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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-04-15
(45)【発行日】2024-04-23
(54)【発明の名称】前立腺癌の診断のためのデータ取得方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/68 20180101AFI20240416BHJP
G01N 33/574 20060101ALI20240416BHJP
C12Q 1/6813 20180101ALN20240416BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20240416BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/68 ZNA
G01N33/574 Z
C12Q1/6813 Z
C12N15/12
【請求項の数】
7
(21)【出願番号】P 2020549474
(86)(22)【出願日】2019-09-27
(86)【国際出願番号】 JP2019038347
(87)【国際公開番号】W WO2020067498
(87)【国際公開日】2020-04-02
【審査請求日】2022-07-22
(31)【優先権主張番号】P 2018185127
(32)【優先日】2018-09-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】000002901
【氏名又は名称】株式会社ダイセル
(73)【特許権者】
【識別番号】504176911
【氏名又は名称】国立大学法人大阪大学
(74)【代理人】
【識別番号】110002860
【氏名又は名称】弁理士法人秀和特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】二村 圭祐
(72)【発明者】
【氏名】川村 憲彦
(72)【発明者】
【氏名】金田 安史
【審査官】飯濱 翔太郎
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２００２／０２９０９９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１３－５０７９８７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００５－０８０５２４（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１７／０９１７０６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１３／０１３０２４１（ＵＳ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１５／０３４４９６５（ＵＳ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１７／０２６８０６３（ＵＳ，Ａ１）
【文献】欧州特許出願公開第０３２１４４４４（ＥＰ，Ａ１）
【文献】Genbank Database[online]，Accession Number NM_006842.2，インターネット：<URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov，2018年09月15日，[検索日 2019.11.20]
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｑ １／００－３／００
Ｇ０１Ｎ ３３／００－３３／９８
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＳＦ３Ｂ２遺伝子の発現量を測定する工程を含む、前立腺癌の予後診断のためのデータ取得方法。
【請求項2】
ＳＦ３Ｂ２遺伝子が、（ｉ）配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡ；又は
（ｉｉ）配列番号１の塩基配列の相補配列を有するＤＮＡに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、前記配列番号１の塩基配列の相補配列と特異的に結合でき、且つ前記配列番号１の塩基配列と９０％以上の同一性を有するＤＮＡ
で表される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前立腺癌の予後診断が、去勢抵抗性の診断である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
ＳＦ３Ｂ２遺伝子の発現量を測定し得る試薬を含む、前立腺癌の予後診断用キット。
【請求項5】
ＳＦ３Ｂ２遺伝子の発現量を測定する工程を含む、去勢抵抗性前立腺癌の診断のためのデータ取得方法。
【請求項6】
ＳＦ３Ｂ２遺伝子が、（ｉ）配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡ；又は
（ｉｉ）配列番号１の塩基配列の相補配列を有するＤＮＡに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、前記配列番号１の塩基配列の相補配列と特異的に結合でき、且つ前記配列番号１の塩基配列と９０％以上の同一性を有するＤＮＡ
で表される、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
ＳＦ３Ｂ２遺伝子の発現量を測定し得る試薬を含む、去勢抵抗性前立腺癌診断用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、前立腺癌の診断のためのデータ取得方法に関する。
【背景技術】
【0002】
前立腺は、外腺（辺縁領域）及び内腺（中心領域及び移行領域）に分かれており、前立腺癌は主として外腺（辺縁領域）において発生する癌である。前立腺癌は、日本及び米国において、男性の部位別罹患者数の上位を占める癌であり、いまなお多数の患者が存在する。日本においては、前立腺癌罹患者数は８万人を超し、そのうちの約１万２千人が死亡すると予測されている（国立がん研究センターがん情報サービス「がん登録・統計」、２０１７年のがん統計予測）。
【0003】
前立腺癌の治療は、外科的治療、放射線治療、化学療法、内分泌療法（ホルモン療法）等がある。これらのうち内分泌療法は、前立腺癌の進行を促進する役割のあるアンドロゲンの分泌を抑制したり、アンドロゲンの機能を阻害したりすることにより、前立腺癌の進行を抑制する治療法である。
しかしながら、内分泌療法の問題点として、長期間の治療によって、内分泌療法で用いられる薬剤に対して抵抗性を有するようになり、内分泌療法による治療効果が低減することがある。このように内分泌療法に対しての抵抗性を有するようになった結果、再び前立腺癌の症状が悪化した前立腺癌を去勢抵抗性前立腺癌という。
しかしながら、内分泌療法の問題点として、長期間の治療によって、内分泌療法で用いられる薬剤に対して抵抗性を有するようになり、内分泌療法による治療効果が低減することがある。このように内分泌療法に対しての抵抗性を有するようになった結果、再び前立腺癌の症状が悪化した前立腺癌を去勢抵抗性前立腺癌という。
【0004】
去勢抵抗性前立腺癌メカニズムには、アンドロゲン受容体（ＡＲ）が関与していることがわかっている（非特許文献１）さらに、ＡＲバリアントの１つであるＡＲ－Ｖ７が、リガンド非依存性に、転写因子として活性化状態にあることによって、去勢状態でも前立腺癌の増殖を促すことができることがわかっている（非特許文献２、３）。
ここで、完全長のＡＲ遺伝子（ＡＲ－ＦＬ）は、８つのエクソンを有する構造である。一方で、そのバリアントであるＡＲ－Ｖ７は、エクソン１～３及び潜在性エクソンであるＣＥ３しか有さず、リガンド結合部位を有さない構造である。そのため、リガンド非依存性に転写因子として活性を有することができるのである。すなわち、ＡＲ－Ｖ７の発現量を低下させることが去勢抵抗性前立腺癌の治療につながると考えられている。
ここで、完全長のＡＲ遺伝子（ＡＲ－ＦＬ）は、８つのエクソンを有する構造である。一方で、そのバリアントであるＡＲ－Ｖ７は、エクソン１～３及び潜在性エクソンであるＣＥ３しか有さず、リガンド結合部位を有さない構造である。そのため、リガンド非依存性に転写因子として活性を有することができるのである。すなわち、ＡＲ－Ｖ７の発現量を低下させることが去勢抵抗性前立腺癌の治療につながると考えられている。
【0005】
グリソン（Ｇｌｅａｓｏｎ）スコアが前立腺癌の悪性度の指標として用いられるが、グリソンスコアが８以上の高い悪性度、且つ３箇所以上の骨転移または実質臓器転移を有する、転移性内分泌療法未治療のハイリスク前立腺癌では、去勢抵抗性が早期に獲得されやすく、予後が不良であることが知られている。又は、グリソンスコアが高い場合、既に去勢抵抗性前立腺癌を発症していることも考えられる。
上記のようなハイリスク前立腺癌に対して、内分泌療法（ＡＤＴ）群、またはＡＤＴ＋アビラテロン及びプレドニゾン併用投与群の２群間でその全生存率を比較したＬＡＴＩＴＵＤＥ試験（国際共同第ＩＩＩ相試験）では、ＡＤＴ＋アビラテロン及びプレドニゾン併用投与群で有意に全生存率が改善することが明らかになっている。
ここで、アビラテロンは、シトクロムＰ４５０ １７Ａ１の阻害剤であり、腎臓及び腫瘍内のアンドロゲンを枯渇させることでＡＲシグナルを傷害する薬剤である。
また、エンザルミドはＡＲシグナル阻害剤であり、ＡＲのリガンド結合ドメインに結合することで、テストステロン等のＡＲリガンドと競合することで、ＡＲシグナルを阻害する。そのため、エンザルミドは、去勢抵抗性前立腺癌の適応薬剤として使用されている。
上記のようなハイリスク前立腺癌に対して、内分泌療法（ＡＤＴ）群、またはＡＤＴ＋アビラテロン及びプレドニゾン併用投与群の２群間でその全生存率を比較したＬＡＴＩＴＵＤＥ試験（国際共同第ＩＩＩ相試験）では、ＡＤＴ＋アビラテロン及びプレドニゾン併用投与群で有意に全生存率が改善することが明らかになっている。
ここで、アビラテロンは、シトクロムＰ４５０ １７Ａ１の阻害剤であり、腎臓及び腫瘍内のアンドロゲンを枯渇させることでＡＲシグナルを傷害する薬剤である。
また、エンザルミドはＡＲシグナル阻害剤であり、ＡＲのリガンド結合ドメインに結合することで、テストステロン等のＡＲリガンドと競合することで、ＡＲシグナルを阻害する。そのため、エンザルミドは、去勢抵抗性前立腺癌の適応薬剤として使用されている。
【0006】
しかしながら、前立腺癌の中にはアビラテロンやエンザルミドに対して初めから抵抗性を有する確率が２０～４０％あることや、アンドロゲンレセプターのスプライシングバリアントであるＡＲ－Ｖ７を発現する循環前立腺癌に対してはアビラテロンやエンザルタミドによる内分泌治療の効果が弱いことが報告されていることから（非特許文献４）、ハイリスク前立腺癌におけるアビラテロンやエンザルタミドによる内分泌治療の効果を予測する因子が必要であった。
ＡＲ－Ｖ７を発現しているか否かは、画像診断でも病理組織診断でもその判定方法が確立されておらず、アビラテロンやエンザルタミドの治療効果を予測する方法もこれまでに確立されていなかった。
ＡＲ－Ｖ７を発現しているか否かは、画像診断でも病理組織診断でもその判定方法が確立されておらず、アビラテロンやエンザルタミドの治療効果を予測する方法もこれまでに確立されていなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0007】
【文献】Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｕｒｏｌ． ２０１３；１０（２）；９０－９８
【文献】Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２００８；６８（１３）；５４６９－５４７７
【文献】Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２００９；６９（６）；２３０５－２３１３
【文献】Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ２０１４；３７１（１１）；１０２８－１０３８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明は、上記の問題点に鑑み、前立腺癌の診断のためのデータ取得方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明者らは、前述の課題を解決すべく鋭意検討した結果、ＡＲ－Ｖ７の発現を制御する遺伝子としてＳＦ３Ｂ２（ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ３Ｂ ｓｕｂｕｎｉｔ ２）遺伝子を同定し、ＳＦ３Ｂ２遺伝子の発現が前立腺癌の発症や予後と相関することを見出した。
【0010】
さらに、前立腺癌の組織中において、ＳＦ３Ｂ２が高発現をしていれば、その前立腺癌では再発率が高いことを見出した。
【0011】
ＳＦ３Ｂ２は去勢抵抗性前立腺癌で高発現することを見出した。また、限局性前立腺癌においてもＳＦ３Ｂ２の高発現はＡＲ－Ｖ７の発現と相関することを見出した。
また、マウスモデルにおいて、ＳＦ３Ｂ２を高発現する前立腺癌細胞で形成した腫瘍は増殖が亢進することを見出した。
また、マウスモデルにおいて、ＳＦ３Ｂ２を高発現する前立腺癌細胞で形成した腫瘍は増殖が亢進することを見出した。
【0012】
さらに、ＳＦ３Ｂ２の高発現によって、前立腺癌細胞においてＡＲ－Ｖ７のみならず、ＮＥＡＴ１、ＡＫＴ１などの腫瘍の増悪化に関与する遺伝子の発現が増加することも見出した。
そのため、前立腺癌組織におけるＳＦ３Ｂ２の遺伝子発現を調べることにより、腫瘍の悪性度の判定が可能になる。
以上の知見に基づき、ＳＦ３Ｂ２遺伝子を用いた前立腺癌の診断のためのデータ取得方法の発明を完成させた。
そのため、前立腺癌組織におけるＳＦ３Ｂ２の遺伝子発現を調べることにより、腫瘍の悪性度の判定が可能になる。
以上の知見に基づき、ＳＦ３Ｂ２遺伝子を用いた前立腺癌の診断のためのデータ取得方法の発明を完成させた。
【0013】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］ＳＦ３Ｂ２遺伝子の発現量を測定する工程を含む、前立腺癌の診断のためのデータ取得方法。
［２］ＳＦ３Ｂ２遺伝子が、配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡ又は配列番号１に記載する塩基配列の相補配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡで表される、［１］に記載の方法。
［３］前立腺癌の診断が前立腺癌の予後診断である、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］前立腺癌の予後診断が、去勢抵抗性の診断である、［３］に記載の方法。
［５］ＳＦ３Ｂ２遺伝子の発現量を測定し得る試薬を含む、前立腺癌診断用キット。
［１］ＳＦ３Ｂ２遺伝子の発現量を測定する工程を含む、前立腺癌の診断のためのデータ取得方法。
［２］ＳＦ３Ｂ２遺伝子が、配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡ又は配列番号１に記載する塩基配列の相補配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡで表される、［１］に記載の方法。
［３］前立腺癌の診断が前立腺癌の予後診断である、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］前立腺癌の予後診断が、去勢抵抗性の診断である、［３］に記載の方法。
［５］ＳＦ３Ｂ２遺伝子の発現量を測定し得る試薬を含む、前立腺癌診断用キット。
【発明の効果】
【0014】
本発明により、ＳＦ３Ｂ２遺伝子を用いた前立腺癌の診断のためのデータ取得が可能となり、去勢抵抗性前立腺癌に進行する症例を正確に診断できるようになる。つまり、再発のリスクのある症例をスクリーニングすることができ、このようなリスク症例をフォローすることで、前立腺癌の再発を早期に発見し、早期に治療介入することが可能になり、再発症例の生存率を高めることが期待できる。また、アビラテロンやエンザルタミドなどの薬に対して抵抗性を示す症例をスクリーニングすることが可能になり、これらの薬の効果が期待できる症例を選択することが可能になることが期待できる。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1】ＳＦ３Ｂ２遺伝子の発現レベルとグリソンスコアとの関係を示した図である。
【図2】ＳＦ３Ｂ２発現量と前立腺癌の非再発生存率との関係を示した図である。
【図3】前立腺癌細胞においてＳＦ３Ｂ２を発現させることによって、ＡＲ－Ｖ７タンパク質の発現レベルの変化を測定したウェスタンブロット図である（図面代用写真）。（Ａ）においては前立腺癌細胞ＣＷＲ２２Ｒｖ１（２２Ｒｖ１）を用い、（Ｂ）においては前立腺癌細胞ＬＮＣａＰ９５を用いた。
【発明を実施するための形態】
【0016】
本発明は、ＳＦ３Ｂ２遺伝子の発現量を測定する工程を含む、前立腺癌の診断のためのデータ取得方法を提供する。
【0017】
前立腺癌は、例えばグリソンスコアにより癌の悪性度を判断することや、ＴＮＭ分類により癌の進行度を判断することによって、病期分類される。グリソンスコアの場合は、病理画像を用いて癌細胞の組織構造を顕微鏡観察して癌の悪性度を判断することで分類することができる。また、ＴＮＭ分類の場合は、転移（リンパ節転移、遠隔転移）の有無及び程度によって病期分類される。本発明における前立腺癌は、これらの指標に基づき判断されたいずれの病期分類をも包含するものである。
ここで、ＴＮＭ分類とは、悪性腫瘍の病期分類に用いられる指標の１つであり、Ｔ因子（原発腫瘍の大きさと浸潤度の程度）、Ｎ因子（リンパ節転移の有無及び程度）、及びＭ因子（遠隔転移の有無及び程度）の３つの因子を評価することによる分類である。
また本発明において、前立腺癌は去勢抵抗性前立腺癌を包含する。去勢抵抗性前立腺癌とは、前立腺癌の内分泌療法によって一度は抑制されていた前立腺癌による症状が、長期間にわたる内分泌療法によって、内分泌療法薬に対して抵抗性を有するようになった結果、病態が再び悪化するようになった前立腺癌のことである。
ここで、ＴＮＭ分類とは、悪性腫瘍の病期分類に用いられる指標の１つであり、Ｔ因子（原発腫瘍の大きさと浸潤度の程度）、Ｎ因子（リンパ節転移の有無及び程度）、及びＭ因子（遠隔転移の有無及び程度）の３つの因子を評価することによる分類である。
また本発明において、前立腺癌は去勢抵抗性前立腺癌を包含する。去勢抵抗性前立腺癌とは、前立腺癌の内分泌療法によって一度は抑制されていた前立腺癌による症状が、長期間にわたる内分泌療法によって、内分泌療法薬に対して抵抗性を有するようになった結果、病態が再び悪化するようになった前立腺癌のことである。
【0018】
ＳＦ３Ｂ２はＡＲ－Ｖ７の正のスプライシング制御因子である。すなわち、ＳＦ３Ｂ２は、ＳＦ３Ｂ２が結合したエクソンを残しつつ、ＳＦ３Ｂ２が結合したイントロンを除去することでＡＲ－Ｖ７のスプライシングを制御する。
ＳＦ３Ｂ２遺伝子は、配列番号１に記載する塩基配列を有する遺伝子が例示される。また、ＳＦ３Ｂ２遺伝子には、ＡＲ－Ｖ７の発現を亢進させる機能を有するＳＦ３Ｂ２タンパク質をコードする限り、配列番号１に記載する塩基配列の相補配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが含まれる。ここで、ストリンジェントな条件としては、例えば、０．１×ＳＤＳ、０．１×ＳＳＣ、６８℃の条件で洗浄する条件が挙げられる。ＳＦ３Ｂ２は、ＡＲ－ＦＬのｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列に比べてＡＲ－Ｖ７のｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列に、より結合しやすく、さらにＡＲ－Ｖ７の潜在性エクソンであるＣＥ３領域に直接結合するタンパク質である。
ＳＦ３Ｂ２遺伝子は、配列番号１に記載する塩基配列を有する遺伝子が例示される。また、ＳＦ３Ｂ２遺伝子には、ＡＲ－Ｖ７の発現を亢進させる機能を有するＳＦ３Ｂ２タンパク質をコードする限り、配列番号１に記載する塩基配列の相補配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが含まれる。ここで、ストリンジェントな条件としては、例えば、０．１×ＳＤＳ、０．１×ＳＳＣ、６８℃の条件で洗浄する条件が挙げられる。ＳＦ３Ｂ２は、ＡＲ－ＦＬのｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列に比べてＡＲ－Ｖ７のｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列に、より結合しやすく、さらにＡＲ－Ｖ７の潜在性エクソンであるＣＥ３領域に直接結合するタンパク質である。
【0019】
ＳＦ３Ｂ２遺伝子の発現量を測定するとは、特に限定されることはないが、例えばｍＲＮＡ又はタンパク質の発現量を測定することである。
ＳＦ３Ｂ２遺伝子の発現量は、例えばＲＴ－ＰＣＲ法、定量ＰＣＲ法、マイクロアレイ法、ノーザンブロット法、分光光度法、蛍光光度法により測定することができ、またＳＦ３Ｂ２タンパク質の発現量を、例えばフローサイトメトリ、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡにより測定することができる。
ＳＦ３Ｂ２遺伝子のコード領域の塩基配列としては、配列番号１の配列が例示され、この配列等を利用して遺伝子発現解析用のプライマーやプローブ等を設計又は取得することができる。前記塩基配列は、配列番号１の塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上の同一性を有するものであってよい。また、前記プライマーやプローブ等は、前記塩基配列と特異的に結合できる限り、前記塩基配列の相補配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上の同一性を有するものであってよい。
また、タンパク質発現量を測定するために使用する抗体は、市販の抗体を用いることもできるし、配列番号２で表されるＳＦ３Ｂ２タンパク質のアミノ酸配列の一部を抗原として作成した抗体を用いることもできる。前記アミノ酸配列は、ＡＲ－Ｖ７の発現を亢進させる機能を有するＳＦ３Ｂ２タンパク質である限り、配列番号２のアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上の同一性を有するものであってよい。また、前記抗体等は、前記アミノ酸配列と特異的に結合できる限り、前記アミノ酸配列の相補配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上の同一性を有するものであってよい。
ＳＦ３Ｂ２遺伝子の発現量は、例えばＲＴ－ＰＣＲ法、定量ＰＣＲ法、マイクロアレイ法、ノーザンブロット法、分光光度法、蛍光光度法により測定することができ、またＳＦ３Ｂ２タンパク質の発現量を、例えばフローサイトメトリ、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡにより測定することができる。
ＳＦ３Ｂ２遺伝子のコード領域の塩基配列としては、配列番号１の配列が例示され、この配列等を利用して遺伝子発現解析用のプライマーやプローブ等を設計又は取得することができる。前記塩基配列は、配列番号１の塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上の同一性を有するものであってよい。また、前記プライマーやプローブ等は、前記塩基配列と特異的に結合できる限り、前記塩基配列の相補配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上の同一性を有するものであってよい。
また、タンパク質発現量を測定するために使用する抗体は、市販の抗体を用いることもできるし、配列番号２で表されるＳＦ３Ｂ２タンパク質のアミノ酸配列の一部を抗原として作成した抗体を用いることもできる。前記アミノ酸配列は、ＡＲ－Ｖ７の発現を亢進させる機能を有するＳＦ３Ｂ２タンパク質である限り、配列番号２のアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上の同一性を有するものであってよい。また、前記抗体等は、前記アミノ酸配列と特異的に結合できる限り、前記アミノ酸配列の相補配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上の同一性を有するものであってよい。
【0020】
被検対象から得た生体試料におけるＳＦ３Ｂ２遺伝子の発現量が、健常対象から得たそれらの発現量と比較して、例えば２０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは１００％以上増加している場合に、前立腺癌に罹患していると判定することができる。また、被検対象から得た生体試料におけるＳＦ３Ｂ２遺伝子の発現量が、前立腺癌患者における値（対照値）と比較して同程度であるかそれ以上である場合、前立腺癌に罹患していると判定することができる。
また、他の遺伝子の発現量等と組み合わせて、診断基準を策定することもでき、その結果をもとに、前立腺癌に罹患しているか判定してもよい。
また、他の遺伝子の発現量等と組み合わせて、診断基準を策定することもでき、その結果をもとに、前立腺癌に罹患しているか判定してもよい。
【0021】
健常対象とは、一般には、特定の慢性疾患を有していない対象と定義される。本発明においては、該定義通りでの意味で用いられてもよいが、前立腺癌を有していないが他の疾患は有している対象の意味で用いられてもよい。健常対象は、前立腺癌を発症する対象である限り特に限定されないが、哺乳類動物が挙げられ、ヒトであることが好ましい。
【0022】
生体試料とは、被検対象又は健常対象から採取した、前立腺の細胞又は組織、前立腺周辺の細胞又は組織、その他前立腺癌の転移が考えられ得るあらゆる部位の細胞又は組織等が含まれる。また、生体試料とは、前立腺癌細胞が含まれ得る血液、リンパ液等の体液であってもよく、好ましくは、血中循環癌細胞が挙げられる。血中循環癌細胞は、特に限定されることはないが、例えば前立腺癌を認識する抗体でコーティングされた磁気ビーズを血液に作用させて、磁気による正の選択をすることで回収することができる。
【0023】
本発明において、診断は予後診断とすることもできる。
予後とは、一般に、疾患に対する今後の見通しのことである。予後診断において、例えば、前立腺癌が寛解又は改善した場合や、長期の生存期間、長期の無増悪期間である場合、予後が良好であると判断され、一方で例えば、前立腺癌が再発、再燃、又は転移した場合や、短期の生存期間、短期の無増悪期間である場合に、予後が不良であると判断される。
予後とは、一般に、疾患に対する今後の見通しのことである。予後診断において、例えば、前立腺癌が寛解又は改善した場合や、長期の生存期間、長期の無増悪期間である場合、予後が良好であると判断され、一方で例えば、前立腺癌が再発、再燃、又は転移した場合や、短期の生存期間、短期の無増悪期間である場合に、予後が不良であると判断される。
【0024】
本発明において診断とは、前立腺癌発症前において、今後、前立腺癌になる可能性、好ましくは去勢抵抗性の前立腺癌になる可能性の評価を行うことも含む。
【0025】
診断又は予後診断の結果に基づき、治療方針の決定をすることができる。例えば、外科的治療、放射線治療、化学療法、内分泌療法（ホルモン療法）の何れを行うかを決定することや、内分泌療法として他の何れの内分泌剤を使用するかを決定することができる。
【0026】
本発明は、前立腺癌診断に用いるためのキットも含む。キットの内容は、機器又は試薬の組み合わせにより構成されるが、以下に述べる各構成要素と本質的に同一、又はその一部と本質的に同一な物質が含まれていれば、構成又は形態が異なっていても、本発明のキットに包含される。
【0027】
試薬としては、例えば、ＰＣＲ法によりＳＦ３Ｂ２遺伝子の発現量を測定する場合には、ＳＦ３Ｂ２遺伝子を特異的に増幅することが可能なプライマーを含む。また、必要に応じて、逆転写酵素、ポリメラーゼ、緩衝液、蛍光試薬等を含めてもよい。機器としては、例えば、蛍光光度計、サーマルサイクラー等を使用することができる。
【0028】
また、マイクロアレイ法によりＳＦ３Ｂ２遺伝子の発現量を測定する場合には、ＳＦ３Ｂ２遺伝子断片をスポットしたガラス、プラスチック、シリコン又はメンブレン等の支持体を含む。また、必要に応じて、ラベル化試薬、ハイブリダイゼーション用バッファー、フラグメンテーション用バッファー等を含めてもよい。
【0029】
また、免疫測定法によりＳＦ３Ｂ２タンパク質の発現量を測定する場合には、抗ＳＦ３Ｂ２抗体を含む。また、必要に応じて、生体試料の希釈液、抗体固定化固相、緩衝液、洗浄液、標識二次抗体又はその抗体断片、標識体の検出用試薬、標準物質なども含まれる。生体試料の希釈液としては、例えば、界面活性剤や緩衝液等にＢＳＡやカゼイン等のタンパク質を含む水溶液等が挙げられる。
【0030】
抗体固定化固相としては、各種高分子素材を用途に合うように整形した素材に、抗分子マーカー抗体又はそれらの抗体断片を固相化したものが用いられる。形状としてはチューブ、ビーズ、プレート、ラテックスなどの微粒子、スティック等が、素材としてはポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ゼラチン、アガロース、セルロース、ポリエチレンテレフタレート等の高分子素材、ガラス、セラミックスや金属等が挙げられる。抗体の固相化の方法としては物理的方法と化学的方法又はこれらの併用方法等、公知の方法が挙げられる。例えば、ポリスチレン製９６ウェルの免疫測定用マイクロタープレートに抗体又は抗体断片等を疎水固相化したものが挙げられる。
【0031】
反応緩衝液は、抗体固定化固相の抗体と生体試料中の抗原とが結合反応をする際の溶媒環境を提供するものであればいかなるものでもよいが、界面活性剤、緩衝剤、ＢＳＡやカゼインなどの蛋白質、防腐剤、安定化剤、反応促進剤等を含む反応緩衝液が挙げられる。
【0032】
標識された二次抗体又はその抗体断片としては、本発明に用いられる抗体又は抗体断片に西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ウシ小腸アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼなどの標識用酵素をラベルしたもの、緩衝剤、ＢＳＡやカゼインなどの蛋白質、防腐剤などを混合したものが用いられる。
【0033】
標識体の検出用試薬としては前記の標識用酵素に応じて、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼであれば、テトラメチルベンジジンやオルトフェニレンジアミンなどの吸光測定用基質、ヒドロキシフェニルプロピオン酸やヒドロキシフェニル酢酸などの蛍光基質、ルミノールなどの発光基質が、アルカリホスファターゼであれば、４－ニトロフェニルフォスフェートなどの吸光度測定用基質、４－メチルウンベリフェリルフォスフェートなどの蛍光基質等が挙げられる。
【実施例】
【0034】
以下実施例により、本発明をより詳細に説明するが、本発明の範囲が実施例のみに限定されないことは言うまでもない。
【0035】
＜実施例１＞グリソンスコアとＳＦ３Ｂ２発現の相関
ＴＣＧＡデータ（Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ Ｒｅｓｅａｃｈ Ｎｅｔｗｏｒｋ，２０１５）によって、グリソンスコアと前立腺癌におけるＳＦ３Ｂ２の遺伝子発現量を調べた（図１）。高いグリソンスコア（８～１０）を有する群は、グリソンスコアが７又は６の群と比較した場合に、ＳＦ３Ｂ２の遺伝子発現量が有意に高いことが分かった（それぞれＰ＜０．０００１、Ｐ＝０．００６９）。各スコアにおける人数は、グリソンスコア６（ｎ＝４５）、グリソンスコア７（ｎ＝２４７）、グリソンスコア８～１０（ｎ＝２０５）であった。すなわち、グリソンスコアが高い群ほどＳＦ３Ｂ２遺伝子発現量が高いこと、つまり、去勢抵抗性を獲得しやすいハイリスク前立腺癌又は去勢抵抗性前立腺癌を有する群はＳＦ３Ｂ２の遺伝子発現量が高いことが分かった。
ＴＣＧＡデータ（Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ Ｒｅｓｅａｃｈ Ｎｅｔｗｏｒｋ，２０１５）によって、グリソンスコアと前立腺癌におけるＳＦ３Ｂ２の遺伝子発現量を調べた（図１）。高いグリソンスコア（８～１０）を有する群は、グリソンスコアが７又は６の群と比較した場合に、ＳＦ３Ｂ２の遺伝子発現量が有意に高いことが分かった（それぞれＰ＜０．０００１、Ｐ＝０．００６９）。各スコアにおける人数は、グリソンスコア６（ｎ＝４５）、グリソンスコア７（ｎ＝２４７）、グリソンスコア８～１０（ｎ＝２０５）であった。すなわち、グリソンスコアが高い群ほどＳＦ３Ｂ２遺伝子発現量が高いこと、つまり、去勢抵抗性を獲得しやすいハイリスク前立腺癌又は去勢抵抗性前立腺癌を有する群はＳＦ３Ｂ２の遺伝子発現量が高いことが分かった。
【0036】
＜実施例２＞非再発生存率とＳＦ３Ｂ２発現の相関
ＴＣＧＡデータによって、前立腺癌患者の、ＳＦ３Ｂ２遺伝子の発現量と非再発生存率との関係を調べた（図２）。前立腺癌患者群をＳＦ３Ｂ２発現量が高いか低いかにより２群に分けた。Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ曲線を示す。ログランク検定を行ったところ、ＳＦ３Ｂ２高発現群の方が、ＳＦ３Ｂ２低発現群と比較して、前立腺癌の非再発生存率が有意に低くなることが分かった（Ｐ＝０．００４２）。ＳＦ３Ｂ２ Ｈｉｇｈ群（ｎ＝２４２）、ＳＦ３Ｂ２ Ｌｏｗ群（ｎ＝２４２）であった。すなわち、ＳＦ３Ｂ２遺伝子発現が高いことによって、非再発生存率が低いことが分かった。
つまり、ＳＦ３Ｂ２遺伝子発現を測定することで、再発リスクの高い症例をスクリーニングすることができ、前立腺癌の再発を早期に発見することが可能になる。その結果、前立腺癌の再発に対して早期に治療介入することが可能になるため、再発患者の生存率を高めることができると考えられる。
ＴＣＧＡデータによって、前立腺癌患者の、ＳＦ３Ｂ２遺伝子の発現量と非再発生存率との関係を調べた（図２）。前立腺癌患者群をＳＦ３Ｂ２発現量が高いか低いかにより２群に分けた。Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ曲線を示す。ログランク検定を行ったところ、ＳＦ３Ｂ２高発現群の方が、ＳＦ３Ｂ２低発現群と比較して、前立腺癌の非再発生存率が有意に低くなることが分かった（Ｐ＝０．００４２）。ＳＦ３Ｂ２ Ｈｉｇｈ群（ｎ＝２４２）、ＳＦ３Ｂ２ Ｌｏｗ群（ｎ＝２４２）であった。すなわち、ＳＦ３Ｂ２遺伝子発現が高いことによって、非再発生存率が低いことが分かった。
つまり、ＳＦ３Ｂ２遺伝子発現を測定することで、再発リスクの高い症例をスクリーニングすることができ、前立腺癌の再発を早期に発見することが可能になる。その結果、前立腺癌の再発に対して早期に治療介入することが可能になるため、再発患者の生存率を高めることができると考えられる。
【0037】
＜実施例３＞ＳＦ３Ｂ２過剰発現によるＡＲ－Ｖ７の発現量増加
ＳＦ３Ｂ２発現量とＡＲ－Ｖ７発現量との間の関連性を調べるために、２種類の前立腺癌細胞２２Ｒｖ１及びＬＮＣａＰ９５において、ＳＦ３Ｂ２を過剰発現させることで、ＡＲ－Ｖ７の発現の増減を確認した。前立腺癌細胞におけるＳＦ３Ｂ２の過剰発現は、ＣＡＧプロモーターを有するベクターにおいて、ＣＡＧプロモーターの下流にＳＦ３Ｂ２遺伝子を挿入したベクターを、前立腺癌細胞にトランスフェクションすることにより行われた。さらにＩＲＥＳによってｐｕｒｏｎｙｃｉｎ耐性遺伝子も同時に細胞に発現させた。
ウェスタンブロットの結果を表す図３で示す通り、ＳＦ３Ｂ２の過剰発現は、２種類の前立腺癌細胞の何れにおいてもＡＲ－Ｖ７の発現量を増加させた。一方で、ＳＦ３Ｂ２の過剰発現は、ＡＲ－ＦＬ（ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ）には影響を及ぼさなかった。
すなわち、アンドロゲン受容体であるＡＲ－Ｖ７の発現の有無を画像診断等により直接的に測定できなくても、その代わりにＳＦ３Ｂ２の発現量を測定することにより、間接的にＡＲ－Ｖ７の発現の有無を推定することが可能になると考えられる。つまり、予めＳＦ３Ｂ２が発現していることを確認できれば、ＡＲ－Ｖ７が発現していると推定できるので、アビラテロンやエンザルタミドといった薬剤による内分泌治療の効果が低いと予測でき、薬剤抵抗性を示す前立腺癌の薬剤投与前スクリーニングが可能となるのである。
ＳＦ３Ｂ２発現量とＡＲ－Ｖ７発現量との間の関連性を調べるために、２種類の前立腺癌細胞２２Ｒｖ１及びＬＮＣａＰ９５において、ＳＦ３Ｂ２を過剰発現させることで、ＡＲ－Ｖ７の発現の増減を確認した。前立腺癌細胞におけるＳＦ３Ｂ２の過剰発現は、ＣＡＧプロモーターを有するベクターにおいて、ＣＡＧプロモーターの下流にＳＦ３Ｂ２遺伝子を挿入したベクターを、前立腺癌細胞にトランスフェクションすることにより行われた。さらにＩＲＥＳによってｐｕｒｏｎｙｃｉｎ耐性遺伝子も同時に細胞に発現させた。
ウェスタンブロットの結果を表す図３で示す通り、ＳＦ３Ｂ２の過剰発現は、２種類の前立腺癌細胞の何れにおいてもＡＲ－Ｖ７の発現量を増加させた。一方で、ＳＦ３Ｂ２の過剰発現は、ＡＲ－ＦＬ（ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ）には影響を及ぼさなかった。
すなわち、アンドロゲン受容体であるＡＲ－Ｖ７の発現の有無を画像診断等により直接的に測定できなくても、その代わりにＳＦ３Ｂ２の発現量を測定することにより、間接的にＡＲ－Ｖ７の発現の有無を推定することが可能になると考えられる。つまり、予めＳＦ３Ｂ２が発現していることを確認できれば、ＡＲ－Ｖ７が発現していると推定できるので、アビラテロンやエンザルタミドといった薬剤による内分泌治療の効果が低いと予測でき、薬剤抵抗性を示す前立腺癌の薬剤投与前スクリーニングが可能となるのである。
【図1】
【図2】
【図3】
【配列表】