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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B1)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-05-02
(45)【発行日】2024-05-14
(54)【発明の名称】シイノトモシビタケ由来の発光関連遺伝子
(51)【国際特許分類】
C12N 15/53 20060101AFI20240507BHJP
A01H 1/00 20060101ALI20240507BHJP
A01H 5/00 20180101ALI20240507BHJP
C12N 5/04 20060101ALI20240507BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240507BHJP
C12N 15/52 20060101ALI20240507BHJP
C12N 15/55 20060101ALI20240507BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240507BHJP
C12N 15/82 20060101ALI20240507BHJP
【ＦＩ】
C12N15/53 ZNA
A01H1/00 A
A01H5/00 A
C12N5/04
C12N5/10
C12N15/52 Z
C12N15/53
C12N15/55
C12N15/63 Z
C12N15/82 Z
【請求項の数】
11
(21)【出願番号】P 2023102058
(22)【出願日】2023-06-21
【審査請求日】2023-10-24
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成３０年度、国立研究開発法人新エネルギー・産業技術総合開発機構／ＮＥＤＯ先導研究プログラム／新産業創出新技術先導研究プログラム委託研究、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】504176911
【氏名又は名称】国立大学法人大阪大学
(74)【代理人】
【識別番号】110002572
【氏名又は名称】弁理士法人平木国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】永井 健治
(72)【発明者】
【氏名】長部 謙二
(72)【発明者】
【氏名】圓谷 徹之
【審査官】小倉 梢
(56)【参考文献】
【文献】特開２０２３－０４３４６１（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１１－１８８７８７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１４－５０００１１（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０２０－５０５０２８（ＪＰ，Ａ）
【文献】Database UniProtKB/TrEMBL [online], ID: A0A8H6WUE9_9AGAR, 22-FEB-2023 version 5 uploaded, [検索日 2023.11.28], Luciferase, Mycena venus，https://rest.uniprot.org/unisave/A0A8H6WUE9?format=txt&versions=5
【文献】Database UniProtKB/TrEMBL [online], ID: A0A8H6Y9W0_9AGAR, 22-FEB-2023 version 5 uploaded, [検索日 2023.11.28], Luciferase, Mycena sanguinolenta，https://rest.uniprot.org/unisave/A0A8H6Y9W0?format=txt&versions=5
【文献】MITIOUCHKINA et al.，Nature Biotechnology，2020年，Vol. 38, No. 8，p.944-946，DOI: 10.1038/s41587-020-0500-9
【文献】KE et al.，Proceedings of the National Academy of Sciences，2020年，Vol. 117, No. 49，p.31267-31277，DOI: 10.1073/pnas.2010761117
【文献】TERANISHI et al，Mushroom Science and Biotechnology，2019年，Vol. 27, No. 2，p. 61-66
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００
Ｃ１２Ｑ １／００－３／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号７で表されるアミノ酸配列、若しくは、配列番号７で表されるアミノ酸配列の２２番目及び２４１番目に相当するアミノ酸がそれぞれロイシン（Ｌ）、アスパラギン酸（Ｄ）であり、全体として配列番号７で表されるアミノ酸配列と９１％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列；配列番号８で表されるアミノ酸配列、若しくは、配列番号８で表されるアミノ酸配列の６番目及び８２番目に相当するアミノ酸がそれぞれアラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）であり、全体として配列番号８で表されるアミノ酸配列と９１％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列；又は、配列番号９で表されるアミノ酸配列、若しくは、配列番号９で表されるアミノ酸配列の８４番目及び２０６番目に相当するアミノ酸がそれぞれグルタミン（Ｑ）、イソロイシン（Ｉ）であり、全体として配列番号９で表されるアミノ酸配列と９１％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列；を含む、ルシフェリンを酸化し発光させる機能を有するタンパク質をコードする塩基配列を含み、前記タンパク質のルシフェリンを酸化し発光させる機能は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質よりも高い、
核酸。
【請求項2】
請求項１に記載の核酸を組み込んだ、発現用ベクター。
【請求項3】
植物発現用ベクターである、請求項２に記載の発現用ベクター。
【請求項4】
請求項１に記載の核酸を含む、非ヒトトランスジェニック生物。
【請求項5】
植物細胞である、請求項４に記載の非ヒトトランスジェニック生物。
【請求項6】
カルスである、請求項４に記載の非ヒトトランスジェニック生物。
【請求項7】
植物体である、請求項４に記載の非ヒトトランスジェニック生物。
【請求項8】
請求項３に記載の発現用ベクターを用いて、植物細胞、カルス又は植物体を形質転換することを含む、非ヒトトランスジェニック生物の製造方法。
【請求項9】
請求項１に記載の核酸を含む、発現カセット。
【請求項10】
請求項９に記載の発現カセットが、配列番号２若しくは３で表されるアミノ酸配列又は配列番号２若しくは３で表される配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、コーヒー酸とマロニルＣｏＡからヒスピジンが生成される反応を触媒する機能を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸を含む、発現カセット；
配列番号４若しくは５で表されるアミノ酸配列又は配列番号４若しくは５で表される配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ヒスピジンの３位の炭素にヒドロキシ基を付加する機能を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸を含む、発現カセット；及び
配列番号６で表されるアミノ酸配列又は配列番号６で表される配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、カフェオイルピルビン酸からコーヒー酸を生成する機能を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸を含む、発現カセット；
から選択される少なくとも１つと、プラスミド内でタンデムに配置される発現カセット。
【請求項11】
請求項９に記載の発現カセットと、配列番号２若しくは３で表されるアミノ酸配列又は配列番号２若しくは３で表される配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、コーヒー酸とマロニルＣｏＡからヒスピジンが生成される反応を触媒する機能を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸を含む、発現カセット；
配列番号４若しくは５で表されるアミノ酸配列又は配列番号４若しくは５で表される配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ヒスピジンの３位の炭素にヒドロキシ基を付加する機能を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸を含む、発現カセット；及び
配列番号６で表されるアミノ酸配列又は配列番号６で表される配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、カフェオイルピルビン酸からコーヒー酸を生成する機能を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸を含む、発現カセット；
から選択される少なくとも１つの発現カセットとの組み合わせ物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、シイノトモシビタケ由来の発光関連遺伝子をコードする核酸、該核酸を含むベクター、該核酸を含むトランスジェニック生物、及びトランスジェニック生物の製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
生物の一部には、発光バクテリア、ホタル等の、自ら光を生成し放射する能力を有するもの、すなわち生物発光を行うものが存在する。生物発光は、ルシフェラーゼ又は発光タンパク質の働きによって生じることが分かっている。ルシフェラーゼとは、発光物質を酸化して発光させる酵素の総称であり、ルシフェラーゼにより酸化される発光物質を総称してルシフェリンという。しかし生物によりルシフェラーゼやルシフェリンは全く違ったものであり、発光反応機構も異なる。発光タンパク質としては、オワンクラゲ由来のイクオリンが知られる。イクオリンは、緑色蛍光タンパク質と複合体を形成し、周囲のカルシウム濃度に応じて発光することが知られる。
【0003】
生物発光を行う生物のうち、発光キノコについて、その発光メカニズムは、長い間解明されていなかったが、２０１５年に発光キノコの１種であるシロヒカリタケのルシフェリンの構造が明らかとなり（非特許文献１）、次いで、ルシフェラーゼの構造及び発光メカニズムが明らかとなった（非特許文献２及び特許文献１）。さらに、シロヒカリタケの発光関連遺伝子を植物に導入することで、植物の生存に大きな影響を与えることなく、植物自体が保有するコーヒー酸を発光物質前駆体として該植物を発光させることができることが明らかとなり、これにより、自家発光植物が構築された（非特許文献３）。植物への発光関連遺伝子の導入は、発光バクテリア等の遺伝子について行われてきたが、シロヒカリタケの遺伝子を用いることで、発光バクテリアの遺伝子と比較して、より強い発光が見られることが明らかになった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【文献】特表２０２０－５０５０２８号公報
【非特許文献】
【0005】
【文献】K. V. Purtov, et al., Angew. Chem. Int. Ed., Vol. 54, pp.8124-8128 (2015)
【文献】A. A. Kotlobay, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 115, pp. 12728-12732 (2018)
【文献】T. Mitiouchkina, et al., Nature Biotechnology, Vol. 38, pp. 944-946 (2020)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
発光植物は、その外観からインテリアとしての有用性がある。また、自家発光する発光植物は、電力等を必要としないことから、環境にやさしい照明としての用途も期待できる。しかしながら、現在のところ、発光植物の発光強度は、照明器具の代替として使用可能なレベルとはいい難く、より強く発光する発光植物が望まれる。
【0007】
本発明は、既知の発光関連遺伝子よりも強い発光を生物（特に植物）に付与することが可能な、新規の発光関連遺伝子（核酸、発現用ベクター）を提供することを目的とする。また、本発明は、該発光関連遺伝子を導入したトランスジェニック生物、及び該トランスジェニック生物の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明は、以下を提供する。
［１］配列番号１で表されるアミノ酸配列又は配列番号１で表される配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列；
配列番号２若しくは３で表されるアミノ酸配列又は配列番号２若しくは３で表される配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列；
配列番号４若しくは５で表されるアミノ酸配列又は配列番号４若しくは５で表される配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列；及び
配列番号６で表されるアミノ酸配列又は配列番号６で表される配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列；
から選択される少なくとも１つの塩基配列を含む、核酸。
［２］配列番号１で表されるアミノ酸配列においてｐ．Ｔ６Ａ、ｐ．Ｐ２２Ｌ、ｐ．Ｅ８２Ｖ、ｐ．Ｐ８４Ｑ、ｐ．Ｖ２０６Ｉ及びｐ．Ｎ２４１Ｄから選択される少なくとも１つの変異を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列を含む、［１］に記載の核酸。
［３］配列番号７～９のいずれかで表されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列を含む、［２］に記載の核酸。
［４］［１］～［３］のいずれかに記載の核酸を組み込んだ、発現用ベクター。
［５］植物発現用ベクターである、［４］に記載の発現用ベクター。
［６］［１］～［３］のいずれかに記載の核酸を含む、トランスジェニック生物。
［７］植物細胞である、［６］に記載のトランスジェニック生物。
［８］カルスである、［６］に記載のトランスジェニック生物。
［９］植物体である、［６］に記載のトランスジェニック生物。
［１０］[５］に記載の発現用ベクターを用いて、植物細胞、カルス又は植物体を形質転換することを含む、トランスジェニック生物の製造方法。
［１］配列番号１で表されるアミノ酸配列又は配列番号１で表される配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列；
配列番号２若しくは３で表されるアミノ酸配列又は配列番号２若しくは３で表される配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列；
配列番号４若しくは５で表されるアミノ酸配列又は配列番号４若しくは５で表される配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列；及び
配列番号６で表されるアミノ酸配列又は配列番号６で表される配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列；
から選択される少なくとも１つの塩基配列を含む、核酸。
［２］配列番号１で表されるアミノ酸配列においてｐ．Ｔ６Ａ、ｐ．Ｐ２２Ｌ、ｐ．Ｅ８２Ｖ、ｐ．Ｐ８４Ｑ、ｐ．Ｖ２０６Ｉ及びｐ．Ｎ２４１Ｄから選択される少なくとも１つの変異を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列を含む、［１］に記載の核酸。
［３］配列番号７～９のいずれかで表されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列を含む、［２］に記載の核酸。
［４］［１］～［３］のいずれかに記載の核酸を組み込んだ、発現用ベクター。
［５］植物発現用ベクターである、［４］に記載の発現用ベクター。
［６］［１］～［３］のいずれかに記載の核酸を含む、トランスジェニック生物。
［７］植物細胞である、［６］に記載のトランスジェニック生物。
［８］カルスである、［６］に記載のトランスジェニック生物。
［９］植物体である、［６］に記載のトランスジェニック生物。
［１０］[５］に記載の発現用ベクターを用いて、植物細胞、カルス又は植物体を形質転換することを含む、トランスジェニック生物の製造方法。
【発明の効果】
【0009】
本発明の核酸、これを組み込んだ発現用ベクター及び、これを用いたトランスジェニック生物の製造方法により、既知の発光関連遺伝子よりも強い発光を生物（特に植物）に付与することが可能である。また、本発明のトランスジェニック生物は、既知の発光関連遺伝子を含む植物より、強い発光を示すことができる。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1】発光キノコのコーヒー酸を介した発光メカニズムを示す概略図である。
【図2】実施例２において、ｃＤＮＡをルシフェラーゼ遺伝子増幅用プライマーを用いて増幅した増幅産物の電気泳動写真である。
【図3】実施例２において、３’ＲＡＣＥ ＰＣＲで得られた増幅産物の電気泳動写真である。
【図4】実施例２において、５’ＲＡＣＥ ＰＣＲで得られた増幅産物の電気泳動写真である。
【図5】実施例３において、ｃＤＮＡをヒスピジンシンターゼ遺伝子増幅用プライマーを用いて増幅した増幅産物の電気泳動写真である。
【図6】実施例３において、３’ＲＡＣＥ ＰＣＲで得られた増幅産物の電気泳動写真である。矢印で示すバンドが目的の増幅産物である。
【図7】実施例３において、ネステッドＰＣＲで得られた増幅産物の電気泳動写真である。矢印で示すバンドが目的の増幅産物である。
【図8】実施例３において、５’ＲＡＣＥ ＰＣＲで得られた増幅産物の電気泳動写真である。矢印で示すバンドが目的の増幅産物である。
【図9】実施例３で得られたヒスピジンシンターゼ遺伝子の全長コーディング領域の電気泳動写真である。矢印で示すバンドが全長コーディング領域である。
【図10】実施例４において、ヒスピジン－３－ヒドロキシラーゼ遺伝子増幅用プライマーを用いた３’ＲＡＣＥ ＰＣＲで得られた増幅産物の電気泳動写真である。矢印で示すバンドが目的の増幅産物である。
【図11】実施例４において、５’ＲＡＣＥ ＰＣＲで得られた増幅産物の電気泳動写真である。
【図12】実施例４において、ヒスピジン－３－ヒドロキシラーゼ遺伝子の全長コーディング領域の電気泳動写真である。
【図13】実施例５において、カフェオイルピルビン酸ヒドロラーゼ遺伝子増幅用プライマーを用いた３’ＲＡＣＥ ＰＣＲで得られた増幅産物の電気泳動写真である。矢印で示すバンドが目的の増幅産物である。
【図14】実施例５において、カフェオイルピルビン酸ヒドロラーゼ遺伝子の５’ＲＡＣＥ ＰＣＲで得られた増幅産物の電気泳動写真である。矢印で示すバンドがカフェオイルピルピン酸ヒドロラーゼ遺伝子由来の増幅産物である。
【図15】実施例７において、シイノトモシビタケ由来の発光関連遺伝子又はヤコウタケ等由来の発光関連遺伝子を含む発現プラスミドを含むアグロバクテリウムを感染させた、ベンサミアナタバコ葉上の部位の発光強度を示す写真である。Ａが明視野で撮像した写真、Ｂが暗視野で撮像した写真である。
【図16】実施例８において、シイノトモシビタケルシフェラーゼ、ヤコウタケルシフェラーゼ、シロヒカリタケルシフェラーゼの遺伝子を含む発現プラスミドをそれぞれ含むアグロバクテリウムを感染させた、ベンサミアナタバコ葉上の部位の発光強度を示す写真である。Ａが明視野で撮像した写真、Ｂが暗視野で撮像した写真である。
【図17】実施例８において、シイノトモシビタケルシフェラーゼ、ヤコウタケルシフェラーゼ、シロヒカリタケルシフェラーゼの遺伝子を含む発現プラスミドをそれぞれ含むアグロバクテリウムを感染させた、ベンサミアナタバコ葉上の各部位の発光強度を示すグラフである。
【図18】実施例９において、野生型ルシフェラーゼ、変異体１～３をそれぞれ導入した大腸菌の培養液１０μＬ当たりのルシフェラーゼタンパク質を検出した、イムノブロットメンブレンの写真である。
【図19】実施例９における、野生型ルシフェラーゼ、変異体１～３をそれぞれ導入した大腸菌の、３－ヒドロキシヒスピジン存在下での、ルシフェラーゼタンパク質量あたりの発光活性を示すグラフである。
【図20】シイノトモシビタケルシフェラーゼの野生型と変異体１～３のアミノ酸配列の配列アラインメントである。
【発明を実施するための形態】
【0011】
本明細書及び図面に記載される化学式は、特に記載がない限り、あらゆる幾何学異性体及び光学的異性体を含むものとする。本明細書において「シイノトモシビタケ（由来）の」とは、シイノトモシビタケから直接単離されたタンパク質、核酸等のみを指すものでなく、これらを解析して人工的に合成されたタンパク質、核酸等も包含するものとする。
【0012】
１．発光関連遺伝子（核酸）
１－１ 概要
本発明の第１の実施形態は、配列番号１で表されるアミノ酸配列又は配列番号１で表される配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列；配列番号２若しくは３で表されるアミノ酸配列又は配列番号２若しくは３で表される配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列；配列番号４若しくは５で表されるアミノ酸配列又は配列番号４若しくは５で表される配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列；及び配列番号６で表されるアミノ酸配列又は配列番号６で表される配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列；から選択される少なくとも１つの塩基配列を含む、核酸である。より具体的には、本実施形態は、シイノトモシビタケのルシフェラーゼ（Ｌｕｚ）（配列番号１）又はその変異体、ヒスピジンシンターゼ（ＨｉｓｐＳ）（配列番号２若しくは３）又はその変異体、ヒスピジン－３－ヒドロキシラーゼ（Ｈ３Ｈ）（配列番号４若しくは５）又はその変異体、及びカフェオイルピルビン酸ヒドロラーゼ（ＣＰＨ）（配列番号６）又はその変異体から選択されるタンパク質に関する発光関連遺伝子に関する。
１－１ 概要
本発明の第１の実施形態は、配列番号１で表されるアミノ酸配列又は配列番号１で表される配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列；配列番号２若しくは３で表されるアミノ酸配列又は配列番号２若しくは３で表される配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列；配列番号４若しくは５で表されるアミノ酸配列又は配列番号４若しくは５で表される配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列；及び配列番号６で表されるアミノ酸配列又は配列番号６で表される配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列；から選択される少なくとも１つの塩基配列を含む、核酸である。より具体的には、本実施形態は、シイノトモシビタケのルシフェラーゼ（Ｌｕｚ）（配列番号１）又はその変異体、ヒスピジンシンターゼ（ＨｉｓｐＳ）（配列番号２若しくは３）又はその変異体、ヒスピジン－３－ヒドロキシラーゼ（Ｈ３Ｈ）（配列番号４若しくは５）又はその変異体、及びカフェオイルピルビン酸ヒドロラーゼ（ＣＰＨ）（配列番号６）又はその変異体から選択されるタンパク質に関する発光関連遺伝子に関する。
【0013】
非特許文献１において明らかにされた通り、発光キノコ（非特許文献１ではシロヒカリタケ（Neonothopanus nambi））の発光は、図１に概説される機序によって生じる。発光キノコの発光物質ルシフェリンは、３－ヒドロキシヒスピジンである。３－ヒドロキシヒスピジンは、コーヒー酸がＨｉｓｐＳの存在下でマロニルＣｏＡと反応することで生成したヒスピジンが、さらに、Ｈ３Ｈの働きでヒドロキシル化することで生成する。この３－ヒドロキシヒスピジンが、Ｌｕｚの働きで酸化されることで、緑色光を発する。この際に生じるオキシルシフェリンから、ＣＰＨの働きにより、再度コーヒー酸が生成される。このように、発光キノコでは、発光関連物質が循環的に使用されることから、生体内に蓄積する量が微小であり、これが、発光関連物質と発光機序の解明を困難にしてきた要因であった。
【0014】
本発明者らは、シイノトモシビタケの発光関連酵素、Ｌｕｚ、ＨｉｓｐＳ、Ｈ３Ｈ、ＣＰＨ及びこれらの遺伝子を同定した。本発明者らは、鋭意検討の結果、これらの発光関連酵素をコードする発光関連遺伝子について、植物に導入することで、既知の発光キノコの発光関連遺伝子を導入するよりも、植物に強い発光を生じさせることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【0015】
１－２ 定義
「核酸」とは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）を指すが、本明細書においては、特に記載のない限り、ＤＮＡを指すものとする。
「核酸」とは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）を指すが、本明細書においては、特に記載のない限り、ＤＮＡを指すものとする。
【0016】
本明細書において、「シイノトモシビタケ（Mycena lux-coeli）」とは、ハラタケ目クヌギタケ科クヌギタケ属に属するキノコの一種である。本明細書において「発光キノコ」とは、担子菌門に属し、かつ自発発光する生物全般を指す。発光キノコとしては、例えば、シイノトモシビタケ、シロヒカリタケ（Neonothopanus nambi）、ナラタケ（Armillaria mellea）、Mycena citricolor、オニナラタケ（Armillaria ostoyae）、ヤコウタケ（Mycena chlorophos）、ワダゲナラタケ（Armillaria gallica）、ワサビタケ（Panellus stipticus）、Omphakotus olearius等が知られる。
【0017】
本明細書において、「発光関連遺伝子」とは、コーヒー酸からのルシフェリンの生合成経路に関与する酵素、ルシフェリンを酸化して発光させる酵素、及び酸化後のルシフェリンからのコーヒー酸の生成に関与する酵素の遺伝子を指す。より具体的には、ルシフェラーゼ（Ｌｕｚ）、ヒスピジンシンターゼ（ＨｉｓｐＳ）、ヒスピジン－３－ヒドロキシラーゼ（Ｈ３Ｈ）及びカフェオイルピルビン酸ヒドロラーゼ（ＣＰＨ）の遺伝子を指す。本明細書において、「ルシフェリン」とは、ルシフェラーゼの働きにより酸化され、発光する物質を指し、より具体的には３－ヒドロキシヒスピジンを指す。「ルシフェラーゼ（Ｌｕｚ）」とは、発光物質を発光させる働きを有する酵素の総称であるが、本明細書においては、３－ヒドロキシヒスピジンを酸化し発光させる酵素を指す。「ヒスピジンシンターゼ（ＨｉｓｐＳ）」とは、コーヒー酸とマロニルＣｏＡからのヒスピジンの生合成を触媒する酵素を指す。「コーヒー酸」は、リグニン生合成の中間体であり、リグニンを含む植物のほとんどに存在する物質として知られる。「ヒスピジン－３－ヒドロキシラーゼ（Ｈ３Ｈ）」は、ヒスピジンの３位の炭素へのヒドロキシ基の付加を触媒する酵素である。ここで生成される３－ヒドロキシヒスピジンが、ルシフェリンとして機能する、すなわち、Ｌｕｚにより酸化されて発光する。「カフェオイルピルビン酸ヒドロラーゼ（ＣＰＨ）」は、３－ヒドロキシヒスピジンが酸化したオキシルシフェリンからのコーヒー酸の生成を触媒する酵素である。ここで生成されたコーヒー酸は、再びルシフェリンの生合成に使用される。
【0018】
本明細書において、「配列同一性」とは、２つのアミノ酸配列または塩基配列にギャップを導入して、またはギャップを導入しないで整列させた場合の、最適なアラインメントにおいて、オーバーラップする全アミノ酸配列（翻訳開始点となるアミノ酸を含む）または塩基配列（開始コドンを含む）に対する同一アミノ酸または塩基の割合（パーセンテージ）を意味し、式（１）によって算出する。配列同一性は、この分野で汎用されているアルゴリズムであるＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）を用いて容易に調べることができる。例えばＢＬＡＳＴは、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）やＫＥＧＧ（Ｋｙｏｔｏ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅｓ）などのウェブサイトから誰でも利用可能であり、デフォルトのパラメーターを用いて容易に配列同一性を調べることができる。
配列同一性（％）＝一致数（ギャップ同士は無視する）／短いほうの配列長（ギャップを含まない長さ）×１００・・・式（１）
配列同一性（％）＝一致数（ギャップ同士は無視する）／短いほうの配列長（ギャップを含まない長さ）×１００・・・式（１）
【0019】
本明細書において、遺伝子変異は以下のように表記する。遺伝子変異を核酸レベルで表記する場合、塩基置換は「ｃ．６５Ｃ＞Ｔ」のように記載する。「ｃ．」は、ｃｏｄｉｎｇＤＮＡの略である。「ｃ．６５Ｃ＞Ｔ」は、６５番目のシトシンがチミンに置換される変異を示す。一方、遺伝子変異をタンパク質レベルで表記する場合、ミスセンス変異は、「ｐ．Ｐ２２Ｌ」のように記載する。「ｐ．」は、ｐｒｏｔｅｉｎの略である。「ｐ．Ｐ２２Ｌ」は、２２番目のプロリンがロイシンに置換される変異を示す。
【0020】
１－３ シイノトモシビタケの発光関連遺伝子又はその変異体
本実施形態の核酸は、シイノトモシビタケの発光関連遺伝子又はその変異体を含む核酸である。
本実施形態の核酸は、シイノトモシビタケの発光関連遺伝子又はその変異体を含む核酸である。
【0021】
１－３－１ ルシフェラーゼ（Ｌｕｚ）
本実施形態の核酸は、シイノトモシビタケ由来のＬｕｚ（以下、本項において、単に「Ｌｕｚ」とも称する）をコードする核酸を選択的に含む。本実施形態において、Ｌｕｚとは、配列番号１に示すアミノ酸配列又は配列番号１で表される配列と９０％以上、好ましくは、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、ルシフェリンを酸化する機能を有するタンパク質を指す。
本実施形態の核酸は、シイノトモシビタケ由来のＬｕｚ（以下、本項において、単に「Ｌｕｚ」とも称する）をコードする核酸を選択的に含む。本実施形態において、Ｌｕｚとは、配列番号１に示すアミノ酸配列又は配列番号１で表される配列と９０％以上、好ましくは、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、ルシフェリンを酸化する機能を有するタンパク質を指す。
【0022】
本発明者らは、後述の実施例２に示す通り、シイノトモシビタケのルシフェラーゼ遺伝子（以下、「ｌｕｚ」とも称する）を同定した（配列番号１０）。ｌｕｚの塩基配列（配列番号１０）は、Ｌｕｚのアミノ酸配列（配列番号１）をコードする。
【0023】
本発明者らは、野生型ｌｕｚ（配列番号１０）にランダム変異を加えて、それぞれ植物に導入し、野生型ｌｕｚよりも強い発光が見られる変異体を選別した。その結果、配列番号１のアミノ酸配列において、ｐ．Ｐ２２Ｌ及びｐ．Ｎ２４１Ｄの変異を有するアミノ酸配列（配列番号７）、ｐ．Ｔ６Ａ及びｐ．Ｅ８２Ｖの変異を有するアミノ酸配列（配列番号８）、ｐ．Ｐ８４Ｑ及びｐ．Ｖ２０６Ｉの変異を有するアミノ酸配列（配列番号９）を有する変異体Ｌｕｚが、野生型Ｌｕｚよりも植物に強い発光能を付与することが示された（図１９、２０）。したがって、本実施形態において、Ｌｕｚは、野生型であっても変異体であってもよいが、より強い発光能を植物に付与する変異体とすることが好ましい。
【0024】
本実施形態において、Ｌｕｚは、ｐ．Ｔ６Ａ、ｐ．Ｐ２２Ｌ、ｐ．Ｅ８２Ｖ、ｐ．Ｐ８４Ｑ、ｐ．Ｖ２０６Ｉ及びｐ．Ｎ２４１Ｄから選択される少なくとも１つの変異を有するアミノ酸配列を含むことが好ましい。これらの変異は、Ｌｕｚ遺伝子（ｌｕｚ、配列番号１０）の塩基配列においては、それぞれ、ｃ．１６Ａ＞Ｇ、ｃ．６５Ｃ＞Ｔ、ｃ．２４５Ａ＞Ｕ、ｃ．２５１Ｃ＞Ａ、ｃ．６１６Ｇ＞Ａ及びｃ．７２１Ａ＞Ｇの変異に相当する。さらに、Ｌｕｚは、配列番号７（配列番号１にｐ．Ｐ２２Ｌ及びｐ．２４１Ｄの変異を有する）、配列番号８（配列番号１にｐ．Ｔ６Ａ及びｐ．Ｅ８２Ｖの変異を有する）及び配列番号９（配列番号１にｐ．Ｐ８４Ｑ及びｐ．Ｖ２０６Ｉの変異を有する）のいずれかで表されるアミノ酸配列を含むことがより好ましい。上記の変異を有するＬｕｚは、野生型と比較して、植物に導入することで、該植物により強い発光能を付与することが可能である。
【0025】
１－３－２ ヒスピジンシンターゼ（ＨｉｓｐＳ）
本実施形態の核酸は、シイノトモシビタケ由来のＨｉｓｐＳ（以下、本項において、単に「ＨｉｓｐＳ」とも称する）をコードする核酸を選択的に含む。本実施形態において、ＨｉｓｐＳは、配列番号２若しくは３に示すアミノ酸配列又は配列番号２若しくは３で表される配列と９０％以上、好ましくは、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、コーヒー酸とマロニルＣｏＡからヒスピジンが生成される反応を触媒する機能を有するタンパク質を指す。
本実施形態の核酸は、シイノトモシビタケ由来のＨｉｓｐＳ（以下、本項において、単に「ＨｉｓｐＳ」とも称する）をコードする核酸を選択的に含む。本実施形態において、ＨｉｓｐＳは、配列番号２若しくは３に示すアミノ酸配列又は配列番号２若しくは３で表される配列と９０％以上、好ましくは、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、コーヒー酸とマロニルＣｏＡからヒスピジンが生成される反応を触媒する機能を有するタンパク質を指す。
【0026】
本発明者らは、後述の実施例３に示す通り、シイノトモシビタケのヒスピジンシンターゼ遺伝子（以下、「ｈｉｓｐｓ」とも称する）の２つの配列を同定した（配列番号１１及び１２）。シイノトモシビタケのｈｉｓｐｓの２つの塩基配列（ｈｉｓｐｓ１（配列番号１１）及びｈｉｓｐｓ２（配列番号１２））は、それぞれＨｉｓｐＳの２つのアミノ酸配列（ＨｉｓｐＳ１（配列番号２）及びＨｉｓｐＳ２（配列番号３））をコードする。
【0027】
本実施形態において、ＨｉｓｐＳは、配列番号２若しくは３のアミノ酸配列を有するタンパク質に限らず、変異を有していてもよい。特に、野生型と比較して、植物に導入した際に、該植物に強い発光能を付与することができる変異を有することが好ましい。
【0028】
１－３－３ ヒスピジン－３－ヒドロキシラーゼ（Ｈ３Ｈ）
本実施形態の核酸は、シイノトモシビタケ由来のＨ３Ｈ（以下、本項において、単に「Ｈ３Ｈ」とも称する）をコードする核酸を選択的に含む。本実施形態において、Ｈ３Ｈは、配列番号４若しくは５に示すアミノ酸配列又は配列番号４若しくは５で表される配列と９０％以上、好ましくは、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、ヒスピジンの３位の炭素にヒドロキシ基を付加する機能を有するタンパク質を指す。
本実施形態の核酸は、シイノトモシビタケ由来のＨ３Ｈ（以下、本項において、単に「Ｈ３Ｈ」とも称する）をコードする核酸を選択的に含む。本実施形態において、Ｈ３Ｈは、配列番号４若しくは５に示すアミノ酸配列又は配列番号４若しくは５で表される配列と９０％以上、好ましくは、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、ヒスピジンの３位の炭素にヒドロキシ基を付加する機能を有するタンパク質を指す。
【0029】
本発明者らは、後述の実施例４に示す通り、シイノトモシビタケのヒスピジン－３－ヒドロキシラーゼ遺伝子（以下、「ｈ３ｈ」とも称する）の２つの配列を同定した（配列番号１３及び１４）。シイノトモシビタケのｈ３ｈの２つの塩基配列（ｈ３ｈ（配列番号１３）及びｈ３ｈ（配列番号１４））は、それぞれＨｉｓｐＳの２つのアミノ酸配列（Ｈ３Ｈ１（配列番号４）及びＨ３Ｈ２（配列番号５））をコードする。
【0030】
本実施形態において、Ｈ３Ｈは、配列番号４若しくは５のアミノ酸配列を有するタンパク質に限らず、変異を有していてもよい。特に、野生型と比較して、植物に導入した際に、該植物に強い発光能を付与することができる変異を有することが好ましい。
【0031】
１－３－４ カフェオイルピルビン酸ヒドロラーゼ（ＣＰＨ）
本実施形態の核酸は、シイノトモシビタケ由来のＣＰＨ（以下、本項において、単に「ＣＰＨ」とも称する）をコードする核酸を選択的に含む。本実施形態において、ＣＰＨは、配列番号６に示すアミノ酸配列又は配列番号６で表される配列と９０％以上、好ましくは、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、オキシルシフェリンからコーヒー酸を生成する機能を有するタンパク質を指す。
本実施形態の核酸は、シイノトモシビタケ由来のＣＰＨ（以下、本項において、単に「ＣＰＨ」とも称する）をコードする核酸を選択的に含む。本実施形態において、ＣＰＨは、配列番号６に示すアミノ酸配列又は配列番号６で表される配列と９０％以上、好ましくは、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、オキシルシフェリンからコーヒー酸を生成する機能を有するタンパク質を指す。
【0032】
本発明者らは、後述の実施例４に示す通り、シイノトモシビタケのカフェオイルピルビン酸ヒドロラーゼ遺伝子（以下、「ｃｐｈ」とも称する）の配列を同定した（配列番号１５）。シイノトモシビタケのｃｐｈの塩基配列（配列番号１５）は、ＣＰＨのアミノ酸配列（ＣＰＨ（配列番号６））をコードする。
【0033】
本実施形態において、ＣＰＨは、配列番号６のアミノ酸配列を有するタンパク質に限らず、変異を有していてもよい。特に、野生型と比較して、植物に導入した際に、該植物に強い発光能を付与することができる変異を有することが好ましい。
【0034】
２．発光関連遺伝子発現用ベクター
本発明の第２の実施形態は、発現用ベクターである。本実施形態の発現用ベクターは、「１．発光関連遺伝子（核酸）」の項に記載の核酸を含む、ことを特徴とする。
本発明の第２の実施形態は、発現用ベクターである。本実施形態の発現用ベクターは、「１．発光関連遺伝子（核酸）」の項に記載の核酸を含む、ことを特徴とする。
【0035】
発現ベクターの種類は、目的生物への遺伝子導入に適したものであれば特に限定されず、適宜選択することが可能である。例えば、プラスミド、ファージ等を使用することができる。発現ベクターは、特に、植物への導入に適したもの、すなわち、植物発現用ベクターとすることが好ましい。植物発現用ベクターとしては、植物の形質転換に適したベクターであれば、特に限定されないが、アグロバクテリウムにベクターを導入した後、該アグロバクテリウム植物に感染させる、バイナリーベクター法に適したベクターを使用することができる。植物形質転換用のバイナリーベクターは、例えば、ｐＢＩシリーズ（インプランタイノベーションズ社）、ｐＢＧシリーズ（インプランタイノベーションズ社）、ｐＲＩシリーズ（タカラバイオ社）、ｐＣａｍｂｉａシリーズ（ａｂｃａｍ社）、ｐＬＣ４１（ＧｅｎＢａｎｋＬＣ２１５６９８）、ｐＩＧ１２１Ｈｍ（ＧｅｎＢａｎｋ： ＡＢ４８９１４２．１）、ｐＧＷＢ２（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ２８９７６５．１）等の既知のベクターを使用することができる。
【0036】
発現用ベクターには、以下の遺伝子のうち、少なくとも１つが含まれる。
Ｌｕｚ遺伝子：配列番号１で表されるアミノ酸配列又は配列番号１で表される配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列を有する；
ＨｉｓｐＳ遺伝子：配列番号２若しくは３で表されるアミノ酸配列又は配列番号２若しくは３で表される配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列を有する；
Ｈ３Ｈ遺伝子：配列番号４若しくは５で表されるアミノ酸配列又は配列番号４若しくは５で表される配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列を有する；
ＣＰＨ遺伝子：配列番号６で表されるアミノ酸配列又は配列番号６で表される配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列を有する。
Ｌｕｚ遺伝子：配列番号１で表されるアミノ酸配列又は配列番号１で表される配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列を有する；
ＨｉｓｐＳ遺伝子：配列番号２若しくは３で表されるアミノ酸配列又は配列番号２若しくは３で表される配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列を有する；
Ｈ３Ｈ遺伝子：配列番号４若しくは５で表されるアミノ酸配列又は配列番号４若しくは５で表される配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列を有する；
ＣＰＨ遺伝子：配列番号６で表されるアミノ酸配列又は配列番号６で表される配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列を有する。
【0037】
好ましくは、発現用ベクターには、上記のＬｕｚ遺伝子、ＨｉｓｐＳ遺伝子、Ｈ３Ｈ遺伝子及びＣＰＨ遺伝子のうち２以上の遺伝子が含まれる。より好ましくは、発現用ベクターには、Ｌｕｚ遺伝子、ＨｉｓｐＳ遺伝子、Ｈ３Ｈ遺伝子及びＣＰＨ遺伝子の全てが含まれる。本実施形態の発現ベクターは、上記のＬｕｚ遺伝子、ＨｉｓｐＳ遺伝子、Ｈ３Ｈ遺伝子及びＣＰＨ遺伝子のうち１以上を含んでいればよく、例えば、シイノトモシビタケ由来の上記遺伝子の１～３つに代えて、ヤコウタケ等の同種遺伝子（オルソログ）を含んでいてもよい。
【0038】
さらに、発現用ベクターには、ホスホパンテテイン転移酵素（ＰＰＴａｓｅ）遺伝子が含まれることが好ましい。４’－ホスホパンテテインは、パントテン酸からの補酵素Ａ（ＣｏＡ）生合成経路における中間体であって、ＰＰＴａｓｅは、４’－ホスホパンテテインから４’－デホスホコエンザイムＡを生成する反応を触媒することで、ＣｏＡ生合成に関与する。ＣｏＡは、コーヒー酸からのヒスピジン生合成に必要とされる成分であることから、発光関連遺伝子（Ｌｕｚ遺伝子、ＨｉｓｐＳ遺伝子、Ｈ３Ｈ遺伝子及びＣＰＨ遺伝子）、特にＨｉｓｐＳ遺伝子に加えて、ＰＰＴａｓｅが有効に作用することで、生物により強い発光能が付与され得る。ＰＰＴａｓｅ遺伝子は、ほぼすべての真核生物に存在する遺伝子である。本実施形態で使用される場合、ＰＰＴａｓｅ遺伝子の由来生物は発光キノコである必要はなく、いずれの由来生物のものを使用してもよい。例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属等の真菌由来のＰＰＴａｓｅ遺伝子を使用することができる。
【0039】
発現用ベクターに組み込まれる遺伝子は、それぞれ、上流にプロモーター配列、下流にターミネーター配列を付加した発現カセットとして組み込まれることが好ましい。プロモーターとしては、目的とする遺伝子の発現を促進する機能を有していれば特に限定されないが、例えば、３５Ｓ（カリフラワーモザイクウイルス由来）＋ＰＯＤ５’（シロイヌナズナ由来）プロモーター、３５Ｓ＋ＣＯＲ４７（シロイヌナズナ由来）プロモーター、ユビキチン１０プロモーター（シロイヌナズナ由来）、セストラムイエローリーフカーリングウィルスプロモーター、CaMV35Sプロモーター（カリフラワーモザイクウイルス由来）、ユビキチンプロモーター（例えばトウモロコシ由来）、NOS（アグロバクテリウム由来）プロモーター、ルビスコ（Rubisco）プロモーター、アクチンプロモーター等を使用できる。ターミネーターとしては、特に限定されないが、例えば、ＨＳＰターミネーター（シロイヌナズナ由来）、ノパリンシンターゼターミネーター（アグロバクテリウム由来）、ジーン７ターミネーター（アグロバクテリウム由来）等を使用できる。
【0040】
なお、発現させるべき遺伝子が複数種ある場合、全ての遺伝子を同一の発現用ベクターに組み込む必要はなく、２種以上の発現ベクターを調製して目的の生物に同時にあるいは連続的に導入してもよい。
【0041】
発現用ベクターとしては、例えば、配列番号１７で表される塩基配列を有するプラスミドを使用することができる。前記プラスミドは、具体的には、植物形質転換用プラスミドｐＲＩ２０１－ＡＮ（タカラバイオ）のＢａｍＨＩサイトに、ｈｉｓｐｓ１（配列番号１１）、コウジカビＰＰＴａｓｅ遺伝子（配列番号１６）、ｃｐｈ（配列番号１５）、ｈ３ｈ１（配列番号１３）及びｌｕｚ（配列番号１１）の発現カセットを５’末端側からこの順にタンデムに組み込んだプラスミドである。前記プラスミドにおける各遺伝子、プロモーター、ターミネーターの位置は、表１に示す通りである。発現用ベクターは、抗生物質耐性遺伝子等のスクリーニングマーカー等を含んでいてもよい。
【0042】
【表1】
【0043】
３．生物発光能を有するトランスジェニック生物
本発明の第３の実施形態は、トランスジェニック生物である。本実施形態のトランスジェニック生物は、「１．発光関連遺伝子（核酸）」の項に記載の核酸を含む、ことを特徴とする。より具体的には、本実施形態のトランスジェニック生物は、シイノトモシビタケ由来の発光関連遺伝子により形質転換された生物を指す。好ましくは、本実施形態のトランスジェニック生物は、「２．発光関連遺伝子発現用ベクター」の項に記載の発現用ベクターの導入により得られる。好ましくは、本実施形態のトランスジェニック生物は、暗所で視認可能な程度に生物発光が見られる。
本発明の第３の実施形態は、トランスジェニック生物である。本実施形態のトランスジェニック生物は、「１．発光関連遺伝子（核酸）」の項に記載の核酸を含む、ことを特徴とする。より具体的には、本実施形態のトランスジェニック生物は、シイノトモシビタケ由来の発光関連遺伝子により形質転換された生物を指す。好ましくは、本実施形態のトランスジェニック生物は、「２．発光関連遺伝子発現用ベクター」の項に記載の発現用ベクターの導入により得られる。好ましくは、本実施形態のトランスジェニック生物は、暗所で視認可能な程度に生物発光が見られる。
【0044】
形質転換の対象となる生物に導入される核酸には、以下の遺伝子のうち、少なくとも１つが含まれる。
Ｌｕｚ遺伝子：配列番号１で表されるアミノ酸配列又は配列番号１で表される配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列を有する；
ＨｉｓｐＳ遺伝子：配列番号２若しくは３で表されるアミノ酸配列又は配列番号２若しくは３で表される配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列を有する；
Ｈ３Ｈ遺伝子：配列番号４若しくは５で表されるアミノ酸配列又は配列番号４若しくは５で表される配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列を有する；
ＣＰＨ遺伝子：配列番号６で表されるアミノ酸配列又は配列番号６で表される配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列を有する。
Ｌｕｚ遺伝子：配列番号１で表されるアミノ酸配列又は配列番号１で表される配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列を有する；
ＨｉｓｐＳ遺伝子：配列番号２若しくは３で表されるアミノ酸配列又は配列番号２若しくは３で表される配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列を有する；
Ｈ３Ｈ遺伝子：配列番号４若しくは５で表されるアミノ酸配列又は配列番号４若しくは５で表される配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列を有する；
ＣＰＨ遺伝子：配列番号６で表されるアミノ酸配列又は配列番号６で表される配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列を有する。
【0045】
好ましくは、形質転換の対象となる生物に導入される核酸には、上記のＬｕｚ遺伝子、ＨｉｓｐＳ遺伝子、Ｈ３Ｈ遺伝子及びＣＰＨ遺伝子のうち２以上の遺伝子が含まれる。より好ましくは、形質転換の対象となる生物に導入される核酸には、Ｌｕｚ遺伝子、ＨｉｓｐＳ遺伝子、Ｈ３Ｈ遺伝子及びＣＰＨ遺伝子の全てが含まれる。前記核酸は、上記のＬｕｚ遺伝子、ＨｉｓｐＳ遺伝子、Ｈ３Ｈ遺伝子及びＣＰＨ遺伝子のうち１以上を含んでいればよく、例えば、シイノトモシビタケ由来の上記遺伝子の１～３つに代えて、ヤコウタケ等の同種遺伝子（オルソログ）を含んでいてもよい。さらに、前記核酸には、ＰＰＴａｓｅ遺伝子が含まれることが好ましい。
【0046】
本実施形態のトランスジェニック生物の生物種は、特に限定されず、植物、動物、微生物等のいずれであってもよい。トランスジェニック生物に導入される発光遺伝子は、コーヒー酸からのルシフェリンの生合成に関与する遺伝子であるが、コーヒー酸は、リグニンの生合成の中間体であり、ほぼすべての植物に存在することが知られる。そのため、形質転換の対象となる生物を植物とすることで、形質転換後の生物は、発光物質（ルシフェリン）又はその前駆体を別途添加することを要さず、自発発光することが可能となる。したがって、本実施形態のトランスジェニック生物は、植物とすることが好ましい。なお、植物以外の生物の場合、別途、コーヒー酸、ヒスピジン及び／又は３－ヒドロキシヒスピジンを生物に付与することで、生物発光させることが可能である。
【0047】
植物の場合、形質転換の対象となる植物の種類は、コーヒー酸を生合成するものであれば特に限定されず、単子葉類、双子葉類、コケ植物、シダ植物、藻類、樹木類等のいずれであってもよい。例えば、ベンサミアナタバコ、ペチュニア、バラ、カーネーション、ユリ、ダリア、コチョウラン、キク、トルコギキョウ、シクラメン、スターチス、シンビジウム，ガーベラ、デンドロビウム、チューリップ、ペラルゴニウム、カトレア、トレニア、イネ、トウモロコシ、ワタ、ナタネ、トマト、ポプラ、トウヒ、カラマツ、スギ等を形質転換することができる。形質転換前の植物は、野生型であってもよく、また、変異体であってもよい。変異体の場合、例えば、野生型と比較してコーヒー酸の含有量の多いものを使用してもよい。
【0048】
形質転換の対象となる植物の状態は、特に限定されず、分化又は未分化の植物細胞の状態であってもよく、カルスの状態であってもよく、また、種子や植物体の状態であってもよい。本明細書において、「カルス」とは、本明細書において、「カルス」とは、未分化の植物細胞塊を指す。また、本明細書において、「植物体」とは、根、茎、葉、花、子葉、胚軸、葯等の各器官に分化した状態の植物を指す。また、本明細書において「種子」とは、完熟種子、未熟種子を指す。植物体の場合、遺伝子（核酸）を導入する対象は、根、茎、葉、花、子葉、胚軸、葯等のいずれの器官であってもよいが、特に、葉又は茎とすることが好ましい。
【0049】
形質転換において対象生物に目的の遺伝子を導入する手法は、特に限定されず、パーティクルガン法、エレトロポレーション法、アグロバクテリウム法等を使用することができる。植物の場合は、特にアグロバクテリウム法を使用することができる。形質転換は、一過性であっても、安定性であってもよい。
【0050】
４．生物発光能を有するトランスジェニック生物の製造方法
本発明の第４の実施形態は、トランスジェニック生物の製造方法である。より具体的には、本実施形態の方法は、「２．発光関連遺伝子発現用ベクター」の項に記載の発現用ベクターのうち、植物発現用ベクターを用いて、植物細胞、カルス又は植物体を形質転換することを含む、ことを特徴とする。
本発明の第４の実施形態は、トランスジェニック生物の製造方法である。より具体的には、本実施形態の方法は、「２．発光関連遺伝子発現用ベクター」の項に記載の発現用ベクターのうち、植物発現用ベクターを用いて、植物細胞、カルス又は植物体を形質転換することを含む、ことを特徴とする。
【0051】
本実施形態の方法において、形質転換の対象となる生物は植物である。植物の種類は、コーヒー酸を生合成するものであれば特に限定されず、単子葉類、双子葉類、コケ植物、シダ植物、藻類等のいずれであってもよい。形質転換前の植物は、野生型であってもよく、また、変異体であってもよい。変異体の場合、例えば、野生型と比較してコーヒー酸の含有量の多いものを使用してもよい。形質転換の対象となる植物の状態は、分化又は未分化の植物細胞、カルス、又は植物体の状態である。植物体の場合、遺伝子（核酸）を導入する対象は、根、茎、葉、花等のいずれの器官であってもよいが、特に、葉又は茎とすることが好ましい。
【0052】
形質転換において植物にベクターを導入する手法は、特に限定されず、パーティクルガン法、エレトロポレーション法、アグロバクテリウム法等のいずれを使用してもよい。特に、アグロバクテリウム法の使用が好ましい。アグロバクテリウム法は、発現用ベクター（バイナリーベクター）を導入したアグロバクテリウムを植物に感染させて、植物の形質転換を行う方法である。アグロバクテリウムの感染は、例えば、植物細胞、カルス又は植物体の所望の部位に、アグロバクテリウムを含む培地を接触させることで達成し得る。
【0053】
本実施形態の方法で使用される発現用ベクターには、以下の遺伝子のうち、少なくとも１つが含まれる。
Ｌｕｚ遺伝子：配列番号１で表されるアミノ酸配列又は配列番号１で表される配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列を有する；
ＨｉｓｐＳ遺伝子：配列番号２若しくは３で表されるアミノ酸配列又は配列番号２若しくは３で表される配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列を有する；
Ｈ３Ｈ遺伝子：配列番号４若しくは５で表されるアミノ酸配列又は配列番号４若しくは５で表される配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列を有する；
ＣＰＨ遺伝子：配列番号６で表されるアミノ酸配列又は配列番号６で表される配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列を有する。
Ｌｕｚ遺伝子：配列番号１で表されるアミノ酸配列又は配列番号１で表される配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列を有する；
ＨｉｓｐＳ遺伝子：配列番号２若しくは３で表されるアミノ酸配列又は配列番号２若しくは３で表される配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列を有する；
Ｈ３Ｈ遺伝子：配列番号４若しくは５で表されるアミノ酸配列又は配列番号４若しくは５で表される配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列を有する；
ＣＰＨ遺伝子：配列番号６で表されるアミノ酸配列又は配列番号６で表される配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列を有する。
【0054】
好ましくは、発現用ベクターには、上記のＬｕｚ遺伝子、ＨｉｓｐＳ遺伝子、Ｈ３Ｈ遺伝子及びＣＰＨ遺伝子のうち２以上の遺伝子が含まれる。より好ましくは、形質転換の対象となる生物に導入される核酸には、Ｌｕｚ遺伝子、ＨｉｓｐＳ遺伝子、Ｈ３Ｈ遺伝子及びＣＰＨ遺伝子の全てが含まれる。前記発現用ベクターは、上記のＬｕｚ遺伝子、ＨｉｓｐＳ遺伝子、Ｈ３Ｈ遺伝子及びＣＰＨ遺伝子のうち１以上を含んでいればよく、例えば、シイノトモシビタケ由来の上記遺伝子の１～３つに代えて、ヤコウタケ等の同種遺伝子（オルソログ）を含んでいてもよい。さらに、前記発現用ベクターには、ＰＰＴａｓｅ遺伝子が含まれることが好ましい。
【0055】
なお、発現させるべき遺伝子が複数種ある場合、全ての遺伝子を同一の発現用ベクターに組み込む必要はなく、２種以上の発現ベクターを調製して目的の生物に同時に又は連続的に導入してもよい。アグロバクテリウムを使用する場合、２種以上の発現ベクターを、それぞれ他のアグロバクテリウムに導入し、全てのアグロバクテリウムを同時に又は連続的に植物に感染させることができる。あるいは、２種以上の発現ベクターを同じアグロバクテリウムに同時に又は連続的に導入し、導入後のあるアグロバクテリウムを植物に感染させてもよい。
【0056】
上記方法により得られたトランスジェニック生物（植物細胞、カルス又は植物体）は、少なくともその一部が、もともと体内に含まれるコーヒー酸を用いて自発発光を行うことができる。
【0057】
５．植物を発光させる方法
本発明の第５の実施形態は、植物を発光させる方法である。本実施形態の方法は、具体的には「４．生物発光能を有するトランスジェニック生物の製造方法」の項に記載の方法で製造されたトランスジェニック生物（植物）を発光させる方法である。前記トランスジェニック生物は、ルシフェリン前駆体であるコーヒー酸を含み、かつ、コーヒー酸からルシフェリンを生合成する機能、ルシフェリンを酸化する機能、さらにオキシルシフェリンからコーヒー酸を再生する機能を有することから、通常の栽培により、自発発光させることが可能である。
本発明の第５の実施形態は、植物を発光させる方法である。本実施形態の方法は、具体的には「４．生物発光能を有するトランスジェニック生物の製造方法」の項に記載の方法で製造されたトランスジェニック生物（植物）を発光させる方法である。前記トランスジェニック生物は、ルシフェリン前駆体であるコーヒー酸を含み、かつ、コーヒー酸からルシフェリンを生合成する機能、ルシフェリンを酸化する機能、さらにオキシルシフェリンからコーヒー酸を再生する機能を有することから、通常の栽培により、自発発光させることが可能である。
【0058】
本実施形態の方法は、植物の発光を強めるために、植物にコーヒー酸、ヒスピジン及び／又は３－ヒドロキシヒスピジンを植物に供給する工程を含んでいてもよい。また、本実施形態の方法は、植物の発光を強めるために、蛍光色素（蛍光タンパク質）を植物に供給する工程を含んでいてもよい。発光能を有する細胞近傍に適切な蛍光色素を存在させることで、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を生じさせ、より強い光とすることが可能となる。かつ／あるいは、発光能を有する細胞近傍に適切な蛍光色素を存在させることで、ＦＲＥＴにより、ルシフェリンの発光波長（５２０ｎｍ）とは異なる所望の波長の光を発生させることが可能となる。
【実施例】
【0059】
実施例１：シイノトモシビタケのＲＮＡ抽出
シイノトモシビタケ発光子実体０．０５ｇからＩｓｏｇｅｎ（ニッポンジーン）を用いてＲＮＡを抽出し、５０μＬの水に溶解して、ＲＮＡ液を調製した。
シイノトモシビタケ発光子実体０．０５ｇからＩｓｏｇｅｎ（ニッポンジーン）を用いてＲＮＡを抽出し、５０μＬの水に溶解して、ＲＮＡ液を調製した。
【0060】
実施例２：ルシフェラーゼｃＤＮＡのクローニング
ＲＮＡ液１μＬと下記リンカーオリゴｄＴプライマー（配列番号１８）、逆転写酵素ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて逆転写反応を行い、逆転写産物を得た。
リンカーオリゴｄＴプライマー ACTCGAATTCACGCGGCCGCATTTTTTTTTTTTTTT (配列番号１８）
ＲＮＡ液１μＬと下記リンカーオリゴｄＴプライマー（配列番号１８）、逆転写酵素ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて逆転写反応を行い、逆転写産物を得た。
リンカーオリゴｄＴプライマー ACTCGAATTCACGCGGCCGCATTTTTTTTTTTTTTT (配列番号１８）
【0061】
前記逆転写産物をＴＥ緩衝液で２．５倍希釈して、そのうち１μＬをテンプレートとしてＰＣＲ反応を行った。プライマーは、ルシフェラーゼの保存領域として既知の配列に基づいて、以下の通りに設計した。
フォワードプライマー CGCCTTCCCGAGAAACGCAGGTGG （配列番号１９）
リバースプライマー AGTCATGGTAGTCGTGCATATG （配列番号２０）
ＰＣＲ産物について、常法に従って、アガロースゲル電気泳動を行い、ゲルグリーン（Ｂｉｏｔｉｕｍ社）染色を行うことで、ＤＮＡ断片を確認した（図２）。
フォワードプライマー CGCCTTCCCGAGAAACGCAGGTGG （配列番号１９）
リバースプライマー AGTCATGGTAGTCGTGCATATG （配列番号２０）
ＰＣＲ産物について、常法に従って、アガロースゲル電気泳動を行い、ゲルグリーン（Ｂｉｏｔｉｕｍ社）染色を行うことで、ＤＮＡ断片を確認した（図２）。
【0062】
常法に従ってＤＮＡ断片の配列を決定し、配列番号２１のフォワードプライマーを設計した。上記逆転写反応物を鋳型として、下記フォワードプライマー及び前記リンカーオリゴｄＴプライマーを用いて３’ＲＡＣＥ ＰＣＲを行った。常法に従って、ＰＣＲ産物のＤＮＡ断片を確認した（図３）。
フォワードプライマー CAACACGTCGAACCGGAATT （配列番号２１）
フォワードプライマー CAACACGTCGAACCGGAATT （配列番号２１）
【0063】
５’側ｃＤＮＡ末端の配列を得るために、５’ＲＡＣＥを行った。具体的には、まず、得られたＤＮＡ断片の配列から、下記のリバースプライマー（配列番号２２）を設計した。
リバースプライマー GAATATGGCCTCCGCATGAA （配列番号２２）
ＲＮＡ液１μＬと該リバースプライマーを用いて逆転写反応を行い、生成したｃＤＮＡを精製し、ターミナルトランスフェラーゼ（タカラバイオ）を用いて３’末端にオリゴｄＡを付加した。
リバースプライマー GAATATGGCCTCCGCATGAA （配列番号２２）
ＲＮＡ液１μＬと該リバースプライマーを用いて逆転写反応を行い、生成したｃＤＮＡを精製し、ターミナルトランスフェラーゼ（タカラバイオ）を用いて３’末端にオリゴｄＡを付加した。
【0064】
得られたＤＮＡ断片の配列から、もう１つのリバースプライマー（配列番号２３）を設計した。
リバースプライマー CGACGTGTTGGTTCAACTGT （配列番号２３）
オリゴｄＡを付加したｃＤＮＡについて、該プライマーと前記リンカーオリゴｄＴプライマーとを用いて、ＰＣＲを行った。常法に従って、ＰＣＲ産物のＤＮＡ断片を確認した（図４）。最終的に、全長コーディング領域（ｌｕｚ（配列番号１０））のｃＤＮＡ配列が得られた。
リバースプライマー CGACGTGTTGGTTCAACTGT （配列番号２３）
オリゴｄＡを付加したｃＤＮＡについて、該プライマーと前記リンカーオリゴｄＴプライマーとを用いて、ＰＣＲを行った。常法に従って、ＰＣＲ産物のＤＮＡ断片を確認した（図４）。最終的に、全長コーディング領域（ｌｕｚ（配列番号１０））のｃＤＮＡ配列が得られた。
【0065】
実施例３：ヒスピジンシンターゼ（ＨｉｓｐＳ）ｃＤＮＡのクローニング
Ｈｉｓｐの保存領域として既知の配列に基づいて、以下の通りにプライマーを設計した。
フォワードプライマー TTCGCTCTCATGCTGGCCGTCTGG （配列番号２４）
リバースプライマー AGGGTCGCTGTGCCGATATCCTGCAT （配列番号２５）
実施例２で調製した逆転写反応物を鋳型として、上記プライマーセットを用いてＰＣＲ反応を行った。常法に従って、ＰＣＲ産物のＤＮＡ断片を確認した（図５）。
Ｈｉｓｐの保存領域として既知の配列に基づいて、以下の通りにプライマーを設計した。
フォワードプライマー TTCGCTCTCATGCTGGCCGTCTGG （配列番号２４）
リバースプライマー AGGGTCGCTGTGCCGATATCCTGCAT （配列番号２５）
実施例２で調製した逆転写反応物を鋳型として、上記プライマーセットを用いてＰＣＲ反応を行った。常法に従って、ＰＣＲ産物のＤＮＡ断片を確認した（図５）。
【0066】
常法に従って、前記ＤＮＡ断片の配列決定を行い、３’側ｃＤＮＡ末端の配列を得るために、さらに下記フォワードプライマー（配列番号２６）を設計した。上記逆転写反応物を鋳型として、下記フォワードプライマー、前記リンカーオリゴｄＴプライマーを用いて３’ＲＡＣＥ ＰＣＲを行った。常法に従って、ＰＣＲ産物のＤＮＡ断片を確認した（図６）。
フォワードプライマー GGCTGTAGGCGAAAACCATCCTTA （配列番号２６）
フォワードプライマー GGCTGTAGGCGAAAACCATCCTTA （配列番号２６）
【0067】
ＨｉｓｐＳの保存領域として既知の配列に基づいて、もう１つのフォワードプライマー（配列番号２７）を設計した。
フォワードプライマー GAYRTNGGNCCNCARVYNGTNGC （配列番号２７）
前記ＰＣＲ産物を鋳型として、下記プライマーと前記リンカーオリゴｄＴプライマーとを用いてネステッドＰＣＲを行った。常法に従って、ＰＣＲ産物のＤＮＡ断片を確認した（図７）。
フォワードプライマー GAYRTNGGNCCNCARVYNGTNGC （配列番号２７）
前記ＰＣＲ産物を鋳型として、下記プライマーと前記リンカーオリゴｄＴプライマーとを用いてネステッドＰＣＲを行った。常法に従って、ＰＣＲ産物のＤＮＡ断片を確認した（図７）。
【0068】
さらに、５’側ｃＤＮＡ末端の配列を得るために、実施例２と同様に５’ＲＡＣＥを行った。常法に従ってＤＮＡ断片の配列を決定し、下記の２つのリバースプライマー（配列番号２８、２９）を設計した。
逆転写用リバースプライマー AGGGGAACTGCCTTCAGATT （配列番号２８）
リバースプライマー GCTGATGAGGTGAAGAGGTA （配列番号２９）
リンカーオリゴｄＴプライマーと逆転写用リバースプライマー（配列番号２８）を用いて、ＲＮＡ液からの逆転写反応を行い、得られた逆転写産物を鋳型として、リンカーオリゴｄＴプライマーとＰＣＲ用のリバースプライマー（配列番号２９）を用いて、ＰＣＲを行った。常法に従って、ＰＣＲ産物のＤＮＡ断片を確認した（図８）。
逆転写用リバースプライマー AGGGGAACTGCCTTCAGATT （配列番号２８）
リバースプライマー GCTGATGAGGTGAAGAGGTA （配列番号２９）
リンカーオリゴｄＴプライマーと逆転写用リバースプライマー（配列番号２８）を用いて、ＲＮＡ液からの逆転写反応を行い、得られた逆転写産物を鋳型として、リンカーオリゴｄＴプライマーとＰＣＲ用のリバースプライマー（配列番号２９）を用いて、ＰＣＲを行った。常法に従って、ＰＣＲ産物のＤＮＡ断片を確認した（図８）。
【0069】
常法にしたがって、５’、３’非翻訳領域の配列決定を行い、各配列に基づいて下記プライマーセット（配列番号３０、３１）を設計した。
フォワードプライマー TTCAAGCCCAACCATAACTGCAGCACAGGT （配列番号３０）
リバースプライマー CACAAAACGTGAAATGAAAATTGTACAAAACAATCAAGCAGAAGA （配列番号３１）
前記逆転写反応物をテンプレートとして、上記プライマーセットを用いてＰＣＲを行った。常法に従って、ＰＣＲ産物のＤＮＡ断片を確認した（図９）。その結果、全長コーディング領域のｃＤＮＡ配列が得られた。この中には、２種類の配列（ｈｉｓｐｓ１、ｈｉｓｐｓ２（配列番号１１、１２））が含まれていた。
フォワードプライマー TTCAAGCCCAACCATAACTGCAGCACAGGT （配列番号３０）
リバースプライマー CACAAAACGTGAAATGAAAATTGTACAAAACAATCAAGCAGAAGA （配列番号３１）
前記逆転写反応物をテンプレートとして、上記プライマーセットを用いてＰＣＲを行った。常法に従って、ＰＣＲ産物のＤＮＡ断片を確認した（図９）。その結果、全長コーディング領域のｃＤＮＡ配列が得られた。この中には、２種類の配列（ｈｉｓｐｓ１、ｈｉｓｐｓ２（配列番号１１、１２））が含まれていた。
【0070】
実施例４：ヒスピジン３ヒドロキシラーゼ（Ｈ３Ｈ）ｃＤＮＡのクローニング
Ｈ３Ｈの保存領域として既知の配列から、下記フォワードプライマー（配列番号３２）を設計した。
フォワードプライマー TTYVRVGAYTAYCAYCCRCGNTT （配列番号３２）
実施例２と同様に調製した逆転写反応物を鋳型として、上記フォワードプライマーと前記リンカーオリゴｄＴプライマーを用いて３’ＲＡＣＥを行った。常法に従って、ＰＣＲ産物のＤＮＡ断片を確認した（図１０）。これにより、３’側コーディング領域末端を含むｃＤＮＡ断片を得た。
Ｈ３Ｈの保存領域として既知の配列から、下記フォワードプライマー（配列番号３２）を設計した。
フォワードプライマー TTYVRVGAYTAYCAYCCRCGNTT （配列番号３２）
実施例２と同様に調製した逆転写反応物を鋳型として、上記フォワードプライマーと前記リンカーオリゴｄＴプライマーを用いて３’ＲＡＣＥを行った。常法に従って、ＰＣＲ産物のＤＮＡ断片を確認した（図１０）。これにより、３’側コーディング領域末端を含むｃＤＮＡ断片を得た。
【0071】
ｃＤＮＡの５’末端の配列を得るために、上記と同様に５’ＲＡＣＥを行った。常法に従ってＤＮＡ断片の配列を決定し、下記の２つのリバースプライマー（配列番号３３、３４）を設計した。
逆転写用リバースプライマー TCTTCTAGCCCCATTCCGAA （配列番号３３）
ＰＣＲ用リバースプライマー AAGTGTGGGAAGCGATGCAT （配列番号３４）
リンカーオリゴｄＴプライマーと逆転写用リバースプライマー（配列番号３３）を用いて、ＲＮＡ液からの逆転写反応を行い、得られた逆転写産物を鋳型として、リンカーオリゴｄＴプライマーとＰＣＲ用のリバースプライマー（配列番号３４）を用いて、ＰＣＲを行った。常法に従って、ＰＣＲ産物のＤＮＡ断片を確認した（図１１）。
逆転写用リバースプライマー TCTTCTAGCCCCATTCCGAA （配列番号３３）
ＰＣＲ用リバースプライマー AAGTGTGGGAAGCGATGCAT （配列番号３４）
リンカーオリゴｄＴプライマーと逆転写用リバースプライマー（配列番号３３）を用いて、ＲＮＡ液からの逆転写反応を行い、得られた逆転写産物を鋳型として、リンカーオリゴｄＴプライマーとＰＣＲ用のリバースプライマー（配列番号３４）を用いて、ＰＣＲを行った。常法に従って、ＰＣＲ産物のＤＮＡ断片を確認した（図１１）。
【0072】
得られたＤＮＡ断片より、常法に従って、５’側及び３’側の非翻訳領域の配列を決定し、該配列に基づいて全長ｃＤＮＡ増幅用のプライマーセット（配列番号３５、３６）を設計した。
フォワードプライマー ACCCTCTCATATGTCTCCCATCCGCACACA （配列番号３５）
リバースプライマー GAGAGCTCAGGGCTAGTGCAAGTCAT （配列番号３６）
上記プライマーセットを用いて、ＲＮＡ液からのＲＴ－ＰＣＲを行い、ＤＮＡ断片を得た（図１２）。この中には、２種類の配列（ｈ３ｈ１、ｈ３ｈ２（配列番号１３、１４））が含まれていた。
フォワードプライマー ACCCTCTCATATGTCTCCCATCCGCACACA （配列番号３５）
リバースプライマー GAGAGCTCAGGGCTAGTGCAAGTCAT （配列番号３６）
上記プライマーセットを用いて、ＲＮＡ液からのＲＴ－ＰＣＲを行い、ＤＮＡ断片を得た（図１２）。この中には、２種類の配列（ｈ３ｈ１、ｈ３ｈ２（配列番号１３、１４））が含まれていた。
【0073】
実施例５：カフェオイルピルビン酸ヒドロラーゼ（ＣＰＨ）ｃＤＮＡのクローニング
Ｈ３Ｈの保存領域として既知の配列から、下記のフォワードプライマー（配列番号３７）を設計した。
フォワードプライマー TCNCARTGGTGTTTYTCNAARRGNTT （配列番号３７）
前記逆転写反応物を鋳型として、前記フォワードプライマーとリンカーオリゴｄＴプライマーを用いて３’ＲＡＣＥを行い、３’側コーディング領域末端を含むｃＤＮＡ断片を得た（図１３）。
Ｈ３Ｈの保存領域として既知の配列から、下記のフォワードプライマー（配列番号３７）を設計した。
フォワードプライマー TCNCARTGGTGTTTYTCNAARRGNTT （配列番号３７）
前記逆転写反応物を鋳型として、前記フォワードプライマーとリンカーオリゴｄＴプライマーを用いて３’ＲＡＣＥを行い、３’側コーディング領域末端を含むｃＤＮＡ断片を得た（図１３）。
【0074】
常法に従ってｃＤＮＡ断片の配列を決定し、得られた配列の５’側ｃＤＮＡ末端の配列を得るために、上記と同様５’ＲＡＣＥを行った。得られたＤＮＡ断片の配列から逆転写用とＰＣＲ用のリバースプライマーを作成し、５’ＲＡＣＥを行い、５’側コーディング領域末端を含むｃＤＮＡ断片を得た（図１４）。
逆転写用リバースプライマー AGAGGCGGTTTCTTCACGAA （配列番号３８）
ＰＣＴ用リバースプライマー GAATATCTGGTCGGAGGTGT （配列番号３９）
最終的に、全長コーディング領域（ｃｐｈ（配列番号１５））のｃＤＮＡ配列が得られた。
逆転写用リバースプライマー AGAGGCGGTTTCTTCACGAA （配列番号３８）
ＰＣＴ用リバースプライマー GAATATCTGGTCGGAGGTGT （配列番号３９）
最終的に、全長コーディング領域（ｃｐｈ（配列番号１５））のｃＤＮＡ配列が得られた。
【0075】
実施例６：植物発現ベクター構築
（１）ＨｉｓｐＳ発現カセット
ＨｉｓｐＳ１のコーディング領域（配列番号１１）をクローニングしたプラスミド（ｐＣＲ－Ｂｌｕｎｔ ＩＩ－ＴＯＰＯ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を鋳型として、ＨｉｓｐＳのコーディング領域を増幅するプライマーセット（配列番号４０、４１）を用いてＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片をＩｎ－ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いて、植物形質転換用プラスミドｐＲＩ２０１－ＡＮ（タカラバイオ）のＮｄｅＩ、ＳａｃＩサイトに挿入した（プラスミド１）。
フォワードプライマー CACTGTTGATACATATGCCTTTACCTTCCGAATTCACCTCCCTC （配列番号４０）
リバースプライマー CTTCATCTTCATAAGCGGAGGTGAGTAATCACTTCTCCATGTATTGTT （配列番号４１）
（１）ＨｉｓｐＳ発現カセット
ＨｉｓｐＳ１のコーディング領域（配列番号１１）をクローニングしたプラスミド（ｐＣＲ－Ｂｌｕｎｔ ＩＩ－ＴＯＰＯ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を鋳型として、ＨｉｓｐＳのコーディング領域を増幅するプライマーセット（配列番号４０、４１）を用いてＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片をＩｎ－ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いて、植物形質転換用プラスミドｐＲＩ２０１－ＡＮ（タカラバイオ）のＮｄｅＩ、ＳａｃＩサイトに挿入した（プラスミド１）。
フォワードプライマー CACTGTTGATACATATGCCTTTACCTTCCGAATTCACCTCCCTC （配列番号４０）
リバースプライマー CTTCATCTTCATAAGCGGAGGTGAGTAATCACTTCTCCATGTATTGTT （配列番号４１）
【0076】
（２）コウジカビホスホパンテテイン転移酵素（ＰＰＴａｓｅ）発現カセット
コウジカビＰＰＴａｓｅのアミノ酸配列をもとに、植物コドンに最適化したコーディング配列を合成した（配列番号１６）。ＰＰＴａｓｅのコーディング領域を増幅するプライマーセット（配列番号４２、４３）を設計し、これを用いて前記コーディング配列を鋳型としてＰＣＲを行い、ＤＮＡ断片を得た。
フォワードプライマー AAATCAAGATTAACTATGCAACCACCTCAAGACGA （配列番号４２）
リバースプライマー CTTCATCTTCATAAGAGCTCTTATTTTAAGCATTGAC （配列番号４３）
さらに、カリフラワーモザイクウイルス３５ＳプロモーターとシロイヌナズナＣＯＲ４７の５’非翻訳領域（Yamasaki et al., J. Biosci. Bioeng, 125, 124-130, 2018）を含む断片を有するプラスミド（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ－３５Ｓ－ＣＯＲ４７－ＦＬｕｃ－ＨＳＰ）を鋳型として、この断片を増幅するプライマーセット（配列番号４４、４５）を用いてＰＣＲを行い、ＤＮＡ断片を得た。
フォワードプライマー GGCCAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGT （配列番号４４）
リバースプライマー AGTTAATCTTGATTTGATTAAAAGT （配列番号４５）
コウジカビＰＰＴａｓｅのアミノ酸配列をもとに、植物コドンに最適化したコーディング配列を合成した（配列番号１６）。ＰＰＴａｓｅのコーディング領域を増幅するプライマーセット（配列番号４２、４３）を設計し、これを用いて前記コーディング配列を鋳型としてＰＣＲを行い、ＤＮＡ断片を得た。
フォワードプライマー AAATCAAGATTAACTATGCAACCACCTCAAGACGA （配列番号４２）
リバースプライマー CTTCATCTTCATAAGAGCTCTTATTTTAAGCATTGAC （配列番号４３）
さらに、カリフラワーモザイクウイルス３５ＳプロモーターとシロイヌナズナＣＯＲ４７の５’非翻訳領域（Yamasaki et al., J. Biosci. Bioeng, 125, 124-130, 2018）を含む断片を有するプラスミド（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ－３５Ｓ－ＣＯＲ４７－ＦＬｕｃ－ＨＳＰ）を鋳型として、この断片を増幅するプライマーセット（配列番号４４、４５）を用いてＰＣＲを行い、ＤＮＡ断片を得た。
フォワードプライマー GGCCAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGT （配列番号４４）
リバースプライマー AGTTAATCTTGATTTGATTAAAAGT （配列番号４５）
【0077】
これらの断片を、ｐＲＩ２０１－ＡＮのＨｉｎｄＩＩＩとＳａｃＩサイトに、Ｉｎ－ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いて同時に挿入した。得られたプラスミドからＰＰＴａｓｅ発現ユニットを増幅するプライマーセット（配列番号４６、４７）を用いてＰＣＲを行い、得られた断片をＩｎ－ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いてプラスミド１のＢａｍＨＩサイトに挿入した（プラスミド２）。
フォワードプライマー TGCGGCCGCTGGATCGTCGACTCTAGATTAGCCTTTTC （配列番号４６）
リバースプライマー CGAATTCCCGGGATCCAGCGGCCGCAGGTA （配列番号４７）
フォワードプライマー TGCGGCCGCTGGATCGTCGACTCTAGATTAGCCTTTTC （配列番号４６）
リバースプライマー CGAATTCCCGGGATCCAGCGGCCGCAGGTA （配列番号４７）
【0078】
（３）ＣＰＨ発現カセット
前記逆転写反応物を鋳型として、ＣＰＨのコーディング領域（配列番号１５）を増幅するプライマーセット（配列番号４８、４９）を用いてＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片をＩｎ－ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いて、植物形質転換用プラスミドｐＲＩ２０１－ＡＮ（タカラバイオ）のＮｄｅＩ、ＳａｃＩサイトに挿入した。
フォワードプライマー CACTGTTGATACATATGTCTCCCATCCGCACACA （配列番号４８）
リバースプライマー CTTCATCTTCATAAGTCAGGGCTAGTGCAAGTCAT （配列番号４９）
前記逆転写反応物を鋳型として、ＣＰＨのコーディング領域（配列番号１５）を増幅するプライマーセット（配列番号４８、４９）を用いてＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片をＩｎ－ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いて、植物形質転換用プラスミドｐＲＩ２０１－ＡＮ（タカラバイオ）のＮｄｅＩ、ＳａｃＩサイトに挿入した。
フォワードプライマー CACTGTTGATACATATGTCTCCCATCCGCACACA （配列番号４８）
リバースプライマー CTTCATCTTCATAAGTCAGGGCTAGTGCAAGTCAT （配列番号４９）
【0079】
得られたプラスミドからＣＰＨの発現ユニットを増幅するプライマーセット（配列番号５０、５１）を用いてＰＣＲを行い、得られた断片をＩｎ－ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いてプラスミド２のＢａｍＨＩサイトに挿入した（プラスミド３）。
フォワードプライマー TGCGGCCGCTGGATCAAGCTTGCATGCCTGCAGGT （配列番号５０）
リバースプライマー CGAATTCCCGGGATCCAGCGGCCGCAGGTA （配列番号５１）
フォワードプライマー TGCGGCCGCTGGATCAAGCTTGCATGCCTGCAGGT （配列番号５０）
リバースプライマー CGAATTCCCGGGATCCAGCGGCCGCAGGTA （配列番号５１）
【0080】
（４）Ｈ３Ｈ発現カセット
Ｈ３Ｈ１のコーディング領域（配列番号１３）をクローニングしたプラスミド（ｐＣＲ－Ｂｌｕｎｔ ＩＩ－ＴＯＰＯ）を鋳型として、Ｈ３Ｈのコーディング領域を増幅するプライマーセット（配列番号５２、５３）を用いてＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片をＩｎ－ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いて、植物形質転換用プラスミドｐＲＩ２０１－ＡＮ（タカラバイオ）のＮｄｅＩ、ＳａｃＩサイトに挿入した。
フォワードプライマー CACTGTTGATACATATGTCAACCGACGCAGA （配列番号５２）
リバースプライマー CTTCATCTTCATAAGCGTCGAATCTGATTGGAGA （配列番号５３）
Ｈ３Ｈ１のコーディング領域（配列番号１３）をクローニングしたプラスミド（ｐＣＲ－Ｂｌｕｎｔ ＩＩ－ＴＯＰＯ）を鋳型として、Ｈ３Ｈのコーディング領域を増幅するプライマーセット（配列番号５２、５３）を用いてＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片をＩｎ－ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いて、植物形質転換用プラスミドｐＲＩ２０１－ＡＮ（タカラバイオ）のＮｄｅＩ、ＳａｃＩサイトに挿入した。
フォワードプライマー CACTGTTGATACATATGTCAACCGACGCAGA （配列番号５２）
リバースプライマー CTTCATCTTCATAAGCGTCGAATCTGATTGGAGA （配列番号５３）
【0081】
得られたプラスミドからＨ３Ｈの発現ユニットを増幅するプライマーセット（配列番号５４、５５）を用いてＰＣＲを行い、得られた断片をＩｎ－ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いてプラスミド３のＢａｍＨＩサイトに挿入した（プラスミド４）。
フォワードプライマー TGCGGCCGCTGGATCAAGCTTGCATGCCTGCAGGT （配列番号５４）
リバースプライマー CGAATTCCCGGGATCCAGCGGCCGCAGGTA （配列番号５５）
フォワードプライマー TGCGGCCGCTGGATCAAGCTTGCATGCCTGCAGGT （配列番号５４）
リバースプライマー CGAATTCCCGGGATCCAGCGGCCGCAGGTA （配列番号５５）
【0082】
（５）Ｌｕｚ発現カセット
Ｌｕｚのコーディング領域（配列番号１０）をクローニングしたプラスミド（ｐＲＳＥＴＢ）を鋳型として、Ｌｕｚのコーディング領域を増幅するプライマーセット（配列番号５６、５７）を用いてＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片をＩｎ－ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いて、植物形質転換用プラスミドｐＲＩ２０１－ＡＮ（タカラバイオ）のＮｄｅＩ、ＳａｃＩサイトに挿入した。
フォワードプライマー CACTGTTGATACATATGGAAATCAGCTGGACGAC （配列番号５６）
リバースプライマー CTTCATCTTCATAAGCTAGATGCTCCCATCAATGG （配列番号５７）
Ｌｕｚのコーディング領域（配列番号１０）をクローニングしたプラスミド（ｐＲＳＥＴＢ）を鋳型として、Ｌｕｚのコーディング領域を増幅するプライマーセット（配列番号５６、５７）を用いてＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片をＩｎ－ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いて、植物形質転換用プラスミドｐＲＩ２０１－ＡＮ（タカラバイオ）のＮｄｅＩ、ＳａｃＩサイトに挿入した。
フォワードプライマー CACTGTTGATACATATGGAAATCAGCTGGACGAC （配列番号５６）
リバースプライマー CTTCATCTTCATAAGCTAGATGCTCCCATCAATGG （配列番号５７）
【0083】
得られたプラスミドからＬｕｚの発現ユニットを増幅するプライマーセット（配列番号５８、５９）を用いてＰＣＲを行い、得られた断片をＩｎ－ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いてプラスミド４のＢａｍＨＩサイトに挿入した（プラスミド５）。
フォワードプライマー TGCGGCCGCTGGATCAAGCTTGCATGCCTGCAGGT （配列番号５８）
リバースプライマー CGAATTCCCGGGATCCAGCGGCCGCAGGTA （配列番号５９）
プラスミド５は、配列番号１７に示す塩基配列を有する。具体的には、シイノトモシビタケ由来のＨｉｓｐＳ、コウジカビ由来のＰＰＴａｓｅ、シイノトモシビタケ由来のＣＰＨ、シイノトモシビタケ由来のＨ３Ｈ及びシイノトモシビタケ由来のＬｕｚの発現カセットがタンデムに配置された構造を有する。
フォワードプライマー TGCGGCCGCTGGATCAAGCTTGCATGCCTGCAGGT （配列番号５８）
リバースプライマー CGAATTCCCGGGATCCAGCGGCCGCAGGTA （配列番号５９）
プラスミド５は、配列番号１７に示す塩基配列を有する。具体的には、シイノトモシビタケ由来のＨｉｓｐＳ、コウジカビ由来のＰＰＴａｓｅ、シイノトモシビタケ由来のＣＰＨ、シイノトモシビタケ由来のＨ３Ｈ及びシイノトモシビタケ由来のＬｕｚの発現カセットがタンデムに配置された構造を有する。
【0084】
（６）ヤコウタケのＨｉｓＰ、ＣＰＨ、Ｈ３Ｈ及びＬｕｚ発現カセット
比較対象用に、ヤコウタケの発光関連遺伝子のクローニングを行った。シイノトモシビタケ由来のＬｕｚ、ＨｉｓｐＳ、Ｈ３Ｈ及びＣＰＨのコーディング領域に代えて、ヤコウタケのＬｕｚ、ＨｉｓｐＳ、Ｈ３Ｈ及びナラタケのＣＰＨ（それぞれ配列番号６０、６１、６２及び６３のアミノ酸配列を有する）のコーディング領域（それぞれ配列番号６４、６５、６６及び６７）の発現カセットを使用した以外は、（１）～（５）と同様に植物形質転換用プラスミドｐＲＩ２０１－ＡＮ（タカラバイオ）に各発現カセットを挿入し、プラスミド５’を調製した。
比較対象用に、ヤコウタケの発光関連遺伝子のクローニングを行った。シイノトモシビタケ由来のＬｕｚ、ＨｉｓｐＳ、Ｈ３Ｈ及びＣＰＨのコーディング領域に代えて、ヤコウタケのＬｕｚ、ＨｉｓｐＳ、Ｈ３Ｈ及びナラタケのＣＰＨ（それぞれ配列番号６０、６１、６２及び６３のアミノ酸配列を有する）のコーディング領域（それぞれ配列番号６４、６５、６６及び６７）の発現カセットを使用した以外は、（１）～（５）と同様に植物形質転換用プラスミドｐＲＩ２０１－ＡＮ（タカラバイオ）に各発現カセットを挿入し、プラスミド５’を調製した。
【0085】
実施例７：アグロバクテリウムを介した植物発現用ベクターのベンサミアナタバコ葉への一過的導入（１）
実施例６で調製したプラスミド５を、アグロバクテリウムＧＶ３１０１系統に導入し、５０μｇ／ｍＬカナマイシン、１２．５μｇ／ｍＬゲンタマイシンを含むＬＢ液体培地で培養した。集菌後、５０ｍＭ塩酸マグネシウム、５ｍＭモルフォリノエタンスルホン酸、２００μＭアセトシリンゴン（ｐＨ５．７）に、ＯＤ５００が０．２となるよう懸濁した。１８℃、４時間静置後、菌懸濁液をシリンジにとり、シリンジの先端をベンサミアナタバコの葉裏に押し当て、ピストンを押して、気孔を通して菌懸濁液を葉肉細胞の間隙に導入した。３日以上経過後、発光の観察を行った。比較対象として、プラスミド５に代えて、実施例６（６）で調製したヤコウタケの発光関連遺伝子を発現するプラスミド５’を用いた。その結果、シイノトモシビタケ由来の発光関連遺伝子が、ヤコウタケ由来の発光関連遺伝子よりも強い発光能を植物に付与することが確認できた（図１５）。
実施例６で調製したプラスミド５を、アグロバクテリウムＧＶ３１０１系統に導入し、５０μｇ／ｍＬカナマイシン、１２．５μｇ／ｍＬゲンタマイシンを含むＬＢ液体培地で培養した。集菌後、５０ｍＭ塩酸マグネシウム、５ｍＭモルフォリノエタンスルホン酸、２００μＭアセトシリンゴン（ｐＨ５．７）に、ＯＤ５００が０．２となるよう懸濁した。１８℃、４時間静置後、菌懸濁液をシリンジにとり、シリンジの先端をベンサミアナタバコの葉裏に押し当て、ピストンを押して、気孔を通して菌懸濁液を葉肉細胞の間隙に導入した。３日以上経過後、発光の観察を行った。比較対象として、プラスミド５に代えて、実施例６（６）で調製したヤコウタケの発光関連遺伝子を発現するプラスミド５’を用いた。その結果、シイノトモシビタケ由来の発光関連遺伝子が、ヤコウタケ由来の発光関連遺伝子よりも強い発光能を植物に付与することが確認できた（図１５）。
【0086】
実施例８：アグロバクテリウムを介した植物発現用ベクターのベンサミアナタバコ葉への一過的導入（２）
（１）シイノトモシビタケＬｕｚ発現プラスミドの調製
Ｌｕｚのコーディング領域（配列番号１０）をクローニングしたプラスミド（ｐＲＳＥＴＢ）を鋳型として、Ｌｕｚのコーディング領域を増幅するプライマーセット（配列番号５６、５７）を用いてＰＣＲを行い、シイノトモシビタケＬｕｚ遺伝子を増幅した。
フォワードプライマー CACTGTTGATACATATGGAAATCAGCTGGACGAC （配列番号５６）
リバースプライマー CTTCATCTTCATAAGCTAGATGCTCCCATCAATGG （配列番号５７）
得られた増幅産物をＮｄｅＩ、ＳａｃＩで処理して、植物形質転換用プラスミドｐＲＩ２０１－ＡＮ（タカラバイオ）のＮｄｅＩ、ＳａｃＩサイトに挿入した。
（１）シイノトモシビタケＬｕｚ発現プラスミドの調製
Ｌｕｚのコーディング領域（配列番号１０）をクローニングしたプラスミド（ｐＲＳＥＴＢ）を鋳型として、Ｌｕｚのコーディング領域を増幅するプライマーセット（配列番号５６、５７）を用いてＰＣＲを行い、シイノトモシビタケＬｕｚ遺伝子を増幅した。
フォワードプライマー CACTGTTGATACATATGGAAATCAGCTGGACGAC （配列番号５６）
リバースプライマー CTTCATCTTCATAAGCTAGATGCTCCCATCAATGG （配列番号５７）
得られた増幅産物をＮｄｅＩ、ＳａｃＩで処理して、植物形質転換用プラスミドｐＲＩ２０１－ＡＮ（タカラバイオ）のＮｄｅＩ、ＳａｃＩサイトに挿入した。
【0087】
（２）ヤコウタケＬｕｚ発現プラスミドの調製
ヤコウタケ発光子実体よりRNAを抽出し、リンカーオリゴｄＴプライマーを用いて逆転写後、下記プライマーセット（配列番号６８、６９）を用いてＰＣＲを行い、ヤコウタケＬｕｚ遺伝子を増幅した。
フォワードプライマー CACTGTTGATACATATGGTCCAACTCACCCGAAC （配列番号６８）
リバースプライマー CTTCATCTTCATAAGATCCTTCGCCCACACTTCCA （配列番号６９）
得られた増幅産物をＮｄｅＩ、ＳａｃＩで処理して、植物形質転換用プラスミドｐＲＩ２０１－ＡＮ（タカラバイオ）のＮｄｅＩ、ＳａｃＩサイトに挿入した。
ヤコウタケ発光子実体よりRNAを抽出し、リンカーオリゴｄＴプライマーを用いて逆転写後、下記プライマーセット（配列番号６８、６９）を用いてＰＣＲを行い、ヤコウタケＬｕｚ遺伝子を増幅した。
フォワードプライマー CACTGTTGATACATATGGTCCAACTCACCCGAAC （配列番号６８）
リバースプライマー CTTCATCTTCATAAGATCCTTCGCCCACACTTCCA （配列番号６９）
得られた増幅産物をＮｄｅＩ、ＳａｃＩで処理して、植物形質転換用プラスミドｐＲＩ２０１－ＡＮ（タカラバイオ）のＮｄｅＩ、ＳａｃＩサイトに挿入した。
【0088】
（３）シロヒカリタケＬｕｚ発現プラスミドの調製
プラスミドｐ３０５－ＦＢＰ＿４（配列番号７０、ＡｄｄＧｅｎｅより入手）をテンプレートとして、下記のプライマーセット（配列番号７１、７２）を用いてＰＣＲを行い、シロヒカリタケＬｕｚ遺伝子を増幅した。
フォワードプライマー CACTGTTGATACATATGCGTATAAATATCTCTCTGTC （配列番号７１）
リバースプライマー CTTCATCTTCATAAGTCATTTGGCATTCTCGACGAT （配列番号７２）
得られた増幅産物をＮｄｅＩ、ＳａｃＩで処理して、植物形質転換用プラスミドｐＲＩ２０１－ＡＮ（タカラバイオ）のＮｄｅＩ、ＳａｃＩサイトに挿入した。
プラスミドｐ３０５－ＦＢＰ＿４（配列番号７０、ＡｄｄＧｅｎｅより入手）をテンプレートとして、下記のプライマーセット（配列番号７１、７２）を用いてＰＣＲを行い、シロヒカリタケＬｕｚ遺伝子を増幅した。
フォワードプライマー CACTGTTGATACATATGCGTATAAATATCTCTCTGTC （配列番号７１）
リバースプライマー CTTCATCTTCATAAGTCATTTGGCATTCTCGACGAT （配列番号７２）
得られた増幅産物をＮｄｅＩ、ＳａｃＩで処理して、植物形質転換用プラスミドｐＲＩ２０１－ＡＮ（タカラバイオ）のＮｄｅＩ、ＳａｃＩサイトに挿入した。
【0089】
（４）ＨｉｓｐＳ、ＰＰＴａｓｅ、Ｈ３Ｈ、ＣＰＨ発現プラスミドの調製
シイノトモシビタケ由来のＨｉｓｐＳ、Ｈ３Ｈ、ＣＰＨをコードする遺伝子の発現カセットに代えて、ヤコウタケのＨｉｓｐＳ（配列番号６１）、ヤコウタケのＨ３Ｈ（配列番号６２）、及びナラタケのＣＰＨ（配列番号６３）をコードする各遺伝子（配列番号６５、６６及び６７）の発現カセットを組み込んだ以外は、実施例６の（１）～（４）と同様にして、ＨｉｓｐＳ、ＰＰＴａｓｅ、Ｈ３Ｈ、ＣＰＨ発現プラスミド（プラスミド４’）を調製した。
シイノトモシビタケ由来のＨｉｓｐＳ、Ｈ３Ｈ、ＣＰＨをコードする遺伝子の発現カセットに代えて、ヤコウタケのＨｉｓｐＳ（配列番号６１）、ヤコウタケのＨ３Ｈ（配列番号６２）、及びナラタケのＣＰＨ（配列番号６３）をコードする各遺伝子（配列番号６５、６６及び６７）の発現カセットを組み込んだ以外は、実施例６の（１）～（４）と同様にして、ＨｉｓｐＳ、ＰＰＴａｓｅ、Ｈ３Ｈ、ＣＰＨ発現プラスミド（プラスミド４’）を調製した。
【0090】
（５）アグロバクテリウムを介した一過性導入
（１）～（４）で調製した発現プラスミドを、それぞれアグロバクテリウムに導入した。各種Ｌｕｚ発現プラスミドを導入したアグロバクテリウムを、それぞれプラスミド４’を導入したアグロバクテリウムと組み合わせて、ベンサミアナタバコ葉に共感染させた。感染７日後に、ベンサミアナタバコ葉の発光像をイメージアナライザーLAS-1000（富士フイルム社、露光10秒）で撮影し、Fusion FX7 Edgeソフトウェア（Vivilber社）で発光を定量化した。図１６は、ベンサミアナタバコ葉上の、シイノトモシビタケＬｕｚ、ヤコウタケＬｕｚ及びシロヒカリタケＬｕｚの遺伝子を導入したアグロバクテリウムの感染箇所を、明視野及び暗視野で観察した写真である。図１７は、各感染箇所の発光量を定量化したグラフである。シイノトモシビタケＬｕｚ遺伝子を導入したアグロバクテリウムを感染させた箇所の発光量は、他のＬｕｚ遺伝子を導入した例と比較して非常に高くなった。
（１）～（４）で調製した発現プラスミドを、それぞれアグロバクテリウムに導入した。各種Ｌｕｚ発現プラスミドを導入したアグロバクテリウムを、それぞれプラスミド４’を導入したアグロバクテリウムと組み合わせて、ベンサミアナタバコ葉に共感染させた。感染７日後に、ベンサミアナタバコ葉の発光像をイメージアナライザーLAS-1000（富士フイルム社、露光10秒）で撮影し、Fusion FX7 Edgeソフトウェア（Vivilber社）で発光を定量化した。図１６は、ベンサミアナタバコ葉上の、シイノトモシビタケＬｕｚ、ヤコウタケＬｕｚ及びシロヒカリタケＬｕｚの遺伝子を導入したアグロバクテリウムの感染箇所を、明視野及び暗視野で観察した写真である。図１７は、各感染箇所の発光量を定量化したグラフである。シイノトモシビタケＬｕｚ遺伝子を導入したアグロバクテリウムを感染させた箇所の発光量は、他のＬｕｚ遺伝子を導入した例と比較して非常に高くなった。
【0091】
実施例９：高光度化ルシフェラーゼ変異体の形成
ｐＲＩ２０１－ＡＮプラスミドに、実施例２で得られたシイノトモシビタケＬｕｚ遺伝子を挿入したものをテンプレートに、下記のプライマーセット（配列番号７３、７４）を用いてＰＣＲを行い、シイノトモシビタケＬｕｚ遺伝子を増幅した。
フォワードプライマー AGAGGTAATACCATATGGAAATCAGCTGGACGAC （配列番号７３）
リバースプライマー ATGGATCCTAGATGCTCCCATCAATGG （配列番号７４）
増幅ＤＮＡ断片をＮｄｅＩとＢａｍＨＩ制限酵素で処理後、ポリヒスチジン配列を付加したｐＣｏｌｄＩＶプラスミド（タカラバイオ社）のＮｄｅＩとＢａｍＨＩサイトにライゲーションした。これを野生型シイノトモシビタケＬｕｚ発現プラスミドとした。
ｐＲＩ２０１－ＡＮプラスミドに、実施例２で得られたシイノトモシビタケＬｕｚ遺伝子を挿入したものをテンプレートに、下記のプライマーセット（配列番号７３、７４）を用いてＰＣＲを行い、シイノトモシビタケＬｕｚ遺伝子を増幅した。
フォワードプライマー AGAGGTAATACCATATGGAAATCAGCTGGACGAC （配列番号７３）
リバースプライマー ATGGATCCTAGATGCTCCCATCAATGG （配列番号７４）
増幅ＤＮＡ断片をＮｄｅＩとＢａｍＨＩ制限酵素で処理後、ポリヒスチジン配列を付加したｐＣｏｌｄＩＶプラスミド（タカラバイオ社）のＮｄｅＩとＢａｍＨＩサイトにライゲーションした。これを野生型シイノトモシビタケＬｕｚ発現プラスミドとした。
【0092】
変異導入は、ｒＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社）の推奨反応条件の反応系に、１６０μＭの塩化マンガンを加えて行った。ｐＲＩ２０１－ＡＮプラスミドにシイノトモシビタケＬｕｚ遺伝子を挿入したものをテンプレートに、以下のプライマーセット（配列番号７５、７６）を用いてＰＣＲを行い、シイノトモシビタケＬｕｚ遺伝子を増幅した。
フォワードプライマー CCGAAAGGCACACTTAATTATTAAGAGGTAATACCATATG （配列番号７５）
リバースプライマー CTAGATCAATGGTGATGGTGATGATGGGATCC （配列番号７６）
増幅ＤＮＡ断片をＮｄｅＩとＢａｍＨＩ制限酵素で処理後、ポリヒスチジン配列を付加したｐＣｏｌｄＩＶプラスミドのＮｄｅＩとＢａｍＨＩサイトにライゲーションした。このライゲーションしたプラスミドを大腸菌に導入して、ＬＢプレートに蒔き、コロニーが形成された後にナイロン膜に移し取った。ナイロン膜を０．２ｍＭＩＰＴＧを含むＬＢプレート上に置き、１５℃で一晩置いた。このプレートに１０μＭ ３－ヒドロキシヒスピジンを含む６ｍＬ ＰＢＳ（タカラバイオ社）を注ぎ、イメージアナライザーＬＡＳ－３０００（富士フイルム社）で、感度：スーパー、５分露光の条件で発光映像を取得した。得られた像から、強い発光を示す大腸菌を選抜した（１次スクリーニング）。
フォワードプライマー CCGAAAGGCACACTTAATTATTAAGAGGTAATACCATATG （配列番号７５）
リバースプライマー CTAGATCAATGGTGATGGTGATGATGGGATCC （配列番号７６）
増幅ＤＮＡ断片をＮｄｅＩとＢａｍＨＩ制限酵素で処理後、ポリヒスチジン配列を付加したｐＣｏｌｄＩＶプラスミドのＮｄｅＩとＢａｍＨＩサイトにライゲーションした。このライゲーションしたプラスミドを大腸菌に導入して、ＬＢプレートに蒔き、コロニーが形成された後にナイロン膜に移し取った。ナイロン膜を０．２ｍＭＩＰＴＧを含むＬＢプレート上に置き、１５℃で一晩置いた。このプレートに１０μＭ ３－ヒドロキシヒスピジンを含む６ｍＬ ＰＢＳ（タカラバイオ社）を注ぎ、イメージアナライザーＬＡＳ－３０００（富士フイルム社）で、感度：スーパー、５分露光の条件で発光映像を取得した。得られた像から、強い発光を示す大腸菌を選抜した（１次スクリーニング）。
【0093】
１次スクリーニング後の各大腸菌株を１ｍＬ ＬＢ液体培地で一晩培養し、培養液にＩＰＴＧを０．５ｍＭとなるよう加えて１５℃で一晩置いた。培養液１０μＬを取って９０μＬのＰＢＳ、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００と１μＬの１００μＭ ３－ヒドロキシヒスピジンを加え、プレートリーダーＳＨ－９０００（コロナ電気社）で発光を検出した（露光１０秒、全波長）。標準用として、野生型シイノトモシビタケＬｕｚ発現プラスミドを導入した大腸菌についても同様の測定を行った。各培養液の発光検出は、ｎ＝３で実施した。
【0094】
各培養液１０μＬについて、イムノブロットを行い、相対的なタンパク質量を測定した。常法に従って、各培養液について、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、ゲルからメンブレンにタンパク質を転写した。メンブレンを、１次抗体（抗ポリヒスチジン抗体（Ａｂｃａｍ社））、２次抗体（ＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（プロメガ社））と順に反応させ、基質（テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ））溶液を用いて発色させた。イメージアナライザー（Ｆｕｓｉｏｎ Fｘ（Ｖｉｌｂｅｒ Ｂｉｏ Ｉｍａｇｉｎｇ社製））を用いて、各バンドの発色度合いを数値化した。野生型シイノトモシビタケＬｕｚ発現プラスミドを導入した大腸菌についても同様の測定を行い、得られたＬｕｚのバンドのタンパク質量を「１」として、各変異体Ｌｕｚのタンパク質量を各バンドの発色強度から算出した（相対的タンパク質量）。図１８に、野生型と、特に発色の強かった変異体１、２及び３の各Ｌｕｚのイムノブロットメンブレンの写真を示す。
【0095】
それぞれのプラスミドについて、発現タンパク質量当たりの発光活性を算出した結果、野生型シイノトモシビタケＬｕｚと比較して高い発光活性を示す３つの変異体（Ｌｕｚ変異体１、２及び３）が得られた。図１９に、各Ｌｕｚの発現タンパク質量当たりの発光活性（発光強度／相対的タンパク質量）を示す。Ｌｕｚ変異体１、２及び３において、野生型と比較してタンパク質量当たりの発光活性が高くなることが示された。
【0096】
常法にしたがって、Ｌｕｚ変異体１、２及び３のアミノ酸配列を決定した。図２０に、野生型シイノトモシビタケＬｕｚ（配列番号１）及び変異体１、２及び３（配列番号７～９）のアミノ酸配列のアラインメントを示す。変異体１、２及び３は、それぞれ独立に２箇所の変異を有していた。
【要約】
【課題】既知の発光関連遺伝子よりも強い発光を生物（特に植物）に付与することが可能な、新規の発光関連遺伝子（核酸、発現用ベクター）を提供する。
【解決手段】配列番号１で表されるアミノ酸配列又は配列番号１で表される配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列；配列番号２若しくは３で表されるアミノ酸配列又は配列番号２若しくは３で表される配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列；配列番号４若しくは５で表されるアミノ酸配列又は配列番号４若しくは５で表される配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列；及び配列番号６で表されるアミノ酸配列又は配列番号６で表される配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列；から選択される少なくとも１つの塩基配列を含む、核酸。
【選択図】なし
【解決手段】配列番号１で表されるアミノ酸配列又は配列番号１で表される配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列；配列番号２若しくは３で表されるアミノ酸配列又は配列番号２若しくは３で表される配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列；配列番号４若しくは５で表されるアミノ酸配列又は配列番号４若しくは５で表される配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列；及び配列番号６で表されるアミノ酸配列又は配列番号６で表される配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列；から選択される少なくとも１つの塩基配列を含む、核酸。
【選択図】なし
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【配列表】