ホーム > 特許ランキング > 雪印メグミルク株式会社
知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-05-15
(45)【発行日】2024-05-23
(54)【発明の名称】ナチュラルチーズ及びその製造方法
(51)【国際特許分類】
A23C 19/032 20060101AFI20240516BHJP
【ＦＩ】
A23C19/032
【請求項の数】
3
(21)【出願番号】P 2019185626
(22)【出願日】2019-10-09
(65)【公開番号】P2021058161
(43)【公開日】2021-04-15
【審査請求日】2022-08-05
(73)【特許権者】
【識別番号】711002926
【氏名又は名称】雪印メグミルク株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110000774
【氏名又は名称】弁理士法人 もえぎ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】飯村 順
(72)【発明者】
【氏名】橋本 年永
(72)【発明者】
【氏名】河野 剛
(72)【発明者】
【氏名】山住 弘
【審査官】戸来 幸男
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２０１６／０１７４５８７（ＵＳ，Ａ１）
【文献】米国特許第０６１４３３３４（ＵＳ，Ａ）
【文献】米国特許第０４７２８５１６（ＵＳ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ２３Ｃ １９／００－１９／１６
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
Ｇｏｏｇｌｅ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
プロピオニバクテリウム属の菌と、ラクトコッカス属ラクティス種の菌とを含み、水分含量が５５重量％以下、塩分が０．３重量％以上６．０重量％以下であり、かつ、３－メチルブタナールが０．５ｐｐｍ以上、３－メチル－１－ブタノールが１０ｐｐｍ以上、イソ吉草酸が５．０ｐｐｍ以上、であることを特徴とするナチュラルチーズ（ただし、パスタフィラータチーズ及び熟成期間が１か月以下の前記ナチュラルチーズを除く）。
【請求項2】
水分含量が５５重量％以下、塩分が０．３重量％以上６．０重量％以下であり、かつ、３－メチルブタナールが０．５ｐｐｍ以上、３－メチル－１－ブタノールが１０ｐｐｍ以上、イソ吉草酸が５．０ｐｐｍ以上、であるナチュラルチーズの製造方法であって、原料乳に、プロピオニバクテリウム属の菌と、ラクトコッカス属ラクティス種の菌を加える工程と、５５℃以下で加温する熟成前加温工程と、を含むことを特徴とするナチュラルチーズの製造方法（ただし、パスタフィラータ工程を含む製造方法及び熟成期間が１か月以下の前記ナチュラルチーズの製造方法を除く）。
【請求項3】
さらに、１５℃以上２５℃以下の熟成後加温工程を含むことを特徴とする請求項２に記載のナチュラルチーズの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ナチュラルチーズ及びその製造方法に関する。特に詳しくは、ナッツの様な香りを有するナチュラルチーズ及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
チーズにおけるナッツの様な香り（以下、ナッツ様香ということがある）の由来は、３－メチルブタナール、イソ吉草酸などの分岐鎖アミノ酸由来成分の寄与が大きいと考えられ、これらの成分は、チーズの製造中や熟成中に分岐鎖アミノ酸を原料として微生物の酵素によって生成されるものである。
チーズ中では、分岐鎖アミノ酸であるロイシン（イソロイシン、バリン）が分岐鎖アミノ酸アミノ基転移酵素により中間体である分岐鎖ケト酸を経由し、分岐鎖アルデヒド及び分岐鎖アルコール（３－メチルブタナール及び３－メチル－１－ブタノール）または分岐鎖有機酸（イソ吉草酸）が生成することが知られている（非特許文献１，非特許文献２）。
チーズ中では、分岐鎖アミノ酸であるロイシン（イソロイシン、バリン）が分岐鎖アミノ酸アミノ基転移酵素により中間体である分岐鎖ケト酸を経由し、分岐鎖アルデヒド及び分岐鎖アルコール（３－メチルブタナール及び３－メチル－１－ブタノール）または分岐鎖有機酸（イソ吉草酸）が生成することが知られている（非特許文献１，非特許文献２）。
【0003】
特許文献１は、２つ以上の微生物の菌株の混合培地であって、前記混合培地に含まれる前記微生物の菌株の少なくとも一部が酵素的経路の一部を実施する能力に基づいて個別に選択され、前記の個別に選択された微生物の菌株が希望するフレーバ化合物に関する完全な経路を一緒に形成する前記混合培地について開示されている。また、高められた、又は特製のフレーバー培地であって、希望するフレーバを形成する範囲でアミノ酸を揮発性化合物に変換する能力が少ない、又は変換することができないが、一緒に使用した場合に、希望するフレーバを与える適切な条件下で、アミノ酸を揮発性化合物に変える２つ以上の微生物の菌株の組み合わせを含む前記スターター培地について開示されている。具体的には、２つのラクトコッカス属の菌株、特にクレモリス菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｅｍｏｒｉｓ）の菌株Ｂ１１５７とクレモリス菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｅｍｏｒｉｓ）の菌株ＳＫ１１０との組み合わせを含むチーズの製造のためのスターター培地、及びブレビバクテリウム属の菌株とブドウ球菌属の菌株、特にブレビバクテリウムカゼイ（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｓｅｉ）の菌株Ｂ１３９２と腐生ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）の菌株Ｂ１１４４の組み合わせを含むチーズの製造のためのスターター培地を開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【文献】特表２００４－５０１６３３号公報
【非特許文献】
【0005】
【文献】GARCIA-CAYUELA, Tomas, et al. Expression in Lactococcus lactis of functional genes related to amino acid catabolism and cheese aroma formation is influenced by branched chain amino acids. International journal of food microbiology, 2012, 159.3: 207-213.
【文献】THIERRY, Anne; RICHOUX, Romain; KERJEAN, Jean-Rene. Isovaleric acid is mainly produced by Propionibacterium freudenreichii in Swiss cheese. International dairy journal, 2004, 14.9: 801-807.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明は、ナッツ様香を有する新規なナチュラルチーズ、及び該チーズの製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
上記課題を解決するため、鋭意検討した結果、スターターとしてプロピオニバクテリウム属の菌と、ラクトコッカス属ラクティス種の菌を用いて特定条件下で熟成することによりナッツ様香を有する新規なナチュラルチーズを製造できることを見出し本発明を完成するに至った。すなわち本発明には以下の構成が含まれる。
（１）プロピオニバクテリウム属の菌と、ラクトコッカス属ラクティス種の菌と、を含み
水分含量が５５重量％以下、塩分が０．３重量％以上６．０重量％以下であり、かつ
３－メチルブタナールが０．５ｐｐｍ以上、３－メチル－１－ブタノールが１０ｐｐｍ以上、イソ吉草酸が５．０ｐｐｍ以上、
であることを特徴とするナチュラルチーズ。
（２）原料乳に、プロピオニバクテリウム属の菌と、ラクトコッカス属ラクティス種の菌を加える工程と、
５５℃以下で加温する熟成前加温工程と、
を含むことを特徴とするナチュラルチーズの製造方法。
（３）さらに、１５℃以上２５℃以下の熟成後加温工程を含むことを特徴とする請求項１に記載のナチュラルチーズの製造方法。
（１）プロピオニバクテリウム属の菌と、ラクトコッカス属ラクティス種の菌と、を含み
水分含量が５５重量％以下、塩分が０．３重量％以上６．０重量％以下であり、かつ
３－メチルブタナールが０．５ｐｐｍ以上、３－メチル－１－ブタノールが１０ｐｐｍ以上、イソ吉草酸が５．０ｐｐｍ以上、
であることを特徴とするナチュラルチーズ。
（２）原料乳に、プロピオニバクテリウム属の菌と、ラクトコッカス属ラクティス種の菌を加える工程と、
５５℃以下で加温する熟成前加温工程と、
を含むことを特徴とするナチュラルチーズの製造方法。
（３）さらに、１５℃以上２５℃以下の熟成後加温工程を含むことを特徴とする請求項１に記載のナチュラルチーズの製造方法。
【発明の効果】
【0008】
本発明は、ナッツ様香を有する新規なナチュラルチーズ、及び該チーズの製造方法を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1】プロピオン酸菌及び／又は乳酸菌を培養した培養液中の３－メチルブタナール、３－メチル―１－ブタノール、イソ吉草酸の濃度（相対値）を示す。
【図2】プロピオン酸菌及び／又は乳酸菌を培養した培養液中のα－ＫＩＣの濃度を示す。
【図3】試作品チーズ中の３－メチルブタナール、３－メチル―１－ブタノール、イソ吉草酸の濃度を示す。
【図4】熟成後加温期間中の試作品チーズの３－メチルブタナール、３－メチル―１－ブタノール、イソ吉草酸の濃度の経時変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【0010】
本発明のナチュラルチーズについて以下に詳細に説明する。
（ナチュラルチーズ）
本発明のナチュラルチーズは、プロピオニバクテリウム属の菌と、ラクトコッカス属ラクティス種の菌とを含み、かつ３－メチルブタナールが０．５ｐｐｍ以上、３－メチル－１－ブタノールが１０ｐｐｍ以上、イソ吉草酸が５．０ｐｐｍ以上を含む。
及びまた、本発明のナチュラルチーズは、所謂セミハードタイプ、あるいはハードタイプといわれるものであり、ｐＨは５．２～６．０程度、水分は３０％～５５％程度、脂肪分は２５～３０％程度、タンパク質量は２５～３５％程度、塩分は０．３重量％以上６．０重量％以下である。
なお、３－メチル－１－ブタノールは上記したとおり１０ｐｐｍ以上であればよいが、２０ｐｐｍ以上が好ましく、３０ｐｐｍ以上がより好ましく、４０ｐｐｍ以上がさらに好ましい。
３－メチルブタナールは上記したとおり０．５ｐｍ以上であればよいが、１．０ｐｐｍ以上が好ましく、２．５ｐｐｍ以上がより好ましく、４．０ｐｐｍ以上がさらに好ましい。
イソ吉草酸は上記したとおり５．０ｐｐｍ以上であればよいが、６．０ｐｐｍ以上が好ましく、７．０ｐｐｍ以上がより好ましく、８．０ｐｐｍ以上がさらに好ましい。
（ナチュラルチーズ）
本発明のナチュラルチーズは、プロピオニバクテリウム属の菌と、ラクトコッカス属ラクティス種の菌とを含み、かつ３－メチルブタナールが０．５ｐｐｍ以上、３－メチル－１－ブタノールが１０ｐｐｍ以上、イソ吉草酸が５．０ｐｐｍ以上を含む。
及びまた、本発明のナチュラルチーズは、所謂セミハードタイプ、あるいはハードタイプといわれるものであり、ｐＨは５．２～６．０程度、水分は３０％～５５％程度、脂肪分は２５～３０％程度、タンパク質量は２５～３５％程度、塩分は０．３重量％以上６．０重量％以下である。
なお、３－メチル－１－ブタノールは上記したとおり１０ｐｐｍ以上であればよいが、２０ｐｐｍ以上が好ましく、３０ｐｐｍ以上がより好ましく、４０ｐｐｍ以上がさらに好ましい。
３－メチルブタナールは上記したとおり０．５ｐｍ以上であればよいが、１．０ｐｐｍ以上が好ましく、２．５ｐｐｍ以上がより好ましく、４．０ｐｐｍ以上がさらに好ましい。
イソ吉草酸は上記したとおり５．０ｐｐｍ以上であればよいが、６．０ｐｐｍ以上が好ましく、７．０ｐｐｍ以上がより好ましく、８．０ｐｐｍ以上がさらに好ましい。
【0011】
（ナチュラルチーズの製造方法）
ナチュラルチーズの製造方法は、一般に、次の工程を含む。
原料乳を、加熱殺菌する工程、冷却工程、スターターを添加する工程、レンネットを添加し原料乳を凝固させる工程、凝固物をカッティングする工程、所定のｐＨとなるまで加温攪拌（以下、熟成前加温工程、とも記載する）する工程、ホエイを排出し型詰めする工程、加塩工程、所定の温度で熟成する工程を含む。本発明の製造方法は、スターターとして特定の菌を組み合わせ、特定温度で熟成前加温工程を経ることを特徴とする。
以下に本発明のナチュラルチーズの製造方法の具体的一態様を記載する。
乳脂肪分を２．８％程度とした原料乳を、加熱殺菌（７５℃１５秒間、６５℃３０分等）した後に３０℃程度に冷却し、塩化カルシウムとスターターを添加する。
スターターの添加後、レンネットを添加し、原料乳を凝固させる。この凝固物をカッティングした後、ｐＨが６．４以下となるまで３５℃から５５℃程度で加温攪拌（以下、熟成前加温工程、とも記載する）した後、ホエイを排出し型詰めする。所定の塩分となるよう加塩を行った後、１０℃程度の温度で６ヶ月間程度熟成する。
熟成前加温工程は、前述のとおり３５℃から５５℃程度であればいずれでもよいが、ラクトコッカス・ラクティスは中温性乳酸菌であることから、より好ましくは３５℃～５０℃であり、よりいっそう好ましくは３５℃～４５℃である。
６ヶ月間程度熟成させたチーズを、さらに１５～２５℃程度で数週間熟成する工程（以下、熟成後加温工程、とも記載する）に供することもでき、この工程によりナッツ様香をさらに増加させるなどして所望の風味に調整することができる。熟成後加温工程は、前述のとおり、１５～２５℃程度で数週間あればよいが、より好ましくは１８～２３℃で数週間あり、よりいっそう好ましくは２０℃で２週間である。
ナチュラルチーズの製造方法は、一般に、次の工程を含む。
原料乳を、加熱殺菌する工程、冷却工程、スターターを添加する工程、レンネットを添加し原料乳を凝固させる工程、凝固物をカッティングする工程、所定のｐＨとなるまで加温攪拌（以下、熟成前加温工程、とも記載する）する工程、ホエイを排出し型詰めする工程、加塩工程、所定の温度で熟成する工程を含む。本発明の製造方法は、スターターとして特定の菌を組み合わせ、特定温度で熟成前加温工程を経ることを特徴とする。
以下に本発明のナチュラルチーズの製造方法の具体的一態様を記載する。
乳脂肪分を２．８％程度とした原料乳を、加熱殺菌（７５℃１５秒間、６５℃３０分等）した後に３０℃程度に冷却し、塩化カルシウムとスターターを添加する。
スターターの添加後、レンネットを添加し、原料乳を凝固させる。この凝固物をカッティングした後、ｐＨが６．４以下となるまで３５℃から５５℃程度で加温攪拌（以下、熟成前加温工程、とも記載する）した後、ホエイを排出し型詰めする。所定の塩分となるよう加塩を行った後、１０℃程度の温度で６ヶ月間程度熟成する。
熟成前加温工程は、前述のとおり３５℃から５５℃程度であればいずれでもよいが、ラクトコッカス・ラクティスは中温性乳酸菌であることから、より好ましくは３５℃～５０℃であり、よりいっそう好ましくは３５℃～４５℃である。
６ヶ月間程度熟成させたチーズを、さらに１５～２５℃程度で数週間熟成する工程（以下、熟成後加温工程、とも記載する）に供することもでき、この工程によりナッツ様香をさらに増加させるなどして所望の風味に調整することができる。熟成後加温工程は、前述のとおり、１５～２５℃程度で数週間あればよいが、より好ましくは１８～２３℃で数週間あり、よりいっそう好ましくは２０℃で２週間である。
【0012】
（使用する菌）
本発明のナチュラルチーズの製造には、スターターとしてプロピオニバクテリウム属の菌とラクトコッカス属ラクティス種の菌を用いる。プロピオニバクテリウム属の菌（プロピオン酸菌、以下、単にＰＡＢとも記載する）としては、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｓｈｅｒｍａｎｉｉ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｇｌｏｂｏｓｕｍ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｊｅｎｓｅｎｉｉ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｏｅｎｉｉを用いることができるが、好ましくはＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｓｈｅｒｍａｎｉｉであり、さらに好ましくはＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｓｈｅｒｍａｎｉｉ ＳＢＴ３１９７（ＮＩＴＥ Ｐ－０３００１）を例示できる。
ラクトコッカス属ラクティス種の菌としてＬｃ．ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｌａｔｉｓ（ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス）を用いることが好ましい。Ｌｃ．ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｌａｔｉｓは、特に限定はしないが、好ましくはＬｃ．ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｌａｔｉｓ ＳＢＴ１２２３（ＮＩＴＥ－Ｐ－０３００３）またはＬｃ．ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｌａｔｉｓ ＳＢＴ１２２０（ＮＩＴＥ－Ｐ－０３００２）を例示できる。
本発明のプロピオン酸菌及びラクトコッカス・ラクティス種の乳酸菌を含み、３－メチル１－ブタノール、３－メチルブタナール、イソ吉草酸を所定量以上含むナチュラルチーズを作るため、プロピオン酸菌及びラクトコッカス・ラクティス種の菌の適切な組み合わせを選ぶことが好ましい。
プロピオン酸菌としては、α－ケトイソカプロン酸（α－ＫＩＣ）生成反応活性が高い菌が望ましく、ラクトコッカス・ラクティス種では、分岐鎖α-ケト酸デカルボキシラーゼ活性の高い菌、すなわち、α－ＫＩＣより３－メチル１－ブタノール、３－メチルブタナールを生成する活性の高い菌が好ましい。
このような菌を共存させ、液体培養でそれぞれ単独よりも３－メチル１－ブタノール、３－メチルブタナール、イソ吉草酸生成活性の高い組み合わせを選択することでチーズの製造においても同様の作用効果を得ることができる。
本発明のナチュラルチーズの製造には、スターターとしてプロピオニバクテリウム属の菌とラクトコッカス属ラクティス種の菌を用いる。プロピオニバクテリウム属の菌（プロピオン酸菌、以下、単にＰＡＢとも記載する）としては、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｓｈｅｒｍａｎｉｉ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｇｌｏｂｏｓｕｍ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｊｅｎｓｅｎｉｉ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｏｅｎｉｉを用いることができるが、好ましくはＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｓｈｅｒｍａｎｉｉであり、さらに好ましくはＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｓｈｅｒｍａｎｉｉ ＳＢＴ３１９７（ＮＩＴＥ Ｐ－０３００１）を例示できる。
ラクトコッカス属ラクティス種の菌としてＬｃ．ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｌａｔｉｓ（ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス）を用いることが好ましい。Ｌｃ．ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｌａｔｉｓは、特に限定はしないが、好ましくはＬｃ．ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｌａｔｉｓ ＳＢＴ１２２３（ＮＩＴＥ－Ｐ－０３００３）またはＬｃ．ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｌａｔｉｓ ＳＢＴ１２２０（ＮＩＴＥ－Ｐ－０３００２）を例示できる。
本発明のプロピオン酸菌及びラクトコッカス・ラクティス種の乳酸菌を含み、３－メチル１－ブタノール、３－メチルブタナール、イソ吉草酸を所定量以上含むナチュラルチーズを作るため、プロピオン酸菌及びラクトコッカス・ラクティス種の菌の適切な組み合わせを選ぶことが好ましい。
プロピオン酸菌としては、α－ケトイソカプロン酸（α－ＫＩＣ）生成反応活性が高い菌が望ましく、ラクトコッカス・ラクティス種では、分岐鎖α-ケト酸デカルボキシラーゼ活性の高い菌、すなわち、α－ＫＩＣより３－メチル１－ブタノール、３－メチルブタナールを生成する活性の高い菌が好ましい。
このような菌を共存させ、液体培養でそれぞれ単独よりも３－メチル１－ブタノール、３－メチルブタナール、イソ吉草酸生成活性の高い組み合わせを選択することでチーズの製造においても同様の作用効果を得ることができる。
【0013】
（香気成分の分析方法）
３－メチル１－ブタノール、３－メチルブタナール、イソ吉草酸は実施例に記載のとおりＧＣ―ＭＳによって定量することができる。
３－メチル１－ブタノール、３－メチルブタナール、イソ吉草酸は実施例に記載のとおりＧＣ―ＭＳによって定量することができる。
【実施例】
【0014】
以下、本発明の実施例を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【0015】
〔試験例１〕プロピオン酸菌及び乳酸菌のスクリーニング
（１）プロピオン酸菌及び乳酸菌の培養方法
表１，２に示すプロピオン酸菌７株及び乳酸菌４株の培養を行った。各プロピオン酸菌の凍結ストック及び各乳酸菌の凍結乾燥アンプルよりＳＣＩ（Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｏｌｏｎｙ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ）し、オートクレーブ滅菌したＭ１７液体培地１０ｍＬに接種したものを、アネロパック・ケンキ（三菱ガス化学）を用いて嫌気条件とした容器内にて３０℃で１８時間程度培養した。次に、Ｍ１７液体培地９００ｍＬにこの培養液を１％（ｖ／ｖ）接種した後、同様の嫌気条件にて培養し、対数増殖期にある菌体を氷で冷却、６，０００×ｇ、４℃、１５分間遠心し集菌した。集菌した菌体は冷却したｍｉｌｌｉ－Ｑ水で２回洗浄、遠心を行い、ＯＤ６００：８０程度となるようｍｉｌｌｉ－Ｑ水で再懸濁した。
（１）プロピオン酸菌及び乳酸菌の培養方法
表１，２に示すプロピオン酸菌７株及び乳酸菌４株の培養を行った。各プロピオン酸菌の凍結ストック及び各乳酸菌の凍結乾燥アンプルよりＳＣＩ（Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｏｌｏｎｙ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ）し、オートクレーブ滅菌したＭ１７液体培地１０ｍＬに接種したものを、アネロパック・ケンキ（三菱ガス化学）を用いて嫌気条件とした容器内にて３０℃で１８時間程度培養した。次に、Ｍ１７液体培地９００ｍＬにこの培養液を１％（ｖ／ｖ）接種した後、同様の嫌気条件にて培養し、対数増殖期にある菌体を氷で冷却、６，０００×ｇ、４℃、１５分間遠心し集菌した。集菌した菌体は冷却したｍｉｌｌｉ－Ｑ水で２回洗浄、遠心を行い、ＯＤ６００：８０程度となるようｍｉｌｌｉ－Ｑ水で再懸濁した。
【0016】
【表1】
【0017】
【表2】
【0018】
（２）プロピオン酸菌又は乳酸菌菌体のＬｅｕ代謝による生成物の測定
表３に示す＃１－１１の水準でＬｅｕ代謝による生成物の測定を行った。各菌体懸濁液を最終濁度でＯＤ６００：１０相当量をＲｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（６０ｍＭ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．８）、 １０ｍＭ α－ケトグルタル酸（α－ＫＧ）、５０ｕＭ ピリドキサール５－リン酸、５０ｕＭ チアミンピロリン酸クロライド、５ｍＭ Ｌｅｕを混合したもの）に懸濁した。なお、Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒの各成分量は菌体懸濁液添加後の最終濃度となるよう調製した。ピリドキサール５－リン酸は１ｍｇ／ｍＬ ｃｏｎｃ．、チアミンピロリン酸クロライドは１００ｍｇ／ｍＬ ｃｏｎｃ．を調製し混合した。これらの混合液は３０℃でインキュベートし、反応開始後４８時間後サンプリングを行った。そして、この反応液中のα－ケトイソカプロン酸をＬＣ－ＭＳを用いて、３－メチルブタナール、３－メチル－１－ブタノール、イソ吉草酸をＧＣ－ＭＳを用いて測定した。なお、それぞれの測定方法については以下に示す。
表３に示す＃１－１１の水準でＬｅｕ代謝による生成物の測定を行った。各菌体懸濁液を最終濁度でＯＤ６００：１０相当量をＲｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（６０ｍＭ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．８）、 １０ｍＭ α－ケトグルタル酸（α－ＫＧ）、５０ｕＭ ピリドキサール５－リン酸、５０ｕＭ チアミンピロリン酸クロライド、５ｍＭ Ｌｅｕを混合したもの）に懸濁した。なお、Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒの各成分量は菌体懸濁液添加後の最終濃度となるよう調製した。ピリドキサール５－リン酸は１ｍｇ／ｍＬ ｃｏｎｃ．、チアミンピロリン酸クロライドは１００ｍｇ／ｍＬ ｃｏｎｃ．を調製し混合した。これらの混合液は３０℃でインキュベートし、反応開始後４８時間後サンプリングを行った。そして、この反応液中のα－ケトイソカプロン酸をＬＣ－ＭＳを用いて、３－メチルブタナール、３－メチル－１－ブタノール、イソ吉草酸をＧＣ－ＭＳを用いて測定した。なお、それぞれの測定方法については以下に示す。
【0019】
【表3】
【0020】
（３）各成分の分析方法
（３－１）α－ケトイソカプロン酸の分析方法
凍結した静止菌体反応液を融解し、反応液：３００ｍＭ シュウ酸水溶液＝９：１の割合で混合し、８，０００×ｇ、４℃、１５分間遠心した。上清を遠心フィルターユニット（ナノセップ３Ｋ）で１２０００ｒｐｍ、６０分間限外ろ過した透過液をＬＣ／ＭＳ分析（ネガティブモード・ＳＩＭモード）に供し、ｍ／ｚ１２９のイオンのピーク面積からα－ケトイソカプロン酸濃度を絶対検量線法で定量した。
（３－１）α－ケトイソカプロン酸の分析方法
凍結した静止菌体反応液を融解し、反応液：３００ｍＭ シュウ酸水溶液＝９：１の割合で混合し、８，０００×ｇ、４℃、１５分間遠心した。上清を遠心フィルターユニット（ナノセップ３Ｋ）で１２０００ｒｐｍ、６０分間限外ろ過した透過液をＬＣ／ＭＳ分析（ネガティブモード・ＳＩＭモード）に供し、ｍ／ｚ１２９のイオンのピーク面積からα－ケトイソカプロン酸濃度を絶対検量線法で定量した。
【0021】
（３－２）３－メチルブタナール、３－メチル－１－ブタノール、イソ吉草酸の分析方法
２０ｍＬバイアルに２ｍＬの分析サンプルを入れ、ヘッドスペースを高純度窒素で置換した後、セプタム付きスクリューキャップで密栓した。窒素ガスを用いた動的ヘッドスペース法により、対象成分を捕集剤（Ｃａｒｂｏｐａｃｋ Ｂ＆Ｘ／ＳｈｉｎｃａｒｂｏｎＸ）に捕集した。その後、捕集剤の対象成分を加熱脱着しＧＣ－ＭＳ（スキャンモード）測定を行った。ＧＣ－ＭＳのオーブン昇温条件は、４０℃－３分保持→２０℃／分→２５０℃・１０分保持し、測定を行った。得られたｍ／ｚ５８（３－メチルブタナール）、ｍ／ｚ７０（３－メチル－１－ブタノール）、ｍ／ｚ６０（イソ吉草酸）のイオンの相対ピーク面積から各成分の生成量を比較した。
２０ｍＬバイアルに２ｍＬの分析サンプルを入れ、ヘッドスペースを高純度窒素で置換した後、セプタム付きスクリューキャップで密栓した。窒素ガスを用いた動的ヘッドスペース法により、対象成分を捕集剤（Ｃａｒｂｏｐａｃｋ Ｂ＆Ｘ／ＳｈｉｎｃａｒｂｏｎＸ）に捕集した。その後、捕集剤の対象成分を加熱脱着しＧＣ－ＭＳ（スキャンモード）測定を行った。ＧＣ－ＭＳのオーブン昇温条件は、４０℃－３分保持→２０℃／分→２５０℃・１０分保持し、測定を行った。得られたｍ／ｚ５８（３－メチルブタナール）、ｍ／ｚ７０（３－メチル－１－ブタノール）、ｍ／ｚ６０（イソ吉草酸）のイオンの相対ピーク面積から各成分の生成量を比較した。
【0022】
（４）プロピオン酸菌または乳酸菌のＬｅｕ代謝活性測定結果
（４－１）３－メチルブタナール、３－メチル―１－ブタノール、イソ吉草酸濃度の測定結果
反応開始４８時間後のプロピオン酸菌及び乳酸菌単体（＃１～＃１１）の３－メチルブタナール、３－メチル―１－ブタノール、イソ吉草酸濃度の相対値を図１Ａに示す。
横軸は、各成分における１１水準中で最もピーク面積が大きい水準を１００％とした相対値で表した。この結果から、プロピオン酸菌単体では、７菌株中でＰ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉの基準株であるＡＴＣＣ６２０７Ｔが最もイソ吉草酸の検出量が高かった。
また、Ｐ．ｓｈｅｒｍａｎｉｉ ＳＢＴ３１９７は、３－メチルブタナール及び３－メチル１－ブタノールの検出量が高く、ＳＢＴ３１９７以外のＰＡＢを用いた水準の平均値と比較して、約２３倍（３－メチルブタナール）、約３倍（３－メチル１－ブタノール）量検出された。
乳酸球菌単体での結果では、Ｌｃ．ｌａｃｔｉｓの基準株であるＡＴＣＣ１９４３５Ｔのイソ吉草酸検出量が最も高く、Ｌｃ．ｌａｃｔｉｓ ＳＢＴ１２２０の３－メチルブタナール、３－メチル－１－ブタノールの検出量が最も高かった。一方で、Ｌｃ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ ＡＴＣＣ１９２５７Ｔ では、Ｌｃ．ｌａｃｔｉｓに見られるレベルのＬｅｕ由来成分の生成量は見られなかった。
（４－１）３－メチルブタナール、３－メチル―１－ブタノール、イソ吉草酸濃度の測定結果
反応開始４８時間後のプロピオン酸菌及び乳酸菌単体（＃１～＃１１）の３－メチルブタナール、３－メチル―１－ブタノール、イソ吉草酸濃度の相対値を図１Ａに示す。
横軸は、各成分における１１水準中で最もピーク面積が大きい水準を１００％とした相対値で表した。この結果から、プロピオン酸菌単体では、７菌株中でＰ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉの基準株であるＡＴＣＣ６２０７Ｔが最もイソ吉草酸の検出量が高かった。
また、Ｐ．ｓｈｅｒｍａｎｉｉ ＳＢＴ３１９７は、３－メチルブタナール及び３－メチル１－ブタノールの検出量が高く、ＳＢＴ３１９７以外のＰＡＢを用いた水準の平均値と比較して、約２３倍（３－メチルブタナール）、約３倍（３－メチル１－ブタノール）量検出された。
乳酸球菌単体での結果では、Ｌｃ．ｌａｃｔｉｓの基準株であるＡＴＣＣ１９４３５Ｔのイソ吉草酸検出量が最も高く、Ｌｃ．ｌａｃｔｉｓ ＳＢＴ１２２０の３－メチルブタナール、３－メチル－１－ブタノールの検出量が最も高かった。一方で、Ｌｃ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ ＡＴＣＣ１９２５７Ｔ では、Ｌｃ．ｌａｃｔｉｓに見られるレベルのＬｅｕ由来成分の生成量は見られなかった。
【0023】
（４－２）α－ＫＩＣ濃度の測定結果
反応液中のα－ＫＩＣの検出量を図２Ａに示す。α－ＫＩＣはＬｅｕ由来香気成分の前駆体であり、Ｌｅｕの脱アミノ化によって生じる化合物である。このことから、α－ＫＩＣ濃度が高いことは、α－ＫＩＣ以降の反応がＬｅｕ由来の香気成分生成反応の律速段階となっていると考えられ、逆にα－ＫＩＣ濃度が低いことは、α－ＫＩＣ生成反応である脱アミノ反応が律速段階となっていると予想される。
図２Ａからは、プロピオン酸菌においては総じて比較的α―ＫＩＣ濃度が高く、単体ではα－ＫＩＣ生成反応活性が高い一方で、それ以降の反応がＬｅｕ由来の香気成分生成反応の律速段階となっていると考えられた。その中でも特に、Ｐ．ｓｈｅｒｍａｎｉｉ ＳＢＴ３１９７がα－ＫＩＣ濃度が非常に高くなっており、α－ＫＩＣ生成反応活性が高い菌株であると考えられた。また、ラクトコッカス属の乳酸菌は比較的α－ＫＩＣ濃度が低く、α－ＫＩＣ生成反応がＬｅｕ由来の香気成分生成反応の律速段階となっていると考えられた。特にＬｃ．ｌａｃｔｉｓ ＳＢＴ１２２０及びＳＢＴ１２２３はα－ＫＩＣ濃度が低く、α－ＫＩＣ以降の反応活性が高いと考えられた。
反応液中のα－ＫＩＣの検出量を図２Ａに示す。α－ＫＩＣはＬｅｕ由来香気成分の前駆体であり、Ｌｅｕの脱アミノ化によって生じる化合物である。このことから、α－ＫＩＣ濃度が高いことは、α－ＫＩＣ以降の反応がＬｅｕ由来の香気成分生成反応の律速段階となっていると考えられ、逆にα－ＫＩＣ濃度が低いことは、α－ＫＩＣ生成反応である脱アミノ反応が律速段階となっていると予想される。
図２Ａからは、プロピオン酸菌においては総じて比較的α―ＫＩＣ濃度が高く、単体ではα－ＫＩＣ生成反応活性が高い一方で、それ以降の反応がＬｅｕ由来の香気成分生成反応の律速段階となっていると考えられた。その中でも特に、Ｐ．ｓｈｅｒｍａｎｉｉ ＳＢＴ３１９７がα－ＫＩＣ濃度が非常に高くなっており、α－ＫＩＣ生成反応活性が高い菌株であると考えられた。また、ラクトコッカス属の乳酸菌は比較的α－ＫＩＣ濃度が低く、α－ＫＩＣ生成反応がＬｅｕ由来の香気成分生成反応の律速段階となっていると考えられた。特にＬｃ．ｌａｃｔｉｓ ＳＢＴ１２２０及びＳＢＴ１２２３はα－ＫＩＣ濃度が低く、α－ＫＩＣ以降の反応活性が高いと考えられた。
【0024】
（５）考察
以上より、プロピオン酸菌、特にＰ．ｓｈｅｒｍａｎｉｉ ＳＢＴ３１９７とラクトコッカス属乳酸菌、特にＬｃ．ｌａｃｔｉｓ ＳＢＴ１２２３を組み合わせてチーズを製造することにより、Ｌｅｕ由来の３－メチルブタナール、３－メチル―１－ブタノール、イソ吉草酸について生成が促進されると推測された。
以上より、プロピオン酸菌、特にＰ．ｓｈｅｒｍａｎｉｉ ＳＢＴ３１９７とラクトコッカス属乳酸菌、特にＬｃ．ｌａｃｔｉｓ ＳＢＴ１２２３を組み合わせてチーズを製造することにより、Ｌｅｕ由来の３－メチルブタナール、３－メチル―１－ブタノール、イソ吉草酸について生成が促進されると推測された。
【0025】
〔試験例２〕プロピオン酸菌及び乳酸菌共存下でのＬｅｕ代謝活性試験
試験例１によりα－ＫＩＣ濃度が高かったプロピオン酸菌と各種の乳酸菌とを組み合わせたこと以外は試験例１と同様に、各香気成分の産生を測定した。
（１）３－メチルブタナール、３－メチル―１－ブタノール、イソ吉草酸濃度の測定結果
図１ＢにＰ．ｓｈｅｒｍａｎｉｉ ＳＢＴ３１９７とラクトコッカス属乳酸菌の共存下での３－メチルブタナール、３－メチル―１－ブタノール、イソ吉草酸の測定結果を示す。コントロールとして、Ｐ．ｓｈｅｒｍａｎｉｉ ＡＴＣＣ９６１４Ｔとラクトコッカス属乳酸菌の試験結果も示した。横軸は、各成分の１４水準中で最もピーク面積が大きい水準を１００％とした相対値で表した。乳酸菌単体では、Ｌｃ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ ＳＢＴ１９２５７Ｔの３成分の検出量は低く、Ｌｃ．ｌａｃｔｉｓの３株については、３－メチルブタナール、３－メチル１－ブタノールの検出量が高かった。
プロピオン酸菌と乳酸菌の共存効果についてはＰ．ｓｈｅｒｍａｎｉｉ ＳＢＴ３１９７とＬｃ．ｌａｃｔｉｓの組み合わせでは、３－メチルブタナール、３－メチル１－ブタノール及びイソ吉草酸の検出量が高く、Ｐ．ｓｈｅｒｍａｎｉｉ ＡＴＣＣ９６１４ＴとＬｃ．ｌａｃｔｉｓの組み合わせでは、３－メチル１－ブタノール及びイソ吉草酸の検出量がそれぞれの単体での反応時の和よりも検出量が高かった。
以上より、プロピオン酸菌とラクトコッカス属の乳酸菌の共存により３－メチルブタナール、３－メチル―１－ブタノール、イソ吉草酸の生成が促進されることが分かった。特にＰ．ｓｈｅｒｍａｎｉｉ ＳＢＴ３１９７とＬｃ．ｌａｃｔｉｓ ＳＢＴ１２２０またはＳＢＴ１２２３との組合せでは、コントロールであるＰ．ｓｈｅｒｍａｎｉｉ ＡＴＣＣ９６１４Ｔでの試験結果と比較し、３成分の検出量が顕著に高かった。
試験例１によりα－ＫＩＣ濃度が高かったプロピオン酸菌と各種の乳酸菌とを組み合わせたこと以外は試験例１と同様に、各香気成分の産生を測定した。
（１）３－メチルブタナール、３－メチル―１－ブタノール、イソ吉草酸濃度の測定結果
図１ＢにＰ．ｓｈｅｒｍａｎｉｉ ＳＢＴ３１９７とラクトコッカス属乳酸菌の共存下での３－メチルブタナール、３－メチル―１－ブタノール、イソ吉草酸の測定結果を示す。コントロールとして、Ｐ．ｓｈｅｒｍａｎｉｉ ＡＴＣＣ９６１４Ｔとラクトコッカス属乳酸菌の試験結果も示した。横軸は、各成分の１４水準中で最もピーク面積が大きい水準を１００％とした相対値で表した。乳酸菌単体では、Ｌｃ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ ＳＢＴ１９２５７Ｔの３成分の検出量は低く、Ｌｃ．ｌａｃｔｉｓの３株については、３－メチルブタナール、３－メチル１－ブタノールの検出量が高かった。
プロピオン酸菌と乳酸菌の共存効果についてはＰ．ｓｈｅｒｍａｎｉｉ ＳＢＴ３１９７とＬｃ．ｌａｃｔｉｓの組み合わせでは、３－メチルブタナール、３－メチル１－ブタノール及びイソ吉草酸の検出量が高く、Ｐ．ｓｈｅｒｍａｎｉｉ ＡＴＣＣ９６１４ＴとＬｃ．ｌａｃｔｉｓの組み合わせでは、３－メチル１－ブタノール及びイソ吉草酸の検出量がそれぞれの単体での反応時の和よりも検出量が高かった。
以上より、プロピオン酸菌とラクトコッカス属の乳酸菌の共存により３－メチルブタナール、３－メチル―１－ブタノール、イソ吉草酸の生成が促進されることが分かった。特にＰ．ｓｈｅｒｍａｎｉｉ ＳＢＴ３１９７とＬｃ．ｌａｃｔｉｓ ＳＢＴ１２２０またはＳＢＴ１２２３との組合せでは、コントロールであるＰ．ｓｈｅｒｍａｎｉｉ ＡＴＣＣ９６１４Ｔでの試験結果と比較し、３成分の検出量が顕著に高かった。
【0026】
（２）α－ＫＩＣ濃度の測定結果
図２Ｂにプロピオン酸菌とラクトコッカス属乳酸菌の共存下での反応液中のα－ＫＩＣの検出量を示す。その結果、Ｐ．ｓｈｅｒｍａｎｉｉとＬｃ．ｌａｃｔｉｓの共存によって、Ｐ．ｓｈｅｒｍａｎｉｉ単体で反応液中に蓄積していたα－ＫＩＣ濃度が低下していた。
このことから、比較的α－ＫＩＣ生成活性が高いプロピオン酸菌とα－ＫＩＣ以降の反応の活性が高いＬｃ．ｌａｃｔｉｓを組み合わせることで香気成分生成増強効果があることが分かった。特に、Ｐ．ｓｈｅｒｍａｎｉｉ ＳＢＴ３１９７とＬｃ．ｌａｃｔｉｓの組合せでは香気成分生成増強効果が顕著に高いと考えられた。
図２Ｂにプロピオン酸菌とラクトコッカス属乳酸菌の共存下での反応液中のα－ＫＩＣの検出量を示す。その結果、Ｐ．ｓｈｅｒｍａｎｉｉとＬｃ．ｌａｃｔｉｓの共存によって、Ｐ．ｓｈｅｒｍａｎｉｉ単体で反応液中に蓄積していたα－ＫＩＣ濃度が低下していた。
このことから、比較的α－ＫＩＣ生成活性が高いプロピオン酸菌とα－ＫＩＣ以降の反応の活性が高いＬｃ．ｌａｃｔｉｓを組み合わせることで香気成分生成増強効果があることが分かった。特に、Ｐ．ｓｈｅｒｍａｎｉｉ ＳＢＴ３１９７とＬｃ．ｌａｃｔｉｓの組合せでは香気成分生成増強効果が顕著に高いと考えられた。
【0027】
〔試験例３〕チーズの製造例１
（１）試験方法
Ｌｃ．ｌａｃｔｉｓ ＳＢＴ１２２３及びＰ．ｓｈｅｒｍａｎｉｉ ＳＢＴ３１９７を用いて以下の方法に従ってナチュラルチーズを製造した。
乳脂肪分２．８％となるように原料乳を調整し、７５℃、１５秒間殺菌した。次いで３０度に冷却し、塩化カルシウム（０．０１ｗ／ｗ％）を添加した。次にＰ．ｓｈｅｒｍａｎｉｉ及びＬｃ．ｌａｃｔｉｓ及びチーズ製造用の市販スターターを添加した。スターターの組合せを表４に示す。
これらのスターターの添加後、カーフレンネットを０．０２４ＩＭＣＵ／ｍＬとなるよう添加し、原料乳を凝固させた。この凝固物を直方体状にカッティングした後、攪拌しながら表４に示す温度（熟成前加温温度）でｐＨが６．４以下となるまで加温を行った後、ホエイを排出し型詰め、圧搾を行った。加塩を行った後、１０℃で６ヶ月間熟成を行い、以下に示す方法で香気成分の分析を行った。得られたチーズの水分は３９％、塩分は１．５％であった。
（１）試験方法
Ｌｃ．ｌａｃｔｉｓ ＳＢＴ１２２３及びＰ．ｓｈｅｒｍａｎｉｉ ＳＢＴ３１９７を用いて以下の方法に従ってナチュラルチーズを製造した。
乳脂肪分２．８％となるように原料乳を調整し、７５℃、１５秒間殺菌した。次いで３０度に冷却し、塩化カルシウム（０．０１ｗ／ｗ％）を添加した。次にＰ．ｓｈｅｒｍａｎｉｉ及びＬｃ．ｌａｃｔｉｓ及びチーズ製造用の市販スターターを添加した。スターターの組合せを表４に示す。
これらのスターターの添加後、カーフレンネットを０．０２４ＩＭＣＵ／ｍＬとなるよう添加し、原料乳を凝固させた。この凝固物を直方体状にカッティングした後、攪拌しながら表４に示す温度（熟成前加温温度）でｐＨが６．４以下となるまで加温を行った後、ホエイを排出し型詰め、圧搾を行った。加塩を行った後、１０℃で６ヶ月間熟成を行い、以下に示す方法で香気成分の分析を行った。得られたチーズの水分は３９％、塩分は１．５％であった。
【0028】
【表4】
【0029】
（２）試作品中の３－メチルブタナール、３－メチル－１－ブタノール、イソ吉草酸の分析方法
熟成６ヶ月目のサンプルを１０ｍＬバイアルに０．２ｇの分析サンプルを秤量し、ヘッドスペースを高純度窒素で置換した後、セプタム付きスクリューキャップで密栓をした。冷却機能付きサンプルトレイ（１０℃）に各バイアルをセットし、窒素ガスを用いた動的ヘッドスペース法により、対象成分を捕集剤（Ｔｅｎａｘ ＴＡ及びＣａｒｂｏｐａｃｋ Ｂ＆Ｘ／ＳｈｉｎｃａｒｂｏｎＸ）に捕集した。その後、捕集剤の対象成分を加熱脱着しＧＣ－ＭＳ（スキャンモード）測定を行った。ＧＣ－ＭＳのオーブン昇温条件は、４０℃－３分保持→２０℃／分→２５０℃・１０分保持し、測定を行った。得られたｍ／ｚ５８（３－メチルブタナール）、ｍ／ｚ７０（３－メチル－１－ブタノール）、ｍ／ｚ６０（イソ吉草酸）のイオンのピーク面積から標準添加法で各成分の濃度を定量した。
熟成６ヶ月目のサンプルを１０ｍＬバイアルに０．２ｇの分析サンプルを秤量し、ヘッドスペースを高純度窒素で置換した後、セプタム付きスクリューキャップで密栓をした。冷却機能付きサンプルトレイ（１０℃）に各バイアルをセットし、窒素ガスを用いた動的ヘッドスペース法により、対象成分を捕集剤（Ｔｅｎａｘ ＴＡ及びＣａｒｂｏｐａｃｋ Ｂ＆Ｘ／ＳｈｉｎｃａｒｂｏｎＸ）に捕集した。その後、捕集剤の対象成分を加熱脱着しＧＣ－ＭＳ（スキャンモード）測定を行った。ＧＣ－ＭＳのオーブン昇温条件は、４０℃－３分保持→２０℃／分→２５０℃・１０分保持し、測定を行った。得られたｍ／ｚ５８（３－メチルブタナール）、ｍ／ｚ７０（３－メチル－１－ブタノール）、ｍ／ｚ６０（イソ吉草酸）のイオンのピーク面積から標準添加法で各成分の濃度を定量した。
【0030】
（３）試験結果
３－メチルブタナール、３－メチル－１－ブタノール、イソ吉草酸の３成分のチーズ中の濃度を図３に示す。３－メチルブタナールは３１９７Ｌ水準で最も濃度が高く０．８ｐｐｍ損存在しており、プロピオン酸菌としてＰ．ｓｈｅｒｍａｎｉｉ ＡＴＣＣ９６１４Ｔを使用した９６１４Ｌと比較して２倍量以上存在していた。菌株の組合せが３１９７Ｌと同じで加温温度が高い３１９７ＬＨ水準についても同様に０．６ｐｐｍと高い濃度となった。
また、３－メチル１－ブタノールについては、３１９７Ｌ水準で４０ｐｐｍ以上検出され、最も濃度が高かった。
イソ吉草酸の濃度についても、３１９７Ｌ水準で８．１ｐｐｍ、３１９７ＬＨで７．１ｐｐｍと他の組み合わせに比べて高かった。
３－メチルブタナール、３－メチル－１－ブタノール、イソ吉草酸の３成分のチーズ中の濃度を図３に示す。３－メチルブタナールは３１９７Ｌ水準で最も濃度が高く０．８ｐｐｍ損存在しており、プロピオン酸菌としてＰ．ｓｈｅｒｍａｎｉｉ ＡＴＣＣ９６１４Ｔを使用した９６１４Ｌと比較して２倍量以上存在していた。菌株の組合せが３１９７Ｌと同じで加温温度が高い３１９７ＬＨ水準についても同様に０．６ｐｐｍと高い濃度となった。
また、３－メチル１－ブタノールについては、３１９７Ｌ水準で４０ｐｐｍ以上検出され、最も濃度が高かった。
イソ吉草酸の濃度についても、３１９７Ｌ水準で８．１ｐｐｍ、３１９７ＬＨで７．１ｐｐｍと他の組み合わせに比べて高かった。
【0031】
（考察）
これらの結果から、試験管試験での結果が実際のチーズにおいても再現されていることが確認された。
一方で、今回の結果から製造工程中の製造中加温攪拌工程における温度（熟成前加温温度）によっても香気成分の成分濃度が異なることが明らかとなった。これは中温性乳酸菌であるＬｃ．ｌａｃｔｉｓが高い温度の加温工程を経ることで減少するためであると考えられた。
これらの結果から、試験管試験での結果が実際のチーズにおいても再現されていることが確認された。
一方で、今回の結果から製造工程中の製造中加温攪拌工程における温度（熟成前加温温度）によっても香気成分の成分濃度が異なることが明らかとなった。これは中温性乳酸菌であるＬｃ．ｌａｃｔｉｓが高い温度の加温工程を経ることで減少するためであると考えられた。
【0032】
〔試験例４〕チーズの製造例２
（１）試験方法
前記チーズの製造例１で製造した３１９７Ｌと３１９７ＬＨを対象に熟成後の加温工程が香気成分量に及ぼす影響について検討した。
すなわち、チーズの製造例１と同様の方法で調製し、１０℃で６ヶ月熟成した３１９７Ｌと３１９７ＬＨに、さらに２０℃で２週間熟成する工程（熟成後加温工程）を追加し、熟成後の香気成分を測定した（図４）。
（１）試験方法
前記チーズの製造例１で製造した３１９７Ｌと３１９７ＬＨを対象に熟成後の加温工程が香気成分量に及ぼす影響について検討した。
すなわち、チーズの製造例１と同様の方法で調製し、１０℃で６ヶ月熟成した３１９７Ｌと３１９７ＬＨに、さらに２０℃で２週間熟成する工程（熟成後加温工程）を追加し、熟成後の香気成分を測定した（図４）。
【0033】
（２）試作品チーズ中の３－メチルブタナール、３－メチル－１－ブタノール、イソ吉草酸の分析結果
３１９７Ｌでは２０℃で２週間熟成する熟成後加温工程の追加により、３－メチルブタナール、３－メチル－１－ブタノール、イソ吉草酸の３成分すべてが増加した。特に、３－メチルブタナールは約５倍に増加した。一方、３１９７ＬＨでは、３－メチルブタナール、３－メチル－１－ブタノールは増加したものの、増加の程度は３１９７Ｌと比べて小さかった。また、イソ吉草酸の増加は認められなかった。
３１９７Ｌでは２０℃で２週間熟成する熟成後加温工程の追加により、３－メチルブタナール、３－メチル－１－ブタノール、イソ吉草酸の３成分すべてが増加した。特に、３－メチルブタナールは約５倍に増加した。一方、３１９７ＬＨでは、３－メチルブタナール、３－メチル－１－ブタノールは増加したものの、増加の程度は３１９７Ｌと比べて小さかった。また、イソ吉草酸の増加は認められなかった。
【0034】
（３）試作品チーズの風味評価
１０℃で６ヶ月熟成した３１９７Ｌ及び３１９７ＬＨ、並びに２０℃で２週間熟成の熟成後加温工程を追加して製造した３１９７Ｌ及び３１９７ＬＨを対象にナッツ様香に関する評価を行った。評価はチーズ開発に従事する担当者１０名で行った。
その結果、すべてのチーズでナッツ様香が感じられると評価された。また、ナッツ様香は３１９７ＬＨが最も弱く、３１９７ＬＨ（熟成後加温工程）、３１９７Ｌ、３１９７Ｌ（熟成後加温工程）の順に強くなり、チーズとしての風味も３１９７Ｌが好ましく、３１９７Ｌ（熟成後加温工程）が最も好ましかった。
１０℃で６ヶ月熟成した３１９７Ｌ及び３１９７ＬＨ、並びに２０℃で２週間熟成の熟成後加温工程を追加して製造した３１９７Ｌ及び３１９７ＬＨを対象にナッツ様香に関する評価を行った。評価はチーズ開発に従事する担当者１０名で行った。
その結果、すべてのチーズでナッツ様香が感じられると評価された。また、ナッツ様香は３１９７ＬＨが最も弱く、３１９７ＬＨ（熟成後加温工程）、３１９７Ｌ、３１９７Ｌ（熟成後加温工程）の順に強くなり、チーズとしての風味も３１９７Ｌが好ましく、３１９７Ｌ（熟成後加温工程）が最も好ましかった。
【0035】
（４）考察
以上から、スターターとしてＰ．ｓｈｅｒｍａｎｉｉ ＳＢＴ３１９７とＬｃ．ｌａｃｔｉｓ ＳＢＴ１２２３の組み合わせを含むものを使用し、熟成前加温工程を３５～４５℃程度にすることでナッツ様香が強く感じられ、風味も好ましいチーズが得られることがわかった。また、これに加え、熟成後加温工程を１５～２５℃程度で行うことで、さらにナッツ様香が強く感じられ、風味も好ましいチーズが得られることがわかった。
以上から、スターターとしてＰ．ｓｈｅｒｍａｎｉｉ ＳＢＴ３１９７とＬｃ．ｌａｃｔｉｓ ＳＢＴ１２２３の組み合わせを含むものを使用し、熟成前加温工程を３５～４５℃程度にすることでナッツ様香が強く感じられ、風味も好ましいチーズが得られることがわかった。また、これに加え、熟成後加温工程を１５～２５℃程度で行うことで、さらにナッツ様香が強く感じられ、風味も好ましいチーズが得られることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【0036】
本発明によればは、ナッツ様香を有する新規なナチュラルチーズ、及び該チーズの製造方法を提供することができる。
【受託番号】
【0037】
［寄託生物材料への言及］
（１）Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｓｈｅｒｍａｎｉｉ ＳＢＴ３１９７
イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター
日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８（郵便番号２９２－０８１８）
ロ イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
２０１９年７月８日
ハ イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＮＩＴＥ Ｐ－０３００１
（２）Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｌａｔｉｓ ＳＢＴ１２２０
イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター
日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８（郵便番号２９２－０８１８）
ロ イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
２０１９年７月８日
ハ イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＮＩＴＥ Ｐ－０３００２
（３）Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｌａｔｉｓ ＳＢＴ１２２３
イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター
日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８（郵便番号２９２－０８１８）
ロ イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
２０１９年７月８日
ハ イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＮＩＴＥ Ｐ－０３００３
（１）Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｓｈｅｒｍａｎｉｉ ＳＢＴ３１９７
イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター
日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８（郵便番号２９２－０８１８）
ロ イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
２０１９年７月８日
ハ イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＮＩＴＥ Ｐ－０３００１
（２）Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｌａｔｉｓ ＳＢＴ１２２０
イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター
日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８（郵便番号２９２－０８１８）
ロ イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
２０１９年７月８日
ハ イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＮＩＴＥ Ｐ－０３００２
（３）Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｌａｔｉｓ ＳＢＴ１２２３
イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター
日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８（郵便番号２９２－０８１８）
ロ イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
２０１９年７月８日
ハ イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＮＩＴＥ Ｐ－０３００３
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
