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特許7497061ＲＮＡ分子、キメラ型ＮＡ分子、二本鎖ＲＮＡ分子、および二本鎖キメラ型ＮＡ分子
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-05-31
(45)【発行日】2024-06-10
(54)【発明の名称】ＲＮＡ分子、キメラ型ＮＡ分子、二本鎖ＲＮＡ分子、および二本鎖キメラ型ＮＡ分子
(51)【国際特許分類】
C12N 15/113 20100101AFI20240603BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240603BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20240603BHJP
A61K 31/713 20060101ALI20240603BHJP
A61K 31/712 20060101ALI20240603BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20240603BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240603BHJP
【ＦＩ】
C12N15/113 Z ZNA
A61P35/00
A61K31/7105
A61K31/713
A61K31/712
A61P35/02
A61K48/00
【請求項の数】
17
(21)【出願番号】P 2021533105
(86)(22)【出願日】2020-07-16
(86)【国際出願番号】 JP2020027738
(87)【国際公開番号】W WO2021010449
(87)【国際公開日】2021-01-21
【審査請求日】2023-06-16
(31)【優先権主張番号】P 2019130966
(32)【優先日】2019-07-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）令和元年度、国立研究開発法人科学技術振興機構、研究成果展開事業、研究題目「１塩基変異遺伝子を正常遺伝子と区別して抑制するＲＮＡ干渉技術の開発」、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(73)【特許権者】
【識別番号】504137912
【氏名又は名称】国立大学法人 東京大学
(74)【代理人】
【識別番号】110000176
【氏名又は名称】弁理士法人一色国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】程 久美子
(72)【発明者】
【氏名】小林 芳明
(72)【発明者】
【氏名】西郷 薫
(72)【発明者】
【氏名】名取 幸和
(72)【発明者】
【氏名】佐藤 淳
(72)【発明者】
【氏名】浅野 吉政
【審査官】福澤 洋光
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１７－５０２６６５（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１９－０８８１９６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１０－５３８６７７（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１８／０９８３２８（ＷＯ，Ａ１）
【文献】ACS Omega，2017年，Vol.2，pp.2055-2064
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １／００－１５／９０
ＣＡｐｌｕｓ／ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
遺伝子の野生型アレルに対して一塩基の点突然変異を有する変異型アレルをターゲット遺伝子とするＲＮＡ干渉法において用いるためのＲＮＡ分子であって、以下の要件を満たすＲＮＡ分子である：（１）下記（２－１）で規定した塩基を除いて前記変異型アレルのコーディング領域と相補的な塩基配列を有すること；
（２）前記変異型アレルと相補的な塩基配列の最も５’側の塩基から数えて
（２－１）５番目または６番目の塩基が前記変異型アレルの塩基に対してミスマッチであること；
（２－２）１０番目または１１番目は前記点突然変異の位置に対応し、１０番目または１１番目の塩基は前記変異型アレルが有する塩基に対応すること；及び
（２－３）６－８番目または７－８番目のリボヌクレオチドにおいて、五炭糖の２’位がＯＣＨ３、ハロゲン、またはＬＮＡで修飾されていること。
【請求項2】
前記ハロゲンがＦである、請求項１に記載のＲＮＡ分子。【請求項3】
請求項１の（１）で規定された塩基配列の５’末端の塩基がシトシンまたはグアニンである場合、アデニンまたはウラシルに置換されている、請求項１または２に記載のＲＮＡ分子。【請求項4】
請求項１の（１）で規定された塩基配列の３’ 末端の塩基がアデニンまたはウラシルである場合、シトシンまたはグアニンに置換されている、請求項１～３のいずれか１項に記載のＲＮＡ分子。【請求項5】
１３～２８個のヌクレオチドからなる、請求項１～４のいずれか１項に記載のＲＮＡ分子。【請求項6】
請求項１の（１）で規定された塩基配列の３’ 末端に、さらに、１～３個のヌクレオチドを有する、請求項１～５のいずれか１項に記載のＲＮＡ分子。【請求項7】
請求項１～６のいずれか１項に記載のＲＮＡ分子において１個または複数個のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、人工核酸、または核酸類縁体に置換されている、キメラ型ＮＡ分子。【請求項8】
請求項１～５のいずれか１項に記載のＲＮＡ分子がガイド鎖であって、前記ＲＮＡ分子に相補的な配列を有するＲＮＡ分子がパッセンジャー鎖である、二本鎖ＲＮＡ分子。【請求項9】
ガイド鎖の３’末端及び／又はパッセンジャー鎖の３’末端にオーバーハング部位を有する、請求項８に記載の二本鎖ＲＮＡ分子。【請求項10】
前記オーバーハング部位が１～３個のヌクレオチドからなる、請求項９に記載の二本鎖ＲＮＡ分子。【請求項11】
請求項８～１０のいずれか１項に記載の二本鎖ＲＮＡ分子において１個または複数個のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、人工核酸、または核酸類縁体に置換されている、二本鎖キメラ型ＮＡ分子。【請求項12】
ＲＮＡ干渉法においてガイド鎖として用いるためのＲＮＡ分子の製造方法であって、請求項１～６のいずれか１項に記載のＲＮＡ分子を製造する工程を含む、製造方法。
【請求項13】
ＲＮＡ干渉法においてガイド鎖として用いるためのキメラ型ＮＡ分子の製造方法であって、請求項７に記載のキメラ型ＮＡ分子を製造する工程を含む、製造方法。
【請求項14】
遺伝子の野生型アレルと、一塩基の点突然変異を有する前記遺伝子の変異型アレルを有する細胞において、前記変異型アレルをターゲット遺伝子とするＲＮＡ干渉法であって、請求項１～６のいずれか１項に記載のＲＮＡ分子、請求項７に記載のキメラ型ＮＡ分子、請求項８～１０のいずれか１項に記載の二本鎖ＲＮＡ分子または請求項１１に記載の二本鎖キメラ型ＮＡ分子を、前記細胞に導入する工程を含む、ＲＮＡ干渉法。
【請求項15】
腫瘍遺伝子の野生型アレルと、一塩基の点突然変異を有する前記腫瘍遺伝子の変異型アレルを有し、前記点突然変異が腫瘍化の原因である腫瘍細胞を含む腫瘍を持つ患者の治療薬であって、請求項１～６のいずれか１項に記載のＲＮＡ分子、請求項７に記載のキメラ型ＮＡ分子、請求項８～１０のいずれか１項に記載の二本鎖ＲＮＡ分子または請求項１１に記載の二本鎖キメラ型ＮＡ分子を有効成分とする、治療薬。
【請求項16】
ターゲット遺伝子を抑制するためのＲＮＡ干渉法において用いるためのＲＮＡ分子、キメラ型ＮＡ分子、二本鎖ＲＮＡ分子または二本鎖キメラ型ＮＡ分子の選択方法であって、請求項１１のＲＮＡ干渉法を、複数の請求項１～６のいずれか１項に記載のＲＮＡ分子、請求項７に記載のキメラ型ＮＡ分子、請求項８～１０のいずれか１項に記載の二本鎖ＲＮＡ分子または請求項１１に記載の二本鎖キメラ型ＮＡ分子のそれぞれを用いてin vitroで行うことによって、前記複数のＲＮＡ分子、キメラ型ＮＡ分子、二本鎖ＲＮＡ分子または二本鎖キメラ型ＮＡ分子の前記ターゲット遺伝子に対する特異的な遺伝子発現抑制能を調べる工程と、
前記特異的な遺伝子発現抑制能が所定レベル以上であるＲＮＡ分子、キメラ型ＮＡ分子、二本鎖ＲＮＡ分子または二本鎖キメラ型ＮＡ分子を選択する工程と、
を含む、ＲＮＡ分子、キメラ型ＮＡ分子、二本鎖ＲＮＡ分子または二本鎖キメラ型ＮＡ分子の選択方法。
【請求項17】
前記遺伝子がＫ－ｒａｓ遺伝子であって、前記野生型アレルがＫ－ｒａｓ（ｗｔ）アレルであって、前記変異アレルがＫ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ａ）アレル、Ｋ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ｔ）アレル、またはＫ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ｃ）アレルである、請求項１～６のいずれか１項に記載のＲＮＡ分子。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＲＮＡ干渉法に用いるための、ＲＮＡ分子、キメラ型ＮＡ分子、二本鎖ＲＮＡ分子、および二本鎖キメラ型ＮＡ分子に関する。
【背景技術】
【0002】
ＲＮＡ干渉法は、細胞内で、特定のターゲット遺伝子の発現を特異的に抑制するための簡便で効率的な方法である。
【0003】
しかし、当初予測されたよりも、本来のターゲットではない遺伝子（オフターゲット）に対しても、その遺伝子発現を抑制することが知られてきた（Jackson, A.L. et al., (2003) Nature Biotechnology vol.21, p.635-7）。特に、ターゲット遺伝子に対するｓｉＲＮＡのアフィニティが強くなれば、オフターゲット効果も大きくなることが明らかになっている（Ui-Tei, K. et al., (2008) Nucleic Acids Res. vol.36, p.7100-7109）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
本発明は、新規なＲＮＡ分子、新規なキメラ型ＮＡ分子、新規な二本鎖ＲＮＡ分子、および新規な二本鎖キメラ型ＮＡ分子を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0005】
本発明者らは、オフターゲット効果の低いＲＮＡ配列を特定するために、鋭意努力していたところ、５番目または６番目の塩基にミスマッチを有し、６－８番目または７－８番目のリボヌクレオチドにおいて五炭糖の２’位を修飾することにより、１０番目または１１番目の塩基について、特にオフターゲット効果が低くなることを見出した。このことから、ある遺伝子の野生型アレルに対して一塩基の点突然変異を有する変異型アレルをターゲット遺伝子とするＲＮＡ干渉法において、１０番目または１１番目の塩基が点突然変異の位置に対応し、変異型アレルの有する塩基であるようにＲＮＡ分子を設計し、このＲＮＡ分子をガイド鎖とする二本鎖ＲＮＡ分子をＲＮＡ干渉法に用いることにより、野生型アレルの発現を事実上抑制しないで、変異型アレルの発現を主に抑制することに成功し、本発明の完成に至った。
【0006】
［１］一般的な遺伝子
［１－１］ 本発明の一実施態様は、遺伝子の野生型アレルに対して一塩基の点突然変異を有する変異型アレルをターゲット遺伝子とするＲＮＡ干渉法において用いるためのＲＮＡ分子であって、以下の要件を満たすＲＮＡ分子である：
（１）下記（２－１）で規定した塩基を除いて前記変異型アレルのコーディング領域と相補的な塩基配列を有すること；
（２）前記変異型アレルと相補的な塩基配列の最も５’側の塩基から数えて
（２－１）５番目または６番目の塩基が前記変異型アレルの塩基に対してミスマッチであること；
（２－２）１０番目または１１番目は前記点突然変異の位置に対応し、１０番目または１１番目の塩基は前記変異型アレルが有する塩基に対応すること；及び
（２－３）６－８番目または７－８番目のリボヌクレオチドにおいて、五炭糖の２’位がＯＣＨ３、ハロゲン、またはＬＮＡで修飾されていること。前記ハロゲンがＦであってもよい。上記（１）で規定された塩基配列の５’末端の塩基がアデニンまたはウラシルでない場合、アデニンまたはウラシルに置換してもよい。上記（１）で規定された塩基配列の３’ 末端の塩基がシトシンまたはグアニンでない場合、シトシンまたはグアニンに置換してもよい。上記いずれのＲＮＡ分子も、１３～２８個のヌクレオチドからなっていてもよい。上記いずれのＲＮＡ分子も、１個または複数個のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、人工核酸、または核酸類縁体に置換されている、キメラ型ＮＡ分子であってもよい。
［１－１］ 本発明の一実施態様は、遺伝子の野生型アレルに対して一塩基の点突然変異を有する変異型アレルをターゲット遺伝子とするＲＮＡ干渉法において用いるためのＲＮＡ分子であって、以下の要件を満たすＲＮＡ分子である：
（１）下記（２－１）で規定した塩基を除いて前記変異型アレルのコーディング領域と相補的な塩基配列を有すること；
（２）前記変異型アレルと相補的な塩基配列の最も５’側の塩基から数えて
（２－１）５番目または６番目の塩基が前記変異型アレルの塩基に対してミスマッチであること；
（２－２）１０番目または１１番目は前記点突然変異の位置に対応し、１０番目または１１番目の塩基は前記変異型アレルが有する塩基に対応すること；及び
（２－３）６－８番目または７－８番目のリボヌクレオチドにおいて、五炭糖の２’位がＯＣＨ３、ハロゲン、またはＬＮＡで修飾されていること。前記ハロゲンがＦであってもよい。上記（１）で規定された塩基配列の５’末端の塩基がアデニンまたはウラシルでない場合、アデニンまたはウラシルに置換してもよい。上記（１）で規定された塩基配列の３’ 末端の塩基がシトシンまたはグアニンでない場合、シトシンまたはグアニンに置換してもよい。上記いずれのＲＮＡ分子も、１３～２８個のヌクレオチドからなっていてもよい。上記いずれのＲＮＡ分子も、１個または複数個のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、人工核酸、または核酸類縁体に置換されている、キメラ型ＮＡ分子であってもよい。
【0007】
［１－２］ 本発明のさらなる実施態様は、上記いずれかのＲＮＡ分子がガイド鎖であって、前記ＲＮＡ分子に相補的な配列を有するＲＮＡ分子がパッセンジャー鎖である、二本鎖ＲＮＡ分子である。ガイド鎖の３’末端及び／又はパッセンジャー鎖の３’末端にオーバーハング部位を有してもよい前記オーバーハング部位が１～３個のヌクレオチドからなっていてもよい。上記いずれの二本鎖ＲＮＡ分子においても、１個または複数個のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、人工核酸、または核酸類縁体に置換されている、二本鎖キメラ型ＮＡ分子であってもよい。
【0008】
［１－３］ 本発明のさらなる実施態様は、ＲＮＡ干渉法においてガイド鎖として用いるためのＲＮＡ分子の製造方法であって、上記いずれかのＲＮＡ分子を製造する工程を含む、製造方法である。ＲＮＡ分子は、１個または複数個のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、人工核酸、または核酸類縁体に置換されている、キメラ型ＮＡ分子であってもよい。
【0009】
［１－４］ 本発明のさらなる実施態様は、遺伝子の野生型アレルと、一塩基の点突然変異を有する前記遺伝子の変異型アレルを有する細胞において、前記変異型アレルをターゲット遺伝子とするＲＮＡ干渉法であって、上記いずれかのＲＮＡ分子、キメラ型ＮＡ分子、二本鎖ＲＮＡ分子または上記いずれかの二本鎖キメラ型ＮＡ分子を、前記細胞に導入する工程を含む、ＲＮＡ干渉法である。
【0010】
［１－５］ 本発明のさらなる実施態様は、腫瘍遺伝子の野生型アレルと、一塩基の点突然変異を有する前記腫瘍遺伝子の変異型アレルを有し、前記点突然変異が腫瘍化の原因である腫瘍細胞を含む腫瘍を持つ患者の治療薬であって、上記いずれかのＲＮＡ分子、キメラ型ＮＡ分子、二本鎖ＲＮＡ分子または上記いずれかの二本鎖キメラ型ＮＡ分子を有効成分とする、治療薬である。
【0011】
［１－６］ 本発明のさらなる実施態様は、ターゲット遺伝子を抑制するためのＲＮＡ干渉法において用いるためのＲＮＡ分子、キメラ型ＮＡ分子、二本鎖ＲＮＡ分子または二本鎖キメラ型ＮＡ分子の選択方法であって、上記ＲＮＡ干渉法を、複数の上記いずれかのＲＮＡ分子、キメラ型ＮＡ分子、二本鎖ＲＮＡ分子または上記いずれかの二本鎖キメラ型ＮＡ分子のそれぞれを用いてin vitroで行うことによって、前記複数のＲＮＡ分子、キメラ型ＮＡ分子、二本鎖ＲＮＡ分子または二本鎖キメラ型ＮＡ分子の前記ターゲット遺伝子に対する特異的な遺伝子発現抑制能を調べる工程と、前記特異的な遺伝子発現抑制能が所定レベル以上であるＲＮＡ分子、キメラ型ＮＡ分子、二本鎖ＲＮＡ分子または二本鎖キメラ型ＮＡ分子を選択する工程と、を含む、ＲＮＡ分子、キメラ型ＮＡ分子、二本鎖ＲＮＡ分子または二本鎖キメラ型ＮＡ分子の選択方法である。
【0012】
［２］Ｋ－ｒａｓ遺伝子
［２－１］ 本発明のさらなる実施態様は、［１－１］に記載のいずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＫ－ｒａｓ遺伝子であって、前記野生型アレルがＫ－ｒａｓ（ｗｔ）アレルであって、前記変異アレルがＫ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ａ）アレル、Ｋ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ｔ）アレル、またはＫ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ｃ）アレルである。前記（２－１）で規定した塩基を含めた前記変異型アレルのコーディング領域と相補的な塩基配列が
５’－ＵＣＣＵＡＣＧＣＣＡＵＣＡＧＣＵＣＣＡ－３’ （配列番号１）
５’－ＵＣＣＵＡＣＧＣＣＡＡＣＡＧＣＵＣＣＡ－３’ （配列番号２）
５’－ＵＣＣＵＡＣＧＣＣＡＧＣＡＧＣＵＣＣＡ－３’ （配列番号３）
のいずれかを有してもよい。また、前記ＲＮＡ分子において１個または複数個のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、人工核酸、または核酸類縁体に置換されていてもよい。
［２－１］ 本発明のさらなる実施態様は、［１－１］に記載のいずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＫ－ｒａｓ遺伝子であって、前記野生型アレルがＫ－ｒａｓ（ｗｔ）アレルであって、前記変異アレルがＫ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ａ）アレル、Ｋ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ｔ）アレル、またはＫ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ｃ）アレルである。前記（２－１）で規定した塩基を含めた前記変異型アレルのコーディング領域と相補的な塩基配列が
５’－ＵＣＣＵＡＣＧＣＣＡＵＣＡＧＣＵＣＣＡ－３’ （配列番号１）
５’－ＵＣＣＵＡＣＧＣＣＡＡＣＡＧＣＵＣＣＡ－３’ （配列番号２）
５’－ＵＣＣＵＡＣＧＣＣＡＧＣＡＧＣＵＣＣＡ－３’ （配列番号３）
のいずれかを有してもよい。また、前記ＲＮＡ分子において１個または複数個のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、人工核酸、または核酸類縁体に置換されていてもよい。
【0013】
［２－２］ 本発明のさらなる実施態様は、［１－２］に記載のいずれかの二本鎖ＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＫ－ｒａｓ遺伝子であって、前記野生型アレルがＫ－ｒａｓ（ｗｔ）アレルであって、前記変異アレルがＫ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ａ）アレル、Ｋ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ｔ）アレル、またはＫ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ｃ）アレルである。前記ガイド鎖において、前記（２－１）で規定した塩基を含めた前記変異型アレルのコーディング領域と相補的な塩基配列が
５’－ＵＣＣＵＡＣＧＣＣＡＵＣＡＧＣＵＣＣＡ－３’ （配列番号１）
５’－ＵＣＣＵＡＣＧＣＣＡＡＣＡＧＣＵＣＣＡ－３’ （配列番号２）
５’－ＵＣＣＵＡＣＧＣＣＡＧＣＡＧＣＵＣＣＡ－３’ （配列番号３）
のいずれかを有してもよい。また、前記二本鎖ＲＮＡ分子において１個または複数個のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、人工核酸、または核酸類縁体に置換されていてもよい。
５’－ＵＣＣＵＡＣＧＣＣＡＵＣＡＧＣＵＣＣＡ－３’ （配列番号１）
５’－ＵＣＣＵＡＣＧＣＣＡＡＣＡＧＣＵＣＣＡ－３’ （配列番号２）
５’－ＵＣＣＵＡＣＧＣＣＡＧＣＡＧＣＵＣＣＡ－３’ （配列番号３）
のいずれかを有してもよい。また、前記二本鎖ＲＮＡ分子において１個または複数個のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、人工核酸、または核酸類縁体に置換されていてもよい。
【0014】
［２－３］ 本発明のさらなる実施態様は、［１－３］に記載のいずれかの製造方法において、前記遺伝子がＫ－ｒａｓ遺伝子であって、前記野生型アレルがＫ－ｒａｓ（ｗｔ）アレルであって、前記変異アレルがＫ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ａ）アレル、Ｋ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ｔ）アレル、またはＫ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ｃ）アレルである。前記（２－１）で規定した塩基を含めた前記変異型アレルのコーディング領域と相補的な塩基配列が
５’－ＵＣＣＵＡＣＧＣＣＡＵＣＡＧＣＵＣＣＡ－３’ （配列番号１）
５’－ＵＣＣＵＡＣＧＣＣＡＡＣＡＧＣＵＣＣＡ－３’ （配列番号２）
５’－ＵＣＣＵＡＣＧＣＣＡＧＣＡＧＣＵＣＣＡ－３’ （配列番号３）
のいずれかを有してもよい。また、前記ＲＮＡ分子において１個または複数個のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、人工核酸、または核酸類縁体に置換されていてもよい。
５’－ＵＣＣＵＡＣＧＣＣＡＵＣＡＧＣＵＣＣＡ－３’ （配列番号１）
５’－ＵＣＣＵＡＣＧＣＣＡＡＣＡＧＣＵＣＣＡ－３’ （配列番号２）
５’－ＵＣＣＵＡＣＧＣＣＡＧＣＡＧＣＵＣＣＡ－３’ （配列番号３）
のいずれかを有してもよい。また、前記ＲＮＡ分子において１個または複数個のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、人工核酸、または核酸類縁体に置換されていてもよい。
【0015】
［２－４］ 本発明のさらなる実施態様は、［１－４］に記載のいずれかのＲＮＡ干渉法において、前記遺伝子がＫ－ｒａｓ遺伝子であって、前記野生型アレルがＫ－ｒａｓ（ｗｔ）アレルであって、前記変異アレルがＫ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ａ）アレル、Ｋ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ｔ）アレル、またはＫ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ｃ）アレルである。前記ガイド鎖において、前記（２－１）で規定した塩基を含めた前記変異型アレルのコーディング領域と相補的な塩基配列が
５’－ＵＣＣＵＡＣＧＣＣＡＵＣＡＧＣＵＣＣＡ－３’ （配列番号１）
５’－ＵＣＣＵＡＣＧＣＣＡＡＣＡＧＣＵＣＣＡ－３’ （配列番号２）
５’－ＵＣＣＵＡＣＧＣＣＡＧＣＡＧＣＵＣＣＡ－３’ （配列番号３）
のいずれかを有してもよい。また、前記二本鎖ＲＮＡ分子において１個または複数個のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、人工核酸、または核酸類縁体に置換されていてもよい。
５’－ＵＣＣＵＡＣＧＣＣＡＵＣＡＧＣＵＣＣＡ－３’ （配列番号１）
５’－ＵＣＣＵＡＣＧＣＣＡＡＣＡＧＣＵＣＣＡ－３’ （配列番号２）
５’－ＵＣＣＵＡＣＧＣＣＡＧＣＡＧＣＵＣＣＡ－３’ （配列番号３）
のいずれかを有してもよい。また、前記二本鎖ＲＮＡ分子において１個または複数個のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、人工核酸、または核酸類縁体に置換されていてもよい。
【0016】
［２－５］ 本発明のさらなる実施態様は、［１－５］に記載のいずれかの治療薬において、前記腫瘍遺伝子がＫ－ｒａｓ遺伝子であって、前記野生型アレルがＫ－ｒａｓ（ｗｔ）アレルであって、前記変異アレルがＫ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ａ）アレル、Ｋ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ｔ）アレル、またはＫ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ｃ）アレルである。前記ガイド鎖において、前記（２－１）で規定した塩基を含めた前記変異型アレルのコーディング領域と相補的な塩基配列が
５’－ＵＣＣＵＡＣＧＣＣＡＵＣＡＧＣＵＣＣＡ－３’ （配列番号１）
５’－ＵＣＣＵＡＣＧＣＣＡＡＣＡＧＣＵＣＣＡ－３’ （配列番号２）
５’－ＵＣＣＵＡＣＧＣＣＡＧＣＡＧＣＵＣＣＡ－３’ （配列番号３）
のいずれかを有してもよい。また、前記二本鎖ＲＮＡ分子において１個または複数個のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、人工核酸、または核酸類縁体に置換されていてもよい。
５’－ＵＣＣＵＡＣＧＣＣＡＵＣＡＧＣＵＣＣＡ－３’ （配列番号１）
５’－ＵＣＣＵＡＣＧＣＣＡＡＣＡＧＣＵＣＣＡ－３’ （配列番号２）
５’－ＵＣＣＵＡＣＧＣＣＡＧＣＡＧＣＵＣＣＡ－３’ （配列番号３）
のいずれかを有してもよい。また、前記二本鎖ＲＮＡ分子において１個または複数個のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、人工核酸、または核酸類縁体に置換されていてもよい。
【0017】
［２－６］ 本発明のさらなる実施態様は、［１－６］に記載のいずれかの選択方法において、前記遺伝子がＫ－ｒａｓ遺伝子であって、前記野生型アレルがＫ－ｒａｓ（ｗｔ）アレルであって、前記変異アレルがＫ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ａ）アレル、Ｋ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ｔ）アレル、またはＫ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ｃ）アレルである。
【0018】
［３］Ｎ－ｒａｓ遺伝子
［３－１］ 本発明のさらなる実施態様は、［１－１］に記載のいずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＮ－ｒａｓ遺伝子であって、前記野生型アレルがＮ－ｒａｓ（ｗｔ）アレルであって、前記変異アレルがＮ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ａ）またはＮ－ｒａｓ（ｃ．１８２Ａ＞Ｇ）アレルである。前記（２－１）で規定した塩基を含めた前記変異型アレルのコーディング領域と相補的な塩基配列が
５’－ＣＣＣＡＡＣＡＣＣＡＣＣＵＧＣＵＣＣＡ－３’（配列番号１４６）
５’－ＧＵＡＣＵＣＵＵＣＵＵＧＵＣＣＡＧＣＵ－３’（配列番号１４７）
のいずれかを有してもよい。また、前記ＲＮＡ分子において１個または複数個のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、人工核酸、または核酸類縁体に置換されていてもよい。
［３－１］ 本発明のさらなる実施態様は、［１－１］に記載のいずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＮ－ｒａｓ遺伝子であって、前記野生型アレルがＮ－ｒａｓ（ｗｔ）アレルであって、前記変異アレルがＮ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ａ）またはＮ－ｒａｓ（ｃ．１８２Ａ＞Ｇ）アレルである。前記（２－１）で規定した塩基を含めた前記変異型アレルのコーディング領域と相補的な塩基配列が
５’－ＣＣＣＡＡＣＡＣＣＡＣＣＵＧＣＵＣＣＡ－３’（配列番号１４６）
５’－ＧＵＡＣＵＣＵＵＣＵＵＧＵＣＣＡＧＣＵ－３’（配列番号１４７）
のいずれかを有してもよい。また、前記ＲＮＡ分子において１個または複数個のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、人工核酸、または核酸類縁体に置換されていてもよい。
【0019】
［３－２］ 本発明のさらなる実施態様は、［１－２］に記載のいずれかの二本鎖ＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＮ－ｒａｓ遺伝子であって、前記野生型アレルがＮ－ｒａｓ（ｗｔ）アレルであって、前記変異アレルがＮ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ａ）またはＮ－ｒａｓ（ｃ．１８２Ａ＞Ｇ）アレルである。前記ガイド鎖において、前記（２－１）で規定した塩基を含めた前記変異型アレルのコーディング領域と相補的な塩基配列が
５’－ＣＣＣＡＡＣＡＣＣＡＣＣＵＧＣＵＣＣＡ－３’（配列番号１４６）
５’－ＧＵＡＣＵＣＵＵＣＵＵＧＵＣＣＡＧＣＵ－３’（配列番号１４７）
のいずれかを有してもよい。また、前記二本鎖ＲＮＡ分子において１個または複数個のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、人工核酸、または核酸類縁体に置換されていてもよい。
５’－ＣＣＣＡＡＣＡＣＣＡＣＣＵＧＣＵＣＣＡ－３’（配列番号１４６）
５’－ＧＵＡＣＵＣＵＵＣＵＵＧＵＣＣＡＧＣＵ－３’（配列番号１４７）
のいずれかを有してもよい。また、前記二本鎖ＲＮＡ分子において１個または複数個のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、人工核酸、または核酸類縁体に置換されていてもよい。
【0020】
［３－３］ 本発明のさらなる実施態様は、［１－３］に記載のいずれかの製造方法において、前記遺伝子がＮ－ｒａｓ遺伝子であって、前記野生型アレルがＮ－ｒａｓ（ｗｔ）アレルであって、前記変異アレルがＮ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ａ）またはＮ－ｒａｓ（ｃ．１８２Ａ＞Ｇ）アレルである。前記（２－１）で規定した塩基を含めた前記変異型アレルのコーディング領域と相補的な塩基配列が
５’－ＣＣＣＡＡＣＡＣＣＡＣＣＵＧＣＵＣＣＡ－３’（配列番号１４６）
５’－ＧＵＡＣＵＣＵＵＣＵＵＧＵＣＣＡＧＣＵ－３’（配列番号１４７）
のいずれかを有してもよい。また、前記ＲＮＡ分子において１個または複数個のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、人工核酸、または核酸類縁体に置換されていてもよい。
５’－ＣＣＣＡＡＣＡＣＣＡＣＣＵＧＣＵＣＣＡ－３’（配列番号１４６）
５’－ＧＵＡＣＵＣＵＵＣＵＵＧＵＣＣＡＧＣＵ－３’（配列番号１４７）
のいずれかを有してもよい。また、前記ＲＮＡ分子において１個または複数個のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、人工核酸、または核酸類縁体に置換されていてもよい。
【0021】
［３－４］ 本発明のさらなる実施態様は、［１－４］に記載のいずれかのＲＮＡ干渉法において、前記遺伝子がＮ－ｒａｓ遺伝子であって、前記野生型アレルがＮ－ｒａｓ（ｗｔ）アレルであって、前記変異アレルがＮ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ａ）またはＮ－ｒａｓ（ｃ．１８２Ａ＞Ｇ）アレルである。前記ガイド鎖において、前記（２－１）で規定した塩基を含めた前記変異型アレルのコーディング領域と相補的な塩基配列が
５’－ＣＣＣＡＡＣＡＣＣＡＣＣＵＧＣＵＣＣＡ－３’（配列番号１４６）
５’－ＧＵＡＣＵＣＵＵＣＵＵＧＵＣＣＡＧＣＵ－３’（配列番号１４７）
のいずれかを有してもよい。また、前記二本鎖ＲＮＡ分子において１個または複数個のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、人工核酸、または核酸類縁体に置換されていてもよい。
５’－ＣＣＣＡＡＣＡＣＣＡＣＣＵＧＣＵＣＣＡ－３’（配列番号１４６）
５’－ＧＵＡＣＵＣＵＵＣＵＵＧＵＣＣＡＧＣＵ－３’（配列番号１４７）
のいずれかを有してもよい。また、前記二本鎖ＲＮＡ分子において１個または複数個のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、人工核酸、または核酸類縁体に置換されていてもよい。
【0022】
［３－５］ 本発明のさらなる実施態様は、［１－５］に記載のいずれかの治療薬において、前記腫瘍遺伝子がＮ－ｒａｓ遺伝子であって、前記野生型アレルがＮ－ｒａｓ（ｗｔ）アレルであって、前記変異アレルがＮ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ａ）またはＮ－ｒａｓ（ｃ．１８２Ａ＞Ｇ）アレルである。前記ガイド鎖において、前記（２－１）で規定した塩基を含めた前記変異型アレルのコーディング領域と相補的な塩基配列が
５’－ＣＣＣＡＡＣＡＣＣＡＣＣＵＧＣＵＣＣＡ－３’（配列番号１４６）
５’－ＧＵＡＣＵＣＵＵＣＵＵＧＵＣＣＡＧＣＵ－３’（配列番号１４７）
のいずれかを有してもよい。また、前記二本鎖ＲＮＡ分子において１個または複数個のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、人工核酸、または核酸類縁体に置換されていてもよい。
５’－ＣＣＣＡＡＣＡＣＣＡＣＣＵＧＣＵＣＣＡ－３’（配列番号１４６）
５’－ＧＵＡＣＵＣＵＵＣＵＵＧＵＣＣＡＧＣＵ－３’（配列番号１４７）
のいずれかを有してもよい。また、前記二本鎖ＲＮＡ分子において１個または複数個のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、人工核酸、または核酸類縁体に置換されていてもよい。
【0023】
［３－６］ 本発明のさらなる実施態様は、［１－６］に記載のいずれかの選択方法において、前記遺伝子がＮ－ｒａｓ遺伝子であって、前記野生型アレルがＮ－ｒａｓ（ｗｔ）アレルであって、前記変異アレルがＮ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ａ）またはＮ－ｒａｓ（ｃ．１８２Ａ＞Ｇ）アレルである。
【0024】
［４］そのほかの遺伝子
［４－１］ 本発明のさらなる実施態様は、［１－１］に記載のいずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＢＲＣＡ２遺伝子であって、前記野生型アレルがＢＲＣＡ２（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＡ１１１４Ｃ変異型アレルであるか；上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＳＴＫ１１遺伝子であって、前記野生型アレルがＳＴＫ１１（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＣ１０６２Ｇ変異型アレルであるか；上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＰＴＥＮ遺伝子であって、前記野生型アレルがＰＴＥＮ（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＣ３８８Ｇ変異型アレルであるか；上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＡＰＣ遺伝子であって、前記野生型アレルがＡＰＣ（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＣ４３４８Ｔ変異型アレルであるか；上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＧＡＴＡ２遺伝子であって、前記野生型アレルがＧＡＴＡ２（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＣ９５３Ｔ変異型アレルであるか；上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＭＹＤ８８遺伝子であって、前記野生型アレルがＭＹＤ８８（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＴ８１８Ｃ変異型アレルであるか；上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＧＮＡＱ遺伝子であって、前記野生型アレルがＧＮＡＱ（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＡ６２６Ｔ変異型アレルであるか；または、上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＩＤＨ１遺伝子であって、前記野生型アレルがＩＤＨ１（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＧ３９５Ａ変異型アレルである。
前記ガイド鎖において、前記（２－１）で規定した塩基を含めた前記変異型アレルのコーディング領域と相補的な塩基配列が、それぞれ、
５’－ＧＧＣＵＵＣＵＧＡＵＵＵＧＣＵＡＣＡＵ－３’（配列番号１４８）
５’－ＣＣＵＣＧＡＵＧＵＣＧＡＡＧＡＧＧＵＣ－３’（配列番号１４９）
５’－ＡＣＡＣＣＡＧＵＵＣＧＵＣＣＣＵＵＵＣ－３’（配列番号１５０）
５’－ＧＧＵＡＣＵＵＣＵＣＧＣＵＵＧＧＵＵＵ－３’（配列番号１５１）
５’－ＧＡＧＧＣＣＡＣＡＧＧＣＡＵＵＧＣＡＣ－３’（配列番号１５２）
５’－ＧＡＵＧＧＧＧＡＵＣＡＧＵＣＧＣＵＵＣ－３’（配列番号１５３）
５’－ＣＵＣＵＧＡＣＣＵＵＵＧＧＣＣＣＣＣＵ－３’（配列番号１５４）および
５’－ＡＵＡＡＧＣＡＵＧＡＣＧＡＣＣＵＡＵＧ－３’（配列番号１５５）
を有してもよい。また、前記二本鎖ＲＮＡ分子において１個または複数個のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、人工核酸、または核酸類縁体に置換されていてもよい。
［４－１］ 本発明のさらなる実施態様は、［１－１］に記載のいずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＢＲＣＡ２遺伝子であって、前記野生型アレルがＢＲＣＡ２（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＡ１１１４Ｃ変異型アレルであるか；上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＳＴＫ１１遺伝子であって、前記野生型アレルがＳＴＫ１１（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＣ１０６２Ｇ変異型アレルであるか；上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＰＴＥＮ遺伝子であって、前記野生型アレルがＰＴＥＮ（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＣ３８８Ｇ変異型アレルであるか；上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＡＰＣ遺伝子であって、前記野生型アレルがＡＰＣ（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＣ４３４８Ｔ変異型アレルであるか；上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＧＡＴＡ２遺伝子であって、前記野生型アレルがＧＡＴＡ２（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＣ９５３Ｔ変異型アレルであるか；上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＭＹＤ８８遺伝子であって、前記野生型アレルがＭＹＤ８８（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＴ８１８Ｃ変異型アレルであるか；上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＧＮＡＱ遺伝子であって、前記野生型アレルがＧＮＡＱ（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＡ６２６Ｔ変異型アレルであるか；または、上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＩＤＨ１遺伝子であって、前記野生型アレルがＩＤＨ１（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＧ３９５Ａ変異型アレルである。
前記ガイド鎖において、前記（２－１）で規定した塩基を含めた前記変異型アレルのコーディング領域と相補的な塩基配列が、それぞれ、
５’－ＧＧＣＵＵＣＵＧＡＵＵＵＧＣＵＡＣＡＵ－３’（配列番号１４８）
５’－ＣＣＵＣＧＡＵＧＵＣＧＡＡＧＡＧＧＵＣ－３’（配列番号１４９）
５’－ＡＣＡＣＣＡＧＵＵＣＧＵＣＣＣＵＵＵＣ－３’（配列番号１５０）
５’－ＧＧＵＡＣＵＵＣＵＣＧＣＵＵＧＧＵＵＵ－３’（配列番号１５１）
５’－ＧＡＧＧＣＣＡＣＡＧＧＣＡＵＵＧＣＡＣ－３’（配列番号１５２）
５’－ＧＡＵＧＧＧＧＡＵＣＡＧＵＣＧＣＵＵＣ－３’（配列番号１５３）
５’－ＣＵＣＵＧＡＣＣＵＵＵＧＧＣＣＣＣＣＵ－３’（配列番号１５４）および
５’－ＡＵＡＡＧＣＡＵＧＡＣＧＡＣＣＵＡＵＧ－３’（配列番号１５５）
を有してもよい。また、前記二本鎖ＲＮＡ分子において１個または複数個のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、人工核酸、または核酸類縁体に置換されていてもよい。
【0025】
［４－２］ 本発明のさらなる実施態様は、［１－２］に記載のいずれかの二本鎖ＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＢＲＣＡ２遺伝子であって、前記野生型アレルがＢＲＣＡ２（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＡ１１１４Ｃ変異型アレルであるか；上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＳＴＫ１１遺伝子であって、前記野生型アレルがＳＴＫ１１（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＣ１０６２Ｇ変異型アレルであるか；上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＰＴＥＮ遺伝子であって、前記野生型アレルがＰＴＥＮ（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＣ３８８Ｇ変異型アレルであるか；上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＡＰＣ遺伝子であって、前記野生型アレルがＡＰＣ（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＣ４３４８Ｔ変異型アレルであるか；上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＧＡＴＡ２遺伝子であって、前記野生型アレルがＧＡＴＡ２（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＣ９５３Ｔ変異型アレルであるか；上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＭＹＤ８８遺伝子であって、前記野生型アレルがＭＹＤ８８（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＴ８１８Ｃ変異型アレルであるか；上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＧＮＡＱ遺伝子であって、前記野生型アレルがＧＮＡＱ（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＡ６２６Ｔ変異型アレルであるか；または、上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＩＤＨ１遺伝子であって、前記野生型アレルがＩＤＨ１（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＧ３９５Ａ変異型アレルである。
前記ガイド鎖において、前記（２－１）で規定した塩基を含めた前記変異型アレルのコーディング領域と相補的な塩基配列が、それぞれ、
５’－ＧＧＣＵＵＣＵＧＡＵＵＵＧＣＵＡＣＡＵ－３’（配列番号１４８）
５’－ＣＣＵＣＧＡＵＧＵＣＧＡＡＧＡＧＧＵＣ－３’（配列番号１４９）
５’－ＡＣＡＣＣＡＧＵＵＣＧＵＣＣＣＵＵＵＣ－３’（配列番号１５０）
５’－ＧＧＵＡＣＵＵＣＵＣＧＣＵＵＧＧＵＵＵ－３’（配列番号１５１）
５’－ＧＡＧＧＣＣＡＣＡＧＧＣＡＵＵＧＣＡＣ－３’（配列番号１５２）
５’－ＧＡＵＧＧＧＧＡＵＣＡＧＵＣＧＣＵＵＣ－３’（配列番号１５３）
５’－ＣＵＣＵＧＡＣＣＵＵＵＧＧＣＣＣＣＣＵ－３’（配列番号１５４）および
５’－ＡＵＡＡＧＣＡＵＧＡＣＧＡＣＣＵＡＵＧ－３’（配列番号１５５）
を有してもよい。また、前記二本鎖ＲＮＡ分子において１個または複数個のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、人工核酸、または核酸類縁体に置換されていてもよい。
前記ガイド鎖において、前記（２－１）で規定した塩基を含めた前記変異型アレルのコーディング領域と相補的な塩基配列が、それぞれ、
５’－ＧＧＣＵＵＣＵＧＡＵＵＵＧＣＵＡＣＡＵ－３’（配列番号１４８）
５’－ＣＣＵＣＧＡＵＧＵＣＧＡＡＧＡＧＧＵＣ－３’（配列番号１４９）
５’－ＡＣＡＣＣＡＧＵＵＣＧＵＣＣＣＵＵＵＣ－３’（配列番号１５０）
５’－ＧＧＵＡＣＵＵＣＵＣＧＣＵＵＧＧＵＵＵ－３’（配列番号１５１）
５’－ＧＡＧＧＣＣＡＣＡＧＧＣＡＵＵＧＣＡＣ－３’（配列番号１５２）
５’－ＧＡＵＧＧＧＧＡＵＣＡＧＵＣＧＣＵＵＣ－３’（配列番号１５３）
５’－ＣＵＣＵＧＡＣＣＵＵＵＧＧＣＣＣＣＣＵ－３’（配列番号１５４）および
５’－ＡＵＡＡＧＣＡＵＧＡＣＧＡＣＣＵＡＵＧ－３’（配列番号１５５）
を有してもよい。また、前記二本鎖ＲＮＡ分子において１個または複数個のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、人工核酸、または核酸類縁体に置換されていてもよい。
【0026】
［４－３］ 本発明のさらなる実施態様は、［１－３］に記載のいずれかの製造方法において、前記遺伝子がＢＲＣＡ２遺伝子であって、前記野生型アレルがＢＲＣＡ２（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＡ１１１４Ｃ変異型アレルであるか；上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＳＴＫ１１遺伝子であって、前記野生型アレルがＳＴＫ１１（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＣ１０６２Ｇ変異型アレルであるか；上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＰＴＥＮ遺伝子であって、前記野生型アレルがＰＴＥＮ（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＣ３８８Ｇ変異型アレルであるか；上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＡＰＣ遺伝子であって、前記野生型アレルがＡＰＣ（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＣ４３４８Ｔ変異型アレルであるか；上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＧＡＴＡ２遺伝子であって、前記野生型アレルがＧＡＴＡ２（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＣ９５３Ｔ変異型アレルであるか；上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＭＹＤ８８遺伝子であって、前記野生型アレルがＭＹＤ８８（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＴ８１８Ｃ変異型アレルであるか；上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＧＮＡＱ遺伝子であって、前記野生型アレルがＧＮＡＱ（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＡ６２６Ｔ変異型アレルであるか；または、上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＩＤＨ１遺伝子であって、前記野生型アレルがＩＤＨ１（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＧ３９５Ａ変異型アレルである。
前記ガイド鎖において、前記（２－１）で規定した塩基を含めた前記変異型アレルのコーディング領域と相補的な塩基配列が、それぞれ、
５’－ＧＧＣＵＵＣＵＧＡＵＵＵＧＣＵＡＣＡＵ－３’（配列番号１４８）
５’－ＣＣＵＣＧＡＵＧＵＣＧＡＡＧＡＧＧＵＣ－３’（配列番号１４９）
５’－ＡＣＡＣＣＡＧＵＵＣＧＵＣＣＣＵＵＵＣ－３’（配列番号１５０）
５’－ＧＧＵＡＣＵＵＣＵＣＧＣＵＵＧＧＵＵＵ－３’（配列番号１５１）
５’－ＧＡＧＧＣＣＡＣＡＧＧＣＡＵＵＧＣＡＣ－３’（配列番号１５２）
５’－ＧＡＵＧＧＧＧＡＵＣＡＧＵＣＧＣＵＵＣ－３’（配列番号１５３）
５’－ＣＵＣＵＧＡＣＣＵＵＵＧＧＣＣＣＣＣＵ－３’（配列番号１５４）および
５’－ＡＵＡＡＧＣＡＵＧＡＣＧＡＣＣＵＡＵＧ－３’（配列番号１５５）
を有してもよい。また、前記二本鎖ＲＮＡ分子において１個または複数個のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、人工核酸、または核酸類縁体に置換されていてもよい。
前記ガイド鎖において、前記（２－１）で規定した塩基を含めた前記変異型アレルのコーディング領域と相補的な塩基配列が、それぞれ、
５’－ＧＧＣＵＵＣＵＧＡＵＵＵＧＣＵＡＣＡＵ－３’（配列番号１４８）
５’－ＣＣＵＣＧＡＵＧＵＣＧＡＡＧＡＧＧＵＣ－３’（配列番号１４９）
５’－ＡＣＡＣＣＡＧＵＵＣＧＵＣＣＣＵＵＵＣ－３’（配列番号１５０）
５’－ＧＧＵＡＣＵＵＣＵＣＧＣＵＵＧＧＵＵＵ－３’（配列番号１５１）
５’－ＧＡＧＧＣＣＡＣＡＧＧＣＡＵＵＧＣＡＣ－３’（配列番号１５２）
５’－ＧＡＵＧＧＧＧＡＵＣＡＧＵＣＧＣＵＵＣ－３’（配列番号１５３）
５’－ＣＵＣＵＧＡＣＣＵＵＵＧＧＣＣＣＣＣＵ－３’（配列番号１５４）および
５’－ＡＵＡＡＧＣＡＵＧＡＣＧＡＣＣＵＡＵＧ－３’（配列番号１５５）
を有してもよい。また、前記二本鎖ＲＮＡ分子において１個または複数個のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、人工核酸、または核酸類縁体に置換されていてもよい。
【0027】
［４－４］ 本発明のさらなる実施態様は、［１－４］に記載のいずれかのＲＮＡ干渉法において、前記遺伝子がＢＲＣＡ２遺伝子であって、前記野生型アレルがＢＲＣＡ２（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＡ１１１４Ｃ変異型アレルであるか；上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＳＴＫ１１遺伝子であって、前記野生型アレルがＳＴＫ１１（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＣ１０６２Ｇ変異型アレルであるか；上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＰＴＥＮ遺伝子であって、前記野生型アレルがＰＴＥＮ（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＣ３８８Ｇ変異型アレルであるか；上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＡＰＣ遺伝子であって、前記野生型アレルがＡＰＣ（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＣ４３４８Ｔ変異型アレルであるか；上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＧＡＴＡ２遺伝子であって、前記野生型アレルがＧＡＴＡ２（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＣ９５３Ｔ変異型アレルであるか；上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＭＹＤ８８遺伝子であって、前記野生型アレルがＭＹＤ８８（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＴ８１８Ｃ変異型アレルであるか；上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＧＮＡＱ遺伝子であって、前記野生型アレルがＧＮＡＱ（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＡ６２６Ｔ変異型アレルであるか；または、上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＩＤＨ１遺伝子であって、前記野生型アレルがＩＤＨ１（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＧ３９５Ａ変異型アレルである。
前記ガイド鎖において、前記（２－１）で規定した塩基を含めた前記変異型アレルのコーディング領域と相補的な塩基配列が、それぞれ、
５’－ＧＧＣＵＵＣＵＧＡＵＵＵＧＣＵＡＣＡＵ－３’（配列番号１４８）
５’－ＣＣＵＣＧＡＵＧＵＣＧＡＡＧＡＧＧＵＣ－３’（配列番号１４９）
５’－ＡＣＡＣＣＡＧＵＵＣＧＵＣＣＣＵＵＵＣ－３’（配列番号１５０）
５’－ＧＧＵＡＣＵＵＣＵＣＧＣＵＵＧＧＵＵＵ－３’（配列番号１５１）
５’－ＧＡＧＧＣＣＡＣＡＧＧＣＡＵＵＧＣＡＣ－３’（配列番号１５２）
５’－ＧＡＵＧＧＧＧＡＵＣＡＧＵＣＧＣＵＵＣ－３’（配列番号１５３）
５’－ＣＵＣＵＧＡＣＣＵＵＵＧＧＣＣＣＣＣＵ－３’（配列番号１５４）および
５’－ＡＵＡＡＧＣＡＵＧＡＣＧＡＣＣＵＡＵＧ－３’（配列番号１５５）
を有してもよい。また、前記二本鎖ＲＮＡ分子において１個または複数個のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、人工核酸、または核酸類縁体に置換されていてもよい。
前記ガイド鎖において、前記（２－１）で規定した塩基を含めた前記変異型アレルのコーディング領域と相補的な塩基配列が、それぞれ、
５’－ＧＧＣＵＵＣＵＧＡＵＵＵＧＣＵＡＣＡＵ－３’（配列番号１４８）
５’－ＣＣＵＣＧＡＵＧＵＣＧＡＡＧＡＧＧＵＣ－３’（配列番号１４９）
５’－ＡＣＡＣＣＡＧＵＵＣＧＵＣＣＣＵＵＵＣ－３’（配列番号１５０）
５’－ＧＧＵＡＣＵＵＣＵＣＧＣＵＵＧＧＵＵＵ－３’（配列番号１５１）
５’－ＧＡＧＧＣＣＡＣＡＧＧＣＡＵＵＧＣＡＣ－３’（配列番号１５２）
５’－ＧＡＵＧＧＧＧＡＵＣＡＧＵＣＧＣＵＵＣ－３’（配列番号１５３）
５’－ＣＵＣＵＧＡＣＣＵＵＵＧＧＣＣＣＣＣＵ－３’（配列番号１５４）および
５’－ＡＵＡＡＧＣＡＵＧＡＣＧＡＣＣＵＡＵＧ－３’（配列番号１５５）
を有してもよい。また、前記二本鎖ＲＮＡ分子において１個または複数個のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、人工核酸、または核酸類縁体に置換されていてもよい。
【0028】
［４－５］ 本発明のさらなる実施態様は、［１－５］に記載のいずれかの治療薬において、前記腫瘍遺伝子がＢＲＣＡ２遺伝子であって、前記野生型アレルがＢＲＣＡ２（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＡ１１１４Ｃ変異型アレルであるか；上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＳＴＫ１１遺伝子であって、前記野生型アレルがＳＴＫ１１（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＣ１０６２Ｇ変異型アレルであるか；上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＰＴＥＮ遺伝子であって、前記野生型アレルがＰＴＥＮ（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＣ３８８Ｇ変異型アレルであるか；上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＡＰＣ遺伝子であって、前記野生型アレルがＡＰＣ（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＣ４３４８Ｔ変異型アレルであるか；上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＧＡＴＡ２遺伝子であって、前記野生型アレルがＧＡＴＡ２（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＣ９５３Ｔ変異型アレルであるか；上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＭＹＤ８８遺伝子であって、前記野生型アレルがＭＹＤ８８（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＴ８１８Ｃ変異型アレルであるか；上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＧＮＡＱ遺伝子であって、前記野生型アレルがＧＮＡＱ（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＡ６２６Ｔ変異型アレルであるか；または、上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＩＤＨ１遺伝子であって、前記野生型アレルがＩＤＨ１（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＧ３９５Ａ変異型アレルである。
前記ガイド鎖において、前記（２－１）で規定した塩基を含めた前記変異型アレルのコーディング領域と相補的な塩基配列が、それぞれ、
５’－ＧＧＣＵＵＣＵＧＡＵＵＵＧＣＵＡＣＡＵ－３’（配列番号１４８）
５’－ＣＣＵＣＧＡＵＧＵＣＧＡＡＧＡＧＧＵＣ－３’（配列番号１４９）
５’－ＡＣＡＣＣＡＧＵＵＣＧＵＣＣＣＵＵＵＣ－３’（配列番号１５０）
５’－ＧＧＵＡＣＵＵＣＵＣＧＣＵＵＧＧＵＵＵ－３’（配列番号１５１）
５’－ＧＡＧＧＣＣＡＣＡＧＧＣＡＵＵＧＣＡＣ－３’（配列番号１５２）
５’－ＧＡＵＧＧＧＧＡＵＣＡＧＵＣＧＣＵＵＣ－３’（配列番号１５３）
５’－ＣＵＣＵＧＡＣＣＵＵＵＧＧＣＣＣＣＣＵ－３’（配列番号１５４）および
５’－ＡＵＡＡＧＣＡＵＧＡＣＧＡＣＣＵＡＵＧ－３’（配列番号１５５）
を有してもよい。また、前記二本鎖ＲＮＡ分子において１個または複数個のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、人工核酸、または核酸類縁体に置換されていてもよい。
前記ガイド鎖において、前記（２－１）で規定した塩基を含めた前記変異型アレルのコーディング領域と相補的な塩基配列が、それぞれ、
５’－ＧＧＣＵＵＣＵＧＡＵＵＵＧＣＵＡＣＡＵ－３’（配列番号１４８）
５’－ＣＣＵＣＧＡＵＧＵＣＧＡＡＧＡＧＧＵＣ－３’（配列番号１４９）
５’－ＡＣＡＣＣＡＧＵＵＣＧＵＣＣＣＵＵＵＣ－３’（配列番号１５０）
５’－ＧＧＵＡＣＵＵＣＵＣＧＣＵＵＧＧＵＵＵ－３’（配列番号１５１）
５’－ＧＡＧＧＣＣＡＣＡＧＧＣＡＵＵＧＣＡＣ－３’（配列番号１５２）
５’－ＧＡＵＧＧＧＧＡＵＣＡＧＵＣＧＣＵＵＣ－３’（配列番号１５３）
５’－ＣＵＣＵＧＡＣＣＵＵＵＧＧＣＣＣＣＣＵ－３’（配列番号１５４）および
５’－ＡＵＡＡＧＣＡＵＧＡＣＧＡＣＣＵＡＵＧ－３’（配列番号１５５）
を有してもよい。また、前記二本鎖ＲＮＡ分子において１個または複数個のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、人工核酸、または核酸類縁体に置換されていてもよい。
【0029】
［４－６］ 本発明のさらなる実施態様は、［１－６］に記載のいずれかの選択方法において、前記遺伝子がＢＲＣＡ２遺伝子であって、前記野生型アレルがＢＲＣＡ２（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＡ１１１４Ｃ変異型アレルであるか；上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＳＴＫ１１遺伝子であって、前記野生型アレルがＳＴＫ１１（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＣ１０６２Ｇ変異型アレルであるか；上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＰＴＥＮ遺伝子であって、前記野生型アレルがＰＴＥＮ（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＣ３８８Ｇ変異型アレルであるか；上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＡＰＣ遺伝子であって、前記野生型アレルがＡＰＣ（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＣ４３４８Ｔ変異型アレルであるか；上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＧＡＴＡ２遺伝子であって、前記野生型アレルがＧＡＴＡ２（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＣ９５３Ｔ変異型アレルであるか；上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＭＹＤ８８遺伝子であって、前記野生型アレルがＭＹＤ８８（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＴ８１８Ｃ変異型アレルであるか；上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＧＮＡＱ遺伝子であって、前記野生型アレルがＧＮＡＱ（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＡ６２６Ｔ変異型アレルであるか；または、上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＩＤＨ１遺伝子であって、前記野生型アレルがＩＤＨ１（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＧ３９５Ａ変異型アレルである。
＝＝関連文献とのクロスリファレンス＝＝
本出願は、２０１９年７月１６日付で出願した日本国特許出願２０１９－１３０９６６に基づく優先権を主張するものであり、当該基礎出願を引用することにより、本明細書に含めるものとする。
＝＝関連文献とのクロスリファレンス＝＝
本出願は、２０１９年７月１６日付で出願した日本国特許出願２０１９－１３０９６６に基づく優先権を主張するものであり、当該基礎出願を引用することにより、本明細書に含めるものとする。
【図面の簡単な説明】
【0030】
【図1】本発明の一実施例において、Ｋ－ｒａｓ遺伝子をターゲットとするｓｉＲＮＡの９～１１番目を点突然変異の位置に対応させた時のｓｉＲＮＡの発現抑制能を調べた結果を表すグラフである。
【図2】本発明の一実施例において、Ｋ－ｒａｓ遺伝子をターゲットとするｓｉＲＮＡの１１番目を点突然変異の位置に対応させ、ｓｉＲＮＡのガイド鎖の５’末端の塩基をグアニンからウラシルに置換し、パッセンジャー鎖の５’末端の塩基をウラシルからグアニンに置換したｓｉＲＮＡを用いた時のｓｉＲＮＡの発現抑制能を調べた結果を表すグラフである。
【図3】本発明の一実施例において、Ｋ－ｒａｓ遺伝子をターゲットとするｓｉＲＮＡの１１番目を点突然変異の位置に対応させ、ｓｉＲＮＡのガイド鎖の５’末端の塩基をグアニンからウラシルに置換し、パッセンジャー鎖の５’末端の塩基をウラシルからグアニンに置換し、ｓｉＲＮＡのガイド鎖の６番目から８番目のリボヌクレオチドにおいて、五炭糖の２’位をＯＣＨ３に置換した時のｓｉＲＮＡの発現抑制能を調べた結果を表すグラフである。
【図4】本発明の一実施例において、Ｋ－ｒａｓ遺伝子をターゲットとするｓｉＲＮＡの１１番目を点突然変異の位置に対応させ、ｓｉＲＮＡのガイド鎖の５’末端の塩基をグアニンからウラシルに置換し、パッセンジャー鎖の５’末端の塩基をウラシルからグアニンに置換し、ｓｉＲＮＡのガイド鎖の３～７番目の塩基をＡ変異型アレルの塩基に対してミスマッチさせた時のｓｉＲＮＡの発現抑制能を調べた結果を表すグラフである。
【図5】本発明の一実施例においてＫ－ｒａｓ遺伝子をターゲットとするｓｉＲＮＡの１１番目を点突然変異の位置に対応させ、ｓｉＲＮＡのガイド鎖の５’末端の塩基をグアニンからウラシルに置換し、パッセンジャー鎖の５’末端の塩基をウラシルからグアニンに置換し、ｓｉＲＮＡのガイド鎖の６番目から８番目のリボヌクレオチドにおいて、五炭糖の２’位をＯＣＨ３に置換し、ｓｉＲＮＡのガイド鎖の３～７番目の塩基をＡ変異型アレルの塩基に対してミスマッチさせた時のｓｉＲＮＡの発現抑制能を調べた結果を表すグラフである。
【図6】本発明の一実施例において、Ｋ－ｒａｓ遺伝子のＡ変異型アレル特異的なｓｉＲＮＡの、野生型アレル、Ｔ変異型Ｋ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ｔ）アレル及びＣ変異型Ｋ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ｃ）アレルに対する発現抑制能を調べた結果を表すグラフである。
【図7】本発明の一実施例において、Ｋ－ｒａｓ遺伝子のＴ変異型アレル特異的なｓｉＲＮＡの、野生型アレル、Ａ変異型アレル及びＣ変異型アレルに対する発現抑制能を調べた結果を表すグラフである。
【図8】本発明の一実施例において、Ｋ－ｒａｓ遺伝子のＣ変異型アレル特異的なｓｉＲＮＡの、野生型アレル、Ａ変異型アレル及びＴ変異型アレルに対する発現抑制能を調べた結果を表すグラフである。
【図9】本発明の一実施例において、Ｎ－ｒａｓ遺伝子のｃＤＮＡ３５番目のヌクレオチドにおける点突然変異を対象とし、ｓｉＲＮＡの１１番目をＡ変異型Ｎ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ａ）アレル（以下、Ａ変異型Ｎ３５アレルと称する）の点突然変異の位置に対応させ、ｓｉＲＮＡのガイド鎖の５’末端の塩基をシトシンからウラシルに置換し、パッセンジャー鎖の５’末端の塩基をアデニンからグアニンに置換し、ガイド鎖の６番目から８番目のリボヌクレオチドにおいて、五炭糖の２’位をＯＣＨ３に置換し、かつｓｉＲＮＡのガイド鎖の５番目の塩基をＡ変異型Ｎ３５アレルの塩基に対してミスマッチさせた時のｓｉＲＮＡの発現抑制能を調べた結果を表すグラフである。
【図10】本発明の一実施例において、Ｎ－ｒａｓ遺伝子のｃＤＮＡ１８２番目のヌクレオチドにおける点突然変異を対象とし、ｓｉＲＮＡの１１番目をＡ変異型Ｎ－ｒａｓ（ｃ．１８２Ａ＞Ｇ）アレル（以下、Ｇ変異型Ｎ１８２アレルと称する）の点突然変異の位置に対応させ、ｓｉＲＮＡのガイド鎖の５’末端の塩基をグアニンからウラシルに置換し、パッセンジャー鎖の５’末端の塩基をアデニンからグアニンに置換し、ガイド鎖の６番目から８番目のリボヌクレオチドにおいて、五炭糖の２’位をＯＣＨ３に置換し、かつｓｉＲＮＡのガイド鎖の５番目の塩基をＧ変異型Ｎ１８２アレルの塩基に対してミスマッチさせた時のｓｉＲＮＡの発現抑制能を調べた結果を表すグラフである。
【図11A】本発明の一実施例において、ＢＲＣＡ２遺伝子の野生型アレルとＡ１１１４Ｃ変異型アレルに対し、本開示の配列を有するｓｉＲＮＡが野生型アレルからの発現をほとんど抑制せず、変異型アレルからの発現を強く抑制することを示す結果を表すグラフである。
【図11B】ＳＴＫ１１遺伝子の野生型アレルとＣ１０６２Ｇ変異型アレルに対し、本開示の配列を有するｓｉＲＮＡが野生型アレルからの発現をほとんど抑制せず、変異型アレルからの発現を強く抑制することを示す結果を表すグラフである。
【図11C】ＰＴＥＮ遺伝子の野生型アレルとＣ３８８Ｇ変異型アレルに対し、本開示の配列を有するｓｉＲＮＡが野生型アレルからの発現をほとんど抑制せず、変異型アレルからの発現を強く抑制することを示す結果を表すグラフである。
【図11D】ＡＰＣ遺伝子の野生型アレルとＣ４３４８Ｔ変異型アレルに対し、本開示の配列を有するｓｉＲＮＡが野生型アレルからの発現をほとんど抑制せず、変異型アレルからの発現を強く抑制することを示す結果を表すグラフである。
【図11E】ＧＡＴＡ２遺伝子の野生型アレルとＣ９５３Ｔ変異型アレルに対し、本開示の配列を有するｓｉＲＮＡが野生型アレルからの発現をほとんど抑制せず、変異型アレルからの発現を強く抑制することを示す結果を表すグラフである。
【図11F】ＭＹＤ８８遺伝子の野生型アレルとＴ８１８Ｃ変異型アレルに対し、本開示の配列を有するｓｉＲＮＡが野生型アレルからの発現をほとんど抑制せず、変異型アレルからの発現を強く抑制することを示す結果を表すグラフである。
【図11G】ＧＮＡＱ遺伝子の野生型アレルとＡ６２６Ｔ変異型アレルに対し、本開示の配列を有するｓｉＲＮＡが野生型アレルからの発現をほとんど抑制せず、変異型アレルからの発現を強く抑制することを示す結果を表すグラフである。
【図11H】ＩＤＨ１遺伝子の野生型アレルとＧ３９５Ａ変異型アレルに対し、本開示の配列を有するｓｉＲＮＡが野生型アレルからの発現をほとんど抑制せず、変異型アレルからの発現を強く抑制することを示す結果を表すグラフである。
【図12】本発明の一実施例において、培養細胞中で、外来性のレポーターからの発現に対して変異型アレルからの発現を特異的に抑制するｓｉＲＮＡが、内在性遺伝子の発現に対しても、同様の特異性を有することを示す結果を表すグラフである。
【図13】本発明の一実施例において、ｓｉＫＲＡＳ－Ａがin vivoで腫瘍細胞の増殖を抑制できることを示す結果を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0031】
本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【0032】
＝＝ＲＮＡ分子＝＝
本発明の一実施態様は、遺伝子の野生型アレルに対して一塩基の点突然変異を有する変異型アレルをターゲット遺伝子とするＲＮＡ干渉法において用いるためのＲＮＡ分子である。対象となる遺伝子は、本開示のＲＮＡ分子を設計できるものであれば、特に限定されないが、点突然変異によって正常細胞ががん化するがん遺伝子であることが好ましい。ＲＮＡ分子を構成するヌクレオチドの個数は特に限定されないが、１３個以上１００個以下でもよく、１３個以上５０個以下でもよく、１３個以上２８個以下でもよく、１５個以上２５個以下でもよく、１７個以上２１個以下でもよいが、１９個以上２１個以下であることがさらに好ましい。また、１個または複数個（２個以上１８個以下であってもよく、２個以上１５個以下であってもよく、２個以上１２個以下であってもよく、２個以上９個以下であってもよく、２個以上６個以下であってもよく、２個以上３個以下であってもよい。）のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、人工核酸、またはイノシンやモルフォリノなどの核酸類縁体に置換されていてもよい。本明細書では、このようなＲＮＡ分子を、キメラ型ＮＡ分子と呼ぶが、本開示では、ＲＮＡ分子はキメラ型ＮＡ分子を含めて説明されるものとする。
本発明の一実施態様は、遺伝子の野生型アレルに対して一塩基の点突然変異を有する変異型アレルをターゲット遺伝子とするＲＮＡ干渉法において用いるためのＲＮＡ分子である。対象となる遺伝子は、本開示のＲＮＡ分子を設計できるものであれば、特に限定されないが、点突然変異によって正常細胞ががん化するがん遺伝子であることが好ましい。ＲＮＡ分子を構成するヌクレオチドの個数は特に限定されないが、１３個以上１００個以下でもよく、１３個以上５０個以下でもよく、１３個以上２８個以下でもよく、１５個以上２５個以下でもよく、１７個以上２１個以下でもよいが、１９個以上２１個以下であることがさらに好ましい。また、１個または複数個（２個以上１８個以下であってもよく、２個以上１５個以下であってもよく、２個以上１２個以下であってもよく、２個以上９個以下であってもよく、２個以上６個以下であってもよく、２個以上３個以下であってもよい。）のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、人工核酸、またはイノシンやモルフォリノなどの核酸類縁体に置換されていてもよい。本明細書では、このようなＲＮＡ分子を、キメラ型ＮＡ分子と呼ぶが、本開示では、ＲＮＡ分子はキメラ型ＮＡ分子を含めて説明されるものとする。
【0033】
このＲＮＡ分子は、変異型アレルと相補的な塩基配列の最も５’側の塩基から数えて、５番目または６番目の塩基が変異型アレルの塩基に対してミスマッチしているが、それ以外の部分に変異型アレルのコーディング領域と相補的な塩基配列を有する。このＲＮＡ分子が変異型アレルのコーディング領域と相補的な塩基配列以外の配列を有してもよく、例えば、当該相補的な塩基配列に相補的な配列を有してもよく、それによって、セルフアニーリングし、ｓｉＲＮＡとして機能してもよい。そのような一本鎖ＲＮＡとして、ボナック核酸が例示できる。あるいは、３’末端に１～３個のヌクレオチドが結合していてもよく、その塩基配列は特に限定されない。相補的な塩基配列の最も５’側の塩基がアデニンまたはウラシルでない場合、アデニンまたはウラシルまたはチミンで置換してもよい。また、相補的な塩基配列の最も３’側の塩基がシトシンまたはグアニンでない場合、シトシンまたはグアニンに置換してもよい。これらの操作によって、このＲＮＡ分子がｓｉＲＮＡのガイド鎖として機能する際に、遺伝子発現の抑制機能を向上させることができる。また、このＲＮＡ分子は、デリバリーのため、膜透過性を高めるため、あるいは血中滞留性を向上させるため、核酸以外の化学物質を有していてもよい。例えば、ＲＮＡ分子がＧａｌＮＡcやＰＥＧとコンジュゲートしていてもよい。また、５番目または６番目の塩基を除いて、ＲＮＡ分子が変異型アレルのコーディング領域と相補的な塩基配列以外の配列からなっていてもよい。なお、ＲＮＡ分子は、５番目または６番目の塩基を除き変異型アレルと相補的な塩基配列を有するが、９０％以上の相補性を有することが好ましく、９５％以上の相補性を有することがより好ましく、９８％以上の相補性を有することがさらに好ましく、１００％の相補性を有することが最も好ましい。５番目または６番目の塩基は、変異型アレルとミスマッチしていれば特に限定されず、その場所の変異型アレルの塩基以外の塩基であれば、Ａ、Ｕ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ｉや、そのほかの人工核酸・核酸類似体でも構わない。
【0034】
また、このＲＮＡ分子において、変異型アレルと相補的な塩基配列の最も５’側の塩基から数えて、１０番目または１１番目は点突然変異の位置に対応し、その塩基は変異型アレルが有する塩基に対応する塩基である。すなわち、変異型アレルの有する変異した塩基が、アデニン、シトシン、グアニン、チミンである場合、ＲＮＡ分子の１０番目または１１番目は、それぞれアデニン、シトシン、グアニン、ウラシル（またはチミン）である。
【0035】
また、このＲＮＡ分子において、変異型アレルと相補的な塩基配列の最も５’側の塩基から数えて、６－８番目または７－８番目のヌクレオチドのもつ五炭糖の２’位は、ＯＣＨ３、ハロゲン、またはＬＮＡで修飾（すなわち、置換）されている。例えば、五炭糖の２’位が、－ＯＣＨ３で置換されているＲＮＡ（以下、２’－Ｏ－メチルＲＮＡと称する）は、下記一般式の構造を有する。
【0036】
【化1】
【0037】
ＲＮＡ分子のターゲット遺伝子に対するＩＣ５０は、１ｎＭ以下であることが好ましく、５００ｐＭ以下であることがより好ましく、２００ｐＭ以下であることがさらに好ましい。
【0038】
このＲＮＡ分子を１本鎖のままＲＮＡ干渉法に用いる場合、その５’末端がリン酸化されているか、in situまたはin vivoでリン酸化され得ることが好ましい。
【0039】
このＲＮＡ分子の設計方法は、以下の工程を含む。
【0040】
まず、変異型アレルの有する変異した塩基を、最も５’側の塩基から数えて１０番目または１１番目として、変異型アレルの塩基配列に相補的な配列を有する所定の長さの塩基配列を決める工程を行う。次に、最も５’側の塩基から数えて５番目または６番目の塩基をミスマッチになる塩基にする工程を行う。そして、最も５’側の塩基から数えて６－８番目または７－８番目のヌクレオチドは、それらが有する五炭糖の２’位が、ＯＣＨ３、ハロゲン、またはＬＮＡで修飾されたものとする。ここで、相補的な塩基配列の最も５’側の塩基がアデニンまたはウラシルでない場合、アデニンまたはウラシルまたはチミンで置換する工程を行なってもよい。また、相補的な塩基配列の最も３’側の塩基がシトシンまたはグアニンでない場合、シトシンまたはグアニンに置換する工程を行なってもよい。最後に、３’側に、１-３個の塩基を付加する工程を行なってもよい。このようにして塩基配列を設計することができる。この設計方法をコンピュータに行わせるためのプログラムを作成してもよく、そのプログラムをコンピュータが読み取り可能な記録媒体に格納してもよい。このようにして設計した塩基配列を有するヌクレオチドは、定法に従って、化学合成できる。
【0041】
＝＝二本鎖ＲＮＡ分子＝＝
本発明の一実施態様は、前述のＲＮＡ分子（以下、第１のＲＮＡ分子と称する）がガイド鎖であって、第１のＲＮＡ分子に相補的な配列を有する第２のＲＮＡ分子がパッセンジャー鎖である、二本鎖ＲＮＡ分子である。第２のＲＮＡ分子は、第１のＲＮＡ分子に相補的な配列を有し、生理的条件で第１のＲＮＡ分子と２重鎖を形成するが、９０％以上の相補性を有することが好ましく、９５％以上の相補性を有することがより好ましく、９８％以上の相補性を有することがさらに好ましく、１００％の相補性を有することが最も好ましい。
本発明の一実施態様は、前述のＲＮＡ分子（以下、第１のＲＮＡ分子と称する）がガイド鎖であって、第１のＲＮＡ分子に相補的な配列を有する第２のＲＮＡ分子がパッセンジャー鎖である、二本鎖ＲＮＡ分子である。第２のＲＮＡ分子は、第１のＲＮＡ分子に相補的な配列を有し、生理的条件で第１のＲＮＡ分子と２重鎖を形成するが、９０％以上の相補性を有することが好ましく、９５％以上の相補性を有することがより好ましく、９８％以上の相補性を有することがさらに好ましく、１００％の相補性を有することが最も好ましい。
【0042】
パッセンジャー鎖の鎖長は特に限定されず、第１のＲＮＡ分子よりかなり短くても構わず、例えば、第１のＲＮＡ分子の半分以下でもよいが、同じ長さであることが好ましい。パッセンジャー鎖が第１のＲＮＡ分子より短い場合、第１のＲＮＡ分子に一本鎖部分が生じるが、その部分は、一本鎖の状態でもよいが、第１のＲＮＡ分子に相補的な第３のＲＮＡ分子が結合していてもよい。第２のＲＮＡ分子と第３のＲＮＡ分子が、第１のＲＮＡ分子全体に結合する場合、１本のパッセンジャー鎖にニックが入っていて二本に別れているのと同じ状態になる。
【0043】
二本鎖ＲＮＡ分子の両端は平滑末端でもよいが、ガイド鎖である第１のＲＮＡ分子の３’末端及び／又はパッセンジャー鎖である第２のＲＮＡ分子の３’末端に、オーバーハングを有してもよい。オーバーハングのヌクレオチド数は特に限定されないが、１～３個であることが好ましい。
【0044】
ガイド鎖及びパッセンジャー鎖のいずれのヌクレオチド鎖も、１個または複数個のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、人工核酸、または核酸類縁体に置換されている、二本鎖キメラ型ＮＡ分子であってもよい。
【0045】
パッセンジャー鎖を構成するヌクレオチドは、修飾されていてもよいが、修飾されていないことが好ましい。ヌクレオチドの修飾は特に限定されないが、それが有する五炭糖の２’位が、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、ハロゲン、ＳＨ、ＳＲ１、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、ＣＮ、ＣＯＯＲ、及びＬＮＡ（式中、ＲはＣ１－Ｃ６アルキル、アルケニル、アルキニル、またはアリール；ハロゲンは、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである）からなる群から選ばれた基により置換されていることが例示できる。
【0046】
パッセンジャー鎖も、周知技術に従って容易に設計し、容易に製造することができる。なお、ガイド鎖とパッセンジャー鎖は、リンカーで結合していてもよい。リンカーの構成材料は特に限定されないが、ペプチドやＰＥＧなどであってもよい。
【0047】
＝＝ＲＮＡ干渉法＝＝
本発明の一実施態様は、目的の遺伝子の野生型アレルと、一塩基の点突然変異を有する遺伝子の変異型アレルを有する細胞において、変異型アレルをターゲット遺伝子とするＲＮＡ干渉法である。このＲＮＡ干渉法は、キメラ型ＮＡ分子を含む第１のＲＮＡ分子、または二本鎖キメラ型ＮＡ分子を含む上述の二本鎖ＲＮＡ分子を、野生型アレルと変異型アレルを有する細胞に導入する工程を含む。
本発明の一実施態様は、目的の遺伝子の野生型アレルと、一塩基の点突然変異を有する遺伝子の変異型アレルを有する細胞において、変異型アレルをターゲット遺伝子とするＲＮＡ干渉法である。このＲＮＡ干渉法は、キメラ型ＮＡ分子を含む第１のＲＮＡ分子、または二本鎖キメラ型ＮＡ分子を含む上述の二本鎖ＲＮＡ分子を、野生型アレルと変異型アレルを有する細胞に導入する工程を含む。
【0048】
ＲＮＡ干渉法は、周知技術に従って容易に行うことができる。例えば、ターゲット遺伝子を発現している培養細胞、またはヒトまたはヒト以外の生物個体に対して、第１のＲＮＡ分子または二本鎖ＲＮＡ分子を導入することで、ターゲット遺伝子の発現を低下させることができる。
【0049】
ＲＮＡ干渉法を行う際、上述の第１のＲＮＡ分子または二本鎖ＲＮＡ分子を用いることによって、目的の遺伝子の野生型アレルの発現を事実上抑制しないで、変異型アレルからの発現を主に抑制することができる。ここで、野生型アレルの発現は、野生型アレルが機能し、正常な表現型をもたらす程度までであれば、抑制されても構わない。変異型アレルの発現は、変異型アレルが機能せず、異常な表現型をもたらさない程度まで、抑制されればよい。これによって、例えば、変異型アレルが優性突然変異を有する場合、変異による表現型を発現させないで、細胞を正常に機能させることが可能になる。
【0050】
＝＝治療薬＝＝
本開示のｓｉＲＮＡが治療薬として用いられるとき、その対象となる疾患は特に限定されないが、本発明の一実施態様は、腫瘍遺伝子（がん原遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、がん抑制遺伝子などとも呼ばれることがある）の野生型アレルと、一塩基の点突然変異を有する腫瘍遺伝子の変異型アレルを有し、点突然変異が腫瘍化の原因である腫瘍細胞を含む腫瘍を持つ患者の治療薬であって、上述のキメラ型ＮＡ分子を含むＲＮＡ分子、または二本鎖キメラ型ＮＡ分子を含む二本鎖ＲＮＡ分子を有効成分とする。
本開示のｓｉＲＮＡが治療薬として用いられるとき、その対象となる疾患は特に限定されないが、本発明の一実施態様は、腫瘍遺伝子（がん原遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、がん抑制遺伝子などとも呼ばれることがある）の野生型アレルと、一塩基の点突然変異を有する腫瘍遺伝子の変異型アレルを有し、点突然変異が腫瘍化の原因である腫瘍細胞を含む腫瘍を持つ患者の治療薬であって、上述のキメラ型ＮＡ分子を含むＲＮＡ分子、または二本鎖キメラ型ＮＡ分子を含む二本鎖ＲＮＡ分子を有効成分とする。
【0051】
投与方法は特に限定されないが、注射であることが好ましく、静脈内注射であることがより好ましい。この場合、治療薬には、有効成分に加え、pH調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤などを添加してもよい。
【0052】
用量は特に限定されず、含有される成分の有効性、投与形態、投与経路、疾患の種類、対象の性質（体重、年齢、病状および他の医薬の使用の有無など）、および担当医師の判断など応じて適宜選択される。
＝＝治療薬の対象となる疾患＝＝
＝＝治療薬の対象となる疾患＝＝
【0053】
本開示のｓｉＲＮＡが治療薬となるときの疾患は特に限定されず、その疾患が変異遺伝子の発現で生じるものであればよいが、上述したように腫瘍であることが好ましい。後述する実施例においては、Ｋ－ｒａｓ遺伝子、Ｎ－ｒａｓ遺伝子、BRCA遺伝子、ＳＴＫ１１遺伝子、ＰＴＥＮ遺伝子、ＡＰＣ遺伝子、ＧＡＴＡ２遺伝子、ＭＹＤ８８遺伝子、ＧＮＡＱ遺伝子、ＩＤＨ１遺伝子を抑制対象としており、それぞれ、Ｋ－ｒａｓ遺伝子の変異によっては大腸癌、肺癌、膵癌、白血病など、Ｎ－ｒａｓ遺伝子の変異によっては大腸癌、甲状腺癌、皮膚癌など、BRCA遺伝子の変異によっては乳癌、卵巣癌など、ＳＴＫ１１遺伝子の変異によっては子宮頸部悪性腺腫、Peutz-Jeghers 症候群、胃癌、乳癌、卵巣癌など、ＰＴＥＮ遺伝子の変異によってはCowden症候群、Lhermitte-Duclos病、Bannayan-Riley-Ruvalcaba症候群、Proteus症候群などのPTEN過誤腫症候群など、ＡＰＣ遺伝子の変異によっては家族性大腸腺腫症（FAP）、肝臓癌など、ＧＡＴＡ２遺伝子の変異によってはMonoMAC症候群、急性巨核芽球性白血病など、ＭＹＤ８８遺伝子の変異によってはリンパ腫など、ＧＮＡＱ遺伝子の変異によってはぶどう膜悪性黒色腫、Sturge-Weber症候群、GNAS遺伝子、BRCA遺伝子血管腫など、そしてＩＤＨ１遺伝子の変異によってはグリオーマなどが生じることが知られており、少なくともこれらの疾患の治療薬になりうる。
＝＝選択方法＝＝
本発明の一実施態様は、ターゲット遺伝子を抑制するためのＲＮＡ干渉法において用いるためのＲＮＡ分子、キメラ型ＮＡ分子、二本鎖ＲＮＡ分子または二本鎖キメラ型ＮＡ分子の選択方法であって、複数の上述のＲＮＡ分子、キメラ型ＮＡ分子、二本鎖ＲＮＡ分子または二本鎖キメラ型ＮＡ分子を用いて、ＲＮＡ干渉法をin vitroで行うことによって、特異的な遺伝子発現抑制能を調べる工程と、特異的な遺伝子発現抑制能が所定レベル以上であるＲＮＡ分子、キメラ型ＮＡ分子、二本鎖ＲＮＡ分子または二本鎖キメラ型ＮＡ分子を選択する工程と、を含む。
＝＝選択方法＝＝
本発明の一実施態様は、ターゲット遺伝子を抑制するためのＲＮＡ干渉法において用いるためのＲＮＡ分子、キメラ型ＮＡ分子、二本鎖ＲＮＡ分子または二本鎖キメラ型ＮＡ分子の選択方法であって、複数の上述のＲＮＡ分子、キメラ型ＮＡ分子、二本鎖ＲＮＡ分子または二本鎖キメラ型ＮＡ分子を用いて、ＲＮＡ干渉法をin vitroで行うことによって、特異的な遺伝子発現抑制能を調べる工程と、特異的な遺伝子発現抑制能が所定レベル以上であるＲＮＡ分子、キメラ型ＮＡ分子、二本鎖ＲＮＡ分子または二本鎖キメラ型ＮＡ分子を選択する工程と、を含む。
【0054】
ＲＮＡ干渉法をin vitroで行う際に、対象遺伝子として、遺伝子の野生型アレルと、一塩基の点突然変異を有する変異型アレルとを用い、野生型アレルの発現は所定のレベル以上には抑制しないが、変異型アレルの発現は所定のレベル以上に抑制する分子を選択する。これによって、変異型アレルの発現を抑制し、野生型アレルの発現を抑制しない分子を得ることができる。ここで、所定レベルの数値は特に限定されないが、５０％が好ましく、７０％がより好ましく、９０％がさらに好ましい。
【0055】
in vitroにおいてＲＮＡ干渉を用いるアッセイ方法は技術常識であって、遺伝子の選択、細胞の選択、ＲＮＡ分子の細胞への導入などは、当業者には明らかである。
【実施例】
【0056】
【実施例1】
【0057】
本実施例では、本明細書に開示のｓｉＲＮＡが、培養細胞中で、外来性のレポーターからの発現に対し、野生型アレルからの発現を抑制しないが、変異型アレルからの発現を特異的に抑制することを示す。
（方法）
１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭで培養したＨｅＬａ細胞を、１ｘ１０５個／ｍＬの密度で２４ウエルプレートに播種し、１００ｎｇの各レポーター及び１００ｎｇの内部標準用プラスミド（ｐＧＬ３）と二重鎖ｓｉＲＮＡとを、２μＬのlipofectamine2000とともにコトランスフェクトした。二重鎖ｓｉＲＮＡの濃度は、各図に示した。なお、コントロールのｓｉＲＮＡとしてはｓｉＧＹ４４１を導入した。２４時間後に細胞を回収し、dual-luciferase reporter assay system（Promega社）を用いて、firefly luciferase及びRenilla luciferaseの活性を測定し、firefly luciferaseの測定値を用いて、Renilla luciferaseの測定値を標準化した。また、二重鎖ｓｉＲＮＡで得られた測定値は、ｓｉＧＹ４４１で得られた測定値を１００％として、グラフに表した。
［実施例１Ａ］
（方法）
１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭで培養したＨｅＬａ細胞を、１ｘ１０５個／ｍＬの密度で２４ウエルプレートに播種し、１００ｎｇの各レポーター及び１００ｎｇの内部標準用プラスミド（ｐＧＬ３）と二重鎖ｓｉＲＮＡとを、２μＬのlipofectamine2000とともにコトランスフェクトした。二重鎖ｓｉＲＮＡの濃度は、各図に示した。なお、コントロールのｓｉＲＮＡとしてはｓｉＧＹ４４１を導入した。２４時間後に細胞を回収し、dual-luciferase reporter assay system（Promega社）を用いて、firefly luciferase及びRenilla luciferaseの活性を測定し、firefly luciferaseの測定値を用いて、Renilla luciferaseの測定値を標準化した。また、二重鎖ｓｉＲＮＡで得られた測定値は、ｓｉＧＹ４４１で得られた測定値を１００％として、グラフに表した。
［実施例１Ａ］
【0058】
本実施例では、発現抑制のターゲット遺伝子として、Ｋ－ｒａｓ遺伝子を用いた。
【0059】
（実施例１Ａ－１）
本実施例では、ｓｉＲＮＡの１０番目または１１番目をＡ変異型Ｋ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ａ）アレル（ｃＤＮＡ（ＧＥＮＥ ＩＤ：３８４５）において、３５番目の塩基がＧからＡに変異）（以下、Ａ変異型アレルと称する）の点突然変異の位置に対応させることで、野生型Ｋ－ｒａｓアレル（以下、野生型アレルと称する）に比較してＡ変異型Ｋ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ａ）アレルに対するＲＮＡ分子の発現抑制能の特異性が向上することを示す。
本実施例では、ｓｉＲＮＡの１０番目または１１番目をＡ変異型Ｋ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ａ）アレル（ｃＤＮＡ（ＧＥＮＥ ＩＤ：３８４５）において、３５番目の塩基がＧからＡに変異）（以下、Ａ変異型アレルと称する）の点突然変異の位置に対応させることで、野生型Ｋ－ｒａｓアレル（以下、野生型アレルと称する）に比較してＡ変異型Ｋ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ａ）アレルに対するＲＮＡ分子の発現抑制能の特異性が向上することを示す。
【0060】
まず、遺伝子発現抑制効果を調べるためのレポーターとして、野生型Ｋ－ｒａｓ（ｗｔ）アレル及びＡ変異型Ｋ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ａ）アレルと同じ塩基配列を有するＤＮＡを化学合成し、発現ベクター（ｐｓｉＣＨＥＣＫ）のルシフェラーゼ遺伝子の３’－ＵＴＲに挿入し、野生型Ｋレポーター及びＡ変異型Ｋレポーターを作製した。それぞれ、ベクターに組み込んだ部分の配列を以下に示す。
【0061】
【0062】
【0063】
図１に、各ｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制効果を示す。
Ｋ（３５）９Ａは、Ａ変異型アレル、野生型アレルの両方に対して、強い発現抑制効果を有していた。Ｋ（３５）１０Ａ及びＫ（３５）１１Ａは、発現抑制効果が少し弱くなったものの、野生型アレルよりＡ変異型アレルの方の発現を強く抑制している。
Ｋ（３５）９Ａは、Ａ変異型アレル、野生型アレルの両方に対して、強い発現抑制効果を有していた。Ｋ（３５）１０Ａ及びＫ（３５）１１Ａは、発現抑制効果が少し弱くなったものの、野生型アレルよりＡ変異型アレルの方の発現を強く抑制している。
【0064】
（実施例１Ａ－２）
本実施例では、ｓｉＲＮＡの１１番目をＡ変異型アレルの点突然変異の位置に対応させた上で、ｓｉＲＮＡのガイド鎖の５’末端の塩基をグアニンからウラシルに置換し、パッセンジャー鎖の５’末端の塩基をウラシルからグアニンに置換したｓｉＲＮＡを用いることで、Ａ変異型アレルに対するＲＮＡ分子の発現抑制能が強くなり、その特異性がさらに向上することを示す。
本実施例では、ｓｉＲＮＡの１１番目をＡ変異型アレルの点突然変異の位置に対応させた上で、ｓｉＲＮＡのガイド鎖の５’末端の塩基をグアニンからウラシルに置換し、パッセンジャー鎖の５’末端の塩基をウラシルからグアニンに置換したｓｉＲＮＡを用いることで、Ａ変異型アレルに対するＲＮＡ分子の発現抑制能が強くなり、その特異性がさらに向上することを示す。
【0065】
遺伝子発現抑制効果を調べるためのレポーターとして、野生型Ｋレポーター及びＡ変異型Ｋレポーターを用い、ｓｉＲＮＡとして、下記配列を有する２重鎖ＲＮＡを化学合成し、コントロールとしてＫ（３５）１１Ａを用いた。なお、下記配列で、点突然変異の位置に対応している塩基対と、ガイド鎖及びパッセンジャー鎖の５’末端の置換した塩基対とが□で囲われている。
【0066】
【0067】
図２に、各ｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制効果を示す。
Ｋ（３５）１１Ａは、野生型アレルよりＡ変異型アレルの方の発現を強く抑制していたが、Ｋ（３５）１１Ａｒｅｖは、両方に対して発現抑制効果が強くなり、野生型アレルよりＡ変異型アレルの方の発現をさらに強く抑制している。
Ｋ（３５）１１Ａは、野生型アレルよりＡ変異型アレルの方の発現を強く抑制していたが、Ｋ（３５）１１Ａｒｅｖは、両方に対して発現抑制効果が強くなり、野生型アレルよりＡ変異型アレルの方の発現をさらに強く抑制している。
【0068】
（実施例１Ａ－３）
本実施例では、ｓｉＲＮＡの１１番目をＡ変異型アレルの点突然変異の位置に対応させ、ｓｉＲＮＡのガイド鎖の５’末端の塩基をグアニンからウラシルに置換し、パッセンジャー鎖の５’末端の塩基をウラシルからグアニンに置換した上で、ｓｉＲＮＡのガイド鎖の６番目から８番目のリボヌクレオチドにおいて、五炭糖の２’位をＯＣＨ３に置換することで、Ａ変異型アレルに対するＲＮＡ分子の発現抑制能が強くなり、その特異性がさらに向上することを示す。
本実施例では、ｓｉＲＮＡの１１番目をＡ変異型アレルの点突然変異の位置に対応させ、ｓｉＲＮＡのガイド鎖の５’末端の塩基をグアニンからウラシルに置換し、パッセンジャー鎖の５’末端の塩基をウラシルからグアニンに置換した上で、ｓｉＲＮＡのガイド鎖の６番目から８番目のリボヌクレオチドにおいて、五炭糖の２’位をＯＣＨ３に置換することで、Ａ変異型アレルに対するＲＮＡ分子の発現抑制能が強くなり、その特異性がさらに向上することを示す。
【0069】
遺伝子発現抑制効果を調べるためのレポーターとして、野生型Ｋレポーター及びＡ変異型Ｋレポーターを用い、ｓｉＲＮＡとして、下記配列を有する２重鎖ＲＮＡを化学合成し、コントロールとしてＫ（３５）１１Ａｒｅｖを用いた。なお、下記配列で、点突然変異の位置に対応している塩基対と、ガイド鎖及びパッセンジャー鎖の５’末端の置換した塩基対とが□で囲われ、五炭糖の２’位をＯＣＨ３に置換したヌクレオチドがシャドウでマークされている。
【0070】
【0071】
図３に、各ｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制効果を示す。
Ｋ（３５）１１Ａｒｅｖは、野生型アレルよりＡ変異型アレルの方の発現を強く抑制していたが、Ｋ（３５）１１ＡｒｅｖＯＭ（６－８）は、両方に対して発現抑制効果が強くなり、野生型アレルよりＡ変異型アレルの方の発現を強く抑制している。もう一つのコントロールであるＫ（３５）１１ＡｒｅｖＯＭ（２－５）（ガイド鎖の２番目から５番目のリボヌクレオチドにおいて、五炭糖の２’位がＯＣＨ３に置換されている）は、両方に対する発現抑制効果がかなり弱くなった。
Ｋ（３５）１１Ａｒｅｖは、野生型アレルよりＡ変異型アレルの方の発現を強く抑制していたが、Ｋ（３５）１１ＡｒｅｖＯＭ（６－８）は、両方に対して発現抑制効果が強くなり、野生型アレルよりＡ変異型アレルの方の発現を強く抑制している。もう一つのコントロールであるＫ（３５）１１ＡｒｅｖＯＭ（２－５）（ガイド鎖の２番目から５番目のリボヌクレオチドにおいて、五炭糖の２’位がＯＣＨ３に置換されている）は、両方に対する発現抑制効果がかなり弱くなった。
【0072】
（実施例１Ａ－４）
本実施例では、ｓｉＲＮＡの１１番目をＡ変異型アレルの点突然変異の位置に対応させ、ｓｉＲＮＡのガイド鎖の５’末端の塩基をグアニンからウラシルに置換し、パッセンジャー鎖の５’末端の塩基をウラシルからグアニンに置換した上で、ｓｉＲＮＡのガイド鎖の５番目または６番目の塩基をＡ変異型アレルの塩基に対してミスマッチさせると、野生型アレルに対するＲＮＡ分子の発現抑制能が弱くなり、その結果、Ａ変異型アレルに対する特異性がさらに向上することを示す。
本実施例では、ｓｉＲＮＡの１１番目をＡ変異型アレルの点突然変異の位置に対応させ、ｓｉＲＮＡのガイド鎖の５’末端の塩基をグアニンからウラシルに置換し、パッセンジャー鎖の５’末端の塩基をウラシルからグアニンに置換した上で、ｓｉＲＮＡのガイド鎖の５番目または６番目の塩基をＡ変異型アレルの塩基に対してミスマッチさせると、野生型アレルに対するＲＮＡ分子の発現抑制能が弱くなり、その結果、Ａ変異型アレルに対する特異性がさらに向上することを示す。
【0073】
遺伝子発現抑制効果を調べるためのレポーターとして、野生型Ｋレポーター及びＡ変異型Ｋレポーターを用い、ｓｉＲＮＡとして、Ｋ（３５）１１Ａｒｅｖをベースにして、３～７番目の塩基にミスマッチを有する下記配列の２重鎖ＲＮＡを化学合成し、コントロールとしてＫ（３５）１１Ａｒｅｖを用いた。なお、下記配列で、点突然変異の位置に対応している塩基対と、ガイド鎖及びパッセンジャー鎖の５’末端の置換した塩基対と、ミスマッチを有する塩基対とが□で囲われている。
【0074】
【0075】
図４に、各ｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制効果を示す。
Ｋ（３５）１１Ａｒｅｖは、野生型アレルよりＡ変異型アレルの方の発現を強く抑制していたが、Ｋ（３５）１１ＡｒｅｖＭ５及びＫ（３５）１１ＡｒｅｖＭ６は、野生型アレルに対するＲＮＡ分子の発現抑制能が非常に弱くなり、その結果、Ａ変異型アレルに対する特異性がさらに向上した。
Ｋ（３５）１１Ａｒｅｖは、野生型アレルよりＡ変異型アレルの方の発現を強く抑制していたが、Ｋ（３５）１１ＡｒｅｖＭ５及びＫ（３５）１１ＡｒｅｖＭ６は、野生型アレルに対するＲＮＡ分子の発現抑制能が非常に弱くなり、その結果、Ａ変異型アレルに対する特異性がさらに向上した。
【0076】
（実施例１Ａ－５）
本実施例では、ｓｉＲＮＡの１１番目をＡ変異型アレルの点突然変異の位置に対応させ、ｓｉＲＮＡのガイド鎖の５’末端の塩基をグアニンからウラシルに置換し、パッセンジャー鎖の５’末端の塩基をウラシルからグアニンに置換した上で、ｓｉＲＮＡのガイド鎖の６番目から８番目のリボヌクレオチドにおいて、五炭糖の２’位をＯＣＨ３に置換ｓｉＲＮＡのガイド鎖の６番目から８番目のリボヌクレオチドにおいて、五炭糖の２’位をＯＣＨ３に置換し、かつｓｉＲＮＡのガイド鎖の５番目または６番目の塩基をＡ変異型アレルの塩基に対してミスマッチさせると、Ａ変異型アレルに対する特異性がさらに向上することを示す。
本実施例では、ｓｉＲＮＡの１１番目をＡ変異型アレルの点突然変異の位置に対応させ、ｓｉＲＮＡのガイド鎖の５’末端の塩基をグアニンからウラシルに置換し、パッセンジャー鎖の５’末端の塩基をウラシルからグアニンに置換した上で、ｓｉＲＮＡのガイド鎖の６番目から８番目のリボヌクレオチドにおいて、五炭糖の２’位をＯＣＨ３に置換ｓｉＲＮＡのガイド鎖の６番目から８番目のリボヌクレオチドにおいて、五炭糖の２’位をＯＣＨ３に置換し、かつｓｉＲＮＡのガイド鎖の５番目または６番目の塩基をＡ変異型アレルの塩基に対してミスマッチさせると、Ａ変異型アレルに対する特異性がさらに向上することを示す。
【0077】
遺伝子発現抑制効果を調べるためのレポーターとして、野生型Ｋレポーター及びＡ変異型Ｋレポーターを用い、ｓｉＲＮＡとして、Ｋ（３５）１１Ａｒｅｖをベースにして、３～７番目の塩基にミスマッチを有する下記配列の２重鎖ＲＮＡを化学合成し、コントロールとしてＫ（３５）１１Ａｒｅｖを用いた。なお、下記配列で、点突然変異の位置に対応している塩基対と、ガイド鎖及びパッセンジャー鎖の５’末端の置換した塩基対と、ミスマッチを有する塩基対とが□で囲われ、五炭糖の２’位をＯＣＨ３に置換したヌクレオチドがシャドウでマークされている。
【0078】
【0079】
図５に、各ｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制効果を示す。
Ｋ（３５）１１ＡｒｅｖＯＭ（６－８）Ｍ５及びＫ（３５）１１ＡｒｅｖＯＭ（６－８）Ｍ６は、野生型アレルに対するＲＮＡ分子の発現抑制能が非常に弱くなり、その結果、Ａ変異型アレルに対する特異性がさらに向上した。
Ｋ（３５）１１ＡｒｅｖＯＭ（６－８）Ｍ５及びＫ（３５）１１ＡｒｅｖＯＭ（６－８）Ｍ６は、野生型アレルに対するＲＮＡ分子の発現抑制能が非常に弱くなり、その結果、Ａ変異型アレルに対する特異性がさらに向上した。
【0080】
（実施例１Ａ－６）
本実施例では、Ａ変異型アレル特異的なｓｉＲＮＡは、野生型アレルだけでなく、Ｔ変異型Ｋ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ｔ）アレル（ｃＤＮＡにおいて、３５番目の塩基がＧからＴに変異）及びＣ変異型Ｋ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ｃ）アレル（ｃＤＮＡにおいて、３５番目の塩基がＧからＣに変異）に対する発現抑制能が低いことを示す。
本実施例では、Ａ変異型アレル特異的なｓｉＲＮＡは、野生型アレルだけでなく、Ｔ変異型Ｋ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ｔ）アレル（ｃＤＮＡにおいて、３５番目の塩基がＧからＴに変異）及びＣ変異型Ｋ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ｃ）アレル（ｃＤＮＡにおいて、３５番目の塩基がＧからＣに変異）に対する発現抑制能が低いことを示す。
【0081】
遺伝子発現抑制効果を調べるためのレポーターとして、下記のＫ－ｒａｓレポーターである、野生型Ｋレポーター、Ａ変異型Ｋレポーター、Ｔ変異型Ｋ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ｔ）レポーター（以下、Ｔ変異型Ｋレポーターと称する）、Ｃ変異型Ｋ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ｃ）レポーター（以下、Ｃ変異型Ｋレポーターと称する）を用い、ｓｉＲＮＡとして、Ｋ（３５）１１ＡｒｅｖＯＭ（６－８）Ｍ５及びＫ（３５）１１ＡｒｅｖＯＭ（６－８）Ｍ６を用い、コントロールとしてＫ（３５）１１Ａｒｅｖを用いた。なお、下記配列で、点突然変異の位置に対応している塩基対が□で囲われている。
【0082】
【0083】
図６に、各レポーターに対する遺伝子発現抑制効果を示す。
いずれのｓｉＲＮＡも、Ａ変異型Ｋレポーターに対して最も発現抑制効果が強かったが、特にＫ（３５）１１ＡｒｅｖＯＭ（６－８）Ｍ５及びＫ（３５）１１ＡｒｅｖＯＭ（６－８）Ｍ６は、Ｔ変異型Ｋレポーター及びＣ変異型Ｋレポーターに対する発現抑制効果が弱かった。
いずれのｓｉＲＮＡも、Ａ変異型Ｋレポーターに対して最も発現抑制効果が強かったが、特にＫ（３５）１１ＡｒｅｖＯＭ（６－８）Ｍ５及びＫ（３５）１１ＡｒｅｖＯＭ（６－８）Ｍ６は、Ｔ変異型Ｋレポーター及びＣ変異型Ｋレポーターに対する発現抑制効果が弱かった。
【0084】
（実施例１Ａ－７）
本実施例では、Ｔ変異型アレル特異的なｓｉＲＮＡは、野生型アレルだけでなく、Ａ変異型アレル及びＣ変異型アレルに対する発現抑制能が低いことを示す。
本実施例では、Ｔ変異型アレル特異的なｓｉＲＮＡは、野生型アレルだけでなく、Ａ変異型アレル及びＣ変異型アレルに対する発現抑制能が低いことを示す。
【0085】
遺伝子発現抑制効果を調べるためのレポーターとして、Ｋ－ｒａｓレポーターである、野生型Ｋレポーター、Ａ変異型Ｋレポーター、Ｔ変異型Ｔ変異型Ｋレポーター、Ｃ変異型Ｋレポーターを用い、ｓｉＲＮＡとして、Ｋ（３５）１１ＴｒｅｖＯＭ（６－８）Ｍ５及びＫ（３５）１１ＴｒｅｖＯＭ（６－８）Ｍ６を用い、コントロールとしてＫ（３５）１１Ｔｒｅｖを用いた。なお、下記配列で、点突然変異の位置に対応している塩基対と、ガイド鎖及びパッセンジャー鎖の５’末端の置換した塩基対と、ミスマッチを有する塩基対とが□で囲われ、五炭糖の２’位をＯＣＨ３に置換したヌクレオチドがシャドウでマークされている。
【0086】
【0087】
図７に、各レポーターに対する遺伝子発現抑制効果を示す。
いずれのｓｉＲＮＡも、Ｔ変異型Ｋレポーターに対して最も発現抑制効果が強かったが、特にＫ（３５）１１ＴｒｅｖＯＭ（６－８）Ｍ５及びＫ（３５）１１ＴｒｅｖＯＭ（６－８）Ｍ６は、Ｔ変異型Ｋレポーター及びＣ変異型Ｋレポーターに対する発現抑制効果が弱かった。
いずれのｓｉＲＮＡも、Ｔ変異型Ｋレポーターに対して最も発現抑制効果が強かったが、特にＫ（３５）１１ＴｒｅｖＯＭ（６－８）Ｍ５及びＫ（３５）１１ＴｒｅｖＯＭ（６－８）Ｍ６は、Ｔ変異型Ｋレポーター及びＣ変異型Ｋレポーターに対する発現抑制効果が弱かった。
【0088】
（実施例１Ａ－８）
本実施例では、Ｃ変異型アレル特異的なｓｉＲＮＡが、野生型アレルだけでなく、Ａ変異型アレル及びＴ変異型アレルの発現抑制能は低いことを示す。
本実施例では、Ｃ変異型アレル特異的なｓｉＲＮＡが、野生型アレルだけでなく、Ａ変異型アレル及びＴ変異型アレルの発現抑制能は低いことを示す。
【0089】
遺伝子発現抑制効果を調べるためのレポーターとして、下記のＫ－ｒａｓレポーターである、野生型Ｋレポーター、Ａ変異型Ｋレポーター、Ｔ変異型Ｔ変異型Ｋレポーター、Ｃ変異型Ｋレポーターを用い、ｓｉＲＮＡとして、Ｋ（３５）１１ＣｒｅｖＯＭ（６－８）Ｍ５及びＫ（３５）１１ＣｒｅｖＯＭ（６－８）Ｍ６を用い、コントロールとしてＫ（３５）１１Ｃｒｅｖを用いた。なお、下記配列で、点突然変異の位置に対応している塩基対と、ガイド鎖及びパッセンジャー鎖の５’末端の置換した塩基対と、ミスマッチを有する塩基対とが□で囲われ、五炭糖の２’位をＯＣＨ３に置換したヌクレオチドがシャドウでマークされている。
【0090】
【0091】
図８に、各レポーターに対する遺伝子発現抑制効果を示す。
いずれのｓｉＲＮＡも、Ｃ変異型Ｋレポーターに対して最も発現抑制効果が強かったが、特にＫ（３５）１１ＣｒｅｖＯＭ（６－８）Ｍ５及びＫ（３５）１１ＣｒｅｖＯＭ（６－８）Ｍ６は、Ａ変異型Ｋレポーター及びＴ変異型Ｋレポーターに対する発現抑制効果が弱かった。
［実施例１Ｂ］
いずれのｓｉＲＮＡも、Ｃ変異型Ｋレポーターに対して最も発現抑制効果が強かったが、特にＫ（３５）１１ＣｒｅｖＯＭ（６－８）Ｍ５及びＫ（３５）１１ＣｒｅｖＯＭ（６－８）Ｍ６は、Ａ変異型Ｋレポーター及びＴ変異型Ｋレポーターに対する発現抑制効果が弱かった。
［実施例１Ｂ］
【0092】
本実施例では、発現抑制のターゲット遺伝子として、Ｎ－ｒａｓ遺伝子を用いた。
【0093】
（実施例１Ｂ－１）
本実施例では、Ｎ－ｒａｓ遺伝子のｃＤＮＡ３５番目のヌクレオチドにおける点突然変異を対象とし、ｓｉＲＮＡの１１番目をＡ変異型Ｎ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ａ）アレル（以下、Ａ変異型Ｎ３５アレルと称する）の点突然変異の位置に対応させ、ｓｉＲＮＡのガイド鎖の５’末端の塩基をシトシンからウラシルに置換し、パッセンジャー鎖の５’末端の塩基をアデニンからグアニンに置換し、ガイド鎖の６番目から８番目のリボヌクレオチドにおいて、五炭糖の２’位をＯＣＨ３に置換し、かつｓｉＲＮＡのガイド鎖の５番目の塩基をＡ変異型Ｎ３５アレルの塩基に対してミスマッチさせると、野生型Ｎ－ｒａｓ（ｗｔ）アレル（以下、野生型Ｎアレルと称する）の発現より、Ａ変異型Ｎ３５アレルの発現をより特異的に抑制することを示す。
本実施例では、Ｎ－ｒａｓ遺伝子のｃＤＮＡ３５番目のヌクレオチドにおける点突然変異を対象とし、ｓｉＲＮＡの１１番目をＡ変異型Ｎ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ａ）アレル（以下、Ａ変異型Ｎ３５アレルと称する）の点突然変異の位置に対応させ、ｓｉＲＮＡのガイド鎖の５’末端の塩基をシトシンからウラシルに置換し、パッセンジャー鎖の５’末端の塩基をアデニンからグアニンに置換し、ガイド鎖の６番目から８番目のリボヌクレオチドにおいて、五炭糖の２’位をＯＣＨ３に置換し、かつｓｉＲＮＡのガイド鎖の５番目の塩基をＡ変異型Ｎ３５アレルの塩基に対してミスマッチさせると、野生型Ｎ－ｒａｓ（ｗｔ）アレル（以下、野生型Ｎアレルと称する）の発現より、Ａ変異型Ｎ３５アレルの発現をより特異的に抑制することを示す。
【0094】
遺伝子発現抑制効果を調べるためのレポーターとして、野生型Ｎアレル及びＡ変異型Ｎ３５アレルと同じ塩基配列を有するＤＮＡを発現ベクター（ｐｓｉＣＨＥＣＫ）のルシフェラーゼ遺伝子の３’－ＵＴＲに挿入し、野生型Ｎ３５レポーター及びＡ変異型Ｎレポーターを作製した。化学合成し、ベクターに組み込んだ配列を以下に示す。なお、下記配列で、点突然変異の位置に対応している塩基対が□で囲われている。
【0095】
【0096】
ｓｉＲＮＡとして、下記配列を有する２重鎖ＲＮＡを化学合成した。Ｎ（３５）１１Ｇは、野生型Ｎアレルに相補的な配列を有する。Ｎ（３５）１１Ａは、１１番目のヌクレオチドをＡ変異型Ｎ３５アレルの点突然変異の位置に対応させたｓｉＲＮＡである。Ｎ（３５）１１ＡｒｅｖＯＭ（６－８）Ｍ５は、１１番目のヌクレオチドをＡ変異型Ｎ３５アレルの点突然変異の位置に対応させ、ガイド鎖の５’末端の塩基をシトシンからウラシルに置換し、パッセンジャー鎖の５’末端の塩基をウラシルからシトシンに置換し、ガイド鎖の６番目から８番目のリボヌクレオチドにおいて、五炭糖の２’位をＯＣＨ３に置換し、かつｓｉＲＮＡのガイド鎖の５番目の塩基をＡ変異型Ｎ３５アレルの塩基に対してミスマッチさせたｓｉＲＮＡである。なお、下記配列で、点突然変異の位置に対応している塩基対と、ガイド鎖及びパッセンジャー鎖の５’末端の置換した塩基対と、ミスマッチを有する塩基対とが□で囲われ、五炭糖の２’位をＯＣＨ３に置換したヌクレオチドがシャドウでマークされている。
【0097】
【0098】
図９に、各ｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制効果を示す。
Ｎ（３５）１１Ｇは、Ａ変異型Ｎ３５アレルの発現より野生型Ｎアレルの発現を効果的に抑制し、Ｎ（３５）１１Ａは、それとは逆に、野生型Ｎアレルの発現よりＡ変異型Ｎ３５アレルの発現を効果的に抑制した。Ｎ（３５）１１ＡｒｅｖＯＭ（６－８）Ｍ５は、野生型アレルの発現抑制能が非常に弱くなり、Ａ変異型Ｎ３５アレルの発現抑制能が強くなった結果、Ａ変異型Ｎ３５アレルに対する特異性が向上した。
Ｎ（３５）１１Ｇは、Ａ変異型Ｎ３５アレルの発現より野生型Ｎアレルの発現を効果的に抑制し、Ｎ（３５）１１Ａは、それとは逆に、野生型Ｎアレルの発現よりＡ変異型Ｎ３５アレルの発現を効果的に抑制した。Ｎ（３５）１１ＡｒｅｖＯＭ（６－８）Ｍ５は、野生型アレルの発現抑制能が非常に弱くなり、Ａ変異型Ｎ３５アレルの発現抑制能が強くなった結果、Ａ変異型Ｎ３５アレルに対する特異性が向上した。
【0099】
（実施例１Ｂ－２）
本実施例では、Ｎ－ｒａｓ遺伝子のｃＤＮＡ１８２番目のヌクレオチドにおける点突然変異を対象とし、ｓｉＲＮＡの１１番目をＡ変異型Ｎ－ｒａｓ（ｃ．１８２Ａ＞Ｇ）アレル（以下、Ｇ変異型Ｎ１８２アレルと称する）の点突然変異の位置に対応させ、ｓｉＲＮＡのガイド鎖の５’末端の塩基をグアニンからウラシルに置換し、パッセンジャー鎖の５’末端の塩基をアデニンからグアニンに置換し、ガイド鎖の６番目から８番目のリボヌクレオチドにおいて、五炭糖の２’位をＯＣＨ３に置換し、かつｓｉＲＮＡのガイド鎖の５番目の塩基をＧ変異型Ｎ１８２アレルの塩基に対してミスマッチさせると、野生型Ｎ－ｒａｓ（ｗｔ）アレル（以下、野生型Ｎアレルと称する）の発現より、Ｇ変異型Ｎ１８２アレルの発現をより特異的に抑制することを示す。
本実施例では、Ｎ－ｒａｓ遺伝子のｃＤＮＡ１８２番目のヌクレオチドにおける点突然変異を対象とし、ｓｉＲＮＡの１１番目をＡ変異型Ｎ－ｒａｓ（ｃ．１８２Ａ＞Ｇ）アレル（以下、Ｇ変異型Ｎ１８２アレルと称する）の点突然変異の位置に対応させ、ｓｉＲＮＡのガイド鎖の５’末端の塩基をグアニンからウラシルに置換し、パッセンジャー鎖の５’末端の塩基をアデニンからグアニンに置換し、ガイド鎖の６番目から８番目のリボヌクレオチドにおいて、五炭糖の２’位をＯＣＨ３に置換し、かつｓｉＲＮＡのガイド鎖の５番目の塩基をＧ変異型Ｎ１８２アレルの塩基に対してミスマッチさせると、野生型Ｎ－ｒａｓ（ｗｔ）アレル（以下、野生型Ｎアレルと称する）の発現より、Ｇ変異型Ｎ１８２アレルの発現をより特異的に抑制することを示す。
【0100】
遺伝子発現抑制効果を調べるためのレポーターとして、Ｇ変異型Ｎ１８２アレルと同じ塩基配列を有するＤＮＡを発現ベクター（ｐｓｉＣＨＥＣＫ）のルシフェラーゼ遺伝子の３’－ＵＴＲに挿入し、Ｇ変異型Ｎ１８２レポーターを作製した。化学合成し、ベクターに組み込んだ配列を以下に示す。
【0101】
【0102】
ｓｉＲＮＡとして、下記配列を有する２重鎖ＲＮＡを化学合成した。Ｎ（１８２）１１Ａは、野生型Ｎアレルに相補的な配列を有する。Ｎ（１８２）１１Ｇは、１１番目のヌクレオチドをＧ変異型Ｎ１８２アレルの点突然変異の位置に対応させたｓｉＲＮＡである。Ｎ（１８２）１１ＧｒｅｖＯＭ（６－８）Ｍ５は、１１番目のヌクレオチドをＡ１８２変異型Ｎアレルの点突然変異の位置に対応させ、ガイド鎖の５’末端の塩基をグアニンからウラシルに置換し、パッセンジャー鎖の５’末端の塩基をアデニンからグアニンに置換し、ガイド鎖の６番目から８番目のリボヌクレオチドにおいて、五炭糖の２’位をＯＣＨ３に置換し、かつｓｉＲＮＡのガイド鎖の５番目の塩基をＧ変異型１８２Ｎアレルの塩基に対してミスマッチさせたｓｉＲＮＡである。なお、下記配列で、点突然変異の位置に対応している塩基対と、ガイド鎖及びパッセンジャー鎖の５’末端の置換した塩基対と、ミスマッチを有する塩基対とが□で囲われ、五炭糖の２’位をＯＣＨ３に置換したヌクレオチドがシャドウでマークされている。
【0103】
【0104】
Ｎ（１８２）１１Ａは、Ｇ変異型Ｎ１８２アレルの発現より野生型Ｎ１８２アレルの発現を効果的に抑制し、Ｎ（１８２）１１Ｇは、それとは逆に、野生型Ｎ１８２アレルの発現よりＡ変異型Ｎ１８２アレルの発現を効果的に抑制した。Ｎ（１８２）１１ＡｒｅｖＯＭ（６－８）Ｍ５は、野生型アレルの発現抑制能がなくなり、Ｇ変異型Ｎ１８２アレルの発現抑制能が若干弱くなった結果、Ｇ変異型１８２アレルに対する特異性が向上した。
【0105】
［実施例１Ｃ］
本実施例では、ＢＲＣＡ２遺伝子の野生型アレルとＡ１１１４Ｃ変異型アレル（ｃＤＮＡ（ＧＥＮＥ ＩＤ：６７５）において、１１１４番目の塩基がＡからＣに変異）、ＳＴＫ１１遺伝子の野生型アレルとＣ１０６２Ｇ変異型アレル（ｃＤＮＡ（ＧＥＮＥ ＩＤ：６７９４）において、１０６２番目の塩基がＣからＧに変異）、ＰＴＥＮ遺伝子の野生型アレルとＣ３８８Ｇ変異型アレル（ｃＤＮＡ（ＧＥＮＥ ＩＤ：５７２８）において、３８８番目の塩基がＣからＧに変異）、ＡＰＣ遺伝子の野生型アレルとＣ４３４８Ｔ変異型アレル（ｃＤＮＡ（ＧＥＮＥ ＩＤ：３２４）において、４３４８番目の塩基がＣからＴに変異）、ＧＡＴＡ２遺伝子の野生型アレルとＣ９５３Ｔ変異型アレル（ｃＤＮＡ（ＧＥＮＥ ＩＤ：２６２４）において、９５３番目の塩基がＣからＴに変異）、ＭＹＤ８８遺伝子の野生型アレルとＴ８１８Ｃ変異型アレル（ｃＤＮＡ（ＧＥＮＥ ＩＤ：４６１５）において、８１８番目の塩基がＴからＣに変異）、ＧＮＡＱ遺伝子の野生型アレルとＡ６２６Ｔ変異型アレル（ｃＤＮＡ（ＧＥＮＥ ＩＤ：２７７６）において、６２６番目の塩基がＡからＴに変異）、ＩＤＨ１遺伝子の野生型アレルとＧ３９５Ａ変異型アレル（ｃＤＮＡ（ＧＥＮＥ ＩＤ：３４１７）において、３９５番目の塩基がＧからＡに変異）の各ペアに対し、本開示の配列を有するｓｉＲＮＡが野生型アレルからの発現をほとんど抑制せず、変異型アレルからの発現を強く抑制することを示す。
本実施例では、ＢＲＣＡ２遺伝子の野生型アレルとＡ１１１４Ｃ変異型アレル（ｃＤＮＡ（ＧＥＮＥ ＩＤ：６７５）において、１１１４番目の塩基がＡからＣに変異）、ＳＴＫ１１遺伝子の野生型アレルとＣ１０６２Ｇ変異型アレル（ｃＤＮＡ（ＧＥＮＥ ＩＤ：６７９４）において、１０６２番目の塩基がＣからＧに変異）、ＰＴＥＮ遺伝子の野生型アレルとＣ３８８Ｇ変異型アレル（ｃＤＮＡ（ＧＥＮＥ ＩＤ：５７２８）において、３８８番目の塩基がＣからＧに変異）、ＡＰＣ遺伝子の野生型アレルとＣ４３４８Ｔ変異型アレル（ｃＤＮＡ（ＧＥＮＥ ＩＤ：３２４）において、４３４８番目の塩基がＣからＴに変異）、ＧＡＴＡ２遺伝子の野生型アレルとＣ９５３Ｔ変異型アレル（ｃＤＮＡ（ＧＥＮＥ ＩＤ：２６２４）において、９５３番目の塩基がＣからＴに変異）、ＭＹＤ８８遺伝子の野生型アレルとＴ８１８Ｃ変異型アレル（ｃＤＮＡ（ＧＥＮＥ ＩＤ：４６１５）において、８１８番目の塩基がＴからＣに変異）、ＧＮＡＱ遺伝子の野生型アレルとＡ６２６Ｔ変異型アレル（ｃＤＮＡ（ＧＥＮＥ ＩＤ：２７７６）において、６２６番目の塩基がＡからＴに変異）、ＩＤＨ１遺伝子の野生型アレルとＧ３９５Ａ変異型アレル（ｃＤＮＡ（ＧＥＮＥ ＩＤ：３４１７）において、３９５番目の塩基がＧからＡに変異）の各ペアに対し、本開示の配列を有するｓｉＲＮＡが野生型アレルからの発現をほとんど抑制せず、変異型アレルからの発現を強く抑制することを示す。
【0106】
まず、遺伝子発現抑制効果を調べるためのレポーターとして、各アレルと同じ塩基配列を有するＤＮＡを化学合成し、発現ベクター（ｐｓｉＣＨＥＣＫ）のルシフェラーゼ遺伝子の３’－ＵＴＲに挿入し、レポーターを作製した。それぞれ、ベクターに組み込んだ部分の配列を以下に示す。
【0107】
【0108】
次に、ｓｉＲＮＡとして、下記配列を有する２重鎖ＲＮＡを化学合成し、これらのレポーターおよびｓｉＲＮＡを用いて、実施例１Ａと同様にレポーターアッセイを行った。図１１にそれぞれの結果を示す。なお、コントロールのｓｉＲＮＡとしてはｓｉＢＲＣＡ２＿ｗｔを導入し、二重鎖ｓｉＲＮＡで得られた測定値は、ｓｉＢＲＣＡ２＿ｗｔで得られた測定値を１００％として、図１１のグラフに表した。
【0109】
なお、下記配列で、ｗｔは、野生型遺伝子の配列に基づいて作られたｓｉＲＮＡである。点突然変異の位置に対応している塩基対と、ガイド鎖及びパッセンジャー鎖の５’末端の置換した塩基対と、ミスマッチを有する塩基対とが□で囲われ、五炭糖の２’位をＯＣＨ３に置換したヌクレオチドがシャドウでマークされている。
【0110】
【0111】
図１１のグラフから明らかであるように、野生型配列に対応するｓｉＲＮＡは、野生型アレルおよび変異型アレルの両方からの発現を抑制するが、本明細書に開示のｓｉＲＮＡは、野生型アレルからの発現はほとんど抑制しない一方、変異型アレルからの発現は強く抑制する。
【実施例2】
【0112】
本実施例では、培養細胞中で、外来性のレポーターからの発現に対して変異型アレルからの発現を特異的に抑制するｓｉＲＮＡが、内在性遺伝子の発現に対しても、同様の特異性を有することを示す。
【0113】
まず、いずれもすい臓腺がん由来の細胞株である、ＢｘＰＣ－３（３５番目の塩基がＧ／Ｇ：野生型ホモ接合）、ＡｓＰＣ－１（３５番目の塩基がＡ／Ａ：Ａ型変異ホモ接合）、及びＰＡＮＣ－１（３５番目の塩基がＧ／Ａ：Ａ型変異ヘテロ接合）の各細胞を接着培養し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸを（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に対し、ｓｉＧＹ４４１（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）、ｓｉＫＲＡＳ－６２（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ：全てのＫ－ｒａｓ ｍＲＮＡを抑制するｓｉＲＮＡ）、ｓｉＫＲＡＳ－ＷＴ（野生型Ｋーｒａｓ特異的ｓｉＲＮＡ）およびｓｉＫＲＡＳ－Ａ（Ａ変異型特異的ｓｉＲＮＡ：Ｋ（３５）１１ＡｒｅｖＯＭ（６－８）Ｍ６）を用いて、各５０ｎＭの濃度で、一日に一度、３日連続でＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎを行った。３回目のＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎの翌日に、一部の細胞からｍＲＮＡを単離し、逆転写反応によりｃＤＮＡを作成、定量的ＰＣＲ法を用いて、Ｋ－ｒａｓのｍＲＮＡを定量した。各細胞において、ｓｉＧＹ４４１の発現量を１００として、各ｓｉＲＮＡを導入したときの発現量を相対値で表した。その結果を図１２に示す。
【0114】
本実施例で用いた塩基配列を以下に記載した。下記配列で、ｗｔは、野生型遺伝子の配列に基づいて作られたｓｉＲＮＡである。点突然変異の位置に対応している塩基対と、ガイド鎖及びパッセンジャー鎖の５’末端の置換した塩基対と、ミスマッチを有する塩基対とが□で囲われ、五炭糖の２’位をＯＣＨ３に置換したヌクレオチドがシャドウでマークされている。
【0115】
【0116】
グラフに示されているように、野生型ホモ接合であるＢｘＰＣ－３では、ｓｉＫＲＡＳ－６２とｓｉＫＲＡＳ－ＷＴが発現を強く抑制し、Ａ型変異ホモ接合であるＡｓＰＣ－１では、ｓｉＫＲＡＳ－６２とｓｉＫＲＡＳ－Ａが発現を強く抑制し、Ａ変異ヘテロ接合であるＰＡＮＣ－１では、ｓｉＫＲＡＳ－６２が発現を強く抑制し、ｓｉＫＲＡＳ－ＷＴとｓｉＫＲＡＳ－Ａが発現を弱く抑制しており、内在性遺伝子に対しても、各細胞の遺伝子型と各ｓｉＲＮＡの特異性とが対応していた。
このように、各ｓｉＲＮＡは、内在性の遺伝子発現に対し、レポーターのような外因性の遺伝子発現と同様の特異性で発現抑制することができる。
このように、各ｓｉＲＮＡは、内在性の遺伝子発現に対し、レポーターのような外因性の遺伝子発現と同様の特異性で発現抑制することができる。
【実施例3】
【0117】
本実施例では、ｓｉＫＲＡＳ－Ａがin vivoで腫瘍細胞の増殖を抑制できることを示す。
ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡＪｃｌ-Ｆｏｘｎ１ｎｕｌｌ）３匹の皮下に、１．０ｘ１０６個のＡｓＰＣ－１細胞を５-６箇所ずつ移植し、毎週２回、腫瘍の体積をノギスで測定することにより、腫瘍の増殖能を評価した。移植後１０日目の腫瘍サイズは、移植３日目と比較して２倍程度に増加していたため、増殖フェーズに入っていると判断し、移植後１１日目から１週間おきに５μｇのｓｉＲＮＡ（ｓｉＣｏｎｔ、ｓｉＫＲＡＳ－ＷＴ、またはｓｉＫＲＡＳ－Ａ）とトランスフェクション試薬であるｉｎ ｖｉｖｏ ＪＥＴ ＰＥＩ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ社）の混合液を２７Ｇのニードルを用い、各腫瘍に対して直接投与した。なお、１個体につき１種類のｓｉＲＮＡのみを投与した。図１３に結果をグラフにして示した。
ｓｉＫＲＡＳ－Ａを投与した群では、ｓｉＣｏｎｔやｓｉＫＲＡＳ－ＷＴの投与群と比較し、移植後２４日目以降、有意に腫瘍サイズが小さくなった。
このように、変異Ｋ－ｒａｓ依存的に増殖する細胞において、ｓｉＫＲＡＳ－Ａはその増殖を抑制できる。
ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡＪｃｌ-Ｆｏｘｎ１ｎｕｌｌ）３匹の皮下に、１．０ｘ１０６個のＡｓＰＣ－１細胞を５-６箇所ずつ移植し、毎週２回、腫瘍の体積をノギスで測定することにより、腫瘍の増殖能を評価した。移植後１０日目の腫瘍サイズは、移植３日目と比較して２倍程度に増加していたため、増殖フェーズに入っていると判断し、移植後１１日目から１週間おきに５μｇのｓｉＲＮＡ（ｓｉＣｏｎｔ、ｓｉＫＲＡＳ－ＷＴ、またはｓｉＫＲＡＳ－Ａ）とトランスフェクション試薬であるｉｎ ｖｉｖｏ ＪＥＴ ＰＥＩ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ社）の混合液を２７Ｇのニードルを用い、各腫瘍に対して直接投与した。なお、１個体につき１種類のｓｉＲＮＡのみを投与した。図１３に結果をグラフにして示した。
ｓｉＫＲＡＳ－Ａを投与した群では、ｓｉＣｏｎｔやｓｉＫＲＡＳ－ＷＴの投与群と比較し、移植後２４日目以降、有意に腫瘍サイズが小さくなった。
このように、変異Ｋ－ｒａｓ依存的に増殖する細胞において、ｓｉＫＲＡＳ－Ａはその増殖を抑制できる。
【産業上の利用可能性】
【0118】
本発明によって、新規なＲＮＡ分子、新規なキメラ型ＮＡ分子、新規な二本鎖ＲＮＡ分子、および新規な二本鎖キメラ型ＮＡ分子を提供することができるようになった。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図11D】
【図11E】
【図11F】
【図11G】
【図11H】
【図12】
【図13】
