特許7493802ナス科植物における可食部への同化産物分配量の調節に関与する遺伝子及びその利用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-05-24
(45)【発行日】2024-06-03
(54)【発明の名称】ナス科植物における可食部への同化産物分配量の調節に関与する遺伝子及びその利用
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/04 20060101AFI20240527BHJP
C12Q 1/6895 20180101ALI20240527BHJP
C12Q 1/6827 20180101ALI20240527BHJP
A01H 5/08 20180101ALI20240527BHJP
A01H 6/82 20180101ALI20240527BHJP
A01H 1/02 20060101ALI20240527BHJP
C12N 15/29 20060101ALN20240527BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/04 ZNA
C12Q1/6895 Z
C12Q1/6827 Z
A01H5/08
A01H6/82
A01H1/02 Z
C12N15/29
【請求項の数】
7
(21)【出願番号】P 2021054293
(22)【出願日】2021-03-26
(65)【公開番号】P2022151296
(43)【公開日】2022-10-07
【審査請求日】2023-10-25
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２９年度、農林水産省「多数の遺伝子が関与する形質を改良する新しい育種技術の開発委託事業」、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】501203344
【氏名又は名称】国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構
(74)【代理人】
【識別番号】110000338
【氏名又は名称】弁理士法人 ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ
(72)【発明者】
【氏名】大山 暁男
(72)【発明者】
【氏名】林 武司
(72)【発明者】
【氏名】松尾 哲
(72)【発明者】
【氏名】宮武 宏治
【審査官】小倉 梢
(56)【参考文献】
【文献】Database UniProtKB/TrEMBL, [online], Accession No. A0A6N2BVH7，2020年12月02日，[2023年11月24日検索], インターネット<https://www.uniprot.org/uniprot/A0A6N2BVH7.txt?version=2>, 02-Dec-2020 uploaded
【文献】Database UniProtKB/TrEMBL, [online], Accession No. A0A2G3B9G7，2019年12月11日，[2023年11月24日検索], インターネット<https://www.uniprot.org/uniprot/A0A2G3B9G7.txt?version=9>, 11-Dec-2019 uploaded
【文献】Database UniProtKB/TrEMBL, [online], Accession No. M1BAW7，2021年02月10日，[2023年11月24日検索], インターネット<https://www.uniprot.org/uniprot/M1BAW7.txt?version=32>, 10-Feb-2021 uploaded
【文献】Theor. Appl. Genet.，2017年，Vol. 130，p. 1601-1616
【文献】Euphytica，2018年，Vol. 214: 210，p. 1-12
【文献】農業および園芸，2018年，Vol. 93(7)，pp. 626-631
【文献】育種学研究，2020年10月10日，Vol. 22，pp. 187
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｑ １／００ － １／７０
Ｃ１２Ｎ １５／００ － １５／９０
Ａ０１Ｈ １／００ － １／０８
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
トマトである植物における果実への同化産物分配量の調節の程度を判別する方法であって、前記植物において、下記（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸に置換又は欠失を引き起こす変異の有無を検査する工程を含み、
前記検査する工程において、
（ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質の８７０番目のアミノ酸に相当するアミノ酸がＥ（グルタミン酸）である；又は
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質の４０２番目のアミノ酸に相当するアミノ酸がＳ（セリン）である；
とき、当該植物は果実への同化産物分配量が増加した植物であると判定し、
前記（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸に相当するアミノ酸は、ホモロジー解析の方法に基づき、配列番号１又は２に示されるアミノ酸配列を基準配列として用いて、前記（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸に相当すると特定されたアミノ酸である、方法。
【請求項2】
前記検査する工程において、前記植物において、下記（ａ’’）又は（ｂ’’）であるとき：
（ａ’’）配列番号３の塩基配列における２６０９番目の塩基に相当する塩基がＡ；
（ｂ’’）配列番号４の塩基配列における１２０４番目の塩基に相当する塩基がＴ；
当該植物は果実への同化産物分配量が増加した植物であると判定し、
前記（ａ’’）又は（ｂ’’）の塩基に相当する塩基は、ホモロジー解析の方法に基づき、配列番号３又は配列番号４の塩基配列を基準配列として用いて、前記（ａ’’）又は（ｂ’’）の塩基に相当すると特定された塩基である、
請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記植物は、以下の（１）～（３）の何れかに記載のポリヌクレオチド：（１）配列番号１又は２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードしているポリヌクレオチド；
（２）配列番号１又は２に示すアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、前記植物の果実への同化産物分配量を調節する機能を有するタンパク質をコードしているポリヌクレオチド；
（３）配列番号１に示すアミノ酸配列に対して、１００個以下のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなるか、又は、配列番号２に示すアミノ酸配列に対して、４６個以下のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、前記植物の果実への同化産物分配量を調節する機能を有するタンパク質をコードしているポリヌクレオチド；
からなる同化産物分配量調節遺伝子を有する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記植物は、育種素材の候補植物であるか、育種のプロセスで得られた植物である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項5】
果実への同化産物分配量が増加したトマトである植物を製造する方法であって、果実への同化産物分配量が増加した前記植物と、他の前記植物とを種内交雑する交雑工程と、
前記交雑工程により得られた前記植物又はその後代系統の前記植物から、請求項１から４のいずれか１項に記載された方法によって、果実への同化産物分配量が増加した前記植物を識別する識別工程とを含む、製造方法。
【請求項6】
前記交雑工程の前に、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法により、被験植物から果実への同化産物分配量が増加した前記植物を識別する識別工程をさらに含む、請求項５に記載の製造方法。
【請求項7】
トマトである植物における、果実への同化産物分配量の調節に関する分子マーカーの使用であって、前記分子マーカーが、
下記（ａ’）又は（ｂ’）の塩基に相当する塩基自体（ＳＮＰ）か、当該塩基を含む連続したポリヌクレオチド：
（ａ’）配列番号３の塩基配列における２６０９番目の塩基に相当する塩基；
（ｂ’）配列番号４の塩基配列における１２０４番目の塩基に相当する塩基；からなり、
前記（ａ’）又は（ｂ’）の塩基に相当する塩基は、ホモロジー解析の方法に基づき、配列番号３又は配列番号４の塩基配列を基準配列として用いて、前記（ａ’）又は（ｂ’）の塩基に相当すると特定された塩基である、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ナス科植物における可食部への同化産物分配量の調節に関与する遺伝子及びその利用に関する。
【背景技術】
【0002】
種子、塊茎、果実などの農業生産物の収量は、その増減が収益と直結するため、農業経営上の重要な指標となっている。農業生産物の収量は、乾物生産量及び収穫物への乾物分配量（同化産物分配量）に比例する。そのため、乾物生産量又は同化産物分配量を増加させることで、農業生産物の収量を増加させることができる。
【0003】
農業生産物の収量を増大させる技術として、補光や資材の選択による光透過率の改善等の環境制御技術があるが、コストがかかる上に安定した収量増加を実現することが困難である。農業生産物の安定した収量増加を実現するために、植物を遺伝的に改変する技術が知られている。
【0004】
トマトのようなナス科の果菜植物の遺伝的改変に用いる遺伝子の候補として、非特許文献１及び２に記載された遺伝子が挙げられる。非特許文献１には、トマトにおいて、大玉品種と小玉品種との間の果実サイズの違いに関与する量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）である、第２染色体上のｆｗ２．２遺伝子について記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【文献】Frary et al. Science 289:85-88, 2000
【文献】Cong et al. Nat.Genet. 40:800-804, 2008
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
非特許文献１に記載されたｆｗ２．２の遺伝子は、大玉品種のトマトに普遍的に存在する遺伝子であり、小玉の野生種のトマトが栽培化・大玉化する過程で獲得された遺伝子であると推測されている。すなわち、ｆｗ２．２の遺伝子は、可食部への同化産物分配量の調節に関与するものではなく、細胞分裂の増大や子室数の増大であると考えられる。したがって、ｆｗ２．２の遺伝子は、植物の形態的変化をもたらすのみであり、可食部への同化産物分配量の様な収量性の改変には使用できない可能性が高い。
【0007】
イネ等では、種子への同化産物分配量の調節に関与する遺伝子が報告されている一方で、トマトでは可食部への同化産物分配量の調節に関与する遺伝子は知られていない。
【0008】
本発明は、上記課題に鑑みなされたものであり、その目的は、トマトを含むナス科の果菜植物において、可食部への同化産物分配量の調節に関与する遺伝子を同定し、その遺伝子の利用を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明の一態様に係る方法は、ナス科植物における可食部への同化産物分配量の調節の程度を判別する方法であって、ナス科植物において、下記（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸：（ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質の８７０番目のアミノ酸に相当するアミノ酸；（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質の４０２番目のアミノ酸に相当するアミノ酸；に置換又は欠失を引き起こす変異の有無を検査する工程を含む。
【0010】
本発明の一態様に係る製造方法は、可食部への同化産物分配量が増加したナス科植物を製造する方法であって、可食部への同化産物分配量が増加したナス科植物と、他のナス科植物とを種内交雑する交雑工程と、前記交雑工程により得られたナス科植物又はその後代系統のナス科植物から、上記いずれかの方法によって、可食部への同化産物分配量が増加したナス科植物を識別する識別工程とを含む。
【0011】
本発明の一態様に係る分子マーカーは、ナス科植物における、可食部への同化産物分配量の調節に関する分子マーカーであって、下記（ａ’）又は（ｂ’）の塩基に相当する塩基自体（ＳＮＰ）か、当該塩基を含む連続したポリヌクレオチド：（ａ’）ｔｆｗ．５．１遺伝子の翻訳開始点から２６０９番目の塩基に相当する塩基；（ｂ’）ｔｆｗ．５．１遺伝子の翻訳開始点から１２０４番目の塩基に相当する塩基；からなる。
【0012】
本発明の一態様に係る遺伝子は、ナス科植物の可食部への同化産物分配量の調節に関与する遺伝子であって、以下の（１）～（３）のいずれかに記載のポリヌクレオチド：（１）配列番号１又は２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードしているポリヌクレオチド；（２）配列番号１又は２に示すアミノ酸配列に対して、７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号１に示すアミノ酸配列における８７０番目のアミノ酸に相当するアミノ酸がＥ、又は、配列番号２に示すアミノ酸配列における４０２番目のアミノ酸に相当するアミノ酸がＳであって、ナス科植物の可食部への同化産物分配量を調節する機能を有するタンパク質をコードしているポリヌクレオチド；（３）配列番号１に示すアミノ酸配列に対して、３００個以下のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号１に示すアミノ酸配列における８７０番目のアミノ酸に相当するアミノ酸がＥ、又は、配列番号２に示すアミノ酸配列における４０２番目のアミノ酸に相当するアミノ酸がＳであって、ナス科植物の可食部への同化産物分配量を調節する機能を有するタンパク質をコードしているポリヌクレオチド；からなる。
【0013】
本発明の一態様に係るタンパク質は、上記ポリヌクレオチドによりコードされている。
【0014】
本発明の一態様に係る発現ベクターは、上記ポリヌクレオチドを含む。
【0015】
本発明の一態様に係る細胞は、上記ポリヌクレオチド又は上記発現ベクターを含む。
【0016】
本発明の一態様に係るナス科植物は、上記ポリヌクレオチド又は上記発現ベクターが組み込まれている。
【発明の効果】
【0017】
本発明の一態様によれば、ナス科植物における可食部への同化産物分配量を調節する遺伝子を用いて、可食部への同化産物分配量が増加したナス科植物を識別すること、及び、可食部への同化産物分配量が増加したナス科植物を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【発明を実施するための形態】
【0019】
本発明の実施の形態について説明すれば、以下の通りである。なお、本発明は、これに限定されるものではない。
【0020】
本明細書において、「ポリヌクレオチド」は、「核酸」又は「核酸分子」とも換言でき、ヌクレオチドの重合体を意図している。また、「塩基配列」は、「核酸配列」又は「ヌクレオチド配列」とも換言でき、特に言及しない限り、デオキシリボヌクレオチドの配列又はリボヌクレオチドの配列を意図している。本明細書において、「ポリペプチド」は、「タンパク質」とも換言できる。
【0021】
本明細書において、「同化産物」とは、「乾物」とも換言でき、光合成によって合成される糖などの有機化合物を意図している。本明細書において、「可食部」とは、植物において主に食用とされる部分であり、果菜においては食用の果実部分を意図しており、茎菜においては、食用の塊茎部分を意図している。本明細書において、「可食部への同化産物分配量の増加」とは、可食部に分配される同化産物の量が増加することを意図しており、特に、着果期又は茎部肥大期から収穫期までの間に、可食部に分配される同化産物の量が増加することを意図している。
【0022】
本明細書において、「ナス科植物」は、一例として、トマト、ジャガイモ、ナス、又はトウガラシである。
【0023】
本明細書において、「ナス」は、広義には、栽培種「ソラナム（以下、Ｓと称する）メロンゲナ（Solanum. melongena）」、並びに野生種「Ｓ．インカナム（S. incanum）」、「Ｓ．トルバム（S. torvum）」、「Ｓ．ニグラム（S. nigrum）」、「Ｓ．アエチオピカム（S. aethiopicum）」、「Ｓ．マクロカルポン（S. macrocarpon）」、及び「Ｓ．クイトエンセ（S. quitoense）」を含む概念であり、狭義には「Ｓ．メロンゲナ」を意図している。
【0024】
本明細書において、「トマト」は、広義には、栽培種「Ｓ．リコペルシクム（S. lycop
ersicum）」、並びに野生種「Ｓ．ケエスマニ（S. cheesmaniae）、Ｓ．チレンセ（S. chilense）、Ｓ．クミエレウスキイ（S. chmielewskii）、Ｓ．ガラパゲンセ（S. galapagense）、Ｓ．ハブロカイテス（S. habrochaites）、Ｓ．リコペルシコイデス（S. lycopersicoides）、Ｓ．ネオリキイ（S. neorickii）、Ｓ．ペネリ（S. pennellii）、Ｓ．ペルビアナム（S. peruvianum）、及びＳ．ピンピネリフォリウム（S. pimpinellifolium）を含む概念であり、狭義には「Ｓ．リコペルシクム」を意図している。
ersicum）」、並びに野生種「Ｓ．ケエスマニ（S. cheesmaniae）、Ｓ．チレンセ（S. chilense）、Ｓ．クミエレウスキイ（S. chmielewskii）、Ｓ．ガラパゲンセ（S. galapagense）、Ｓ．ハブロカイテス（S. habrochaites）、Ｓ．リコペルシコイデス（S. lycopersicoides）、Ｓ．ネオリキイ（S. neorickii）、Ｓ．ペネリ（S. pennellii）、Ｓ．ペルビアナム（S. peruvianum）、及びＳ．ピンピネリフォリウム（S. pimpinellifolium）を含む概念であり、狭義には「Ｓ．リコペルシクム」を意図している。
【0025】
本明細書において、「トウガラシ」は、広義には、栽培種「カプシカム（以下、Ｃと称する）・アニウム（Capsicum annuum）」、並びに野生種「Ｃ．プベッセンス（C. pubescens）」、「Ｃ．バッカータム（C. baccatum）」、「Ｃ．チネンセ（C. chinense）」、及び「Ｃ．フルテッセンス（C. frutescens）」を含む概念であり、狭義には「Ｃ．アニウム」を意図している。また、「トウガラシ」は、園芸作物の呼称として「ピーマン」、「パプリカ」および「シシトウ」など、「トウガラシ」以外の用語が用いられる上記の植物も含む概念である。
【0026】
本明細書において、「ジャガイモ」は、広義には、栽培種「Ｓ．トゥベローサム（S. tuberosum）」、並びに野生種「Ｓ．アカウレ（S. acaule）」、「Ｓ．スパルシピウム（S. sparsipilum）」、「Ｓ．レプトフィエス（S. leptophyes）」、及び「Ｓ．メジスタクロブム（S. megistacrobum）」を含む概念であり、狭義には「Ｓ．トゥベローサム」を意図している。
【0027】
〔１．可食部への同化産物分配量調節遺伝子〕
本発明の一態様に係る可食部への同化産物分配量調節遺伝子は、可食部への同化産物分配量を調節する活性（可食部への同化産物分配量調節活性）を有するタンパク質をコードする遺伝子である。タンパク質が可食部への同化産物分配量を正に調節する活性を有する場合、当該タンパク質が存在すれば、可食部への同化産物分配量が増加する。また、可食部への同化産物分配量調節遺伝子がコードするタンパク質の活性が低下しているか又は阻害されると、その活性が低下していないか又は阻害されていない植物よりも可食部への同化産物分配量が低減するか又は増加しない。
本発明の一態様に係る可食部への同化産物分配量調節遺伝子は、可食部への同化産物分配量を調節する活性（可食部への同化産物分配量調節活性）を有するタンパク質をコードする遺伝子である。タンパク質が可食部への同化産物分配量を正に調節する活性を有する場合、当該タンパク質が存在すれば、可食部への同化産物分配量が増加する。また、可食部への同化産物分配量調節遺伝子がコードするタンパク質の活性が低下しているか又は阻害されると、その活性が低下していないか又は阻害されていない植物よりも可食部への同化産物分配量が低減するか又は増加しない。
【0028】
可食部への同化産物分配量調節遺伝子の一例は、ナス科植物の可食部への同化産物分配量の調節に関与する遺伝子であって、以下の（１）～（３）のいずれかに記載のポリヌクレオチドからなる遺伝子である：
（１）配列番号１又は２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードしているポリヌクレオチド；
（２）配列番号１又は２に示すアミノ酸配列に対して、７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号１に示すアミノ酸配列における８７０番目のアミノ酸に相当するアミノ酸がＥ（グルタミン酸）、又は、配列番号２に示すアミノ酸配列における４０２番目のアミノ酸に相当するアミノ酸がＳ（セリン）であって、ナス科植物の可食部への同化産物分配量を調節する機能を有するタンパク質をコードしているポリヌクレオチド；
（３）配列番号１又は２に示すアミノ酸配列に対して、３００個以下のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号１に示すアミノ酸配列における８７０番目のアミノ酸に相当するアミノ酸がＥ、又は、配列番号２に示すアミノ酸配列における４０２番目のアミノ酸に相当するアミノ酸がＳであって、ナス科植物の可食部への同化産物分配量を調節する機能を有するタンパク質をコードしているポリヌクレオチド。
（１）配列番号１又は２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードしているポリヌクレオチド；
（２）配列番号１又は２に示すアミノ酸配列に対して、７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号１に示すアミノ酸配列における８７０番目のアミノ酸に相当するアミノ酸がＥ（グルタミン酸）、又は、配列番号２に示すアミノ酸配列における４０２番目のアミノ酸に相当するアミノ酸がＳ（セリン）であって、ナス科植物の可食部への同化産物分配量を調節する機能を有するタンパク質をコードしているポリヌクレオチド；
（３）配列番号１又は２に示すアミノ酸配列に対して、３００個以下のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号１に示すアミノ酸配列における８７０番目のアミノ酸に相当するアミノ酸がＥ、又は、配列番号２に示すアミノ酸配列における４０２番目のアミノ酸に相当するアミノ酸がＳであって、ナス科植物の可食部への同化産物分配量を調節する機能を有するタンパク質をコードしているポリヌクレオチド。
【0029】
上記（１）のポリヌクレオチドは、トマト由来のｔｆｗ．５．１遺伝子の塩基配列又はｔｆｗ．５．１遺伝子のコーディング領域（ＣＤＳ）の塩基配列を含み、可食部への同化産物分配量を調節するタンパク質をコードしているポリヌクレオチドである。また、上記（１）のポリヌクレオチドは、ナス科植物の上記ｔｆｗ.５．１遺伝子に対応する遺伝子の塩基配列又は当該遺伝子のＣＤＳの塩基配列を含み、可食部への同化産物分配量を調節するタンパク質をコードしているポリヌクレオチドであり得る。
【0030】
上記（２）のポリヌクレオチドに関して、アミノ酸配列の配列同一性は、７０％以上、７５％以上、８０％以上、又は、９０％以上であることが好ましく、９５％以上であることがより好ましく、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は、９９％以上であることが特に好ましい。例えば、トマトに由来する変異遺伝子、又は、トマト以外のナス科植物に由来する相同遺伝子（オーソログを含む）が、上記（２）のポリヌクレオチドの範疇に含まれる。これらの変異遺伝子や相同遺伝子は、ナス科植物の内在性（endogeneous)の遺伝子である。後述する〔４．ナス科植物における可食部への同化産物分配量の調節の程度を判別する方法〕の欄で検査がなされる分子マーカーは、これらの変異遺伝子や相同遺伝子上の分子マーカーでありうる。
【0031】
上記（３）のポリヌクレオチドに関して、配列番号１又は２のアミノ酸配列において、置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸の個数は、１～３００個であることが好ましく、１～２５０個、１～２００個、１～１５０個、又は１～１００個であることがより好ましく、１～５０個であることがさらに好ましく、１～２５個、１～１５個、１～１０個、１～５個、１～４個、１～３個、又は１～２個であることが特に好ましい。
【0032】
なお、可食部への同化産物分配量調節遺伝子が人工的に変異を導入した遺伝子を指す場合、上記「アミノ酸の置換、欠失、付加又は挿入」は、例えば、Ｋｕｎｋｅｌ法（Kunkel et al. (1985):Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 82, p488-）等の部位特異的突然変異誘発法、薬剤を用いた変異原処理、放射線（γ線、重イオンビーム等）の照射による変異誘発手法等を用いて人工的に変異を導入してもよいし、天然に存在する同様の変異ポリペプチドに由来するものであってもよい。
【0033】
可食部への同化産物分配量調節遺伝子は、ＲＮＡの形態（例えば、ｍＲＮＡ）、又は、ＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）で存在し得る。ＤＮＡは、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。可食部への同化産物分配量調節遺伝子の一例である、配列番号３に示す塩基配列は、配列番号１に示すポリペプチドをコードする遺伝子の完全長ｃＤＮＡである。また、可食部への同化産物分配量調節遺伝子の他の例である、配列番号４に示す塩基配列は、配列番号２に示すポリペプチドをコードする遺伝子の完全長ｃＤＮＡである。可食部への同化産物分配量調節遺伝子は、ｔｆｗ．５．１遺伝子のＣＤＳと共に、非翻訳領域（ＵＴＲ）の塩基配列等の付加的な配列を含むものであってもよい。
【0034】
可食部への同化産物分配量調節遺伝子を取得する（単離する）方法は、特に限定されるものではないが、例えば、可食部への同化産物分配量調節遺伝子の塩基配列の一部と特異的にハイブリダイズするプローブを調製し、ゲノムＤＮＡライブラリ又はｃＤＮＡライブラリをスクリーニングすればよい。
【0035】
また、可食部への同化産物分配量調節遺伝子を取得する方法として、ＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法を挙げることができる。例えば、可食部への同化産物分配量調節遺伝子のｃＤＮＡのうち、５’側及び３’側の配列（又はその相補配列）の中からそれぞれプライマーを調製し、これらプライマーを用いてゲノムＤＮＡ（又はｃＤＮＡ）等を鋳型にしてＰＣＲ等を行い、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することで、可食部への同化産物分配量調節遺伝子を含むＤＮＡ断片を大量に取得できる。
【0036】
可食部への同化産物分配量調節遺伝子の由来はナス科の植物である限り特に限定されないが、トマト、ジャガイモ、ナス、又はトウガラシの何れかであることが好ましく、トマトであることがより好ましい。
【0037】
なお、単離された可食部への同化産物分配量調節遺伝子の候補遺伝子が、所望する可食部への同化産物分配量を調節する活性を有するか否かは、由来する植物における当該候補遺伝子の発現によって、可食部への同化産物分配量の増加が誘導されるかを観察することによって評価することができる。
【0038】
可食部への同化産物分配量調節遺伝子は、ナス科植物における、可食部への同化産物分配量の増加機構の解明に利用することができる。また、可食部への同化産物分配量調節遺伝子は、その配列を発現ベクターに組み込む等して、ナス科植物の植物体又は細胞に導入することによって、形質転換体を作製するために用いることができる。可食部への同化産物分配量調節遺伝子が導入されたナス科植物を栽培することで、可食部への同化産物分配量が増加したナス科植物を得ることができる。
【0039】
可食部への同化産物分配量調節遺伝子として、トマトであるＳ．リコペルシクム由来のｔｆｗ．５．１遺伝子のＣＤＳの塩基配列である第１の遺伝子（配列番号３）又は第２の遺伝子（配列番号４）の塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。また、可食部への同化産物分配量調節遺伝子の範疇には、配列番号３又は４に示す塩基配列に対して、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５＆以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は、９９％以上の配列同一性を有し、可食部への同化産物分配量調節活性を有するポリヌクレオチドからなる遺伝子も含まれる。
【0040】
〔２．可食部への同化産物分配量調節タンパク質〕
本発明の一態様に係る可食部への同化産物分配量調節タンパク質は、上記〔１．可食部への同化産物分配量調節遺伝子〕欄に記載した遺伝子の翻訳産物であり、少なくとも可食部への同化産物分配量調節活性を有する。可食部への同化産物分配量調節タンパク質が、可食部への同化産物分配量を正に調節する活性を有する場合、当該タンパク質が存在すれば、可食部への同化産物分配量が増加する。可食部への同化産物分配量調節タンパク質が存在しない場合、可食部への同化産物分配量調節タンパク質が存在する場合よりも可食部への同化産物分配量が低減するか又は増加しない。
本発明の一態様に係る可食部への同化産物分配量調節タンパク質は、上記〔１．可食部への同化産物分配量調節遺伝子〕欄に記載した遺伝子の翻訳産物であり、少なくとも可食部への同化産物分配量調節活性を有する。可食部への同化産物分配量調節タンパク質が、可食部への同化産物分配量を正に調節する活性を有する場合、当該タンパク質が存在すれば、可食部への同化産物分配量が増加する。可食部への同化産物分配量調節タンパク質が存在しない場合、可食部への同化産物分配量調節タンパク質が存在する場合よりも可食部への同化産物分配量が低減するか又は増加しない。
【0041】
可食部への同化産物分配量調節タンパク質は、天然の供給源より単離されてもよいし、化学的に合成されてもよい。より具体的には、当該タンパク質は、天然の精製産物、化学的合成手順の産物、及び、原核生物宿主又は真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、及び哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって産生された翻訳産物をその範疇に含む。
【0042】
可食部への同化産物分配量調節タンパク質は、より具体的には、以下の（１’）～（３’）のいずれかに記載のタンパク質である：
（１’）配列番号１又は２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質；
（２’）配列番号１又は２に示すアミノ酸配列に対して、７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号１に示すアミノ酸配列における８７０番目のアミノ酸に相当するアミノ酸がＥ、又は、配列番号２に示すアミノ酸配列における４０２番目のアミノ酸に相当するアミノ酸がＳであって、ナス科植物の可食部への同化産物分配量を調節する機能を有するタンパク質；
（３’）配列番号１又は２に示すアミノ酸配列に対して、３００個以下のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号１に示すアミノ酸配列における８７０番目に相当するアミノ酸がＥ、又は、配列番号２に示すアミノ酸配列における４０２番目に相当するアミノ酸がＳであって、ナス科植物の可食部への同化産物分配量を調節する機能を有するタンパク質。
（１’）配列番号１又は２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質；
（２’）配列番号１又は２に示すアミノ酸配列に対して、７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号１に示すアミノ酸配列における８７０番目のアミノ酸に相当するアミノ酸がＥ、又は、配列番号２に示すアミノ酸配列における４０２番目のアミノ酸に相当するアミノ酸がＳであって、ナス科植物の可食部への同化産物分配量を調節する機能を有するタンパク質；
（３’）配列番号１又は２に示すアミノ酸配列に対して、３００個以下のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号１に示すアミノ酸配列における８７０番目に相当するアミノ酸がＥ、又は、配列番号２に示すアミノ酸配列における４０２番目に相当するアミノ酸がＳであって、ナス科植物の可食部への同化産物分配量を調節する機能を有するタンパク質。
【0043】
上記（１’）のタンパク質は、上記ｔｆｗ.５．１遺伝子、又は、ナス科植物における上記ｔｆｗ.５．１遺伝子に対応する遺伝子がコードするタンパク質であり、可食部への同化産物分配量調節活性を有するタンパク質である。
【0044】
上記（２’）のタンパク質に関して、アミノ酸配列の配列同一性は、７０％以上、７５％以上、８０％以上、又は９０％以上であることが好ましく、９５％以上であることがより好ましく、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は、９９％以上であることが特に好ましい。例えば、トマトに由来する変異タンパク質、又は、トマト以外のナス科植物に由来する相同タンパク質が、上記（２’）のタンパク質の範疇に含まれる。これらの変異タンパク質や相同タンパク質は、ナス科植物の内在性の遺伝子にコードされたタンパク質である。
【0045】
上記（３’）のタンパク質に関して、配列番号１又は２のアミノ酸配列において、置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸の個数は、１～３００個であることが好ましく、１～２５０個、１～２００個、１～１５０個、又は１～１００個であることがより好ましく、１～５０個であることがさらに好ましく、１～２５個、１～１５個、１～１０個、１～５個、１～４個、１～３個、又は１～２個であることが特に好ましい。
【0046】
可食部への同化産物分配量調節タンパク質は、アミノ酸がペプチド結合してなるポリペプチドであるが、ポリペプチド以外の構造を含むものであってもよい。ここでいうポリペプチド以外の構造としては、糖鎖やイソプレノイド基等を挙げることができるが、これに限定されない。
【0047】
なお、可食部への同化産物分配量調節タンパク質として、トマトであるＳ．リコペルシクム由来のタンパク質が挙げられる。また、可食部への同化産物分配量調節タンパク質として、ジャガイモ、ナス、又はトウガラシ由来のタンパク質が挙げられる。
【0048】
〔３．発現ベクター、細胞、及び形質転換体〕
本発明の一態様に係る可食部への同化産物分配量調節遺伝子が組み込まれた発現ベクター、当該発現ベクター又は可食部への同化産物分配量調節遺伝子を含む細胞、並びに、当該発現ベクター又は可食部への同化産物分配量調節遺伝子が発現可能に導入された形質転換体についても、本発明の範疇に含まれる。当該発現ベクターは、細胞又は生物個体に、可食部への同化産物分配量を調節する形質を付与するものである。
本発明の一態様に係る可食部への同化産物分配量調節遺伝子が組み込まれた発現ベクター、当該発現ベクター又は可食部への同化産物分配量調節遺伝子を含む細胞、並びに、当該発現ベクター又は可食部への同化産物分配量調節遺伝子が発現可能に導入された形質転換体についても、本発明の範疇に含まれる。当該発現ベクターは、細胞又は生物個体に、可食部への同化産物分配量を調節する形質を付与するものである。
【0049】
発現ベクターを構成するためのベクターの種類は特に限定されるものではなく、宿主細胞中で発現可能なものを適宜選択すればよい。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、適宜プロモータ配列を選択し、当該プロモータ配列と可食部への同化産物分配量調節遺伝子とを、例えば、プラスミド、ファージミド、またはコスミド等に組み込んだものを発現ベクターとして用いればよい。
【0050】
発現ベクターを導入する宿主細胞としては、例えば、細菌細胞、酵母細胞、酵母細胞以外の真菌細胞および高等真核細胞などが挙げられる。細菌細胞としては、例えば、大腸菌細胞が挙げられる。高等真核細胞としては、例えば、植物細胞および動物細胞が挙げられる。植物細胞としては、例えば、双子葉植物細胞および単子葉植物細胞が挙げられる。双子葉植物細胞としては、例えば、ナス科植物の懸濁培養細胞（例えば、タバコＢＹ－２株及びトマトＳｌｙ－１株）が挙げられる。単子葉植物細胞としては、例えば、イネの懸濁培養細胞であるＯｃ株などが挙げられる。動物細胞としては、昆虫細胞、両生類細胞、爬虫類細胞、鳥類細胞、魚類細胞、哺乳動物細胞などが挙げられる。
【0051】
発現ベクターにおいて可食部への同化産物分配量調節遺伝子は、転写に必要な要素（例えば、プロモータなど）が機能的に連結されている。また、必要に応じて、エンハンサー、選択マーカー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、及び５’－ＵＴＲ配列などを連結されていてもよい。プロモータは、宿主細胞において転写活性を示すＤＮＡ配列であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。
【0052】
宿主細胞内で作動可能なプロモータ配列としては、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモータ、アグロバクテリウムのノパリン合成酵素遺伝子プロモータ及びイネユビキチン遺伝子プロモータなどが挙げられる。また、組換え発現プロモータとしては、可食部への同化産物分配量調節遺伝子におけるプロモータ領域の配列を用いてもよい。
【0053】
発現ベクターにおいて、可食部への同化産物分配量調節遺伝子は、必要に応じて、適切なターミネータ（例えば、ＮＯＳターミネータ及びカリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓターミネータ）に機能的に結合されてもよい。適切なターミネータの種類は、宿主細胞の種類に応じて適宜選択すればよく、上述のプロモータにより転写された遺伝子の転写を終結できる配列であればよい。エンハンサーは、目的遺伝子の発現効率を高めるために用いられ、例えばタバコモザイクウイルスのオメガ配列が挙げられる。
【0054】
発現ベクターは、さらに選択マーカーを含有してもよい。選択マーカーとしては、例えば、アンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、ハイグロマイシン又はスペクチノマイシンのような薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。
【0055】
また、発現ベクターにおいて可食部への同化産物分配量調節遺伝子は、必要に応じて、好適なタンパク質精製用のタグ配列、または好適なスペーサー配列に結合されていてもよい。
【0056】
また、上記形質転換体とは、上記発現ベクター又は可食部への同化産物分配量調節遺伝子が発現可能に導入された細胞、組織および器官のみならず、生物個体を含む意味である。このような形質転換体は、ナス科植物であり得る。また、形質転換体は、例えば、大腸菌等の微生物、動物等であってもよい。
【0057】
〔４．ナス科植物における可食部への同化産物分配量の調節の程度を判別する方法〕
本発明の一態様に係るナス科植物における可食部への同化産物分配量の調節の程度を判別する方法（判別方法）は、ナス科植物において、可食部への同化産物分配量が増加していること又は増加していないことを判別する。判別方法は、ナス科植物において、可食部への同化産物分配量が増加した個体を判別するために使用することができる。判別方法は、ナス科植物のゲノムに存在する、可食部への同化産物分配量の決定に関与する遺伝子の遺伝子型を判定することで、可食部への同化産物分配量に基づいてナス科植物を判別する。なお、判別方法において、可食部への同化産物分配量の概念には、あるナス科植物個体の可食部への同化産物分配量が、他のナス科植物個体と比較して相対的に多い又は少ないことを表す同化産物分配量の程度が含まれる。
本発明の一態様に係るナス科植物における可食部への同化産物分配量の調節の程度を判別する方法（判別方法）は、ナス科植物において、可食部への同化産物分配量が増加していること又は増加していないことを判別する。判別方法は、ナス科植物において、可食部への同化産物分配量が増加した個体を判別するために使用することができる。判別方法は、ナス科植物のゲノムに存在する、可食部への同化産物分配量の決定に関与する遺伝子の遺伝子型を判定することで、可食部への同化産物分配量に基づいてナス科植物を判別する。なお、判別方法において、可食部への同化産物分配量の概念には、あるナス科植物個体の可食部への同化産物分配量が、他のナス科植物個体と比較して相対的に多い又は少ないことを表す同化産物分配量の程度が含まれる。
【0058】
ナス科植物、例えばトマトにおいては、可食部への同化産物分配量は、成長に伴って徐々に増加し、連続生産期にピークに達した後に一定になると考えられる（参考文献１：Saito et al. Hort. J. 89: 445-453, 2020を参照のこと）。すなわち、果房が着果し始めた又は茎部が肥大し始めた栽培初期は、可食部への同化産物分配量が少ない。したがって、特に、着果期又は茎部肥大期のような栽培初期における可食部への同化産物分配量を増加させることによって、収量を安定的に増加させることができる。
【0059】
ナス科植物は、育種素材の候補植物であるか、育種のプロセスで得られた植物であり得る。育種素材の候補植物としては、例えば、交配に用いる親植物、及び、遺伝子組換え技術を利用した分子育種に用いられる植物が含まれる。また、育種のプロセスで得られた植物としては、例えば、ナス科植物のトマト、ジャガイモ、ナス、又はトウガラシを種内交雑した植物、及びこれらの後代系統である。また、ナス科植物は、ある品種に属するトマトと他の品種に属するトマトとの交雑植物のように品種間交雑した植物、及びその後代系統であってもよい。さらに、ナス科植物は、可食部への同化産物分配量が増加していることが分かっている品種同士を交雑した植物、及びその後代系統であってもよい。また、ナス科植物は、可食部への同化産物分配量が増加していることが分かっている品種と、可食部への同化産物分配量が増加しているか不明な品種とを交雑した植物、及びその後代系統であってもよい。さらに、ナス科植物は、可食部への同化産物分配量が増加しているか不明な品種同士を交雑した植物、及びその後代系統であってもよい。また、ナス科植物は、可食部への同化産物分配量が増加していることが分かっている品種と、可食部への同化産物分配量が増加していないことが分かっている品種とを交雑した植物、及びその後代系統であってもよい。また、ナス科植物は、可食部への同化産物分配量が増加していることが分かっている個体同士を交雑した植物、及びその後代系統であってもよい。
【0060】
本明細書において、植物とは、植物体の一部又は全部であってもよい。植物体の一部としては、例えば、繁殖素材（例えば、葉、枝、種子等）等が挙げられる。
【0061】
判別方法は、以下に示すような分子マーカーを用いて、可食部への同化産物分配量調節遺伝子の変異の有無を検査することができる。このような分子マーカーについても、本発明の範疇に含まれる。
【0062】
分子マーカーは、ナス科植物において、下記（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸：
（ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質の８７０番目のアミノ酸に相当するアミノ酸；
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質の４０２番目のアミノ酸に相当するアミノ酸；
に置換又は欠失を引き起こす変異の有無を検出する分子マーカーである。
（ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質の８７０番目のアミノ酸に相当するアミノ酸；
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質の４０２番目のアミノ酸に相当するアミノ酸；
に置換又は欠失を引き起こす変異の有無を検出する分子マーカーである。
【0063】
配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質は、可食部への同化産物分配量調節遺伝子によりコードされたタンパク質であり、一例として、配列番号３に示す塩基配列からなる遺伝子によりコードされたタンパク質である。配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質は、可食部への同化産物分配量調節遺伝子によりコードされたタンパク質であり、一例として、配列番号４に示す塩基配列からなる遺伝子によりコードされたタンパク質である。
【0064】
配列番号１又は２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質は、基準となるトマト（Ｓ．リコペルシクム）由来のｔｆｗ．５．１遺伝子にコードされたタンパク質のアミノ酸配列からなる。ナス科植物においては、基準となるトマト由来のｔｆｗ．５．１遺伝子にコードされたタンパク質のアミノ酸配列に対して、上記（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸に相当する部分以外でもアミノ酸配列が異なる部分が含まれ得る。ナス科植物において、上記（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸に相当するアミノ酸の位置は、ホモロジー解析等の手法によって特定することができる。すなわち、ナス科植物の上記ｔｆｗ．５．１遺伝子に対応する遺伝子（すなわち植物間で高度に保存されている遺伝子が存在する場合）において、「（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸に相当するアミノ酸」とは、ホモロジー解析等の手法によって、（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸に相当するとされたアミノ酸を指す。
【0065】
なお、ホモロジー解析の方法としては、例えば、Needleman-Wunsch法やSmith-Waterman法等のPairwise Sequence Alignmentによる方法や、ClustalW法等のMultiple Sequence Alignmentによる方法が挙げられ、当業者であれば、これら方法に基づき、配列番号１又は２に示されるアミノ酸配列を基準配列として用いて、解析対象のアミノ酸配列中における「相当するアミノ酸」を理解することができる。
【0066】
ナス科植物における、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質の相同タンパク質及び（ａ）のアミノ酸に相当するアミノ酸の一例を示す。配列番号５に示すアミノ酸配列からなるピーマン（C. annuum. var. glabriusculum_1）のタンパク質において、（ａ）のアミノ酸に相当するアミノ酸は、８５０番目のアミノ酸である。配列番号７に示すアミノ酸配列からなるピーマン（C.Annuum_Zunla）のタンパク質において、（ａ）のアミノ酸に相当するアミノ酸は、８５０番目のアミノ酸である。配列番号９に示すアミノ酸配列からなるジャガイモ（PGSC0003DMC400027859）のタンパク質において、（ａ）のアミノ酸に相当するアミノ酸は、８７１番目のアミノ酸である。配列番号１１に示すアミノ酸配列からなるジャガイモ（Sotub05g017810.1.1）のタンパク質において、（ａ）のアミノ酸に相当するアミノ酸は、８７１番目のアミノ酸である。
【0067】
ナス科植物における、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質の相同タンパク質及び（ｂ）のアミノ酸に相当するアミノ酸の一例を示す。配列番号１３に示すアミノ酸配列からなるピーマン（C. annuum. var. glabriusculum_1）のタンパク質において、（ｂ）のアミノ酸に相当するアミノ酸は、４０２番目のアミノ酸である。配列番号１５に示すアミノ酸配列からなるピーマン（C.Annuum_Zunla）のタンパク質において、（ｂ）のアミノ酸に相当するアミノ酸は、４００番目のアミノ酸である。配列番号１７に示すアミノ酸配列からなるジャガイモ（PGSC0003DMC400056411）のタンパク質において、（ｂ）のアミノ酸に相当するアミノ酸は、４０１番目のアミノ酸である。配列番号１９に示すアミノ酸配列からなるジャガイモ（Sotub05g016440.1.1）のタンパク質において、（ｂ）のアミノ酸に相当するアミノ酸は、４０１番目のアミノ酸である。配列番号２１に示すアミノ酸配列からなるナス（SMEL_003g177800）のタンパク質において、（ｂ）のアミノ酸に相当するアミノ酸は、４３４番目のアミノ酸である。
【0068】
「（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸に相当するアミノ酸」は、一例として、（Ｉ）配列番号１又は２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質における（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸、（ＩＩ）配列番号１又は２に示すアミノ酸配列に対して、７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質における（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸に相当するアミノ酸、又は、（ＩＩＩ）配列番号１又は２に示すアミノ酸配列に対して、３００個以下のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質における（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸に相当するアミノ酸である。
【0069】
（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸に相当するアミノ酸に置換又は欠失を引き起こす変異の有無を検出する分子マーカーは、（ａ）及び（ｂ）の両方のアミノ酸に相当するアミノ酸に置換又は欠失を引き起こす変異の有無を検出するものであってもよい。
【0070】
分子マーカーの一例は、ナス科植物における、
（ａ’）ｔｆｗ．５．１遺伝子の翻訳開始点から２６０９番目の塩基に相当する塩基、又は、
（ｂ’）ｔｆｗ．５．１遺伝子の翻訳開始点から１２０４番目の塩基に相当する塩基自体（ＳＮＰ）か、当該塩基を含む連続したポリヌクレオチドである。すなわち、判別方法は、上記（ａ’）又は（ｂ’）の塩基に相当する塩基自体（ＳＮＰ）か、当該塩基を含む連続したポリヌクレオチドを、可食部への同化産物分配量の調節に関する分子マーカーとして検査する工程を含む。
（ａ’）ｔｆｗ．５．１遺伝子の翻訳開始点から２６０９番目の塩基に相当する塩基、又は、
（ｂ’）ｔｆｗ．５．１遺伝子の翻訳開始点から１２０４番目の塩基に相当する塩基自体（ＳＮＰ）か、当該塩基を含む連続したポリヌクレオチドである。すなわち、判別方法は、上記（ａ’）又は（ｂ’）の塩基に相当する塩基自体（ＳＮＰ）か、当該塩基を含む連続したポリヌクレオチドを、可食部への同化産物分配量の調節に関する分子マーカーとして検査する工程を含む。
【0071】
上記（ａ’）又は（ｂ’）の塩基に相当する塩基は、アミノ酸置換を引き起こすＳＮＰである。上記（ａ’）又は（ｂ’）の塩基に相当する塩基を分子マーカーとして用いることで、上記（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸に相当するアミノ酸に置換又は欠失を引き起こす変異の有無を検出することができる。一例として、上記（ａ’）のｔｆｗ．５．１遺伝子の翻訳開始点から２６０９番目の塩基に相当する塩基は、配列番号３の塩基配列における２６０９番目の塩基である。また、上記（ｂ’）のｔｆｗ．５．１遺伝子の翻訳開始点から１２０４番目の塩基に相当する塩基は、配列番号４の塩基配列における１２０４番目の塩基である。
【0072】
分子マーカーは、一例として、ＳＮＰマーカー、ＡＦＬＰ（分子増幅断片長多型）マーカー、ＲＦＬＰマーカー、マイクロサテライトマーカー、ＳＣＡＲマーカー、ＣＡＰＳマーカーである。
【0073】
上記（ａ’）及び（ｂ’）の塩基に相当する塩基自体、又は当該塩基を含む連続したポリヌクレオチドは、本実施例に記載されたＳＮＰマーカー又はこれと同一視できるＳＮＰマーカーである。ＳＮＰマーカーは、（ｉ）ＳＮＰに相当する塩基自体、（ｉｉ）ＳＮＰを含む連続したポリヌクレオチド、又は、（ｉｉｉ）２つのＳＮＰを含む連続したポリヌクレオチドであり得る。
【0074】
（ｉ：ＳＮＰマーカー）
ＳＮＰは、ＤＮＡの塩基配列中のある特定の領域内に一塩基の変異が見られるＤＮＡ多型を意味している。ＳＮＰマーカーにおいて、ＳＮＰは、トマト（Ｓ．リコペルシクム）のゲノム配列を基準とした一塩基多型である。基準植物であるトマト（Ｓ．リコペルシクム）のゲノム配列は、ｓｏｌｇｅｎｏｍｉｃｓ ＦＴＰサイト（ftp://ftp.solgenomics.net/genomes/Solanum_lycopersicum/annotation/ITAG4.1_release/)に公表されている。
ＳＮＰは、ＤＮＡの塩基配列中のある特定の領域内に一塩基の変異が見られるＤＮＡ多型を意味している。ＳＮＰマーカーにおいて、ＳＮＰは、トマト（Ｓ．リコペルシクム）のゲノム配列を基準とした一塩基多型である。基準植物であるトマト（Ｓ．リコペルシクム）のゲノム配列は、ｓｏｌｇｅｎｏｍｉｃｓ ＦＴＰサイト（ftp://ftp.solgenomics.net/genomes/Solanum_lycopersicum/annotation/ITAG4.1_release/)に公表されている。
【0075】
「（ａ’）及び（ｂ’）の塩基」とは、本実施例に記載されたＳＮＰマーカーである。「（ａ’）及び（ｂ’）の塩基に相当する塩基」とは、本実施例に記載されたＳＮＰマーカーと同一視できるＳＮＰマーカーである。「（ａ’）及び（ｂ’）の塩基」は、ｔｆｗ．５．１遺伝子上の変異である。ｔｆｗ．５．１遺伝子は、基準となるトマト（Ｓ．リコペルシクム）由来の塩基配列からなる。ナス科植物においては、基準となる塩基配列に対してＳＮＰ以外の部分でも塩基配列が異なる部分が含まれ得る。このＳＮＰマーカーが位置するゲノム上の領域は、多数のナス科植物間で保存されているため、ホモロジー解析等の手法によって、このＳＮＰマーカーを特定することができる。ホモロジー解析の手法としては、「相当するアミノ酸」を特定する場合と同様の手法を用いることができる。
【0076】
すなわち、他のナス科植物において、ｔｆｗ．５．１遺伝子に対応する遺伝子（すなわち植物間で高度に保存されている遺伝子）が存在する場合、「（ａ’）及び（ｂ’）の塩基に相当する塩基」とは、ホモロジー検索等の手法によって、（ａ’）及び（ｂ’）の塩基に相当するとされたｔｆｗ．５．１遺伝子に対応する遺伝子上の塩基を指す。例えば、後述する（ａ２’）及び（ｂ２’）に記載のポリヌクレオチドや、（ａ３’）及び（ｂ３’）に記載のポリヌクレオチドが、ｔｆｗ．５．１遺伝子に対応する遺伝子の一例である。
【0077】
ナス科植物における、配列番号３に示すｔｆｗ．５．１遺伝子のＣＤＳの塩基配列からなる遺伝子の相同遺伝子及び（ａ’）の塩基に相当する塩基の一例を示す。配列番号６に示す塩基配列からなるピーマン（C. annuum. var. glabriusculum_1）の遺伝子において、（ａ’）の塩基に相当する塩基は、２５４９番目の塩基である。配列番号８に示す塩基配列からなるピーマン（C.Annuum_Zunla）の遺伝子において、（ａ’）の塩基に相当する塩基は、２５４９番目の塩基である。配列番号１０に示す塩基配列からなるジャガイモ（PGSC0003DMC400027859）の遺伝子において、（ａ’）の塩基に相当する塩基は、２６１２番目の塩基である。配列番号１２に示す塩基配列からなるジャガイモ（Sotub05g017810.1.1）の遺伝子において、（ａ’）の塩基に相当する塩基は、２６１２番目の塩基である。
【0078】
ナス科植物における、配列番号４に示すｔｆｗ．５．１遺伝子のＣＤＳの塩基配列からなる遺伝子の相同遺伝子及び（ｂ’）の塩基に相当する塩基の一例を示す。配列番号１４に示す塩基配列からなるピーマン（C. annuum. var. glabriusculum_1）の遺伝子において、（ｂ’）の塩基に相当する塩基は、１２０４番目の塩基である。配列番号１６に示す塩基配列からなるピーマン（C.Annuum_Zunla）の遺伝子において、（ｂ’）の塩基に相当する塩基は、１１９８番目の塩基である。配列番号１８に示す塩基配列からなるジャガイモ（PGSC0003DMC400056411）の遺伝子において、（ｂ’）の塩基に相当する塩基は、１２０１番目の塩基である。配列番号２０に示す塩基配列からなるジャガイモ（Sotub05g016440.1.1）の遺伝子において、（ｂ’）の塩基に相当する塩基は、１２０１番目の塩基である。配列番号２２に示す塩基配列からなるナス（SMEL_003g177800）の遺伝子において、（ｂ’）の塩基に相当する塩基は、１３００番目の塩基である。
【0079】
分子マーカーは、上記の（ａ’）又は（ｂ’）のＳＮＰからなるＳＮＰマーカーである。このＳＮＰマーカーは、本発明者らが新たに同定したＳＮＰマーカーであり、当業者は、このＳＮＰマーカーのそれぞれのＳＮＰを表す塩基配列に基づき、当該ＳＮＰマーカーのゲノム上の位置を特定することができる。
【0080】
（ａ’）のＳＮＰ（以下、ＳＮＰ（ａ’）ともいう）は、ｔｆｗ．５．１遺伝子の翻訳開始点から２６０９番目の塩基又はこれに相当する塩基の多型を示している。また、（ｂ’）のＳＮＰ（以下、ＳＮＰ（ｂ’）ともいう）は、ｔｆｗ．５．１遺伝子の翻訳開始点から１２０４番目の塩基又はこれに相当する塩基の多型を示している。
【0081】
分子マーカーは、（ａ’’）ＳＮＰ（ａ’）がＡであるか、又は、（ｂ’’）ＳＮＰ（ｂ’）がＴであるとき、当該ナス科植物は可食部への同化産物分配量が増加していると判定することができる。また、分子マーカーは、ＳＮＰ（ａ’）及びＳＮＰ（ｂ’）をハプロタイプブロックとして解析することにより、ナス科植物における可食部への同化産物分配量を判定してもよい。ここで、ナス科植物は可食部への同化産物分配量が増加しているとは、あるナス科植物個体の可食部への同化産物分配量が、他のナス科植物個体と比較して相対的に多いことが意図される。
【0082】
（ｉｉ：ＳＮＰを含むポリヌクレオチド）
分子マーカーは、ＳＮＰ（ａ’）を含む連続したポリヌクレオチド（以下、ポリヌクレオチド（ａ’）ともいう）、又は、ＳＮＰ（ｂ’）を含む連続したポリヌクレオチド（以下、ポリヌクレオチド（ｂ’）ともいう）であってもよい。
分子マーカーは、ＳＮＰ（ａ’）を含む連続したポリヌクレオチド（以下、ポリヌクレオチド（ａ’）ともいう）、又は、ＳＮＰ（ｂ’）を含む連続したポリヌクレオチド（以下、ポリヌクレオチド（ｂ’）ともいう）であってもよい。
【0083】
ポリヌクレオチド（ａ’）は、（ａ１’）ｔｆｗ．５．１遺伝子の塩基配列において、ＳＮＰ（ａ’）を含む領域の塩基配列からなるポリヌクレオチド、（ａ２’）（ａ１’）のポリヌクレオチドの塩基配列において、ＳＮＰ（ａ’）以外の塩基配列に対して、１又は数個の塩基が置換、欠失、付加又は挿入された塩基配列からなり、ナス科植物における可食部への同化産物分配量を判定する機能を有するポリヌクレオチド、又は、（ａ３’）（ａ１’）のポリヌクレオチドの塩基配列において、ＳＮＰ（ａ’）以外の塩基配列に対して、９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、ナス科植物における可食部への同化産物分配量を判定する機能を有するポリヌクレオチドである。
【0084】
ポリヌクレオチド（ｂ’）は、（ｂ１’）ｔｆｗ．５．１遺伝子の塩基配列において、ＳＮＰ（ｂ’）を含む領域の塩基配列からなるポリヌクレオチド、（ｂ２’）（ｂ１’）のポリヌクレオチドの塩基配列において、ＳＮＰ（ｂ’）以外の塩基配列に対して、１又は数個の塩基が置換、欠失、付加又は挿入された塩基配列からなり、ナス科植物における可食部への同化産物分配量を判定する機能を有するポリヌクレオチド、又は、（ｂ３’）（ｂ１’）のポリヌクレオチドの塩基配列において、ＳＮＰ（ｂ’）以外の塩基配列に対して、９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、ナス科植物における可食部への同化産物分配量を判定する機能を有するポリヌクレオチドである。
【0085】
（ａ１’）及び（ｂ１’）のポリヌクレオチドは、例えば、ｔｆｗ．５．１遺伝子の塩基配列に基づき、可食部への同化産物分配量の増加したナス科植物（例えば、可食部への同化産物分配量の多いトマト（Ｓ．リコペルシクムのオランダＦ１品種）から得ることができる。
【0086】
（ａ２’）及び（ｂ２’）のポリヌクレオチドは、（ａ１’）及び（ｂ１’）のポリヌクレオチドの塩基配列において、ＳＮＰ（ａ’）及び（ｂ’）に相当する塩基は保存され、それ以外の塩基配列に、数個（例えば１～１０個、好ましくは１～５個、より好ましくは１、２または３個）の塩基の修飾（置換、欠失、挿入または付加）を含むものであり得る。このようなポリヌクレオチドの塩基配列は、当該技術分野における当業者にとって明らかであり、上述したデータベースに登録されているトマト（Ｓ．リコペルシクム）のゲノム配列を参照することにより、又は、可食部への同化産物分配量の多いナス科植物のゲノム上におけるＳＮＰの近傍領域の塩基配列を解読することにより、決定することができる。
【0087】
（ａ３’）及び（ｂ３’）のポリヌクレオチドは、（ａ１’）及び（ｂ１’）のポリヌクレオチドの塩基配列において、ＳＮＰ（ａ’）及び（ｂ’）に相当する塩基は保存され、それ以外の塩基配列に対して、例えば、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の同一性を有するものであり得る。このような塩基配列の同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等の解析ソフトウェアを用いて、２つの塩基配列をアライメントすることによって決定することができる。
【0088】
（ａ’’）ポリヌクレオチド（ａ’）におけるＳＮＰ（ａ’）に相当する塩基がＡであるか、又は、（ｂ’’）ポリヌクレオチド（ｂ’）におけるＳＮＰ（ｂ’）に相当する塩基がＴであるときに、当該ナス科植物は可食部への同化産物分配量が増加していると判定することができる。分子マーカーは、ポリヌクレオチド（ａ’）及び（ｂ’）をハプロタイプブロックとして解析することにより、ナス科植物は可食部への同化産物分配量を判定してもよい。
【0089】
（ｉｉｉ：２つのＳＮＰを含むポリヌクレオチド）
分子マーカーは、ＳＮＰ（ａ’）及びＳＮＰ（ｂ’）を含む連続したポリヌクレオチド（以下、ポリヌクレオチド（ｃ’）ともいう）であってもよい。ポリヌクレオチド（ｃ’）は、ＳＮＰ（ａ’）とＳＮＰ（ｂ’）との部位間の領域を、ＳＮＰ（ａ’）及びＳＮＰ（ｂ’）の部位と共に含んでいる。ポリヌクレオチド（ｃ’）は、例えば、可食部への同化産物分配量が増加したナス科植物における対応するＳＮＰ（ａ’）及びＳＮＰ（ｂ’）の部位間の領域を参照することで得られる。ポリヌクレオチド（ｃ’）の塩基配列は、可食部への同化産物分配量が増加したナス科植物の塩基配列と少なくとも部分的に一致する。
分子マーカーは、ＳＮＰ（ａ’）及びＳＮＰ（ｂ’）を含む連続したポリヌクレオチド（以下、ポリヌクレオチド（ｃ’）ともいう）であってもよい。ポリヌクレオチド（ｃ’）は、ＳＮＰ（ａ’）とＳＮＰ（ｂ’）との部位間の領域を、ＳＮＰ（ａ’）及びＳＮＰ（ｂ’）の部位と共に含んでいる。ポリヌクレオチド（ｃ’）は、例えば、可食部への同化産物分配量が増加したナス科植物における対応するＳＮＰ（ａ’）及びＳＮＰ（ｂ’）の部位間の領域を参照することで得られる。ポリヌクレオチド（ｃ’）の塩基配列は、可食部への同化産物分配量が増加したナス科植物の塩基配列と少なくとも部分的に一致する。
【0090】
上述した分子マーカーを用いて、ナス科植物における可食部への同化産物分配量を判定する方法としては特に限定されず、例えば、ＳＮＰを検出する公知のＳＮＰ分析方法を用いることができる。このような公知のＳＮＰ分析方法には、ナス科植物の被検体のＰＣＲ増幅断片中のＳＮＰを検出することによりＳＮＰ分析する方法が含まれる。
【0091】
判別方法は、分子マーカーを含む領域を増幅するプライマーセットを用いて、ナス科植物のＤＮＡにおける前記領域を増幅してもよい。このようなプライマーセットは、一例として、ＳＮＰ（ａ’）及びＳＮＰ（ｂ’）の少なくとも一方を含む領域を増幅するプライマーセットである。
【0092】
ナス科植物の被検体のＤＮＡにおける前記領域の増幅は、ナス科植物の被検体から抽出したＤＮＡを鋳型にして、ＳＮＰを含む領域を増幅するプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により行うことができる。そして、得られた増幅断片におけるＳＮＰの塩基（遺伝子型）を決定し、決定された塩基（遺伝子型）とナス科植物における可食部への同化産物分配量との関係を示すデータに基づいて、ナス科植物における可食部への同化産物分配量を判定する。
【0093】
ＰＣＲにおいて用いるプライマーセットは、標的のＳＮＰを含む領域のＤＮＡ断片を増幅することができるものである限り、特に限定されず、増幅断片の長さが短くなるようにプライマーセットを設計してもよい。例えば、プライマー増幅断片の長さが、好ましくは、７００塩基対（ｂｐ）以下、２００ｂｐ以下、１５０ｂｐ以下、１２０ｂｐ以下、又は１００ｂｐ以下となるようにプライマーセットを設計する。プライマーセットは、フォワードプライマーである第１のプライマーと、リバースプライマーである第２のプライマーとが含まれる。これらのプライマーの長さは、例えば、１５ｂｐ以上、１６ｂｐ以上、１７ｂｐ以上、１８ｂｐ以上、または１９ｂｐ以上であってもよく、５０塩基ｂｐ以下、４０ｂｐ以下、または３０ｂｐ以下であってもよい。
【0094】
ＳＮＰ（ａ’）を含む領域を増幅するプライマーセットは、例えば、配列番号２３に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１のプライマーと、配列番号２４に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２のプライマーとからなる、プライマーセットである。このプライマーセットを用いることで、可食部への同化産物分配量が増加したナス科植物においては、配列番号２５に示す塩基配列からなるＰＣＲ増幅産物が得られ、ＳＮＰ（ａ’）に相当する塩基を検出することができる。
【0095】
ＳＮＰ（ｂ’）を含む領域を増幅するプライマーセットは、例えば、配列番号２６に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第３のプライマーと、配列番号２７に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第４のプライマーとからなる、プライマーセットである。このプライマーセットを用いることで、可食部への同化産物分配量が増加したナス科植物においては、配列番号２８に示す塩基配列からなるＰＣＲ増幅産物が得られ、ＳＮＰ（ｂ’）に相当する塩基を検出することができる。
【0096】
ＳＮＰ分析におけるＰＣＲは、単独のプライマーセットを含む反応系でＤＮＡ断片を増幅するシングルプレックスＰＣＲ、または、複数のプライマーセットを含む反応系で遺伝子増幅するマルチプレックスＰＣＲ、のいずれであってもよい。マルチプレックスＰＣＲの場合は、異なる波長を有する蛍光物質（例えば、ＮＥＤ、６－ＦＡＭ、ＶＩＣ、ＰＥＴ）により標識したプライマーセットを混合してもよい。
【0097】
ＰＣＲの反応条件は、用いるＤＮＡポリメラーゼおよびＰＣＲ装置の種類、増幅断片の長さ等に応じて適宜に設定され得る。サイクル条件としては、変性工程、アニーリング工程および伸長工程の３工程を１サイクルとする３ステップＰＣＲ法、および、変性工程とアニーリングおよび伸長工程との２工程を１サイクルとする２ステップＰＣＲ法を適用することができる。ＰＣＲ反応条件の一例としては、９０～１００℃で４０～６０秒（例えば、９５℃で５０秒）、次いで、９０～１００℃（例えば、９５℃）で５秒、アニーリング１０～２０秒（例えば、１５秒）、及び６５～８０℃で１０～３０秒（例えば、７２℃で２０秒）の３０～６０サイクル（例えば、４０サイクル）などである。アニーリング温度は、６０～７０℃（例えば、６６℃）の初期アニーリング温度から５０～６０℃（例えば、５６℃）の最終アニーリング温度まで、所定サイクル毎に段階的に低下させる条件が挙げられる。鋳型となるＤＮＡの状態に応じて、ＳＮＰを安定的に検出するために、ＰＣＲ反応条件を調整してもよい。
【0098】
ＳＮＰ分析におけるＰＣＲとして、ＰＣＲによる増幅およびＳＮＰマーカーの特定を行うＴａｑＭａｎ（登録商標）－ＰＣＲ法、Ｔｍ－ｓｈｉｆｔジェノタイピング法（Fukuoka et al., Breed Sci 58:461-464, 2008）のようなリアルタイムＰＣＲを用いてもよい。すなわち、プライマーセットを用いて増幅した増幅断片に含まれるＳＮＰを検出するＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブをさらに用いてもよい。リアルタイムＰＣＲ法を用いることにより、高処理能力の判別方法を提供することができる。なお、ＰＣＲにより増幅した増幅断片においてＳＮＰを特定する方法としては、自動ＤＮＡシークエンサー等を用いて増幅断片の塩基配列を決定することにより、解析してもよい。
【0099】
ナス科植物の被検体から、ＰＣＲにより増幅するＤＮＡを抽出する方法としては、特に限定されず、公知のＤＮＡ抽出方法を用いることができる。また、市販のＤＮＡ抽出キットを用いて、ＤＮＡを抽出してもよい。被検体の種類および夾雑物の量等に応じて、ＤＮＡ抽出工程の前に、適宜に前処理を行ってもよい。また、被検体から抽出されたＤＮＡは、ＰＣＲ反応において鋳型として用いるために、必要に応じて洗浄または精製してもよい。さらに、被検体から抽出されたＤＮＡを２種類の制限酵素で消化した制限酵素切断断片をＰＣＲにより増幅してもよい。
【0100】
また、ナス科植物における可食部への同化産物分配量を判定する方法においては、ＳＮＰ（ａ’）及びＳＮＰ（ｂ’）と連鎖不平衡状態にある遺伝子多型を分析し、ＳＮＰ（ａ’）及びＳＮＰ（ｂ’）を同定してもよい。上記連鎖不平衡状態は、一例として、連鎖不平衡係数が０．９以上の連鎖不平衡状態である。
【0101】
判別方法によれば、分子マーカーにより、被験ナス科植物が、可食部への同化産物分配量が増加しているか否かを判定することができる。したがって、判定結果に基づき可食部への同化産物分配量が増加したナス科植物及びその後代系統を選抜することができる。
【0102】
〔５．可食部への同化産物分配量が増加したナス科植物〕
本発明の一態様に係る可食部への同化産物分配量が増加したナス科植物は、後述する製造方法によって得られる植物である。可食部への同化産物分配量が増加したナス科植物は、上述した分子マーカーで特定される上述したＳＮＰを有し、可食部への同化産物分配量が増加した植物である。
本発明の一態様に係る可食部への同化産物分配量が増加したナス科植物は、後述する製造方法によって得られる植物である。可食部への同化産物分配量が増加したナス科植物は、上述した分子マーカーで特定される上述したＳＮＰを有し、可食部への同化産物分配量が増加した植物である。
【0103】
本発明の一態様に係る可食部への同化産物分配量が増加したナス科植物は、後述する製造方法に示すように、可食部への同化産物分配量が増加したナス科植物と、他のナス科植物とを交雑して得られた植物及びその後代系統から、上述した分子マーカーを用いて可食部への同化産物分配量が増加したナス科植物を判別することで得られる。なお、上述したＳＮＰを有するように遺伝子工学的に改変した、可食部への同化産物分配量が増加したナス科植物についても、本発明の範疇に含まれる。
【0104】
〔６．可食部への同化産物分配量が増加したナス科植物を製造する方法〕
本発明の一態様に係る製造方法は、可食部への同化産物分配量が増加したナス科植物を製造する方法であって、可食部への同化産物分配量が増加したナス科植物と、他のナス科植物とを種内交雑する交雑工程と、前記交雑工程により得られたナス科植物又はその後代系統のナス科植物から、上述した判別方法によって、可食部への同化産物分配量が増加したナス科植物を識別する識別工程とを含む。
本発明の一態様に係る製造方法は、可食部への同化産物分配量が増加したナス科植物を製造する方法であって、可食部への同化産物分配量が増加したナス科植物と、他のナス科植物とを種内交雑する交雑工程と、前記交雑工程により得られたナス科植物又はその後代系統のナス科植物から、上述した判別方法によって、可食部への同化産物分配量が増加したナス科植物を識別する識別工程とを含む。
【0105】
したがって、上述した分子マーカー、可食部への同化産物分配量が増加したナス科植物、及び、ナス科植物における可食部への同化産物分配量の調節の程度を判別する方法に関する説明を、可食部への同化産物分配量が増加したナス科植物を製造する方法の説明に援用する。
【0106】
交雑工程において、親植物として使用する可食部への同化産物分配量が増加したナス科植物は、本発明の一態様に係る可食部への同化産物分配量が増加したナス科植物であり得る。また、交雑工程において用いる可食部への同化産物分配量が増加したナス科植物は、本発明の一態様に係るナス科植物における可食部への同化産物分配量の調節の程度を判別する方法により選抜された可食部への同化産物分配量が増加したナス科植物であってもよい。すなわち、本発明の一態様に係る製造方法は、前記交雑工程の前に、本発明の一態様に係るナス科植物における可食部への同化産物分配量の調節の程度を判別する方法により、被験ナス科植物から可食部への同化産物分配量が増加したナス科植物を識別する識別工程をさらに含み得る。
【0107】
識別工程は、本発明の一態様に係るナス科植物における可食部への同化産物分配量の調節の程度を判別する方法により、交雑工程により得られたナス科植物又はその後代系統のナス科植物から、可食部への同化産物分配量が増加したナス科植物を識別する。
【0108】
本発明の一態様に係る製造方法によれば、分子マーカーによりナス科植物において可食部への同化産物分配量の調節の程度を判定し、判定結果に基づき選抜した可食部への同化産物分配量が増加したナス科植物を製造することができる。
【0109】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【0110】
〔材料及び方法〕
（組換え型自殖系統の構築）
高収量ビーフステーキ型オランダＦ１品種「Ｇｅｒｏｎｉｍｏ」及び高糖度の大玉日本Ｆ１品種「Ｍｏｍｏｔａｒｏ８」を交雑親として用いた。植物は全て三重県津市の農研機構野菜花き研究部門にある温室内の土が入ったポット中で栽培した。この交雑は四元交雑に相当し、２つのＦ１品種（Ｇ１世代）の４つの親系統を祖先（Ｇ０世代）としている。図１は、２つのＦ１品種の交配に由来する組換え型自殖系統の構築及びそのＱＴＬマッピングの概要を説明する図である。図１に示すように、「Ｇｅｒｏｎｉｍｏ」（Ｐ１；Ｇ１）及び「Ｍｏｍｏｔａｒｏ８」（Ｐ２；Ｇ１）を、２４０株からなる四元Ｆ１群（Ｇ１Ｆ１）を生成するために交配した。ついで、各Ｇ１Ｆ１植物からの単粒系統法による自殖の繰り返しにより、四元組換え型自殖系統を育成した。Ｇ１Ｆ６世代の２０６の組換え型自殖系統を得、これらの農業形質を評価するために、自殖によってそれらを維持した。これら系統をＧＭ系統と称した。
（組換え型自殖系統の構築）
高収量ビーフステーキ型オランダＦ１品種「Ｇｅｒｏｎｉｍｏ」及び高糖度の大玉日本Ｆ１品種「Ｍｏｍｏｔａｒｏ８」を交雑親として用いた。植物は全て三重県津市の農研機構野菜花き研究部門にある温室内の土が入ったポット中で栽培した。この交雑は四元交雑に相当し、２つのＦ１品種（Ｇ１世代）の４つの親系統を祖先（Ｇ０世代）としている。図１は、２つのＦ１品種の交配に由来する組換え型自殖系統の構築及びそのＱＴＬマッピングの概要を説明する図である。図１に示すように、「Ｇｅｒｏｎｉｍｏ」（Ｐ１；Ｇ１）及び「Ｍｏｍｏｔａｒｏ８」（Ｐ２；Ｇ１）を、２４０株からなる四元Ｆ１群（Ｇ１Ｆ１）を生成するために交配した。ついで、各Ｇ１Ｆ１植物からの単粒系統法による自殖の繰り返しにより、四元組換え型自殖系統を育成した。Ｇ１Ｆ６世代の２０６の組換え型自殖系統を得、これらの農業形質を評価するために、自殖によってそれらを維持した。これら系統をＧＭ系統と称した。
【0111】
（ＧＭ系統の栽培と２つの場所における表現型の評価）
三重県において、２０１０年から２０１３年の７月３０日から８月１９日の間に、ＧＭ系統の種子を、土の入った育苗トレーに播種した（Ｆ７、Ｆ９、Ｆ１０世代の秋作栽培、実験３～６）。また、２０１１年及び２０１２年の２月１日又は２月２日にＧＭ系統の種子を播種し、Ｆ８及びＦ１０世代の春作栽培を行った（実験１及び２）。育苗箱を３週間温室内に置いた後、全ての植物（１実験当たり１系統当たり１植物）をロックウールスラブに直接植え付けた（栽植密度２．３０３／ｍ２）。全ての植物を１６度以上の温室内において、電気伝導度（ＥＣ）２．８ｍＳ／ｃｍの培養液（大塚化学製）を施与し、栽培した。１果房当たりの最大の花の数を６に制限し、第３果房（実験３）又は第４果房（実験１、２及び４～６）の上で摘心した。
三重県において、２０１０年から２０１３年の７月３０日から８月１９日の間に、ＧＭ系統の種子を、土の入った育苗トレーに播種した（Ｆ７、Ｆ９、Ｆ１０世代の秋作栽培、実験３～６）。また、２０１１年及び２０１２年の２月１日又は２月２日にＧＭ系統の種子を播種し、Ｆ８及びＦ１０世代の春作栽培を行った（実験１及び２）。育苗箱を３週間温室内に置いた後、全ての植物（１実験当たり１系統当たり１植物）をロックウールスラブに直接植え付けた（栽植密度２．３０３／ｍ２）。全ての植物を１６度以上の温室内において、電気伝導度（ＥＣ）２．８ｍＳ／ｃｍの培養液（大塚化学製）を施与し、栽培した。１果房当たりの最大の花の数を６に制限し、第３果房（実験３）又は第４果房（実験１、２及び４～６）の上で摘心した。
【0112】
愛知県において、Ｆ１０世代のＧＭ系統の種子を２０１２年８月２７日（実験７）及び２０１３年８月２８日（実験８）に上記と同様に播種した。実生を、２５℃（昼）／２０℃（夜）、ＣＯ２濃度９００又は１０００ｐｐｍ、日長１６時間の条件で、生育チャンバ内に置いて培養液（ＥＣ＝１．８ｍＳ／ｃｍ、三菱ケミカルアグリドリーム社製）を施与し栽培した。３週間後、全ての植物（１実験当たり１系統当たり２植物）をロックウールスラブ中に直接植え付けた（栽植密度３．０８６／ｍ２）。全ての植物を１３℃以上の温室内において、ＥＣ＝０．８～１．８ｍＳ／ｃｍ（実験７）、又は、ＥＣ＝１．５～２．０ｍＳ／ｃｍ（実験８）の培養液（大塚化学社製）を施与し、栽培した。植物は、第４果房上で摘心した。
【0113】
２～１０の形質の表現型を、三重県においては１系統当たり１植物、又は、愛知県においては１系統当たり２植物から収集した。生育特性、収量、及び果実の質に関連する形質の表現型を、各ＧＭ系統植物において測定した。赤く熟した市場価値のある果実における糖度を、糖度計（ＰＡＬ－１）を用いて測定した。しり腐れ又はひび割れのようないずれの生理障害も生じていない果実を良果として定義した。一方で、少なくとも１つの生理障害が生じている果実を不良果として定義した。
【0114】
（ＧＭ系統における表現型の相関分析）
形質間の相関係数を、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ ２０１６により提供される、ｐ値を算出するための相関ツール及びＴＤＩＳＴ機能を用いて算出した。
形質間の相関係数を、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ ２０１６により提供される、ｐ値を算出するための相関ツール及びＴＤＩＳＴ機能を用いて算出した。
【0115】
（形質遺伝）
各実験におけるＧＭ系統の表現型の線形モデルを用いて、遺伝率を算出した。
各実験におけるＧＭ系統の表現型の線形モデルを用いて、遺伝率を算出した。
【0116】
（ゲノムＤＮＡの単離）
ＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、Ｐ１及びＰ２の葉のゲノムＤＮＡを単離した。Ｇ１Ｆ１及びＦ９世代のＧＭ系統の植物の葉のゲノムＤＮＡを、ＤＮｅａｓｙ ９６ Ｐｌａｎｔ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離した。Ｑｕａｎｔ－ｉＴ ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｋ．Ｋ）及びＡＲＶＯ ＭＸ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｊａｐａｎ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）を用いて、製造者による取扱説明書にしたがって、ゲノムＤＮＡを定量した。
ＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、Ｐ１及びＰ２の葉のゲノムＤＮＡを単離した。Ｇ１Ｆ１及びＦ９世代のＧＭ系統の植物の葉のゲノムＤＮＡを、ＤＮｅａｓｙ ９６ Ｐｌａｎｔ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離した。Ｑｕａｎｔ－ｉＴ ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｋ．Ｋ）及びＡＲＶＯ ＭＸ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｊａｐａｎ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）を用いて、製造者による取扱説明書にしたがって、ゲノムＤＮＡを定量した。
【0117】
（トマトＳＳＲマーカーのスクリーニング）
非冗長ＢＡＣ端由来ゲノムＳＳＲマーカー（“ｔｍａ”、“ｔｍｂ”、“ｔｍｃ”、及び“ＴＧＳ”と称する。総数４０４７）、ＥＳＴ由来ＳＳＲマーカー（“ｔｍｅ”及び“ＴＥＳ”と称する。総数２１９５）、ＥＳＴベースゲノムＳＳＲマーカー（“ｔｂｍ”と称する。総数２５１０）、及び、ウェブサイト（https://solgenomics.net）で公開されたｃＤＮＡ由来ＳＳＲマーカー（本実験では“ｔｍｓ”と称する。総数１３５）を用いた。
非冗長ＢＡＣ端由来ゲノムＳＳＲマーカー（“ｔｍａ”、“ｔｍｂ”、“ｔｍｃ”、及び“ＴＧＳ”と称する。総数４０４７）、ＥＳＴ由来ＳＳＲマーカー（“ｔｍｅ”及び“ＴＥＳ”と称する。総数２１９５）、ＥＳＴベースゲノムＳＳＲマーカー（“ｔｂｍ”と称する。総数２５１０）、及び、ウェブサイト（https://solgenomics.net）で公開されたｃＤＮＡ由来ＳＳＲマーカー（本実験では“ｔｍｓ”と称する。総数１３５）を用いた。
【0118】
テンプレートとして親（Ｇ１世代）のゲノムＤＮＡを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）後、蛍光標識を行い、ＰＣＲ増幅産物の多型性に基づきマーカーをスクリーニングした。２つの群（Ｇ１Ｆ１及びＦ９世代のＧＭ系統）の遺伝子型を用いて、両親（Ｇ１世代、Ｐ１及びＰ２）アレルの組み合わせパターン（８つのカテゴリー）に、ＳＳＲマーカーを分類した（表１）。
【0119】
これらのマーカー（プライマー対）の情報は、ＮＩＶＴＳウェブサイト（http://vegmarks.nivot.affrc.go.jp/）において入手可能である。
【0120】
（ＳＳＲアレルの遺伝子型解析）
ＳＳＲアレルのフォワードプライマーを、６－ＦＡＭ、ＮＥＤ、ＰＥＴ、又はＶＩＣ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて５’端標識した。Ｐ１Ｐ２のゲノムＤＮＡ並びに（Ｇ１Ｆ１及びＦ９世代のＧＭ系統の植物のゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いた。ＰＣＲを、Ｔｙｐｅ－ｉｔ Ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ＰＣＲ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）の反応液１０μＬ中で行った。ＰＣＲは、９５℃で５分からスタートし、９５℃で３０秒、６０℃で９０秒、及び７２℃で３０秒のサイクルを２８サイクル行い、最後に６０℃で３０分とした。ＰＣＲ増幅産物を、ＧｅｎｅＳｃａｎ－５００ＬＩＺ Ｓｉｚｅ Ｓｔａｎｄａｒｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と共に自動シーケンサー（３７３０ ｘ１ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ， Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において分析した。断片長をＧｅｎｅＭａｐｐｅｒ ｖ． ３．７ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において決定した。
ＳＳＲアレルのフォワードプライマーを、６－ＦＡＭ、ＮＥＤ、ＰＥＴ、又はＶＩＣ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて５’端標識した。Ｐ１Ｐ２のゲノムＤＮＡ並びに（Ｇ１Ｆ１及びＦ９世代のＧＭ系統の植物のゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いた。ＰＣＲを、Ｔｙｐｅ－ｉｔ Ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ＰＣＲ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）の反応液１０μＬ中で行った。ＰＣＲは、９５℃で５分からスタートし、９５℃で３０秒、６０℃で９０秒、及び７２℃で３０秒のサイクルを２８サイクル行い、最後に６０℃で３０分とした。ＰＣＲ増幅産物を、ＧｅｎｅＳｃａｎ－５００ＬＩＺ Ｓｉｚｅ Ｓｔａｎｄａｒｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と共に自動シーケンサー（３７３０ ｘ１ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ， Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において分析した。断片長をＧｅｎｅＭａｐｐｅｒ ｖ． ３．７ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において決定した。
【0121】
（ＳＮＰアレルの遺伝子型解析）
全１５３６のＳＮＰをＰ１Ｐ２及びＧＭ系統の遺伝子型解析に用いた。遺伝子型解析は、ＧｏｌｄｅｎＧａｔｅ ａｓｓａｙ ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．）を用いて、製造者のプロトコルにしたがって行った。マーカーのカテゴリーは、表１のＳＳＲマーカーと同様に分類した。
全１５３６のＳＮＰをＰ１Ｐ２及びＧＭ系統の遺伝子型解析に用いた。遺伝子型解析は、ＧｏｌｄｅｎＧａｔｅ ａｓｓａｙ ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．）を用いて、製造者のプロトコルにしたがって行った。マーカーのカテゴリーは、表１のＳＳＲマーカーと同様に分類した。
【0122】
（連鎖地図の構築）
Ｃａｒｔｈａｇｅｎｅ ｓｏｆｔｗａｒｅ（de Givry et al. Bioinformatics 21: 1703-1704, 2005）を用いて、ＧＭ系統の連鎖地図を構築した。ＧＭ系統の連鎖地図は、各Ｇ１Ｆ１植物から各ＧＭ系統の子孫植物に至る世代の経過に伴って生じる各マーカー間での組換えの頻度（地図距離）を推定することによって、構築した。表１に記載したＳＳＲマーカー及びＳＮＰマーカーを用いた。Ｐ１Ｐ２（表１のカテゴリー１～７）におけるヘテロマーカーの遺伝子型は、Ｇ１Ｆ１世代において即座に分離し、それらのマーカー対間の組換え頻度が推定できた。組換え頻度の推定は、Ｇ１Ｆ１植物からそれらの後代のＧＭ系統へのアレルの遺伝に着目して行い、Ｇ１Ｆ１における分離に関する情報は、組み換え頻度の推定を確認するためにのみ用いた。連鎖地図におけるマーカー遺伝子型の分離歪みをカイ２乗検定により同定した。連鎖地図はＭａｐＣｈａｒｔ ｖ． ２．１ ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて描いた。
Ｃａｒｔｈａｇｅｎｅ ｓｏｆｔｗａｒｅ（de Givry et al. Bioinformatics 21: 1703-1704, 2005）を用いて、ＧＭ系統の連鎖地図を構築した。ＧＭ系統の連鎖地図は、各Ｇ１Ｆ１植物から各ＧＭ系統の子孫植物に至る世代の経過に伴って生じる各マーカー間での組換えの頻度（地図距離）を推定することによって、構築した。表１に記載したＳＳＲマーカー及びＳＮＰマーカーを用いた。Ｐ１Ｐ２（表１のカテゴリー１～７）におけるヘテロマーカーの遺伝子型は、Ｇ１Ｆ１世代において即座に分離し、それらのマーカー対間の組換え頻度が推定できた。組換え頻度の推定は、Ｇ１Ｆ１植物からそれらの後代のＧＭ系統へのアレルの遺伝に着目して行い、Ｇ１Ｆ１における分離に関する情報は、組み換え頻度の推定を確認するためにのみ用いた。連鎖地図におけるマーカー遺伝子型の分離歪みをカイ２乗検定により同定した。連鎖地図はＭａｐＣｈａｒｔ ｖ． ２．１ ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて描いた。
【0123】
（ＭＣＭＣ法を用いたベイズＱＴＬマッピング）
四元交雑群のベイズＱＴＬマッピングを、ＧＭ系統の遺伝子型及びＰ１、Ｐ２、Ｇ１Ｆ１及びＧＭ系統群のマーカー遺伝子型を用いて行った。このマッピング法では、各ＱＴＬにおいて４つの未知の祖先（Ｐ１の両親及びＰ２の両親）由来の４つのアレルを仮定した。Ｇ１Ｆ１植物のマーカー遺伝子型は、Ｐ１及びＰ２のハプロタイプを推定するために用いた。ＧＭ系統のハプロタイプは、Ｇ１Ｆ１親のハプロタイプから推測した。ＭＣＭＣ法に基づくベイズ法に加えて、四元交雑におけるＱＴＬマッピングのための変分近似値を用いたベイズ解析（変分近似法）を行った。
四元交雑群のベイズＱＴＬマッピングを、ＧＭ系統の遺伝子型及びＰ１、Ｐ２、Ｇ１Ｆ１及びＧＭ系統群のマーカー遺伝子型を用いて行った。このマッピング法では、各ＱＴＬにおいて４つの未知の祖先（Ｐ１の両親及びＰ２の両親）由来の４つのアレルを仮定した。Ｇ１Ｆ１植物のマーカー遺伝子型は、Ｐ１及びＰ２のハプロタイプを推定するために用いた。ＧＭ系統のハプロタイプは、Ｇ１Ｆ１親のハプロタイプから推測した。ＭＣＭＣ法に基づくベイズ法に加えて、四元交雑におけるＱＴＬマッピングのための変分近似値を用いたベイズ解析（変分近似法）を行った。
【0124】
（ｔｆｗ５．１分離系統の獲得と採種）
Ｆ９世代のＧＭ系統のうち、系統２２９については、ｔｆｗ５．１領域（ここでは、便宜的に２つのＳＳＲマーカー、ｔｂｍ１３０６とｔｍａ０１４６に挟まれた間と規定、図２を参照のこと）が、ヘテロの遺伝子型を示していた。この系統の自殖後代種子を、上記と同様、土の入った育苗トレーに２０１４年９月８日に採種後、実験７及び実験８と同様に栽培した。３週間後、植物はロックウールキューブに鉢上げし、茨城県つくば市の農研機構の温室（植物工場）内に仮定植した。ＥＣ＝１．０ｍＳ／ｃｍの培養液（大塚化学社製）を施与し、同年９月３０日～１１月４日まで栽培した。この間に、上記「ゲノムＤＮＡの単離」に従ってゲノムＤＮＡを単離し、このＤＮＡをテンプレートにして、ｔｆｗ５．１領域周辺に座乗するＳＳＲマーカーセットを用い、蛍光色素を利用したＢＳ－ｔａｇ法（Shimizu and Yano, BMC Research Notes, 4:161, 2011;小西ら, 野菜茶業研究所研究報告, 14: 15-22, 2015）によるマルチプレックスＰＣＲを実施した。使用したＳＳＲマーカーセット（セット１：ｔｂｍ１３０６、ＴＧＳ０１５５、ＴＧＳ０４４３、ｔｂｍ１３２１；セット２：ＴＧＳ０６３３、ｔｍａ０１４６、ＴＧＳ０２８０、ｔｍａ０２５２）の情報は、公開データベース（VegMarks, https://vegmarks.nivot.affrc.go.jp/VegMarks/app/page/home）から入手可能である。蛍光色素は、６－ＦＡＭ、ＮＥＤ、ＰＥＴ、又はＶＩＣのいずれかを用いた。上記「ＳＳＲアレルの遺伝子型解析」に基づき、多収のオランダ型トマトのアレルをホモ型で有する個体、日本トマト型のアリルをホモ型で持つ個体、ヘテロのアレルを持つ個体を選抜した。多収型アレルを持つ個体を２２９Ｇ、日本型アレルを持つ個体を２２９Ｍ、ヘテロのアレルを持つ個体を２２９Ｈと命名した。１１月４日にこれら植物の入ったロックウールキューブをロックウールスラブ上に定植、さらに栽培し、２２９Ｇ、２２９Ｍ、２２９Ｈの自殖種子を採種した。
Ｆ９世代のＧＭ系統のうち、系統２２９については、ｔｆｗ５．１領域（ここでは、便宜的に２つのＳＳＲマーカー、ｔｂｍ１３０６とｔｍａ０１４６に挟まれた間と規定、図２を参照のこと）が、ヘテロの遺伝子型を示していた。この系統の自殖後代種子を、上記と同様、土の入った育苗トレーに２０１４年９月８日に採種後、実験７及び実験８と同様に栽培した。３週間後、植物はロックウールキューブに鉢上げし、茨城県つくば市の農研機構の温室（植物工場）内に仮定植した。ＥＣ＝１．０ｍＳ／ｃｍの培養液（大塚化学社製）を施与し、同年９月３０日～１１月４日まで栽培した。この間に、上記「ゲノムＤＮＡの単離」に従ってゲノムＤＮＡを単離し、このＤＮＡをテンプレートにして、ｔｆｗ５．１領域周辺に座乗するＳＳＲマーカーセットを用い、蛍光色素を利用したＢＳ－ｔａｇ法（Shimizu and Yano, BMC Research Notes, 4:161, 2011;小西ら, 野菜茶業研究所研究報告, 14: 15-22, 2015）によるマルチプレックスＰＣＲを実施した。使用したＳＳＲマーカーセット（セット１：ｔｂｍ１３０６、ＴＧＳ０１５５、ＴＧＳ０４４３、ｔｂｍ１３２１；セット２：ＴＧＳ０６３３、ｔｍａ０１４６、ＴＧＳ０２８０、ｔｍａ０２５２）の情報は、公開データベース（VegMarks, https://vegmarks.nivot.affrc.go.jp/VegMarks/app/page/home）から入手可能である。蛍光色素は、６－ＦＡＭ、ＮＥＤ、ＰＥＴ、又はＶＩＣのいずれかを用いた。上記「ＳＳＲアレルの遺伝子型解析」に基づき、多収のオランダ型トマトのアレルをホモ型で有する個体、日本トマト型のアリルをホモ型で持つ個体、ヘテロのアレルを持つ個体を選抜した。多収型アレルを持つ個体を２２９Ｇ、日本型アレルを持つ個体を２２９Ｍ、ヘテロのアレルを持つ個体を２２９Ｈと命名した。１１月４日にこれら植物の入ったロックウールキューブをロックウールスラブ上に定植、さらに栽培し、２２９Ｇ、２２９Ｍ、２２９Ｈの自殖種子を採種した。
【0125】
（試験１：固定した分離系統における収量構成要素の解析）
２２９Ｇ及び２２９Ｍは、ｔｆｗ５．１アレルが多収型又は日本型に固定したと考えられる。これらの系統の種子は、２０１５年２月２３日に上記同様播種、生育チャンバ内で栽培し、３月１９日にロックウールキューブに鉢上げ後、栽植密度２．７（株／ｍ２）でロックウールスラブ上に定植し、温室内で春作栽培した。定植時の培養液はＥＣ＝１．１ｍＳ／ｃｍとし、４月３０日にＥＣ＝１．９ｍＳ／ｃｍに上げ、以後栽培終了時までこの濃度で施与した。栽培は、摘心せず定植後１２５日目まで行った。成熟果実は、栽培期間中定期的に収穫し、良果と不良果とに分け、個数及び新鮮重を求めた。栽培終了後、植物は、株元から切り取り、未熟果、良果、葉、茎、に切り分けた。果実については、果数、新鮮重、及び乾燥重を求め、葉及び茎については、新鮮重及び乾燥重を求めた。ここでいう乾燥重は、乾物重と換言できる。収穫期間中に収穫した果実の乾燥重は、栽培終了後に求めた乾物率（乾燥重／新鮮重）により新鮮重から換算して求めた。
２２９Ｇ及び２２９Ｍは、ｔｆｗ５．１アレルが多収型又は日本型に固定したと考えられる。これらの系統の種子は、２０１５年２月２３日に上記同様播種、生育チャンバ内で栽培し、３月１９日にロックウールキューブに鉢上げ後、栽植密度２．７（株／ｍ２）でロックウールスラブ上に定植し、温室内で春作栽培した。定植時の培養液はＥＣ＝１．１ｍＳ／ｃｍとし、４月３０日にＥＣ＝１．９ｍＳ／ｃｍに上げ、以後栽培終了時までこの濃度で施与した。栽培は、摘心せず定植後１２５日目まで行った。成熟果実は、栽培期間中定期的に収穫し、良果と不良果とに分け、個数及び新鮮重を求めた。栽培終了後、植物は、株元から切り取り、未熟果、良果、葉、茎、に切り分けた。果実については、果数、新鮮重、及び乾燥重を求め、葉及び茎については、新鮮重及び乾燥重を求めた。ここでいう乾燥重は、乾物重と換言できる。収穫期間中に収穫した果実の乾燥重は、栽培終了後に求めた乾物率（乾燥重／新鮮重）により新鮮重から換算して求めた。
【0126】
（試験２：固定した分離系統における収量構成要素の解析）
固定系統２２９Ｇ及び２２９Ｍの種子を２０１７年９月４日に試験１と同様播種し、生育チャンバ内で栽培、９月２８日にロックウールキューブに鉢上げ後、栽植密度３．３（株／ｍ２）でロックウールスラブ上に定植し、温室内で秋作栽培した。定植時の培養液はＥＣ＝２．６ｍＳ／ｃｍとし、栽培終了時までこの濃度で施与した。すべての株は第４果房で摘心し、定植後１２４日目まで栽培した。成熟果実は、栽培期間中定期的に収穫し、良果と不良果とに分け、個数及び新鮮重を求めた。栽培終了後のデータ収集は、試験１と同様に行った。
固定系統２２９Ｇ及び２２９Ｍの種子を２０１７年９月４日に試験１と同様播種し、生育チャンバ内で栽培、９月２８日にロックウールキューブに鉢上げ後、栽植密度３．３（株／ｍ２）でロックウールスラブ上に定植し、温室内で秋作栽培した。定植時の培養液はＥＣ＝２．６ｍＳ／ｃｍとし、栽培終了時までこの濃度で施与した。すべての株は第４果房で摘心し、定植後１２４日目まで栽培した。成熟果実は、栽培期間中定期的に収穫し、良果と不良果とに分け、個数及び新鮮重を求めた。栽培終了後のデータ収集は、試験１と同様に行った。
【0127】
（分離系統のｔｆｗ５．１領域が短縮化した系統の育成）
ｔｆｗ５．１分離系統のうち、２２９Ｈの自殖種子を、２０１６年８月９日に、試験１と同様に播種後、生育チャンバ内で栽培した。播種後２週間目に、幼苗の葉からＤＮＡを抽出した（ＤＮＡすいすい－Ｐ、株式会社リーゾ）。このＤＮＡをテンプレートにして、上記「ｔｆｗ５．１分離系統の獲得と採種」と同様にマルチプレックスＰＣＲを実施後、「ＳＳＲアレルの遺伝子型解析」に従って遺伝子型解析を行い、ｔｆｗ５．１領域が組換えにより短くなった系統を選抜した。９月８日に、試験２と同様の栽植密度、養液濃度により秋作栽培を実施し、自殖種子を採種した。
ｔｆｗ５．１分離系統のうち、２２９Ｈの自殖種子を、２０１６年８月９日に、試験１と同様に播種後、生育チャンバ内で栽培した。播種後２週間目に、幼苗の葉からＤＮＡを抽出した（ＤＮＡすいすい－Ｐ、株式会社リーゾ）。このＤＮＡをテンプレートにして、上記「ｔｆｗ５．１分離系統の獲得と採種」と同様にマルチプレックスＰＣＲを実施後、「ＳＳＲアレルの遺伝子型解析」に従って遺伝子型解析を行い、ｔｆｗ５．１領域が組換えにより短くなった系統を選抜した。９月８日に、試験２と同様の栽植密度、養液濃度により秋作栽培を実施し、自殖種子を採種した。
【0128】
（試験３：ｔｆｗ５．１領域が短縮化した系統の固定化と収量構成要素の解析による領域の限定）
上記で選抜された短縮化された系統のｔｆｗ５．１領域のマーカー遺伝子型は部分的にヘテロのアリルとなる。したがって、これらが多収型か日本型に固定した系統を選抜するため、短縮化した８系統の自殖種子を２０１７年９月４日に播種し、再度遺伝子型解析を行った。生育チャンバ及び温室内の栽培に関しては、全て試験２と同様に行なった。生育途中でＳＳＲマーカーセットを用いた遺伝子型解析を行い、固定系統を判別後、これら系統の収量構成要素解析を試験２と同様に行った。なお、収量比較は、多収型と日本型との間で実施したが、いずれかの型が今回の選抜で十分に得られなかった系統が２つ存在した。これら系統については、ここで得られた固定種子を用いて２０１９年春作で再度収量構成要素解析を実施した（播種２０１９年２月４日、定植日２月２８日、定植後栽培期間１０９日）。栽培管理は、培養液濃度をＥＣ＝２．６ｍＳ／ｃｍとした以外は、試験１に準じて行った。
上記で選抜された短縮化された系統のｔｆｗ５．１領域のマーカー遺伝子型は部分的にヘテロのアリルとなる。したがって、これらが多収型か日本型に固定した系統を選抜するため、短縮化した８系統の自殖種子を２０１７年９月４日に播種し、再度遺伝子型解析を行った。生育チャンバ及び温室内の栽培に関しては、全て試験２と同様に行なった。生育途中でＳＳＲマーカーセットを用いた遺伝子型解析を行い、固定系統を判別後、これら系統の収量構成要素解析を試験２と同様に行った。なお、収量比較は、多収型と日本型との間で実施したが、いずれかの型が今回の選抜で十分に得られなかった系統が２つ存在した。これら系統については、ここで得られた固定種子を用いて２０１９年春作で再度収量構成要素解析を実施した（播種２０１９年２月４日、定植日２月２８日、定植後栽培期間１０９日）。栽培管理は、培養液濃度をＥＣ＝２．６ｍＳ／ｃｍとした以外は、試験１に準じて行った。
【0129】
〔結果〕
（ＧＭ系統における表現型の相関分析）
（ＧＭ系統における表現型の相関分析）
【0130】
表現型の相関分析において、総果実新鮮重は果実糖度に対し、負の相関を示した。これらの形質がトレードオフの関係にあることは、他の報告（Bernacchi et al. 1998; Fulton et al. 1997; Gur et al. 2011）においても示されている。
【0131】
三重県で栽培した系統においては、総果実新鮮重と良果新鮮重、総果実新鮮重と良果の数、良果新鮮重と良果の数、及び、平均総果実新鮮重と平均良果新鮮重のそれぞれの間で、有意に高い相関がみられた。作型は表現型に顕著に影響していることが示唆された。
【0132】
（Ｇ１Ｆ１系統及び組換え型自殖系統において有効なＳＳＲマーカー及びＳＮＰマーカーのスクリーニング及び分類）
有効なＳＳＲマーカーを、それぞれの系統のアレル型の組み合わせパターンにより８つのカテゴリーに分類した（表１）。カテゴリー７のマーカーは、４つの異なるアレルを検出可能であり、当該マーカーが有用であることが示された。しかしながら、トマトゲノムにおけるマーカー頻度は非常に低かった。したがって、ＱＴＬ解析においては、異なるカテゴリーのマーカーを組み合わせ、それらを、染色体の各領域における遺伝情報の不足を補うために用いた。一例として、カテゴリー０のマーカーＡ（ａａ－ｂｂ）、カテゴリー２のマーカーＢ（ａｂ－ａａ）、及びカテゴリー３のマーカーＣ（ａａ－ａｂ）により、カテゴリー７のマーカー（ａｂ－ｃｄ）により得られる情報と同様の情報を得ることができる。合計１９７のＳＳＲマーカーを選択した。
有効なＳＳＲマーカーを、それぞれの系統のアレル型の組み合わせパターンにより８つのカテゴリーに分類した（表１）。カテゴリー７のマーカーは、４つの異なるアレルを検出可能であり、当該マーカーが有用であることが示された。しかしながら、トマトゲノムにおけるマーカー頻度は非常に低かった。したがって、ＱＴＬ解析においては、異なるカテゴリーのマーカーを組み合わせ、それらを、染色体の各領域における遺伝情報の不足を補うために用いた。一例として、カテゴリー０のマーカーＡ（ａａ－ｂｂ）、カテゴリー２のマーカーＢ（ａｂ－ａａ）、及びカテゴリー３のマーカーＣ（ａａ－ａｂ）により、カテゴリー７のマーカー（ａｂ－ｃｄ）により得られる情報と同様の情報を得ることができる。合計１９７のＳＳＲマーカーを選択した。
【0133】
ＳＳＲマーカーの低密度領域をカバーするＳＮＰマーカーのスクリーニング及び遺伝子型の特定を行った。全部で３３８のＳＳＲマーカー及びＳＮＰマーカー（表１）を、連鎖地図構築及びＱＴＬ解析に用いた。
（連鎖地図の評価）
ＧＭ系統の連鎖地図は、１２の連鎖群からなり、総遺伝距離１２２１．８ｃＭをカバーした。マーカー間の平均距離は３．７ｃＭであり、最大２８．５ｃＭのギャップがあった。ゲノムカバー率は、トマトゲノムＳＬ３．００(http://solgenomics.net/)の９８．２％であった。連鎖地図の分離歪み率は４％未満（１３／３３８マーカー＝０．０３８５）であった。大きなギャップが存在していたが（２０ｃＭ以上）、ゲノムカバー率及びマーカー間の平均距離（１０ｃＭ未満、Lander and Botstein 1989）は、連鎖地図が、組換え型自殖系統の全ゲノムの探索に十分であることを示唆していた。
【表1】
ＧＭ系統の連鎖地図は、１２の連鎖群からなり、総遺伝距離１２２１．８ｃＭをカバーした。マーカー間の平均距離は３．７ｃＭであり、最大２８．５ｃＭのギャップがあった。ゲノムカバー率は、トマトゲノムＳＬ３．００(http://solgenomics.net/)の９８．２％であった。連鎖地図の分離歪み率は４％未満（１３／３３８マーカー＝０．０３８５）であった。大きなギャップが存在していたが（２０ｃＭ以上）、ゲノムカバー率及びマーカー間の平均距離（１０ｃＭ未満、Lander and Botstein 1989）は、連鎖地図が、組換え型自殖系統の全ゲノムの探索に十分であることを示唆していた。
【0134】
（ＭＣＭＣ法と変分近似法とのマッピング精度の比較）
全ての形質データを用いてＱＴＬマッピングをする前に、ＱＴＬを検出するための２つのベイズマッピング法であるＭＣＭＣ法と変分近似法とを、総果実新鮮重のデータを用いて比較した。ＱＴＬの検出は、各ＱＴＬ位置がモデルに含まれる事後確率に基づいて行った。各ＱＴＬ位置の事後確率は、ＭＣＭＣ法においては総ＭＣＭＣサンプルに対する当該ＱＴＬを含むモデルが採択されたＭＣＭＣサンプルの比率として算出し、また、変分近似法においてはゲノム中に等間隔で配置された仮想的なＱＴＬのモデルへの包含に関する指示変数γ１の近似事後期待値として得た。２つのベイズ法から得られた結果は概ね等値であったことから、計算時間の短縮のために、変分近似法のみを残りの形質の解析に適用した。
全ての形質データを用いてＱＴＬマッピングをする前に、ＱＴＬを検出するための２つのベイズマッピング法であるＭＣＭＣ法と変分近似法とを、総果実新鮮重のデータを用いて比較した。ＱＴＬの検出は、各ＱＴＬ位置がモデルに含まれる事後確率に基づいて行った。各ＱＴＬ位置の事後確率は、ＭＣＭＣ法においては総ＭＣＭＣサンプルに対する当該ＱＴＬを含むモデルが採択されたＭＣＭＣサンプルの比率として算出し、また、変分近似法においてはゲノム中に等間隔で配置された仮想的なＱＴＬのモデルへの包含に関する指示変数γ１の近似事後期待値として得た。２つのベイズ法から得られた結果は概ね等値であったことから、計算時間の短縮のために、変分近似法のみを残りの形質の解析に適用した。
【0135】
近似法により検出した総果実新鮮重に関与するＱＴＬの解析結果を表２に示す。表２において、Ｒ２は、ＱＴＬによって明らかにされた表現型分散の推定比率である。図２は、連鎖群５の連鎖地図及びＱＴＬ ｔｆｗ５．１の位置を説明する図である。
【表2】
【0136】
（試験１の結果）
試験１の構成要素解析の結果を表３に示す。多収オランダ型トマトに由来するｔｆｗ５．１アレルを持つ固定系統２２９Ｇは、日本型トマト由来のアレルを持つ固定系統２２９Ｍに比べ、株あたりの総果重（未熟果、不良果、良果の合計新鮮重）、平均果重（総果重／総果数）、果実乾物重（総果重を乾燥重量に換算したもの）、果実分配率（果実乾物重／総乾物重）のいずれも、有意に増大していた。ここで、総乾物重は、葉、茎、全ての果実の乾燥重量の合計を指す。なお、総乾物重（地上部バイオマスと同義）や果実数は２系統間で差が無かった。これらの結果は、地上部バイオマスは不変のまま、果実への乾物分配が増大したことを示している。そして、その分茎や葉への同化産物（乾物）分配が減少し、果実一個当たりの重量（新鮮重及び乾燥重）が増え、収量（個体あたりの果実新鮮重）が増大したことを示している。
試験１の構成要素解析の結果を表３に示す。多収オランダ型トマトに由来するｔｆｗ５．１アレルを持つ固定系統２２９Ｇは、日本型トマト由来のアレルを持つ固定系統２２９Ｍに比べ、株あたりの総果重（未熟果、不良果、良果の合計新鮮重）、平均果重（総果重／総果数）、果実乾物重（総果重を乾燥重量に換算したもの）、果実分配率（果実乾物重／総乾物重）のいずれも、有意に増大していた。ここで、総乾物重は、葉、茎、全ての果実の乾燥重量の合計を指す。なお、総乾物重（地上部バイオマスと同義）や果実数は２系統間で差が無かった。これらの結果は、地上部バイオマスは不変のまま、果実への乾物分配が増大したことを示している。そして、その分茎や葉への同化産物（乾物）分配が減少し、果実一個当たりの重量（新鮮重及び乾燥重）が増え、収量（個体あたりの果実新鮮重）が増大したことを示している。
【0137】
Higashide and Heuvelink (J.Amer.Soc.Hort.Sci. 134: 460-465, 2009)による構成要素解析によれば、上記の収量増効果は果実シンク能増大による果実への乾物分配率向上によるものと考えられる（同論文の図２を参照のこと）。
【0138】
（試験２の結果）
試験２の構成要素解析の結果を表３に示す。秋作の摘心栽培においても、試験１と同様の結果が得られた。
試験２の構成要素解析の結果を表３に示す。秋作の摘心栽培においても、試験１と同様の結果が得られた。
【表3】
【0139】
（試験３の結果）
果実への乾物分配率について、ｔｆｗ５．１領域が短縮化された系統の、多収型マーカーアレルの領域と、日本型マーカーアレル領域との比較により、ｔｆｗ５．１領域がさらに限定された（表４）。マーカーｔｍａ０２５２とマーカーｔｂｍ１３０６に挟まれた領域に多収型に由来するマーカーアリルが存在する系統１Ｇにおいて分配率が向上している。この領域内で非同義置換が生じている予測遺伝子は、マーカーｔｂｍ１３０７とマーカーｔｂｍ１３０６との間、及び、マーカーｔｍａ０１４６とマーカーＴＧＳ０１５５との間の２個のみであった。なお、表４において、Ａは多収型のトマトの遺伝子型、Ｂは日本型トマトの遺伝子型を示す。
果実への乾物分配率について、ｔｆｗ５．１領域が短縮化された系統の、多収型マーカーアレルの領域と、日本型マーカーアレル領域との比較により、ｔｆｗ５．１領域がさらに限定された（表４）。マーカーｔｍａ０２５２とマーカーｔｂｍ１３０６に挟まれた領域に多収型に由来するマーカーアリルが存在する系統１Ｇにおいて分配率が向上している。この領域内で非同義置換が生じている予測遺伝子は、マーカーｔｂｍ１３０７とマーカーｔｂｍ１３０６との間、及び、マーカーｔｍａ０１４６とマーカーＴＧＳ０１５５との間の２個のみであった。なお、表４において、Ａは多収型のトマトの遺伝子型、Ｂは日本型トマトの遺伝子型を示す。
【表4】
【0140】
（ＲＮＡ―ＳＥＱ変異解析）
ｔｆｗ５．１分離系統２２９Ｇ（多収型）と２２９Ｍ（日本型）について、次世代型シーケンサーを用いたｍＲＮＡの変異解析を行った。それぞれの系統の未熟果実から、トライゾール法（https://ipmb.sinica.edu.tw/microarray/protocol.htm）により総ＲＮＡを抽出し、これらを用いて断片化ｃＤＮＡライブラリを作成した（ＴｒｕＳｅｑ ＲＮＡ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ ｖ２、イルミナ社）。ライブラリを次世代シーケンサー（ＨｉＳｅｑ ４０００、イルミナ社）解析に供し、ペアエンドシーケンスによるリード配列を取得した（約４Ｇｂ／サンプル）。得られたリード配列をＣＬＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈソフトウェアを用い、参照トマトゲノム（バージョンＳＬ４．０、ftp://ftp.solgenomics.net/genomes/Solanum_lycopersicum/assembly/build_4.00/）へマッピングし、変異検出プログラム（Ｂａｓｉｃ Ｖａｒｉａｎｔ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ等）により非同義置換の検出を行った。その結果、限定されたｔｆｗ５．１領域内の２つの予測遺伝子にコードされる配列番号１又は２に示すアミノ酸配列において、多収型と日本型の間で差異（非同義置換）が見出された（表４）。
ｔｆｗ５．１分離系統２２９Ｇ（多収型）と２２９Ｍ（日本型）について、次世代型シーケンサーを用いたｍＲＮＡの変異解析を行った。それぞれの系統の未熟果実から、トライゾール法（https://ipmb.sinica.edu.tw/microarray/protocol.htm）により総ＲＮＡを抽出し、これらを用いて断片化ｃＤＮＡライブラリを作成した（ＴｒｕＳｅｑ ＲＮＡ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ ｖ２、イルミナ社）。ライブラリを次世代シーケンサー（ＨｉＳｅｑ ４０００、イルミナ社）解析に供し、ペアエンドシーケンスによるリード配列を取得した（約４Ｇｂ／サンプル）。得られたリード配列をＣＬＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈソフトウェアを用い、参照トマトゲノム（バージョンＳＬ４．０、ftp://ftp.solgenomics.net/genomes/Solanum_lycopersicum/assembly/build_4.00/）へマッピングし、変異検出プログラム（Ｂａｓｉｃ Ｖａｒｉａｎｔ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ等）により非同義置換の検出を行った。その結果、限定されたｔｆｗ５．１領域内の２つの予測遺伝子にコードされる配列番号１又は２に示すアミノ酸配列において、多収型と日本型の間で差異（非同義置換）が見出された（表４）。
【産業上の利用可能性】
【0141】
本発明は、農業分野、植物育種分野等に利用することができる。
【図1】
【図2】
【配列表】