知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-04-24
(45)【発行日】2024-05-07
(54)【発明の名称】精子保存液及び精子保存方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/076 20100101AFI20240425BHJP
C12N 1/04 20060101ALI20240425BHJP
A01K 67/02 20060101ALN20240425BHJP
【ＦＩ】
C12N5/076
C12N1/04
A01K67/02
【請求項の数】
7
(21)【出願番号】P 2019222047
(22)【出願日】2019-12-09
(65)【公開番号】P2020092703
(43)【公開日】2020-06-18
【審査請求日】2022-12-07
(31)【優先権主張番号】P 2018231140
(32)【優先日】2018-12-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】504202472
【氏名又は名称】大学共同利用機関法人情報・システム研究機構
(74)【代理人】
【識別番号】100106909
【弁理士】
【氏名又は名称】棚井 澄雄
(74)【代理人】
【識別番号】100188558
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100161207
【弁理士】
【氏名又は名称】西澤 和純
(74)【代理人】
【識別番号】100141139
【弁理士】
【氏名又は名称】及川 周
(72)【発明者】
【氏名】酒井 則良
【審査官】北田 祐介
(56)【参考文献】
【文献】特表２０００－５００３２７（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１９／０４９９８５（ＷＯ，Ａ１）
【文献】中国特許出願公開第１０３３１４９５１（ＣＮ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１３／０１８５４５（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２０１４－１２８２１９（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１５－０８２９８７（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１８／００３１５８３（ＵＳ，Ａ１）
【文献】Biology of Reproduction，2005年，72，444-450
【文献】Theriogenology，2004年，61，1455-1469
【文献】神奈川県水産総合研究所研究報告，2002年，7，23-28
【文献】Aquaculture，2009年，290，165-171
【文献】Cryobiology，2012年，65，335-337
【文献】Cryobiology，2006年，53，51-57
【文献】Cryobiology，2013年，67，1-6
【文献】低温生物工学会誌，2008年，54(1)，29-32
【文献】Zoological Science，1997年，14，641-644
【文献】Biology of Reproduction，2015年，93(4)，Article 104
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ ５／００－５／２８
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
魚類から採取した精子を精子保存液に懸濁して得た精子懸濁液を室温で保存する精子の保存方法であって、前記精子保存液は、無機塩類、アミノ酸、ビタミン類、ウシ胎児血清、ウシ血清アルブミン、及び０．０６ｍＭ～２ｍＭの乳酸を含有する、精子の保存方法。
【請求項2】
前記精子保存液は、さらに、緩衝剤を含有し、ｐＨが６．５～１０．０である請求項１に記載の精子の保存方法。
【請求項3】
前記精子保存液は、さらに、グルコースを含有する請求項１又は２に記載の精子の保存方法。
【請求項4】
前記精子保存液は、さらに、抗酸化剤を含有する請求項１～３のいずれか一項に記載の精子の保存方法。
【請求項5】
前記精子保存液は、さらに、ペニシリン及び／又はストレプトマイシンを含有する請求項１～４のいずれか一項に記載の精子の保存方法。
【請求項6】
前記魚類は、ゼブラフィッシュであり、前記精子保存液は、終濃度として、塩化カルシウム二水和物０．１ｇ／Ｌ～０．２５ｇ／Ｌ、塩化マグネシウム六水和物０．１５ｇ／Ｌ～０．２５ｇ／Ｌ、無水硫酸マグネシウム０．０６ｇ／Ｌ～０．１２ｇ／Ｌ、塩化カリウム０．３ｇ／Ｌ～０．６ｇ／Ｌ、無水リン酸二水素カリウム０．０４ｇ／Ｌ～０．０８ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム６．０ｇ／Ｌ～１０．０ｇ／Ｌ、及び無水リン酸水素二ナトリウム０．１５ｇ／Ｌ～０．２５ ｇ／Ｌを含む無機塩類と、
ＤＬ－アラニン０．３ｇ／Ｌ～０．６ｇ／Ｌ、Ｌ－アルギニン（塩基フリー）０．３５ｇ／Ｌ～０．６５ｇ／Ｌ、無水Ｌ－アスパラギン０．１５ｇ／Ｌ～０．３５ｇ／Ｌ、Ｌ－システイン（塩基フリー）０．０８ｇ／Ｌ～０．２ｇ／Ｌ、Ｌ－グルタミン０．２ ｇ／Ｌ～０．４ ｇ／Ｌ、グリシン０．１５ｇ／Ｌ～０．３５ｇ／Ｌ、Ｌ－ヒスチジン０．１５ｇ／Ｌ～０．３５ｇ／Ｌ、ＤＬ－イソロイシン０．１３ｇ／Ｌ～０．３５ｇ／Ｌ、Ｌ－ロイシン０．０８ｇ／Ｌ～０．２ｇ／Ｌ、Ｌ－リジン０．０５５ｇ／Ｌ～０．０９５ｇ／Ｌ、ＤＬ－メチオニン０．０８ｇ／Ｌ～０．２５ｇ／Ｌ、ＤＬ－フェニルアラニン０．１５ｇ／Ｌ～０．３５ ｇ／Ｌ、Ｌ－セリン０．１５ｇ／Ｌ～０．３ｇ／Ｌ、ＤＬ－スレオニン０．４ｇ／Ｌ～０．８ｇ／Ｌ、Ｌ－トリプトファン０．０１５ｇ／Ｌ～０．０３５ｇ／Ｌ、Ｌ－チロシン（塩基フリー）０．２ｇ／Ｌ～０．４ｇ／Ｌ、及びＤＬ－バリン０．１５ｇ／Ｌ～０．３５ｇ／Ｌを含むアミノ酸と、
塩化コリン０．０００８ｇ／Ｌ～０．００１２ｇ／Ｌ、フラビンモノヌクレオチドナトリウム塩０．００００８ｇ／Ｌ～０．０００１２ｇ／Ｌ、葉酸０．０００８ｇ／Ｌ～０．００１２ｇ／Ｌ、ミオイノシトール０．００１５ｇ／Ｌ～０．００２５ｇ／Ｌ、ニコチンアミド０．０００８ｇ／Ｌ～０．００１２ｇ／Ｌ、ＤＬ－パントテン酸ヘミカルシウム塩０．０００８ｇ／Ｌ～０．００１２ｇ／Ｌ、ピリドキシン塩酸塩０．０００８ｇ／Ｌ～０．００１２ｇ／Ｌ、及びチアミン一リン酸塩酸塩０．０００８ｇ／Ｌ～０．００１２ｇ／Ｌを含むビタミン類と、
Ｄ－ガラクトース０．７ｇ／Ｌ～１．２ｇ／Ｌと、
フェノールレッドナトリウム塩０．００８ｇ／Ｌ～０．０１３ ｇ／Ｌと、
ピルビン酸ナトリウム塩０．４５ｇ／Ｌ～０．６ｇ／Ｌと、
ウシ胎児血清（ＦＢＳ）２％（ｖ／ｖ）～４％（ｖ／ｖ）と、
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）０．３％（ｗ／ｖ）～０．６％（ｗ／ｖ）と、
Ｈｅｐｅｓ８ｍＭ～１５ｍＭ （ｐＨ７～８）と、
グルコース３ｇ／Ｌ～５．５ｇ／Ｌと、
乳酸０．０６ｍＭ～０．１５ｍＭと、
を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の精子の保存方法。
【請求項7】
前記魚類は、メダカであり、前記精子保存液は、終濃度として、塩化カルシウム二水和物０．１ｇ／Ｌ～０．２５ｇ／Ｌ、塩化マグネシウム六水和物０．１５ｇ／Ｌ～０．２５ｇ／Ｌ、無水硫酸マグネシウム０．０６ｇ／Ｌ～０．１２ｇ／Ｌ、塩化カリウム０．３ｇ／Ｌ～０．６ｇ／Ｌ、無水リン酸二水素カリウム０．０４ｇ／Ｌ～０．０８ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム６．０ｇ／Ｌ～１０．０ｇ／Ｌ、及び無水リン酸水素二ナトリウム０．１５ｇ／Ｌ～０．２５ｇ／Ｌ含む無機塩類と、
ＤＬ－アラニン０．０７ｇ／Ｌ～０．６ｇ／Ｌ、Ｌ－アルギニン（塩基フリー）０．１５ｇ／Ｌ～０．６５ｇ／Ｌ、無水Ｌ－アスパラギン０．０８ｇ／Ｌ～０．３５ｇ／Ｌ 、Ｌ－システイン（塩基フリー）０．０４５ｇ／Ｌ～０．２ｇ／Ｌ、Ｌ－グルタミン０．０８５ｇ／Ｌ～０．４ ｇ／Ｌ、グリシン０．０８ｇ／Ｌ～０．３５ｇ／Ｌ、Ｌ－ヒスチジン０．０７ｇ／Ｌ～０．３５ｇ／Ｌ、ＤＬ－イソロイシン０．０７ｇ／Ｌ～０．３５ｇ／Ｌ、Ｌ－ロイシン０．０４ｇ／Ｌ～０．２ｇ／Ｌ、Ｌ－リジン０．０２ｇ／Ｌ～０．０９５ｇ／Ｌ、ＤＬ－メチオニン０．０４５ｇ／Ｌ～０．２５ｇ／Ｌ、ＤＬ－フェニルアラニン０．０８５ｇ／Ｌ～０．３５ｇ／Ｌ、Ｌ－セリン０．０８ｇ／Ｌ～０．３ｇ／Ｌ、ＤＬ－スレオニン０．２～０．８ｇ／Ｌ、Ｌ－トリプトファン０．０１～０．０２ｇ／Ｌ、Ｌ－チロシン（塩基フリー）０．０８５～０．４ｇ／Ｌ、ＤＬ－バリン０．０８５～０．３５ｇ／Ｌ含むアミノ酸と、
塩化コリン０．０００４ｇ／Ｌ～０．００１２ｇ／Ｌ、フラビンモノヌクレオチドナトリウム塩０．００００４ｇ／Ｌ～０．０００１２ｇ／Ｌ、葉酸０．０００４ｇ／Ｌ～０．００１２ｇ／Ｌ、ミオイノシトール０．０００７ｇ／Ｌ～０．００２５ｇ／Ｌ、ニコチンアミド０．０００４ｇ／Ｌ～０．００１２ｇ／Ｌ、ＤＬ－パントテン酸ヘミカルシウム塩０．０００４ｇ／Ｌ～０．００１２ｇ／Ｌ、ピリドキシン塩酸塩０．０００４ｇ／Ｌ～０．００１２ｇ／Ｌ、及びチアミン一リン酸塩酸塩０．０００４ｇ／Ｌ～０．００１２ｇ／Ｌ含むビタミン類と、
Ｄ－ガラクトース０．３ｇ／Ｌ～１．２ｇ／Ｌと、
フェノールレッドナトリウム塩０．００４ｇ／Ｌ～０．０１３ｇ／Ｌと、
ピルビン酸ナトリウム塩０．２ｇ／Ｌ～０．６ｇ／Ｌと、
ウシ胎児血清（ＦＢＳ） ２（ｖ／ｖ）～４％（ｖ／ｖ）と、
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ） ０．３（ｗ／ｖ）～０．６％（ｗ／ｖ）と、
Ｈｅｐｅｓ８ｍＭ～１５ｍＭ （ｐＨ ７～８）と、
グルコース３ｇ／Ｌ～５．５ｇ／Ｌと、
乳酸０．０６ｍＭ～０．３５ｍＭと、
を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の精子の保存方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、精子保存液及び精子保存方法に関する。
【背景技術】
【0002】
治療目的や研究目的で精子を輸送する場合、精子を凍結することが一般的である。しかし、凍結精子の凍結融解後の受精能が著しく低下することが問題であった。
【0003】
このような問題に対し、凍結融解後の精子の受精能を維持するための凍結保存剤の改良がなされてきた（例えば、特許文献１参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【文献】特開２００９－０２２２１４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
しかしながら、凍結保存した精子を輸送する場合には、ドライジッパーを用いて液体窒素中に凍結保存した精子を入れ、高額な容器とともに荷物として輸送する方法を取らざるを得なかったため、高額の輸送コストを要した。
【0006】
本発明は上記事情を鑑みてなされたものであり、室温で精子を長期間保存できる精子保存液及び精子保存方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者らは、精子保存液の組成を検討した結果、室温でも魚類の精子は１週間以上、ほ乳類の精子は３日以上保存できる精子保存液を同定し、本発明を完成させた。
【0008】
すなわち、本発明は以下の態様を含む。
［１］無機塩類、アミノ酸、ビタミン類、及びウシ胎児血清を含有することを特徴とする精子保存液。
［２］さらに、ウシ血清アルブミンを含有する［１］に記載の精子保存液。
［３］さらに、緩衝剤を含有し、ｐＨが６．５～１０．０である［１］又は［２］に記載の精子保存液。
［４］さらに、グルコースを含有する［１］～［３］のいずれか一つに記載の精子保存液。
［５］さらに、乳酸を含有する［１］～［４］のいずれか一つに記載の精子保存液。
［６］さらに、抗酸化剤を含有する［１］～［５］のいずれか一つに記載の精子保存液。
［７］さらに、ペニシリン及び／又はストレプトマイシンを含有する［１］～［６］のいずれか一つに記載の精子保存液。
［８］［１］～［７］のいずれか一つに記載の精子保存液を用いることを特徴とする精子保存方法。
［１］無機塩類、アミノ酸、ビタミン類、及びウシ胎児血清を含有することを特徴とする精子保存液。
［２］さらに、ウシ血清アルブミンを含有する［１］に記載の精子保存液。
［３］さらに、緩衝剤を含有し、ｐＨが６．５～１０．０である［１］又は［２］に記載の精子保存液。
［４］さらに、グルコースを含有する［１］～［３］のいずれか一つに記載の精子保存液。
［５］さらに、乳酸を含有する［１］～［４］のいずれか一つに記載の精子保存液。
［６］さらに、抗酸化剤を含有する［１］～［５］のいずれか一つに記載の精子保存液。
［７］さらに、ペニシリン及び／又はストレプトマイシンを含有する［１］～［６］のいずれか一つに記載の精子保存液。
［８］［１］～［７］のいずれか一つに記載の精子保存液を用いることを特徴とする精子保存方法。
【発明の効果】
【0009】
本発明によれば、室温でも魚類の精子を１週間以上、ほ乳類の精子は４日以上保存できる。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1】比較例１～２の培地を用いて保存した精子の受精率を示したグラフである。
【図2】比較例２及び実施例１の培地を用いて保存した精子の受精率を示したグラフである。
【図3】実施例１～２の培地を用いて保存した精子の受精率を示したグラフである。
【図4】実施例２～３の培地を用いて保存した精子の受精率を示したグラフである。
【図5】実施例３～４の培地を用いて保存した精子の受精率を示したグラフである。
【図6】実施例４の培地を用いて、７日間、２８日間保存した精子の受精率を示したグラフである。
【図7】実施例４～６の培地を用いて、７日間、８日間保存した精子の受精率を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0011】
＜＜精子保存液＞＞
本発明の精子保存液は、無機塩類、アミノ酸、ビタミン類、及びウシ胎児血清を含有する。
本発明の精子保存液は、無機塩類、アミノ酸、ビタミン類、及びウシ胎児血清を含有する。
【0012】
無機塩類としては、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素カリウム、これらの無水物、これらの水和物が挙げられる。
中でも、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、及びリン酸二水素カリウム、並びに、これらの無水物、及びこれらの水和物からなる群から選ばれる少なくとも１種を含有することが好ましく、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、塩化ナトリウム、及びリン酸水素二ナトリウム、並びに、これらの無水物、及びこれらの水和物からなる群から選ばれる少なくとも１種を含有することがより好ましく、塩化カルシウム二水和物、塩化マグネシウム六水和物、無水硫酸マグネシウム、塩化カリウム、無水リン酸二水素カリウム、塩化ナトリウム、及び無水リン酸水素二ナトリウムからなる群から選ばれる少なくとも１種を含有することが更に好ましい。
中でも、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、及びリン酸二水素カリウム、並びに、これらの無水物、及びこれらの水和物からなる群から選ばれる少なくとも１種を含有することが好ましく、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、塩化ナトリウム、及びリン酸水素二ナトリウム、並びに、これらの無水物、及びこれらの水和物からなる群から選ばれる少なくとも１種を含有することがより好ましく、塩化カルシウム二水和物、塩化マグネシウム六水和物、無水硫酸マグネシウム、塩化カリウム、無水リン酸二水素カリウム、塩化ナトリウム、及び無水リン酸水素二ナトリウムからなる群から選ばれる少なくとも１種を含有することが更に好ましい。
【0013】
亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素カリウム、これらの無水物、又はこれらの水和物としては、精子保存液１Ｌ中に０．００５ｇ～２ｇ含有することが好ましく、０．０１ｇ～１ｇ含有することがより好ましく、０．０２ｇ～０．５ｇ含有することが更に好ましい。
塩化ナトリウムとしては、精子保存液１Ｌ中に１ｇ～４０ｇ含有することが好ましく、２ｇ～２０ｇ含有することがより好ましく、５ｇ～１０ｇ含有することが更に好ましい。
塩化ナトリウムとしては、精子保存液１Ｌ中に１ｇ～４０ｇ含有することが好ましく、２ｇ～２０ｇ含有することがより好ましく、５ｇ～１０ｇ含有することが更に好ましい。
【0014】
ゼブラフィッシュ用又はメダカ用の精子保存液における無機塩類としては、塩化カルシウム二水和物０．１ｇ／Ｌ～０．２５ｇ／Ｌ、塩化マグネシウム六水和物０．１５ｇ／Ｌ～０．２５ｇ／Ｌ、無水硫酸マグネシウム０．０６ｇ／Ｌ～０．１２ｇ／Ｌ、塩化カリウム０．３ｇ／Ｌ～０．６ｇ／Ｌ、無水リン酸二水素カリウム０．０４ｇ／Ｌ～０．０８ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム６．０ｇ／Ｌ～１０．０ｇ／Ｌ、及び無水リン酸水素二ナトリウム０．１５ｇ／Ｌ～０．２５ｇ／Ｌを含むことが好ましく、塩化カルシウム二水和物０．１ｇ／Ｌ～０．２５ｇ／Ｌ、塩化マグネシウム六水和物０．１５ｇ／Ｌ～０．２５ｇ／Ｌ、無水硫酸マグネシウム０．０６ｇ／Ｌ～０．１２ｇ／Ｌ、塩化カリウム０．３ｇ／Ｌ～０．６ｇ／Ｌ、無水リン酸二水素カリウム０．０４ｇ／Ｌ～０．０８ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム６．０ｇ／Ｌ～１０．０ｇ／Ｌ、及び無水リン酸水素二ナトリウム０．１５ｇ／Ｌ～０．２５ｇ／Ｌからなることがより好ましい。
【0015】
マウス用の精子保存液における無機塩類としては、塩化カルシウム二水和物０．０４ｇ／Ｌ～０．０７５ｇ／Ｌ、塩化マグネシウム六水和物０．１５ｇ／Ｌ～０．２５ｇ／Ｌ、無水硫酸マグネシウム０．０６ｇ／Ｌ～０．１２ｇ／Ｌ、塩化カリウム０．０９ｇ／Ｌ～０．１８ｇ／Ｌ、無水リン酸二水素カリウム０．０４ｇ／Ｌ～０．０８ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム６．０ｇ／Ｌ～１０．０ｇ／Ｌ、及び無水リン酸水素二ナトリウム０．１５ｇ／Ｌ～０．２５ｇ／Ｌを含むことが好ましく、塩化カルシウム二水和物０．０４ｇ／Ｌ～０．０７５ｇ／Ｌ、塩化マグネシウム六水和物０．１５ｇ／Ｌ～０．２５ｇ／Ｌ、無水硫酸マグネシウム０．０６ｇ／Ｌ～０．１２ｇ／Ｌ、塩化カリウム０．０９ｇ／Ｌ～０．１８ｇ／Ｌ、無水リン酸二水素カリウム０．０４ｇ／Ｌ～０．０８ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム６．０ｇ／Ｌ～１０．０ｇ／Ｌ、及び無水リン酸水素二ナトリウム０．１５ｇ／Ｌ～０．２５ｇ／Ｌからなることがより好ましい。
【0016】
精子保存液中の無機塩類の総量としては、０．０１～１０％含有することが好ましく、０．１～１０％含有することがより好ましく、０．１～５％含有することが更に好ましい。
【0017】
アミノ酸としては、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、これらのＬ体、Ｄ体、ＤＬ体、塩基フリー体、これらの無水物が挙げられる。
中でも、アラニン、アルギニン、アスパラギン、システイン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリン、並びに、これらのＬ体、Ｄ体、ＤＬ体、塩基フリー体、及びこれらの無水物からなる群から選ばれる少なくとも１種を含有することが好ましく、ＤＬ－アラニン、Ｌ－アルギニン（塩基フリー）、無水Ｌ－アスパラギン、Ｌ－システイン（塩基フリー）、Ｌ－グルタミン、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、ＤＬ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、ＤＬ－メチオニン、ＤＬ－フェニルアラニン、Ｌ－セリン、ＤＬ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン（塩基フリー）、及びＤＬ－バリンからなる群から選ばれる少なくとも１種を含有することがより好ましい。
中でも、アラニン、アルギニン、アスパラギン、システイン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリン、並びに、これらのＬ体、Ｄ体、ＤＬ体、塩基フリー体、及びこれらの無水物からなる群から選ばれる少なくとも１種を含有することが好ましく、ＤＬ－アラニン、Ｌ－アルギニン（塩基フリー）、無水Ｌ－アスパラギン、Ｌ－システイン（塩基フリー）、Ｌ－グルタミン、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、ＤＬ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、ＤＬ－メチオニン、ＤＬ－フェニルアラニン、Ｌ－セリン、ＤＬ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン（塩基フリー）、及びＤＬ－バリンからなる群から選ばれる少なくとも１種を含有することがより好ましい。
【0018】
アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、これらのＬ体、Ｄ体、ＤＬ体、塩基フリー体、又はこれらの無水物としては、精子保存液１Ｌ中に０．０００５ｇ～４ｇ含有することが好ましく、０．００１ｇ～２ｇ含有することがより好ましく、０．００３ｇ～１ｇ含有することが更に好ましい。
【0019】
ゼブラフィッシュ用又はマウス用の精子保存液におけるアミノ酸としては、ＤＬ－アラニン０．３ｇ／Ｌ～０．６ｇ／Ｌ、Ｌ－アルギニン（塩基フリー）０．３５ｇ／Ｌ～０．６５ｇ／Ｌ、無水Ｌ－アスパラギン０．１５ｇ／Ｌ～０．３５ｇ／Ｌ、Ｌ－システイン（塩基フリー）０．０８ｇ／Ｌ～０．２ｇ／Ｌ、Ｌ－グルタミン０．２ｇ／Ｌ～０．４ｇ／Ｌ、グリシン０．１５ｇ／Ｌ～０．３５ｇ／Ｌ、Ｌ－ヒスチジン０．１５ｇ／Ｌ～０．３５ｇ／Ｌ、ＤＬ－イソロイシン０．１３ｇ／Ｌ～０．３５ｇ／Ｌ、Ｌ－ロイシン０．０８ｇ／Ｌ～０．２ｇ／Ｌ、Ｌ－リジン０．０５５ｇ／Ｌ～０．０９５ｇ／Ｌ、ＤＬ－メチオニン０．０８ｇ／Ｌ～０．２５ｇ／Ｌ、ＤＬ－フェニルアラニン０．１５ｇ／Ｌ～０．３５ｇ／Ｌ、Ｌ－セリン０．１５ｇ／Ｌ～０．３ｇ／Ｌ、ＤＬ－スレオニン０．４ｇ／Ｌ～０．８ｇ／Ｌ、Ｌ－トリプトファン０．０１５ｇ／Ｌ～０．０３５ｇ／Ｌ、Ｌ－チロシン（塩基フリー）０．２ｇ／Ｌ～０．４ｇ／Ｌ、及びＤＬ－バリン０．１５ｇ／Ｌ～０．３５ｇ／Ｌを含むことが好ましく、ＤＬ－アラニン０．３ｇ／Ｌ～０．６ｇ／Ｌ、Ｌ－アルギニン（塩基フリー）０．３５ｇ／Ｌ～０．６５ｇ／Ｌ、無水Ｌ－アスパラギン０．１５ｇ／Ｌ～０．３５ｇ／Ｌ、Ｌ－システイン（塩基フリー）０．０８ｇ／Ｌ～０．２ｇ／Ｌ、Ｌ－グルタミン０．２ｇ／Ｌ～０．４ｇ／Ｌ、グリシン０．１５ｇ／Ｌ～０．３５ｇ／Ｌ、Ｌ－ヒスチジン０．１５ｇ／Ｌ～０．３５ｇ／Ｌ、ＤＬ－イソロイシン０．１３ｇ／Ｌ～０．３５ｇ／Ｌ、Ｌ－ロイシン０．０８ｇ／Ｌ～０．２ｇ／Ｌ、Ｌ－リジン０．０５５ｇ／Ｌ～０．０９５ｇ／Ｌ、ＤＬ－メチオニン０．０８ｇ／Ｌ～０．２５ｇ／Ｌ、ＤＬ－フェニルアラニン０．１５ｇ／Ｌ～０．３５ｇ／Ｌ、Ｌ－セリン０．１５ｇ／Ｌ～０．３ｇ／Ｌ、ＤＬ－スレオニン０．４ｇ／Ｌ～０．８ｇ／Ｌ、Ｌ－トリプトファン０．０１５ｇ／Ｌ～０．０３５ｇ／Ｌ、Ｌ－チロシン（塩基フリー）０．２ｇ／Ｌ～０．４ｇ／Ｌ、及びＤＬ－バリン０．１５ｇ／Ｌ～０．３５ｇ／Ｌからなることがより好ましい。
【0020】
メダカ用の精子保存液におけるアミノ酸としては、ＤＬ－アラニン０．０７ｇ／Ｌ～０．６ｇ／Ｌ、Ｌ－アルギニン（塩基フリー）０．１５ｇ／Ｌ～０．６５ｇ／Ｌ、無水Ｌ－アスパラギン０．０８ｇ／Ｌ～０．３５ｇ／Ｌ、Ｌ－システイン（塩基フリー）０．０４５ｇ／Ｌ～０．２ｇ／Ｌ、Ｌ－グルタミン０．０８５ｇ／Ｌ～０．４ｇ／Ｌ、グリシン０．０８ｇ／Ｌ～０．３５ｇ／Ｌ、Ｌ－ヒスチジン０．０７ｇ／Ｌ～０．３５ｇ／Ｌ、ＤＬ－イソロイシン０．０７ｇ／Ｌ～０．３５ｇ／Ｌ、Ｌ－ロイシン０．０４ｇ／Ｌ～０．２ｇ／Ｌ、Ｌ－リジン０．０２ｇ／Ｌ～０．０９５ｇ／Ｌ、ＤＬ－メチオニン０．０４５ｇ／Ｌ～０．２５ｇ／Ｌ、ＤＬ－フェニルアラニン０．０８５ｇ／Ｌ～０．３５ｇ／Ｌ、Ｌ－セリン０．０８ｇ／Ｌ～０．３ｇ／Ｌ、ＤＬ－スレオニン０．２ｇ／Ｌ～０．８ｇ／Ｌ、Ｌ－トリプトファン０．０７５ｇ／Ｌ～０．０３５ｇ／Ｌ、Ｌ－チロシン（塩基フリー）０．０８５ｇ／Ｌ～０．４ｇ／Ｌ、及びＤＬ－バリン０．０８５ｇ／Ｌ～０．３５ｇ／Ｌを含むことが好ましく、ＤＬ－アラニン０．０７ｇ／Ｌ～０．６ｇ／Ｌ、Ｌ－アルギニン（塩基フリー）０．１５ｇ／Ｌ～０．６５ｇ／Ｌ、無水Ｌ－アスパラギン０．０８ｇ／Ｌ～０．３５ｇ／Ｌ、Ｌ－システイン（塩基フリー）０．０４５ｇ／Ｌ～０．２ｇ／Ｌ、Ｌ－グルタミン０．０８５ｇ／Ｌ～０．４ｇ／Ｌ、グリシン０．０８ｇ／Ｌ～０．３５ｇ／Ｌ、Ｌ－ヒスチジン０．０７ｇ／Ｌ～０．３５ｇ／Ｌ、ＤＬ－イソロイシン０．０７ｇ／Ｌ～０．３５ｇ／Ｌ、Ｌ－ロイシン０．０４ｇ／Ｌ～０．２ｇ／Ｌ、Ｌ－リジン０．０２ｇ／Ｌ～０．０９５ｇ／Ｌ、ＤＬ－メチオニン０．０４５ｇ／Ｌ～０．２５ｇ／Ｌ、ＤＬ－フェニルアラニン０．０８５ｇ／Ｌ～０．３５ｇ／Ｌ、Ｌ－セリン０．０８ｇ／Ｌ～０．３ｇ／Ｌ、ＤＬ－スレオニン０．２ｇ／Ｌ～０．８ｇ／Ｌ、Ｌ－トリプトファン０．０７５ｇ／Ｌ～０．０３５ｇ／Ｌ、Ｌ－チロシン（塩基フリー）０．０８５ｇ／Ｌ～０．４ｇ／Ｌ、及びＤＬ－バリン０．０８５ｇ／Ｌ～０．３５ｇ／Ｌからなることがより好ましい。
【0021】
精子保存液中のアミノ酸の総量としては、０．３～２００ｍＭ含有することが好ましく、１～１００ｍＭ含有することがより好ましく、３～５０ｍＭ含有することが更に好ましい。
【0022】
ビタミン類としては、ビオチン、コリン、葉酸、イノシトール、ニコチン酸、パントテン酸、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、ビタミンＢ１２、パラアミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）、アスコルビン酸、エルゴカルシフェロール（ビタミンＤ２）、ビタミンＡ、α－トコフェロール、これらの誘導体、これらの塩、これらの水和物が挙げられる。
中でも、塩化コリン、フラビンモノヌクレオチドナトリウム塩、葉酸、ミオイノシトール、ニコチンアミド、ＤＬ－パントテン酸ヘミカルシウム塩、ピリドキシン塩酸塩、及びチアミン一リン酸塩酸塩からなる群から選ばれる少なくとも１種を含有することがより好ましく、塩化コリン、フラビンモノヌクレオチドナトリウム塩、葉酸、ミオイノシトール、ニコチンアミド、ＤＬ－パントテン酸ヘミカルシウム塩、ピリドキシン塩酸塩、及びチアミン一リン酸塩酸塩からなる群から選ばれる少なくとも１種を含有することが更に好ましい。
中でも、塩化コリン、フラビンモノヌクレオチドナトリウム塩、葉酸、ミオイノシトール、ニコチンアミド、ＤＬ－パントテン酸ヘミカルシウム塩、ピリドキシン塩酸塩、及びチアミン一リン酸塩酸塩からなる群から選ばれる少なくとも１種を含有することがより好ましく、塩化コリン、フラビンモノヌクレオチドナトリウム塩、葉酸、ミオイノシトール、ニコチンアミド、ＤＬ－パントテン酸ヘミカルシウム塩、ピリドキシン塩酸塩、及びチアミン一リン酸塩酸塩からなる群から選ばれる少なくとも１種を含有することが更に好ましい。
【0023】
ビオチン、コリン、葉酸、イノシトール、ニコチン酸、パントテン酸、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、ビタミンＢ１２、パラアミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）、アスコルビン酸、エルゴカルシフェロール（ビタミンＤ２）、ビタミンＡ、α－トコフェロール、これらの誘導体、これらの塩、又はこれらの水和物としては、精子保存液１Ｌ中に０．０１ｍｇ～５ｍｇ含有することが好ましく、０．０２ｍｇ～２ｍｇ含有することがより好ましく、０．０３ｍｇ～１ｍｇ含有することが更に好ましい。
【0024】
ゼブラフィッシュ用、又はマウス用の精子保存液におけるビタミン類としては、塩化コリン０．０００８ｇ／Ｌ～０．００１２ｇ／Ｌ、フラビンモノヌクレオチドナトリウム塩０．００００８ｇ／Ｌ～０．０００１２ｇ／Ｌ、葉酸０．０００８ｇ／Ｌ～０．００１２ｇ／Ｌ、ミオイノシトール０．００１５ｇ／Ｌ～０．００２５ｇ／Ｌ、ニコチンアミド０．０００８ｇ／Ｌ～０．００１２ｇ／Ｌ、ＤＬ－パントテン酸ヘミカルシウム塩０．０００８ｇ／Ｌ～０．００１２ｇ／Ｌ、ピリドキシン塩酸塩０．０００８ｇ／Ｌ～０．００１２ｇ／Ｌ、及びチアミン一リン酸塩酸塩０．０００８ｇ／Ｌ～０．００１２ｇ／Ｌを含むことが好ましく、塩化コリン０．０００８ｇ／Ｌ～０．００１２ｇ／Ｌ、フラビンモノヌクレオチドナトリウム塩０．００００８ｇ／Ｌ～０．０００１２ｇ／Ｌ、葉酸０．０００８ｇ／Ｌ～０．００１２ｇ／Ｌ、ミオイノシトール０．００１５ｇ／Ｌ～０．００２５ｇ／Ｌ、ニコチンアミド０．０００８ｇ／Ｌ～０．００１２ｇ／Ｌ、ＤＬ－パントテン酸ヘミカルシウム塩０．０００８ｇ／Ｌ～０．００１２ｇ／Ｌ、ピリドキシン塩酸塩０．０００８ｇ／Ｌ～０．００１２ｇ／Ｌ、及びチアミン一リン酸塩酸塩０．０００８ｇ／Ｌ～０．００１２ｇ／Ｌからなることがより好ましい。
【0025】
メダカ用の精子保存液におけるビタミン類としては、塩化コリン０．０００４ｇ／Ｌ～０．００１２ｇ／Ｌ、フラビンモノヌクレオチドナトリウム塩０．００００４ｇ／Ｌ～０．０００１２ｇ／Ｌ、葉酸０．０００４ｇ／Ｌ～０．００１２ｇ／Ｌ、ミオイノシトール０．０００７ｇ／Ｌ～０．００２５ｇ／Ｌ、ニコチンアミド０．０００４ｇ／Ｌ～０．００１２ｇ／Ｌ、ＤＬ－パントテン酸ヘミカルシウム塩０．０００４ｇ／Ｌ～０．００１２ｇ／Ｌ、ピリドキシン塩酸塩０．０００４ｇ／Ｌ～０．００１２ｇ／Ｌ、及びチアミン一リン酸塩酸塩０．０００４ｇ／Ｌ～０．００１２ｇ／Ｌを含むことが好ましく、塩化コリン０．０００４ｇ／Ｌ～０．００１２ｇ／Ｌ、フラビンモノヌクレオチドナトリウム塩０．００００４ｇ／Ｌ～０．０００１２ｇ／Ｌ、葉酸０．０００４ｇ／Ｌ～０．００１２ｇ／Ｌ、ミオイノシトール０．０００７ｇ／Ｌ～０．００２５ｇ／Ｌ、ニコチンアミド０．０００４ｇ／Ｌ～０．００１２ｇ／Ｌ、ＤＬ－パントテン酸ヘミカルシウム塩０．０００４ｇ／Ｌ～０．００１２ｇ／Ｌ、ピリドキシン塩酸塩０．０００４ｇ／Ｌ～０．００１２ｇ／Ｌ、及びチアミン一リン酸塩酸塩０．０００４ｇ／Ｌ～０．００１２ｇ／Ｌからなることがより好ましい。
【0026】
精子保存液中の総量としては、精子保存液１Ｌ中に、０．１ｍｇ～４０ｍｇ含有することが好ましく、０．３ｍｇ～２０ｍｇ含有することがより好ましく、０．６ｍｇ～１０ｍｇ含有することが更に好ましい。
【0027】
ウシ胎児血清としては、精子保存液中に０．２％（ｖ／ｖ）～１５％（ｖ／ｖ）含有することが好ましく、０．５％（ｖ／ｖ）～１０％（ｖ／ｖ）含有することがより好ましく、１％（ｖ／ｖ）～５％（ｖ／ｖ）含有することが更に好ましい。
ゼブラフィッシュ用、メダカ用又はマウス用の精子保存液は、ウシ胎児血清を、２％（ｖ／ｖ）～４％（ｖ／ｖ）含むことが好ましい。
ゼブラフィッシュ用、メダカ用又はマウス用の精子保存液は、ウシ胎児血清を、２％（ｖ／ｖ）～４％（ｖ／ｖ）含むことが好ましい。
【0028】
本発明の精子保存液は、さらに、ウシ血清アルブミンを含有することが好ましい。ウシ血清アルブミンとしては、精子保存液中に０．０５％～１０％含有することが好ましく、０．１％～５％含有することがより好ましく、０．２％～２％含有することが更に好ましい。
ゼブラフィッシュ用、メダカ用又はマウス用の精子保存液は、ウシ血清アルブミンを、０．３％（ｗ／ｖ）～０．６％（ｗ／ｖ）含むことが好ましい。
ゼブラフィッシュ用、メダカ用又はマウス用の精子保存液は、ウシ血清アルブミンを、０．３％（ｗ／ｖ）～０．６％（ｗ／ｖ）含むことが好ましい。
【0029】
本発明の精子保存液は、さらに、Ｈｅｐｅｓ（２－［４－（２－Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ） 等の緩衝剤を含有してｐＨが６．５～１０．０であることが好ましい。Ｈｅｐｅｓとしては、精子保存液中に１～１００ｍＭ含有することが好ましく、２～５０ｍＭ含有することがより好ましく、５～２０ｍＭ含有することが更に好ましい。 ｐＨとしては、６．５～１０．０であり、７．０～９．５であることが好ましく、７．５～９．０であることがより好ましい。
ゼブラフィッシュ用、又はメダカ用の精子保存液は、Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ ７～８）を、８ｍＭ～１５ｍＭ含むことが好ましい。
マウス用の精子保存液は、Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ ８～９）を、１５ｍＭ～２５ｍＭ含むことが好ましい。
ゼブラフィッシュ用、又はメダカ用の精子保存液は、Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ ７～８）を、８ｍＭ～１５ｍＭ含むことが好ましい。
マウス用の精子保存液は、Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ ８～９）を、１５ｍＭ～２５ｍＭ含むことが好ましい。
【0030】
本発明の精子保存液は、さらに、グルコースを含有することが好ましい。グルコースとしては、精子保存液１Ｌ中に、０．５ｇ～４０ｇ含有することが好ましく、１ｇ～２０ｇ含有することがより好ましく、２ｇ～１０ｇ含有することが更に好ましい。
ゼブラフィッシュ用、メダカ用又はマウス用の精子保存液は、グルコースを、３ｇ／Ｌ～５．５ｇ／Ｌ含むことが好ましい。
ゼブラフィッシュ用、メダカ用又はマウス用の精子保存液は、グルコースを、３ｇ／Ｌ～５．５ｇ／Ｌ含むことが好ましい。
【0031】
本発明の精子保存液は、さらに、乳酸を含有することが好ましい。乳酸としては、精子保存液中に、０．０１ｍＭ～２ｍＭ含有することが好ましく、０．０２ｍＭ～１ｍＭ含有することがより好ましく、０．０５ｍＭ～０．５ｍＭ含有することが更に好ましい。
ゼブラフィッシュ用、又はマウス用の精子保存液は、乳酸を、０．０６ｍＭ～０．１５ｍＭ含むことが好ましい。
メダカ用の精子保存液は、乳酸を、０．０６ｍＭ～０．３５ｍＭ含むことが好ましい。
ゼブラフィッシュ用、又はマウス用の精子保存液は、乳酸を、０．０６ｍＭ～０．１５ｍＭ含むことが好ましい。
メダカ用の精子保存液は、乳酸を、０．０６ｍＭ～０．３５ｍＭ含むことが好ましい。
【0032】
本発明の精子保存液は、さらに、抗酸化剤を含有することが好ましい。抗酸化剤としては、ビタミンＣ、ハイドロキノン、アルブチン、アスタキサンチン、ジブチルヒドロキシトルエン、コエンザイムＱ１０、ブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、クエン酸、グルタチオン、セレン、リコペン、ビタミンＡ、ビタミンＥ等が挙げられる。
抗酸化剤としては、精子保存液中に、０．０１ｍＭ～２ｍＭ含有することが好ましく、０．０２ｍＭ～１ｍＭ含有することがより好ましく、０．０５ｍＭ～０．５ｍＭ含有することが更に好ましい。
抗酸化剤としては、精子保存液中に、０．０１ｍＭ～２ｍＭ含有することが好ましく、０．０２ｍＭ～１ｍＭ含有することがより好ましく、０．０５ｍＭ～０．５ｍＭ含有することが更に好ましい。
【0033】
本発明の精子保存液は、さらに、ペニシリン及び／又はストレプトマイシンを含有することが好ましく、ペニシリン及びストレプトマイシンを含有することがより好ましい。５，０００ユニット／ｍｌのペニシリン及び５，０００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンにおいては、精子保存液中に、５０～１０００倍希釈して用いられることが好ましく、５０～３００倍希釈して用いられることがより好ましく、５０～１５０倍希釈して用いられることが更に好ましい。
【0034】
その他、本発明の精子保存液は、Ｄ－ガラクトース、フェノールレッドナトリウム塩、ピルビン酸ナトリウム塩等を含有することが好ましい。
ゼブラフィッシュ用、又はマウス用の精子保存液は、Ｄ－ガラクトースを０．７ｇ／Ｌ～１．２ｇ／Ｌ含むことが好ましく、フェノールレッドナトリウム塩を０．００８ｇ／Ｌ～０．０１３ｇ／Ｌ含むことが好ましく、ピルビン酸ナトリウム塩を０．４５ｇ／Ｌ～０．６ｇ／Ｌ含むことが好ましい。
メダカ用の精子保存液は、Ｄ－ガラクトースを０．３ｇ／Ｌ～１．２ｇ／Ｌ含むことが好ましく、フェノールレッドナトリウム塩を０．００４ｇ／Ｌ～０．０１３ｇ／Ｌ含むことが好ましく、ピルビン酸ナトリウム塩を０．２ｇ／Ｌ～０．６ｇ／Ｌ含むことが好ましい。
ゼブラフィッシュ用、又はマウス用の精子保存液は、Ｄ－ガラクトースを０．７ｇ／Ｌ～１．２ｇ／Ｌ含むことが好ましく、フェノールレッドナトリウム塩を０．００８ｇ／Ｌ～０．０１３ｇ／Ｌ含むことが好ましく、ピルビン酸ナトリウム塩を０．４５ｇ／Ｌ～０．６ｇ／Ｌ含むことが好ましい。
メダカ用の精子保存液は、Ｄ－ガラクトースを０．３ｇ／Ｌ～１．２ｇ／Ｌ含むことが好ましく、フェノールレッドナトリウム塩を０．００４ｇ／Ｌ～０．０１３ｇ／Ｌ含むことが好ましく、ピルビン酸ナトリウム塩を０．２ｇ／Ｌ～０．６ｇ／Ｌ含むことが好ましい。
【0035】
＜＜精子保存方法＞＞
本発明の精子保存方法は、上述した精子保存液を用いる方法である。
保存対象の精子としては、例えば、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウシ、マウス、ラット、ハムスター等の哺乳動物の精子が挙げられる。更に、魚類、両生類、鳥類、爬虫類等の精子も挙げられる。魚類の精子としては、メダカ、ゼブラフィッシュの精子が挙げられる。
本発明の精子保存方法は、上述した精子保存液を用いる方法である。
保存対象の精子としては、例えば、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウシ、マウス、ラット、ハムスター等の哺乳動物の精子が挙げられる。更に、魚類、両生類、鳥類、爬虫類等の精子も挙げられる。魚類の精子としては、メダカ、ゼブラフィッシュの精子が挙げられる。
【0036】
本発明の精子保存液及び精子保存方法によれば、室温で精子を長期間保存できるため、少量の精子懸濁液をチューブに入れて封筒で輸送することができる。精子保存液そのものは、低価格で調整できるため、本発明によれば大幅な輸送コストの削減が可能となる。
【実施例】
【0037】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【0038】
［抗生物質の検討］
２～３個体分のゼブラフィッシュから採取した精子を、氷冷した表１に示す比較例１及び比較例２の培地に懸濁して精子懸濁液を作製した。この精子懸濁液１０μＬをサンプリングし、精子数をカウントした。次いで、培地を用いて７４０００個／μＬに調製した精子懸濁液を冷蔵庫で４日４℃保存した。受精当日、ゼブラフィッシュ雌から卵をガラス製ディッシュに絞り取り、この卵１００個程度に、精子懸濁液４０μＬをかけた後、８００μＬの滅菌魚類飼育水をさらにかけ、１分半放置した。さらに、このチューブに、適量の滅菌魚類飼育水を入れ、この卵を嚢胚期まで培養した後、受精率をカウントした。結果を図１に示す。
２～３個体分のゼブラフィッシュから採取した精子を、氷冷した表１に示す比較例１及び比較例２の培地に懸濁して精子懸濁液を作製した。この精子懸濁液１０μＬをサンプリングし、精子数をカウントした。次いで、培地を用いて７４０００個／μＬに調製した精子懸濁液を冷蔵庫で４日４℃保存した。受精当日、ゼブラフィッシュ雌から卵をガラス製ディッシュに絞り取り、この卵１００個程度に、精子懸濁液４０μＬをかけた後、８００μＬの滅菌魚類飼育水をさらにかけ、１分半放置した。さらに、このチューブに、適量の滅菌魚類飼育水を入れ、この卵を嚢胚期まで培養した後、受精率をカウントした。結果を図１に示す。
【0039】
【表1】
【0040】
【0041】
［ウシ胎児血清（ＦＢＳ）の検討］
表２に示す、氷冷した実施例１及び比較例２の培地を用いた以外は、［抗生物質の検討］と同じ方法で、ＦＢＳ添加による受精率に対する影響を調べた。結果を図２に示す。
表２に示す、氷冷した実施例１及び比較例２の培地を用いた以外は、［抗生物質の検討］と同じ方法で、ＦＢＳ添加による受精率に対する影響を調べた。結果を図２に示す。
【0042】
【表2】
【0043】
【0044】
［ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）とｐＨの検討］
表３に示す、氷冷した実施例１及び実施例２の培地を用いた以外は、［抗生物質の検討］と同じ方法で、ＢＳＡ添加とｐＨ調整による受精率に対する影響を調べた。結果を図３に示す。
表３に示す、氷冷した実施例１及び実施例２の培地を用いた以外は、［抗生物質の検討］と同じ方法で、ＢＳＡ添加とｐＨ調整による受精率に対する影響を調べた。結果を図３に示す。
【0045】
【表3】
【0046】
【0047】
［グルコースの検討］
表４に示す、氷冷した実施例２及び実施例３の培地を用いた以外は、［抗生物質の検討］と同じ方法で、グルコース添加による受精率に対する影響を調べた。結果を図４に示す。
表４に示す、氷冷した実施例２及び実施例３の培地を用いた以外は、［抗生物質の検討］と同じ方法で、グルコース添加による受精率に対する影響を調べた。結果を図４に示す。
【0048】
【表4】
【0049】
【0050】
［乳酸の検討］
表５に示す、氷冷した実施例３及び実施例４の培地を用い、実施例４の培地を用いて作製した精子懸濁液を２３℃で４日保存した以外は、［抗生物質の検討］と同じ方法で、乳酸添加による受精率に対する影響を調べた。結果を図５に示す。
表５に示す、氷冷した実施例３及び実施例４の培地を用い、実施例４の培地を用いて作製した精子懸濁液を２３℃で４日保存した以外は、［抗生物質の検討］と同じ方法で、乳酸添加による受精率に対する影響を調べた。結果を図５に示す。
【0051】
【表5】
【0052】
【0053】
［長期保存効果の検討］
氷冷した実施例４の培地を用い、実施例４の培地を用いて作製した精子懸濁液を２３℃で７日、２８日保存した以外は、［抗生物質の検討］と同じ方法で、乳酸添加による受精率に対する影響を調べた。結果を図６に示す。
氷冷した実施例４の培地を用い、実施例４の培地を用いて作製した精子懸濁液を２３℃で７日、２８日保存した以外は、［抗生物質の検討］と同じ方法で、乳酸添加による受精率に対する影響を調べた。結果を図６に示す。
【0054】
【0055】
［メダカ精子の保存］
表６に示すように、実施例４の培地に加え、乳酸のみを０．２ｍＭに増やした培地を用意した（実施例５）。また、無機塩類（塩化カルシウム二水和物、塩化マグネシウム六水和物、無水硫酸マグネシウム、塩化カリウム、無水リン酸二水素カリウム、塩化ナトリウム、無水リン酸水素二ナトリウム）、ペニシリン／ストレプトマイシン、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ （ｐＨ ８．８）、グルコース、乳酸については、実施例４のゼブラフィッシュに用いた培地の分量と同じで、アミノ酸類、ビタミン類、Ｄ－ガラクトース、フェノールレッドナトリウム塩、ピルビン酸ナトリウム塩についてはゼブラフィッシュに用いた培地の分量の１／２量の培地を用意した（実施例６）。精巣（１つ）を取り出して、０．５％のｂｌｅａｃｈで３０秒滅菌し、メダカのリンガー液（ＢＳＳ）で２回ｗａｓｈ後に、用意したそれぞれの培地（６６μｌ）の中で、ピンセットを使って精子を絞り出した。その精子懸濁液１０μｌを１．５ｍｌチューブに移し、そこに９０μｌの培地を加えて、精子の濃度は４５０，０００／ｍｌで保存した。
７日間室温または８日間４℃で保存した後、受精実験にはメダカ雌から準備した卵を用いて１チューブ分１００μｌ（４５，０００精子）を用いて行った。この卵を嚢胚期まで培養した後、受精率をカウントした。結果を図７に示す。図７中、縦軸は受精率（％）を示す。実施例４の培地を用いて室温で保存したものは、一部、一週間目頃から精子保存液の色が黄色～オレンジ色っぽくなった。精巣に由来する体細胞が増殖したものと推測される。それ以外は、精子の受精能が維持されていることを確認した。
表６に示すように、実施例４の培地に加え、乳酸のみを０．２ｍＭに増やした培地を用意した（実施例５）。また、無機塩類（塩化カルシウム二水和物、塩化マグネシウム六水和物、無水硫酸マグネシウム、塩化カリウム、無水リン酸二水素カリウム、塩化ナトリウム、無水リン酸水素二ナトリウム）、ペニシリン／ストレプトマイシン、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ （ｐＨ ８．８）、グルコース、乳酸については、実施例４のゼブラフィッシュに用いた培地の分量と同じで、アミノ酸類、ビタミン類、Ｄ－ガラクトース、フェノールレッドナトリウム塩、ピルビン酸ナトリウム塩についてはゼブラフィッシュに用いた培地の分量の１／２量の培地を用意した（実施例６）。精巣（１つ）を取り出して、０．５％のｂｌｅａｃｈで３０秒滅菌し、メダカのリンガー液（ＢＳＳ）で２回ｗａｓｈ後に、用意したそれぞれの培地（６６μｌ）の中で、ピンセットを使って精子を絞り出した。その精子懸濁液１０μｌを１．５ｍｌチューブに移し、そこに９０μｌの培地を加えて、精子の濃度は４５０，０００／ｍｌで保存した。
７日間室温または８日間４℃で保存した後、受精実験にはメダカ雌から準備した卵を用いて１チューブ分１００μｌ（４５，０００精子）を用いて行った。この卵を嚢胚期まで培養した後、受精率をカウントした。結果を図７に示す。図７中、縦軸は受精率（％）を示す。実施例４の培地を用いて室温で保存したものは、一部、一週間目頃から精子保存液の色が黄色～オレンジ色っぽくなった。精巣に由来する体細胞が増殖したものと推測される。それ以外は、精子の受精能が維持されていることを確認した。
【0056】
【表6】
【0057】
［マウス精子の保存］
表７に示すように、塩化マグネシウム六水和物、無水硫酸マグネシウム、無水リン酸二水素カリウム、塩化ナトリウム、無水リン酸水素二ナトリウム、ペニシリン／ストレプトマイシン、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、グルコース、乳酸、アミノ酸類、ビタミン類、Ｄ－ガラクトース、フェノールレッドナトリウム塩、ピルビン酸ナトリウム塩については、実施例４のゼブラフィッシュに用いた培地の分量と同じで、塩化カルシウム二水和物、塩化カリウムについては、実施例４のゼブラフィッシュに用いた培地の分量の１／３量で、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ ８．８）の培地を用意した（実施例７）。マウス精巣上体尾部を剪刀ばさみで切り、絞り出した精子を上記培養液０．５ ｍｌに懸濁して精子懸濁液を作成した。
室温（２２～２３℃）で４日間保存した後、下層部約０．０２ ｍｌを、精子前培養用ディッシュ中のＣＡＲＤ ＦＥＲＴＩＵＰマウス精子前培養培地 ０． ２ｍｌドロップに加えて、６０分３７℃で前培養し、その精子を、未受精卵を含む受精用ｍＨＴＦドロップに加えて媒精した。媒精から３時間後、形態的に正常な卵子のみをｍＨＴＦドロップで洗浄した。翌日、２ｃｅｌｌに発生した胚を胚培養用培地ＫＳＯＭに移し、この卵を胚盤胞まで培養した後、受精率をカウントした。結果を表８に示す。
表７に示すように、塩化マグネシウム六水和物、無水硫酸マグネシウム、無水リン酸二水素カリウム、塩化ナトリウム、無水リン酸水素二ナトリウム、ペニシリン／ストレプトマイシン、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、グルコース、乳酸、アミノ酸類、ビタミン類、Ｄ－ガラクトース、フェノールレッドナトリウム塩、ピルビン酸ナトリウム塩については、実施例４のゼブラフィッシュに用いた培地の分量と同じで、塩化カルシウム二水和物、塩化カリウムについては、実施例４のゼブラフィッシュに用いた培地の分量の１／３量で、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ ８．８）の培地を用意した（実施例７）。マウス精巣上体尾部を剪刀ばさみで切り、絞り出した精子を上記培養液０．５ ｍｌに懸濁して精子懸濁液を作成した。
室温（２２～２３℃）で４日間保存した後、下層部約０．０２ ｍｌを、精子前培養用ディッシュ中のＣＡＲＤ ＦＥＲＴＩＵＰマウス精子前培養培地 ０． ２ｍｌドロップに加えて、６０分３７℃で前培養し、その精子を、未受精卵を含む受精用ｍＨＴＦドロップに加えて媒精した。媒精から３時間後、形態的に正常な卵子のみをｍＨＴＦドロップで洗浄した。翌日、２ｃｅｌｌに発生した胚を胚培養用培地ＫＳＯＭに移し、この卵を胚盤胞まで培養した後、受精率をカウントした。結果を表８に示す。
【0058】
【表7】
【0059】
【表8】
【0060】
表８中、実施例４－１～４－５は、実施例４の培地を用いて、５回の繰り返し実験を行った結果を示し、実施例７－１～７－５は、実施例７の培地を用いて、５回の繰り返し実験を行った結果を示し、
表８に示すように、５回の繰り返し実験で実施例７の培地は、保存能力に優れていることが確認された。
表８に示すように、５回の繰り返し実験で実施例７の培地は、保存能力に優れていることが確認された。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】