特許 7478452 光検出装置、光検出方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-04-24

(45)【発行日】2024-05-07

(54)【発明の名称】光検出装置、光検出方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 21/65 20060101AFI20240425BHJP

【ＦＩ】

G01N21/65

【請求項の数】 6

(21)【出願番号】P 2021570009

(86)(22)【出願日】2020-12-24

(86)【国際出願番号】 JP2020048526

(87)【国際公開番号】W WO2021140943

(87)【国際公開日】2021-07-15

【審査請求日】2023-07-05

(31)【優先権主張番号】P 2020002107

(32)【優先日】2020-01-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成３０年度国立研究開発法人科学技術振興機構 研究成果展開事業 産学共創プラットフォーム共同研究推進プログラム事業 「光融合科学から創生する「命をつなぐ早期診断・予防技術」研究イニシアティブ」委託研究、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願

(73)【特許権者】

【識別番号】504132881

【氏名又は名称】国立大学法人東京農工大学

(74)【代理人】

【識別番号】110001519

【氏名又は名称】弁理士法人太陽国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】三沢 和彦

(72)【発明者】

【氏名】伊藤 輝将

【審査官】吉田 将志

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１９／０８９５３１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１４／２０５４１３（ＷＯ，Ａ２）

【文献】特開２０１０－４８８０５（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ ２１／６５

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

光源パルス光を発生するレーザ光源と、
前記光源パルス光を第１のパルス光、第２のパルス光、および第３のパルス光に分岐する分岐部と、
前記第１のパルス光を振幅変調するとともに前記振幅変調の実行、停止が切り替え可能とされた第１の変調部と、
前記第２のパルス光を位相変調するとともに前記位相変調の実行、停止が切り替え可能とされた第２の変調部と、
光を検出する第１の検出部および第２の検出部と、
振幅変調が実行された前記第１のパルス光および位相変調が停止された前記第２のパルス光が合波された第１の合波光を試料に照射して、発生した誘導ラマン散乱信号を前記第１の検出部で検出して第１の画像を取得する第１の光検出モード、
振幅変調が停止された前記第１のパルス光、位相変調が実行された前記第２のパルス光、および前記第３のパルス光が合波された第２の合波光を試料に照射して、発生した誘導ラマン散乱信号を前記第１の検出部で検出して第２の画像を取得する第２の光検出モード、
および、振幅変調が実行された前記第１のパルス光を試料に照射して発生した共焦点反射光を前記第２の検出部で検出して第３の画像を取得する第３の光検出モード、のうちの少なくとも２つを切り替えて実行し、取得された少なくとも２つの画像を合成して合成画像を生成する制御部と、
を含む光検出装置。

【請求項2】

前記制御部は、
前記第１の光検出モードにおいて、励起光としての前記第２のパルス光に含まれる誘導ラマン信号をロックイン検出して前記第１の画像を取得し、
前記第２の光検出モードにおいて、前記第１のパルス光を第１のプローブ光とし、前記第２のパルス光を第２のプローブ光とし、前記第３のパルス光を励起光とし、前記第１のプローブ光で発生した誘導ラマン信号光と前記第２のプローブ光によるヘテロダイン干渉の結果、前記第１のプローブ光に施された振幅変調信号を誘導ラマン散乱信号に対応する信号としてロックイン検出することにより前記第２の画像を取得し、
前記第３の光検出モードにおいて、前記第１のパルス光に施された変調信号をロックイン検出して前記第３の画像を取得する
請求項１に記載の光検出装置。

【請求項3】

前記第１の光検出モードにおいて、前記第３のパルス光を遮断する第１のシャッターと、
前記第３の光検出モードにおいて、前記第２のパルス光を遮断する第２のシャッターと、前記第３のパルス光を遮断する第３のシャッターと、をさらに含む
請求項１または請求項２に記載の光検出装置。

【請求項4】

前記第１の光検出モードにおいて、前記第１の合波光から前記第１のパルス光を除去して前記第２のパルス光を前記第１の検出部に導く第１のフィルタと、
前記第２の光検出モードにおいて、前記第２の合波光から前記第２のパルス光および前記第３のパルス光を除去して第１のパルス光を前記第１の検出部に導く第２のフィルタと、
前記第３の光検出モードにおいて、前記共焦点反射光を分岐して取り出す偏光ビームスプリッタと、前記共焦点反射光を絞るアパチャーと、をさらに含む
請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の光検出装置。

【請求項5】

前記第１のパルス光が通過する第１の光路および前記第２のパルス光が通過する第２の光路の少なくとも一方に配置された、前記第１の光路の累積分散と前記第２の光路の累積分散との差分を補正する分散補正部と、
前記第１の光路および前記第２の光路の少なくとも一方に配置された、前記第１の光路の累積遅延と前記第２の光路の累積遅延との差分を補正する遅延補正部と、をさらに含む 請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の光検出装置。

【請求項6】

光源パルス光を発生するレーザ光源と、前記光源パルス光を第１のパルス光、第２のパルス光、および第３のパルス光に分岐する分岐部と、前記第１のパルス光を振幅変調するとともに前記振幅変調の実行、停止が切り替え可能とされた第１の変調部と、前記第２のパルス光を位相変調するとともに前記位相変調の実行、停止が切り替え可能とされた第２の変調部と、光を検出する第１の検出部および第２の検出部と、を含む光検出装置を用いた光検出方法であって、
振幅変調が実行された前記第１のパルス光および位相変調が停止された前記第２のパルス光が合波された第１の合波光を試料に照射して、発生した誘導ラマン散乱信号を前記第１の検出部で検出して第１の画像を取得する第１の光検出モード、
振幅変調が停止された前記第１のパルス光、位相変調が実行された前記第２のパルス光、および前記第３のパルス光が合波された第２の合波光を試料に照射して、発生した誘導ラマン散乱信号を前記第１の検出部で検出して第２の画像を取得する第２の光検出モード、
および振幅変調が実行された前記第１のパルス光を試料に照射して発生した共焦点反射光を前記第２の検出部で検出して第３の画像を取得する第３の光検出モード、のうち少なくとも２つを切り替えて実行し、取得された少なくとも２つの画像を合成して合成画像を生成する
光検出方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、ラマン散乱を検出する光検出装置、および光検出方法に関する。

【背景技術】

【0002】

ラマン散乱を検出する光検出装置として、コヒーレントラマン散乱顕微鏡が知られている。コヒーレントラマン散乱顕微鏡とは、２つ以上のパルスレーザ光を試料に照射し、その結果試料から発せられるラマン散乱光を観察することにより、試料内の物質を分析する装置である。このような技術は一般に、ラマン分光技術と総称され、ラマン分光技術による微量物質の検出は、分析装置における基本技術としての重要性が高く、多くの技術開発が行われてきた。一方、昨今の医療技術の進歩と共に、微量物質検出技術の医療診断技術への応用が試みられており、当該医療診断技術の分野においてもより一層の微量物質の検出感度の向上が求められようになってきている。

【0003】

従来、コヒーレントラマン散乱顕微鏡は、観察に用いる入射レーザ光の振幅を変調して試料に入射させ、入射光に対する透過光または反射散乱光を光検出器で検出し、それを復調することでラマン信号を検出する振幅変調型コヒーレントラマン散乱顕微鏡が一般的である。

【0004】

振幅変調型コヒーレントラマン散乱顕微鏡に関連する従来技術として、例えば特開２０１０－０４８８０５号公報に開示された顕微撮像システムが知られている。特開２０１０－０４８８０５号公報に係る顕微撮像システムは、コヒーレントラマン効果のひとつとして知られる誘導ラマン散乱（Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ Ｒａｍａｎ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ：ＳＲＳ）を用いた光検出装置である。特開２０１０－０４８８０５号公報に係る顕微撮像システム１０は、ポンプ（励起）ビームとして使用される中心周波数ω１のレーザパルス列２０と、ストークスビームとして使用される中心周波数ω２のレーザパルス列１６の２つのレーザパルス列を用いている。ストークスビームは変調器で振幅変調され、励起ビームとストークスビームは結合器２５で結合された後、サンプル２２に照射される。サンプル２２を透過した透過光は光検知器３６に送られ、光検知器３６からの検知信号から振幅変調成分を検知することによって、誘導ラマン散乱に基づく画像を取得する。

【0005】

これに対し、誘導ラマン散乱の検知手段として位相変調を用いる位相変調型コヒーレントラマン散乱顕微鏡という考え方もある。図８は、位相変調型コヒーレントラマン散乱顕微鏡として構成された比較例に係る光検出装置１００を示している。図８に示すように、光検出装置１００は、光源１１１、パルス光生成部１５０、および顕微鏡１２５を備えて構成されている。

【0006】

光源１１１は、ＳＲＳ過程に基づく信号（ＳＲＳ信号）を生成させるための励起光とプローブ光を発生するレーザ光源である。光検出装置１００ではパルス状の励起光（励起パルス光）、およびプローブ光（プローブパルス光）を用いており、光源１１１はこれらのパルス光の元となる光源パルス光Ｐｓを発生する。光検出装置１００では、光源パルス光Ｐｓとしてフェムト秒パルスを用いている。また、光検出装置１００では、励起光Ｌｅに加え、プローブ光として、リファレンス（参照）プローブ光Ｌｒおよび位相変調プローブ光Ｌｐの２つを用いる。顕微鏡１２５は、励起光Ｌｅおよびプローブ光Ｌｒ、Ｌｐを試料に照射させる部位であり、後段には図示を省略する受光部、制御部が接続される。

【0007】

光検出装置１００では、光源１１１の出力を、励起光Ｌｅ、位相変調プローブ光Ｌｐおよびリファレンスプローブ光Ｌｒの３つに分け、励起パルス光Ｐｅ、位相変調プローブパルス光Ｐｐ、リファレンスプローブパルス光Ｐｒの時間的な関係を図８に示すように設定している。すなわち、励起パルス光Ｐｅを時間的に先に入射させ、その後に続けて時間的に重なった位相変調プローブパルス光Ｐｐとリファレンスプローブパルス光Ｐｒを入射させる。そして、位相変調プローブパルス光Ｐｐとリファレンスプローブパルス光Ｐｒとの間の相対位相を変調し、その結果生じたラマン信号光とリファレンスプローブパルス光Ｐｒとの干渉による光強度の変調を光検出器で検出して復調する。

【0008】

より詳細には、パルス光生成部１５０が光源パルス光Ｐｓを用いて、励起パルス光Ｐｅ、および２つのプローブパルス光、すなわち、リファレンスプローブパルス光Ｐｒ、位相変調プローブパルス光Ｐｐを生成する。そのため、光源１１１からのレーザ光は、励起光Ｌｅ、リファレンスプローブ光Ｌｒ、および位相変調プローブ光Ｌｐの３つに分割される。光検出装置１００の光源パルス光Ｐｓ、そして励起パルス光Ｐｅは超短パルス光とされている。また、リファレンスプローブパルス光Ｐｒ、および位相変調プローブパルス光Ｐｐは、立ち上がりが速く立下りが遅い非対称の波形とされ、励起パルス光Ｐｅから予め定められた時間だけ遅延するように配置される。光検出装置１００では、リファレンスプローブパルス光Ｐｒと位相変調プローブパルス光Ｐｐとは中心波長が異なる略同一の波形（互いに近似した波形）とされるとともに、時間的に重畳されている。図８に示すように、リファレンスプローブ光Ｌｒの光路には波形整形のためのバンドパスフィルタ１１８およびエンドミラー１２０を含む構成が配置されている。一方、位相変調プローブ光Ｌｐの光路には光変調器１２１とともに、波形整形のためのバンドパスフィルタ１１６が配置されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0009】

【文献】特開２０１０－０４８８０５号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

ここで、振幅変調型コヒーレントラマン散乱顕微鏡（以下、「ＡＭ（Ａｍｐｌｉｔｕｄｅ Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）－ＳＲＳ顕微鏡」）と、位相変調型コヒーレントラマン顕微鏡（以下、「ＰＭ（Ｐｈａｓｅ Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）－ＳＲＳ顕微鏡」）とには、各々の構成に起因する特徴がある。すなわち、ＡＭ－ＳＲＳ顕微鏡では、水や脂質などの生体自身に含まれる分子振動持続時間の短い、強いラマン信号を検出することで、細胞や組織等の形態情報を高速に画像化できるという特徴がある。一方、ＰＭ－ＳＲＳ顕微鏡では、励起光とプローブ光の相対的な時間差を利用することにより、分子振動の持続時間が比較的長い低分子量の物質を高いコントラストで選択的に検出できるという特徴がある。

【0011】

すなわち、従来、ＡＭ－ＳＲＳ顕微鏡、あるいはＰＭ－ＳＲＳ顕微鏡においては、観察の目的、観察対象の特質等を勘案し、それぞれの観察内容に応じて使い分けられていた。
例えば、細胞や組織等を観察したい場合はＡＭ－ＳＲＳ顕微鏡が選択され、生体中に分布する低分子量の物質等を観察したい場合にはＰＭ－ＳＲＳ顕微鏡が選択されていた。

【0012】

例えば医療等の分野では、皮膚に対する薬剤の浸透の状態の観察のように、生体の構造と物質の分布を同時に画像化できれば至便である。しかしながら、これまでは上記のＡＭ－ＳＲＳ顕微鏡あるいはＰＭ－ＳＲＳ顕微鏡を単独で使用することのみ検討され、そのため、細胞や組織などの生体そのものの構造と、その中にある小分子の空間分布との対応が可視化できず、生体内における分子の局在や輸送、代謝の動態解析などには不向きであった。

【0013】

本開示の実施形態は、以上のような背景に鑑みてなされたものであり、細胞や組織などの生体構造と、生体構造中に含まれる物質の空間分布を可視化し、生体内における分子の局在や、輸送、代謝等の動態解析を行うことが可能な光検出装置、および光検出方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0014】

上記目的を達成するために、第１態様に係る光検出装置は、光源パルス光を発生するレーザ光源と、前記光源パルス光を第１のパルス光、第２のパルス光、および第３のパルス光に分岐する分岐部と、前記第１のパルス光を振幅変調するとともに前記振幅変調の実行、停止が切り替え可能とされた第１の変調部と、前記第２のパルス光を位相変調するとともに前記位相変調の実行、停止が切り替え可能とされた第２の変調部と、光を検出する第１の検出部および第２の検出部と、振幅変調が実行された前記第１のパルス光および位相変調が停止された前記第２のパルス光が合波された第１の合波光を試料に照射して、発生した誘導ラマン散乱信号を前記第１の検出部で検出して第１の画像を取得する第１の光検出モード、振幅変調が停止された前記第１のパルス光、位相変調が実行された前記第２のパルス光、および前記第３のパルス光が合波された第２の合波光を試料に照射して、発生した誘導ラマン散乱信号を前記第１の検出部で検出して第２の画像を取得する第２の光検出モード、および、振幅変調が実行された前記第１のパルス光を試料に照射して発生した共焦点反射光を前記第２の検出部で検出して第３の画像を取得する第３の光検出モード、のうちの少なくとも２つを切り替えて実行し、取得された少なくとも２つの画像を合成して合成画像を生成する制御部と、を含むものである。

【0015】

また、第２態様に係る光検出装置は、第１態様に係る光検出装置において、前記制御部は、前記第１の光検出モードにおいて、励起光としての前記第２のパルス光に含まれる誘導ラマン信号をロックイン検出して前記第１の画像を取得し、前記第２の光検出モードにおいて、前記第１のパルス光を第１のプローブ光とし、前記第２のパルス光を第２のプローブ光とし、前記第３のパルス光を励起光とし、前記第１のプローブ光で生じた誘導ラマン信号光と前記第２のプローブ光によるヘテロダイン干渉の結果、前記第１のプローブ光に施された振幅変調信号を誘導ラマン散乱信号に対応する信号としてロックイン検出することにより前記第２の画像を取得し、前記第３の光検出モードにおいて、前記第１のパルス光に施された変調信号をロックイン検出して前記第３の画像を取得するものである。

【0016】

また、第３態様に係る光検出装置は、第１態様または第２態様に係る光検出装置において、前記第１の光検出モードにおいて、前記第３のパルス光を遮断する第１のシャッターと、前記第３の光検出モードにおいて、前記第２のパルス光を遮断する第２のシャッターと、前記第３のパルス光を遮断する第３のシャッターと、をさらに含むものである。

【0017】

また、第４態様に係る光検出装置は、第１態様から第３態様のいずれかの態様に係る光検出装置において、前記第１の光検出モードにおいて、前記第１の合波光から前記第１のパルス光を除去して前記第２のパルス光を前記第１の検出部に導く第１のフィルタと、前記第２の光検出モードにおいて、前記第２の合波光から前記第２のパルス光および前記第３のパルス光を除去して第１のパルス光を前記第１の検出部に導く第２のフィルタと、前記第３の光検出モードにおいて、前記共焦点反射光を分岐して取り出す偏光ビームスプリッタと、前記共焦点反射光を絞るアパチャーと、をさらに含むものである。

【0018】

また、第５態様に係る光検出装置は、第１態様から第４態様のいずれかの態様に係る光検出装置において、前記第１のパルス光が通過する第１の光路および前記第２のパルス光が通過する第２の光路の少なくとも一方に配置された、前記第１の光路の累積分散と前記第２の光路の累積分散との差分を補正する分散補正部と、前記第１の光路および前記第２の光路の少なくとも一方に配置された、前記第１の光路の累積遅延と前記第２の光路の累積遅延との差分を補正する遅延補正部と、をさらに含むものである。

【0019】

上記目的を達成するために、第６態様に係る光検出方法は、光源パルス光を発生するレーザ光源と、前記光源パルス光を第１のパルス光、第２のパルス光、および第３のパルス光に分岐する分岐部と、前記第１のパルス光を振幅変調するとともに前記振幅変調の実行、停止が切り替え可能とされた第１の変調部と、前記第２のパルス光を位相変調するとともに前記位相変調の実行、停止が切り替え可能とされた第２の変調部と、光を検出する第１の検出部および第２の検出部と、を含む光検出装置を用いた光検出方法であって、振幅変調が実行された前記第１のパルス光および位相変調が停止された前記第２のパルス光が合波された第１の合波光を試料に照射して、発生した誘導ラマン散乱信号を前記第１の検出部で検出して第１の画像を取得する第１の光検出モード、振幅変調が停止された前記第１のパルス光、位相変調が実行された前記第２のパルス光、および前記第３のパルス光が合波された第２の合波光を試料に照射して、発生した誘導ラマン散乱信号を前記第１の検出部で検出して第２の画像を取得する第２の光検出モード、および振幅変調が実行された前記第１のパルス光を試料に照射して発生した共焦点反射光を前記第２の検出部で検出して第３の画像を取得する第３の光検出モード、のうち少なくとも２つを切り替えて実行し、取得された少なくとも２つの画像を合成して合成画像を生成するものである。

【発明の効果】

【0020】

本開示の実施形態によれば、細胞や組織などの生体構造と、生体構造中に含まれる物質の空間分布を可視化し、生体内における分子の局在や、輸送、代謝等の動態解析を行うことが可能な光検出装置、および光検出方法を提供することが可能となる。

【図面の簡単な説明】

【0021】

【図1】実施の形態に係る光検出装置の構成の一例を示すブロック図である。

【図2】実施の形態に係る光検出装置の共焦点モードにおける構成を示すブロック図である。

【図3】実施の形態に係る光検出装置の、各モードにおける設定を示す図である。

【図4】実施の形態に係るＡＭ－ＳＲＳモードの動作を説明するブロック図である。

【図5】実施の形態に係るＰＭ－ＳＲＳモードの動作を説明するブロック図である。

【図6】実施の形態に係る共焦点モードの動作を説明するブロック図である。

【図7】実施の形態に係る光検出処理プログラムの処理の流れを示すフローチャートである。

【図8】比較例に係る光検出装置の構成を示すブロック図である。

【発明を実施するための形態】

【0022】

以下、図面を参照して、本開示を実施するための形態について詳細に説明する。以下で説明する本実施の形態に係る光検出装置は、ＡＭ－ＳＲＳ顕微鏡による観察と、ＰＭ－ＳＲＳ顕微鏡による観察が同じ観察装置で行うことができ、かつ両顕微鏡で取得した画像を合成できるように、ＡＭ－ＳＲＳ顕微鏡の構成とＰＭ－ＳＲＳ顕微鏡の構成とを切り替える機構を備えている。本実施の形態に係る光検出装置は、形態情報の観察機能を高めるために、さらに共焦点（Ｃｏｎｆｏｃａｌ：コンフォーカル）顕微鏡の機能も併せ持つように構成されている。

【0023】

ここで、共焦点顕微鏡とは、サンプル表面からの反射光を、検出器で受光する光学系である。共焦点顕微鏡では、点光源から照射された照明光がサンプル表面に焦点を結ぶ際、その反射光も検出器上で焦点が合うように設計されていることから、共焦点光学系と呼ばれている。共焦点顕微鏡では、焦点位置だけの情報がピンホールを通過して検出器に到達し、焦点位置以外の光はピンホールでカットされるため、深さ方向に分解能が生じ、光学的断層像を得ることができる。

【0024】

ここで、ＡＭ－ＳＲＳ顕微鏡、あるいはＰＭ－ＳＲＳ顕微鏡を単独で使用する場合では、細胞や組織などの生体そのものの構造と、その中にある小分子の空間分布との対応が可視化できず、生体内における分子の局在や輸送、代謝の動態解析などが可能ではなかった。より具体的には、実際の薬剤分子の測定では、背景の成分含めて同じ基準点を用いての測定ができないと、実測したい小分子がどこに存在するのか判然としない場合がある。つまり、生体組織の撮像では、コヒーレントラマン散乱の情報だけでは構造の区別が不明瞭な場合がある。そのような場合には共焦点顕微鏡による共焦点反射等の別のコントラスト情報を付加することが有効である。

【0025】

しかしながら、共焦点反射の信号を取得する場合において、ＰＭＴ（Ｐｈｏｔｏｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ Ｔｕｂｅ：光電子増倍管）などの高感度検出器を使用すると、迷光を防止するために顕微鏡を遮光しなければならない。その一方で、通常のフォトダイオードでは感度が不足し、オフセット電圧も揺らぐため、構造情報がノイズに埋もれてしまうという問題がある。これに対し、ＡＭ－ＳＲＳ顕微鏡、あるいはＰＭ－ＳＲＳ顕微鏡は、基本的に変調を用いた技術であるため、遮光を要しない。そこで、本実施の形態では、共焦点顕微鏡において、ＡＭ－ＳＲＳで使用する光変調器を使用し、試料に照射する光を振幅変調し、変調された共焦点反射光をロックイン検出するようにしている。このため、煩雑な遮光設備は不要となっている。

【0026】

以上のように、本実施の形態に係る光検出装置は、例えば小分子の薬剤がある界面から浸透していく場合に、その界面がどこに存在するか共焦点反射でとらえ、背景となる組織や細胞の状態をＡＭ－ＳＲＳモードで高速に画像情報として取得し、組織内にある分子振動の長い小分子をＰＭ－ＳＲＳモードで検出するように構成されている。本実施の形態に係る光検出装置は、以上の構成を備えることによって、例えば生体試料を対象に、生体構造中における分子をその分子種を同定しながら無標識で濃度分布を可視化することができる。その結果、コヒーレントラマン散乱顕微鏡の有用性を飛躍的に高めた光検出装置を実現している。

【0027】

＜光検出装置の構成＞
図１を参照して、本実施の形態に係る光検出装置１０について説明する。図１に示すように、光検出装置１０は、光源１１、波形整形部１２、ＰＢＳ（Ｐｏｌａｒｉｚｉｎｇ Ｂｅａｍ Ｓｐｌｉｔｔｅｒ：偏光ビームスプリッタ）１３、励起パルス光調整部４０、第１プローブパルス光調整部４１、第２プローブパルス光調整部４２、顕微鏡２５、受光部４３、および制御部４４を含んで構成されている。光検出装置１０は、上記のように、ＡＭ－ＳＲＳ顕微鏡、ＰＭ－ＳＲＳ顕微鏡、および共焦点顕微鏡として構成可能であるが、以下図１を参照して、ＡＭ－ＳＲＳ顕微鏡、ＰＭ－ＳＲＳ顕微鏡の構成について説明し、共焦点顕微鏡については別途図２を参照して説明する。また、以下の説明では、ＡＭ－ＳＲＳ顕微鏡、ＰＭ－ＳＲＳ顕微鏡、および共焦点顕微鏡の構成として動作させることを各々、「ＡＭ－ＳＲＳモード」、「ＰＭ－ＳＲＳモード」、「共焦点モード」といい、「ＡＭ－ＳＲＳモード」および「ＰＭ－ＳＲＳモード」を総称する場合は、「ＳＲＳモード」という。

【0028】

光源１１は、ＳＲＳ信号を生成させるための励起光Ｌｅとプローブ光（第１プローブ光Ｌ１、および第２プローブ光Ｌ２）を発生するレーザ光源である。励起光Ｌｅ、第１プローブ光Ｌ１、第２プローブ光Ｌ２は、光検出装置１０のモードに応じて選択される。本実施の形態では、パルス状の励起光（励起パルス光Ｐｅ）、およびプローブ光（第１プローブパルス光Ｐ１、および第２プローブパルス光Ｐ２）を用いており、光源１１はこれらのパルス光の元となる光源パルス光Ｐｓを発生する。本実施の形態では、光源パルス光Ｐｓとしてフェムト秒パルスを用いている。そのため、光源１１からのレーザ光は、励起光Ｌｅ、第１プローブ光Ｌ１、および第２プローブ光Ｌ２の３つに分割される。本実施の形態に係る光源パルス光Ｐｓ、そして励起パルス光Ｐｅは超短パルス光とされている。

【0029】

励起パルス光調整部４０は、入射された励起パルス光Ｐｅの調整を行う部位、第１プローブパルス光調整部４１は、入射された第１プローブパルス光Ｐ１の調整を行う部位、第２プローブパルス光調整部４２は、入射された第２プローブパルス光Ｐ２の調整を行う部位である。顕微鏡２５は、励起光およびプローブ光を試料に照射させる部位である。受光部４３は、試料で発生したラマン信号光を受光し、制御部４４は光検出装置１０の全体を統括制御する。以下、各々の部位について詳細に説明する。なお、以下の説明では、図１に示された全ての構成について説明するために、全ての構成を用いるＰＭ－ＳＲＳモードを念頭において説明する。従って、以下の説明は、図８の構成をより詳細に説明するものであり、第１プローブ光Ｌ１は図８におけるリファレンスプローブ光Ｌｒに、第２プローブ光Ｌ２は図８における位相変調プローブ光Ｌｐに相当する。

【0030】

本実施の形態に係る光検出装置１０では、光源１１に広帯域の光源パルス光Ｐｓを発生する超短パルスレーザを用いている。本実施の形態では光源１１の一例として、近赤外の広帯域フェムト秒レーザを用いている。より具体的には、図１に示すように、光源１１の一例として、中心波長が７９０ｎｍのチタンサファイアレーザを用い、パルス幅を１５ｆｓ（ｆｅｍｔｏｓｅｃｏｎｄ）以下としている。ただし、光源１１の波長、パルス幅はこれに限定されるものではなく、光検出装置１０の設計内容等に応じて適切な値に設定してよい。なお、本実施の形態では、光源１１から出射される光源パルス光Ｐｓを予め定められた方向の直線偏光としている。しかしながら、光源パルス光Ｐｓの偏光態様はこれに限られず、例えば円偏光、楕円偏光等であってもよい。

【0031】

波形整形部１２は、光源パルス光Ｐｓを補償して所望の特性を満たすようにする部位である。すなわち波形整形部１２は、一例として図示を省略する分散補償光学素子、ＳＬＭ（Ｓｐａｔｉａｌ Ｌｉｇｈｔ Ｍｏｄｕｌａｔｏｒ：空間光変調器）等を含んで構成され、後述する対物レンズ３２下での照射光のパルス幅が光源１１から出射される最短のパルス幅と等しくなるように適切に分散補償される。なお、本実施の形態では、分散補償光学素子の一例として、誘電体多層膜により高い反射率と負の２次分散補償を与えるチャープミラーを用い、ＳＬＭの一例として液晶空間光変調器を用いている。

【0032】

ＰＢＳ１３は、光源１１で発生したレーザ光を励起光Ｌｅとプローブ光（第１プローブ光Ｌ１、第２プローブ光Ｌ２）に２分割する光学素子である。

【0033】

励起パルス光調整部４０は、λ／４波長板１４、およびエンドミラー１５を備えている。図１において、励起光Ｌｅの光路は、光源１１→波形整形部１２→ＰＢＳ１３→１／４波長板１４→エンドミラー１５→１／４波長板１４→ＰＢＳ１３→ミラー２９となっている。１／４波長板１４は、励起光Ｌｅを一旦円偏光に変換し、エンドミラー１５で反射させた後の偏光方向を光源パルス光Ｐｓの偏光方向とは異なる方向とすることによりＰＢＳ１３で反射されるようにしている。エンドミラー１５は励起光Ｌｅの光軸方向に可動とされ、励起パルス光Ｐｅに与える遅延時間を調整し、プローブパルス光との間の時間差を設定する。

【0034】

第１プローブパルス光調整部４１は、光変調器１７（図１では、「ＥＯＭ２」と表記）、分散補償器３６（図１では、「ＤＷ」と表記）、および波長走査部２４を備え、波長走査部２４はバンドパスフィルタ１８、１／４波長板１９、およびエンドミラー２０を含んで構成されている。第１プローブ光Ｌ１の光路は、光源１１→波形整形部１２→ＰＢＳ１３→バンドパスフィルタ１６（図１では、「ＤＭ」と表記）→光変調器１７→分散補償器３６→バンドパスフィルタ１８→１／４波長板１９→エンドミラー２０→１／４波長板１９→バンドパスフィルタ１８→分散補償器３６→光変調器１７→バンドパスフィルタ１６→ＰＢＳ１３→ミラー２９となっている。

【0035】

１／４波長板１９の機能は１／４波長板１４と同様である。光変調器１７は、ＡＭ－ＳＲＳモードおよび共焦点モードにおいて、第１プローブ光Ｌ１を振幅変調する変調器であり、本実施の形態では、一例としてＥＯＭ（Ｅｌｅｃｔｒｏ Ｏｐｔｉｃ Ｍｏｄｕｌａｔｏｒ：電気光学変調器）を用いている。光変調器１７は図示を省略する駆動回路に接続され、該駆動回路は制御部４４に接続されている。

【0036】

図１に示すように、バンドパスフィルタ１８は予め定められた回転軸を中心に回転可能とされた、第１プローブパルス光Ｐ１の中心周波数を設定するチューナブルフィルタである。エンドミラー２０は、主として、バンドパスフィルタ１８の回転に伴う第１プローブパルス光Ｐ１の遅延の変動を補償する。波長走査部２４は、後述する制御部４４に接続され、バンドパスフィルタ１８、およびエンドミラー２０は制御部４４によって制御される。

【0037】

第２プローブパルス光調整部４２は、光変調器２１（図１では、「ＥＯＭ１」と表記）、バンドパスフィルタ３５（図１では、「ＢＰＦ１」と表記）、１／４波長板２２、およびエンドミラー２３を含んで構成されている。第２プローブ光Ｌ２の光路は、光源１１→波形整形部１２→ＰＢＳ１３→バンドパスフィルタ１６→光変調器２１→バンドパスフィルタ３５→１／４波長板２２→エンドミラー２３→１／４波長板２２→バンドパスフィルタ３５→光変調器２１→バンドパスフィルタ１６→ＰＢＳ１３→ミラー２９となっている。すなわち、本実施の形態では、ＰＢＳ１３により励起光Ｌｅとプローブ光（第１プローブ光Ｌ１、第２プローブ光Ｌ２）に分割され、バンドパスフィルタ１６により第１プローブ光Ｌ１と第２プローブ光Ｌ２とに分割される。

【0038】

光変調器２１は、第２プローブ光Ｌ２を位相変調する位相変調器であり、本実施の形態では、一例としてＥＯＭを用いている。光変調器２１は図示を省略する駆動回路に接続され、該駆動回路は制御部４４に接続されている。バンドパスフィルタ３５は、第２プローブパルス光Ｐ２の中心周波数を設定するチューナブルフィルタである。１／４波長板２２の機能は１／４波長板１４と同様である。また、エンドミラー２３は、第１プローブパルス光Ｐ１と第２プローブパルス光Ｐ２との間の時間的な配置関係を調整する。なお、本実施の形態ではエンドミラー１５、２０、２３によって遅延を調整する形態を例示して説明するが、これに限られず光学遅延を可変にできる機構であれば他の光学素子、例えば光遅延線等を用いた形態としてもよい。

【0039】

ここで、第１プローブパルス光Ｐ１、および第２プローブパルス光Ｐ２は、立ち上がりが速く立下りが遅い非対称の波形とされ、励起パルス光Ｐｅから予め定められた時間だけ遅延するように配置される。本実施の形態では、第１プローブパルス光Ｐ１と第２プローブパルス光Ｐ２とは中心波長が異なる略同一の波形（互いに近似した波形）とされるとともに、時間的に重畳されている。

【0040】

図１に示すように、上述の励起光Ｌｅ、第１プローブ光Ｌ１、および第２プローブ光Ｌ２はミラー２９で折り返された後同軸上に合波されて合波光Ｌｇとされ、ミラー３７、３８を介して、顕微鏡２５に導入される。この際、励起パルス光Ｐｅとプローブパルス光の相対遅延時間は、励起パルス光調整部４０のエンドミラー１５の光軸方向位置により調整が可能である。ここで、ミラー２９、３７、および３８は光路を変換するための素子であり、図１に示す構成に限定されるものではない。

【0041】

顕微鏡２５は光学顕微鏡であり、対物レンズ３２、ステージ３４、および折り返し用のミラー３０、３１を含んで構成されている。ステージ３４には試料３３が載置され、対物レンズ３２に入射された合波光Ｌｇが試料３３に照射される。試料３３は例えば薬剤が浸透された生体細胞である。試料３３に合波光Ｌｇが照射されると、ＳＲＳ過程に基づいて、例えば薬剤分子の分子振動に起因するＳＲＳ信号が生成される。なお、本実施の形態に係る光検出装置１０では、深さ方向（Ｚ軸方向、図１の紙面の上下方向）のスキャン（走査）機能を備えている。本実施の形態に係る光検出装置１０では、ステージ３４のＺ軸方向の移動によって深さ方向のスキャンを行っている。

【0042】

受光部４３は、偏光子（ポラライザ）２６、ロングパスフィルタ２７、受光器２８を含んで構成されている。

【0043】

偏光子２６は励起光Ｌｅの偏光方向と異なる方向（例えば、直交する方向）の偏光軸を有し、合波光Ｌｇから励起光Ｌｅを除去する。ロングパスフィルタ２７は、励起光Ｌｅが除去され、第１プローブ光Ｌ１、第２プローブ光Ｌ２を含む合波光Ｌｇから第２プローブ光Ｌ２を除去するフィルタである。これは、本実施の形態では第１プローブ光Ｌ１の波長の方が第２プローブ光Ｌ２の波長よりも長く設定されていることによる。受光器２８は第１プローブ光Ｌ１を受光して電気信号に変換する。受光器２８には、例えばフォトダイオードが用いられる。受光器２８は制御部４４に接続されており、受光器２８における受光信号は制御部４４に送られる。なお、本実施の形態でロングパスフィルタ２７を用いるのは、上記のように第１プローブ光Ｌ１の波長を第２プローブ光Ｌ２の波長より長く設定しているからである。第１プローブ光Ｌ１の波長と第２プローブ光Ｌ２の波長の関係に特に制限はないので、第１プローブ光Ｌ１の波長を第２プローブ光Ｌ２の波長より短く設定した場合にはロングパスフィルタ２７の代わりにショートパスフィルタを用いればよい。

【0044】

すなわち、顕微鏡２５を通過した後は、励起パルス光Ｐｅ、第１プローブパルス光Ｐ１、および第２プローブパルス光Ｐ２のレーザパルスのうち、励起パルス光Ｐｅは偏光子２６で、第２プローブパルス光Ｐ２はロングパスフィルタ２７で各々ブロックされ、第１プローブパルス光Ｐ１だけが受光器２８まで通過する。第１プローブパルス光Ｐ１の光強度は光検出器で電流に変換され、第１プローブパルス光Ｐ１に重畳された光強度変調成分がロックインアンプで検出される。ロックインアンプで検出された光強度変調成分が試料３３におけるラマン散乱に由来する信号成分、すなわちＳＲＳ信号である。ＳＲＳ信号はサンプル（本実施の形態では、一例として薬剤）の濃度に比例した信号となる。なお、図１では偏光子２６、ロングパスフィルタ２７の順で配置する形態を例示して説明したが、この順序は逆であってもよい。ただし、実用上は現状の順とし、励起パルス光Ｐｅを最初に除去するのが好ましい。

【0045】

制御部４４は光検出装置１０を統括制御する部位であり、図示を省略するＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｕｎｉｔ、ＲＯＭ（Ｒｅａｄ Ｏｎｌｙ Ｍｅｍｏｒｙ）、ＲＡＭ（Ｒａｎｄｏｍ Ａｃｃｅｓｓ Ｍｅｍｏｒｙ）等を含んで構成されている。制御部４４はまた、試料３３において発生したＳＲＳ光を含む第１プローブ光Ｌ１から、ＳＲＳ光の周波数成分を抽出する光検出処理を行う。当該光検出処理は、ＣＰＵが、ＲＯＭ等に格納された光検出処理プログラムを読み出し、ＲＡＭ等に展開して実行する。

【0046】

制御部４４は、さらに、光変調器１７、光変調器２１の駆動回路（信号発生器を含む。図示省略）、受光器２８、および波長走査部２４等に接続されている。制御部４４の内部に、あるいは外付けで、光変調器１７の駆動電圧を変えて振幅変調を行うための電気信号を発生する信号発生器（シグナルジェネレータ）や高電圧アンプが、光変調器２１の駆動電圧を変えて位相変調を行うための電気信号を発生する信号発生器や高電圧アンプが設けられる場合もある。この場合制御部４４は、当該信号発生器を制御して、光変調器１７、および光変調器２１を変調するための駆動電圧の波形制御等を行う。制御部４４は、一般的なパーソナル・コンピュータ等を用いて構成することができる。制御部４４は駆動回路を介して光変調器１７、および光変調器２１を駆動するとともに受光器２８からの振幅変調信号を受けてロックインアンプを構成し、ヘテロダイン干渉により振幅変調された第１プローブパルス光Ｐ１からＳＲＳ信号を抽出する。より具体的には、第１プローブ光Ｌ１および第２プローブ光Ｌ２によるヘテロダイン干渉の結果、第１のプローブパルス光Ｐｌに施された振幅変調信号をＳＲＳ信号に対応する信号としてロックイン検出する。

【0047】

制御部４４にはさらに波長走査部２４が接続され、制御部４４は波長走査部２４に含まれるバンドパスフィルタ１８の回転、およびエンドミラー２０の移動を制御している。

【0048】

以上のように、本実施の形態に係る光検出装置、および光検出方法では、励起光Ｌｅによって励起された分子振動により発生する物質応答（瞬時的な屈折率変化）を時間遅延したプローブ光の強度変調に変換し、変調周波数に同期した光強度変調成分をロックインアンプなどの復調器を用いて検出している。

【0049】

＜共焦点モード時の構成＞
次に、図２を参照して、光検出装置１０の共焦点モード時における構成について説明する。図２に示すように、共焦点モードでは、第１プローブパルス光調整部４１が接続され、ＰＢＳ４５、１／４波長板４６、ミラー５８、レンズ４７、アパチャー４８、マルチモードファイバ４９、および受光器３９が付加されている。図２において、光源１１から出射された光源パルス光Ｐｓの、共焦点モードにおける光路は、光源１１→波形整形部１２→ＰＢＳ１３→バンドパスフィルタ１６→光変調器１７→分散補償器３６→波長走査部２４→分散補償器３６→光変調器１７→バンドパスフィルタ１６→ＰＢＳ１３→ミラー２９→ＰＢＳ４５→１／４波長板４６→ミラー３７→ミラー３８→顕微鏡２５→ミラー３８→ミラー３７→１／４波長板４６→ＰＢＳ４５→ミラー５８→レンズ４７→アパチャー４８→マルチモードファイバ４９→受光器３９となっている。受光器３９は制御部４４に接続されている。マルチモードファイバ４９は、アパチャー４８を透過した共焦点反射光を受光器３９に伝達する機能を有する。ここで、ミラー２９、３７、３８、および５８は光路を変換するための素子であり、図２に示す構成に限定されるものではない。なお、ＰＢＳ４５は、ＳＲＳモードから共焦点モードに切り替える場合に挿入される素子であり、本実施の形態ではキューブ型ＰＢＳを用いている。

【0050】

以上のような光学系を有する共焦点モードでは、ＰＭ－ＳＲＳモードで用いられる２つのプローブ光のうちの一方である第１プローブ光Ｌ１を用い、光路に共焦点ピンホールに相当するアパチャー（開口）４８を配置して共焦点反射光Ｌｃを得ている。共焦点モードにおける試料３３への照射光は、ＳＲＳモードにおける照射光と同じ対物レンズ３２によって試料３３に集光され、試料３３への入射光路と試料３３からの検出光路の相対的な光軸が一致するように調整されている。試料３３に照射する光は円偏光としてもよい。また、上述したように、深さ方向のスキャン（走査）は、ステージ３４のＺ軸方向の移動によって行っている。そして、共焦点モードによる検出信号は、ＳＲＳモードによる検出信号とともに記録、保存され、最終的に重ねて表示される。

【0051】

つまり、光検出装置１０では、ＡＭ－ＳＲＳ顕微鏡およびＰＭ－ＳＲＳ顕微鏡が同じ装置で構成されていることにより、細胞や生体組織構造とその中にある小分子の空間分布の相関が得られるため、分子の局在や輸送、代謝の動態解析がより容易になる。さらに、共焦点顕微鏡による形態情報が、コヒーレントラマン信号による分子構造の情報と同時に得られるため、分子濃度の組織内空間分布の情報が高い精度で得られる。

【0052】

ここで、本実施の形態に係る共焦点顕微鏡の特徴は以下のとおりである。すなわち、本実施の形態に係る共焦点顕微鏡による共焦点信号の検出と、ＳＲＳ顕微鏡によるＳＲＳ信号の検出において、共通のパルスレーザ光源、光変調器、ロックインアンプを使用している。このことにより、装置のコストが低減されるとともに、低域ノイズの影響を受けずに、高いＳＮ比で生体組織構造の情報の取得が可能となっている。また、対物レンズ３２の移動ではなく、ステージ３４のＺ軸方向の移動による深さ方向のスキャン機能を備えているので、ＳＲＳ顕微鏡の透過型検出系と共焦点顕微鏡の反射型検出系とを両立させることができる。さらに、共焦点モードへの切り替えにキューブ型のＰＢＳ４５を用いているので、ＳＲＳモードの測定系との相対的な光軸ずれが抑制される。また、試料３３に照射する光の偏光を円偏光としているので、共焦点反射信号を効率よく取得できる。

【0053】

＜各モードの動作＞
次に、図３から図６を参照して、ＡＭ－ＳＲＳモード、ＰＭ－ＳＲＳモード、および共焦点モードの各モードにおける光検出装置１０の動作についてより詳細に説明する。図３は各モードにおける各構成の設定を示す図、図４はＡＭ－ＳＲＳモードにおける接続を示すブロック図、図５はＰＭ－ＳＲＳモードにおける接続を示すブロック図、図６は共焦点モードにおける接続を示すブロック図である。図１に対して図４から図６では一部の構成を省略し、また図１に対して図４から図６では、分散制御デバイス５０、５１、シャッター５２、５３、５６が追加されているが、基本的な動作は図１と同様である。

【0054】

（ＡＭ－ＳＲＳモードの動作）
まず、ＡＭ－ＳＲＳモードでは、図４に示すように光源１１（図４では「Ｐｕｌｓｅｄ ｌａｓｅｒ」と表記）から出射した光源パルス光Ｐｓは、波形整形部１２（図４では「Ｄｉｓｐ Ｃｔｒｌ ０」と表記）、ＰＢＳ１３（図４では「ＢＳ１」と表記）を通過し、バンドパスフィルタ１６（図４では、「ＢＳ２」と表記）で２分岐される。この２分岐は、第１プローブ光Ｌ１と、第２プローブ光Ｌ２の分岐に対応する。ＡＭ－ＳＲＳモードでは、図１に示す励起光Ｌｅ側には分岐されていない。ただし、実際の動作では、後述のシャッター５６によって励起光Ｌｅが遮断される。２分岐された一方の光源パルス光Ｐｓは、光変調器１７（図４では「ＡＭ」と表記）、バンドパスフィルタ１８（図４では「Ｆ１」と表記）、分散制御デバイス５０（図４では「Ｄｉｓｐ Ｃｔｒｌ １」と表記）、シャッター５２を通過して、バンドパスフィルタ１６（図４では「ＢＣ２」と表記）、ＰＢＳ１３（図４では「ＢＣ１」と表記）へと進行する。一方、２分岐された他方の光源パルス光Ｐｓは、光変調器２１（図４では「ＰＭ」と表記）、バンドパスフィルタ３５（図４では「Ｆ２」と表記）、分散制御デバイス５１（図４では「Ｄｉｓｐ Ｃｔｒｌ ２」と表記）、シャッター５３を通過して、バンドパスフィルタ１６、ＰＢＳ１３へと進行する。

【0055】

第１プローブ光Ｌ１と第２プローブ光Ｌ２はバンドパスフィルタ１６で合波され合波光Ｌｇａとなる。合波光Ｌｇａは、ＰＢＳ４５（図４では「ＢＳ３」と表記）、対物レンズ３２（図４では「Ｌ１、Ｌ２」と表記）を通過した後試料３３を透過し、試料３３を透過した光はロングパスフィルタ２７（図４では「Ｆ３」と表記）を通過して、受光器２８（図４では「ＰＤ１」と表記）へ入射される。ここで、分散制御デバイス５０、５１は、通過する光の分散を調整するデバイスであり、第１プローブ光Ｌ１側の分散と、第２プローブ光Ｌ２側の分散との関係を調整する（一例として等しくする）。シャッター５２、５３は、例えば、光の通過／遮断を制御する光スイッチである。

【0056】

ＡＭ－ＳＲＳモードの設定は、図３に示すように、励起光Ｌｅがオフ、第１プローブ光Ｌ１がオン、第２プローブ光Ｌ２がオンとなる。ここで、本実施の形態において「オン」とは光を通過させることをいい、「オフ」とは光を遮断することをいう。また、振幅変調器である光変調器１７の変調動作を有効とし（オンとし）、位相変調器である光変調器２１の変調動作を無効とする（オフ）とする。従って、図３に示すように、ＲＦ変調は第１プローブ光Ｌ１を被変調光とする振幅変調となる。そして、受光器２８で受光する際には第１プローブ光Ｌ１をカットし、第２プローブ光Ｌ２を検出光とする。図４に示す検出方式は透過方式であるが、むろん反射方式としてもよい。図３に示すように、本ＡＭ－ＳＲＳモードで取得される情報は主として薬品の濃度マップのような化学的情報である。ここで、本実施の形態に係る光検出装置１０では、本ＡＭ－ＳＲＳモードにおけるＲＦ変調信号の波形を一例として正弦波としている。

【0057】

（ＰＭ－ＳＲＳモードの動作）
次に、図３および図５を参照して、ＰＭ－ＳＲＳモードの動作について説明する。図５に示すように、ＰＭ－ＳＲＳモードでは、光源１１から出射した光源パルス光Ｐｓは、波形整形部１２を通過後、ＰＢＳ１３で２分岐される。ＰＢＳ１３で２分岐された光源パルス光Ｐｓのうち一方は、励起光Ｌｅとして、エンドミラー１５（図５では「Ｄｅｌａｙ」と表記）、シャッター５６（図５では「Ｓ０」と表記）を通過し、ＰＢＳ１３に導かれる。また、ＰＢＳ１３で２分岐された光源パルス光Ｐｓのうち他方は、バンドパスフィルタ１６で２分岐される。この２分岐は、第１プローブ光Ｌ１と、第２プローブ光Ｌ２の分岐に対応し、各々のプローブ光の経路は上記ＡＭ－ＳＲＳモードと同様なので、詳細な説明を省略する。

【0058】

バンドパスフィルタ１６で２分岐された一方の光源パルス光Ｐｓは、光変調器１７、バンドパスフィルタ１８、分散制御デバイス５０、シャッター５２を通過して、バンドパスフィルタ１６、ＰＢＳ１３へと進行する。一方、２分岐された他方の光源パルス光Ｐｓは、光変調器２１、バンドパスフィルタ３５、分散制御デバイス５１、シャッター５３を通過して、バンドパスフィルタ１６、ＰＢＳ１３へと進行する。第１プローブ光Ｌ１と第２プローブ光Ｌ２はバンドパスフィルタ１６で合波され、該合波光はＰＢＳ１３でさらに励起光Ｌｅと合波され、合波光Ｌｇｐとなる。合波光Ｌｇｐは、ＰＢＳ４５、対物レンズ３２を通過した後試料３３を透過し、試料３３を透過した透過光はロングパスフィルタ２７を通過して、受光器２８へ入射される。

【0059】

ＰＭ－ＳＲＳモードの設定は、図３に示すように、励起光Ｌｅがオン、第１プローブ光Ｌ１がオン、第２プローブ光Ｌ２がオンとなる。また、位相変調器である光変調器２１の変調動作を有効とし（オンとし）、振幅変調器である光変調器１７の変調動作を無効とする（オフ）とする。従って、図３に示すように、ＲＦ変調は第２プローブ光Ｌ２を被変調光とする位相変調となる。なお、本実施の形態に係る光検出装置１０では、本ＰＭ－ＳＲＳモードにおけるＲＦ変調信号の波形を一例としてのこぎり（鋸歯状）波としている。そして、受光器２８で受光する際には、励起光Ｌｅ、および第２プローブ光をカットし、第１プローブ光を検出光とする。図５に示す検出方式は透過方式であるが、むろん反射方式としてもよい。図３に示すように、本ＰＭ－ＳＲＳモードで取得される情報は主として薬品の濃度マップのような化学的情報である。なお、ＰＭ－ＳＲＳモードで取得される濃度マップは、ＡＭ－ＳＲＳモードで取得される濃度マップよりも背景雑音が抑制されている。

【0060】

ここで、ＡＭ－ＳＲＳモードと、ＰＭ－ＳＲＳモードとの間における分散補正について説明する。ＰＭ－ＳＲＳモードでは、バンドパスフィルタ１８およびバンドパスフィルタ３５を使った非線形分散の効果により、プローブ光（第１プローブ光Ｌ１、第２プローブ光Ｌ２）は非対称波形となっている（図８参照）。従って、ＡＭ－ＳＲＳモードにおいて非線形効果の影響が出ないように、第１プローブパルス光調整部４１のバンドパスフィルタ１８および分散制御デバイス５０と、第２プローブパルス光調整部４２のバンドパスフィルタ３５および分散制御デバイス５１によって、双方における分散の違いを補正している。

【0061】

（共焦点モードの動作）
次に、図３および図６を参照して、共焦点モードの動作について説明する。図６に示すように、共焦点モードでは、光源１１から出射した光源パルス光Ｐｓは、波形整形部１２を通過後、ＰＢＳ１３、バンドパスフィルタ１６、光変調器１７、バンドパスフィルタ１８、分散制御デバイス５０、シャッター５２、バンドパスフィルタ１６、ＰＢＳ１３を通過し、ＰＢＳ４５へと導かれる。ＰＢＳ４５を通過した光源パルス光Ｐｓは、Ｌ１と表記された対物レンズ３２によって試料３３に照射され、試料３３で反射された光は再度対物レンズ３２（Ｌ１）、ＰＢＳ４５を通過する。ＰＢＳ４５を通過した光は、共焦点反射光Ｌｃとしてアパチャー４８を介し、受光器３９に入射する。すなわち、共焦点モードでは第１プローブ光Ｌ１のみが使用され、図６において、第２プローブ光Ｌ２はシャッター５３によって、励起光Ｌｅはシャッター５６によって各々遮断される。

【0062】

共焦点モードの設定は、図３に示すように、励起光Ｌｅがオフ、第１プローブ光Ｌ１がオン、第２プローブ光Ｌ２がオフとなる。また、振幅変調器である光変調器１７の変調動作を有効とする（オンとする）。従って、図３に示すように、ＲＦ変調は第１プローブ光Ｌ１を被変調光とする振幅変調となり、検出方式は反射方式となる。また、検出光は第１プローブ光Ｌ１である。ここで、図３に示すように、本共焦点モードで取得される情報は主として光散乱に基づく形態情報である。

【0063】

＜光検出処理＞
次に、図７を参照して、本実施の形態に係る光検出装置１０において実行される光検出処理について説明する。図７は当該光検出処理において実行される光検出処理プログラムの処理の流れを示すフローチャートである。本光検出処理プログラムは光検出装置１０の図示しないＲＯＭ等の記憶手段に記憶されており、光検出装置１０の図示を省略するユーザインタフェース部等を介して実行開始の指示を受け付けると、図示しないＣＰＵがＲＯＭ等の記憶手段から本光検出処理プログラムを読み込み、ＲＡＭ等に展開して実行する。

【0064】

ステップＳ１００では、光検出装置１０の構成を、図６に示す共焦点モードの構成に設定する。この際、光変調器１７の振幅変調動作をオンとする（有効とする）。

【0065】

ステップＳ１０１で、共焦点モードによる検出画像Ｇｃを取得する。検出画像Ｇｃは、主として、奥行き方向の組織構造情報を含む画像である。

【0066】

ステップＳ１０２で、光検出装置１０の構成を、図５に示すＰＭ－ＳＲＳモードの構成に設定する。この際、光変調器２１の位相変調動作をオンとし（有効とし）、光変調器１７の振幅変調動作をオフとする（無効とする）。また、励起光Ｌｅと、プローブ光（第１プローブ光Ｌ１、第２プローブ光Ｌ２）との間の相対的な遅延時間を予め設定しておく。

【0067】

ステップＳ１０３で、ＰＭ－ＳＲＳモードによる検出画像Ｇｐを取得する。検出画像Ｇｐは、主として、奥行き方向の分子濃度情報を含む画像である。

【0068】

ステップＳ１０４で、光検出装置１０の構成を、図４に示すＡＭ－ＳＲＳモードの構成に設定する。この際、光変調器１７の振幅変調動作をオンとし（有効とし）、光変調器２１の位相変調動作をオフとする（無効とする）。

【0069】

ステップＳ１０５で、ＡＭ－ＳＲＳモードによる検出画像Ｇａを取得する。検出画像Ｇａは、主として、奥行き方向の分子濃度情報を含む画像である。

【0070】

ステップＳ１０６で、検出画像Ｇｃ、Ｇｐ、およびＧａを合成して合成画像Ｇｔを生成する。その後、本光検出処理プログラムを終了する。生成した合成画像Ｇｔは、図示を省略する液晶ディスプレイ等の表示部に表示させてもよいし、ＲＡＭ等の記憶部に記憶させてもよい。

【0071】

なお、本実施の形態では、共焦点モード、ＰＭ－ＳＲＳモード、ＡＭ－ＳＲＳモードの順で検出画像を取得する形態を例示して説明したが、これに限られず、いずれの順番であってもよい。

【0072】

＜本実施の形態に係る光検出装置の特徴＞
本実施の形態に係る光検出装置１０の基本的な特徴は、以下のとおりである。すなわち、ＰＭ－ＳＲＳ顕微鏡では励起光、プロープ光の相対的な時間差を利用することにより、分子振動の持続時間の比較的長い分子を高いコントラストで選択的に検出できる。一方、ＡＭ－ＳＲＳ顕微鏡では、水や脂質などの生体自身に含まれる分子振動持続時間の短い、強いラマン信号を検出することで、細胞や組織の形態情報を高速に画像化できる。本実施の形態に係る光検出装置１０では、ＡＭ－ＳＲＳ顕微鏡およびＰＭ－ＳＲＳ顕微鏡を共焦点顕微鏡と同じ装置に組み込むことにより、コヒーレントラマン信号による分子構造の情報と共焦点反射による形態情報が同時に得られるため、分子濃度の組織内空間分布の情報が高い精度で得られる。また、細胞や生体組織構造とその中にある小分子の空間分布の相関が得られるため、分子の局在や輸送、代謝の動態解析がより容易になる。

【0073】

また、本実施の形態に係る光検出装置１０のその他の特徴は以下のとおりである。すなわち、振幅変調系（第１プローブパルス光調整部４１）と、位相変調系（第２プローブパルス光調整部４２）の光路を分割し、振幅変調系の光路に振幅変調器を、位相変調系の光路に位相変調器を各々配置している。このことにより、２つのプローブ光の役割が予め分けられる、つまり変調方式で光学系を固定される。その結果振幅変調系と位相変調系との間の空間的な位置ずれが抑制され、さらにラマンピークの波数が相対的にずれることが抑制されるため、光検出装置１０の調整は大幅に簡素化されている。

【0074】

さらに、振幅変調系の光路と、位相変調系の光路とは相対的に分散補償され、ほぼ同じ遅延量、ほぼ同じ分散量になるように調整されている。つまり、光変調器の違いによる時間遅延量を補償するための補正素子（エンドミラー２０、２３）、および分散量を補償するための補正素子（分散制御デバイス５０、５１）が用いられている。そのため、光検出感度、あるいは波数分解能を向上させることができる。

【0075】

なお、本実施の形態では、共焦点顕微鏡、ＡＭ－ＳＲＳ顕微鏡、およびＰＭ－ＳＲＳ顕微鏡の３種類の顕微鏡を組み合わせる形態を例示して説明したが、これに限られず、共焦点顕微鏡、ＡＭ－ＳＲＳ顕微鏡、およびＰＭ－ＳＲＳ顕微鏡の少なくとも２種類の顕微鏡を組み合わせる形態としてもよい。例えば、上述したような、共焦点顕微鏡、ＡＭ－ＳＲＳ顕微鏡、およびＰＭ－ＳＲＳ顕微鏡の各々の特質を比較、検討し組み合わせを決定してもよい。

【0076】

また、本実施の形態では、振幅変調器および位相変調器として別々の光変調器を用いる形態を例示して説明したが、振幅変調、位相変調の双方が切り替えて行える光変調器であれば、１つの光変調器を共用する形態としてもよい。

【0077】

２０２０年１月９日に出願された日本国特許出願２０２０－００２１０７号の開示は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。

【0078】

本明細書に記載された全ての文献、特許出願、および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。

【符号の説明】

【0079】

１０ 光検出装置
１１ 光源
１２ 波形整形部
１３ ＰＢＳ
１４ １／４波長板
１５ エンドミラー
１６ バンドパスフィルタ
１７ 光変調器
１８ バンドパスフィルタ
１９ １／４波長板
２０ エンドミラー
２１ 光変調器
２２ １／４波長板
２３ エンドミラー
２４ 波長走査部
２５ 顕微鏡
２６ 偏光子
２７ ロングパスフィルタ
２８ 受光器
２９、３０、３１ ミラー
３２ 対物レンズ
３３ 試料
３４ ステージ
３５ バンドパスフィルタ
３６ 分散補償器
３７、３８ ミラー
３９ 受光器
４０ 励起パルス光調整部
４１ 第１プローブパルス光調整部
４２ 第２プローブパルス光調整部
４３ 受光部
４４ 制御部
４５ ＰＢＳ
４６ １／４波長板
４７ レンズ
４８ アパチャー
４９ マルチモードファイバ
５０、５１ 分散制御デバイス
５２、５３、５６ シャッター
５８、５９ ミラー
１００ 光検出装置
１１１ 光源
１１６ バンドパスフィルタ
１１８ バンドパスフィルタ
１２０ エンドミラー
１２１ 位相変調器
１２５ 顕微鏡
１５０ パルス光生成部
Ｇｃ、Ｇｐ、Ｇａ 検出画像、Ｇｔ 合成画像、Ｌｅ 励起光、Ｌ１ 第１プローブ光、Ｌ２ 第２プローブ光、Ｌｒ リファレンスプローブ光、Ｌｐ 位相変調プローブ光、Ｌｇ、Ｌｇａ、Ｌｇｐ 合波光、Ｌｃ 共焦点反射光、Ｐ１ 第１プローブパルス光、Ｐ２ 第２プローブパルス光、Ｐｓ 光源パルス光、Ｐｅ 励起パルス光、Ｐｐ 位相変調プローブパルス光、Ｐｒ リファレンスプローブパルス光

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】