特許 7475597 ＦＧＦ２１産生促進剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-04-19

(45)【発行日】2024-04-30

(54)【発明の名称】ＦＧＦ２１産生促進剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/22 20060101AFI20240422BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240422BHJP

   A61P 3/06 20060101ALI20240422BHJP

   A61P 3/04 20060101ALI20240422BHJP

【ＦＩ】

A61K31/22

A61P43/00 111

A61P3/06

A61P3/04

【請求項の数】 2

(21)【出願番号】P 2019236209

(22)【出願日】2019-12-26

(65)【公開番号】P2021104951

(43)【公開日】2021-07-26

【審査請求日】2022-11-28

(73)【特許権者】

【識別番号】000186588

【氏名又は名称】小林製薬株式会社

(73)【特許権者】

【識別番号】500175325

【氏名又は名称】学校法人愛知学院

(74)【代理人】

【識別番号】100124431

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 順也

(74)【代理人】

【識別番号】100174160

【弁理士】

【氏名又は名称】水谷 馨也

(74)【代理人】

【識別番号】100175651

【弁理士】

【氏名又は名称】迫田 恭子

(72)【発明者】

【氏名】井上 誠

(72)【発明者】

【氏名】平居 貴生

(72)【発明者】

【氏名】中島 健一

(72)【発明者】

【氏名】田中 貴大

(72)【発明者】

【氏名】赤木 淳二

【審査官】新熊 忠信

(56)【参考文献】

【文献】特開平０９－０６７２４９（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開平１０－２６５３２８（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１６－１９９５３６（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１７－１８４７１８（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１９－１５１５７２（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１９／１８０９６４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特開２０１８－１３５３１１（ＪＰ，Ａ）

【文献】Chemio-Biological Interaction，2010年，Vol.185，pp.59-65

【文献】Drug Development Research，2007年，Vol.68，pp.261-266

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ３１／００－３３／４４

Ａ６１Ｐ １／００

Ａ６１Ｐ ３／００

Ａ６１Ｐ ９／００

Ａ６１Ｐ １９／００

Ａ６１Ｐ ２９／００

Ａ６１Ｐ ３１／００

Ａ６１Ｐ ４３／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

３－アセチルオレアノール酸及び／又はその薬学的に許容される塩を含有する、ＦＧＦ２１産生促進剤。

【請求項2】

脂質代謝低下又は肥満の予防又は改善に用いられる、請求項１に記載のＦＧＦ２１産生促進剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＦＧＦ２１産生促進剤に関する。より具体的には、本発明は、オレアノール酸及びその誘導体の、ＦＧＦ２１産生促進剤としての新たな用途に関する。

【背景技術】

【0002】

ＦＧＦ（線維芽細胞増殖因子： fibroblast growth factor）は、線維芽細胞をはじめとする様々な細胞に対して増殖活性や分化誘導など多彩な作用を示す多機能性細胞間シグナル因子である（非特許文献１）。ＦＧＦの一つであるＦＧＦ２１は、分泌サイトカインとして生体に対して様々な作用を及ぼす因子であることから、医療への応用を目指した研究が進められている。

【0003】

近年、ＦＧＦ２１産生を促進する成分がいくつか報告されている。具体的には、生薬オウレンの主要成分であるベルベリン（非特許文献２、３）、及び特定の藻体（特許文献１）に、ＦＧＦ２１産生を促進する作用が見出されている。

【0004】

ところで、トリテルペンは炭素数３０を基本骨格とするテルペンであり、様々な生理活性が期待されている。トリペルテンの１種であるオレアノール酸に関しては、抗う蝕作用（特許文献２）、抗癌作用（特許文献３）、抗酸化作用（非特許文献４）、骨粗鬆症予防作用（特許文献４）、幹細胞の未分化状態維持作用（特許文献５）、保湿作用（特許文献６）等が報告されている。一方で、オレアノール酸に関してＦＧＦ２１産生との関連性は一切報告されていない。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【文献】生化学 第８８巻第１号，ｐｐ８６－９３（２０１６）

【文献】「Berberine stimulates FGF21 expression via activation of AMP-activated protein kinase in brown and beige adipocytes」、愛知学院大学薬学会誌、第１１巻、２０１８年１２月、ｐ．１８－１９

【文献】「代謝調節因子FGF21 を制御する天然物の探索」、愛知学院大学薬学会誌、第１１巻、２０１８年１２月、ｐ．２２－２３

【文献】食品化学 ２００５年、９２（４）、７２１－７２７頁

【特許文献】

【0006】

【文献】特開２０１８－１３５３１１号公報

【文献】特開平１－２９０６１９号公報

【文献】特開平８－１１９８６６号公報

【文献】特開２０１４－１４１４４４号公報

【文献】特開２０１６－１６９１７２号公報

【文献】特開２０１８－０５８８０４号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

これまで報告されているＦＧＦ２１産生を促進する成分はわずかであり、たとえばベルベリンについては特有の副作用（例えば便秘）の可能性があること、特定の藻体については規格化されていない天然物であるために一定の品質保証が困難であること等に鑑みると、ＦＧＦ２１産生を促進する成分について更なる選択肢が望まれる。

【0008】

そこで、本発明の目的は、ＦＧＦ２１産生を促進する新たな成分を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明者らが鋭意検討を行ったところ、オレアノール酸に、ＦＧＦ２１産生を促進する作用があることを見出した。さらに検討を行ったところ、オレアノール酸を誘導体化することによって、ＦＧＦ２１産生促進効果が一層向上することも見出した。本発明は、これらの知見に基づいて、更に検討を重ねることにより完成したものである。

【0010】

即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１． 下記式（Ｉ）で表される化合物及び／又はその薬学的に許容される塩を含有する、ＦＧＦ２１産生促進剤。

【化1】

（式中、Ｒは、水素原子、炭素数２～３０のアシル基、又は炭素数１～６のアルキル基である。）
項２． 前記Ｒが炭素数２～７の脂肪族アシル基である、項１に記載のＦＧＦ２１産生促進剤。
項３． 脂質代謝低下又は肥満の予防又は改善に用いられる、項１又は２に記載のＦＧＦ２１産生促進剤。

【発明の効果】

【0011】

本発明によれば、ＦＧＦ２１産生を促進する新たな成分が提供される。

【発明を実施するための形態】

【0012】

本発明のＦＧＦ２１産生促進剤は、オレアノール酸及びその特定の誘導体を含有することを特徴とする。以下、本発明のＦＧＦ２１産生促進剤について詳述する。

【0013】

本発明のＦＧＦ２１産生促進剤に含まれるオレアノール酸及びその特定の誘導体は、下記式（Ｉ）で表される化合物及び／又はその薬学的に許容される塩である。

【0014】

【化2】

【0015】

式（Ｉ）中、Ｒは、水素原子、炭素数２～３０のアシル基、又は炭素数１～６のアルキル基である。Ｒが水素原子である場合の化合物（Ｉ）はオレアノール酸である。また、Ｒが上記のアシル基又は上記のアルキル基である場合の化合物（Ｉ）は、オレアノール酸の３位の水酸基がエステル又はエーテルに改変された誘導体（エステル型誘導体又はエーテル型誘導体）である。本発明のＦＧＦ２１産生促進剤においては、オレアノール酸、オレアノール酸のエステル型誘導体、及びオレアノール酸のエーテル型誘導体から１種を単独で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。

【0016】

化合物（Ｉ）が、Ｒが炭素数２～３０のアシル基であるエステル型誘導体である場合、当該アシル基は、脂肪族アシル基及び芳香族アシル基のいずれであってもよい。脂肪族アシル基としては、炭素数２～７の脂肪族アシル基が挙げられ、具体的には、炭素数２～７、好ましくは炭素数２～４の、直鎖又は分岐状の飽和又は不飽和アシル基が挙げられ、より具体的には、アセチル基、ｎ－プロピオニル基、イソプロピオニル基、ｎ－ブチリル基、ｔ－ブチリル基等のアルカノイル基；アクリロイル基（プロペノイル基）、メタクリロイル基、ｎ－ブテノイル基等のアルケノイル基が挙げられる。

【0017】

芳香族アシル基としては、炭素数７～３０、好ましくは炭素数７～１４の芳香族アシル基が挙げられ、より具体的には、ホルミル基の水素原子が芳香族基で置換された基、及び上記の脂肪族アシル基のいずれかの水素原子が芳香族基で置換された基が挙げられる。ホルミル基の水素原子が芳香族基で置換された基としては、ベンゾイル基、ナフトイル基等が挙げられる。上記の脂肪族アシル基のいずれかの水素原子が芳香族基で置換された基としては、好ましくは、上記の脂肪族アシル基、好ましくはアルケノイル基の末端水素原子が芳香族基（ベンジル基、ナフチル基等）で置換された基が挙げられ、より好ましくは、アクリロイル基（プロペノイル基）、メタクリロイル基の末端水素原子が芳香族基（ベンジル基、ナフチル基等）で置換された基が挙げられ、さらに好ましくはシンナモイル基（３－フェニルプロペノイル基）が挙げられる。

【0018】

これらのエステル型誘導体は、１種を単独で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。

【0019】

化合物（Ｉ）が、Ｒが炭素数１～６のアルキル基であるエーテル型誘導体である場合、当該アルキル基は、直鎖又は分岐状のいずれであってもよく、具体的には、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基またはｔ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｔ－ペンチル基、２－メチルブチル基、ｎ－へキシル基、イソへキシル基、３－メチルペンチル基、エチルブチル基が挙げられ、好ましくは、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基が挙げられる。

【0020】

これらのエーテル型誘導体は、１種を単独で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。

【0021】

上記式（Ｉ）で表される化合物の薬学的に許容される塩としては、カルボン酸塩が挙げられ、具体的には、アルカリ金属塩（ナトリウム塩、カリウム塩等）；アルカリ土類金属塩（カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩等）；有機塩基との塩（トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、２，６－ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ－ジベンジルエチレンジアミン等との塩）等が挙げられる。

【0022】

本発明のＦＧＦ２１産生促進剤においては、上記式（Ｉ）で表される化合物及び／又はその薬学的に許容される塩の中でも、ＦＧＦ２１産生促進効果をより一層高く得る観点から、好ましくは上記式（Ｉ）で表される化合物が挙げられ、より好ましくはオレアノール酸の誘導体が挙げられ、さらに好ましくはオレアノール酸のエステル型誘導体が挙げられ、一層好ましくはＲが炭素数２～７の脂肪族アシル基であるエステル型誘導体が挙げられ、特に好ましくはＲがアセチル基であるエステル型誘導体（つまり、３－アセチルオレアノール酸）が挙げられる。

【0023】

オレアノール酸としては、市販品（例えば、富士フィルム和光純薬（株）より入手可能）を用いてもよいし、公知の製造方法によって得たものであってもよい。公知の製造方法としては、オレアノール酸を含有する植物原料から抽出及び単離精製する方法、及びオレアノール酸を産生する微生物の培養物から単離精製する方法等が挙げられる。オレアノール酸を含有する植物原料としては、オリーブ、ブドウ、ビート、ナツメ、アーモンド、バナバ葉、オリーブ葉、セージ、サンザシ、ラズベリー、カリン、ローズマリー葉、グァバ、シソ葉、ブルーベリー、プルーン、ビワ、ザクロ、レモンバーム、バジル、ローズヒップ、カキ、センブリ等が挙げられる。また、オレアノール酸を産生する微生物としては、オーランチオキトリウム（Aurantiochytrium）属と類縁関係の藻類、具体的には、ＡＪ７８６６株（ＦＥＲＭ Ｐ－２２２８９）、ＡＪ７８６８株（ＦＥＲＭ Ｐ－２２２９０）、ＡＪ７８６７株（ＦＥＲＭ Ｐ－２２３０４）及びそれらの誘導株が挙げられる。

【0024】

オレアノール酸の誘導体は、オレアノール酸を用い、３位の水酸基を誘導体化する公知の方法を用いて合成することができる。

【0025】

例えば、オレアノール酸のエステル型誘導体は、オレアノール酸の３位の水酸基に対して公知のエステル化法を用いることで合成することができる。具体的には、オレアノール酸のエステル型誘導体は、オレアノール酸に、上記式（Ｉ）中のアシル基Ｒに対応するカルボン酸（ＲＯＨ）の酸ハロゲン化物（ＲＯＸ¹）、活性エステル（ＲＯＸ²）、酸無水物（ＲＯＲ）等を反応させることで得ることができる。上記カルボン酸、酸ハロゲン化物、活性エステル、及び酸無水物において、Ｒは、上記式（Ｉ）中のアシル基Ｒと同じである。上記酸ハロゲン化物において、Ｘ¹は、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ等のハロゲンを表す。上記活性エステルにおいて、Ｘ²は、活性エステル化剤Ｘ²ＯＨ由来基を表し、活性エステル化剤としては、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、１－ヒドロキシベンズトリァゾール、Ｎ－ヒドロキシ－５－ノルボルネンー２，３－ジカルボキシルイミド等のＮ－ヒドロキシ化合物；ジピリジルジスルフイド等のジスルフイド化合物；ジシクロへキシルカルボジイミド等のカルボジイミド等が挙げられる。

【0026】

また、オレアノール酸のエーテル型誘導体は、オレアノール酸の３位の水酸基に対して公知のエーテル化法を用いることで合成することができる。具体的には、オレアノール酸のエーテル型誘導体は、オレアノール酸に、上記式（Ｉ）中のアルキル基Ｒに対応するハロゲン化アルキル（ＲＸ¹）等を反応させることで得ることができる。上記ハロゲン化アルキルにおいて、Ｒは、上記式（Ｉ）中のアルキル基Ｒと同じである。上記ハロゲン化アルキルにおいて、Ｘ¹は、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ等のハロゲンを表す。

【0027】

またオレアノール酸の誘導体は、オレアノール酸の誘導体を含有する植物原料から抽出及び単離精製する方法によって得てもよい。例えば、３－アセチルオレアノール酸を含有する植物原料としては、レンギョウ（生薬）、赤小豆等が挙げられる。

【0028】

その他の成分
本発明のＦＧＦ２１産生促進剤は、有効成分である上記の化合物のみからなるものであってもよいし、製剤形態に応じた添加剤や基剤を含んでいてもよい。このような添加剤及び基剤としては、薬学的に許容されることを限度として特に制限されないが、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、等張化剤、可塑剤、分散剤、乳化剤、溶解補助剤、湿潤化剤、安定化剤、懸濁化剤、粘着剤、コーティング剤、光沢化剤、水、油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、高級アルコール類、エステル類、水溶性高分子、界面活性剤、金属石鹸、低級アルコール類、多価アルコール、ｐＨ調整剤、緩衝剤、酸化防止剤、紫外線防止剤、防腐剤、矯味剤、香料、粉体、増粘剤、色素、キレート剤等が挙げられる。これらの添加剤は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。また、これらの添加剤及び基剤の含有量については、使用する添加剤及び基剤の種類、ＦＧＦ２１産生促進剤の製剤形態等に応じて適宜設定される。

【0029】

また、本発明のＦＧＦ２１産生促進剤は、有効成分である上記の化合物の他に、必要に応じて、他の栄養成分や薬理成分を含有していてもよい。このような栄養成分や薬理成分としては、薬学的に許容されることを限度として特に制限されないが、例えば、制酸剤、健胃剤、消化剤、整腸剤、鎮痙剤、粘膜修復剤、抗炎症剤、収れん剤、鎮吐剤、鎮咳剤、去痰剤、消炎酵素剤、鎮静催眠剤、抗ヒスタミン剤、カフェイン類、強心利尿剤、抗菌剤、血管収縮剤、血管拡張剤、局所麻酔剤、生薬エキス、ビタミン類、メントール類等が挙げられる。これらの栄養成分や薬理成分は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。また、これらの成分の含有量については、使用する成分の種類、ＦＧＦ２１産生促進剤の製剤形態等に応じて適宜設定される。

【0030】

製剤形態
本発明のＦＧＦ２１産生促進剤の製剤形態については、経口投与が可能であることを限度として特に制限されないが、例えば、散剤、細粒剤、顆粒剤(ドライシロップを含む)、錠剤、丸剤、カプセル剤(軟カプセル剤、硬カプセル剤)等の固形状製剤;ゼリー剤等の半固形状製剤;液剤、懸濁剤、シロップ剤等の液状製剤が挙げられる。本発明のＦＧＦ２１産生促進剤をこれらの製剤形態に調製するには、有効成分である上記の化合物、及び必要に応じて添加される添加剤、基剤、及び薬理成分を用いて、通常の製剤化手法に従って製剤化すればよい。

【0031】

用途
本発明のＦＧＦ２１産生促進剤は、ＦＧＦ２１の産生を促進させる目的で使用される。ＦＧＦ２１産生促進剤は、生体に投与することにより、生体内のＦＧＦ２１の発現量を増加させる。ＦＧＦ２１に基づく作用として、糖尿病、脂質異常症、肥満、心血管疾患、心臓障害（肥大心等）、敗血症、関節リウマチ、非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)およびメタボリック症候群（インスリン抵抗性、脂質異常症、内臓型肥満および高血圧）等に対する予防・治療効果が知られている。そのため、本発明のＦＧＦ２１産生促進剤は、ＦＧＦ２１の発現量を増加させることに伴い、ＦＧＦ２１に基づく上記の作用を得る目的で使用することができる。

【0032】

用量・用法
本発明のＦＧＦ２１産生促進剤は経口投与によって使用される。本発明のＦＧＦ２１産生促進剤の用量については、有効成分の種類、投与対象者の年齢、性別、体質等に応じて適宜設定されるが、例えば、ヒト１人に対して１日当たり、有効成分である上記化合物の量で、例えば０．１～５００ｍｇ／ｋｇ体重程度、好ましくは１～３００ｍｇ／ｋｇ体重程度、より好ましくは２～１００ｍｇ／ｋｇ体重程度となる量で、１日１～３回、好ましくは２又は３回の頻度で服用すればよい。

【0033】

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

【0034】

試験例１
（１）オレアノール酸
市販品のオレアノール酸（富士フィルム和光純薬（株））を用意した。

【0035】

（２）３－アセチルオレアノール酸の合成
オレアノール酸（３８．４ｍｍｏｌ）を５００ｍＬのジクロロメタン（超脱水）に溶解後、無水酢酸（１５．８１ｇ）、トリエチルアミン（２４．１５ｍＬ）、ジメチルアミノピリジン（４６５ｍｇ）を順次加え、室温にて１２時間撹拌した。反応終了後、反応液を５００ｍＬのジエチルエーテルで希釈後、０．１Ｍ塩酸５００ｍＬ（１回）、精製水５００ｍＬ（２回）、飽和食塩水５００ｍＬ（１回）で洗浄し、エーテル相を得た。エーテル相に無水硫酸マグネシウムを適量加え、濾過を行った。濾液を減圧下で濃縮し、得られた残留物（２５．４４ｇ）を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ－ヘキサン：アセトン＝１５：１）により精製した。薄層クロマトグラフィーにおける標品との比較により３－アセチルオレアノール酸を含有する画分を収集し、濃縮後、ｎ－ヘキサン／ジクロロメタンにより再結晶化を行い、３－アセチルオレアノール酸（５．３ｇ）を白色粉末として得た。

【0036】

（３）３－アセチルオレアノール酸の単離精製
レンギョウ（ツムラ；２ｋｇ）を、室温にてメタノール（８Ｌ）に２４時間浸漬し抽出する工程を３回繰り返すことで、レンギョウ抽出液を得た。得られた抽出液を減圧下濃縮することでレンギョウ抽出物（１７５．３ｇ）を得た。得られたレンギョウ抽出物をメタノールに再溶解したところ、不溶物（３４．４ｇ）が沈殿したため、濾過により不溶物を除去した。得られたろ液を、酢酸エチル（１Ｌ）及び精製水（１Ｌ）を用いて液－液分配し、酢酸エチル画分（１１１．３ｇ）を得た。酢酸エチル画分をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、クロロホルム／メタノール混合溶媒系を用いて溶出させることで、２７個の画分を得た。得られた画分のうち１～６番目の画分に活性が認められたため、この画分を濃縮し、ｎ－ヘキサン／アセトン混合溶媒を移動相としたシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、３６個の画分を得た。このうち、２７～３５番目の画分を濃縮し、ｎ－ヘキサン／ジクロメタンを用いて再結晶化することで、白色粉末（２１．２ｍｇ）を得た。得られた白色粉末について¹Ｈ－ＮＭＲ及び¹³Ｃ－ＮＭＲデータを取得し、既知化合物である３－アセチルオレアノール酸のＮＭＲデータとの照合した結果、得られた白色粉末を３－アセチルオレアノール酸と同定した。

【0037】

（２）細胞試験
Ｃ２Ｃ１２細胞を、増殖培地［ＤＭＥＭ（高グルコース）、ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｗａｋｏ）、及び１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｗａｋｏ）］を入れた培養ディッシュ（４８ウェルプレート、ｃｏｒｎｉｎｇ）に、底面積１ｃｍ²あたり２５，０００個となるように播種した。２４時間後、分化培地［ＤＭＥＭ（高グルコース）、ペニシリン－ストレプトマイシン、１％ＨＳ（ウマ血清；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）］に交換し（０日目）、その後、分化培地で４日間培養した。

【0038】

培養４日目のＣ２Ｃ１２細胞に対して、（１）のオレアノール酸の５０μＭ水溶液、又は、（２）で調製した３－アセチルオレアノール酸の５０μＭ水溶液を添加し、２０時間インキュベートした。また、コントロールとして、３－アセチルオレアノール酸を加えなかったことを除いて同様の操作を行った。培地を回収し、ＥＬＩＳＡ法によりＦＧＦ２１を測定した。ＦＧＦ２１の測定にはＭｏｕｓｅ／Ｒａｔ ＦＧＦ－２１ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ）を使用した。コントロールにおけるＦＧＦ２１量を１００％とした場合の３－アセチルオレアノール酸添加によるＦＧＦ２１量の相対量（％）を導出した。結果を表１に示す。

【0039】

【表1】

【0040】

表１から明らかなとおり、オレアノール酸（実施例１）及び３－アセチルオレアノール酸（実施例２）には、ＦＧＦ２１の産生を促進する効果が確認できた。さらに、この効果は、３－アセチルオレアノール酸（実施例２）において顕著であることも確認できた。

【0041】

試験例２
試験例１の（２）で調製した３－アセチルオレアノール酸を用い、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤であるＳＢ２０３５８０を用いた阻害試験を行った。

【0042】

試験例１と同様にして培養４日目のＣ２Ｃ１２細胞を調製し、３－アセチルオレアノール酸の３０μＭ水溶液を添加後、６時間培養した（実施例３）。また、別途、培養４日目のＣ２Ｃ１２細胞に、３－アセチルオレアノール酸の３０μＭ水溶液の添加３０分前に、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤であるＳＢ２０３５８０の１０μＭ水溶液を添加し、３－アセチルオレアノール酸添加後６時間培養した（参考例３）。また、コントロールとして、３－アセチルオレアノール酸を加えなかったことを除いて実施例３と同様の操作を行った（参考例２）。

【0043】

培養後の、ｔｏｔａｌ ＲＮＡを、ＲＮＡｉｓｏ Ｐｌｕｓ（Ｔａｋａｒａ）を用いて回収した。ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ^(R) ｑＰＣＲ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ｗｉｔｈ ｇＤＮＡ Ｒｅｍｏｖｅｒ（Ｔｏｙｏｂｏ）を用いて１μｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡは滅菌水を用いて１０倍希釈した後、リアルタイムＰＣＲ法に用いた。Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ； Ｔｏｙｏｂｏ）、プライマー、ｃＤＮＡを調製後、ＴＰ８００ Ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ^(R) Ｒｅａｌ-ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔａｋａｒａ）を用いて反応させた。コントロールにおけるＦＧＦ２１ ｍＲＮＡ量を１００％とした場合の実施例３及び参考例３におけるＦＧＦ２１ ｍＲＮＡの相対量（％）を導出した。結果を表２に示す。

【0044】

【表2】

【0045】

表２から明らかなとおり、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤であるＳＢ２０３５８０（１０μＭ）によって、ＦＧＦ２１産生促進剤である３－アセチルオレアノール酸によるＦＧＦ２１の産生を促進する効果（実施例３）が抑制されたことが確認できた（参考例３）。つまり、３－アセチルオレアノール酸によるＦＧＦ２１の産生を促進する効果にはｐ３８ＭＡＰキナーゼが関与することが確認できた。

【0046】

試験例３
試験例１の（２）で調製した３－アセチルオレアノール酸を用いて、ＦＧＦ２１産生促進効果を確認する動物実験を行った。

【0047】

実験動物として、１４日間予備飼育した雄性６週齢のｄｄｙマウス（日本エスエルシー株式会社）を用い、予備飼育期間及び実験期間を通して、室温２４±１℃の飼育室（照明時間８時～２０時）で飼育した。マウスに対して、３－アセチルオレアノール酸を３０ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内投与した。投与後４時間経過時に、ヘパリンナトリウム添加の注射筒を用いて採血を行った。コントロールとして、同様に予備飼育したｄｄｙマウスに３－アセチルオレアノール酸を投与しなかったことを除いて同様の操作を行った。採血した血液を遠心分離（３０００ｒｐｍ、１５分）して血漿を分離し、血漿中のＦＧＦ２１を、ＥＬＩＳＡ法により測定した。ＦＧＦ２１の測定にはＭｏｕｓｅ／Ｒａｔ ＦＧＦ－２１ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ）を使用した。

【0048】

また、マウスに対して３－アセチルオレアノール酸を投与後４時間経過時に、ヒラメ筋を摘出した。摘出した組織の１０倍量のＲＮＡｉｓｏ Ｐｌｕｓ（Ｔａｋａｒａ）を加え、組織をホモジナイズした後、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ^(R) ｑＰＣＲ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ｗｉｔｈ ｇＤＮＡ Ｒｅｍｏｖｅｒ（Ｔｏｙｏｂｏ）を用いて１μｇ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ からｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡは滅菌水を用いて１０倍希釈した後、リアルタイムＰＣＲ法に用いた。Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ； Ｔｏｙｏｂｏ）、プライマー、ｃＤＮＡを調製後、ＴＰ８００ Ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ^(R) Ｒｅａｌ-ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔａｋａｒａ）を用いて反応させた。

【0049】

コントロールにおける血漿ＦＧＦ２１量を１００％とした場合の３－アセチルオレアノール酸投与による血漿ＦＧＦ２１の相対量（％）を導出した。また、コントロールにおけるヒラメ筋のＦＧＦ２１ ｍＲＮＡ量を１００％とした場合の３－アセチルオレアノール酸投与によるヒラメ筋のＦＧＦ２１ ｍＲＮＡの相対量（％）を導出した。結果を表３に示す。

【0050】

【表3】

【0051】

表３から明らかなとおり、３－アセチルオレアノール酸には、ＦＧＦ２１の産生を促進する効果があることが確認できた。

【0052】

試験例４
試験例１の（２）で調製した３－アセチルオレアノール酸を用いて、脂肪低減効果を確認する動物実験を行った。

【0053】

実験動物として、１４日間予備飼育した雄性６週齢のｄｄｙマウス（日本エスエルシー株式会社）を用い、予備飼育期間及び実験期間を通して、室温２４±１℃の飼育室（照明時間８時～２０時）で飼育した。マウスを、通常餌群、高脂肪食群、及び高脂肪食＋ＦＧＦ２１産生促進剤群（１群当たり１０～１２匹）の３群に分けた。通常餌群には、通常飼料（Ｄ１２４５０Ｂ ３５ｋｃａｌ％；Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ）を３週間与え、高脂肪食群及び高脂肪食＋ＦＧＦ２１産生促進剤群には、高脂肪食飼料（Ｄ１２４９２、６０ｋｃａｌ％；Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ）を３週間与えた。飼料の交換は週２回（毎週月曜日と金曜日）、１回当たり１５０ｇとし、飲料水は滅菌蒸留水を給水瓶で自由に与えた。また、高脂肪食＋ＦＧＦ２１産生促進剤群には、高脂肪食飼料と共に、３－アセチルオレアノール酸を３０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で、週５回（月曜日から金曜日まで毎日）、３週間腹腔内投与した。試験終了時の各群について、体重及び生殖器周囲脂肪組織の重量を測定し、平均値を導出した。結果を表４に示す。

【表4】

【0054】

表４から明らかなとおり、ＦＧＦ２１産生促進剤である３－アセチルオレアノール酸の投与（実施例５）によって、高脂肪食による体重増加及び脂肪量増加（参考例５と対比した参考例６）が抑制されたことが確認できた。３－アセチルオレアノール酸によって、脂肪増加の抑制又は低下の効果が得られることが確認できた。これらの結果から、ＦＧＦ２１産生促進剤である３－アセチルオレアノール酸が、脂質代謝低下又は肥満の予防又は改善に有効であることが認められる。