7497858 分岐オリゴ糖およびキシロースの製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-06-03

(45)【発行日】2024-06-11

(54)【発明の名称】分岐オリゴ糖およびキシロースの製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12P 19/14 20060101AFI20240604BHJP

   C12P 19/02 20060101ALI20240604BHJP

   C12N 15/56 20060101ALN20240604BHJP

【ＦＩ】

C12P19/14 A ZNA

C12P19/02

C12N15/56

【請求項の数】 7

(21)【出願番号】P 2020087827

(22)【出願日】2020-05-20

(65)【公開番号】P2021180640

(43)【公開日】2021-11-25

【審査請求日】2023-02-28

(73)【特許権者】

【識別番号】504145308

【氏名又は名称】国立大学法人 琉球大学

(74)【代理人】

【識別番号】100152180

【弁理士】

【氏名又は名称】大久保 秀人

(72)【発明者】

【氏名】金子 哲

【審査官】大久保 智之

(56)【参考文献】

【文献】Frontiers in Microbiology，2020年04月24日，Vol. 11, Article 545

【文献】Extremophiles，2013年，Vol. 17，pp. 357-366

【文献】Database Genbank, Accession No. BAB05833.1 [online], 2017.05.10 [検索日 2023.12.27], インターネット：<URL:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/BAB05833.1>

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｐ １／００－４１／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

キシランを含む原料にＣＡＺｙの分類でＧＨ１１に分類されるβ－キシラナーゼを作用させて得られる低分子化キシランに、ＣＡＺｙの分類でＧＨ５２に分類されるβ－キシロシダーゼを作用させることで分岐オリゴ糖を得ることを特徴とする分岐オリゴ糖の製造方法。

【請求項2】

β－キシロシダーゼを作用させた後のキシロースと分岐オリゴ糖の混合物からキシロースを分離することで分岐オリゴ糖を得るものである請求項１記載の分岐オリゴ糖の製造方法。

【請求項3】

分岐オリゴ糖が、非還元末端キシロースに分岐を持たない分岐オリゴ糖を含むものである請求項１または２記載の分岐オリゴ糖の製造方法。

【請求項4】

ＣＡＺｙの分類でＧＨ５２に分類されるβ－キシロシダーゼが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ Ｃ－１２５株由来のβ－キシロシダーゼである請求項１～３の何れか１に記載の分岐オリゴ糖の製造方法。

【請求項5】

キシランを含む原料にＣＡＺｙの分類でＧＨ１１に分類されるβ－キシラナーゼを作用させて得られる低分子化キシランに、ＣＡＺｙの分類でＧＨ５２に分類されるβ－キシロシダーゼを作用させることでキシロースを得ることを特徴とするキシロースの製造方法。

【請求項6】

β－キシロシダーゼを作用させた後のキシロースと分岐オリゴ糖の混合物から分岐オリゴ糖を分離することでキシロースを得るものである請求項５記載のキシロースの製造方法。

【請求項7】

ＣＡＺｙの分類でＧＨ５２に分類されるβ－キシロシダーゼが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ Ｃ－１２５株由来のβ－キシロシダーゼである請求項５または６記載のキシロースの製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、低分子化キシランから分岐オリゴ糖およびキシロースを製造する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

キシランは、セルロースに次ぐバイオマス資源であり、その構造は以下の式で示されるように、キシロースがβ－１，４－結合でつながった主鎖にアラビノース（α－１，３－）や４－Ｏ－メチル－グルクロン酸またはグルクロン酸（α－１，２－）の側鎖を持つヘテロ多糖である。

【0003】

【化1】

【0004】

このキシランに、従来より知られているキシラナーゼ（エンド型酵素）を作用させると、分解物は分岐オリゴ糖と直鎖状オリゴ糖の混合物となってしまうため、この混合物からは分岐オリゴ糖の分離が困難となる。そのため、キシラナーゼ分解物にキシロシダーゼを作用させ、直鎖状オリゴ糖を単糖に分解し、分岐オリゴ糖とキシロースを活性炭や膜分離により容易に分離する手法が考えられるが、分岐オリゴ糖にもキシロシダーゼが作用してしまい、非還元末端に分岐のあるオリゴ糖ばかりになってしまう。

【0005】

また、ＣＡＺｙの分類でＧＨ３に分類されるキシロシダーゼ（カビ由来）では、アラビノース側鎖を有するオリゴ糖の非還元末端キシロースの結合が切れないという報告がある（非特許文献１）。

【0006】

しかしながら、ＧＨ３に分類される酵素は作用させる際に酵素を大量に用いると、アラビノース側鎖を有するオリゴ糖の非還元末端キシロースの結合を切ってしまうことが知られている。更に、ＧＨ３に分類される酵素はアラビノフラノシダーゼ活性をサイドアクテビティーとして有するため、多量の酵素を使う、または反応時間が長い場合には、アラビノース側鎖を遊離し、主鎖を分解するという反応も起こってしまう。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0007】

【文献】Carbohydrate Research Volume249,Issue2,3,Pages355-367(1993)

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

従って、本発明では低分子化キシランから分岐オリゴ糖を得るに当たり、酵素を作用させた後のキシロースと分岐オリゴ糖の混合物からの分岐オリゴ糖の分離が容易で、かつ、得られた分岐オリゴ糖を分解させずに保持できる技術を提供することを課題とした。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究した結果、ＣＡＺｙの分類で特定のカテゴリーに分類される酵素を用いることにより、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成させた。また、この低分子化キシランから分岐オリゴ糖を得る際に、同時にキシロースも得られることを見出し、本発明を完成させた。

【0010】

すなわち、本発明は、低分子化キシランに、ＣＡＺｙの分類でＧＨ５２に分類されるβ－キシロシダーゼを作用させることで分岐オリゴ糖を得ることを特徴とする分岐オリゴ糖の製造方法である。

【0011】

また、本発明は、低分子化キシランに、ＣＡＺｙの分類でＧＨ５２に分類されるβ－キシロシダーゼを作用させることでキシロースを得ることを特徴とするキシロースの製造方法である。

【発明の効果】

【0012】

本発明の分岐オリゴ糖の製造方法は、酵素を作用させた後のキシロースと分岐オリゴ糖の混合物からの分岐オリゴ糖の分離が容易で、かつ、得られた分岐オリゴ糖を分解させずに保持できる。

【0013】

そのため、本発明の分岐オリゴ糖の製造方法は、分岐オリゴ糖を大量に製造することができるため、これまで不明であった分岐オリゴ糖の種々の性質の探索に貢献できる。

【0014】

また、本発明の分岐オリゴ糖の製造方法は、酵素を作用させた後のキシロースと分岐オリゴ糖の混合物からキシロースを単離することができるため、キシロースの製造方法としても有用である。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】図１は精製した酵素のＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果である（図中、レーン１はマーカー、レーン２は精製した酵素）。

【図2】図２は酵素の性質を示す図である（図中、ａは酵素のｐＨと比活性の関係を示し、ｂは酵素の温度と比活性の関係を示し、ｃはｐＨと残存活性の関係を示し、ｄが温度と残存活性の関係を示す）。

【図3】図３はバガスを原料とした分岐オリゴ糖の製造スキームを示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0016】

本発明の分岐オリゴ糖の製造方法（以下、「本発明製法」という）は、低分子化キシランに、ＣＡＺｙの分類でＧＨ５２に分類されるβ－キシロシダーゼを作用させることで分岐オリゴ糖を得ることを特徴とする。なお、本明細書において分岐オリゴ糖とは、糖の重合度が２～１０のものをいう。

【0017】

本発明製法において用いられる低分子化キシランは、分子量が２０００以下、好ましくは２８０～１５００のものである。なお、この分子量の測定法は特に限定されるものではなく、例えば、質量分析やゲル濾過法で測定することができる。また、この分子量は薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）等で低分子化キシランを構成する糖の数から推測することもできる。このような低分子化キシランは、キシランを含む原料にキシラナーゼを作用させたり、酸を作用させたりすること等により得られるが、キシランを含む原料にキシラナーゼを作用させることが分岐オリゴ糖の構造を制御する点から好ましい。キシランを含む原料は、植物細胞壁を有するものであれば特に限定されず、例えば、バガス、イナワラ、コーンストーバー、木粉等が挙げられる。これらの中でもバガス、イナワラ、コーンストーバーが好ましい。

【0018】

また、上記キシラナーゼは、特に限定されず、例えば、ＣＡＺｙの分類でファミリー分類されるＧＨ８キシラナーゼ、ＧＨ１０、ＧＨ１１に分類されるβ－キシラナーゼ等が挙げられる。これらキシラナーゼの中でも非還元末端から２番目のキシロースに分岐を持つオリゴ糖を主生産物とすることから、ＧＨ１１に分類されるβ－キシラナーゼが好ましい。なお、キシラナーゼの種類により、得られる分岐オリゴ糖の種類も変化させることができる。

【0019】

更に、キシランを含む原料にキシラナーゼを作用させる条件は特に限定されないが、例えば、キシランを含む原料１に対して、キシラナーゼを０.０５～５質量％（以下、単に「％」という）、好ましくは０.１～０.５％添加し、３０～６０℃、好ましくは４０～５０℃、ｐＨが５.５～９.５、好ましくは５.５～７で、１～９６時間、好ましくは３～４８時間保持する条件である。

【0020】

また、上記酸は、特に限定されず、例えば、硫酸、塩酸、トリフルオロ酢酸等が挙げられる。これら酸の中でも硫酸、塩酸が好ましい。

【0021】

更に、キシランを含む原料に酸を作用させる条件は特に限定されないが、例えば、キシランを含む原料１に対して、０．１～５％、好ましくは０．５～１％の酸を添加し、８０～２００℃、好ましくは１００～１２０℃、０．１～２４時間、好ましくは２～３時間保持する条件である。

【0022】

なお、キシランを含む原料を低分子化キシランにする時期は、後記するβ－キシロシダーゼの添加と同じでも、前でもよい。

【0023】

本発明製法において用いられるＣＡＺｙの分類でＧＨ５２に分類されるβ－キシロシダーゼは特に限定されず、例えば、ＣＡＺｙのホームページ（http://www.cazy.org/）でＧＨ５２に分類されるβ－キシロシダーゼを検索し（検索結果：http://www.cazy.org/GH52_all.html）、これを産生する微生物を入手し、これを培養してＧＨ５２に分類されるβ－キシロシダーゼを産生させ、それを必要により精製等したものや、ＧＨ５２に分類されるβ－キシロシダーゼのアミノ酸配列やこれをコードする塩基配列、遺伝子を利用して大腸菌等でＧＨ５２に分類されるβ－キシロシダーゼを産生させ、それを必要により精製等したもの等が挙げられる。

【0024】

なお、ＧＨ５２に分類されるβ－キシロシダーゼの一般的な性質は以下の通りである。
・ｐＨ６付近に反応の至適がある。
・分子量は８万弱程度。
・アノマー保持型の反応機構であり、大量に使用すると糖転移反応を触媒する。
・キシロビオース、キシロトリオースを最も良く分解し、キシロテトラオース、キシロペンタオース、キシロヘキサオースと鎖長が長くなるにつれ活性が低下する。
・アラビノース側鎖、グルクロン酸側鎖いずれの場合も非還元末端にキシロースを１つ有する分岐オリゴ糖を分解しない。

【0025】

これらＧＨ５２に分類されるキシロシダーゼとしては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ Ｃ－１２５株（JCM9153株：理化学研究所・バイオリソースセンター・微生物材料開発室（http://jcm.brc.riken.jp/ja/）から入手可能）由来のものが好ましい。このＢａｃｉｌｌｕｓ ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ Ｃ－１２５株由来のＧＨ５２に分類されるキシロシダーゼのアミノ酸配列のアクセッションナンバーはBAB05833.1（配列番号１）である。そして、上記アミノ酸配列をコードする遺伝子としては、上記Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ Ｃ－１２５株の全ゲノム配列（アクセッションナンバーはNC002570）を利用することができる。

【0026】

低分子化キシランに、ＧＨ５２に分類されるキシロシダーゼを作用させる条件は特に限定されないが、例えば、低分子化キシラン１に対して、ＧＨ５２に分類されるキシロシダーゼを０.０００００５～０.０００５、好ましくは０.００００１～０.００００５％で添加し、３０～６０℃、好ましくは４０～５０℃、ｐＨが５.５～９.５、好ましくは５.５～７で、１～９６時間、好ましくは３～４８時間である。

【0027】

低分子化キシランに、ＧＨ５２に分類されるキシロシダーゼを作用させた後は、キシロースと分岐オリゴ糖の混合物が得られる。なお、この分岐オリゴ糖は、非還元末端キシロースに分岐を持たない分岐オリゴ糖を含むものである。非還元末端キシロースに分岐を持たない分岐オリゴ糖としては、例えば、キシラナーゼとしてＧＨ１１に分類されるβ－キシラナーゼを用いた場合には、O-β-D-xylopyranosyl-(1→4)-[O-α-L-arabinofuranosyl-(1→3)]-O-β-D-xylopyranosyl-(1→4)-β-D-xylopyranosyl-(1→4)-β-D-xylopyranose、O-β-D-xylopyranosyl-(1→4)-[O-4-O-methyl-α-D-glucuronopyranosyl-(l→2)]-β-D-xylopyranosyl-(1→4)-β-D-xylopyranosyl-(1→4)-β-D-xylopyranose等が得られる。

【0028】

本発明製法においては、上記で得られるキシロースと分岐オリゴ糖の混合物からキシロースを分離することが好ましい。キシロースと分岐オリゴ糖の混合物からキシロースを分離する方法は特に限定されず、例えば、活性炭クロマトグラフィーや膜分離法等の方法が挙げられる。

【0029】

また、本発明製法においては、上記分離の後に、更に、精製、乾燥等の処理を行ってもよい。

【0030】

斯くして得られる分岐オリゴ糖は、例えば、腸内細菌、腸内細菌の増殖作用、整腸作用等を有する。そのため、この分岐オリゴ糖は、そのまま、または各種飲食品に利用することにより健康の増進に役立つ。

【0031】

また、この分岐オリゴ糖は、従来は入手が困難で有り、その機能の解明もあまり進んでいなかったため、その機能の解明にも役立つ。

【0032】

なお、上記した低分子化キシランに、ＣＡＺｙの分類でＧＨ５２に分類されるβ－キシロシダーゼを作用させた後のキシロースと分岐オリゴ糖の混合物から分岐オリゴ糖を分離することでキシロースを得ることができる。

【0033】

キシロースと分岐オリゴ糖の混合物から分岐オリゴ糖を分離する方法は特に限定されず、例えば、活性炭クロマトグラフィーや膜分離法等の方法が挙げられる。

【0034】

上記分離の後には、更に、精製、乾燥等の処理を行ってもよい。

【0035】

斯くして得られるキシロースは、例えば、甘味料、焼き色改良、風味改善、矯臭作用、テリの付与、酸化防止等を有する。そのため、このキシロースは、そのまま、または各種飲食品の製造に役立つ。また、キシロースは、キシロースを炭素源として多糖等を産生する微生物の発酵原料としても役立つ。

【実施例】

【0036】

以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。

【0037】

実 施 例 １
β－キシロシダーゼの製造：
（１）酵素の調製
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ Ｃ－１２５のゲノム（アクセッションナンバーNC002570）において、ＣＡＺｙの分類でＧＨ５２に分類されるキシロシダーゼと推定されるタンパク（アクセッションナンバーBAB05833.1：配列番号１）をコードする遺伝子を以下のプライマーを用いてＰＣＲで増幅した。

【0038】

・forwardプライマー（配列番号２）：CATATGAATCGAGGAGAAACTGGTTATGAAACATG
・reverseプライマー（配列番号３）：GCGGCCGCTATCGGATAAATGGTT

【0039】

上記で得た増幅物をpET28a(NcoI-HindIII)の間に挿入してpET28-bhxyl52プラスミドを得た。このプラスミドを用いたエレクトロポレーション法でEscherichia coli BL21（DE3）（Merck KGaA,Darmstadt,Germany）を形質転換した。形質転換体はKanamycineを含むLuria-Bertani培地を使用し37℃で振盪（200rpm）しながら増殖させた。培養液のOD600nmが0.2に達したときにイソプロピルβ-D-チオガラクトピラノシド（IPTG）を最終濃度0.1mMで培養液に添加し、その後、培養液を25℃で振盪(200rpm)しながら22時間酵素を発現させた．遠心分離（6,000rpm,15min,4℃）によって細胞を回収し，50mMリン酸緩衝液（pH7.0）に懸濁して5分間超音波破砕した後、遠心分離（10,000rpm,30min,4℃）により不溶物を取り除いた。回収した上清もHisTrap HP（GE Healthcare,USA）を添加し、C末端の6xヒスチジンタグを利用して活性画分を精製した。活性画分を回収し、蒸留水に対して透析して得られた溶液を精製酵素とした。得られた精製酵素の純度はSDS-PAGEで確認した。

【0040】

pET28にクローニングしBL21(DE3)に形質転換したbhxyl52をIPTGにより誘導し発現させ、金属アフィニティークロマトグラフィーによりBhXyl52を精製した。精製酵素の純度をSDS-PAGEで確認したところ、電気泳動的に単一なバンドを得た（図１）。SDS-PAGEの結果から計算した精製酵素の分子量はおよそ76,382であり、アミノ酸配列から想定される分子量(78,580)と一致した。得られた精製酵素の活性と安定性に対するpHと温度の影響を調べた。本酵素の諸性質を図２に示す。本酵素の至適はpH6.2、50℃であった。pHに対する酵素の安定性では30℃、30分の処理でpH6.0～8.0の間、40℃以下で安定だった。

【0041】

（２）酵素と基質の反応
PNP-基質（Sigma）に対する活性は、2mM基質25μl、McIlvaine buffer(pH6.2)20μLを混ぜたものを5分プレインキュベーションし、酵素5μL（36nM）を添加して50℃、10分反応した後、0.2M Na₂CO₃50μLを添加して反応を停止した。発色はA405nmを測定して行った。

【0042】

キシロオリゴ糖に対する活性は、表１に記載の基質を用い、基質濃度100μM 30μL、0.005% fucose35μL、McIlvaine budffer（pH6.2）100μL、DW73μL、enzyme100μL（final 5.5nM for GH52）を混ぜたものを0、10、20、40、60、80、100、150、200分インキュベーションした後、100℃で10分加熱することにより失活させた。反応停止液はDionex社HPLC装置によって分析した。分析条件は既報の通り（S. Kaneko, H. Ichinose, Z. Fujimoto, A. Kuno, K. Yura, M. Go, H. Mizuno, I. Kusakabe, and H. Kobayashi: Structure and function of a family 10 β-xylanase chimera of Streptomyces olivaceoviridis E-86 FXYN and Cellulomonas fimi Cex. J. Biol. Chem., 279, 26619-26626(2004).）。オリゴ糖のピークの減少を定量し、分解率を得た。

【0043】

なお、基質のうち、キシロビオース(X2)、キシロトリオース(X3)、キシロテトラオース(X4)、キシロペンタオース(X5)、キシロヘキサオース(X6)は先の報告に従い調製した（Kusakabe et al. xylooligosaccharide）。また、O-β-D-xylopyranosyl-(1→4)-[O-α-L-arabinofuranosyl-(1→3)]-O-β-D-xylopyranosyl-(1→4)-β-D-xylopyranosyl-(1→4)-β-D-xylopyranose (A₁X₄)とO-β-D-xylopyranosyl-(1→4)-[O-4-O-methyl-α-D-glucuronopyranosyl-(l→2)]-β-D-xylopyranosyl-(1→4)-β-D-xylopyranosyl-(1→4)-β-D-xylopyranose (MeGlcA³Xyl₄)は先の報告に従い調製した（I. Kusakabe, S. Ohgushi, T. Yasui, and T. Kobayashi: Structures of the arabinoxylo-oligosaccharides from the hydrolytic products of corncob arabinoxylan by a xylanase from Streptomyces. Agric. Biol.Chem.,47,2713-2723(1983).）。

【0044】

BhXyl52はPNP-基質に対してはPNP-Xylにのみ反応した。多糖には作用させた場合、還元力の増加は見られなかった(結果は省略)。直鎖状のキシロオリゴ糖に作用させたところ、X2とX3をもっとも早く分解した。X2=X3>X4>X5>X6と、X2とX3の分解速度はほぼ同じであり、主鎖が長くなるにつれて反応速度が低下した（表１）。また、分岐した基質には作用しなかった。分岐した基質に酵素量を1000倍に増やして作用させたが、結果は同じであった（結果は省略）。

【0045】

【表1】

【0046】

以上の結果から、BhXyl52は、β－キシロシダーゼであり、直鎖状のキシロオリゴ糖は分解するものの、非還元末端キシロースに分岐を持たない分岐オリゴ糖は分解しないことが分かった。また、BhXyl52は酵素量を多くしても非還元末端キシロースに分岐を持たない分岐オリゴ糖は分解しないことが分かった。

【0047】

実 施 例 ２
バガスを原料とした分岐オリゴ糖の製造：
図３のスキームに従って、バガスを原料として、これにβ－キシラナーゼ（SoXyn11B）を作用させて、低分子化キシラン（ＴＬＣの結果から低分子化キシランが５糖以下で構成されていることを確認した（分子量は７００以下）。）を得て、それに更にβ－キシロシダーゼ（GhXyl52）を作用させて分岐オリゴ糖（Ａ_１Ｘ_４）を得た。なお、β－キシラナーゼは文献（https://www.jstage.jst.go.jp/article/jag/66/1/66_jag.JAG-2018_0008/_article）に基づいて調製したものを用いた。また、β－キシロシダーゼは、実施例１で得られたものを用いた。

【0048】

低分子化キシラン（Ｃ５を８１０ｍｇ含む）にβ－キシロシダーゼを作用させることにより分岐オリゴ糖（Ａ_１Ｘ_４）が６４０ｍｇ（乾燥後）得られた。また、同時にキシロースも得られた（結果は省略）。

【産業上の利用可能性】

【0049】

本発明製法は健康の増進に役立つ分岐オリゴ糖や飲食品の製造に役立つキシロースを大量に製造することができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【配列表】

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