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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-04-12
(45)【発行日】2024-04-22
(54)【発明の名称】ルシフェラーゼ変異体
(51)【国際特許分類】
C12N 15/53 20060101AFI20240415BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240415BHJP
C12N 9/02 20060101ALI20240415BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240415BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240415BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240415BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240415BHJP
C12Q 1/26 20060101ALI20240415BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20240415BHJP
【ＦＩ】
C12N15/53 ZNA
C12N15/63 Z
C12N9/02
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12Q1/26
C12N15/12
【請求項の数】
8
(21)【出願番号】P 2020529058
(86)(22)【出願日】2019-07-05
(86)【国際出願番号】 JP2019026784
(87)【国際公開番号】W WO2020009215
(87)【国際公開日】2020-01-09
【審査請求日】2022-06-30
(31)【優先権主張番号】P 2018129384
(32)【優先日】2018-07-06
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】000004477
【氏名又は名称】キッコーマン株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110002572
【氏名又は名称】弁理士法人平木国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】林 華奈子
(72)【発明者】
【氏名】一柳 敦
【審査官】山本 匡子
(56)【参考文献】
【文献】特表２００１－５１６５８５（ＪＰ，Ａ）
【文献】DEMENTIEVA, EI. et al.，Physicochemical Properties of Recombinant Luciola mingrelica Luciferase and Its Mutant Forms，Biochemistry(Moscow)，1996年，Vol.61, No.1，p.115-119，Abstract, TABLE1, Fig.1, p.118 left column line 21 - right column line 16
【文献】HATTORI N. et al.，Mutant Luciferase Enzymes from Fireflies with Increased Resistance to Benzalkonium Chloride，Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry，2002年，Vol.66, No.12，p.2587-2593，Abstract, Materials and Methods, Fig.1-3, Table 1-2
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－９０
Ｃ１２Ｎ １／００－５／２８
Ｃ１２Ｑ
ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＣＡＰＬＵＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の（ｉ）～（ｉｉｉ）、すなわち
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列、
（ｉｉ）前記（ｉ）のアミノ酸配列において、配列番号１の３９３位に対応する位置以外の位置において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列、及び、
（ｉｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むルシフェラーゼの、配列番号１の３９３位に対応する位置のアミノ酸がロイシン、プロリン、バリン、イソロイシン、ヒスチジン、及びメチオニンからなる群から選択されるアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むホタルルシフェラーゼの変異体であって、熱安定性が改善されたルシフェラーゼ変異体。
【請求項2】
配列番号１の２１７位に対応する位置のアミノ酸がロイシン又はイソロイシンであり、配列番号１の４９０位に対応する位置のアミノ酸がリシンであり、及び／又は
配列番号１の２５２位に対応する位置のアミノ酸がメチオニンである、
請求項１に記載のルシフェラーゼ変異体。
【請求項3】
請求項１又は２に記載のルシフェラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項4】
請求項３に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項5】
請求項３に記載のポリヌクレオチド又は請求項４に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項6】
請求項５に記載の宿主細胞を培養する工程を含む、熱安定性が改善されたルシフェラーゼ変異体の生産方法。
【請求項7】
請求項１又は２に記載のルシフェラーゼ変異体を含む、ＡＴＰ、ＡＤＰ、及びＡＭＰの少なくとも一つを検出するためのキット。
【請求項8】
請求項１又は２に記載のルシフェラーゼ変異体を使用することを含む、ＡＴＰ、ＡＤＰ、及びＡＭＰの少なくとも一つを検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、熱安定性が改善されたルシフェラーゼ変異体、該ルシフェラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド、該ルシフェラーゼ変異体の生産方法、該ルシフェラーゼ変異体を含む、ＡＴＰ、ＡＤＰ、及びＡＭＰの少なくとも一つを検出するためのキット、及び該ルシフェラーゼ変異体を使用することを含む、ＡＴＰ、ＡＤＰ、及びＡＭＰの少なくとも一つを検出する方法等に関する。
【背景技術】
【0002】
ホタルルシフェラーゼは、マグネシウムイオン及び酸素の存在下で、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、Ｄ－ルシフェリン及び酸素を、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、オキシルシフェリン及び二酸化炭素に変換し、光を生成する酵素である。ホタルルシフェラーゼの発光原理を応用すれば、微量の酵素反応基質を極めて感度良く測定することができる。そのため、ホタルルシフェラーゼは、例えば、ＡＴＰを指標とした飲食料品中の微生物検出や、手指や器具類に付着した食物残渣及び汚れの判定、又は、各種抗体技術や遺伝子増幅技術を利用した高感度測定法等に広く用いられている。
【0003】
しかしながら、一般的に、ホタルルシフェラーゼ等の甲虫類ルシフェラーゼは、熱に対して不安定なため、試薬として保存する際に失活しやすいという欠点を有する。そのため、かかる欠点を克服し、良好な熱安定性を有するルシフェラーゼを得るための試みがなされている。
【0004】
その試みのひとつは、測定試薬中に塩等を添加して、ある程度の安定性を確保するという配合組成の工夫である。しかし、この方法は、試薬組成上の制約を伴う場合があるなど広範に適用できるというものではなく、また、多くの場合、塩類の添加は、ルシフェラーゼ反応に何らかの反応障害を惹起しがちであるという欠点を有する。
【0005】
試薬組成の工夫の他に試みられている異なるアプローチのひとつは、好ましい性質を有する変異ルシフェラーゼの探索である。例えば、非特許文献１では、３４２位のアミノ酸がアラニンに変異された北米産ホタルルシフェラーゼが取得され、このホタルルシフェラーゼの発光持続性が向上していることが報告されている。また、特許文献１には２１７位のアミノ酸が疎水性アミノ酸に置換されたゲンジボタル又はヘイケボタルのルシフェラーゼが、耐熱性を有することが開示されている。特許文献２には、ヘイケボタルルシフェラーゼの２８７位に相当するアミノ酸がアラニンに変異されているか、３９２位に相当するアミノ酸がイソロイシンに変異されているアミノ酸配列を有するホタルルシフェラーゼにおいて、熱安定性が向上することが開示されている。
【0006】
しかしながら、これらの文献に開示された置換を有するルシフェラーゼについても、熱安定性は必ずしも十分なものとは言えなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【文献】特開平５－２４４９４２号
【文献】特開２０１１－１２０５５９号
【非特許文献】
【0008】
【文献】Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００３年、４２巻、ｐ１０４２９－１０４３６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本発明は、熱安定性が改善されたホタルルシフェラーゼを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明者は、ヘイケボタルの３９３位のシステインをシステイン以外の非酸性アミノ酸に置換する変異が、ホタルルシフェラーゼの熱安定性を向上させることを見出した。また、本発明者は、配列番号１の３９３位に対応する位置のアミノ酸を置換した場合にホタルルシフェラーゼの熱安定性が向上し得ることを見出し、本願発明を完成させた。
【0011】
したがって、本発明は、以下の態様を包含する。
（１）配列番号１の３９３位に対応する位置のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列を含むホタルルシフェラーゼの変異体であって、熱安定性が改善されたルシフェラーゼ変異体。
（２）配列番号１の３９３位に対応する位置のアミノ酸残基がシステインであるアミノ酸配列を含む野生型ホタルルシフェラーゼの変異体であって、前記位置のアミノ酸がシステイン以外の非酸性アミノ酸であるアミノ酸配列を含む、熱安定性が改善されたルシフェラーゼ変異体。
（３）ホタルルシフェラーゼの変異体であって、配列番号１の３９３位に対応する位置のアミノ酸が、ロイシン、プロリン、バリン、イソロイシン、ヒスチジン、メチオニン、アラニン、フェニルアラニン、グルタミン、トリプトファン、チロシン、セリン、グリシン、アスパラギン、リシン、トレオニン、及びアルギニンからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、熱安定性が改善されたルシフェラーゼ変異体。
（４）配列番号１の３９３位に対応する位置のアミノ酸残基がチロシンであるアミノ酸配列を含む野生型ホタルルシフェラーゼの変異体であって、前記位置のアミノ酸がチロシン及びシステイン以外のアミノ酸配列を含む、熱安定性が改善されたルシフェラーゼ変異体。
（５）配列番号１の３９３位に対応する位置のアミノ酸が、ロイシン、プロリン、バリン、イソロイシン、ヒスチジン、メチオニン、及びアラニンからなる群から選択される、（１）～（４）のいずれかに記載のルシフェラーゼ変異体。
（６）配列番号１の３９３位に対応する位置のアミノ酸が、ロイシン、プロリン、又はバリンである、（５）に記載のルシフェラーゼ変異体。
（７）配列番号１の２１７位に対応する位置のアミノ酸がロイシン又はイソロイシンであり、
配列番号１の４９０位に対応する位置のアミノ酸がリシンであり、及び／又は
配列番号１の２５２位に対応する位置のアミノ酸がメチオニンである、
（１）～（６）のいずれかに記載のルシフェラーゼ変異体。
（８）ルシフェラーゼ変異体が、以下の（ｉ）～（ｉｉｉ）からなる群より選択されるアミノ酸配列：
（ｉ）配列番号１、３、５、及び７からなる群から選択されるアミノ酸配列、
（ｉｉ）前記（ｉ）のいずれかのアミノ酸配列において、配列番号１の３９３位に対応する位置以外の位置において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列、及び
（ｉｉｉ）前記（ｉ）のいずれかのアミノ酸配列に対して全長で７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、かつ配列番号１の以下の位置：４～５位、９～１０位、１３～１４位、１６～１７位、１９位、２３位、２５～２６位、２８位、３５～３７位、４０位、４２～４３位、４５位、４７位、５５位、５７位、６２位、６５位、７２～７４位、８０位、８３～８６位、９０～９１位、９３位、９８位、１０１位、１０５～１０６位、１１１位、１１４～１１６位、１１９位、１２２位、１２５位、１２９位、１３１～１３２位、１３７位、１４１位、１５１位、１５３位、１５５位、１５９位、１６２位、１６４位、１６９位、１８３位、１９０位、１９５～１９６位、１９８位、２００～２０２位、２０４～２０５位、２０８～２１０位、２１２位、２１４位、２２０～２２３位、２２６～２２７位、２３０～２３１位、２３５位、２３７～２３８位、２４０位、２４２位、２４４～２５１位、２５３～２５７位、２６０～２６３位、２７０位、２７２位、２７５～２７６位、２７９～２８３位、２８６位、２８９～２９３位、３００位、３０２位、３０５～３０９位、３１１位、３１３～３２４位、３２６～３２７位、３２９位、３３２～３３３位、３３５位、３３９～３５０位、３５３～３５５位、３５８位、３６１～３６２位、３６５～３６６位、３６８～３６９位、３７４～３７５位、３７７位、３８０位、３８２位、３８４～３８５位、３８７位、３９０～３９１位、３９６位、３９８位、４００位、４０３位、４０６位、４０８～４１０位、４１４位、４１８～４２０位、４２３～４２５位、４２７位、４２９位、４３３～４３４位、４３６～４５１位、４５３～４５５位、４５７位、４６０～４６４位、４６６位、４６８～４７１位、４７３位、４７５～４７６位、４７９～４８３位、４８５位、４８７～４８８位、４９２～４９３位、４９７位、５０４位、５０６～５０８位、５１１～５１２位、５１４～５１８位、５２０位、５２２～５２３位、５２５～５２７位、５２９～５３１位、５３３位、５３８位、５４３位、及び５４７位のアミノ酸配列からなる領域と、ルシフェラーゼ変異体におけるこれらの位置と対応する位置のアミノ酸配列からなる領域とが９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列
を含む、（１）～（７）のいずれかに記載のルシフェラーゼ変異体。
（９）ルシフェラーゼ変異体が、以下の（ｉ）～（ｉｉｉ）からなる群より選択されるアミノ酸配列：
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列、
（ｉｉ）前記（ｉ）のアミノ酸配列において、配列番号１の３９３位に対応する位置以外の位置において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列、及び （ｉｉｉ）前記（ｉ）のアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、
を含む、（８）に記載のルシフェラーゼ変異体。
（１０）（１）～（９）のいずれかに記載のルシフェラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド。
（１１）（１０）に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
（１２）（１０）に記載のポリヌクレオチド又は（１１）に記載のベクターを含む宿主細胞。
（１３）（１２）に記載の宿主細胞を培養する工程を含む、熱安定性が改善されたルシフェラーゼ変異体の生産方法。
（１４）（１）～（９）のいずれかに記載のルシフェラーゼ変異体を含む、ＡＴＰ、ＡＤＰ、及びＡＭＰの少なくとも一つを検出するためのキット。
（１５）（１）～（９）のいずれかに記載のルシフェラーゼ変異体を使用することを含む、ＡＴＰ、ＡＤＰ、及びＡＭＰの少なくとも一つを検出する方法。
（１）配列番号１の３９３位に対応する位置のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列を含むホタルルシフェラーゼの変異体であって、熱安定性が改善されたルシフェラーゼ変異体。
（２）配列番号１の３９３位に対応する位置のアミノ酸残基がシステインであるアミノ酸配列を含む野生型ホタルルシフェラーゼの変異体であって、前記位置のアミノ酸がシステイン以外の非酸性アミノ酸であるアミノ酸配列を含む、熱安定性が改善されたルシフェラーゼ変異体。
（３）ホタルルシフェラーゼの変異体であって、配列番号１の３９３位に対応する位置のアミノ酸が、ロイシン、プロリン、バリン、イソロイシン、ヒスチジン、メチオニン、アラニン、フェニルアラニン、グルタミン、トリプトファン、チロシン、セリン、グリシン、アスパラギン、リシン、トレオニン、及びアルギニンからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、熱安定性が改善されたルシフェラーゼ変異体。
（４）配列番号１の３９３位に対応する位置のアミノ酸残基がチロシンであるアミノ酸配列を含む野生型ホタルルシフェラーゼの変異体であって、前記位置のアミノ酸がチロシン及びシステイン以外のアミノ酸配列を含む、熱安定性が改善されたルシフェラーゼ変異体。
（５）配列番号１の３９３位に対応する位置のアミノ酸が、ロイシン、プロリン、バリン、イソロイシン、ヒスチジン、メチオニン、及びアラニンからなる群から選択される、（１）～（４）のいずれかに記載のルシフェラーゼ変異体。
（６）配列番号１の３９３位に対応する位置のアミノ酸が、ロイシン、プロリン、又はバリンである、（５）に記載のルシフェラーゼ変異体。
（７）配列番号１の２１７位に対応する位置のアミノ酸がロイシン又はイソロイシンであり、
配列番号１の４９０位に対応する位置のアミノ酸がリシンであり、及び／又は
配列番号１の２５２位に対応する位置のアミノ酸がメチオニンである、
（１）～（６）のいずれかに記載のルシフェラーゼ変異体。
（８）ルシフェラーゼ変異体が、以下の（ｉ）～（ｉｉｉ）からなる群より選択されるアミノ酸配列：
（ｉ）配列番号１、３、５、及び７からなる群から選択されるアミノ酸配列、
（ｉｉ）前記（ｉ）のいずれかのアミノ酸配列において、配列番号１の３９３位に対応する位置以外の位置において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列、及び
（ｉｉｉ）前記（ｉ）のいずれかのアミノ酸配列に対して全長で７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、かつ配列番号１の以下の位置：４～５位、９～１０位、１３～１４位、１６～１７位、１９位、２３位、２５～２６位、２８位、３５～３７位、４０位、４２～４３位、４５位、４７位、５５位、５７位、６２位、６５位、７２～７４位、８０位、８３～８６位、９０～９１位、９３位、９８位、１０１位、１０５～１０６位、１１１位、１１４～１１６位、１１９位、１２２位、１２５位、１２９位、１３１～１３２位、１３７位、１４１位、１５１位、１５３位、１５５位、１５９位、１６２位、１６４位、１６９位、１８３位、１９０位、１９５～１９６位、１９８位、２００～２０２位、２０４～２０５位、２０８～２１０位、２１２位、２１４位、２２０～２２３位、２２６～２２７位、２３０～２３１位、２３５位、２３７～２３８位、２４０位、２４２位、２４４～２５１位、２５３～２５７位、２６０～２６３位、２７０位、２７２位、２７５～２７６位、２７９～２８３位、２８６位、２８９～２９３位、３００位、３０２位、３０５～３０９位、３１１位、３１３～３２４位、３２６～３２７位、３２９位、３３２～３３３位、３３５位、３３９～３５０位、３５３～３５５位、３５８位、３６１～３６２位、３６５～３６６位、３６８～３６９位、３７４～３７５位、３７７位、３８０位、３８２位、３８４～３８５位、３８７位、３９０～３９１位、３９６位、３９８位、４００位、４０３位、４０６位、４０８～４１０位、４１４位、４１８～４２０位、４２３～４２５位、４２７位、４２９位、４３３～４３４位、４３６～４５１位、４５３～４５５位、４５７位、４６０～４６４位、４６６位、４６８～４７１位、４７３位、４７５～４７６位、４７９～４８３位、４８５位、４８７～４８８位、４９２～４９３位、４９７位、５０４位、５０６～５０８位、５１１～５１２位、５１４～５１８位、５２０位、５２２～５２３位、５２５～５２７位、５２９～５３１位、５３３位、５３８位、５４３位、及び５４７位のアミノ酸配列からなる領域と、ルシフェラーゼ変異体におけるこれらの位置と対応する位置のアミノ酸配列からなる領域とが９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列
を含む、（１）～（７）のいずれかに記載のルシフェラーゼ変異体。
（９）ルシフェラーゼ変異体が、以下の（ｉ）～（ｉｉｉ）からなる群より選択されるアミノ酸配列：
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列、
（ｉｉ）前記（ｉ）のアミノ酸配列において、配列番号１の３９３位に対応する位置以外の位置において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列、及び （ｉｉｉ）前記（ｉ）のアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、
を含む、（８）に記載のルシフェラーゼ変異体。
（１０）（１）～（９）のいずれかに記載のルシフェラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド。
（１１）（１０）に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
（１２）（１０）に記載のポリヌクレオチド又は（１１）に記載のベクターを含む宿主細胞。
（１３）（１２）に記載の宿主細胞を培養する工程を含む、熱安定性が改善されたルシフェラーゼ変異体の生産方法。
（１４）（１）～（９）のいずれかに記載のルシフェラーゼ変異体を含む、ＡＴＰ、ＡＤＰ、及びＡＭＰの少なくとも一つを検出するためのキット。
（１５）（１）～（９）のいずれかに記載のルシフェラーゼ変異体を使用することを含む、ＡＴＰ、ＡＤＰ、及びＡＭＰの少なくとも一つを検出する方法。
【0012】
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2018-129384号の開示内容を包含する。
【発明の効果】
【0013】
本発明により、熱安定性が改善されたホタルルシフェラーゼが提供される。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【発明を実施するための形態】
【0015】
（ルシフェラーゼ変異体）
一態様において、本発明は、配列番号１の３９３位に対応する位置のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列を含むホタルルシフェラーゼ、例えば野生型ホタルルシフェラーゼの変異体に関する。一態様において、本発明は、配列番号１の３９３位に対応する位置のアミノ酸残基がシステインであるアミノ酸配列を含むホタルルシフェラーゼ、例えば野生型ホタルルシフェラーゼの変異体に関する。一実施形態において、本発明のルシフェラーゼ変異体は、熱安定性が改善されている。
一態様において、本発明は、配列番号１の３９３位に対応する位置のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列を含むホタルルシフェラーゼ、例えば野生型ホタルルシフェラーゼの変異体に関する。一態様において、本発明は、配列番号１の３９３位に対応する位置のアミノ酸残基がシステインであるアミノ酸配列を含むホタルルシフェラーゼ、例えば野生型ホタルルシフェラーゼの変異体に関する。一実施形態において、本発明のルシフェラーゼ変異体は、熱安定性が改善されている。
【0016】
本明細書において、「野生型」とは、同種集団内において自然界に最も多く存在する形質をいう。
【0017】
本発明のホタルルシフェラーゼとしては、任意のホタル由来のものを用いることができる。例えば、ヘイケボタル（Ｌｕｃｉｏｌａ ｌａｔｅｒａｌｉｓ）、ゲンジボタル（Ｌｕｃｉｏｌａ ｃｒｕｃｉａｔａ）、北米産ホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ）、フォツリス・ペンシルバニカ（Ｐｈｏｔｕｒｉｓ ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉｃａ）、ヨーロッパツチボタル（Ｌａｍｐｙｒｉｓ ｎｏｃｔｉｌｕｃａ）、ミヤコマドボタル（Ｐｙｒｏｃｏｅｌｉａ ｍｉｙａｋｏ）、クリックビートル（Ｐｙｒｏｐｈｏｒｕｓ ｐｌａｇｉｏｐｈｔｈａｌａｍｕｓ）、又はルシオラ・ミングレリカ（Ｌｕｃｉｏｌａ ｍｉｎｇｒｅｌｉｃａ）、好ましくはヘイケボタル、ゲンジボタル、北米産ホタル、又はフォツリス・ペンシルバニカ由来のホタルルシフェラーゼを用いることができる。あるいは、各種のホタル由来のルシフェラーゼ遺伝子をもとに作製されたキメラタンパク質を用いてもよい。
【0018】
本明細書において、アミノ酸位置の対応関係は、例えば、既成のアミノ酸の相同性解析用ソフト、例えば、ＧＥＮＥＴＹＸ（ＧＥＮＥＴＹＸ社製）等を用いて、各種ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列を比較することにより、容易に特定することができる。例えば、配列番号１のアミノ酸配列の位置Ｘに対応するルシフェラーゼのアミノ酸位置は、該ルシフェラーゼのアミノ酸配列を配列番号１のアミノ酸配列とアラインメントすることによって特定することができる。例えば、「配列番号１の３９３位に対応する位置」は、配列番号３のアミノ酸配列の３９３位、配列番号５の３９１位、及び配列番号７の３９０位であってよい。図１に、ヘイケボタルルシフェラーゼ、ゲンジボタルルシフェラーゼ、北米産ホタルルシフェラーゼ、及びフォツリス・ペンシルバニカルシフェラーゼのアラインメント結果を示す。このようなアラインメント結果を参照して各アミノ酸配列における対応する位置を定めることができる。
【0019】
一実施形態において、ルシフェラーゼ変異体における配列番号１の３９３位に対応する位置のアミノ酸は、システイン以外の非酸性アミノ酸（すなわち、ロイシン、プロリン、バリン、イソロイシン、ヒスチジン、メチオニン、アラニン、フェニルアラニン、グルタミン、トリプトファン、チロシン、セリン、グリシン、アスパラギン、リシン、トレオニン、又はアルギニン）である。この実施形態において、ルシフェラーゼ変異体はヘイケボタル由来のルシフェラーゼ変異体、又は配列番号１のアミノ酸配列と高い配列同一性、例えば９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む変異体であってよい。配列番号１の３９３位に対応する位置のアミノ酸は、好ましくはロイシン、プロリン、バリン、イソロイシン、ヒスチジン、メチオニン、アラニン、フェニルアラニン、グルタミン、トリプトファン、チロシン、セリン、及びグリシンからなる群から選択され、さらに好ましくはロイシン、プロリン、バリン、イソロイシン、ヒスチジン、メチオニン、及びアラニンからなる群から選択され、より好ましくはロイシン、プロリン、又はバリンである。
【0020】
一実施形態において、ルシフェラーゼ変異体における配列番号１の３９３位に対応する位置のアミノ酸（例えば、配列番号３の３９３位のアミノ酸）は、システイン以外のアミノ酸である。この実施形態において、ルシフェラーゼ変異体はゲンジボタル由来のルシフェラーゼ変異体、又は配列番号３のアミノ酸配列と高い配列同一性、例えば９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む変異体であってよい。配列番号１の３９３位に対応する位置のアミノ酸は、アスパラギン、アラニン、セリン、アルギニン、ロイシン、トレオニン、ヒスチジン、バリン、フェニルアラニン、グリシン、トリプトファン、チロシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、又はグルタミンであってよく、例えばアスパラギン、アラニン、セリン、アルギニン、ロイシン、トレオニン、ヒスチジン、又はバリンであってよい。
【0021】
一実施形態において、ルシフェラーゼ変異体における配列番号１の３９３位に対応する位置のアミノ酸（例えば、配列番号５の３９１位のアミノ酸）は、トリプトファンである。この実施形態において、ルシフェラーゼ変異体は北米産ホタル由来のルシフェラーゼ変異体、又は配列番号５のアミノ酸配列と高い配列同一性、例えば７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む変異体であってよい。
【0022】
一態様において、本発明は、配列番号１の３９３位に対応する位置のアミノ酸が、ロイシン、プロリン、バリン、イソロイシン、ヒスチジン、メチオニン、アラニン、フェニルアラニン、グルタミン、トリプトファン、チロシン、セリン、グリシン、アスパラギン、リシン、トレオニン、及びアルギニンからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、熱安定性が改善されたルシフェラーゼ変異体に関する。本態様において、変異導入前のホタルルシフェラーゼ、例えば野生型ホタルルシフェラーゼにおける配列番号１の３９３位に対応する位置のアミノ酸は、上記アミノ酸のいずれか以外であれば限定しないが、例えばチロシンであってよい（ただしこの場合、置換後のアミノ酸はチロシンではないことを条件とする）。一実施形態において、ルシフェラーゼ変異体における配列番号１の３９３位に対応する位置のアミノ酸は、トリプトファンではない。一実施形態において、ルシフェラーゼ変異体における配列番号１の３９３位に対応する位置のアミノ酸は、好ましくはロイシン、プロリン、バリン、イソロイシン、ヒスチジン、メチオニン、及びアラニンからなる群から選択され、より好ましくはロイシン、プロリン、又はバリンである。
【0023】
一態様において、本発明は、配列番号１の３９３位に対応する位置（例えば、配列番号７の３９０位）のアミノ酸残基がチロシンであるアミノ酸配列を含むホタルルシフェラーゼの変異体であって、前記位置のアミノ酸がチロシン及びシステイン以外のアミノ酸配列（例えば、チロシン、システイン及びトリプトファン以外のアミノ酸配列）を含む、熱安定性が改善されたルシフェラーゼ変異体に関する。本態様において、配列番号１の３９３位に対応する位置のアミノ酸残基は、プロリン、アスパラギン、アルギニン、グリシン、セリン、リシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、グルタミン、トレオニン、グルタミン酸、イソロイシン、又はアラニンであってよく、例えばプロリン、アスパラギン、アルギニン、グリシン、セリン、リシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、グルタミン、又はトレオニンであってよい。
【0024】
一実施形態において、配列番号１の３９３位に対応する位置の変異は、人為的に導入されたものである。これは、ルシフェラーゼをコードする遺伝子の配列に変異を人為的に導入することによりなされ得る。
【0025】
一実施形態において、本発明のホタルルシフェラーゼ変異体は、上記３９３位、又は３９３位に対応する位置の変異以外の変異をさらに含んでもよい。前記変異は、何らかの特定の効果を意図して人為的に導入されたものでもよく、ランダムに、又は非人為的に導入されたものでもよい。特定の効果を意図して導入される変異としては、例えば、ホタルルシフェラーゼの発現量を増強するための配列の付加や改変、ホタルルシフェラーゼの精製効率を向上させるための改変等の他、ホタルルシフェラーゼに実用上好ましい特性を付与する各種の変異も含まれ得る。そのような公知の変異の例としては、特開２０００－１９７４８４号公報に記載されるような発光持続性を高める変異、特開平３－２８５６８３号公報又は特表２００３－５１２０７１号公報に記載されるような発光波長を変化させる変異、特開平１１－２３９４９３号公報に記載されるような界面活性剤耐性を高める変異、国際公開第９９／０２６９７号パンフレット、特表平１０－５１２７５０号公報又は特表２００１－５１８７９９号公報に記載されるような基質親和性を変化させる変異、特開平５－２４４９４２号公報、特開２０１１－１２０５５９号公報、特開２０００－１９７４８７号公報、特表平９－５１０６１０号公報又は特表２００３－５１８９１２号公報に記載されるような、安定性を高める変異、又は特開２０１１－１８８７８７に記載されるような、発光持続性、安定性及び発光量を改善する変異等が挙げられる。例えば、特開２０１１－１２０５５９号公報には、ヘイケボタルルシフェラーゼの２８７位に相当するアミノ酸がアラニンに変異されているか、３９２位に相当するアミノ酸がイソロイシンに変異されているアミノ酸配列を有するホタルルシフェラーゼにおいて、熱安定性が向上することが開示されている。特開２０１１－１２０５５９号公報には、これらの変異と、３２６位のアミノ酸がセリンに置換された変異、及び／又は４６７位のアミノ酸がイソロイシンに置換された変異を組み合わせることにより、さらに安定性が向上したホタルルシフェラーゼを得ることができることが記載されている。
【0026】
例えば、本発明のルシフェラーゼ変異体において、配列番号１の２１７位に対応する位置のアミノ酸はロイシン又はイソロイシンであり、及び／又は配列番号１の４９０位に対応する位置のアミノ酸はリシンであってよい。また、本発明のルシフェラーゼ変異体において、配列番号１の２５２位に対応する位置のアミノ酸はメチオニンであってよい。
【0027】
本発明のホタルルシフェラーゼ変異体の例として、野生型ヘイケボタルルシフェラーゼ（配列番号１）に対し、配列番号１の２１７位に対応する位置にロイシンを導入し、かつ４９０位に対応する位置にリシンを導入した変異体（アミノ酸配列を配列番号９で示す）；野生型ゲンジボタルルシフェラーゼ（配列番号３）に対し、配列番号１の２１７位に対応する位置（配列番号３の２１７位）にイソロイシンを導入した変異体；及び野生型フォツリス・ペンシルバニカホタルルシフェラーゼ（配列番号７）に対し、配列番号１の２５２位に対応する位置（配列番号７の２４９位）にメチオニンを導入した変異体が挙げられる。これらの変異体は、上記３９３位、又は３９３位に対応する位置の変異をさらに含んでいてもよい。
【0028】
一実施形態において、ルシフェラーゼ変異体は、配列番号１の３９３位に対応する位置におけるアミノ酸変異（及び任意に本明細書に記載の他のアミノ酸変異）を含み、かつ以下の（ｉ）～（ｉｉｉ）からなる群より選択されるアミノ酸配列：
（ｉ）配列番号１、３、５、及び７からなる群から選択されるアミノ酸配列、
（ｉｉ）前記（ｉ）のいずれかのアミノ酸配列において、配列番号１の３９３位に対応する位置以外の位置において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列、及び
（ｉｉｉ）前記（ｉ）のいずれかのアミノ酸配列に対して全長で７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、かつ配列番号１の以下の位置：４～５位、９～１０位、１３～１４位、１６～１７位、１９位、２３位、２５～２６位、２８位、３５～３７位、４０位、４２～４３位、４５位、４７位、５５位、５７位、６２位、６５位、７２～７４位、８０位、８３～８６位、９０～９１位、９３位、９８位、１０１位、１０５～１０６位、１１１位、１１４～１１６位、１１９位、１２２位、１２５位、１２９位、１３１～１３２位、１３７位、１４１位、１５１位、１５３位、１５５位、１５９位、１６２位、１６４位、１６９位、１８３位、１９０位、１９５～１９６位、１９８位、２００～２０２位、２０４～２０５位、２０８～２１０位、２１２位、２１４位、２２０～２２３位、２２６～２２７位、２３０～２３１位、２３５位、２３７～２３８位、２４０位、２４２位、２４４～２５１位、２５３～２５７位、２６０～２６３位、２７０位、２７２位、２７５～２７６位、２７９～２８３位、２８６位、２８９～２９３位、３００位、３０２位、３０５～３０９位、３１１位、３１３～３２４位、３２６～３２７位、３２９位、３３２～３３３位、３３５位、３３９～３５０位、３５３～３５５位、３５８位、３６１～３６２位、３６５～３６６位、３６８～３６９位、３７４～３７５位、３７７位、３８０位、３８２位、３８４～３８５位、３８７位、３９０～３９１位、３９６位、３９８位、４００位、４０３位、４０６位、４０８～４１０位、４１４位、４１８～４２０位、４２３～４２５位、４２７位、４２９位、４３３～４３４位、４３６～４５１位、４５３～４５５位、４５７位、４６０～４６４位、４６６位、４６８～４７１位、４７３位、４７５～４７６位、４７９～４８３位、４８５位、４８７～４８８位、４９２～４９３位、４９７位、５０４位、５０６～５０８位、５１１～５１２位、５１４～５１８位、５２０位、５２２～５２３位、５２５～５２７位、５２９～５３１位、５３３位、５３８位、５４３位、及び５４７位のアミノ酸配列からなる領域（以下、「同一領域」とも記載する）と、ルシフェラーゼ変異体におけるこれらの位置と対応する位置のアミノ酸配列からなる領域とが９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
（ｉ）配列番号１、３、５、及び７からなる群から選択されるアミノ酸配列、
（ｉｉ）前記（ｉ）のいずれかのアミノ酸配列において、配列番号１の３９３位に対応する位置以外の位置において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列、及び
（ｉｉｉ）前記（ｉ）のいずれかのアミノ酸配列に対して全長で７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、かつ配列番号１の以下の位置：４～５位、９～１０位、１３～１４位、１６～１７位、１９位、２３位、２５～２６位、２８位、３５～３７位、４０位、４２～４３位、４５位、４７位、５５位、５７位、６２位、６５位、７２～７４位、８０位、８３～８６位、９０～９１位、９３位、９８位、１０１位、１０５～１０６位、１１１位、１１４～１１６位、１１９位、１２２位、１２５位、１２９位、１３１～１３２位、１３７位、１４１位、１５１位、１５３位、１５５位、１５９位、１６２位、１６４位、１６９位、１８３位、１９０位、１９５～１９６位、１９８位、２００～２０２位、２０４～２０５位、２０８～２１０位、２１２位、２１４位、２２０～２２３位、２２６～２２７位、２３０～２３１位、２３５位、２３７～２３８位、２４０位、２４２位、２４４～２５１位、２５３～２５７位、２６０～２６３位、２７０位、２７２位、２７５～２７６位、２７９～２８３位、２８６位、２８９～２９３位、３００位、３０２位、３０５～３０９位、３１１位、３１３～３２４位、３２６～３２７位、３２９位、３３２～３３３位、３３５位、３３９～３５０位、３５３～３５５位、３５８位、３６１～３６２位、３６５～３６６位、３６８～３６９位、３７４～３７５位、３７７位、３８０位、３８２位、３８４～３８５位、３８７位、３９０～３９１位、３９６位、３９８位、４００位、４０３位、４０６位、４０８～４１０位、４１４位、４１８～４２０位、４２３～４２５位、４２７位、４２９位、４３３～４３４位、４３６～４５１位、４５３～４５５位、４５７位、４６０～４６４位、４６６位、４６８～４７１位、４７３位、４７５～４７６位、４７９～４８３位、４８５位、４８７～４８８位、４９２～４９３位、４９７位、５０４位、５０６～５０８位、５１１～５１２位、５１４～５１８位、５２０位、５２２～５２３位、５２５～５２７位、５２９～５３１位、５３３位、５３８位、５４３位、及び５４７位のアミノ酸配列からなる領域（以下、「同一領域」とも記載する）と、ルシフェラーゼ変異体におけるこれらの位置と対応する位置のアミノ酸配列からなる領域とが９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0029】
一実施形態において、上記（ｉｉｉ）のアミノ酸配列は、前記（ｉ）のいずれかのアミノ酸配列に対して全長で７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、好ましくは８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、より好ましくは９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、さらに好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、さらにより好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の配列同一性を有する。また、上記（ｉｉｉ）のアミノ酸配列における「同一領域」は、図１に示す４つのホタルルシフェラーゼ（ヘイケボタル、ゲンジボタル、北米産ホタル、及びフォツリス・ペンシルバニカ）において同一のアミノ酸残基が保存されている領域として特定することができる。上記（ｉｉｉ）のアミノ酸配列において、上記同一領域とルシフェラーゼ変異体における同一領域と対応する領域とは、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の配列同一性を有する。
【0030】
本明細書において、アミノ酸配列及び遺伝子配列の同一性は、ＧＥＮＥＴＹＸ（ＧＥＮＥＴＹＸ社製）のマキシマムマッチングやサーチホモロジー等のプログラム、又はＣＬＵＳＴＡＬ Ｗのマルチプルアラインメント、ＢＬＡＳＴによるペアワイズアラインメント等のプログラムにより計算することができる。アミノ酸配列同一性を計算するために、２以上のルシフェラーゼをアラインメントしたときに、該２以上のルシフェラーゼにおいて同一であるアミノ酸の位置を調べることができる。こうした情報を基に、アミノ酸配列中の同一領域を決定できる。ここで２以上のアミノ酸配列について、同一性％とは、アミノ酸配列を対象としたＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴＰ）等を利用して２以上のアミノ酸配列のアラインメントを行った際に、アラインメント可能であった領域の総アミノ酸数を分母とし、そのうち同一のアミノ酸によって占められる位置の数を分子としたときのパーセンテージをいう。故に、通常、２以上のアミノ酸配列に同一性が全く見られない領域がある場合、例えばＣ末端に同一性が全く見られない付加配列が一方のアミノ酸配列にある場合、当該同一性のない領域はアラインメント不可能であるため、同一性％の算出には利用されない。
【0031】
本明細書において、「１又は数個」の範囲は、１から１０個、好ましくは１から７個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個、あるいは１個又は２個である。
【0032】
一実施形態において、ルシフェラーゼ変異体は、配列番号１の３９３位に対応する位置におけるアミノ酸変異（及び任意に本明細書に記載の他のアミノ酸変異）を含み、かつ以下の（ｉ）～（ｉｉｉ）からなる群より選択されるアミノ酸配列：
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列、
（ｉｉ）前記（ｉ）のアミノ酸配列において、配列番号１の３９３位に対応する位置以外の位置において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列、及び （ｉｉｉ）前記（ｉ）のアミノ酸配列に対して９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、
を含む。
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列、
（ｉｉ）前記（ｉ）のアミノ酸配列において、配列番号１の３９３位に対応する位置以外の位置において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列、及び （ｉｉｉ）前記（ｉ）のアミノ酸配列に対して９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、
を含む。
【0033】
一実施形態において、本発明のルシフェラーゼ変異体は、ルシフェラーゼ活性を有する。ルシフェラーゼ活性の有無は、例えば実施例に記載の方法に従って、ルミテスターＣ－１１０（キッコーマンバイオケミファ社製）を使用して測定することができる。
【0034】
本明細書において、「熱安定性」は、例えば、ホタルルシフェラーゼを所定の温度で所定の時間の熱処理を行った時の残存活性を指標に評価することができる。具体的には、本発明におけるホタルルシフェラーゼの熱安定性は、ホタルルシフェラーゼを高温条件下、例えば、通常３０～５０℃、例えば３５～４５℃又は３５～４０℃の反応温度下で、一定時間、通常５～１８０分又は１０～１８０分、例えば６０～１８０分又は約９０分熱処理後の活性残存率を比較することにより評価することができる。本発明におけるホタルルシフェラーゼの活性残存率は、上述の高温条件で作用させる前のホタルルシフェラーゼ活性に対する熱処理後の活性の比で算出する。本発明における熱安定性改善とは、ホタルルシフェラーゼ変異体を上記条件で作用させた際の活性残存率が、本発明の変異（配列番号１の３９３位に対応する位置の変異）を導入しないルシフェラーゼ、例えば野生型ルシフェラーゼ又は本発明の変異以外のアミノ酸配列が同一であるルシフェラーゼに対して１．０１倍以上、１．０２倍以上、１．１倍以上、１．２倍以上、好ましくは１．４倍以上又は１．５倍以上の改善を示す場合を言う。
【0035】
（ポリヌクレオチド）
一態様において、本発明は、本発明のルシフェラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド（以下、「ルシフェラーゼ遺伝子」とも記載する）に関する。ポリヌクレオチドの配列は、ホタルルシフェラーゼ変異体のアミノ酸配列に基づいて容易に定めることができる。例えば、配列番号１、３、５、及び７のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとして、それぞれ配列番号２、４、６、及び８のポリヌクレオチドが挙げられる。本発明のポリヌクレオチドは、例えば、
（ｉ）配列番号２、４、６、及び８からなる群から選択されるヌクレオチド配列、
（ｉｉ）前記（ｉ）のいずれかのヌクレオチド配列において、１又は数個のヌクレオチドが置換、欠失又は付加されたヌクレオチド配列、及び
（ｉｉｉ）前記（ｉ）のいずれかのヌクレオチド配列に対して全長で７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、好ましくは８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、より好ましくは９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、さらに好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、さらにより好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含んでよい。
一態様において、本発明は、本発明のルシフェラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド（以下、「ルシフェラーゼ遺伝子」とも記載する）に関する。ポリヌクレオチドの配列は、ホタルルシフェラーゼ変異体のアミノ酸配列に基づいて容易に定めることができる。例えば、配列番号１、３、５、及び７のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとして、それぞれ配列番号２、４、６、及び８のポリヌクレオチドが挙げられる。本発明のポリヌクレオチドは、例えば、
（ｉ）配列番号２、４、６、及び８からなる群から選択されるヌクレオチド配列、
（ｉｉ）前記（ｉ）のいずれかのヌクレオチド配列において、１又は数個のヌクレオチドが置換、欠失又は付加されたヌクレオチド配列、及び
（ｉｉｉ）前記（ｉ）のいずれかのヌクレオチド配列に対して全長で７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、好ましくは８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、より好ましくは９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、さらに好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、さらにより好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含んでよい。
【0036】
これらのルシフェラーゼをコードするヌクレオチドを得るには、通常一般的に用いられている遺伝子のクローニング方法が用いられる。例えば、ルシフェラーゼ生産能を有するホタルの組織又は細胞から常法、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＷＩＬＥＹ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９）記載の方法により、染色体ＤＮＡ又はｍＲＮＡを抽出することができる。さらにｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成することができる。このようにして得られた染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡを用いて、染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡのライブラリーを作製することができる。
【0037】
次いで、上記ルシフェラーゼのアミノ酸配列に基づき、適当なプローブＤＮＡを合成して、これを用いて染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡのライブラリーからルシフェラーゼをコードするポリヌクレオチドを選抜する方法、又は、上記アミノ酸配列に基づき、適当なプライマーＤＮＡを作製して、５’ＲＡＣＥ法や３’ＲＡＣＥ法などの適当なポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＰＣＲ法）により、ルシフェラーゼをコードする目的のヌクレオチド断片を含むＤＮＡを増幅させ、これらのＤＮＡ断片を連結させて、目的のルシフェラーゼをコードするヌクレオチドの全長を含むＤＮＡを得ることができる。
【0038】
また、例えば配列番号２、４、６、及び８に示されるヌクレオチド配列のように、ルシフェラーゼをコードするヌクレオチド配列が既知の場合には、該ヌクレオチド配列を人工的に合成してもよい。このような人工遺伝子合成サービスは、例えば、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から提供されている。
【0039】
（ルシフェラーゼ遺伝子の作製方法）
ルシフェラーゼ遺伝子の変異処理は、企図する変異形態に応じた、公知の任意の方法で行うことができる。すなわち、ルシフェラーゼ遺伝子又は当該遺伝子の組み込まれた組換え体ＤＮＡと変異原となる薬剤とを接触、作用させる方法；紫外線照射法；遺伝子工学的手法；又は蛋白質工学的手法を駆使する方法等を広く用いることができる。
ルシフェラーゼ遺伝子の変異処理は、企図する変異形態に応じた、公知の任意の方法で行うことができる。すなわち、ルシフェラーゼ遺伝子又は当該遺伝子の組み込まれた組換え体ＤＮＡと変異原となる薬剤とを接触、作用させる方法；紫外線照射法；遺伝子工学的手法；又は蛋白質工学的手法を駆使する方法等を広く用いることができる。
【0040】
上記変異処理に用いられる変異原となる薬剤としては、例えば、ヒドロキシルアミン、Ｎ－メチル－Ｎ’－ニトロ－Ｎ－ニトロソグアニジン、亜硝酸、亜硫酸、ヒドラジン、蟻酸、若しくは５－ブロモウラシル等を挙げることができる。
【0041】
この接触、作用の諸条件は、用いる薬剤の種類等に応じた条件を採ることが可能であり、現実に所望の変異をルシフェラーゼ遺伝子において惹起することができる限り特に限定されない。通常、好ましくは０．５～１２Ｍの上記薬剤濃度において、２０～８０℃の反応温度下で１０分間以上、好ましくは１０～１８０分間接触、作用させることで、所望の変異を惹起可能である。紫外線照射を行う場合においても、上記の通り常法に従い行うことができる（現代化学、０２４～３０、１９８９年６月号）。
【0042】
蛋白質工学的手法を駆使する方法としては、一般的に、Ｓｉｔｅ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓとして知られる手法を用いることができる。例えば、Ｋｒａｍｅｒ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １２， ９４４１ （１９８４）： Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， １５４， ３５０ （１９８７）： Ｇｅｎｅ， ３７， ７３ （１９８５））、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １３， ８７４９ （１９８５）： Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １３， ８７６５ （１９８５）： Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ， １４， ９６７９ （１９８６））、Ｋｕｎｋｅｌ法（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃｉｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ８２， ４８８ （１９８５）： Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， １５４， ３６７ （１９８７））等が挙げられる。また、Ｓｉｔｅ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓは市販のキット、例えば、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を利用して実施することもできる。
【0043】
また、一般的なＰＣＲ法として知られる手法を用いることもできる（Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ， １， １１（１９８９）参照）。なお、上記遺伝子改変法の他に、有機合成法又は酵素合成法により、直接所望の改変ルシフェラーゼ遺伝子を合成することもできる。
【0044】
上記方法により得られるルシフェラーゼ遺伝子のＤＮＡ塩基配列の決定若しくは確認を行う場合には、例えば、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３１３０ｘｌジェネティックアナライザ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）等を用いることにより行うことができる。
【0045】
（ベクター、宿主細胞）
一態様において、本発明は、上記ポリヌクレオチドを含むベクターに関する。これらのルシフェラーゼ遺伝子は、常法に従って各種ベクターに連結されていることが、取扱い上好ましい。本発明において用いることのできるベクターとしてはプラスミドが挙げられるが、それ以外の、例えば、バクテリオファージ、コスミド等の当業者に公知の任意のベクターを用いることができる。ベクターの種類は宿主細胞に応じて選択することができ、具体的には、例えばｐＥＴ１６－ｂ又はｐＫＫ２２３－３等が好ましい。
一態様において、本発明は、上記ポリヌクレオチドを含むベクターに関する。これらのルシフェラーゼ遺伝子は、常法に従って各種ベクターに連結されていることが、取扱い上好ましい。本発明において用いることのできるベクターとしてはプラスミドが挙げられるが、それ以外の、例えば、バクテリオファージ、コスミド等の当業者に公知の任意のベクターを用いることができる。ベクターの種類は宿主細胞に応じて選択することができ、具体的には、例えばｐＥＴ１６－ｂ又はｐＫＫ２２３－３等が好ましい。
【0046】
一態様において、本発明は、上記ポリヌクレオチド又はベクターを含む宿主細胞に関する。宿主細胞は、限定されないが、大腸菌や枯草菌等の細菌、酵母細胞、昆虫細胞、動物細胞（例えば、哺乳動物細胞）、及び植物細胞等であり、好ましくは大腸菌等の細菌細胞である。
【0047】
（形質転換及び形質導入）
上述のように得られたルシフェラーゼ遺伝子を、常法により、バクテリオファージ、コスミド、又は原核細胞若しくは真核細胞の形質転換に用いられるプラスミド等のベクターに組み込み、各々のベクターに対応する宿主を常法により、形質転換又は形質導入をすることができる。例えば、宿主として、エッシェリシア属に属する微生物、例えば得られた組換え体ＤＮＡを用いて、例えば、大腸菌Ｋ－１２株、又は大腸菌Ｂ株、好ましくは大腸菌ＪＭ１０９株、大腸菌ＤＨ５α株、大腸菌ＢＬ２１株、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（ともにタカラバイオ社製）等を形質転換又はそれらに形質導入してそれぞれの菌株を得ることができる。
上述のように得られたルシフェラーゼ遺伝子を、常法により、バクテリオファージ、コスミド、又は原核細胞若しくは真核細胞の形質転換に用いられるプラスミド等のベクターに組み込み、各々のベクターに対応する宿主を常法により、形質転換又は形質導入をすることができる。例えば、宿主として、エッシェリシア属に属する微生物、例えば得られた組換え体ＤＮＡを用いて、例えば、大腸菌Ｋ－１２株、又は大腸菌Ｂ株、好ましくは大腸菌ＪＭ１０９株、大腸菌ＤＨ５α株、大腸菌ＢＬ２１株、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（ともにタカラバイオ社製）等を形質転換又はそれらに形質導入してそれぞれの菌株を得ることができる。
【0048】
（ルシフェラーゼ変異体の生産方法）
一態様において、本発明は、上記宿主細胞を培養する工程を含む、熱安定性が改善されたルシフェラーゼ変異体の生産方法に関する。培養は各種公知の方法で行うことができ、固体培養法でもよいが、好ましくは液体培養法により培養する。
一態様において、本発明は、上記宿主細胞を培養する工程を含む、熱安定性が改善されたルシフェラーゼ変異体の生産方法に関する。培養は各種公知の方法で行うことができ、固体培養法でもよいが、好ましくは液体培養法により培養する。
【0049】
本発明の方法は、上記宿主細胞を、ルシフェラーゼタンパク質を発現しうる条件下で培養する工程、及び任意に培養物又は培養液からルシフェラーゼを単離する工程を含んでよい。ここでルシフェラーゼタンパク質を発現しうる条件とは、ルシフェラーゼ遺伝子が転写、翻訳され、当該遺伝子によりコードされるポリペプチドが産生されることをいう。
【0050】
一実施形態において、本発明の方法は、培養工程前に、ルシフェラーゼタンパク質の配列番号１の３９３位に対応する位置の変異を、人為的に導入することを含む。これは、ルシフェラーゼをコードする遺伝子の配列に変異を人為的に導入することによりなされ得る。
【0051】
また、上記宿主細胞を培養する培地としては、例えば、酵母エキス、トリプトン、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー又は大豆若しくは小麦ふすまの浸出液等の１種以上の窒素源に、塩化ナトリウム、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄又は硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加し、さらに必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添加したものが用いられる。
【0052】
培地の初発ｐＨは、ｐＨ７～９に調整するのが適当である。培養は、２０～４２℃の培養温度、好ましくは２５～３７℃前後の培養温度で４～２４時間、さらに好ましくは２５～３７℃前後の培養温度で８～１６時間、通気攪拌深部培養、振盪培養、静置培養等により実施するのが好ましい。
【0053】
培養終了後、該培養物よりルシフェラーゼを採取するには、通常の酵素採取手段を用いて得ることができる。例えば、常法により菌体を、超音波破壊処理、磨砕処理等するか、又はリゾチーム等の溶菌酵素を用いて本酵素を抽出するか、又はトルエン等の存在下で振盪若しくは放置して溶菌を行わせ、本酵素を菌体外に排出させることができる。そして、この溶液を濾過、遠心分離等して固形部分を除去し、必要によりストレプトマイシン硫酸塩、プロタミン硫酸塩、若しくは硫酸マンガン等により核酸を除去したのち、これに硫安、アルコール、アセトン等を添加して分画し、沈澱物を採取し、ルシフェラーゼの粗酵素を得る。
【0054】
上記ルシフェラーゼの粗酵素よりさらにルシフェラーゼ精製酵素を得るには、例えば、セファデックス、スーパーデックス若しくはウルトロゲル等を用いるゲル濾過法、イオン交換性担体、疎水性担体、ヒドロキシアパタイトを用いる吸着溶出法、ポリアクリルアミドゲル等を用いる電気泳動法、蔗糖密度勾配遠心法等の沈降法、アフィニティクロマトグラフィー法、分子ふるい膜若しくは中空糸膜等を用いる分画法等を適宜選択し、又はこれらを組み合わせて実施することにより、精製されたルシフェラーゼ酵素を得ることができる。このようにして、所望のルシフェラーゼを得ることができる。
【0055】
本発明の方法により生産されたルシフェラーゼは本明細書に記載のキット、又はＡＴＰ、ＡＤＰ、及びＡＭＰの少なくとも一つを検出するための方法において使用することができる。
【0056】
（ＡＴＰ、ＡＤＰ、及びＡＭＰの少なくとも一つを検出するためのキット）
一態様において、本発明は、本明細書に記載のルシフェラーゼ変異体を含む、ＡＴＰ、ＡＤＰ、及びＡＭＰの少なくとも一つを検出するためのキットに関する。本発明のキットは、ルシフェラーゼ変異体に加えて、ルシフェリンを含んでよい。この場合、マグネシウム、マンガン、カルシウムなどの金属イオンもキットに含まれうる。当業者であれば用いる酵素に応じて金属イオンの濃度を決定することができる。ルシフェラーゼによりＡＴＰ、Ｏ２及びルシフェリンはＡＭＰ、ピロリン酸、ＣＯ２及びオキシルシフェリンに変換され、このとき発光がもたらされる。このとき生じる反応は、以下の通り表される。
一態様において、本発明は、本明細書に記載のルシフェラーゼ変異体を含む、ＡＴＰ、ＡＤＰ、及びＡＭＰの少なくとも一つを検出するためのキットに関する。本発明のキットは、ルシフェラーゼ変異体に加えて、ルシフェリンを含んでよい。この場合、マグネシウム、マンガン、カルシウムなどの金属イオンもキットに含まれうる。当業者であれば用いる酵素に応じて金属イオンの濃度を決定することができる。ルシフェラーゼによりＡＴＰ、Ｏ２及びルシフェリンはＡＭＰ、ピロリン酸、ＣＯ２及びオキシルシフェリンに変換され、このとき発光がもたらされる。このとき生じる反応は、以下の通り表される。
【0057】
ルシフェリン＋ＡＴＰ＋Ｏ２→オキシルシフェリン＋アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）＋ピロリン酸（ＰＰｉ）＋ＣＯ２＋光
【0058】
一実施形態において、本発明のキットは、ＡＤＰからＡＴＰを生成する反応を触媒する酵素をさらに含む。該ＡＤＰからＡＴＰを生成する反応を触媒する酵素は、ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）、酢酸キナーゼ（ＡＫ）、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）、ポリリン酸キナーゼ（ＰＰＫ）、ヘキソキナーゼ、グルコキナーゼ、グリセロールキナーゼ、フルクトキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、リボフラビンキナーゼ、及びフルクトースビスホスファターゼからなる群より選択され得る。別の実施形態において、本発明のキットはさらにピルベートオルトホスフェートジキナーゼ（ＰＰＤＫ）、アデニル酸キナーゼ（ＡＤＫ）又はピルビン酸ウォータージキナーゼ（ＰＷＤＫ）を含む。
【0059】
試料にＡＴＰが含まれると、これはルシフェラーゼによりＡＭＰに変換されるとともに発光が生じる。ＡＤＰからＡＴＰを生成する反応を触媒する酵素が存在する系において試料にＡＤＰが含まれると、該酵素によりＡＤＰがＡＴＰに変換され、その後ＡＴＰが発光反応に供される。これにより系に存在するＡＴＰ及びＡＤＰの総量を測定することができる。さらにＰＰＤＫが存在する系において、試料にＡＭＰが含まれると、これはＰＰＤＫ、ＰＥＰ、ＰＰｉによりＡＴＰに変換される。あるいは、ＰＷＤＫが存在する系において、試料にＡＭＰが含まれると、これはＰＷＤＫ、ＰＥＰ、リン酸によりＡＴＰに変換される。生成したＡＴＰは再度、ルシフェラーゼにより発光する。発光は安定して維持され、発光量は系に存在するＡＴＰ及びＡＭＰの総量と相関することから、ＡＴＰ及びＡＭＰの定量が可能となる。ＡＤＰからＡＴＰを生成する反応を触媒する酵素とＰＰＤＫ、ＡＤＫ又はＰＷＤＫが存在すると、ＡＴＰ、ＡＤＰ及びＡＭＰの総量を測定することができる。
【0060】
ルシフェリンは、用いるルシフェラーゼにより基質として認識されるものであればどのようなものでもよく、天然のもの又は化学合成されたものでもよい。また任意の公知のルシフェリン誘導体を用いることもできる。ルシフェリンの基本骨格はイミダゾピラジノンであり、多くの互変異性体がある。ルシフェリンとしては、ホタルルシフェリンが挙げられる。ホタルルシフェリンはホタルルシフェラーゼ（ＥＣ １．１３．１２．７）の基質である。ルシフェリン誘導体は特開２００７－９１６９５号公報、特表２０１０－５２３１４９号公報（国際公開２００８／１２７６７７号）等に記載されているものであり得る。
【0061】
本発明のキットには、上記成分に加え、安定化剤、バッファー、及び説明書の少なくとも一つを含んでもよい。
【0062】
（ＡＴＰ、ＡＤＰ、及びＡＭＰの少なくとも一つを検出するための方法）
一態様において、本発明は、本明細書に記載のルシフェラーゼ変異体を使用することを含む、ＡＴＰ、ＡＤＰ、及びＡＭＰの少なくとも一つを検出する方法に関する。本方法は、本明細書に記載のルシフェラーゼ変異体を用いてルシフェリンの酸化反応を触媒する工程、及び該酸化反応により生じる発光を測定する工程を含んでよい。
一態様において、本発明は、本明細書に記載のルシフェラーゼ変異体を使用することを含む、ＡＴＰ、ＡＤＰ、及びＡＭＰの少なくとも一つを検出する方法に関する。本方法は、本明細書に記載のルシフェラーゼ変異体を用いてルシフェリンの酸化反応を触媒する工程、及び該酸化反応により生じる発光を測定する工程を含んでよい。
【0063】
ルシフェラーゼ変異体によるルシフェリンの酸化反応の触媒については、「ＡＴＰ、ＡＤＰ、及びＡＭＰの少なくとも一つを検出するためのキット」において記載した通りである。本明細書に記載のルシフェラーゼ変異体及びルシフェリンと試料を反応させることにより行うことができる。試料にＡＴＰが含まれると、これはルシフェラーゼによりＡＭＰに変換されるとともに発光が生じるためＡＴＰを測定することができる。ＡＤＰからＡＴＰを生成する反応を触媒する酵素が存在する系では系に存在するＡＴＰ及びＡＤＰの総量を測定することができる。また、ＰＰＤＫ又はＰＷＤＫが存在する系においては、ＡＴＰ及びＡＭＰの定量が可能となる。ＡＤＰからＡＴＰを生成する反応を触媒する酵素とＰＰＤＫ、ＡＤＫ又はＰＷＤＫが存在すると、ＡＴＰ、ＡＤＰ及びＡＭＰの総量を測定することができる。
【0064】
ルシフェラーゼの発光量の測定は、公知の方法により行うことができ、例えば適当な発光測定装置、例えば、ルミノメーター（ベルトールド社製、ＣｅｎｔｒｏＬＢ９６０又はＬｕｍａｔ３ ＬＢ９５０８、キッコーマンバイオケミファ社製、ルミテスターＣ－１１０、ルミテスターＣ－１００、ルミテスターＰＤ－２０、ルミテスターＰＤ－３０等）を用いて得られる相対発光強度（ＲＬＵ）を指標に評価することができる。通常、ルシフェリンからオキシルシフェリンへの変換の際に生じる発光を測定する。発光測定装置としては、高感度測定が可能であり、光電子増倍管を備えた装置（３Ｍ社製等）やフォトダイオードを備えた装置（Ｈｙｇｉｅｎａ社、Ｎｅｏｇｅｎ社製等）を使用することもできる。
【0065】
以下、実施例を参照して本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲は、それらの例により何ら限定されるものではない。
【実施例】
【0066】
＜実施例１：ヘイケボタルルシフェラーゼの変異体の耐熱性試験＞
（材料と方法）
ベクター構築
ｐＥＴ１６－ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＭＣＳ(マルチクローニングサイト、Ｎｄｅ１－ＢａｍＨ１サイト)に、ＨＬＫ（野生型ヘイケボタルルシフェラーゼ（配列番号１）に熱安定性向上のためのＡ２１７Ｌ、及びＥ４９０Ｋ変異を導入したもの（アミノ酸配列：配列番号９、ヌクレオチド配列：配列番号１０）の遺伝子配列が挿入されたプラスミド（ＨＬＫ ｐＥＴ－１６ｂ）をテンプレートとし、各変異体をコードする配列を増幅するためのプライマーを用いたＰＣＲにより、Ｃ３９３位のシステインを各種アミノ酸に置換した各変異体をコードするプラスミドベクターを作製した。
（材料と方法）
ベクター構築
ｐＥＴ１６－ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＭＣＳ(マルチクローニングサイト、Ｎｄｅ１－ＢａｍＨ１サイト)に、ＨＬＫ（野生型ヘイケボタルルシフェラーゼ（配列番号１）に熱安定性向上のためのＡ２１７Ｌ、及びＥ４９０Ｋ変異を導入したもの（アミノ酸配列：配列番号９、ヌクレオチド配列：配列番号１０）の遺伝子配列が挿入されたプラスミド（ＨＬＫ ｐＥＴ－１６ｂ）をテンプレートとし、各変異体をコードする配列を増幅するためのプライマーを用いたＰＣＲにより、Ｃ３９３位のシステインを各種アミノ酸に置換した各変異体をコードするプラスミドベクターを作製した。
【0067】
各プラスミドベクターを作製するために用いたリバースプライマーの配列は共通であり、配列番号１１（AACTTCTCCACGTCTGTTCGGGCCCAAAG）である。393位に各アミノ酸を含むルシフェラーゼをコードするプラスミドベクターを作製するために用いた各フォワードプライマーの配列及び配列番号を以下の表に示す。
【0068】
【表1】
【0069】
続いて、１０×ＫＯＤ ｐｌｕｓ ｂｕｆｆｅｒ（東洋紡） ２．０μｌ、２ｍＭ ｄＮＴＰｓ ２．０μｌ、２５ｍＭ ＭｇＳＯ４ １．２μｌ、２μＭ ｐｒｉｍｅｒ Ｆｗ ３．０μｌ、２μＭ ｐｒｉｍｅｒ Ｒｖ ３．０μｌ、ＫＯＤ－ｐｌｕｓ－Ｎｅｏ（東洋紡） ０．４μｌ、４０μｇ／ｍｌ ＨＬＫ ｐＥＴ１６－ｂ ０．５μｌ、ｄＨ２Ｏ ７．９μｌを混合して合計２０μｌの溶液とし、これをＰＣＲ反応に供した。ＰＣＲ反応は、９４℃で２分加熱後、９４℃１５秒、５５℃３０秒、６８℃３分のサイクルを１４回繰り返すことによって行い、反応後は１５℃で放置した。
【0070】
形質転換
上記で得られたＰＣＲ産物に、制限酵素ＤｐｎＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｊａｐａｎ）を１μｌ添加して３７℃で１時間インキュベートし、反応産物を形質転換に用いた。
上記で得られたＰＣＲ産物に、制限酵素ＤｐｎＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｊａｐａｎ）を１μｌ添加して３７℃で１時間インキュベートし、反応産物を形質転換に用いた。
【0071】
氷上でコンピテントセル（ＥＣＯＳＴＭ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３））（株式会社ニッポンジーン）３０μｌを融解し、直ちに３μｌの上記反応産物を添加した。タッピング後、５分間氷上に置き、続いて４２℃で３０秒間加温した。加温後、タッピングし、全量をＬＢ（Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ）＋Ａｍｐ（アンピシリン）プレートにまき、３７℃で終夜培養しコロニーを形成させた。
【0072】
耐熱性変異体の調製
上記で得たコロニーを終濃度が５０μｇ／ｍｌとなるようにＡｍｐを添加した２ｍｌのＬＢ培地において終夜振盪培養（レシプロ）した。続いて、終濃度が５０μｇ／ｍｌとなるようにＡｍｐを添加した２ｍｌのＬＢ培地に上記培養液を２μｌ添加し、２８℃で２２時間振盪培養（レシプロ）し、振盪開始時に終濃度が０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧ（イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド）を添加して発現誘導を行った。
上記で得たコロニーを終濃度が５０μｇ／ｍｌとなるようにＡｍｐを添加した２ｍｌのＬＢ培地において終夜振盪培養（レシプロ）した。続いて、終濃度が５０μｇ／ｍｌとなるようにＡｍｐを添加した２ｍｌのＬＢ培地に上記培養液を２μｌ添加し、２８℃で２２時間振盪培養（レシプロ）し、振盪開始時に終濃度が０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧ（イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド）を添加して発現誘導を行った。
【0073】
集菌した後、１ｍｌのルシフェラーゼｂｕｆｆｅｒ（５％トレハロース、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、４．４ｍＭ コハク酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ（ｐＨ７．６））に懸濁した。ソニケーター ａｓｔｒａｓｏｎ ＵＬＴＲＡＳＯＮＩＣ ＰＲＯＣＥＳＳＯＲ ＸＬ（Ｍｉｓｏｎｉｘ社製）を用いて菌体破砕（１０ｓ ｐｕｌｓｅ、２０ｓ ｒｅｓｔ、ｔｏｔａｌ ｐｕｌｓｅ １ｍｉｎ）を行った。遠心して得た上清を０．４５μｍ又は０．２０μｍのＰＶＤＦ膜で濾過し、粗酵素液とした。
【0074】
評価の際のコントロールとして、Ａ２１７Ｌ、及びＥ４９０Ｋ変異を導入したＨＬＫ（配列番号９）は、特開平８－９８６８０号公報に記載の方法に従って発現し、予め精製済のものを使用した。
【0075】
熱安定性試験
調製した酵素を３７℃で保存する前に、冷蔵から室温に戻すため、２５℃で５分間プレインキュベートした。続いて、ウォーターバスを用いて酵素を３７℃で９０分間保存し、希釈ｂｕｆｆｅｒ（５００ｍｌあたり、４．４８ｇ Ｔｒｉｃｉｎｅ、１８５ｍｇ ＥＤＴＡ・Ｎａ２・２Ｈ２Ｏ、２５ｇ ｇｌｙｃｅｒｏｌ、５ｇ ＢＳＡ（ｐＨ７．８））を使用して、必要に応じて希釈し、ルミテスターＣ－１１０の測定範囲内に収まるように酵素を調製した。調製した粗酵素液１００μｌ又は精製済みのＨＬＫ１００μｌを、以下に示す発光試薬１００μｌと等量混和して、ルミテスターＣ－１１０（キッコーマンバイオケミファ社製）を使用して発光量を測定した。
調製した酵素を３７℃で保存する前に、冷蔵から室温に戻すため、２５℃で５分間プレインキュベートした。続いて、ウォーターバスを用いて酵素を３７℃で９０分間保存し、希釈ｂｕｆｆｅｒ（５００ｍｌあたり、４．４８ｇ Ｔｒｉｃｉｎｅ、１８５ｍｇ ＥＤＴＡ・Ｎａ２・２Ｈ２Ｏ、２５ｇ ｇｌｙｃｅｒｏｌ、５ｇ ＢＳＡ（ｐＨ７．８））を使用して、必要に応じて希釈し、ルミテスターＣ－１１０の測定範囲内に収まるように酵素を調製した。調製した粗酵素液１００μｌ又は精製済みのＨＬＫ１００μｌを、以下に示す発光試薬１００μｌと等量混和して、ルミテスターＣ－１１０（キッコーマンバイオケミファ社製）を使用して発光量を測定した。
【0076】
発光試薬として、２．０ｍｌ ５０ｍＭ Ｔｒｉｃｉｎｅ－ＮａＯＨ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．８）、０．５ｍｌ ４０ｍＭ ＡＴＰ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、２．０ｍｌ ５．０ｍＭ Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ、及び０．５ｍｌ ０．１Ｍ ＭｇＳＯ４を混合した溶液を用いた。
【0077】
測定条件は以下の通りである。
測定開始時間：発光試薬を酵素液に添加してから１０秒後
測定時間：積算で１０秒間
測定開始時間：発光試薬を酵素液に添加してから１０秒後
測定時間：積算で１０秒間
【0078】
（結果）
各ルシフェラーゼについて、３回の試験を行って測定値の平均値を求め、３７℃保管時間０分のときの値を１とした場合の、３７℃保管時間９０分での相対値、及び変異なしの場合の９０分後の残存活性を1とした場合の各変異体の残存活性比（９０分後残存活性比）を以下の表に示す(表２)。
各ルシフェラーゼについて、３回の試験を行って測定値の平均値を求め、３７℃保管時間０分のときの値を１とした場合の、３７℃保管時間９０分での相対値、及び変異なしの場合の９０分後の残存活性を1とした場合の各変異体の残存活性比（９０分後残存活性比）を以下の表に示す(表２)。
【0079】
【表2】
【0080】
表２に示される通り、Ｃ３９３を酸性アミノ酸（Ｅ、Ｄ）以外のアミノ酸に置換した場合、耐熱性の向上が見られ、特にＧ（グリシン）、Ｓ（セリン）、Ｙ（チロシン）、Ｗ（トリプトファン）、Ｑ（グルタミン）、Ｆ（フェニルアラニン）、Ａ（アラニン）、Ｍ（メチオニン）、Ｈ（ヒスチジン）、Ｉ（イソロイシン）、Ｖ（バリン）、Ｐ（プロリン）、又はＬ（ロイシン）で置換した場合には、耐熱性向上の効果が著しかった。
【0081】
上記試験系において、コントロールとして使用しているＨＬＫはＨｉｓタグを含まない精製酵素、Ｃ３９３変異体は配列のＮ末端にＨｉｓタグを１０個含む粗精製の酵素である。そこで、Ｈｉｓタグ及び精製の有無で熱安定性が変化しないことを確認するため、ＨＬＫの精製酵素、Ｎ末端にＨｉｓタグを１０個含む精製又は粗精製のＨＬＫを上記と同様の方法で調製し、その耐熱性を、４２℃で３０分又は６０分加温し試験した。その結果、ＨＬＫの精製酵素、Ｈｉｓタグを含むＨＬＫの精製酵素、Ｈｉｓタグを含むＨＬＫの粗精製酵素の３つにおいて安定性に差がなかったことから、Ｈｉｓタグの有無及び精製の有無は熱安定性に影響しないと考えられた（データ示さず）。
【0082】
＜実施例２：他のホタルルシフェラーゼの変異体の耐熱性試験＞
（材料と方法）
野生型北米産ホタルルシフェラーゼ（アミノ酸配列：配列番号５、ヌクレオチド配列：配列番号６）の遺伝子配列をｐＥＴ１６－ｂのＭＣＳサイト（Ｎｄｅ１－ＢａｍＨ１サイト）に導入した。得られたプラスミドは、Ｐｐｙ ｐＥＴ１６－ｂとした。
（材料と方法）
野生型北米産ホタルルシフェラーゼ（アミノ酸配列：配列番号５、ヌクレオチド配列：配列番号６）の遺伝子配列をｐＥＴ１６－ｂのＭＣＳサイト（Ｎｄｅ１－ＢａｍＨ１サイト）に導入した。得られたプラスミドは、Ｐｐｙ ｐＥＴ１６－ｂとした。
【0083】
また、野生型ゲンジボタルルシフェラーゼ（アミノ酸配列：配列番号３、ヌクレオチド配列：配列番号４）にＴ２１７Ｉ変異を導入したもの、及び野生型フォツリス・ペンシルバニカルシフェラーゼ（アミノ酸配列：配列番号７、ヌクレオチド配列：配列番号８）にＴ２４９Ｍ変異を導入したものの遺伝子配列を、ｐＫＫ２２３－３のＭＣＳサイト（ＥｃｏＲ１－ＨｉｎｄIIIサイト）に導入した。得られたプラスミドは、それぞれＬｕｃＴ ｐＫＫ２２３－３、及びＰｐｅＴ２４９Ｍ ｐＫＫ２２３－３とした。なお、ゲンジボタルルシフェラーゼをコードする遺伝子としては、配列番号４のヌクレオチド配列を、Ｔ２１７Ｉ変異が含まれるよう変異を導入し、Ｈｉｓタグ（６個のＨｉｓ）をコードする配列を終止コドンの直前に付加した配列番号７４のヌクレオチド配列を用いた。フォツリス・ペンシルバニカルシフェラーゼをコードする遺伝子としては、配列番号８のヌクレオチド配列をコドン最適化し、Ｔ２４９Ｍ変異が含まれるよう変異を導入し、かつＨｉｓタグ（６個のＨｉｓ）をコードする配列を終止コドンの直前に付加した配列番号３１のヌクレオチド配列を用いた。
【0084】
ＬｕｃＴ ｐＫＫ２２３－３、ＰｐｅＴ２４９Ｍ ｐＫＫ２２３－３、及びＰｐｙ ｐＥＴ１６－ｂを用いて、ゲンジボタルルシフェラーゼのＣ３９３位、フォツリス・ペンシルバニカルシフェラーゼのＹ３９０位、及び北米産ホタルルシフェラーゼのＣ３９１位を各種アミノ酸に置換した各変異体をコードするプラスミドベクターを、以下のプライマーを用いて、実施例１に従ってそれぞれ作製した。
【0085】
ゲンジボタルルシフェラーゼの３９３位に各アミノ酸を含むルシフェラーゼをコードするプラスミドベクターを作製するために用いたリバースプライマーの配列は共通（配列番号３２（AACTTCTCCACGTCTGTTAGGACCTAAAG））であり、各フォワードプライマーの配列及び配列番号を以下の表に示す。
【表3】
【0086】
フォツリス・ペンシルバニカルシフェラーゼの３９０位に各アミノ酸を含むルシフェラーゼをコードするプラスミドベクターを作製するために用いたリバースプライマーの配列は、３９０位にアスパラギン酸を導入する場合以外は共通（配列番号５２（CAGTTCACCGGTTTCGTTCGGGCCCAGG））である。各フォワードプライマー、及び３９０位にアスパラギン酸を導入する場合のリバースプライマーの配列、及び配列番号を以下の表に示す。
【表4】
【0087】
北米産ホタルルシフェラーゼの３９１位にトリプトファンを導入したプラスミドベクターを作製するために用いたフォワードプライマーの配列は配列番号７２（CAGAGAGGCGAATTATGGGTCAGAGGACC）であり、リバースプライマーの配列は配列番号７３（TAATTCGCCTCTCTGATTAACGCCCAGCG）である。
【0088】
ベクター構築の詳細、形質転換、及び耐熱性変異体の調製は実施例１に従った。
【0089】
熱安定性試験も実施例１に従ったが、以下の変更を加えた。ウォーターバスによる加温時間、ゲンジボタルルシフェラーゼでは９０分、フォツリス・ペンシルバニカルシフェラーゼでは５分、北米産ホタルルシフェラーゼでは２０分とした。また、コントロールとして、ゲンジボタルルシフェラーゼについては野生型ゲンジボタルルシフェラーゼにＴ２１７Ｉ変異を導入したもの（ＬｕｃＴ）を、フォツリス・ペンシルバニカルシフェラーゼについては野生型フォツリス・ペンシルバニカルシフェラーゼにＴ２４９Ｍ変異を導入したもの（ＰｐｅＴ２４９Ｍ）を、北米産ホタルルシフェラーゼについては野生型北米産ホタルルシフェラーゼ（Ｐｐｙ）を用いた。これらのコントロールの調製方法は、上記と同様である。なお、Ｔ２１７ＩとＴ２４９Ｍはいずれも耐熱性を向上させる既知の変異である。
【0090】
（結果）
ゲンジボタルルシフェラーゼについて、３回の試験を行って測定値の平均値を求め、３７℃保管時間０分のときの値を１とした場合の、３７℃保管時間９０分での相対値、及び変異なしの場合の９０分後の残存活性を1とした場合の各変異体の残存活性比（９０分後残存活性比）を以下の表に示す。
ゲンジボタルルシフェラーゼについて、３回の試験を行って測定値の平均値を求め、３７℃保管時間０分のときの値を１とした場合の、３７℃保管時間９０分での相対値、及び変異なしの場合の９０分後の残存活性を1とした場合の各変異体の残存活性比（９０分後残存活性比）を以下の表に示す。
【表5】
【0091】
フォツリス・ペンシルバニカルシフェラーゼについて、３回の試験を行って測定値の平均値を求め、３７℃保管時間０分のときの値を１とした場合の、３７℃保管時間５分での相対値、及び変異なしの場合の５分後の残存活性を1とした場合の各変異体の残存活性比（５分後残存活性比）を以下の表に示す。
【表6】
【0092】
北米産ホタルルシフェラーゼについて、３回の試験を行って測定値の平均値を求め、３７℃保管時間０分のときの値を１とした場合の、３７℃保管時間２０分での相対値、及び変異なしの場合の２０分後の残存活性を1とした場合の各変異体の残存活性比（２０分後残存活性比）を以下の表に示す。
【表7】
【0093】
表５～７に示される通り、ゲンジボタルルシフェラーゼ、フォツリス・ペンシルバニカルシフェラーゼ、及び北米産ホタルルシフェラーゼについても、配列番号１の３９３位に対応する位置のアミノ酸残基を置換した場合に、耐熱性が向上し得ることが示された。
【0094】
ゲンジボタルルシフェラーゼで耐熱性向上の効果が特に著しかったのは、３９３位をアスパラギン、アラニン、セリン、アルギニン、ロイシン、トレオニン、ヒスチジン、バリン（残存活性７０％以上）；又はフェニルアラニン、グリシン、トリプトファン、チロシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、グルタミン（残存活性６０％以上）に置換した場合であった。
【0095】
フォツリス・ペンシルバニカルシフェラーゼで耐熱性向上の効果が特に著しかったのは、３９０位をプロリン、アスパラギン、アルギニン、グリシン、セリン、リシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、グルタミン、トレオニン（残存活性９０％以上）；グルタミン酸、イソロイシン、アラニン（残存活性８０％以上）；又はバリン、メチオニン、ロイシン、ヒスチジン（残存活性７０％以上）に置換した場合であった。
【0096】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
【図1-1】
【図1-2】
【配列表】