合物を得た。
【0050】
工程Ａ：１－（ｔｅｒｔ－ブチル）２－メチル（２Ｓ，４Ｓ）－４－アジドピロリジン－１，２－ジカルボキシレートの調製
窒素下で、１－（ｔｅｒｔ－ブチル）２－メチル（２Ｓ，４Ｒ）－４－（（メチルスルホニル）オキシ）ピロリジン－１，２－ジカルボキシレート（４８．５ｇ、１５０ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ’－ジメチルホルムアミド（２５０ｍＬ）に溶解し、アジ化ナトリウム（１９．５ｇ、３００ｍＬ）を加えた。８０℃で１６時間撹拌した後、反応溶媒を減圧濃縮し、水を加え、酢酸エチルで２回抽出をした。有機層を塩化ナトリウム水溶液及び水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過した。ろ液を減圧下で濃縮して、粗製物（３９．５９ｇ、９８％）を得た。これを精製することなく次の工程で使用した。
窒素下で、１－（ｔｅｒｔ－ブチル）２－メチル（２Ｓ，４Ｒ）－４－（（メチルスルホニル）オキシ）ピロリジン－１，２－ジカルボキシレート（４８．５ｇ、１５０ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ’－ジメチルホルムアミド（２５０ｍＬ）に溶解し、アジ化ナトリウム（１９．５ｇ、３００ｍＬ）を加えた。８０℃で１６時間撹拌した後、反応溶媒を減圧濃縮し、水を加え、酢酸エチルで２回抽出をした。有機層を塩化ナトリウム水溶液及び水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過した。ろ液を減圧下で濃縮して、粗製物（３９．５９ｇ、９８％）を得た。これを精製することなく次の工程で使用した。
【0051】
MS [M+H] = 271 (M+1)
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 4.43-4.37 (m, 1H), 4.35-4.27 (br, 1H), 3.77 (s, 1.8H), 3.76 (s, 1.2H), 3.73-3.66 (m, 1H), 3.44-3.38 (m, 1H), 2.63-2.49 (m, 1H), 2.19-2.11 (m, 1H), 1.50 (s, 4.5H), 1.44 (s, 4.5H)
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 4.43-4.37 (m, 1H), 4.35-4.27 (br, 1H), 3.77 (s, 1.8H), 3.76 (s, 1.2H), 3.73-3.66 (m, 1H), 3.44-3.38 (m, 1H), 2.63-2.49 (m, 1H), 2.19-2.11 (m, 1H), 1.50 (s, 4.5H), 1.44 (s, 4.5H)
【0052】
工程Ｂ：１－（ｔｅｒｔ－ブチル）２－メチル（２Ｓ，４Ｓ）－４－アミノピロリジン－１，２－ジカルボキシレートの調製
前記工程Ａで得られた１－（ｔｅｒｔ－ブチル）２－メチル（２Ｓ，４Ｓ）－４－アジドピロリジン－１，２－ジカルボキシレート（２４．５９ｇ、９１．０ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（１８０ｍＬ）に溶解し後、１Ｍトリメチルホスフィンテトラヒドロ溶液（１０９．２ｍＬ、１０９．２ｍｍｏｌ）を０℃でゆっくり加えた。同温度で１時間撹拌をした後、混合物を室温で３時間撹拌した。反応溶媒を減圧濃縮した後、ジクロロメタン（１００ｍＬ）と水（１５０ｍＬ）を加え、約３０分間撹拌した。層を分離し、ジクロロメタンで再度抽出した後、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過した。ろ液を減圧下で濃縮して、粗製物（２０．６２ｇ、９３％）を得た。これを精製することなく次の工程で使用した。
前記工程Ａで得られた１－（ｔｅｒｔ－ブチル）２－メチル（２Ｓ，４Ｓ）－４－アジドピロリジン－１，２－ジカルボキシレート（２４．５９ｇ、９１．０ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（１８０ｍＬ）に溶解し後、１Ｍトリメチルホスフィンテトラヒドロ溶液（１０９．２ｍＬ、１０９．２ｍｍｏｌ）を０℃でゆっくり加えた。同温度で１時間撹拌をした後、混合物を室温で３時間撹拌した。反応溶媒を減圧濃縮した後、ジクロロメタン（１００ｍＬ）と水（１５０ｍＬ）を加え、約３０分間撹拌した。層を分離し、ジクロロメタンで再度抽出した後、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過した。ろ液を減圧下で濃縮して、粗製物（２０．６２ｇ、９３％）を得た。これを精製することなく次の工程で使用した。
【0053】
MS [M+H] = 245 (M+1)
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 4.27 (m, 1H), 3.77 (s, 1.8H), 3.76 (s, 1.2H), 3.75-3.67 (m, 1H), 3.50-3.42 (m, 1H), 3.22-3.17 (m, 1H), 2.58-2.47 (m, 1H), 1.82-1.71 (m, 1H), 1.48 (s, 4.5H), 1.42 (s, 4.5H)
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 4.27 (m, 1H), 3.77 (s, 1.8H), 3.76 (s, 1.2H), 3.75-3.67 (m, 1H), 3.50-3.42 (m, 1H), 3.22-3.17 (m, 1H), 2.58-2.47 (m, 1H), 1.82-1.71 (m, 1H), 1.48 (s, 4.5H), 1.42 (s, 4.5H)
【0054】
工程Ｃ：１－（ｔｅｒｔ－ブチル）２－メチル（２Ｓ，４Ｓ）－４－（（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）アミノ）ピロリジン－１，２－ジカルボキシレートの調製
前記工程Ｂで得られた１－（ｔｅｒｔ－ブチル）２－メチル（２Ｓ，４Ｓ）－４－アミノピロリジン－１，２－ジカルボキシレート（２０．６２ｇ、８４．４ｍｍｏｌ）をジクロロエタン（１５０ｍＬ）に溶解し、４－メティルサイクルロヘクサノン（９．５ｍＬ、１０１．３ｍｍｏｌ）を加えた。トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（２６．８ｇ、１２６．６ｍｍｏｌ）を０℃で加え、室温で１６時間撹拌した。反応溶媒を減圧濃縮し、水を加え、酢酸エチルで２回抽出をした。有機層を塩化ナトリウム水溶液で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過した。ろ液を減圧下濃縮し、カラム・クロマトグラフィーで精製して、表題化合物（２２．９ｇ、８０％）を得た。
前記工程Ｂで得られた１－（ｔｅｒｔ－ブチル）２－メチル（２Ｓ，４Ｓ）－４－アミノピロリジン－１，２－ジカルボキシレート（２０．６２ｇ、８４．４ｍｍｏｌ）をジクロロエタン（１５０ｍＬ）に溶解し、４－メティルサイクルロヘクサノン（９．５ｍＬ、１０１．３ｍｍｏｌ）を加えた。トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（２６．８ｇ、１２６．６ｍｍｏｌ）を０℃で加え、室温で１６時間撹拌した。反応溶媒を減圧濃縮し、水を加え、酢酸エチルで２回抽出をした。有機層を塩化ナトリウム水溶液で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過した。ろ液を減圧下濃縮し、カラム・クロマトグラフィーで精製して、表題化合物（２２．９ｇ、８０％）を得た。
【0055】
MS [M+H] = 341 (M+1)
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 4.26 (m, 1H), 3.76 (s, 1.8H), 3.75 (s, 1.2H), 3.78-3.71 (m, 1H), 3.49-3.40 (m, 1H), 3.22-3.16 (m, 1H), 2.69-2.60 (br, 1H), 2.58-2.46 (m, 1H), 1.87-1.77 (m, 1H), 1.73-1.63 (m, 1H), 1.62-1.35 (m, 8H), 1.48 (s, 4.5H), 1.42 (s, 4.5H), 0.96 (d, 3H)
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 4.26 (m, 1H), 3.76 (s, 1.8H), 3.75 (s, 1.2H), 3.78-3.71 (m, 1H), 3.49-3.40 (m, 1H), 3.22-3.16 (m, 1H), 2.69-2.60 (br, 1H), 2.58-2.46 (m, 1H), 1.87-1.77 (m, 1H), 1.73-1.63 (m, 1H), 1.62-1.35 (m, 8H), 1.48 (s, 4.5H), 1.42 (s, 4.5H), 0.96 (d, 3H)
【0056】
工程Ｄ：１－（ｔｅｒｔ－ブチル）２－メチル（２Ｓ，４Ｓ）－４－（Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）イソブチルアミド）ピロリジン－１，２－ジカルボキシレートの調製
前記工程Ｃで得られた１－（ｔｅｒｔ－ブチル）２－メチル（２Ｓ，４Ｓ）－４－（（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）アミノ）ピロリジン－１，２－ジカルボキシレート（３７．２９ｇ、１０９．５ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５００ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（６１．１ｍＬ、４３８．１ｍｍｏｌ）を加え、塩化イソブチル（１１．７ｍＬ、２１９ｍｍｏｌ）を０℃でゆっくり加えた。室温で１６時間撹拌した後、反応溶媒を減圧濃縮し、炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、酢酸エチルで２回抽出をした。有機層を塩化ナトリウム水溶液と水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過した。ろ液を減圧下で濃縮し、カラム・クロマトグラフィーで精製して、表題化合物（３８．７９ｇ、８６％）を得た。
前記工程Ｃで得られた１－（ｔｅｒｔ－ブチル）２－メチル（２Ｓ，４Ｓ）－４－（（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）アミノ）ピロリジン－１，２－ジカルボキシレート（３７．２９ｇ、１０９．５ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５００ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（６１．１ｍＬ、４３８．１ｍｍｏｌ）を加え、塩化イソブチル（１１．７ｍＬ、２１９ｍｍｏｌ）を０℃でゆっくり加えた。室温で１６時間撹拌した後、反応溶媒を減圧濃縮し、炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、酢酸エチルで２回抽出をした。有機層を塩化ナトリウム水溶液と水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過した。ろ液を減圧下で濃縮し、カラム・クロマトグラフィーで精製して、表題化合物（３８．７９ｇ、８６％）を得た。
【0057】
MS [M+H] = 411 (M+1)
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 4.27 (m, 1H), 3.76 (s, 1.8H), 3.75 (s, 1.2H), 3.78-3.72 (m, 1H), 3.50-3.41 (m, 1H), 3.33-3.14 (m, 1H), 2.69-2.60 (m, 2H), 2.57-2.43 (m, 1H), 1.87-1.79 (m, 1H), 1.70-1.61 (m, 1H), 1.60-1.32 (m, 8H), 1.47 (s, 4.5H), 1.41 (s, 4.5H), 1.10 (dd, 6H), 0.99 (d, 3H)
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 4.27 (m, 1H), 3.76 (s, 1.8H), 3.75 (s, 1.2H), 3.78-3.72 (m, 1H), 3.50-3.41 (m, 1H), 3.33-3.14 (m, 1H), 2.69-2.60 (m, 2H), 2.57-2.43 (m, 1H), 1.87-1.79 (m, 1H), 1.70-1.61 (m, 1H), 1.60-1.32 (m, 8H), 1.47 (s, 4.5H), 1.41 (s, 4.5H), 1.10 (dd, 6H), 0.99 (d, 3H)
【0058】
工程Ｅ：メチル（２Ｓ，４Ｓ）－４－（Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）イソブチルアミド）ピロリジン－２－カルボキシレート塩酸塩の調製
前記工程Ｄで得られた１－（ｔｅｒｔ－ブチル）２－メチル（２Ｓ，４Ｓ）－４－（Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）イソブチルアミド）ピロリジン－１，２－ジカルボキシレート（３４．０ｇ、８２．８ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（２００ｍＬ）に溶解し、４Ｎ塩酸１，４－ジオキサン溶液（８２．８ｍＬ、３３１．３ｍｍｏｌ）を０℃で加えた。室温で６時間撹拌し後、反応溶媒を減圧下で濃縮して、粗製物（２８．７ｇ、９９％）を得た。これを精製することなく次の工程で使用した。
前記工程Ｄで得られた１－（ｔｅｒｔ－ブチル）２－メチル（２Ｓ，４Ｓ）－４－（Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）イソブチルアミド）ピロリジン－１，２－ジカルボキシレート（３４．０ｇ、８２．８ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（２００ｍＬ）に溶解し、４Ｎ塩酸１，４－ジオキサン溶液（８２．８ｍＬ、３３１．３ｍｍｏｌ）を０℃で加えた。室温で６時間撹拌し後、反応溶媒を減圧下で濃縮して、粗製物（２８．７ｇ、９９％）を得た。これを精製することなく次の工程で使用した。
【0059】
MS[M+H] = 311 (M+1)
【0060】
製造例２：（３Ｓ，４Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブチル）－４－（４－クロロフェニル）ピロリジン－３－カルボン酸の調製
国際公開番号ＷＯ２００４／０９２１２６号に記載されている方法で表題化合物を得た。
【化11】
【0061】
MS[M+H] = 282 (M+1)
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 7.43-7.33 (m, 4H), 3.90-3.69 (m, 3H), 3.59 (dd, J = 11.2, 10.0 Hz, 1H), 3.29 (dd, J = 11.2, 11.2 Hz, 1H), 3.18-3.09 (m, 1H), 1.44 (s, 9H)
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 7.43-7.33 (m, 4H), 3.90-3.69 (m, 3H), 3.59 (dd, J = 11.2, 10.0 Hz, 1H), 3.29 (dd, J = 11.2, 11.2 Hz, 1H), 3.18-3.09 (m, 1H), 1.44 (s, 9H)
【0062】
製造例３：メチル（２Ｓ，４Ｓ）－４－（Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）プロピオンアミド）ピロリジン－２－カルボキシレート塩酸塩の調製
以下の工程Ａ及びＢにより表題化合物を得た。
【化12】
【0063】
工程Ａ：１－（ｔｅｒｔ－ブチル）２－メチル（２Ｓ，４Ｓ）－４－（Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）プロピオンアミド）ピロリジン－１，２－ジカルボキシレートの調製
製造例１の工程Ｃで得られた１－（ｔｅｒｔ－ブチル）２－メチル（２Ｓ，４Ｓ）－４－（（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）アミノ）ピロリジン－１，２－ジカルボキシレート（１．０ｇ、２．９ｍｍｏｌ）と塩化プロピオニル（０．３３ｇ、３．５ｍｍｏｌ）を用いて、製造例１の工程Ｄと同様の方法で表題化合物（０．９８ｇ、８４％）を得た。
【化13】
【0064】
MS [M+Na] = 419.5 (M+23)
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 4.33 (m, 1H), 4.00-3.80 (m, 2H), 3.75 (m, 3H), 3.58 (m, 1H), 3.47 (m, 1H), 2.85-2.68 (m, 1H), 2.38 (q, 2H), 2.31 (m, 1H), 1.93 (m, 1H), 1.80 (m, 2H), 1.72-1.55 (m, 4H), 1.45 (m, 2H), 1.45-1.41 (m, 9H), 1.07 (m, 6H)
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 4.33 (m, 1H), 4.00-3.80 (m, 2H), 3.75 (m, 3H), 3.58 (m, 1H), 3.47 (m, 1H), 2.85-2.68 (m, 1H), 2.38 (q, 2H), 2.31 (m, 1H), 1.93 (m, 1H), 1.80 (m, 2H), 1.72-1.55 (m, 4H), 1.45 (m, 2H), 1.45-1.41 (m, 9H), 1.07 (m, 6H)
【0065】
工程Ｂ：メチル（２Ｓ，４Ｓ）－４－（Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）プロピオンアミド）ピロリジン－２－カルボキシレート塩酸塩の調製
前記工程Ａで得られた１－（ｔｅｒｔ－ブチル）２－メチル（２Ｓ，４Ｓ）－４－（Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）プロピオンアミド）ピロリジン－１，２－ジカルボキシレート（０．９８ｇ、２．４ｍｍｏｌ）を用いて、製造例１の工程Ｅと同様の方法で表題化合物（０．７６ｇ、９３％）を得た。
【化14】
【0066】
MS [M+H] = 297.4 (M+1)
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.95 (brs, 1H), 8.63 (brs, 1H), 4.38 (m, 1H), 4.21 (m, 1H), 3.77 (s, 3H), 3.53 (m, 1H), 3.40 (m, 2H), 2.53 (m, 1H), 2.37 (q, 2H), 2.24 (m, 1H), 1.88 (m, 1H), 1.68-1.55 (m, 4H), 1.52 (m, 2H), 1.40 (m, 2H), 0.97 (m, 6H)
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.95 (brs, 1H), 8.63 (brs, 1H), 4.38 (m, 1H), 4.21 (m, 1H), 3.77 (s, 3H), 3.53 (m, 1H), 3.40 (m, 2H), 2.53 (m, 1H), 2.37 (q, 2H), 2.24 (m, 1H), 1.88 (m, 1H), 1.68-1.55 (m, 4H), 1.52 (m, 2H), 1.40 (m, 2H), 0.97 (m, 6H)
【0067】
製造例４：メチル（２Ｓ，４Ｓ）－４－（Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）ピバルアミド）ピロリジン－２－カルボキシレート塩酸塩の調製
以下の工程Ａ及びＢにより表題化合物を得た。
【化15】
【0068】
工程Ａ：１－（ｔｅｒｔ－ブチル）２－メチル（２Ｓ，４Ｓ）－４－（Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）ピバルアミド）ピロリジン－１，２－ジカルボキシレートの調製
国際公開番号ＷＯ２００８／００７９３０号に記載された方法で表題化合物を得た。
【化16】
【0069】
MS [M+Na] = 447.5 (M+23)
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 4.34 (m, 1H), 3.90-3.75 (m, 2H), 3.73 (m, 3H), 3.45 (m, 2H), 2.75-2.60 (m, 1H), 2.30 (m, 1H), 1.95 (m, 1H), 1.85 (m, 2H), 1.66 (m, 4H), 1.50 (m, 2H), 1.45-1.41 (m, 9H), 1.25-1.20 (m, 9H), 1.05 (d, 3H)
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 4.34 (m, 1H), 3.90-3.75 (m, 2H), 3.73 (m, 3H), 3.45 (m, 2H), 2.75-2.60 (m, 1H), 2.30 (m, 1H), 1.95 (m, 1H), 1.85 (m, 2H), 1.66 (m, 4H), 1.50 (m, 2H), 1.45-1.41 (m, 9H), 1.25-1.20 (m, 9H), 1.05 (d, 3H)
【0070】
工程Ｂ：メチル（２Ｓ，４Ｓ）－４－（Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）ピバルアミド）ピロリジン－２－カルボキシレート塩酸塩の調製
前記工程Ａで得られた１－（ｔｅｒｔ－ブチル）２－メチル（２Ｓ，４Ｓ）－４－（Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）ピバルアミド）ピロリジン－１，２－ジカルボキシレート（０．８０ｇ、１．８８ｍｍｏｌ）を用いて、製造例１の工程Ｅと同様の方法で表題化合物（０．６８ｇ、９９％）を得た。
【化17】
【0071】
MS [M+H] = 325.4 (M+1)
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.24 (brs, 1H), 8.60 (brs, 1H), 4.41 (m, 1H), 4.22 (m, 1H), 3.77 (m, 3H), 3.40-3.28 (m, 3H), 2.55 (m, 1H), 2.20 (m, 1H), 1.87 (m, 1H), 1.70-1.50 (m, 6H), 1.40 (m, 2H), 1.21-1.10 (m, 9H), 1.00 (m, 3H)
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.24 (brs, 1H), 8.60 (brs, 1H), 4.41 (m, 1H), 4.22 (m, 1H), 3.77 (m, 3H), 3.40-3.28 (m, 3H), 2.55 (m, 1H), 2.20 (m, 1H), 1.87 (m, 1H), 1.70-1.50 (m, 6H), 1.40 (m, 2H), 1.21-1.10 (m, 9H), 1.00 (m, 3H)
【0072】
実施例１：Ｎ－（（３Ｓ，５Ｓ）－１－（（３Ｓ，４Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブチル）－４－（４－クロロフェニル）ピロリジン－３－カルボニル）－５－（モルホリン－４－カルボニル）ピロリジン－３－イル）－Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）イソブチルアミド塩酸塩の調製
以下の工程Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤにより表題化合物を得た。
【化18】
【0073】
工程Ａ：メチル（２Ｓ，４Ｓ）－１－（（３Ｓ，４Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブチル）－４－（４－クロロフェニル）ピロリジン－３－カルボニル）－４－（Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）イソブチルアミド）ピロリジン－２－カルボキシレートの調製
製造例１で得られたメチル（２Ｓ，４Ｓ）－４－（Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）イソブチルアミド）ピロリジン－２－カルボキシレート塩酸塩（２８．７ｇ、８２．７３ｍｍｏｌ）、製造例２で得られた（３Ｓ，４Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブチル）－４－（４－クロロフェニル）ピロリジン－３－カルボン酸（２４．５ｇ、８６．８７ｍｍｏｌ）、１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（２２．２ｇ、１１５．８３ｍｍｏｌ）及び１－ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（１５．７ｇ、１１５．８３ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ’－ジメチルホルムアミド（４００ｍＬ）に溶解し、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルエチルアミン（７２．０ｍＬ、４１３．６６ｍｍｏｌ）をゆっくり加えた。室温で１６時間撹拌し、反応溶媒を減圧濃縮した後、０．５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を加え、酢酸エチルで２回抽出をした。有機層を塩化ナトリウム水溶液と水で２回洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過した。ろ液を減圧下濃縮してカラム・クロマトグラフィーで精製して、表題化合物（４１．１９ｇ、８７％）を得た。
製造例１で得られたメチル（２Ｓ，４Ｓ）－４－（Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）イソブチルアミド）ピロリジン－２－カルボキシレート塩酸塩（２８．７ｇ、８２．７３ｍｍｏｌ）、製造例２で得られた（３Ｓ，４Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブチル）－４－（４－クロロフェニル）ピロリジン－３－カルボン酸（２４．５ｇ、８６．８７ｍｍｏｌ）、１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（２２．２ｇ、１１５．８３ｍｍｏｌ）及び１－ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（１５．７ｇ、１１５．８３ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ’－ジメチルホルムアミド（４００ｍＬ）に溶解し、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルエチルアミン（７２．０ｍＬ、４１３．６６ｍｍｏｌ）をゆっくり加えた。室温で１６時間撹拌し、反応溶媒を減圧濃縮した後、０．５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を加え、酢酸エチルで２回抽出をした。有機層を塩化ナトリウム水溶液と水で２回洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過した。ろ液を減圧下濃縮してカラム・クロマトグラフィーで精製して、表題化合物（４１．１９ｇ、８７％）を得た。
【0074】
MS [M+H] = 575 (M+1)
【0075】
工程Ｂ：（２Ｓ，４Ｓ）－１－（（３Ｓ，４Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブチル）－４－（４－クロロフェニル）ピロリジン－３－カルボニル）－４－（Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）イソブチルアミド）ピロリジン－２－カルボン酸の調製
前記工程Ａで得られたメチル（２Ｓ，４Ｓ）－１－（（３Ｓ，４Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブチル）－４－（４－クロロフェニル）ピロリジン－３－カルボニル）－４－（Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）イソブチルアミド）ピロリジン－２－カルボキシレート（３９．４ｇ、６８．６２ｍｍｏｌ）をメタノール（４５０ｍＬ）に溶解し、６Ｎの水酸化ナトリウム水溶液（５７．２ｍＬ、３４３．０９ｍｍｏｌ）を加えた。室温で１６時間撹拌し、６Ｎの塩酸水溶液でｐＨを約５に調整した後、反応溶液を減圧濃縮し。濃縮液をジクロロメタンで溶解し、次に不溶性固体をろ紙でろ過した。ろ液を減圧下で濃縮して、粗製物（３８．４ｇ、９９％）を得た。これを精製することなく次の工程で使用した。
前記工程Ａで得られたメチル（２Ｓ，４Ｓ）－１－（（３Ｓ，４Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブチル）－４－（４－クロロフェニル）ピロリジン－３－カルボニル）－４－（Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）イソブチルアミド）ピロリジン－２－カルボキシレート（３９．４ｇ、６８．６２ｍｍｏｌ）をメタノール（４５０ｍＬ）に溶解し、６Ｎの水酸化ナトリウム水溶液（５７．２ｍＬ、３４３．０９ｍｍｏｌ）を加えた。室温で１６時間撹拌し、６Ｎの塩酸水溶液でｐＨを約５に調整した後、反応溶液を減圧濃縮し。濃縮液をジクロロメタンで溶解し、次に不溶性固体をろ紙でろ過した。ろ液を減圧下で濃縮して、粗製物（３８．４ｇ、９９％）を得た。これを精製することなく次の工程で使用した。
【0076】
MS [M+H] = 561 (M+1)
【0077】
工程Ｃ：Ｎ－（（３Ｓ，５Ｓ）－１－（（３Ｓ，４Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブチル）－４－（４－クロロフェニル）ピロリジン－３－カルボニル）－５－（モルホリン－４－カルボニル）ピロリジン－３－イル）－Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）イソブチルアミドの調製
前記工程Ｂで得られた（２Ｓ，４Ｓ）－１－（（３Ｓ，４Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブチル）－４－（４－クロロフェニル）ピロリジン－３－カルボニル）－４－（Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）イソブチルアミド）ピロリジン－２－カルボン酸（３８．４ｇ、６８．６０ｍｍｏｌ）、１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（１８．４ｇ、９６．０４ｍｍｏｌ）及び１－ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（１３．０ｇ、９６．０４ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ’－ジメチルホルムアミド（２００ｍＬ）に溶解し、モルホリン（５．９ｍＬ、６８．８０ｍｍｏｌ）とＮ，Ｎ’－ジイソプロピルエチルアミン（５９．７ｍＬ、３４３．０２ｍｍｏｌ）をゆっくり連続して加えた。室温で１６時間撹拌し、反応溶液を減圧濃縮した後、０．５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を加え、酢酸エチルで２回抽出をした。有機層を塩化ナトリウム水溶液と水で２回洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過した。ろ液を減圧下で濃縮し、カラム・クロマトグラフィーで精製して、表題化合物（３７．０５ｇ、８６％）を得た。
前記工程Ｂで得られた（２Ｓ，４Ｓ）－１－（（３Ｓ，４Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブチル）－４－（４－クロロフェニル）ピロリジン－３－カルボニル）－４－（Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）イソブチルアミド）ピロリジン－２－カルボン酸（３８．４ｇ、６８．６０ｍｍｏｌ）、１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（１８．４ｇ、９６．０４ｍｍｏｌ）及び１－ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（１３．０ｇ、９６．０４ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ’－ジメチルホルムアミド（２００ｍＬ）に溶解し、モルホリン（５．９ｍＬ、６８．８０ｍｍｏｌ）とＮ，Ｎ’－ジイソプロピルエチルアミン（５９．７ｍＬ、３４３．０２ｍｍｏｌ）をゆっくり連続して加えた。室温で１６時間撹拌し、反応溶液を減圧濃縮した後、０．５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を加え、酢酸エチルで２回抽出をした。有機層を塩化ナトリウム水溶液と水で２回洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過した。ろ液を減圧下で濃縮し、カラム・クロマトグラフィーで精製して、表題化合物（３７．０５ｇ、８６％）を得た。
【0078】
MS [M+H] = 630 (M+1)
【0079】
工程Ｄ：Ｎ－（（３Ｓ，５Ｓ）－１－（（３Ｓ，４Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブチル）－４－（４－クロロフェニル）ピロリジン－３－カルボニル）－５－（モルホリン－４－カルボニル）ピロリジン－３－イル）－Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）イソブチルアミド塩酸塩の調製
前記工程Ｃで得られたＮ－（（３Ｓ，５Ｓ）－１－（（３Ｓ，４Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブチル）－４－（４－クロロフェニル）ピロリジン－３－カルボニル）－５－（モルホリン－４－カルボニル）ピロリジン－３－イル）－Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）イソブチルアミド（５．０ｇ、７．９５ｍｍｏｌ）を酢酸エチル（５０ｍＬ）に溶解し、２Ｎの塩酸酢酸エチル溶液（３．９７ｍＬ、１５．８９ｍｍｏｌ）をゆっくり加えた。室温で３０分間撹拌し、反応溶媒を減圧濃縮した。生成された粗固体をヘキサンとジエチルエーテルをも用いた粉砕により精製して、表題化合物（５．２３ｇ、９９％）を得た。
前記工程Ｃで得られたＮ－（（３Ｓ，５Ｓ）－１－（（３Ｓ，４Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブチル）－４－（４－クロロフェニル）ピロリジン－３－カルボニル）－５－（モルホリン－４－カルボニル）ピロリジン－３－イル）－Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）イソブチルアミド（５．０ｇ、７．９５ｍｍｏｌ）を酢酸エチル（５０ｍＬ）に溶解し、２Ｎの塩酸酢酸エチル溶液（３．９７ｍＬ、１５．８９ｍｍｏｌ）をゆっくり加えた。室温で３０分間撹拌し、反応溶媒を減圧濃縮した。生成された粗固体をヘキサンとジエチルエーテルをも用いた粉砕により精製して、表題化合物（５．２３ｇ、９９％）を得た。
【0080】
MS [M+H] = 630 (M+1)
1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ 7.49-7.44 (m, 4H), 4.83 (m, 1H), 4.23-4.20 (m, 1H), 3.95-3.91 (m, 2H), 3.79-3.47 (m, 14H), 3.03-3.00 (m, 1H), 2.86-2.82 (m, 1H), 2.73-2.67 (m, 1H), 2.20-2.14 (m, 1H), 1.97 (m, 1H), 1.80-1.62 (m, 5H), 1.50 (s, 9H), 1.44-1.27 (m, 3H), 1.06-1.04 (m, 9H)
1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ 7.49-7.44 (m, 4H), 4.83 (m, 1H), 4.23-4.20 (m, 1H), 3.95-3.91 (m, 2H), 3.79-3.47 (m, 14H), 3.03-3.00 (m, 1H), 2.86-2.82 (m, 1H), 2.73-2.67 (m, 1H), 2.20-2.14 (m, 1H), 1.97 (m, 1H), 1.80-1.62 (m, 5H), 1.50 (s, 9H), 1.44-1.27 (m, 3H), 1.06-1.04 (m, 9H)
【0081】
実施例２：Ｎ－（（３Ｓ，５Ｓ）－１－（（３Ｓ，４Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブチル）－４－（４－クロロフェニル）ピロリジン－３－カルボニル）－５－（モルホリン－４－カルボニル）ピロリジン－３－イル）－Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）プロピオンアミド塩酸塩の調製
以下の工程Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤにより表題化合物を得た。
【化19】
【0082】
工程Ａ：メチル（２Ｓ，４Ｓ）－１－（（３Ｓ，４Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブチル）－４－（４－クロロフェニル）ピロリジン－３－カルボニル）－４－（Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）プロピオンアミド）ピロリジン－２－カルボキシレートの調製
製造例３で得られたメチル（２Ｓ，４Ｓ）－４－（Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）プロピオンアミド）ピロリジン－２－カルボキシレート塩酸塩（０．７６ｇ、２．２８ｍｍｏｌ）と製造例２で得られた（３Ｓ，４Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブチル）－４－（４－クロロフェニル）ピロリジン－３－カルボン酸（０．６４ｇ、２．２８ｍｍｏｌ）を用いて、実施例１の工程Ａと同様の方法で表題化合物（０．４５ｇ、３５％）を得た。
【化20】
【0083】
MS [M+H] = 560.4 (M+1)
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 7.39-7.30 (m, 4H), 4.45 (m, 1H), 4.04 (m, 1H), 3.71 (s, 3H), 3.65-3.35 (m, 6H), 3.13 (m, 2H), 2.99 (m, 1H), 2.71 (m, 1H), 2.34 (q, 2H), 2.20 (m, 1H), 1.92 (m, 1H), 1.75-1.55 (m, 6H), 1.42 (m, 2H), 1.22 (m, 9H), 1.03 (m, 6H)
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 7.39-7.30 (m, 4H), 4.45 (m, 1H), 4.04 (m, 1H), 3.71 (s, 3H), 3.65-3.35 (m, 6H), 3.13 (m, 2H), 2.99 (m, 1H), 2.71 (m, 1H), 2.34 (q, 2H), 2.20 (m, 1H), 1.92 (m, 1H), 1.75-1.55 (m, 6H), 1.42 (m, 2H), 1.22 (m, 9H), 1.03 (m, 6H)
【0084】
工程Ｂ：（２Ｓ，４Ｓ）－１－（（３Ｓ，４Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブチル）－４－（４－クロロフェニル）ピロリジン－３－カルボニル）－４－（Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）プロピオンアミド）ピロリジン－２－カルボン酸の調製
前記工程Ａで得られたメチル（２Ｓ，４Ｓ）－１－（（３Ｓ，４Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブチル）－４－（４－クロロフェニル）ピロリジン－３－カルボニル）－４－（Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）プロピオンアミド）ピロリジン－２－カルボキシレート（０．４５ｇ、０．８０ｍｍｏｌ）を用いて、実施例１の工程Ｂと同様の方法で表題化合物（０．４４ｇ、９９％）を得た。
【化21】
【0085】
MS [M+H] = 546.4 (M+1)
【0086】
工程Ｃ：Ｎ－（（３Ｓ，５Ｓ）－１－（（３Ｓ，４Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブチル）－４－（４－クロロフェニル）ピロリジン－３－カルボニル）－５－（モルホリン－４－カルボニル）ピロリジン－３－イル）－Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）プロピオンアミドの調製
前記工程Ｂで得られた（２Ｓ，４Ｓ）－１－（（３Ｓ，４Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブチル）－４－（４－クロロフェニル）ピロリジン－３－カルボニル）－４－（Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）プロピオンアミド）ピロリジン－２－カルボン酸（０．４４ｇ、０．８０ｍｍｏｌ）を用いて、実施例１の工程Ｃと同様の方法で表題化合物（０．２８ｇ、５３％）を得た。
【化22】
【0087】
MS [M+H] = 615.5 (M+1)
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 7.36 (m, 4H), 4.79 (m, 1H), 4.18 (m, 1H), 3.80-3.40 (m, 15H), 3.20 (m, 1H), 3.03 (m, 1H), 2.70 (m, 1H), 2.33 (q, 2H), 2.15 (m, 1H), 1.93 (m, 1H), 1.71-1.56 (m, 6H), 1.40-1.20 (m, 11H), 1.00 (m, 6H)
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 7.36 (m, 4H), 4.79 (m, 1H), 4.18 (m, 1H), 3.80-3.40 (m, 15H), 3.20 (m, 1H), 3.03 (m, 1H), 2.70 (m, 1H), 2.33 (q, 2H), 2.15 (m, 1H), 1.93 (m, 1H), 1.71-1.56 (m, 6H), 1.40-1.20 (m, 11H), 1.00 (m, 6H)
【0088】
工程Ｄ：Ｎ－（（３Ｓ，５Ｓ）－１－（（３Ｓ，４Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブチル）－４－（４－クロロフェニル）ピロリジン－３－カルボニル）－５－（モルホリン－４－カルボニル）ピロリジン－３－イル）－Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）プロピオンアミド塩酸塩の調製
前記工程Ｃで得られたＮ－（（３Ｓ，５Ｓ）－１－（（３Ｓ，４Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブチル）－４－（４－クロロフェニル）ピロリジン－３－カルボニル）－５－（モルホリン－４－カルボニル）ピロリジン－３－イル）－Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）プロピオンアミド（０．０８ｇ、０．１３ｍｍｏｌ）を用いて、実施例１の工程Ｄと同様の方法で表題化合物（０．０８ｇ、９４％）を得た。
【化23】
【0089】
MS [M+H] = 615.5 (M+1)
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 7.43 (m, 4H), 4.82 (t, 1H), 4.20 (m, 1H), 4.06-3.40 (m, 15H), 2.97 (m, 1H), 2.69 (m, 1H), 2.33 (m, 2H), 2.15 (m, 1H), 1.93 (m, 1H), 1.80-1.53 (m, 5H), 1.47 (s, 9H), 1.50-1.25 (m, 4H), 1.01 (m, 6H)
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 7.43 (m, 4H), 4.82 (t, 1H), 4.20 (m, 1H), 4.06-3.40 (m, 15H), 2.97 (m, 1H), 2.69 (m, 1H), 2.33 (m, 2H), 2.15 (m, 1H), 1.93 (m, 1H), 1.80-1.53 (m, 5H), 1.47 (s, 9H), 1.50-1.25 (m, 4H), 1.01 (m, 6H)
【0090】
実施例３：Ｎ－（（３Ｓ，５Ｓ）－１－（（３Ｓ，４Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブチル）－４－（４－クロロフェニル）ピロリジン－３－カルボニル）－５－（モルホリン－４－カルボニル）ピロリジン－３－イル）－Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）ピバルアミド塩酸塩の調製
以下の工程Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤにより表題化合物を得た。
【化24】
【0091】
工程Ａ：メチル（２Ｓ，４Ｓ）－１－（（３Ｓ，４Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブチル）－４－（４－クロロフェニル）ピロリジン－３－カルボニル）－４－（Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）ピバルアミド）ピロリジン－２－カルボキシレートの調製
製造例４で得られたメチル（２Ｓ，４Ｓ）－４－（Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）ピバルアミド）ピロリジン－２－カルボキシレート塩酸塩（０．６５ｇ、１．８ｍｍｏｌ）と製造例２で得られた（３Ｓ，４Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブチル）－４－（４－クロロフェニル）ピロリジン－３－カルボン酸（０．５０ｇ、１．８ｍｍｏｌ）を用いて、実施例１の工程Ａと同様の方法で表題化合物（０．７０ｇ、６６％）を得た。
【化25】
【0092】
MS [M+H] = 588.5 (M+1)
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 7.40-7.30 (m, 4H), 4.49 (m, 1H), 4.00-3.50 (m, 4H), 3.71 (s, 3H), 3.40 (m, 3H), 3.20-3.05 (m, 2H), 3.00 (m, 1H), 2.70 (m, 1H), 2.27 (m, 1H), 1.90 (m, 1H), 1.73-1.60 (m, 6H), 1.60-1.35 (m, 2H), 1.25-1.17 (m, 18H), 1.01 (m, 3H)
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 7.40-7.30 (m, 4H), 4.49 (m, 1H), 4.00-3.50 (m, 4H), 3.71 (s, 3H), 3.40 (m, 3H), 3.20-3.05 (m, 2H), 3.00 (m, 1H), 2.70 (m, 1H), 2.27 (m, 1H), 1.90 (m, 1H), 1.73-1.60 (m, 6H), 1.60-1.35 (m, 2H), 1.25-1.17 (m, 18H), 1.01 (m, 3H)
【0093】
工程Ｂ：（２Ｓ，４Ｓ）－１－（（３Ｓ，４Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブチル）－４－（４－クロロフェニル）ピロリジン－３－カルボニル）－４－（Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）ピバルアミド）ピロリジン－２－カルボン酸の調製
前記工程Ａで得られたメチル（２Ｓ，４Ｓ）－１－（（３Ｓ，４Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブチル）－４－（４－クロロフェニル）ピロリジン－３－カルボニル）－４－（Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）ピバルアミド）ピロリジン－２－カルボキシレート（０．１０ｇ、０．１８ｍｍｏｌ）を用いて、実施例１の工程Ｂと同様の方法で表題化合物（０．１０ｇ、９９％）を得た。
【化26】
【0094】
MS [M+H] = 574.4 (M+1)
【0095】
工程Ｃ：Ｎ－（（３Ｓ，５Ｓ）－１－（（３Ｓ，４Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブチル）－４－（４－クロロフェニル）ピロリジン－３－カルボニル）－５－（モルホリン－４－カルボニル）ピロリジン－３－イル）－Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）ピバルアミドの調製
前記工程Ｂで得られた（２Ｓ，４Ｓ）－１－（（３Ｓ，４Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブチル）－４－（４－クロロフェニル）ピロリジン－３－カルボニル）－４－（Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）ピバルアミド）ピロリジン－２－カルボン酸（０．１０ｇ、０．１８ｍｍｏｌ）を用いて、実施例１の工程Ｃと同様の方法で表題化合物（０．０２０ｇ、１７％）を得た。
【化27】
【0096】
MS [M+H] = 643.5 (M+1)
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 7.40-7.30 (m, 4H), 4.79 (m, 1H), 4.17 (m, 1H), 3.80-3.40 (m, 15H), 3.10 (m, 1H), 2.96 (m, 1H), 2.71 (m, 1H), 2.15 (m, 1H), 1.90 (m, 1H), 1.80-1.35 (m, 8H), 1.21-1.15 (m, 18H), 1.02 (m, 3H)
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 7.40-7.30 (m, 4H), 4.79 (m, 1H), 4.17 (m, 1H), 3.80-3.40 (m, 15H), 3.10 (m, 1H), 2.96 (m, 1H), 2.71 (m, 1H), 2.15 (m, 1H), 1.90 (m, 1H), 1.80-1.35 (m, 8H), 1.21-1.15 (m, 18H), 1.02 (m, 3H)
【0097】
工程Ｄ：Ｎ－（（３Ｓ，５Ｓ）－１－（（３Ｓ，４Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブチル）－４－（４－クロロフェニル）ピロリジン－３－カルボニル）－５－（モルホリン－４－カルボニル）ピロリジン－３－イル）－Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）ピバルアミド塩酸塩の調製
前記工程Ｃで得られたＮ－（（３Ｓ，５Ｓ）－１－（（３Ｓ，４Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブチル）－４－（４－クロロフェニル）ピロリジン－３－カルボニル）－５－（モルホリン－４－カルボニル）ピロリジン－３－イル）－Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）ピバルアミド（０．３３ｇ、０．５１ｍｍｏｌ）を用いて、実施例１の工程Ｄと同様の方法で表題化合物（０．２９ｇ、８３％）を得た。
【化28】
【0098】
MS [M+H] = 643.5 (M+1)
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 7.41 (m, 4H), 4.80 (m, 1H), 4.13 (m, 1H), 3.90 (m, 2H), 3.80-3.40 (m, 13H), 2.94 (m, 1H), 2.63 (m, 1H), 2.11 (m, 1H), 1.93 (m, 1H), 1.75 (m, 2H), 1.60 (m, 4H), 1.46 (s, 9H), 1.15 (s, 9H), 1.45-1.30 (m, 3H), 1.01 (m, 3H)
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 7.41 (m, 4H), 4.80 (m, 1H), 4.13 (m, 1H), 3.90 (m, 2H), 3.80-3.40 (m, 13H), 2.94 (m, 1H), 2.63 (m, 1H), 2.11 (m, 1H), 1.93 (m, 1H), 1.75 (m, 2H), 1.60 (m, 4H), 1.46 (s, 9H), 1.15 (s, 9H), 1.45-1.30 (m, 3H), 1.01 (m, 3H)
【0099】
比較例１：Ｎ－（（３Ｓ，５Ｓ）－１－（（３Ｓ，４Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブチル）－４－（２,４－ジフルオロフェニル）ピロリジン－３－カルボニル）－５－（モルホリン－４－カルボニル）ピロリジン－３－イル）－Ｎ－（４，４－ジメチルシクロヘキシル）アセトアミド塩酸塩（Ａ９５）の調製
国際公開番号ＷＯ２００８／００７９３０号のＡ９５化合物は、そこに記載されているのと同じ方法によって得られた。
【化29】
【0100】
比較例２：Ｎ－（（３Ｓ，５Ｓ）－１－（（３Ｓ，４Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブチル）－４－（４－クロロフェニル）ピロリジン－３－カルボニル）－５－（モルホリン－４－カルボニル）ピロリジン－３－イル）－Ｎ－（４，４－ジメチルシクロヘキシル）アセトアミド塩酸塩（Ａ９６）の調製
国際公開番号ＷＯ２００８／００７９３０号のＡ９６化合物は、そこに記載されているのと同じ方法によって得られた。
【化30】
【0101】
実験例１：ルシフェラーゼアッセイ
ＭＣ４Ｒ（メラノコルチン－４受容体）に対するアゴニスト能力を測定するために、ＭＣ４ＲとＣＲＥ（ｃＡＭＰ応答エレメント）の制御下で、ルシフェラーゼ遺伝子（ＣＲＥ－ＬＵＣ）を恒久的に発現する細胞株を樹立した。ＭＣ４Ｒ遺伝子を含む哺乳動物細胞発現ベクター（ｐＣＤＮＡ３（Ｎｅｏ））（Invitrogen社）を調製した後、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞株は、ＣＲＥ（ｃＡＭＰ応答エレメント）の制御下で、ルシフェラーゼ遺伝子（ＣＲＥ－ＬＵＣ）を発現するベクター（ｐＣＲＥ－Ｌｕｃ）（Stratagen社製）と一緒にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Invitrogen社）を使用して形質転換させた。形質転換細胞株（ＨＥＫ ＭＣ４Ｒ－Ｌｕｃ）は、１０％加熱不活化ウシ胎仔血清（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を使用して、５％ＣＯ2の存在下で、３７℃恒温培養器で２４時間培養した。前記細胞株を、１０ｍＬの選択培地（１０％加熱不活化ウシ胎仔血清（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）、１００ユニット／ｍＬのペニシリン（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）、１００unit/ｍＬstreptomycin（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）、８００μｇ／ｍＬのＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｇ４１８）（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ））の存在下で４日間培養した。培地を新しい選択培地と交換することによって選択培地によって死滅させた細胞を除去する工程を、４日に１回、３回繰り返した。最終的に選択された増殖されたクローンによって形成された個々のコロニーを、顕微鏡下で、ウェル当たり１ｍＬの選択培地を含む２４ウェル細胞培養プレートに移し、４日間培養した。フォルスコリン（SIGMA社）を最終濃度１０μＭに処理した後、５％ＣＯ2の存在下で、３７℃の恒温培養器で５時間培養した。各ウェルを５０μＬのＢｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏルシフェラーゼ試薬（Promega社）で処理し、室温で１５分間放置した後、発光測定器（Victor社）を使用して各ウェルの発光を測定した。フォルスコリンの処理により基本値の１００倍以上の発光を示すクローンを選定し、各化合物のＭＣ４Ｒアゴニスト能を測定した。
ＭＣ４Ｒ（メラノコルチン－４受容体）に対するアゴニスト能力を測定するために、ＭＣ４ＲとＣＲＥ（ｃＡＭＰ応答エレメント）の制御下で、ルシフェラーゼ遺伝子（ＣＲＥ－ＬＵＣ）を恒久的に発現する細胞株を樹立した。ＭＣ４Ｒ遺伝子を含む哺乳動物細胞発現ベクター（ｐＣＤＮＡ３（Ｎｅｏ））（Invitrogen社）を調製した後、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞株は、ＣＲＥ（ｃＡＭＰ応答エレメント）の制御下で、ルシフェラーゼ遺伝子（ＣＲＥ－ＬＵＣ）を発現するベクター（ｐＣＲＥ－Ｌｕｃ）（Stratagen社製）と一緒にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Invitrogen社）を使用して形質転換させた。形質転換細胞株（ＨＥＫ ＭＣ４Ｒ－Ｌｕｃ）は、１０％加熱不活化ウシ胎仔血清（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を使用して、５％ＣＯ2の存在下で、３７℃恒温培養器で２４時間培養した。前記細胞株を、１０ｍＬの選択培地（１０％加熱不活化ウシ胎仔血清（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）、１００ユニット／ｍＬのペニシリン（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）、１００unit/ｍＬstreptomycin（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）、８００μｇ／ｍＬのＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｇ４１８）（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ））の存在下で４日間培養した。培地を新しい選択培地と交換することによって選択培地によって死滅させた細胞を除去する工程を、４日に１回、３回繰り返した。最終的に選択された増殖されたクローンによって形成された個々のコロニーを、顕微鏡下で、ウェル当たり１ｍＬの選択培地を含む２４ウェル細胞培養プレートに移し、４日間培養した。フォルスコリン（SIGMA社）を最終濃度１０μＭに処理した後、５％ＣＯ2の存在下で、３７℃の恒温培養器で５時間培養した。各ウェルを５０μＬのＢｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏルシフェラーゼ試薬（Promega社）で処理し、室温で１５分間放置した後、発光測定器（Victor社）を使用して各ウェルの発光を測定した。フォルスコリンの処理により基本値の１００倍以上の発光を示すクローンを選定し、各化合物のＭＣ４Ｒアゴニスト能を測定した。
【0102】
ＨＥＫ ＭＣ４Ｒ－Ｌｕｃ細胞を、９６ウェル発光測定器用細胞培養プレート（Costar社）の各ウェルに１００μＬの培養で２．５×１０4細胞のサイズになるように加え、６％ＣＯ2の存在下で、３７℃の恒温培養器で１８時間培養した。前記培養を使用して各工程濃度で希釈したＭＣＲアゴニストを、最終ＤＭＳＯ濃度が１％を越えないように処理し、６％ＣＯ2の存在下で、３７℃の℃恒温培養器で５時間培養した。各ウェルを５０μＬのＢｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏルシフェラーゼ試薬（Promega社製）で処理し、室温で５分間放置した後、発光測定器（Victor社）を使用して各ウェルの発光を測定した。各工程濃度で希釈されたアゴニストによって誘導された発光量は、１０μＭのＮＤＰ－α－ＭＳＨ処理によって示された量に対する相対的な％値に変換された。ＥＣ0.5 ＭＳＨは、ＮＤＰ－α－ＭＳＨによって誘導される最大発光量の５０％を誘導させる濃度として表され、ＥＣ50は、各アゴニストによって誘導される可能性のある最大発光量の５０％を誘導する濃度と表された。前記測定値は、統計ソフトウェア（Prizm）を使用して測定した。
【0103】
前記実験で得られた各化合物のＭＣ４Ｒのアゴニスト能力をＥＣ50（ｎＭ）単位で測定した結果を表１に示した。
【表1】
【0104】
前記表１に示されるように、生体内でよく知られたメラノコルチン受容体の中で、生体内のエネルギー代謝と体重調節に関与するメラノコルチン－４受容体（ＭＣ４Ｒ）に関して、実施例の化合物は、比較例の化合物（Ａ９５及びＡ９６）よりも優れたＭＣ４Ｒアゴニスト能力を有することが確認された。
【0105】
実験例２：ｃＡＭＰアッセイ
メラノコルチン受容体は、Ｇ－タンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）の一種であり、Ｇ－タンパク質の主な役割は、シグナル伝達を通じて多くの生理学的刺激に対する細胞の反応を調節するために、２次トランスデューサーを活性化することである。ＭＣ４ＲはＧｓ－結合受容体であり、ＭＣ４Ｒがアゴニストと相互作用すれと、アデニル酸シクラーゼ（ＡＣ）が活性化され、細胞内の２次トランスデューサーの一つである環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）濃度を上昇させることが知られている。従って、ｃＡＭＰシグナルの生成を測定することにより、メラノコルチン受容体の活性を評価することができる。
メラノコルチン受容体は、Ｇ－タンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）の一種であり、Ｇ－タンパク質の主な役割は、シグナル伝達を通じて多くの生理学的刺激に対する細胞の反応を調節するために、２次トランスデューサーを活性化することである。ＭＣ４ＲはＧｓ－結合受容体であり、ＭＣ４Ｒがアゴニストと相互作用すれと、アデニル酸シクラーゼ（ＡＣ）が活性化され、細胞内の２次トランスデューサーの一つである環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）濃度を上昇させることが知られている。従って、ｃＡＭＰシグナルの生成を測定することにより、メラノコルチン受容体の活性を評価することができる。
【0106】
アゴニスト反応による細胞内のｃＡＭＰレベルの増加の測定ができるようにＭＣ１Ｒ、ＭＣ３Ｒ、ＭＣ４Ｒ及びＭＣ５Ｒのそれぞれが過剰発現されたｃＡＭＰＨハンターＧｓ－結合細胞株（ＣＨＯ－Ｋ１細胞株）を確立した後、細胞は白細胞培養プレートの各ウェルに接種し、５％ＣＯ2の存在下で３７℃の恒温培養器で２４時間培養した。培養後、培地を除去し、１５μＬの２：１ＨＢＢＳ/１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ：ｃＡＭＰＸＳ＋Ａｂ試薬を加えた。バッファーで４倍に希釈されたサンプル５μＬを加えた後、ビヒクル濃度を１％に設定し、各工程濃度で希釈したＭＣ４Ｒアゴニスト化合物を加え、３７℃で３０分間反応した。各アゴニスト化合物の活性（％）は、１００％×（サンプルの平均ＲＬＵ値－ビヒクル対照の平均ＲＬＵ値）／（最大対照の平均ＲＬＵ値－ビヒクル対照の平均ＲＬＵ値）として表され、前記値は、ＣＢＩＳdata analysis suite（ChemInnovation, ＣＡ）によって分析された。
【0107】
前記実験で得られた各化合物のＭＣ４Ｒのアゴニスト能力をＥＣ50（ｎＭ）単位で測定した結果を表２に示した。
【表2】
【0108】
前記表２に示されるように、生体内でよく知られているメラノコルチン受容体の中で、生体内のエネルギー代謝と体重調節に関与するメラノコルチン－４受容体（ＭＣ４Ｒ）に関して、実施例の化合物は、比較例の化合物（Ａ９５及びＡ９６）よりも優れたアゴニスト能力を有することが確認された。
【0109】
実験例３：β－アレスチンアッセイ
メラノコルチン受容体は、Ｇ－タンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）の一種であり、多くの神経伝達物質のシグナルを伝達することにより、様々な生理反応を調節する。ＧＰＣＲがリン酸化されると、β－アレスチンは、受容体のリン酸化部分が結合し、他のタンパク質との相互作用を通じて細胞内の様々なシグナル伝達経路を活性化するうえで重要な役割を果たしている。メラノコルチン受容体がアゴニストと相互作用すると、β－アレスチンが動員され、β－アレスチン媒介シグナル伝達経路に関与すると知られている。従って、β－アレスチン測定を通じてメラノコルチン受容体の活性を評価することができる。
メラノコルチン受容体は、Ｇ－タンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）の一種であり、多くの神経伝達物質のシグナルを伝達することにより、様々な生理反応を調節する。ＧＰＣＲがリン酸化されると、β－アレスチンは、受容体のリン酸化部分が結合し、他のタンパク質との相互作用を通じて細胞内の様々なシグナル伝達経路を活性化するうえで重要な役割を果たしている。メラノコルチン受容体がアゴニストと相互作用すると、β－アレスチンが動員され、β－アレスチン媒介シグナル伝達経路に関与すると知られている。従って、β－アレスチン測定を通じてメラノコルチン受容体の活性を評価することができる。
【0110】
Ｐｒｏｌｉｎｋ（ＰＫ）タグ付きＭＣ１Ｒ、ＭＣ３Ｒ、ＭＣ４Ｒ、ＭＣ５Ｒ及び酵素アクセプター（ＥＡ）タグ付きβ－アレスチンが一緒に発現されたＰａｔｈｈｕｎｔｅｒｅ（登録商標） Ｘｐｒｅｓｓ β－アレスチン細胞株（Ｕ２ＯＳ細胞株）を確立した。この細胞株のＭＣＲ－ＰＫ部分が活性化されると、β－アレスチン－ＥＡが動員され、β－ガラクトシダーゼ酵素断片である酵素受容体（ＥＡ）とＰｒｏｌｉｎｋ（ＰＫ）が相互作用する。活性化された酵素は、β－ガラクトシダーゼ活性によって基質を加水分解して化学発光シグナルを生成するため、活性を測定することができる。Ｐａｔｈｈｕｎｔｅｒｅ（登録商標） Ｘｐｒｅｓｓ β－アレスチン細胞株（Ｕ２ＯＳ細胞株）を培養した後、細胞培養プレートの各ウェルに接種し、５％のＣＯ2の存在下で３７℃の恒温培養器で４８時間培養した。培養後、バッファーで５倍に希釈されたサンプル５μＬを加え、ビヒクル濃度を１％に設定し、各工程濃度で希釈したＭＣ４Ｒアゴニスト化合物を加え、３７℃で９０分の間反応したた。各アゴニスト化合物の活性（％）は、１００％×（サンプルの平均ＲＬＵ値－ビヒクル対照の平均ＲＬＵ値）／（対照リガンドの平均最大値－ビヒクル対照の平均ＲＬＵ値）として表され、前記価値はＣＢＩＳ data analysis suite（ChemInnovation, CA）によって分析した。
【0111】
前記実験で得られた各化合物のＭＣ４Ｒのアゴニスト能力をＥＣ50（ｎＭ）単位で測定した結果を表３に示した。
【表3】
【0112】
前記表３に示されるように、生体内でよく知られているメラノコルチン受容体の中で、生体内のエネルギー代謝と体重調節に関与するメラノコルチン－４受容体（ＭＣ４Ｒ）に関して、実施例の化合物は、比較例の化合物（Ａ９５及びＡ９６）よりも優れたアゴニスト能力を有することが確認された。
【0113】
実験例４：結合親和性
生体内でのメラノコルチン受容体（ＭＣＲ）の５つのサブタイプが知られており、サブタイプ４であるＭＣ４Ｒがエネルギー代謝と体重調節に関与しているがことが知られている。他のＭＣＲサブタイプは、皮膚の色素沈着、エネルギー恒常性、外分泌機能など、様々な生体内の機能の調節に関与しているため、ＭＣ４Ｒアゴニスト化合物のＭＣ４Ｒに対する選択性を確保することは、将来起こり得る副作用を防ぐうえで非常に重要である。従って、各ＭＣRサブタイプのＭＣ４Ｒアゴニストの受容体結合能力を測定した。
生体内でのメラノコルチン受容体（ＭＣＲ）の５つのサブタイプが知られており、サブタイプ４であるＭＣ４Ｒがエネルギー代謝と体重調節に関与しているがことが知られている。他のＭＣＲサブタイプは、皮膚の色素沈着、エネルギー恒常性、外分泌機能など、様々な生体内の機能の調節に関与しているため、ＭＣ４Ｒアゴニスト化合物のＭＣ４Ｒに対する選択性を確保することは、将来起こり得る副作用を防ぐうえで非常に重要である。従って、各ＭＣRサブタイプのＭＣ４Ｒアゴニストの受容体結合能力を測定した。
【0114】
ヒト組換えＭＣ１Ｒを発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞株、ＭＣ３Ｒ、ＭＣ４Ｒ及びＭＣ５Ｒを発現するＨＥＫ－２９３細胞株を樹立した後、各細胞株から膜を回収した。９６－ウェル細胞培養プレートで、ウェル当たり３μｇのＭＣ１Ｒ膜と０．０４ｎＭの125I－ＮＤＰ－α－ＭＳＨを３７℃で２時間反応させた。３μｇのＭＣ３Ｒ、ＭＣ５膜と０．０３５ｎＭの125I－ＮＤＰ－α－ＭＳＨを３７℃で１時間反応し、３．１２μｇのＭＣ４Ｒ膜と０．０２ｎＭの125I－ＮＤＰ－α－ＭＳＨを３７℃で２時間反応させた。このとき、各工程濃度で希釈したＭＣＲアゴニストを含む２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ吸着緩衝液（ｐＨ７．０）を各ウェルに加え、反応させた。反応液をフィルターに移し、吸着緩衝液で洗浄した後、放射能を測定した。各総結合量から１μＭ（ＭＣ１Ｒ）、３μＭ（ＭＣ３Ｒ、ＭＣ４Ｒ、ＭＣ５Ｒ）のＮＤＰ－α－ＭＳＨ存下での非特異的結合量を除いた値を125Ｉ－ＮＤＰ－α－ＭＳＨの特異的結合量として使用した。各工程濃度で希釈されたアゴニストによって前記125Ｉ－ＮＤＰ－α－ＭＳＨ特異結合が阻害される程度を測定した。ＩＣ50は、５０％の125Ｉ－ＮＤＰ－α－ＭＳＨ特異結合を阻害する各アゴニストの濃度として表された。
【0115】
前記実験で得られた各化合物のＭＣ４Ｒのアゴニスト能力をＫｉ（ｎＭ）単位で測定した結果を表４に示した。
【表4】
【0116】
前記表４に示されるように、生体内でよく知られているメラノコルチン受容体の中で、生体内のエネルギー代謝と体重調節に関与するメラノコルチン－４受容体（ＭＣ４Ｒ）に関して、実施例の化合物は、比較例の化合物（Ａ９５及びＡ９６）よりも優れた受容体結合能力を有することが確認された。
【0117】
実験例５：薬物動態及び薬物代謝
実験例５－１：薬物動態プロファイル
実施例１の化合物と比較例の化合物の薬物動態（ＰＫ）特性を調査するために、以下の実験を行った。
実験例５－１：薬物動態プロファイル
実施例１の化合物と比較例の化合物の薬物動態（ＰＫ）特性を調査するために、以下の実験を行った。
【0118】
実施例１の化合物と比較例の化合物（Ａ９５及びＡ９６）のＰＫ試験を実施するために、約７週齢のＣ５７ＢＬ６マウスを準備し、投与物質ごとに１２個体を割り当て群分けし、経口投与ために飢餓状態にした。投与当日、ビヒクルとして蒸留水（ＤＷ）を用いて１ｍｇ／ｍＬの濃度で薬液を準備し、各個体の体重１ｋｇ当たり１ｍＬで経口投与し、最終用量を１０ｍｇ／ｋｇにした。投与１、３、８及び２４時間後に、各群３個体のそれぞれから心臓採血により全血を採取し、ヘパリンチューブに入れて凝固を防止した。その後、各個体の大脳を採取してＥＰチューブに入れ、組織の重量を測定し、－２０℃で冷凍保存した。
【0119】
分析当日、組織重量の４倍のＤＤＷを各組織チューブに加えてホモジナイズし、保存した血漿を室温で解凍した。血漿と同様に、５０μＬの組織ホモジネートを採取して別のチューブに移し、次のサンプル量の合計の４倍である２００μＬのアセトニトリル（ＡＮ）を血漿と組織ホモジネートの各チューブに加えて、除タンパクを行った。このとき、ＡＮは内部標準が含まれていた。検量線を作成するために、既知の濃度０．１、０．５、５、５０及び５００ｎｇ／ｍＬのＡＮ溶液（内部標準を含む）を調製し、前記の４倍の用量で血漿と脳のブランク血漿において除タンパクを行った。従って、血漿の場合は０．４～２,０００ｎｇ／ｍＬ、脳の場合は１、５、５０、５００及び５、０００ｎｇ／ｍＬの最終検量線を作成した。除タンパク後に得られた上清０．５μＬをＬＣ－ＭＳ／ＭＳに注入後、実施例の化合物と比較例の化合物（Ａ９５及びＡ９６）のピーク面積をＩＳのピーク面積で補正して、各試料収集時点でのピーク応答を求め、検量線による濃度変換を行った。
【0120】
薬物動態パラメーター（Ｃmax、ＡＵＣinf、ｔ1/2など）は、各投与群格の経時的な血中濃度の値について、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ ８．１を使用したノンコンパートメント分析法によって算出された。
【0121】
各薬物投与群の曝露量及び半減期変化などを比較することにより、各化合物の薬物動態特性を比較し、その結果を表５及び６に示した。また、脳への曝露と血液への曝露に比率による結果値を表７に示した。
【表5】
【表6】
【表7】
【0122】
以上の結果から、各化合物の曝露は、全身及び脳で実施例１の化合物、比較例２の化合物（Ａ９６）、比較例１の化合物（Ａ９５）ｎ順に全身及び脳で確認された。観察期間中の脳の消失の半減期は、血液で観察された値よりも長く、これは、有効性の発現部位での一連の物質の効果的な持続を意味すると考えられる。また、各化合物を同じ用量で投与した場合、実施例の化合物は脳内で最も優れた絶対曝露及び持続力が有することが確認された。また、実施例１の化合物が比較例の化合物（Ａ９５及びＡ９６）と比較して、実施例１の化合物の血中曝露に対する脳曝露の比率も最も優れていることが確認された。
【0123】
これらの結果に加えて、各化合物のインビトロ活性及び薬物の持続力などを総合的に考慮すると、比較例の化合物と比較して、同じ要領で投与した場合、実施例１の化合物はから最高の有効性が期待できた。特定のレベルの効能を達成するために、より低い用量が投与することができ、従って、全身曝露に起因する副作用を最小限に抑えることが期待される。
【0124】
実験例５－２：ＣＹＰ阻害率（％）
ＣＹＰ（シトクロムＰ４５０）アイソザイムに対する薬物相互作用を確認するために、以下の実験を行った。
ＣＹＰ（シトクロムＰ４５０）アイソザイムに対する薬物相互作用を確認するために、以下の実験を行った。
【0125】
実施例１の化合物と比較例２の化合物（Ａ９６）の阻害能を測定及び比較するために、ＣＹＰ１Ａ２、２Ｃ９、２Ｃ１９、２Ｄ６、３Ａ４組換え酵素を準備した。各物質の阻害能を測定するためのプローブ基質、陽性対照群、アイソザイムの使用及び測定条件は下記表８を参考にして行った。
【表8】
【0126】
培養は、９６ウェルプレート（Costar、３７９２－黒、丸底）で行い、代謝に使用したバッファーシステムは、５０ｍＭリン酸カリウムバッファー、ｐＨ７．４で、最終反応容量は２５０μＬであった。総バッファー中の実施例１の化合物、比較例２の化合物（A９６）及び陽性対照群の最終濃度は、１０μＭ（２％メタノール（ｖ／ｖ））であり、それぞれ陰性対照（メタノールのみ、２％（ｖ／ｖ））を含んでいた。実験化合物がスパイクされたバッファーを同量のＣＹＰアイソザイム調製溶液と混合して最終濃度を１０μＭにし、３７℃の蛍光プレートリーダーで１０分間予熱した。各ウェルＮＲＳ溶液（ＮＡＤＰＨ再生システム：０．２２ｍＭ β－ＮＡＤＰ、２．８ｍＭ グルコース－６－ホスフェート及び０．６ユニット／ｍＬのグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ）を加え、３０分間プレインキュベーションした。この後、プレインキュベーションを実施したウェルに基質を加えることにより反応を開始し、各基質の測定波長で１分間隔で３０分間モニタリングした。陽性対照群及び実施例１の化合物から得られた測定値を、陰性対照（阻害又は化合物なし）の蛍光強度を比較し、アイソザイムに対する阻害能を確認した。各化合物を１０μＭで処理した場合の各アイソザイムに対する阻害能（％）を表９に示した。阻害能（％）は、以下の基準に基づいて表された：Ａ＝＜５０％、Ｂ＝＞５０％。
【0127】
化合物１０μＭの治療濃度は非常に高く、その治療濃度に基づいて阻害能を評価し、阻害率が５０％未満の薬物を候補として選択することは保守的な基準である。この場合、選択された候補薬物はＣＹＰアイソザイムを阻害する確率が非常に低いと考えられた。
【表9】
【0128】
前記結果から、同濃度で処理した場合、実施例１の化合物の主ＣＹＰアイソザイムに対する阻害能は、比較例２の化合物（Ａ９６）の阻害能以下であることが確認された。比較例２の化合物（Ａ９６）は、ＣＹＰ２Ｃ９に対する非常に高い阻害能のために薬物相互作用を有することが懸念されている。ＣＹＰ２Ｃ９は、市販されているすべての薬物の約１０％の代謝に関与し、治療域が狭い薬物の効能性の消失に大きな役割果たすことが知られている。また、ＣＹＰ２Ｃ９は、各個人に依存する多型が報告されているため、研究や臨床の両方の側面で非常に重要である。これは、ＣＹＰ２Ｃ９がＦＤＡ ＤＤＩ（薬物・薬物相互作用）ガイダンスでの薬物開発中にその阻害効果を確認しなければならない必須アイソザイムのリストに示されているという事実からも知ることができる。
【0129】
これに基づいて、実施例１の化合物を投与した場合、ＣＹＰ阻害による薬物相互作用は、比較例の化合物（Ａ９６）よりも低いと判断される。
【0130】
実験例６：薬理効果
本発明の化合物のメラノコルチン－４受容体アゴニストの薬理効果を、以下の肥満モデルで評価した。
本発明の化合物のメラノコルチン－４受容体アゴニストの薬理効果を、以下の肥満モデルで評価した。
【0131】
実験例６－１：高脂肪食によって誘導されたマウス肥満モデル
メラノコルチン－４受容体アゴニストの肥満への影響は、マウス肥満モデルを使用して高脂肪食で誘導された効果を評価した。
メラノコルチン－４受容体アゴニストの肥満への影響は、マウス肥満モデルを使用して高脂肪食で誘導された効果を評価した。
【0132】
５週齢の雄のＣ５７ＢＬ/６Ｎタコニックマウスに、６０ｋｃａｌ％の脂肪食（Ｄ１２４９２、Research Diet．）を１５週間供給して、肥満を誘導した。実施例１の化合物、比較例の化合物（Ａ９５及びＡ９６）及び陽性対照としてのシブトラミンを蒸溜水中で調製し、高脂肪食によって誘導された１９週齢のマウス肥満モデルに１日目から第１６日目まで１日１回経口投与した。１日目から１６日目まで、体重は１日１回、食事摂取量は週５回、飲料水摂取量は週２回測定した。１５日目は血糖値及び糖化ヘモグロビンを測定し、１７日目にすべての動物を犠牲にした。腹部大静脈から採血し、肝臓及び精巣上体脂肪組織を摘出して秤量した。採取した血液をヘパリンチューブに入れ、遠心分離して血漿を分離した後、血漿生化学分析を行った。
【0133】
下記表１０には、各化合物の各用量について、１２日目に測定されたビヒクルに対する体重変化率の差を示した。
【表10】
【0134】
このマウス肥満モデルでは、特に、実施例１の化合物のみを投与した場合、有意な体重減少が示された。実施例１の化合物を１０ｍｇ／ｋｇ及び３０ｍｇ／ｋｇ用量で投与した場合、溶媒投与ビヒクル対照と比較して、それぞれ－９．４％及び－１５．１％の体重増加阻害を引き起こされ、比較例の化合物（Ａ９５及びＡ９６）と比較して、統計的に有意な体重減少効果が示された。
【0135】
これは、比較例の化合物と比較して、実施例１の化合物が優れたインビトロＭＣ４Ｒアゴニスト能力、優れた脳絶対曝露及び持続力、並びに血液曝露と比較して優れた脳曝露比によって引き起これ、低投与用量でも有意差を示すことができると判断される。
【0136】
また、実施例１の化合物は、関連分野の肥満治療剤であるシブトラミン（リダクティル）と比較して、有効性において同等以上の優れた結果を示し、実際の臨床適用において有意な薬効を示すことが期待される。