特許 7497035 イネウンカ類を識別する方法、プライマーセット、及び、識別するキット

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-05-31

(45)【発行日】2024-06-10

(54)【発明の名称】イネウンカ類を識別する方法、プライマーセット、及び、識別するキット

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/686 20180101AFI20240603BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20240603BHJP

   C12Q 1/6888 20180101ALI20240603BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/686 Z

C12N15/09 Z ZNA

C12Q1/6888 Z

【請求項の数】 6

(21)【出願番号】P 2020146157

(22)【出願日】2020-08-31

(65)【公開番号】P2022041117

(43)【公開日】2022-03-11

【審査請求日】2023-03-09

(73)【特許権者】

【識別番号】501203344

【氏名又は名称】国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構

(74)【代理人】

【識別番号】110000338

【氏名又は名称】弁理士法人 ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ

(72)【発明者】

【氏名】矢代 敏久

【審査官】天野 皓己

(56)【参考文献】

【文献】特開２００４－３３７０６９（ＪＰ，Ａ）

【文献】LIU Yu-Di et al.，Molecular identification of Nilaparvata lugens (Stal), Sogatella furcifera (Horvath) and Laodelphax striatellus (Fallen)(Homoptera: Delphacidae) based on rDNA ITS1 and ITS2 sequences，Acta Entomologica Sinica，2009年11月，Vol.52, No.11，p.1266-1272

【文献】GUANG-HUA WANG et al.，Development and preliminary application of a triplex real-time polymerase chain reaction assay for evaluating predation on three planthoppers in a rice ecosystem，Molecular Ecology Resources，2013年，Vol.13，p.811-819

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｑ １／００ ー ３／００

Ｃ１２Ｎ １５／００ ー １５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

イネウンカ類のｒＤＮＡにおけるＩＴＳ２（Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ Ｓｐａｃｅｒ ２）領域内の少なくとも一部を増幅するように設計したプライマーセットを用いて、イネウンカ類由来のＤＮＡが含まれ得る試料をマルチプレックスＰＣＲに供し、増幅産物の電気泳動パターンを解析する、イネウンカ類を識別する方法であって、
前記プライマーセットは、以下の（ａ）～（ｄ）のプライマー：
（ａ）配列番号１に示す塩基配列における２０の連続する塩基を含む第１のプライマー；
（ｂ）配列番号２に示す塩基配列における２１の連続する塩基を含む第２のプライマー；
（ｃ）配列番号３に示す塩基配列における２０の連続する塩基を含む第３のプライマー；及び
（ｄ）配列番号４に示す塩基配列における２１の連続する塩基を含む第４のプライマー；を含むプライマーセットであり、
前記イネウンカ類は、トビイロウンカ、セジロウンカ、及び、ヒメトビウンカである、方法。

【請求項2】

前記イネウンカ類由来のＤＮＡは、粘着板払い落し法、捕虫網、又は吸虫管により捕獲した幼虫及び成虫を含むイネウンカ個体由来のＤＮＡである、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

電気泳動パターンの解析において、
前記増幅産物のサイズが４８０ｂｐ～５６０ｂｐであるとき、トビイロウンカ由来のＤＮＡであると判定し、
前記増幅産物のサイズが１６５ｂｐ～２４５ｂｐであるとき、セジロウンカ由来のＤＮＡであると判定し、
前記増幅産物のサイズが３００ｂｐ～３８０ｂｐであるとき、ヒメトビウンカ由来のＤＮＡであると判定する、
請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

前記マルチプレックスＰＣＲでは、ヨコバイ類由来のＤＮＡを増幅した増幅産物が生じない、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項5】

イネウンカ類を識別するためのマルチプレックスＰＣＲ用のプライマーセットであって、以下の（ａ）～（ｄ）のプライマー：
（ａ）配列番号１に示す塩基配列における２０の連続する塩基を含む第１のプライマー；
（ｂ）配列番号２に示す塩基配列における２１の連続する塩基を含む第２のプライマー；
（ｃ）配列番号３に示す塩基配列における２０の連続する塩基を含む第３のプライマー；及び
（ｄ）配列番号４に示す塩基配列における２１の連続する塩基を含む第４のプライマー；を含むプライマーセットを含み、
前記イネウンカ類は、トビイロウンカ、セジロウンカ、及び、ヒメトビウンカである、プライマーセット。

【請求項6】

請求項５に記載のプライマーセットを備えた、イネウンカ類を識別するキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、イネウンカ類を識別する方法、プライマーセット、及び、識別するキットに関する。

【背景技術】

【0002】

アジア地域における水稲の重要害虫であるイネウンカ類には、トビイロウンカ（Nilaparvata lugens）、セジロウンカ（Sogatella furcifera）、ヒメトビウンカ（Laodelphax striatellus）の３種が含まれる。イネウンカ類は、直接の吸汁によってイネの坪枯れ被害を引き起こすほかに、様々なイネのウイルス病を媒介することで、水稲の収量に多大な悪影響を及ぼす。種ごとに異なる殺虫剤に対する抵抗性を発達させているイネウンカ類の防除指針の迅速な策定には、水田におけるイネウンカ類の種ごとの発生状況を早期に把握することが求められる。

【0003】

イネウンカ類３種は、日本を含めたアジア地域の水田において同時に見られることが多い。イネウンカ類の種の識別は、主に個体の形態形質に基づき行われている。しかし、形態によるイネウンカ類の種の同定には、専門知識と経験を必要とする。特に、イネウンカ類の若齢幼虫では、形態からの正確な種の識別が極めて困難である。そのため、水田におけるイネウンカ類各種の正確な発生量の早期把握が妨げられている。

【0004】

イネウンカ類の種の識別方法として、遺伝子診断技術が挙げられる。遺伝子診断によれば、形態形質に基づく種の同定に関する専門知識や経験、さらには個体の発育ステージに関わらず、イネウンカ類の正確な種の識別が可能である。非特許文献１には、イネウンカ類３種の種特異的プライマー対を用いたシングルプレックスPCR法による識別が記載されている。また、非特許文献２には、イネウンカ類３種の種特異的プライマー対と蛍光プローブを用いたマルチプレックスＰＣＲ法による識別が記載されている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【文献】Liu et al. 2009 Acta Entomologica Sinica 52(11):1266-1272

【文献】Wang et al. 2013 Molecular Ecology Resources 13:811-819

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

非特許文献１の技術では、イネウンカ類３種の種特異的プライマー対を用いた複数回のPCRとアガロースゲル電気泳動を行わなければならない。非特許文献２の技術では、蛍光プローブを用いたマルチプレックスＰＣＲを行うため、アガロースゲル電気泳動よりも費用のかかるシーケンサーを用いた解析が必要である。

【0007】

したがって、より低コストかつ簡易な方法で、イネウンカ類の種を識別できる技術が求められている。

【0008】

本発明の一態様は、イネウンカ類の種を容易に識別する技術を実現することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0009】

上記の課題を解決するために、本発明の一態様に係るイネウンカ類を識別する方法は、イネウンカ類のｒＤＮＡにおけるＩＴＳ２（Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ Ｓｐａｃｅｒ ２）領域内の少なくとも一部を増幅するように設計したプライマーセットを用いて、イネウンカ類由来のＤＮＡが含まれ得る試料をマルチプレックスＰＣＲに供し、増幅産物の電気泳動パターンを解析する。

【0010】

また、本発明の一態様に係るプライマーセットは、
イネウンカ類を識別するためのマルチプレックスＰＣＲ用のプライマーセットであって、以下の（ａ）～（ｄ）のプライマー：
（ａ）配列番号１に示す塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１のプライマー；
（ｂ）配列番号２に示す塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２のプライマー；
（ｃ）配列番号３に示す塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第３のプライマー；及び
（ｄ）配列番号４に示す塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第４のプライマー；を含む。

【0011】

さらに、本発明の一態様に係るプライマーセットは、
イネウンカ類を識別するためのＰＣＲ用のプライマーセットであって、以下の（ａ）のプライマーと、以下の（ｂ）～（ｄ）からなる群より選択される少なくとも１種のプライマー：
（ａ）配列番号１に示す塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１のプライマー；
（ｂ）配列番号２に示す塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２のプライマー；
（ｃ）配列番号３に示す塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第３のプライマー；
（ｄ）配列番号４に示す塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第４のプライマー；を含む。

【0012】

また、本発明の一態様に係るイネウンカ類を識別するキットは、上述したいずれかのプライマーセットを備えている。

【発明の効果】

【0013】

本発明の一態様によれば、イネウンカ類の種を容易に識別することができる。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】実施例１の結果を示す図である。

【図2】実施例２の結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0015】

以下、本発明を詳細に説明する。なお、本明細書中に記載された文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。また、本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ～Ｂ」は、「Ａ以上（Ａを含みかつＡより大きい）、Ｂ以下（Ｂを含みかつＢより小さい）」を意味する。

【0016】

本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、「核酸」又は「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。ここで、核酸は、ＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡ若しくはゲノムＤＮＡ）、又は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態にて存在し得る。ＤＮＡ又はＲＮＡは、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡは、コード鎖（センス鎖）であっても、非コード鎖（アンチセンス鎖）であってもよい。本明細書において使用される場合、塩基の表記は、適宜ＩＵＰＡＣ及びＩＵＢの定める１文字表記を使用する。

【0017】

本発明の一形態は、イネウンカ類を識別するための技術である。本発明の一形態は、イネウンカ類のｒＤＮＡに存在するＩＴＳ２（Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ Ｓｐａｃｅｒ ２）領域の少なくとも一部を増幅し、増幅産物の電気泳動パターンを解析することで、イネウンカ類を識別する。

【0018】

イネウンカ類は、イネを吸汁することによってイネの坪枯れ被害や様々な病気を発生させる、アジア地域における水稲の重要害虫である。イネウンカ類には、トビイロウンカ（Nilaparvata lugens）、セジロウンカ（Sogatella furcifera）及びヒメトビウンカ（Laodelphax striatellus）が含まれる。本発明の一形態は、トビイロウンカ、セジロウンカ、及び、ヒメトビウンカのイネウンカ類３種を識別するための技術である。イネウンカ類の水田における近縁の昆虫は、ヨコバイ類である。ヨコバイ類は、水田においてイネウンカ類と同時に見られ、同様にイネを吸汁してウイルス病を媒介する。ヨコバイ類には、ツマグロヨコバイ（Nephotettix cincticeps）及びイナズマヨコバイ（Maiestas dorsalis）が含まれる。

【0019】

イネウンカ類の防除指針の迅速な策定には、水田におけるイネウンカ類の種ごとの発生状況を早期に把握することが求められており、本発明によれば、イネウンカ類の複数の種を一度に識別することが可能である。すなわち、本発明によれば、イネウンカ類の種を容易に識別することができる。

【0020】

（イネウンカ類の識別方法）
本発明の一形態に係るイネウンカ類を識別する方法は、イネウンカ類のｒＤＮＡにおけるＩＴＳ２領域内の少なくとも一部を増幅するように設計したプライマーセットを用いて、イネウンカ類由来のＤＮＡが含まれ得る試料をマルチプレックスＰＣＲに供し、増幅産物の電気泳動パターンを解析する、方法である。

【0021】

本発明の一形態に係るイネウンカ類の識別方法においては、マルチプレックスＰＣＲにより試料中のイネウンカ類由来のＤＮＡを増幅する。増幅するイネウンカ類由来のＤＮＡは、イネウンカ個体由来のＤＮＡであり、イネウンカ類の任意の組織から、従来公知の方法にしたがって抽出し、必要に応じて精製して、増幅反応に供する。

【0022】

ＤＮＡを抽出するイネウンカ類の組織には、全身、脚部、頭部、胸部、腹部等が含まれる。また、イネウンカ類は、若齢幼虫から成虫までのいずれの発育ステージであってもよいが、早期識別の観点や形態による識別の困難性を考慮すれば、幼虫（特に若齢幼虫）が好ましい場合がある。本発明の一形態に係る識別方法において、識別の対象となるイネウンカ類は、粘着板払い落し法にて捕獲したイネウンカ類個体（幼虫及び成虫を含む）に限定されず、捕虫網や吸虫管等を用いて捕獲した個体であってもよい。

【0023】

ＤＮＡの抽出方法は特に限定されず、フェノール抽出法、アルカリＳＤＳ法等が例として挙げられるが、Ｃｈｅｌｅｘ法により簡易抽出してもよい。また、市販のＤＮＡ抽出キットを用いてイネウンカ類からＤＮＡを抽出してもよい。

【0024】

マルチプレックスＰＣＲに供する、イネウンカ類由来のＤＮＡが含まれ得る試料は、イネから捕獲した昆虫（成虫、幼虫等）由来のＤＮＡが含まれる試料であり得る。イネからの昆虫の捕獲方法は特に限定されず、上述したいずれかの捕獲方法であってもよい。また、イネから捕獲した昆虫は、イネウンカ類及びヨコバイ類であり得る。

【0025】

イネウンカ類のｒＤＮＡにおけるＩＴＳ２領域（５．８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子と２８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子との間）内の少なくとも一部を増幅するように設計したプライマーセットは、増幅反応の際にイネウンカ類のｒＤＮＡにおけるＩＴＳ２領域内の所定の位置に特異的にアニーリングするように、５．８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子内もしくはＩＴＳ２領域内の部分配列又はこれらの相補配列を含むように作成したプライマーセットを意味している。

【0026】

本発明の一形態に係る識別方法において用いられるプライマーセットは、イネウンカ類各種について、日本国内で採集された採集場所及び採集年の異なる１０個体の５．８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子及びＩＴＳ２領域のＤＮＡシーケンス解析により得られた塩基配列情報と、ＧｅｎＢａｎｋに登録されているイネウンカ類３種の塩基配列情報（GenBank accession numbers：KC660120-KC660122及びAB625596-AB625609）に基づき、設計されたものである。このように、本発明の一形態に係る識別方法において用いられるプライマーセットは、採集場所及び採集時期の異なる複数個体の遺伝子配列に基づき設計されているので、塩基配列多型に対応したイネウンカ類の識別が可能である。

【0027】

本発明の一形態に係る識別方法において用いられるプライマーセットに含まれる各プライマーの長さは、例えば、１５ｂｐ以上、１６ｂｐ以上、１７ｂｐ以上、１８ｂｐ以上、または１９ｂｐ以上であってもよく、５０ｂｐ以下、４０ｂｐ以下、または３０ｂｐ以下であってもよい。各プライマーは、オリゴヌクレオチドにさらに標識物質等の修飾が施されていてもよい。

【0028】

本発明の一形態に係る識別方法において用いられるプライマーセットは、以下の（ａ）～（ｄ）のプライマー：
（ａ）配列番号１に示す塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１のプライマー；
（ｂ）配列番号２に示す塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２のプライマー；
（ｃ）配列番号３に示す塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第３のプライマー；及び
（ｄ）配列番号４に示す塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第４のプライマー；を含むプライマーセットであり得る。

【0029】

第１のプライマーは、配列番号１に示す塩基配列における１５以上の連続する塩基を含むプライマーであり、一例として、本実施例のプライマーＵｎｋａ０１Ｆ３が挙げられる。第１のプライマーは、イネウンカ類３種に共通するフォワードプライマーである。

【0030】

第２のプライマーは、配列番号２に示す塩基配列における１５以上の連続する塩基を含むプライマーであり、一例として、本実施例のプライマーＵｎｋａＴ０１Ｒが挙げられる。第２のプライマーは、トビイロウンカ由来のＤＮＡを増幅するリバースプライマーである。

【0031】

第３のプライマーは、配列番号３に示す塩基配列における１５以上の連続する塩基を含むプライマーであり、一例として、本実施例のプライマーＵｎｋａＳ０１Ｒが挙げられる。第３のプライマーは、セジロウンカ由来のＤＮＡを増幅するリバースプライマーである。

【0032】

第４のプライマーは、配列番号４に示す塩基配列における１５以上の連続する塩基を含むプライマーであり、一例として、本実施例のプライマーＵｎｋａＨ０１Ｒが挙げられる。第４のプライマーは、ヒメトビウンカ由来のＤＮＡを増幅するリバースプライマーである。

【0033】

上記プライマーセットを用いたイネウンカ類由来のＤＮＡの増幅は、１つのＰＣＲ反応系に複数のプライマー対を同時に使用し、複数のＤＮＡを同時に増幅できるマルチプレックスＰＣＲにより行う。なお、上記プライマーセットは、１つのＰＣＲ反応系に１対のプライマーを使用し、ＰＣＲ反応を複数回行うことでイネウンカ類を識別する方法にも適用することができる。

【0034】

ＰＣＲの反応条件は、用いるＤＮＡポリメラーゼおよびＰＣＲ装置の種類、増幅断片の長さ等に応じて適宜に設定され得る。サイクル条件としては、変性工程、アニーリング工程および伸長工程の３工程を１サイクルとする３ステップＰＣＲ法、および、変性工程とアニーリングおよび伸長工程との２工程を１サイクルとする２ステップＰＣＲ法を適用することができる。ＰＣＲ反応条件の一例としては、９０～１００℃で４０～６０秒（例えば、９５°Ｃで６０秒）、続いて９０～１００℃で２０～４０秒（例えば、９４℃で３０秒）、５０～６０℃で２０～４０秒（例えば、５６℃で３０秒）、及び６５～７５℃で２０～４０秒（例えば、７２℃で３０秒）を２５～３５サイクル（例えば、３０サイクル）、最後に６５～７５℃で４～６分（例えば、７２℃で５分）である。鋳型となるＤＮＡの状態に応じて、ＰＣＲ反応条件を調整してもよい。

【0035】

ＰＣＲ反応において使用するプライマーセットに含まれる各プライマーの量はそれぞれ１００ｎＭ～５００ｎＭであればよく、１２０ｎＭ～４５０ｎＭであることが好ましく、例えば、１５０ｎＭである。また、ＰＣＲ反応において増幅の対象となる抽出ＤＮＡの量は０．５μＬ～３μＬであればよく、０．７５μＬ～２μＬであることが好ましく、例えば、１μＬである。

【0036】

本発明の一形態に係る識別方法においては、マルチプレックスＰＣＲにより得られた増幅産物を電気泳動に供し、得られた電気泳動パターンを解析して、イネウンカ類を識別する。増幅産物の電気泳動は、アガロースゲル電気泳動、アクリルアミドゲル電気泳動等の公知の方法により行う。電気泳動により分離したバンドの検出は、エチジウム染色により行ってもよいし、蛍光標識した場合には蛍光発色を指標として行ってもよい。

【0037】

電気泳動パターンは、増幅産物を電気泳動して得られたバンド（核酸断片）のパターンを意味しており、バンドの有無及びバンドの位置（核酸断片の塩基長）が含まれる。また、電気泳動パターンには、バンドの濃淡（核酸断片の存在量）が含まれてもよい。

【0038】

電気泳動パターンの解析において、前記増幅産物のサイズが４８０ｂｐ～５６０ｂｐであるとき、好ましくは４９０ｂｐ～５４０ｂｐであるとき、より好ましくは５００ｂｐ～５２０ｂｐであるとき、例えば、５０１ｂｐであるとき、トビイロウンカ由来のＤＮＡであると判定し得る。

【0039】

電気泳動パターンの解析において、前記増幅産物のサイズが１６５ｂｐ～２４５ｂｐであるとき、好ましくは１７０ｂｐ～２２０ｂｐであるとき、より好ましくは１８０ｂｐ～２００ｂｐであるとき、例えば、１８４ｂｐであるとき、セジロウンカ由来のＤＮＡであると判定し得る。

【0040】

電気泳動パターンの解析において、前記増幅産物のサイズが３００ｂｐ～３８０ｂｐであるとき、好ましくは３１０ｂｐ～３６０ｂｐであるとき、より好ましくは３１５ｂｐ～３５０ｂｐであるとき、例えば、３１９ｂｐであるとき、ヒメトビウンカ由来のＤＮＡであると判定し得る。

【0041】

また、本発明の一形態に係る識別方法によれば、マルチプレックスＰＣＲでは、ヨコバイ類由来のＤＮＡを増幅した増幅産物が生じない。したがって、イネウンカ類をその近縁のヨコバイ類と混同せずに明確に識別することができる。

【0042】

本発明の一形態に係る識別方法によれば、イネウンカ類由来のＤＮＡが含まれ得る試料をマルチプレックスＰＣＲに供し、増幅産物の電気泳動パターンを解析することで、複数の種類のイネウンカ類を一度のＰＣＲ反応により識別することができる。

【0043】

（プライマーセット）
本発明の一形態に係るプライマーセットは、イネウンカ類を識別するためのマルチプレックスＰＣＲ用のプライマーセットであって、以下の（ａ）～（ｄ）のプライマー：
（ａ）配列番号１に示す塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１のプライマー；
（ｂ）配列番号２に示す塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２のプライマー；
（ｃ）配列番号３に示す塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第３のプライマー；及び
（ｄ）配列番号４に示す塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第４のプライマー；を含む。

【0044】

上述した本発明の一形態に係るイネウンカ類の識別方法において用いられるプライマーセットは本発明に係るプライマーセットの一態様である。したがって、本発明に係るプライマーセットの詳細は、上述した本発明の一形態に係るイネウンカ類の識別方法の説明に準じる。

【0045】

また、本発明の一形態に係るプライマーセットは、イネウンカ類を識別するためのＰＣＲ用のプライマーセットであって、以下の（ａ）のプライマーと、以下の（ｂ）～（ｄ）からなる群より選択される少なくとも１種のプライマー：
（ａ）配列番号１に示す塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１のプライマー；
（ｂ）配列番号２に示す塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２のプライマー；
（ｃ）配列番号３に示す塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第３のプライマー；
（ｄ）配列番号４に示す塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第４のプライマー；を含む。

【0046】

すなわち、本発明のプライマーセットを用いれば、１つのＰＣＲ反応系において１対のプライマーを用い、ＰＣＲ反応を複数回行う方法によっても、イネウンカ類を識別することができる。

【0047】

（イネウンカ類の識別キット）
本発明の一形態に係るイネウンカ類の識別キットは、本発明の一形態に係るプライマーセットを備えた、イネウンカ類を識別するキットである。したがって、本発明に係るイネウンカ類の識別キットの詳細は、上述した本発明の一形態に係るイネウンカ類の識別方法及びプライマーセットの説明に準じる。

【0048】

本発明の一形態に係るイネウンカ類の識別キットは、上述したプライマーセットの他に、マルチプレックスＰＣＲに必要な試薬類、ＤＮＡ抽出用試薬、使用説明書等を含んでもよい。

【0049】

本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。

【実施例】

【0050】

本発明の一実施例について以下に説明する。本発明の一形態にかかるプライマーセットを用いて、イネウンカ類３種を遺伝子診断した。

【0051】

（プライマーの設計）
イネウンカ類各種について、日本国内で採集された採集場所と採集年の異なる１０個体の５．８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子およびＩＴＳ２領域のＤＮＡシーケンス解析を行った。上記解析で得られた塩基配列情報と、ＧｅｎＢａｎｋに登録されている海外の複数国で採集されたイネウンカ類３種の塩基配列情報（GenBank accession numbers KC660120-KC660122 and AB625596-AB625609）に基づき、イネウンカ類３種の識別を目的とした新規プライマーセットを設計した（表１）

【表1】

【0052】

（実施例１）
熊本県合志市及び鹿児島南さつま市から入手したイネウンカ類３種それぞれの室内飼育虫の成虫及び終齢幼虫から脚を採取した。また、熊本県合志市及び鹿児島南さつま市から入手したイネウンカ類の室内飼育虫の若齢幼虫の全身を用いた。採取した脚及び全身から、Ｃｈｅｌｅｘ法により個体毎にＤＮＡを簡易抽出した。

【0053】

表１に示すプライマーセットを用いて、上記の抽出ＤＮＡを鋳型に、ＰＣＲ（９５℃で１分、続いて９４℃で３０秒、５６℃で３０秒、及び７２℃で３０秒を３０サイクル、最後に７２℃で５分）を実施した。ＰＣＲ反応に用いたプライマーの量はそれぞれ１５０ｎＭ、抽出ＤＮＡの量は１μＬとした。

【0054】

ＰＣＲ産物にＳＡＦＥＬＯＯＫ（登録商標）ロードグリーン（富士フィルム和光純薬社製）を加え、３％アガロースゲル電気泳動を行った。青色ＬＥＤを用いて、分離したバンドを観察した。結果を図１に示す。図１に示すように、トビイロウンカ（５０１ｂｐ）、セジロウンカ（１８４ｂｐ）、及びヒメトビウンカ（３１９ｂｐ）のそれぞれの核酸断片のバンドが検出された。このように、イネウンカ類３種それぞれについて特異的なＰＣＲ増幅産物が得られ、イネウンカ個体（成虫、終齢幼虫、若齢幼虫）の種を明確に識別できた。

【0055】

（実施例２）
発生予察調査で用いられる粘着板払い落し法により、野外水田圃場からイネウンカ類３種を採集した。ウンカ類に近縁のヨコバイ類で、水田においてイネウンカ類と同時に見られるツマグロヨコバイ及びイナズマヨコバイも採集した。

【0056】

イネウンカ類の成虫の脚、終齢幼虫の脚、若齢幼虫の全身及びヨコバイ類の成虫の脚のそれぞれから、Ｃｈｅｌｅｘ法により個体毎にＤＮＡを簡易抽出した。

【0057】

表１に示すプライマーセットを用いて、上記の抽出ＤＮＡを鋳型に、ＰＣＲ（９５℃で１分、続いて９４℃で３０秒、５６℃で３０秒、及び７２℃で３０秒を３０サイクル、最後に７２℃で５分）を実施した。ＰＣＲ反応に用いたプライマーの量はそれぞれ１５０ｎＭ、抽出ＤＮＡの量は１μＬとした。

【0058】

ＰＣＲ産物にＳＡＦＥＬＯＯＫ（登録商標）ロードグリーン（富士フィルム和光純薬社製）を加え、３％アガロースゲル電気泳動を行った。青色ＬＥＤを用いて、分離したバンドを観察した。結果を図２に示す。図２に示すように、トビイロウンカ（５０１ｂｐ）、セジロウンカ（１８４ｂｐ）、及びヒメトビウンカ（３１９ｂｐ）のそれぞれの核酸断片のバンドが検出された。また、ツマグロヨコバイとイナヅマヨコバイではPCR増幅産物が得られないことを確認した。

【0059】

このように、ヨコバイ類と混同せずにイネウンカ類個体の種を明確に識別することができた。

【産業上の利用可能性】

【0060】

本発明は、農業分野、農薬分野等に利用することができる。

【図1】

【図2】

【配列表】

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