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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-06-11
(45)【発行日】2024-06-19
(54)【発明の名称】膵癌細胞の浸潤転移抑制剤
(51)【国際特許分類】
A61K 31/436 20060101AFI20240612BHJP
A61P 35/04 20060101ALI20240612BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240612BHJP
A61P 1/18 20060101ALI20240612BHJP
A61K 31/713 20060101ALI20240612BHJP
A61K 31/519 20060101ALI20240612BHJP
A61K 31/277 20060101ALI20240612BHJP
A61K 31/513 20060101ALI20240612BHJP
A61K 31/4412 20060101ALI20240612BHJP
A61K 31/53 20060101ALI20240612BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20240612BHJP
C12N 15/113 20100101ALN20240612BHJP
【ＦＩ】
A61K31/436
A61P35/04 ZNA
A61P43/00 121
A61P1/18
A61K31/713
A61K31/519
A61K31/277
A61K31/513
A61K31/4412
A61K31/53
A61K45/00 101
C12N15/113 Z
【請求項の数】
5
(21)【出願番号】P 2023109994
(22)【出願日】2023-07-04
(62)【分割の表示】P 2019091817の分割
【原出願日】2019-05-15
(65)【公開番号】P2023126901
(43)【公開日】2023-09-12
【審査請求日】2023-07-06
(31)【優先権主張番号】P 2018099145
(32)【優先日】2018-05-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】504174180
【氏名又は名称】国立大学法人高知大学
(74)【代理人】
【識別番号】110002837
【氏名又は名称】弁理士法人アスフィ国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】谷内 恵介
【審査官】六笠 紀子
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１７／０１７１８７（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１７／０２３８１５（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１６／００２８４４（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１１／０６５５４１（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２００８／０３５４６１（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１８／００５２３４（ＷＯ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２００６／００９４６７４（ＵＳ，Ａ１）
【文献】Cell Reports，2016年，16，pp.2017-2031
【文献】Journal of Clinical Oncology，2013年，Vol. 31, No. 4, Supp.，Abstract Number: 198
【文献】Anti-cancer drugs，2014年，Vol. 25, No. 9，pp. 1095-1101
【文献】Pancreas，2017年，Vol. 46, No. 10，pp. 1444
【文献】Biochemical and Biophysical Research Communications，2008年，368，pp.162-167
【文献】Annals of Oncology，2015年，26，pp.58-64
【文献】Neuroendocrinology，2016年，103 (suppl 1)，p.77, L1
【文献】Neuroendocrinology，2015年，102，p.130-131, L9
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３１／００－３３／４４
Ａ６１Ｋ ４５／００－４５／０８
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ｍＴＯＲ阻害剤、またはＥＲＫ１／２阻害薬とｍＴＯＲ阻害剤との組み合わせを有効成分として含み、上記ｍＴＯＲ阻害剤が、エベロリムス、配列番号５の抗ｍＴＯＲ ｓｉＲＮＡ、およびシロリムスから必須的になる群より選択される１以上であり、
上記ＥＲＫ１／２阻害薬が、トラメチニブ、Ｕ０１２６、および配列番号１の塩基配列を有する抗ＡＲＨＧＥＦ４ ｓｉＲＮＡから必須的になる群より選択される１以上であることを特徴とする膵癌細胞の浸潤転移抑制剤。
【請求項2】
上記ｍＴＯＲ阻害薬がシロリムスである請求項１に記載の膵癌細胞の浸潤転移抑制剤。
【請求項3】
ＥＲＫ１／２阻害薬とｍＴＯＲ阻害剤との組み合わせを有効成分として含み、上記ＥＲＫ１／２阻害薬とｍＴＯＲ阻害剤との組み合わせが、トラメチニブとエベロリムスとの組み合わせである請求項１に記載の膵癌細胞の浸潤転移抑制剤。
【請求項4】
更に、膵癌の標準化学療法薬を含む請求項１～３のいずれかに記載の膵癌細胞の浸潤転移抑制剤。
【請求項5】
上記膵癌の標準化学療法薬がＴＳ－１である請求項４に記載の膵癌細胞の浸潤転移抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、膵癌細胞の浸潤転移を効果的に抑制する薬剤に関するものである。
【背景技術】
【0002】
日本人の死因の第１位は悪性新生物であり、悪性新生物のうち、膵癌により年間３万９０００人の日本人が死亡している。膵癌は、近年、増加傾向にあり、日本では肺癌、胃癌、大腸癌に次いで４番目に多いがんである。膵癌は難治性癌の代表であり、年間の罹患者数と死亡者数が悪性新生物の中で最も近接しており、ほぼ同数である。膵癌患者の生存率を上げる唯一の方法は、早期発見と手術のみであるといえる。
【0003】
膵癌に対する化学療法は、切除不能例に対する治療と、術後補助療法の２つに分類できる。切除不能例に対する治療では、オキサリプラチン＋イリノテカン＋フルオロウラシル＋レボホリナートカルシウムを用いるＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸ療法と、ゲムシタビン（ＧＥＭ）＋ナブパクリタキセル併用療法が第一選択である。全身状態が悪い場合は、ＧＥＭ単独、ＧＥＭ＋エルロチニブ併用、あるいはＴＳ－１（テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤）単独から適切な薬剤を選択する。手術の補助療法としては、ＴＳ－１単独治療が第一選択となっている。
【0004】
しかし、膵癌には早期の段階から周辺臓器への浸潤と遠隔転移が認められ、手術により除去できなかった腹腔内残存腫瘍が膵癌の予後が悪いことに対する最大の原因である。よって、膵癌の治療においては、膵癌細胞の増殖を抑制することの他、膵癌細胞の運動性や浸潤性を抑制することが非常に重要である。ところが、膵癌細胞の増殖を抑制するデータをもって膵癌細胞の運動性や浸潤性も抑制されているとしている従来技術が多く、膵癌細胞の運動性や浸潤性自体を抑制することが証明されている薬剤はほとんど無いといってよい。
【0005】
本発明者は、膵癌細胞において、ヒトインスリン様成長因子２ｍＲＮＡ結合タンパク質３（ＩＧＦ２ＢＰ３）がｍＲＮＡと複合体を形成し、カイネシンモータータンパク質であるＫＩＦ２０Ａにより膵癌細胞の運動性や浸潤性に必須である葉状仮足まで運搬され、ｍＲＮＡの局所翻訳に関与することを見出し、ＩＧＦ２ＢＰ３の一部のペプチドを膵癌細胞浸潤転移抑制ワクチンとして開発している（特許文献１）。また、本発明者は、ＩＧＦ２ＢＰ３に対するｓｉＲＮＡを膵癌細胞浸潤転移阻害剤として開発している（特許文献２）。
【0006】
なお、ＥＲＫ１／２は細胞増殖シグナル伝達因子として知られており（特許文献３）、例えば特許文献４には、ＥＲＫ阻害剤をがんなどの過剰増殖性障害を治療するために用いることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【文献】特開２０１５－２２７２９２号公報
【文献】国際公開第２０１６／００２８４４号パンフレット
【文献】特開２０１８－３５１１７号公報
【文献】特表２０１６－５３１１３９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
上述したように、膵癌が難治性である最大の理由は膵癌細胞の高い運動性と浸潤性にあるが、膵癌細胞の運動性や浸潤性自体を抑制する薬剤はほとんど無いのが実情である。
そこで本発明は、膵癌細胞の浸潤転移を効果的に抑制する薬剤を提供することを目的とする。
そこで本発明は、膵癌細胞の浸潤転移を効果的に抑制する薬剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、ＥＲＫ１／２阻害薬およびｍＴＯＲ阻害剤が膵癌細胞の運動性や浸潤性を抑制するのに非常に有効であることを見出して、本発明を完成した。
以下、本発明を示す。
以下、本発明を示す。
【0010】
［１］ ＥＲＫ１／２阻害薬および／またはｍＴＯＲ阻害剤を有効成分として含むことを特徴とする膵癌細胞の浸潤転移抑制剤。
［２］ 上記ＥＲＫ１／２阻害薬が、トラメチニブ、Ｕ０１２６、セルメチニブおよびコビメチニブから必須的になる群より選択される１以上である上記［１］に記載の膵癌細胞の浸潤転移抑制剤。
［３］ 上記ＥＲＫ１／２阻害薬がＡＲＨＧＥＦ４に対するｓｉＲＮＡである上記［１］に記載の膵癌細胞の浸潤転移抑制剤。
［４］ 上記ｓｉＲＮＡが、配列番号１～４のいずれかの塩基配列を有するＲＮＡおよびその相補鎖を含む二本鎖ＲＮＡである上記［３］に記載の膵癌細胞の浸潤転移抑制剤。
［５］ 上記ｍＴＯＲ阻害薬が、エベロリムス、スニチニブ、シロリムスおよびテムシロリムスから必須的になる群より選択される１以上である上記［１］～［４］のいずれかに記載の膵癌細胞の浸潤転移抑制剤。
［６］ 上記ｍＴＯＲ阻害薬がｍＴＯＲに対するｓｉＲＮＡである上記［１］～［４］のいずれかに記載の膵癌細胞の浸潤転移抑制剤。
［７］ ＥＲＫ１／２阻害薬を有効成分として含む上記［１］～［６］のいずれかに記載の膵癌細胞の浸潤転移抑制剤。
［８］ 更に、膵癌の標準化学療法薬を含む上記［１］～［７］のいずれかに記載の膵癌細胞の浸潤転移抑制剤。
［９］ 上記膵癌の標準化学療法薬がＴＳ－１である上記［８］に記載の膵癌細胞の浸潤転移抑制剤。
［２］ 上記ＥＲＫ１／２阻害薬が、トラメチニブ、Ｕ０１２６、セルメチニブおよびコビメチニブから必須的になる群より選択される１以上である上記［１］に記載の膵癌細胞の浸潤転移抑制剤。
［３］ 上記ＥＲＫ１／２阻害薬がＡＲＨＧＥＦ４に対するｓｉＲＮＡである上記［１］に記載の膵癌細胞の浸潤転移抑制剤。
［４］ 上記ｓｉＲＮＡが、配列番号１～４のいずれかの塩基配列を有するＲＮＡおよびその相補鎖を含む二本鎖ＲＮＡである上記［３］に記載の膵癌細胞の浸潤転移抑制剤。
［５］ 上記ｍＴＯＲ阻害薬が、エベロリムス、スニチニブ、シロリムスおよびテムシロリムスから必須的になる群より選択される１以上である上記［１］～［４］のいずれかに記載の膵癌細胞の浸潤転移抑制剤。
［６］ 上記ｍＴＯＲ阻害薬がｍＴＯＲに対するｓｉＲＮＡである上記［１］～［４］のいずれかに記載の膵癌細胞の浸潤転移抑制剤。
［７］ ＥＲＫ１／２阻害薬を有効成分として含む上記［１］～［６］のいずれかに記載の膵癌細胞の浸潤転移抑制剤。
［８］ 更に、膵癌の標準化学療法薬を含む上記［１］～［７］のいずれかに記載の膵癌細胞の浸潤転移抑制剤。
［９］ 上記膵癌の標準化学療法薬がＴＳ－１である上記［８］に記載の膵癌細胞の浸潤転移抑制剤。
【発明の効果】
【0011】
本発明に係る薬剤は、膵癌細胞の運動性と浸潤性を効果的に抑制し、結果として膵癌細胞の浸潤転移を効果的に抑制することができる。よって、例えば膵癌の手術による除去後、除去しきれなかった膵癌細胞を腹腔内に封じ込めることが可能になると考えられる。その際、細胞増殖抑制作用を有する成分を併用することにより治療が可能になり、また、術後の再発を抑制でき、予後の改善が期待できる。手術適用外の症例でも、本発明に係る薬剤は同様に膵癌の有効な治療手段となり、予後の改善が期待される。よって本発明は、膵癌の新たな治療手段として非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図2】図２は、ＡＲＨＧＥＦ４ ｍＲＮＡをノックダウンした膵癌細胞とコントロール膵癌細胞との間でのウエスタンブロットの結果を示す写真（図２Ａ）と、ＥＲＫ１／２阻害薬であるＵ０１２６を添加した培養液と添加しない培養液で培養した膵癌細胞のライセートのウエスタンブロットの結果を示す写真（図２Ｂ）である。
【図4】図４は、ＡＲＨＧＥＦ４ ｍＲＮＡをノックダウンした膵癌細胞とコントロール膵癌細胞との細胞運動アッセイの結果を示すグラフ（図４Ａ）と、同細胞のマトリゲル浸潤アッセイの結果を示すグラフ（図４Ｂ）と、ｍｙｃタグＡＲＨＧＥＦ４回復コンストラクトまたはモックコントロールベクターを導入した同細胞の細胞運動アッセイの結果を示すグラフ（図４Ｃ）と、ｍｙｃタグＡＲＨＧＥＦ４回復コンストラクトまたはモックコントロールベクターを導入した同細胞のマトリゲル浸潤アッセイの結果を示すグラフ（図４Ｄ）である。
【図5】図５は、ｍｙｃタグＡＲＨＧＥＦ４回復コンストラクトまたはモックコントロールベクターを導入したＡＲＨＧＥＦ４遺伝子ノックダウン膵癌細胞株Ｓ２－０１３の細胞運動アッセイとマトリゲル浸潤アッセイの結果を示すグラフ（図５Ａ）と、膵癌細胞株ＰＡＮＣ－１を用いた同様の実験の結果を示すグラフ（図５Ｂ）である。
【図8】図８は、膵癌細胞の培養液中にＥＲＫ１／２阻害薬であるトラメチニブを添加した場合としない場合の細胞運動アッセイの結果を示すグラフ（図８Ａ）と、マトリゲル浸潤アッセイの結果を示すグラフ（図８Ｂ）である。
【図12】図１２は、膵癌細胞の培養液中にＥＲＫ１／２阻害薬であるトラメチニブとｍＴＯＲ阻害薬であるエベロリムスを添加した場合としない場合の細胞運動アッセイの結果を示すグラフ（図１２Ａ）と、マトリゲル浸潤アッセイの結果を示すグラフ（図１２Ｂ）である。
【図13】図１３は、膵癌細胞の培養液中にＥＲＫ１／２阻害薬であるトラメチニブとｍＴＯＲ阻害薬であるエベロリムスを添加した場合としない場合の細胞運動アッセイの結果を示すグラフ（図１３Ａ）と、マトリゲル浸潤アッセイの結果を示すグラフ（図１３Ｂ）である。
【図14】図１４は、ｍＴＯＲ阻害剤であるシロリムスを投与したマウス群、膵癌の標準化学療法薬であるＴＳ－１を投与したマウス群、および薬剤非投与マウス群（コントロールマウス群）の、ヒト膵癌細胞株Ｓ２－０１３を皮下移植されてから８週間後の写真である。
【発明を実施するための形態】
【0013】
本発明に係る膵癌細胞の浸潤転移抑制剤は、ＥＲＫ１／２阻害薬および／またはｍＴＯＲ阻害剤を有効成分として含む。なお、本開示において「有効成分として含む」とは、成分がその効果を示すに十分な量で含まれることを意味する。
【0014】
ＥＲＫ（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｓｉｇｎａｌ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ Ｋｉｎａｓｅ，細胞外シグナル調節キナーゼ）は、ＭＡＰＫ（Ｍｉｔｏｇｅｎ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ，分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ）のサブファミリーであり、ＥＧＦＲ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，上皮増殖促進因子受容体）などのチロシンキナーゼ受容体にリガンドが結合することでリン酸化されて活性化される。ＥＲＫ１／２は分子量が４４ｋＤａのＥＲＫ１と４２ｋＤａのＥＲＫ２から成り、リン酸化されて活性化すると、Ｅｌｋ１やｃ－Ｍｙｃなどの転写因子またはＲＳＫなどのリン酸化酵素をリン酸化することで細胞増殖シグナルを活性化する。
【0015】
上述した通り、ＥＲＫ１／２は細胞増殖に関与することから、その阻害剤は抗がん剤として検討されている。しかし本発明者の実験的知見によれば、意外にもＥＲＫ１／２阻害剤は膵癌細胞の増殖抑制作用を十分に示さない一方で、膵癌細胞の運動性や浸潤性を顕著に抑制する。ＥＲＫ１／２が膵癌細胞の運動性や浸潤性に関与することは、これまで知られていない知見である。
【0016】
ＥＲＫ１／２の阻害薬は、ＥＲＫ１／２の活性を阻害するものであれば特に制限されない。例えば、ＥＲＫ１／２はリン酸化により活性化され、脱リン酸化により不活性化される。よって、例えば、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製のＰｒｏｔｅｏｍｅ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ(TM) Ｈｕｍａｎ Ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｋｉｎａｓｅ Ａｒｒａｙ Ｋｉｔ ＡＲＹ００３などを用い、被検試料を含む試料と含まない試料とでリン酸化による化学発光の強度を比較し、発光強度を低下させる被検試料をＥＲＫ１／２阻害薬として同定することができる。
【0017】
ＥＲＫ１／２阻害薬としては、例えば、トラメチニブ（ＣＡＳ ８７１７００－１７－３）、Ｕ０１２６（ＣＡＳ １０９５１１－５８－２）、セルメチニブ（ＣＡＳ ６０６１４３－５２－６）、コビメチニブ（ＣＡＳ ９３４６６０－９３－２）、ＰＤ０３２５９０１（ＣＡＳ ３９１２１０－１０－９）、プルリポチン（ＣＡＳ ８３９７０７－３７－８）、ケンパウロン（ＣＡＳ １４２２７３－２０－９）、エボジアミン（ＣＡＳ ５１８－１７－２）、ＦＲ１８０２０４（ＣＡＳ ８６５３６２－７４－９）、ｐ３８ ＭＡＰ Ｋｉｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＩＶ （ＣＡＳ １６３８－４１－１）、３－（２－Ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）－５－（（４－ｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ）－２，４－ｔｈｉａｚｏｌｉｄｉｎｅｄｉｏｎｅ（ＣＡＳ １０４９７３８－５４－６）、Ｐｙｒａｚｏｌｙｌｐｙｒｒｏｌｅ ＥＲＫ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＣＡＳ ９３３７８６－５８－４）、ＣＲ８，（Ｓ）－Ｉｓｏｍｅｒ（ＣＡＳ １０８４８９３－５６－０）、５－Ｉｏｄｏｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎ（ＣＡＳ ２４３８６－９３－４）、ＳＣＨ７７２９８４（ＣＡＳ ９４２１８３－８０－４）などの低分子化合物を挙げることができる。ＥＲＫ１／２阻害薬としては、トラメチニブ、Ｕ０１２６、セルメチニブおよびコビメチニブから必須的になる群より選択される１以上が好ましく、トラメチニブがより好ましい。
【0018】
ＥＲＫ１／２阻害薬は、ＥＲＫ１／２に対する抗体や、ＥＲＫ１／２ ｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ、更には、ＥＲＫ１／２をリン酸化して活性化する酵素に対する抗体や、当該酵素ｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡであってもよい。
【0019】
例えば、本発明者は、後記の実施例の通り、膵癌細胞においてそのｍＲＮＡがＩＧＦ２ＢＰ３に結合して葉状仮足に運搬され、葉状仮足において翻訳されて製造されるタンパク質であるＡＲＨＧＥＦ４（Ｒｈｏ ｇｕａｎｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｆａｃｔｏｒ，Ｒｈｏグアニンヌクレオチド交換因子）が、膵癌細胞の運動性と浸潤性に関与することを実験的に明らかにし、また、ＡＲＨＧＥＦ４がＥＲＫ１／２の活性化に関与していることを実験的に明らかにした。よって、ＡＲＨＧＥＦ４に対する阻害薬は、ＥＲＫ１／２阻害薬としても用い得る。
【0020】
ＡＲＨＧＥＦ４阻害薬としては、例えば、以下の塩基配列およびその相補配列を有するｓｉＲＮＡを用いることができる。なお、ｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの一部配列とその相補配列の二本鎖ＲＮＡである。下記の配列番号１～４の塩基配列は、ＡＲＨＧＥＦ４ ｍＲＮＡの一部配列である。
塩基配列１： 配列番号１～４のいずれかの塩基配列；
塩基配列２： 上記塩基配列１において、１または２の塩基配列が欠失、置換および／または付加された塩基配列であり、且つ、ＡＲＨＧＥＦ４ ｍＲＮＡにストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列；
塩基配列３： 上記塩基配列１に対して９０％以上の配列同一性を有する塩基配列であり、且つ、ＡＲＨＧＥＦ４ ｍＲＮＡにストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列。
塩基配列１： 配列番号１～４のいずれかの塩基配列；
塩基配列２： 上記塩基配列１において、１または２の塩基配列が欠失、置換および／または付加された塩基配列であり、且つ、ＡＲＨＧＥＦ４ ｍＲＮＡにストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列；
塩基配列３： 上記塩基配列１に対して９０％以上の配列同一性を有する塩基配列であり、且つ、ＡＲＨＧＥＦ４ ｍＲＮＡにストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列。
【0021】
上記塩基配列２において、欠失、置換および付加から選択される変異の数としては、１が好ましい。また、上記塩基配列３において、配列同一性としては９５％以上が好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上または９９．５％以上がより更に好ましい。
【0022】
ｍＴＯＲ（ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ ｔａｒｇｅｔ ｏｆ ｒａｐａｍｙｃｉｎ）は、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達経路の中心的なシグナル因子であり、複数のタンパク質による複合体を形成し、インスリンや他の成長因子、栄養・エネルギー状態、酸化還元状態など細胞内外の環境情報を統合し、それらに応じた細胞のサイズ、分裂、生存などの調節に中心的な役割を果たすと考えられ、特に細胞増殖と血管新生に関与している。
【0023】
本発明者は、ｍＴＯＲの活性を阻害することにより、膵癌細胞の運動性と浸潤性を抑制できることを見出した。また、ＥＲＫ１／２と異なり、ｍＴＯＲの活性を阻害することにより、膵癌細胞の増殖も抑制することができる。よって、ＥＲＫ１／２阻害薬に加えてｍＴＯＲ阻害薬を併用することにより、膵癌細胞の運動性と浸潤性を抑制できるのみならず、膵癌細胞の増殖も抑制することができる。
【0024】
ｍＴＯＲの阻害薬は、ｍＴＯＲの活性を阻害するものであれば特に制限されない。例えば、Ｍｅｒｃｋ社のＫ－ＬＩＳＡ(TM) ｍＴＯＲ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｋｉｔなど、ｍＴＯＲの活性を試験するキットを用い、ｍＴＯＲ活性阻害能を有する化合物を選択して用いればよい。
【0025】
ｍＴＯＲ阻害薬としては、例えば、エベロリムス（ＣＡＳ １５９３５１－６９－６）、スニチニブ（ＣＡＳ ５５７７９５－１９－４）、ソラフェニブ（ＣＡＳ ２８４４６１－７３－０）、シロリムス（ＣＡＳ ５３１２３－８８－９）、テムシロリムス（ＣＡＳ １６２６３５－０４－３）、ゾタロリムス（ＣＡＳ ２２１８７７－５４－９）、ＡＳ６０４８５０（ＣＡＳ ６４８４４９－７６－７）、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ １５ｅ（ＣＡＳ ３７１９４３－０５－４）、ＫＵ００６３７９４（ＣＡＳ ９３８４４０－６４－３）、ＰＰ２４２（ＣＡＳ １０９２３５１－６７－１）などの低分子化合物を挙げることができる。ｍＴＯＲ阻害薬としては、エベロリムス、スニチニブ、シロリムスおよびテム
シロリムスから必須的になる群より選択される１以上が好ましく、エベロリムスおよびシロリムスから必須的になる群より選択される１以上がより好ましく、シロリムスがより更に好ましい。
シロリムスから必須的になる群より選択される１以上が好ましく、エベロリムスおよびシロリムスから必須的になる群より選択される１以上がより好ましく、シロリムスがより更に好ましい。
【0026】
ｍＴＯＲ阻害薬は、ｍＴＯＲに対する抗体や、ｍＴＯＲ ｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ、更には、ｍＴＯＲをリン酸化して活性化する酵素に対する抗体や、当該酵素ｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡであってもよい。例えば、ｍＴＯＲ阻害薬としては、例えば、以下の塩基配列およびその相補配列を有するｓｉＲＮＡを用いることができる。下記の配列番号５～８の塩基配列は、ｍＴＯＲ ｍＲＮＡの一部配列である。
【0027】
塩基配列４： 配列番号５～８のいずれかの塩基配列；
塩基配列５： 上記塩基配列４において、１または２の塩基配列が欠失、置換および／または付加された塩基配列であり、且つ、ｍＴＯＲ ｍＲＮＡにストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列；
塩基配列６： 上記塩基配列４に対して９０％以上の配列同一性を有する塩基配列であり、且つ、ｍＴＯＲ ｍＲＮＡにストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列。
塩基配列５： 上記塩基配列４において、１または２の塩基配列が欠失、置換および／または付加された塩基配列であり、且つ、ｍＴＯＲ ｍＲＮＡにストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列；
塩基配列６： 上記塩基配列４に対して９０％以上の配列同一性を有する塩基配列であり、且つ、ｍＴＯＲ ｍＲＮＡにストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列。
【0028】
上記塩基配列５において、欠失、置換および付加から選択される変異の数としては、１が好ましい。また、上記塩基配列６において、配列同一性としては９５％以上が好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上または９９．５％以上がより更に好ましい。
【0029】
上記塩基配列２，３，５，６における変異の位置や配列同一性は、当業者であれば配列多重アラインメント用プログラムなどを用いて容易に特定することができる。また、上記塩基配列２，３，５，６におけるストリンジェントな条件とは、標的配列とのハイブリダイゼーションとその後の洗浄を意味し、より具体的には、例えば、３０～６０℃で、ＳＳＣ、界面活性剤、ホルムアミド、デキストラン硫酸塩、ブロッキング剤などを含む溶液中で１～２４時間、標的配列とハイブリダイズさせた後、３０℃の０．５×ＳＳＣと０．１％ＳＤＳを含む溶液、および３０℃の０．２×ＳＳＣと０．１％ＳＤＳを含む溶液、および３０℃の０．０５×ＳＳＣ溶液による連続した洗浄を挙げることができる。
【0030】
ＥＲＫ１／２の阻害薬とｍＴＯＲ阻害薬を併用する場合、ＥＲＫ１／２阻害薬とｍＴＯＲ阻害薬の割合は特に制限されず、適宜調整すればよい。具体的には、ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験、ｉｎ ｖｉｖｏ実験、臨床試験などで、ＥＲＫ１／２阻害薬とｍＴＯＲ阻害薬のそれぞれの有効投与量を決定すればよい。例えば、ＥＲＫ１／２阻害薬に対するｍＴＯＲ阻害薬の割合を０．１質量倍以上、２０質量倍以下とすることができる。
【0031】
ＥＲＫ１／２阻害薬とｍＴＯＲ阻害薬を併用する場合、両阻害剤は１つの製剤に含まれていてもよい。或いは、各阻害剤はそれぞれ別の製剤に含まれており、それら製剤は同時に投与されてもよいし、時間をおいて別々に投与されてもよい。
【0032】
上述した通り、本発明に係る膵癌細胞の浸潤転移抑制剤の有効成分であるＥＲＫ１／２阻害薬およびｍＴＯＲ阻害薬は、膵癌細胞の浸潤転移を効果的に抑制することができるため、膵癌の標準化学療法薬と組み合わせることにより、膵癌細胞の浸潤転移を抑制しつつ、膵癌を縮小することが可能になり得る。
【0033】
膵癌の標準化学療法薬は、国によって異なる。例えば日本ではＴＳ－１、即ちテガフール／ギメラシル／オテラシルカリウムの併用が標準であり、米国ではゲムシタビン（ＧＥＭ）が標準である。よって、膵癌の標準化学療法薬は、患者の人種に応じて選択してもよい。しかし、個人差があるため、患者の国以外の国における膵癌の標準化学療法薬を選択
してもよい。
ＥＲＫ１／２阻害薬またはｍＴＯＲ阻害薬と膵癌の標準化学療法薬、或いはＥＲＫ１／２阻害薬とｍＴＯＲ阻害薬と膵癌の標準化学療法薬を併用する場合、これら成分は１つの製剤に含まれていてもよい。或いは、各成分はそれぞれ別の製剤に含まれているか、または二成分が１つの製剤に含まれており、残りの一成分が別の製剤に含まれており、それら製剤は同時に投与されてもよいし、時間をおいて別々に投与されてもよい。膵癌の標準化学療法薬の使用量も、ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験、ｉｎ ｖｉｖｏ実験、臨床試験などで決定すればよい。
してもよい。
ＥＲＫ１／２阻害薬またはｍＴＯＲ阻害薬と膵癌の標準化学療法薬、或いはＥＲＫ１／２阻害薬とｍＴＯＲ阻害薬と膵癌の標準化学療法薬を併用する場合、これら成分は１つの製剤に含まれていてもよい。或いは、各成分はそれぞれ別の製剤に含まれているか、または二成分が１つの製剤に含まれており、残りの一成分が別の製剤に含まれており、それら製剤は同時に投与されてもよいし、時間をおいて別々に投与されてもよい。膵癌の標準化学療法薬の使用量も、ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験、ｉｎ ｖｉｖｏ実験、臨床試験などで決定すればよい。
【0034】
本発明に係る膵癌細胞の浸潤転移抑制剤の剤形は、所望の投与経路に応じて適宜選択すればよい。例えば、経口投与の場合には、散剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、錠剤、エキス剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤、チンキ剤、シロップ剤などにすればよく、静脈注射、動脈注射、皮下注射などの場合には、溶液やエマルションとすればよいし、或いは、凍結乾燥品とし、溶液やエマルションを用事調製してもよい。
【0035】
本発明に係る膵癌細胞の浸潤転移抑制剤には、その剤形に応じた添加成分を配合してもよい。添加成分としては、例えば、有効成分であるＥＲＫ１／２阻害薬および／またはｍＴＯＲ阻害薬の他、その剤形などに応じて、基材、賦形剤、着色剤、滑沢剤、矯味剤、乳化剤、増粘剤、湿潤剤、安定剤、保存剤、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、抗酸化剤、佐薬、緩衝剤、ｐＨ調整剤、甘味料、香料などを配合することができる。
【0036】
本発明に係る膵癌細胞の浸潤転移抑制剤の投与量は、患者の重篤度、性別、年齢などに応じて適宜調整すればよい。例えば、１日あたりのＥＲＫ１／２阻害薬の投与量を０．１ｍｇ以上、２０ｍｇ以下程度、より好ましくは０．５ｍｇ以上、１０ｍｇ以下程度、より更に好ましくは２ｍｇ以下程度となるようにすることができ、ｍＴＯＲ阻害薬の投与量を１ｍｇ以上、５０ｍｇ以下程度、より好ましくは５ｍｇ以上、２０ｍｇ以下程度、より更に好ましくは１０ｍｇ以下程度となるようにすることができる。ＥＲＫ１／２阻害薬とｍＴＯＲ阻害薬を併用する場合には、それぞれの投与量を比較的少なく設定してもよい。また、膵癌の標準化学療法薬の投与量は、各有効成分の標準的な投与量とすることができ、或いは、少なくともＥＲＫ１／２および／またはｍＴＯＲ阻害薬と併用することから、標準的な投与量に比べて比較的少なくしてもよい。例えば１日あたりのＴＳ－１は、テガフール相当量で１０ｍｇ以上、２００ｍｇ以下程度、より好ましくは４０ｍｇ以上、１５０ｍｇ以下程度、より更に好ましくは８０ｍｇ以上、１２０ｍｇ以下程度とすることができる。
【0037】
本発明に係る膵癌細胞の浸潤転移抑制剤の１日あたりの投与回数も適宜調整すればよく、例えば１日あたり１回以上、３回以下とすることができ、１回または２回が好ましい。勿論ではあるが、一人の患者に対して、症状などに応じて１日あたりの投与量や投与回数などは適宜変更してもよい。
【0038】
本発明に係る膵癌細胞の浸潤転移抑制剤の投与対象は膵癌患者であるが、膵癌の更なる浸潤転移を抑制するために、膵癌細胞がリンパ節や他の臓器に転移した患者に投与してもよい。
【実施例】
【0039】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
【0040】
実施例１
（１） ＡＲＨＧＥＦ４遺伝子ノックダウンにより活性が抑制されるタンパク質の特定
本発明者は、カイネシンモータータンパク質の一つであるＫＩＦ２０Ａが、膵癌細胞においてＲＮＡ結合タンパク質であるＩＧＦ２ＢＰ３とｍＲＮＡの複合体を内包したＲＮＡ顆粒を葉状仮足まで輸送し、膵癌細胞の浸潤転移を促進していることを明らかにしている。より詳しくは、ＫＩＦ２０Ａにより輸送されるｍＲＮＡが葉状仮足において局所翻訳されてタンパク質が製造され、当該タンパク質のある一群は葉状仮足においてアクチン結合タンパク質と結合することによりアクチン重合を促進して葉状仮足の形成に関与し、別の一群は様々なシグナル伝達経路に作用して膵癌細胞の浸潤転移を活発化させる。
本実験では、膵癌細胞において葉状仮足に運搬されるｍＲＮＡをＲＮＡ干渉法によりノックダウンし、かかるノックダウンにより膵癌細胞の葉状仮足の形成が抑制されるｍＲＮＡを特定した。ＩＧＦ２ＢＰ３と結合するＡＲＨＧＥＦ４ ｍＲＮＡをノックダウンした膵癌細胞とノックダウンしない膵癌細胞において、リン酸化タンパク質アレイを用いて、リン酸化の程度が異なるタンパク質を網羅的に検出した。具体的には、スクランブルドコントロールｓｉＲＮＡトランスフェクトＳ２－０１３細胞およびＡＲＨＧＥＦ４－ｓｉＲＮＡトランスフェクトＳ２－０１３細胞における３８の選択されたタンパク質の相対的なタンパク質リン酸化レベルを、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｐｒｏｆｉｌｅｒヒトホスホキナーゼアレイキット（「ＡＲＹ００３」Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、４６の特異的リン酸化部位をプロファイリングすることによって得た。ＡＲＨＧＥＦ４－ｓｉＲＮＡとしては、配列番号１～４の塩基配列を有する４種のＲＮＡとその相補配列ＲＮＡとの二本鎖の混合物を用いた。簡単に説明すると、各細胞をＰＢＳですすぎ、１×１０7細胞／ｍ
Ｌの溶解緩衝液を４℃で３０分間振盪して可溶化し、溶解物のアリコートを－８０℃で凍結保存した。キャッチャー抗体を有するメンブランを、４℃で一晩、希釈細胞溶解物と共にインキュベートした。その後、ビオチン化検出抗体のカクテルを室温で２時間添加した。西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗マウス/ウサギ抗体を用いてリン酸化タンパク質を
検出した。次いで、ブロットを増強化学発光溶液と共に１分間インキュベートし、露光させた。結果を図１に示す。
図１に示す結果の通り、ＡＲＨＧＥＦ４遺伝子をノックダウンした細胞では、ＥＲＫ１／２のリン酸化の程度が低下していた。この結果から、ＡＲＨＧＥＦ４はＥＲＫ１／２のリン酸化に関与していることが明らかとなった。
（１） ＡＲＨＧＥＦ４遺伝子ノックダウンにより活性が抑制されるタンパク質の特定
本発明者は、カイネシンモータータンパク質の一つであるＫＩＦ２０Ａが、膵癌細胞においてＲＮＡ結合タンパク質であるＩＧＦ２ＢＰ３とｍＲＮＡの複合体を内包したＲＮＡ顆粒を葉状仮足まで輸送し、膵癌細胞の浸潤転移を促進していることを明らかにしている。より詳しくは、ＫＩＦ２０Ａにより輸送されるｍＲＮＡが葉状仮足において局所翻訳されてタンパク質が製造され、当該タンパク質のある一群は葉状仮足においてアクチン結合タンパク質と結合することによりアクチン重合を促進して葉状仮足の形成に関与し、別の一群は様々なシグナル伝達経路に作用して膵癌細胞の浸潤転移を活発化させる。
本実験では、膵癌細胞において葉状仮足に運搬されるｍＲＮＡをＲＮＡ干渉法によりノックダウンし、かかるノックダウンにより膵癌細胞の葉状仮足の形成が抑制されるｍＲＮＡを特定した。ＩＧＦ２ＢＰ３と結合するＡＲＨＧＥＦ４ ｍＲＮＡをノックダウンした膵癌細胞とノックダウンしない膵癌細胞において、リン酸化タンパク質アレイを用いて、リン酸化の程度が異なるタンパク質を網羅的に検出した。具体的には、スクランブルドコントロールｓｉＲＮＡトランスフェクトＳ２－０１３細胞およびＡＲＨＧＥＦ４－ｓｉＲＮＡトランスフェクトＳ２－０１３細胞における３８の選択されたタンパク質の相対的なタンパク質リン酸化レベルを、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｐｒｏｆｉｌｅｒヒトホスホキナーゼアレイキット（「ＡＲＹ００３」Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、４６の特異的リン酸化部位をプロファイリングすることによって得た。ＡＲＨＧＥＦ４－ｓｉＲＮＡとしては、配列番号１～４の塩基配列を有する４種のＲＮＡとその相補配列ＲＮＡとの二本鎖の混合物を用いた。簡単に説明すると、各細胞をＰＢＳですすぎ、１×１０7細胞／ｍ
Ｌの溶解緩衝液を４℃で３０分間振盪して可溶化し、溶解物のアリコートを－８０℃で凍結保存した。キャッチャー抗体を有するメンブランを、４℃で一晩、希釈細胞溶解物と共にインキュベートした。その後、ビオチン化検出抗体のカクテルを室温で２時間添加した。西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗マウス/ウサギ抗体を用いてリン酸化タンパク質を
検出した。次いで、ブロットを増強化学発光溶液と共に１分間インキュベートし、露光させた。結果を図１に示す。
図１に示す結果の通り、ＡＲＨＧＥＦ４遺伝子をノックダウンした細胞では、ＥＲＫ１／２のリン酸化の程度が低下していた。この結果から、ＡＲＨＧＥＦ４はＥＲＫ１／２のリン酸化に関与していることが明らかとなった。
【0041】
（２） 上記（１）の実験結果の確認
上記実施例１の結果を確認するために、コントロール膵癌細胞とＡＲＨＧＥＦ４遺伝子をノックダウンした膵癌細胞を用いて、ウエスタンブロットを行った。具体的には、スクランブルドコントロールｓｉＲＮＡトランスフェクトＳ２－０１３細胞およびＡＲＨＧＥＦ４－ｓｉＲＮＡトランスフェクトＳ２－０１３細胞から得られた細胞ペレットを、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）、１００ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．５％
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、プロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤（Ｒｏｃｈｅ社製）およびホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｎａｃａｌａｉ社製）中に再懸濁した。ＡＲＨＧＥＦ４－ｓｉＲＮＡとしては、上記実施例１（１）と同じものを用いた。各溶解物中のタンパク質濃度を、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイで測定した。次いで、各溶解物のアリコートをサンプル緩衝液（５０ｍＭトリス，２％ＳＤＳ，０．１％ブロモフェノールブルー，１０％グリセロール）で最終濃度が１～２μｇ／μＬになるように希釈し、抗ＡＲＨＧＥＦ抗体と抗リン酸化ＥＲＫ１／２抗体を用い、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングによって分析した。結果を図２Ａに示す。
図２Ａに示す結果の通り、ＡＲＨＧＥＦ４遺伝子をノックダウンした膵癌細胞では、ＥＲＫ１／２のリン酸化の程度が抑制されていることを確認できた。
上記実施例１の結果を確認するために、コントロール膵癌細胞とＡＲＨＧＥＦ４遺伝子をノックダウンした膵癌細胞を用いて、ウエスタンブロットを行った。具体的には、スクランブルドコントロールｓｉＲＮＡトランスフェクトＳ２－０１３細胞およびＡＲＨＧＥＦ４－ｓｉＲＮＡトランスフェクトＳ２－０１３細胞から得られた細胞ペレットを、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）、１００ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．５％
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、プロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤（Ｒｏｃｈｅ社製）およびホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｎａｃａｌａｉ社製）中に再懸濁した。ＡＲＨＧＥＦ４－ｓｉＲＮＡとしては、上記実施例１（１）と同じものを用いた。各溶解物中のタンパク質濃度を、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイで測定した。次いで、各溶解物のアリコートをサンプル緩衝液（５０ｍＭトリス，２％ＳＤＳ，０．１％ブロモフェノールブルー，１０％グリセロール）で最終濃度が１～２μｇ／μＬになるように希釈し、抗ＡＲＨＧＥＦ抗体と抗リン酸化ＥＲＫ１／２抗体を用い、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングによって分析した。結果を図２Ａに示す。
図２Ａに示す結果の通り、ＡＲＨＧＥＦ４遺伝子をノックダウンした膵癌細胞では、ＥＲＫ１／２のリン酸化の程度が抑制されていることを確認できた。
【0042】
（３） 上記（１）の実験結果の確認
次に、ＥＲＫ１／２の阻害作用を示すＭＥＫ阻害剤Ｕ０１２６を培養液に添加して培養
した膵癌細胞の細胞ライセートについて、ウエスタンブロットを行った。具体的には、ヒト膵癌細胞であるＳ２－０１３株を、３０μＭ Ｕ０１２６（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を含む培養液中、２４時間インキュベートし、上記（２）と同様にしてウェスタンブロッティングにより分析した。結果を図２Ｂに示す。
図２Ｂに示す結果の通り、Ｕ０１２６によるＥＲＫ１／２の阻害は、ＥＲＫ１／２のリン酸化の抑制によるものであることを確認できた。
次に、ＥＲＫ１／２の阻害作用を示すＭＥＫ阻害剤Ｕ０１２６を培養液に添加して培養
した膵癌細胞の細胞ライセートについて、ウエスタンブロットを行った。具体的には、ヒト膵癌細胞であるＳ２－０１３株を、３０μＭ Ｕ０１２６（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を含む培養液中、２４時間インキュベートし、上記（２）と同様にしてウェスタンブロッティングにより分析した。結果を図２Ｂに示す。
図２Ｂに示す結果の通り、Ｕ０１２６によるＥＲＫ１／２の阻害は、ＥＲＫ１／２のリン酸化の抑制によるものであることを確認できた。
【0043】
（４）Ｕ０１２６による膵癌細胞の浸潤転移抑制作用
（４－１）トランス－ウェル運動性アッセイ
ヒト膵癌細胞であるＳ２－０１３株とＰＡＮＣ－１株を、３０μＭのＵ０１２６を含む培地中、２４時間インキュベートした。３．０×１０4の各細胞を、ＢＤ ＢｉｏＣｏａ
ｔ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｉｎｓｅｒｔｓ（２４ウェルプレート，孔径：８μｍ，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）の上部チャンバーに播種した。無血清培地を各上部チャンバーに添加し、５％ＦＣＳを含む培地を下部チャンバーに添加した。各細胞を膜上で１２時間インキュベートした。１２時間のインキュベーション後、顕微鏡観察を用い、独立した４視野を調べ、下部チャンバーに移動した細胞を計数した。結果を図３に示す。なお、図３中の「＊」は、ｔ－テストにおいてコントロールに対してｐ＜０．０５で有意差があることを示す。
（４－１）トランス－ウェル運動性アッセイ
ヒト膵癌細胞であるＳ２－０１３株とＰＡＮＣ－１株を、３０μＭのＵ０１２６を含む培地中、２４時間インキュベートした。３．０×１０4の各細胞を、ＢＤ ＢｉｏＣｏａ
ｔ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｉｎｓｅｒｔｓ（２４ウェルプレート，孔径：８μｍ，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）の上部チャンバーに播種した。無血清培地を各上部チャンバーに添加し、５％ＦＣＳを含む培地を下部チャンバーに添加した。各細胞を膜上で１２時間インキュベートした。１２時間のインキュベーション後、顕微鏡観察を用い、独立した４視野を調べ、下部チャンバーに移動した細胞を計数した。結果を図３に示す。なお、図３中の「＊」は、ｔ－テストにおいてコントロールに対してｐ＜０．０５で有意差があることを示す。
【0044】
（４－２）マトリゲル浸潤性アッセイ
マトリゲル細胞外マトリックスタンパク質の層で被覆された孔径８μｍの膜と２４ウェルプレートを用いた二室浸潤アッセイにより、膵癌細胞の浸潤性を評価した。４．０×１０4の上記各細胞を上部チャンバーに播種し、下部チャンバー内の５％ＦＣＳ化学誘引物
質に向かって浸潤させた。２０時間のインキュベーション後、顕微鏡観察を用い、独立した４視野を調べ、下部チャンバーに移動した細胞を計数した。結果を図３に示す。なお、図３中の「＊」は、ｔ－テストにおいてコントロールに対してｐ＜０．０５で有意差があることを示す。
図３に示す結果の通り、ＥＲＫ１／２に対する阻害作用を示すＵ０１２６により、膵癌細胞の運動性の浸潤性が有意に抑制されることが明らかとなった。
マトリゲル細胞外マトリックスタンパク質の層で被覆された孔径８μｍの膜と２４ウェルプレートを用いた二室浸潤アッセイにより、膵癌細胞の浸潤性を評価した。４．０×１０4の上記各細胞を上部チャンバーに播種し、下部チャンバー内の５％ＦＣＳ化学誘引物
質に向かって浸潤させた。２０時間のインキュベーション後、顕微鏡観察を用い、独立した４視野を調べ、下部チャンバーに移動した細胞を計数した。結果を図３に示す。なお、図３中の「＊」は、ｔ－テストにおいてコントロールに対してｐ＜０．０５で有意差があることを示す。
図３に示す結果の通り、ＥＲＫ１／２に対する阻害作用を示すＵ０１２６により、膵癌細胞の運動性の浸潤性が有意に抑制されることが明らかとなった。
【0045】
実施例２
（１） ＡＲＨＧＥＦ４の機能の確認
コントロール膵癌細胞とＡＲＨＧＥＦ４遺伝子をノックダウンした膵癌細胞を用いた以外は上記実施例１（４）と同様にして、膵癌細胞の運動性と浸潤性を試験した。結果を図４Ａ～Ｄに示す。
図４Ａは、コントロール膵癌細胞とＡＲＨＧＥＦ４遺伝子をノックダウンした膵癌細胞の細胞運動アッセイにおいて、上部チャンバーから下部チャンバーへ移動した細胞の数を示すグラフである。「＊」は、ｔ－テストにおいてコントロールに対してｐ＜０．０５で有意差があることを示す。ヒト膵癌細胞株であるＳ２－０１３とＰＡＮＣ－１のいずれにおいても、ＡＲＨＧＥＦ４遺伝子をノックダウンした場合には、膵癌細胞の運動性と浸潤性が顕著に低下することが明らかとなった。
図４Ｂは、コントロール膵癌細胞とＡＲＨＧＥＦ４遺伝子をノックダウンした膵癌細胞のマトリゲル浸潤アッセイにおいて、上部チャンバーから下部チャンバーへ移動した細胞の数を示すグラフである。「＊」は、ｔ－テストにおいてコントロールに対してｐ＜０．０５で有意差があることを示す。当該実験でも、ヒト膵癌細胞株であるＳ２－０１３とＰＡＮＣ－１のいずれにおいても、ＡＲＨＧＥＦ４遺伝子をノックダウンした場合には、膵癌細胞の運動性と浸潤性が顕著に低下することが明らかとなった。
図４Ｃは、ｍｙｃタグＡＲＨＧＥＦ４回復コンストラクトまたはモックコントロールベクターを、コントロール膵癌細胞とＡＲＨＧＥＦ４遺伝子をノックダウンした膵癌細胞に導入した後、細胞運動アッセイを行い、上部チャンバーから下部チャンバーへ移動した細
胞の数を示すグラフである。「＊」は、モックベクターをトランスフェクションした細胞に対して、ｍｙｃタグＡＲＨＧＥＦ４回復コンストラクトをトランスフェクションした細胞の数が、ｔ－テストにおいてｐ＜０．０５で有意に多いことを示す。図４Ｃの結果の通り、ＡＲＨＧＥＦ４遺伝子をノックダウンした膵癌細胞の運動性と浸潤性は低下したが、ＡＲＨＧＥＦ４の回復により膵癌細胞の運動性と浸潤性も回復することが明らかとなった。
図４Ｄは、ｍｙｃタグＡＲＨＧＥＦ４回復コンストラクトまたはモックコントロールベクターを、コントロール膵癌細胞とＡＲＨＧＥＦ４遺伝子をノックダウンした膵癌細胞に導入した後、マトリゲル浸潤アッセイを行い、上部チャンバーから下部チャンバーへ移動した細胞の数を示すグラフである。「＊」は、モックベクターをトランスフェクションした細胞に対して、ｍｙｃタグＡＲＨＧＥＦ４回復コンストラクトをトランスフェクションした細胞の数が、ｔ－テストにおいてｐ＜０．０５で有意に多いことを示す。当該実験でも、ＡＲＨＧＥＦ４遺伝子をノックダウンした膵癌細胞の運動性と浸潤性は低下したが、ＡＲＨＧＥＦ４の回復により膵癌細胞の運動性と浸潤性も回復することが明らかとなった。
以上の実験結果より、ＡＲＨＧＥＦ４は膵癌細胞の運動性と浸潤性に関与することが明らかとなった。
（１） ＡＲＨＧＥＦ４の機能の確認
コントロール膵癌細胞とＡＲＨＧＥＦ４遺伝子をノックダウンした膵癌細胞を用いた以外は上記実施例１（４）と同様にして、膵癌細胞の運動性と浸潤性を試験した。結果を図４Ａ～Ｄに示す。
図４Ａは、コントロール膵癌細胞とＡＲＨＧＥＦ４遺伝子をノックダウンした膵癌細胞の細胞運動アッセイにおいて、上部チャンバーから下部チャンバーへ移動した細胞の数を示すグラフである。「＊」は、ｔ－テストにおいてコントロールに対してｐ＜０．０５で有意差があることを示す。ヒト膵癌細胞株であるＳ２－０１３とＰＡＮＣ－１のいずれにおいても、ＡＲＨＧＥＦ４遺伝子をノックダウンした場合には、膵癌細胞の運動性と浸潤性が顕著に低下することが明らかとなった。
図４Ｂは、コントロール膵癌細胞とＡＲＨＧＥＦ４遺伝子をノックダウンした膵癌細胞のマトリゲル浸潤アッセイにおいて、上部チャンバーから下部チャンバーへ移動した細胞の数を示すグラフである。「＊」は、ｔ－テストにおいてコントロールに対してｐ＜０．０５で有意差があることを示す。当該実験でも、ヒト膵癌細胞株であるＳ２－０１３とＰＡＮＣ－１のいずれにおいても、ＡＲＨＧＥＦ４遺伝子をノックダウンした場合には、膵癌細胞の運動性と浸潤性が顕著に低下することが明らかとなった。
図４Ｃは、ｍｙｃタグＡＲＨＧＥＦ４回復コンストラクトまたはモックコントロールベクターを、コントロール膵癌細胞とＡＲＨＧＥＦ４遺伝子をノックダウンした膵癌細胞に導入した後、細胞運動アッセイを行い、上部チャンバーから下部チャンバーへ移動した細
胞の数を示すグラフである。「＊」は、モックベクターをトランスフェクションした細胞に対して、ｍｙｃタグＡＲＨＧＥＦ４回復コンストラクトをトランスフェクションした細胞の数が、ｔ－テストにおいてｐ＜０．０５で有意に多いことを示す。図４Ｃの結果の通り、ＡＲＨＧＥＦ４遺伝子をノックダウンした膵癌細胞の運動性と浸潤性は低下したが、ＡＲＨＧＥＦ４の回復により膵癌細胞の運動性と浸潤性も回復することが明らかとなった。
図４Ｄは、ｍｙｃタグＡＲＨＧＥＦ４回復コンストラクトまたはモックコントロールベクターを、コントロール膵癌細胞とＡＲＨＧＥＦ４遺伝子をノックダウンした膵癌細胞に導入した後、マトリゲル浸潤アッセイを行い、上部チャンバーから下部チャンバーへ移動した細胞の数を示すグラフである。「＊」は、モックベクターをトランスフェクションした細胞に対して、ｍｙｃタグＡＲＨＧＥＦ４回復コンストラクトをトランスフェクションした細胞の数が、ｔ－テストにおいてｐ＜０．０５で有意に多いことを示す。当該実験でも、ＡＲＨＧＥＦ４遺伝子をノックダウンした膵癌細胞の運動性と浸潤性は低下したが、ＡＲＨＧＥＦ４の回復により膵癌細胞の運動性と浸潤性も回復することが明らかとなった。
以上の実験結果より、ＡＲＨＧＥＦ４は膵癌細胞の運動性と浸潤性に関与することが明らかとなった。
【0046】
（２） ｓｉＲＮＡによる膵癌細胞の浸潤転移抑制作用
６週齢のヌードマウス（「ＢＡＬＢ／ｃＡＢｏｍＣｒ－ｎｕ／ｎｕ」日本ＳＬＣより入手）にイソフルランを用いた吸入麻酔により迅速な麻酔導入を行った後、開腹して膵臓を露出した。１×１０6のＳ２－０１３株細胞を０．１ｍＬのＰＢＳに懸濁してマウスの膵
臓内にインシュリン皮下注射用注射器を用いて移植し、移植後は縫合を行った。この方法により移植を行ったマウスを膵癌浸潤転移モデルとした。また、ＡＲＨＧＥＦ４ ｍＲＮＡに対してＲＮＡ干渉を起こすｓｉＲＮＡ（配列番号１）を合成し、リガンド付きキトサンオリゴ糖ナノ粒子を付加した。第１日目に移植手術を１回行い、ＰＢＳに溶解した６ｍｇ／ｍＬのリガンド付きキトサンオリゴ糖ナノ粒子付加ｓｉＲＮＡ溶液（４００μＬ）を尾静脈から投与した。以降、リガンド付きキトサンオリゴ糖ナノ粒子付加ｓｉＲＮＡ溶液を１回／週の頻度で計５回静注投与した。また、コントロールとして、ｓｉＲＮＡ溶液の代わりにリガンド付きキトサンオリゴ糖ナノ粒子を付加したｓｃｒａｍｂｌｅｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ溶液、ＰＢＳのみ、およびリガンド付きキトサンオリゴ糖ナノ粒子分散液を投与した３群を設定した。６週目にマウスを屠殺し、腹膜播種、肝臓と肺への遠隔転移の有無を病理組織学的に検討した。結果を表１に示す。「＊」は、コントロールに対してｐ＜０．０５で有意差があることを示す。
６週齢のヌードマウス（「ＢＡＬＢ／ｃＡＢｏｍＣｒ－ｎｕ／ｎｕ」日本ＳＬＣより入手）にイソフルランを用いた吸入麻酔により迅速な麻酔導入を行った後、開腹して膵臓を露出した。１×１０6のＳ２－０１３株細胞を０．１ｍＬのＰＢＳに懸濁してマウスの膵
臓内にインシュリン皮下注射用注射器を用いて移植し、移植後は縫合を行った。この方法により移植を行ったマウスを膵癌浸潤転移モデルとした。また、ＡＲＨＧＥＦ４ ｍＲＮＡに対してＲＮＡ干渉を起こすｓｉＲＮＡ（配列番号１）を合成し、リガンド付きキトサンオリゴ糖ナノ粒子を付加した。第１日目に移植手術を１回行い、ＰＢＳに溶解した６ｍｇ／ｍＬのリガンド付きキトサンオリゴ糖ナノ粒子付加ｓｉＲＮＡ溶液（４００μＬ）を尾静脈から投与した。以降、リガンド付きキトサンオリゴ糖ナノ粒子付加ｓｉＲＮＡ溶液を１回／週の頻度で計５回静注投与した。また、コントロールとして、ｓｉＲＮＡ溶液の代わりにリガンド付きキトサンオリゴ糖ナノ粒子を付加したｓｃｒａｍｂｌｅｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ溶液、ＰＢＳのみ、およびリガンド付きキトサンオリゴ糖ナノ粒子分散液を投与した３群を設定した。６週目にマウスを屠殺し、腹膜播種、肝臓と肺への遠隔転移の有無を病理組織学的に検討した。結果を表１に示す。「＊」は、コントロールに対してｐ＜０．０５で有意差があることを示す。
【0047】
【表1】
【0048】
表１に示す結果の通り、ＡＲＨＧＥＦ４に対するｓｉＲＮＡを投与したマウスでは、膵癌細胞の腹膜播種、後腹膜浸潤および肺転移が抑制された。
【0049】
（３） ＥＲＫ１／２とＡＲＨＧＥＦ４との関係
ＡＲＨＧＥＦ４レスキューコンストラクトを、スクランブルドコントロールｓｉＲＮＡトランスフェクトＳ２－０１３細胞およびＡＲＨＧＥＦ４－ｓｉＲＮＡトランスフェクト
Ｓ２－０１３細胞にトランスフェクトした。ＡＲＨＧＥＦ４－ｓｉＲＮＡとしては、上記実施例１（１）と同じものを用いた。２４時間後、これらの細胞を３０μＭのＵ０１２６と共に２４時間インキュベートした。次いで、上記実施例１（４）と同様にして各細胞の運動性と浸潤性を評価した。結果を図５Ａ～Ｂに示す。
図５Ａは、ｍｙｃタグＡＲＨＧＥＦ４回復コンストラクトまたはモックコントロールベクターを、ＡＲＨＧＥＦ４遺伝子をノックダウンした膵癌細胞株Ｓ２－０１３に導入した後、細胞運動アッセイとマトリゲル浸潤アッセイを行い、上部チャンバーから下部チャンバーへ移動した細胞の数を示すグラフである。図５Ｂは、膵癌細胞としてＳ２－０１３の代わりにＰＡＮＣ－１を用いた同様の実験の結果を示すグラフである。
ヒト膵癌細胞株であるＳ２－０１３とＰＡＮＣ－１のいずれにおいても、ＡＲＨＧＥＦ４遺伝子をノックダウンした場合には、膵癌細胞の運動性と浸潤性が顕著に低下するが、ＡＲＨＧＥＦ４遺伝子の発現をレスキューすることにより有意に回復した。しかし培地にＥＲＫ１／２の阻害作用を有するＵ０１２６を添加すると、ＡＲＨＧＥＦ４遺伝子の発現をレスキューしても膵癌細胞の運動性と浸潤性の程度は抑制されたままであり、全く回復しなかった。この様に、リン酸化された活性型ＥＲＫ１／２は、ＡＲＨＧＥＦ４が関与する膵癌細胞の浸潤転移機構において重要な因子であることが証明された。
ＡＲＨＧＥＦ４レスキューコンストラクトを、スクランブルドコントロールｓｉＲＮＡトランスフェクトＳ２－０１３細胞およびＡＲＨＧＥＦ４－ｓｉＲＮＡトランスフェクト
Ｓ２－０１３細胞にトランスフェクトした。ＡＲＨＧＥＦ４－ｓｉＲＮＡとしては、上記実施例１（１）と同じものを用いた。２４時間後、これらの細胞を３０μＭのＵ０１２６と共に２４時間インキュベートした。次いで、上記実施例１（４）と同様にして各細胞の運動性と浸潤性を評価した。結果を図５Ａ～Ｂに示す。
図５Ａは、ｍｙｃタグＡＲＨＧＥＦ４回復コンストラクトまたはモックコントロールベクターを、ＡＲＨＧＥＦ４遺伝子をノックダウンした膵癌細胞株Ｓ２－０１３に導入した後、細胞運動アッセイとマトリゲル浸潤アッセイを行い、上部チャンバーから下部チャンバーへ移動した細胞の数を示すグラフである。図５Ｂは、膵癌細胞としてＳ２－０１３の代わりにＰＡＮＣ－１を用いた同様の実験の結果を示すグラフである。
ヒト膵癌細胞株であるＳ２－０１３とＰＡＮＣ－１のいずれにおいても、ＡＲＨＧＥＦ４遺伝子をノックダウンした場合には、膵癌細胞の運動性と浸潤性が顕著に低下するが、ＡＲＨＧＥＦ４遺伝子の発現をレスキューすることにより有意に回復した。しかし培地にＥＲＫ１／２の阻害作用を有するＵ０１２６を添加すると、ＡＲＨＧＥＦ４遺伝子の発現をレスキューしても膵癌細胞の運動性と浸潤性の程度は抑制されたままであり、全く回復しなかった。この様に、リン酸化された活性型ＥＲＫ１／２は、ＡＲＨＧＥＦ４が関与する膵癌細胞の浸潤転移機構において重要な因子であることが証明された。
【0050】
実施例３
（１） トラメチニブのＥＲＫ１／２不活性化作用
ヒト膵癌細胞株Ｓ２－０１３を、５００ｎＭのトラメチニブ（ＭｅｄＣｈｅｍ Ｅｘｐｒｅｓｓ社製）を含む培地中、１６時間インキュベートした。次いで、抗リン酸化ＥＲＫ１／２抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った。結果を図６に示す。
図６に示す結果の通り、培養液にトラメチニブを添加することにより、ヒト膵癌細胞株Ｓ２－０１３において、リン酸化された活性型ＥＲＫ１／２は低減され、ＥＲＫ１／２の活性は明らかに低下することが分かった。
（１） トラメチニブのＥＲＫ１／２不活性化作用
ヒト膵癌細胞株Ｓ２－０１３を、５００ｎＭのトラメチニブ（ＭｅｄＣｈｅｍ Ｅｘｐｒｅｓｓ社製）を含む培地中、１６時間インキュベートした。次いで、抗リン酸化ＥＲＫ１／２抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った。結果を図６に示す。
図６に示す結果の通り、培養液にトラメチニブを添加することにより、ヒト膵癌細胞株Ｓ２－０１３において、リン酸化された活性型ＥＲＫ１／２は低減され、ＥＲＫ１／２の活性は明らかに低下することが分かった。
【0051】
（２） トラメチニブの膵癌細胞増殖作用
ヒト膵癌細胞株Ｓ２－０１３を、５００ｎＭのトラメチニブを含む培地中、１６時間インキュベートした。次いで、３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイによって、細胞の生存率を評価した。具体的には、各ウェルに細胞計数キット－８溶液を１／１０容量になるように加え、プレートを３７℃で更に３時間インキュベートした。次に、Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ ５５０（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）を用いて、４９０ｎｍおよび６３０ｎｍでの吸光度を測定した。結果を図７に示す。
図７に示す結果の通り、悪性黒色腫の治療薬として使用されているトラメチニブは、膵癌細胞に対しては増殖抑制作用を全く示さないことが明らかとなった。
ヒト膵癌細胞株Ｓ２－０１３を、５００ｎＭのトラメチニブを含む培地中、１６時間インキュベートした。次いで、３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイによって、細胞の生存率を評価した。具体的には、各ウェルに細胞計数キット－８溶液を１／１０容量になるように加え、プレートを３７℃で更に３時間インキュベートした。次に、Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ ５５０（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）を用いて、４９０ｎｍおよび６３０ｎｍでの吸光度を測定した。結果を図７に示す。
図７に示す結果の通り、悪性黒色腫の治療薬として使用されているトラメチニブは、膵癌細胞に対しては増殖抑制作用を全く示さないことが明らかとなった。
【0052】
（３） トラメチニブの膵癌細胞の運動性と浸潤性の抑制作用
ヒト膵癌細胞株Ｓ２－０１３を、５００ｎＭのトラメチニブを含む培地中、１６時間インキュベートした。次いで、上記実施例１（４）と同様にして、細胞の運動性と浸潤性を試験した。結果を図８Ａ～Ｂに示す。
図８Ａは、ヒト膵癌細胞株Ｓ２－０１３の培養液中にトラメチニブを添加した場合としない場合の細胞運動アッセイにおいて、上部チャンバーから下部チャンバーへ移動した細胞の数を示すグラフである。図８Ｂは、膵癌細胞株としてＳ２－０１３の代わりにＰＡＮＣ－１を用いた同様の実験の結果を示すグラフである。「＊」は、ｔ－テストにおいてコントロールに対してｐ＜０．０５で有意差があることを示す。
図８Ａ～Ｂに示す結果の通り、ＥＲＫ１／２阻害薬であるトラメチニブは、膵癌細胞の運動性と浸潤性を有意に阻害することが証明された。
ヒト膵癌細胞株Ｓ２－０１３を、５００ｎＭのトラメチニブを含む培地中、１６時間インキュベートした。次いで、上記実施例１（４）と同様にして、細胞の運動性と浸潤性を試験した。結果を図８Ａ～Ｂに示す。
図８Ａは、ヒト膵癌細胞株Ｓ２－０１３の培養液中にトラメチニブを添加した場合としない場合の細胞運動アッセイにおいて、上部チャンバーから下部チャンバーへ移動した細胞の数を示すグラフである。図８Ｂは、膵癌細胞株としてＳ２－０１３の代わりにＰＡＮＣ－１を用いた同様の実験の結果を示すグラフである。「＊」は、ｔ－テストにおいてコントロールに対してｐ＜０．０５で有意差があることを示す。
図８Ａ～Ｂに示す結果の通り、ＥＲＫ１／２阻害薬であるトラメチニブは、膵癌細胞の運動性と浸潤性を有意に阻害することが証明された。
【0053】
実施例４
（１） ｍＴＯＲと膵癌細胞の運動性および浸潤性との関係
ＩＧＦ２ＢＰ３と結合して膵癌細胞の葉状仮足に運搬されるｍＲＮＡの一つに、ｍＴＯＲ（哺乳類ラパマイシン標的タンパク質） ｍＲＮＡがある。ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達経路の中心的なシグナル因子であるｍＴＯＲは、細胞増殖と血管新生に関与している。そこで、ｍＴＯＲと膵癌細胞の運動性および浸潤性との関係につき試験した。
スクランブルドコントロールｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたヒト膵癌細胞Ｓ２－０１３細胞株、およびｍＴＯＲ－ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＳ２－０１３細胞の運動性と浸潤性を、上記実施例１（４）と同様にして評価した。ｍＴＯＲ－ｓｉＲＮＡとしては、配列番号５～８の塩基配列を有する４種のＲＮＡとその相補配列ＲＮＡとの二本鎖の混合物を用いた。結果を図９Ａ～Ｂに示す。
図９Ａは、コントロール膵癌細胞とｍＴＯＲ遺伝子をノックダウンした膵癌細胞株Ｓ２－０１３の細胞運動アッセイにおいて、上部チャンバーから下部チャンバーへ移動した細胞の数を示すグラフである。「＊」は、ｔ－テストにおいてコントロールに対してｐ＜０．０５で有意差があることを示す。
図９Ｂは、コントロール膵癌細胞とｍＴＯＲ遺伝子をノックダウンした膵癌細胞株Ｓ２－０１３のマトリゲル浸潤アッセイにおいて、上部チャンバーから下部チャンバーへ移動した細胞の数を示すグラフである。「＊」は、ｔ－テストにおいてコントロールに対してｐ＜０．０５で有意差があることを示す。
図９Ａ～Ｂに示す結果の通り、ｍＴＯＲは膵癌細胞の運動性と浸潤性に関与することが明らかとなった。
（１） ｍＴＯＲと膵癌細胞の運動性および浸潤性との関係
ＩＧＦ２ＢＰ３と結合して膵癌細胞の葉状仮足に運搬されるｍＲＮＡの一つに、ｍＴＯＲ（哺乳類ラパマイシン標的タンパク質） ｍＲＮＡがある。ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達経路の中心的なシグナル因子であるｍＴＯＲは、細胞増殖と血管新生に関与している。そこで、ｍＴＯＲと膵癌細胞の運動性および浸潤性との関係につき試験した。
スクランブルドコントロールｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたヒト膵癌細胞Ｓ２－０１３細胞株、およびｍＴＯＲ－ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＳ２－０１３細胞の運動性と浸潤性を、上記実施例１（４）と同様にして評価した。ｍＴＯＲ－ｓｉＲＮＡとしては、配列番号５～８の塩基配列を有する４種のＲＮＡとその相補配列ＲＮＡとの二本鎖の混合物を用いた。結果を図９Ａ～Ｂに示す。
図９Ａは、コントロール膵癌細胞とｍＴＯＲ遺伝子をノックダウンした膵癌細胞株Ｓ２－０１３の細胞運動アッセイにおいて、上部チャンバーから下部チャンバーへ移動した細胞の数を示すグラフである。「＊」は、ｔ－テストにおいてコントロールに対してｐ＜０．０５で有意差があることを示す。
図９Ｂは、コントロール膵癌細胞とｍＴＯＲ遺伝子をノックダウンした膵癌細胞株Ｓ２－０１３のマトリゲル浸潤アッセイにおいて、上部チャンバーから下部チャンバーへ移動した細胞の数を示すグラフである。「＊」は、ｔ－テストにおいてコントロールに対してｐ＜０．０５で有意差があることを示す。
図９Ａ～Ｂに示す結果の通り、ｍＴＯＲは膵癌細胞の運動性と浸潤性に関与することが明らかとなった。
【0054】
（２） ｍＴＯＲ ｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡによる膵癌細胞の浸潤転移抑制作用
ｍＴＯＲ ｍＲＮＡに対してＲＮＡ干渉を起こすｓｉＲＮＡ（配列番号５）を合成し、リガンド付きキトサンオリゴ糖ナノ粒子を付加した。上記実施例２（２）と同様にしてＳ２－０１３株細胞を移植した膵癌浸潤転移モデルマウスに移植を行った週から、ＰＢＳに溶解した６ｍｇ／ｍＬのリガンド付きキトサンオリゴ糖ナノ粒子付加ｓｉＲＮＡ溶液（４００μＬ）を尾静脈から投与した。以降、リガンド付きキトサンオリゴ糖ナノ粒子付加ｓｉＲＮＡ溶液を１回／週の頻度で計５回静注投与した。また、コントロールとして、リガンド付きキトサンオリゴ糖ナノ粒子を付加したｓｃｒａｍｂｌｅｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ溶液、ＰＢＳのみ、およびリガンド付きキトサンオリゴ糖ナノ粒子のみを投与した３群を設定した。６週目にマウスを屠殺し、腹膜播種、肝臓と肺への遠隔転移の有無を病理組織学的に検討した。結果を表２に示す。「＊」は、コントロールに対してｐ＜０．０５で有意差があることを示す。
ｍＴＯＲ ｍＲＮＡに対してＲＮＡ干渉を起こすｓｉＲＮＡ（配列番号５）を合成し、リガンド付きキトサンオリゴ糖ナノ粒子を付加した。上記実施例２（２）と同様にしてＳ２－０１３株細胞を移植した膵癌浸潤転移モデルマウスに移植を行った週から、ＰＢＳに溶解した６ｍｇ／ｍＬのリガンド付きキトサンオリゴ糖ナノ粒子付加ｓｉＲＮＡ溶液（４００μＬ）を尾静脈から投与した。以降、リガンド付きキトサンオリゴ糖ナノ粒子付加ｓｉＲＮＡ溶液を１回／週の頻度で計５回静注投与した。また、コントロールとして、リガンド付きキトサンオリゴ糖ナノ粒子を付加したｓｃｒａｍｂｌｅｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ溶液、ＰＢＳのみ、およびリガンド付きキトサンオリゴ糖ナノ粒子のみを投与した３群を設定した。６週目にマウスを屠殺し、腹膜播種、肝臓と肺への遠隔転移の有無を病理組織学的に検討した。結果を表２に示す。「＊」は、コントロールに対してｐ＜０．０５で有意差があることを示す。
【0055】
【表2】
【0056】
表２に示す結果の通り、ｍＴＯＲに対するｓｉＲＮＡを投与したマウスでは、膵癌細胞の腹膜播種、後腹膜浸潤および肺転移が抑制された。
【0057】
（３） ｍＴＯＲ ｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡによる予後の改善作用
上記実施例４（２）と同様にしてマウスに膵癌細胞を移植した後、移植から８週目における生存数を確認した。コントロール群には、ｍＴＯＲ ｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡの代わりにｓｃｒａｍｂｌｅｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡを用いた。結果を表３に示す
。
上記実施例４（２）と同様にしてマウスに膵癌細胞を移植した後、移植から８週目における生存数を確認した。コントロール群には、ｍＴＯＲ ｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡの代わりにｓｃｒａｍｂｌｅｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡを用いた。結果を表３に示す
。
【0058】
【表3】
【0059】
表３に示す結果の通り、ｍＴＯＲ ｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡの投与により、膵癌細胞移植後の予後が明らかに改善された。
【0060】
（４） エベロリムスによるｍＴＯＲの活性抑制作用
ヒト膵癌細胞株Ｓ２－０１３を、１０μＭのエベロリムス（和光純薬工業社製）を含む培地中、４８時間インキュベートした。次いで、抗リン酸化ｍＴＯＲ抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った。結果を図１０に示す。
図１０に示される結果の通り、ヒト膵癌細胞株Ｓ２－０１３の培養液中にエベロリムスを添加した場合にはｍＴＯＲのリン酸化が明らかに抑制され、活性化が抑制されていることが分かった。
ヒト膵癌細胞株Ｓ２－０１３を、１０μＭのエベロリムス（和光純薬工業社製）を含む培地中、４８時間インキュベートした。次いで、抗リン酸化ｍＴＯＲ抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った。結果を図１０に示す。
図１０に示される結果の通り、ヒト膵癌細胞株Ｓ２－０１３の培養液中にエベロリムスを添加した場合にはｍＴＯＲのリン酸化が明らかに抑制され、活性化が抑制されていることが分かった。
【0061】
（５） エベロリムスによる膵癌細胞の増殖抑制作用
ヒト膵癌細胞株Ｓ２－０１３を、１０μＭのエベロリムス（和光純薬工業社製）と５０μＭのＴＳ－１を含む培地中、７２時間インキュベートした。次いで、実施例３（２）と同様にして、ＭＴＴアッセイにより細胞の生存率を評価した。結果を図１１に示す。
図１１に示される結果の通り、ヒト膵癌細胞株Ｓ２－０１３の培養液中にＳ－１（テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤）を添加した場合には膵癌細胞の増殖は有意には低下しなかったのに対して、エベロリムスを添加した場合には膵癌細胞の増殖は有意に低下した。
ヒト膵癌細胞株Ｓ２－０１３を、１０μＭのエベロリムス（和光純薬工業社製）と５０μＭのＴＳ－１を含む培地中、７２時間インキュベートした。次いで、実施例３（２）と同様にして、ＭＴＴアッセイにより細胞の生存率を評価した。結果を図１１に示す。
図１１に示される結果の通り、ヒト膵癌細胞株Ｓ２－０１３の培養液中にＳ－１（テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤）を添加した場合には膵癌細胞の増殖は有意には低下しなかったのに対して、エベロリムスを添加した場合には膵癌細胞の増殖は有意に低下した。
【0062】
（６） エベロリムスによる膵癌細胞の運動性と浸潤性の抑制作用
ヒト膵癌細胞株Ｓ２－０１３を、１０μＭのエベロリムス（和光純薬工業社製）を含む培地中、４８時間インキュベートした。次いで、細胞の運動性と浸潤性を、上記実施例１（４）と同様にして評価した。結果を図１２Ａ～Ｂに示す。
図１２Ａは、ヒト膵癌細胞株Ｓ２－０１３の培養液中にエベロリムスを添加した場合としない場合の細胞運動アッセイにおいて、上部チャンバーから下部チャンバーへ移動した細胞の数を示すグラフである。図１２Ｂは、膵癌細胞株としてＳ２－０１３の代わりにＰＡＮＣ－１を用いた同様の実験の結果を示すグラフである。「＊」は、ｔ－テストにおいてコントロールに対してｐ＜０．０５で有意差があることを示す。
図１２Ａ～Ｂに示す結果の通り、ｍＴＯＲ阻害薬であるエベロリムスは、膵癌細胞の運動性と浸潤性を有意に阻害することが証明された。
ヒト膵癌細胞株Ｓ２－０１３を、１０μＭのエベロリムス（和光純薬工業社製）を含む培地中、４８時間インキュベートした。次いで、細胞の運動性と浸潤性を、上記実施例１（４）と同様にして評価した。結果を図１２Ａ～Ｂに示す。
図１２Ａは、ヒト膵癌細胞株Ｓ２－０１３の培養液中にエベロリムスを添加した場合としない場合の細胞運動アッセイにおいて、上部チャンバーから下部チャンバーへ移動した細胞の数を示すグラフである。図１２Ｂは、膵癌細胞株としてＳ２－０１３の代わりにＰＡＮＣ－１を用いた同様の実験の結果を示すグラフである。「＊」は、ｔ－テストにおいてコントロールに対してｐ＜０．０５で有意差があることを示す。
図１２Ａ～Ｂに示す結果の通り、ｍＴＯＲ阻害薬であるエベロリムスは、膵癌細胞の運動性と浸潤性を有意に阻害することが証明された。
【0063】
（７） トラメチニブとエベロリムスによる膵癌細胞の運動性と浸潤性の抑制作用
ヒト膵癌細胞株Ｓ２－０１３を、５００μＭのトラメチニブを含む培地中で１６時間インキュベートするか、１０μＭのエベロリムスまたはトラメチニブを含む培地中で４８時間インキュベートするか、或いは５００μＭのトラメチニブまたは１０μＭのエベロリムストラメチニブを含む培地中で１６時間インキュベートした。次いで、細胞の運動性と浸潤性を、上記実施例１（４）と同様にして評価した。結果を図１３Ａ～Ｂに示す。
図１３Ａは、ヒト膵癌細胞株Ｓ２－０１３の培養液中にトラメチニブおよび／またはエベロリムスを添加した場合としない場合の細胞運動アッセイにおいて、上部チャンバーから下部チャンバーへ移動した細胞の数を示すグラフである。「＊」は、ｔ－テストにおい
てコントロール、トラメチニブ単独、エベロリムス単独に対してｐ＜０．０５で有意差があることを示す。
図１３Ｂは、ヒト膵癌細胞株Ｓ２－０１３の培養液中にトラメチニブおよび／またはエベロリムスを添加した場合としない場合のマトリゲル浸潤アッセイにおいて、上部チャンバーから下部チャンバーへ移動した細胞の数を示すグラフである。「＊」は、ｔ－テストにおいてコントロール、トラメチニブ単独、エベロリムス単独に対してｐ＜０．０５で有意差があることを示す。
図１３Ａ～Ｂに示される結果の通り、トラメチニブとエベロリムスを併用した場合には、いずれか単独の場合に比べ、膵癌細胞の運動性と浸潤性を有意に抑制することができた。また、トラメチニブは膵癌細胞の増殖抑制作用を示さないのに対してエベロリムスは膵癌細胞に対して増殖抑制作用を示すことから、トラメチニブとエベロリムスの併用は、膵癌に対するより一層有効な治療手段となり得ることが実証された。
ヒト膵癌細胞株Ｓ２－０１３を、５００μＭのトラメチニブを含む培地中で１６時間インキュベートするか、１０μＭのエベロリムスまたはトラメチニブを含む培地中で４８時間インキュベートするか、或いは５００μＭのトラメチニブまたは１０μＭのエベロリムストラメチニブを含む培地中で１６時間インキュベートした。次いで、細胞の運動性と浸潤性を、上記実施例１（４）と同様にして評価した。結果を図１３Ａ～Ｂに示す。
図１３Ａは、ヒト膵癌細胞株Ｓ２－０１３の培養液中にトラメチニブおよび／またはエベロリムスを添加した場合としない場合の細胞運動アッセイにおいて、上部チャンバーから下部チャンバーへ移動した細胞の数を示すグラフである。「＊」は、ｔ－テストにおい
てコントロール、トラメチニブ単独、エベロリムス単独に対してｐ＜０．０５で有意差があることを示す。
図１３Ｂは、ヒト膵癌細胞株Ｓ２－０１３の培養液中にトラメチニブおよび／またはエベロリムスを添加した場合としない場合のマトリゲル浸潤アッセイにおいて、上部チャンバーから下部チャンバーへ移動した細胞の数を示すグラフである。「＊」は、ｔ－テストにおいてコントロール、トラメチニブ単独、エベロリムス単独に対してｐ＜０．０５で有意差があることを示す。
図１３Ａ～Ｂに示される結果の通り、トラメチニブとエベロリムスを併用した場合には、いずれか単独の場合に比べ、膵癌細胞の運動性と浸潤性を有意に抑制することができた。また、トラメチニブは膵癌細胞の増殖抑制作用を示さないのに対してエベロリムスは膵癌細胞に対して増殖抑制作用を示すことから、トラメチニブとエベロリムスの併用は、膵癌に対するより一層有効な治療手段となり得ることが実証された。
【0064】
実施例５
（１）ｍＴＯＲ阻害剤による膵癌組織の増大抑制効果の確認試験
ヒト膵癌細胞株Ｓ２－０１３由来の膵癌組織をマウス脇腹の皮下に移植した。マウスを３群に分け、移植の翌週から、６匹に対してｍＴＯＲ阻害剤であるシロリムス（８ｍｇ/
ｋｇ）を５日／週の頻度で経口投与し、５匹に対して膵癌の標準化学療法薬であるＴＳ－１（１０ｍｇ/ｋｇ）を５日／週の頻度で経口投与した。４週間の薬剤投与後、２週間休
薬し、再び２週間投与した。また、コントロール群として６匹には薬剤を投与せず観察のみした。移植の２週間後から毎週、膵癌組織の腫瘍径の計測と写真撮影を行った。移植から８週間後における各マウスの写真を図１４に、各群マウスの腫瘍径の経時的変化を図１５に示す。図１５中、「＊」はｔ－テストにおいてシロリムス投与群に対してｐ＜０．０５で有意差があることを示す。
図１４および図１５に示された結果の通り、シロリムスを投与したマウス群の皮下に形成された膵癌腫瘍の体積は、コントロール群およびＴＳ－１投与群に比較して有意に抑制された。
（１）ｍＴＯＲ阻害剤による膵癌組織の増大抑制効果の確認試験
ヒト膵癌細胞株Ｓ２－０１３由来の膵癌組織をマウス脇腹の皮下に移植した。マウスを３群に分け、移植の翌週から、６匹に対してｍＴＯＲ阻害剤であるシロリムス（８ｍｇ/
ｋｇ）を５日／週の頻度で経口投与し、５匹に対して膵癌の標準化学療法薬であるＴＳ－１（１０ｍｇ/ｋｇ）を５日／週の頻度で経口投与した。４週間の薬剤投与後、２週間休
薬し、再び２週間投与した。また、コントロール群として６匹には薬剤を投与せず観察のみした。移植の２週間後から毎週、膵癌組織の腫瘍径の計測と写真撮影を行った。移植から８週間後における各マウスの写真を図１４に、各群マウスの腫瘍径の経時的変化を図１５に示す。図１５中、「＊」はｔ－テストにおいてシロリムス投与群に対してｐ＜０．０５で有意差があることを示す。
図１４および図１５に示された結果の通り、シロリムスを投与したマウス群の皮下に形成された膵癌腫瘍の体積は、コントロール群およびＴＳ－１投与群に比較して有意に抑制された。
【0065】
（２）移植膵癌組織の拡大染色観察
ヒト膵癌細胞株Ｓ２－０１３の移植後８週目に各マウスを解剖して、マウス脇腹に形成されたＳ２－０１３由来のヒト膵癌組織をホルマリン固定し、ヘマトキシリン－エオシン染色を行った。移植ヒト膵癌組織の拡大染色写真を図１６に示す。
図１６に示された結果の通り、コントロール群では、膵癌細胞は皮下組織と筋組織に強く浸潤していた。また、ＴＳ－１投与群では、膵癌組織の先進部の皮下組織に顕著なリンパ球の浸潤が認められた。
それに対して、シロリムス投与群の皮下に形成された膵癌細胞は、皮下および筋肉への浸潤が抑制されており、シロリムス投与群での筋組織への浸潤の程度はより一層軽度であった。
ヒト膵癌細胞株Ｓ２－０１３の移植後８週目に各マウスを解剖して、マウス脇腹に形成されたＳ２－０１３由来のヒト膵癌組織をホルマリン固定し、ヘマトキシリン－エオシン染色を行った。移植ヒト膵癌組織の拡大染色写真を図１６に示す。
図１６に示された結果の通り、コントロール群では、膵癌細胞は皮下組織と筋組織に強く浸潤していた。また、ＴＳ－１投与群では、膵癌組織の先進部の皮下組織に顕著なリンパ球の浸潤が認められた。
それに対して、シロリムス投与群の皮下に形成された膵癌細胞は、皮下および筋肉への浸潤が抑制されており、シロリムス投与群での筋組織への浸潤の程度はより一層軽度であった。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【配列表】