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特許7508048細胞外小胞の分泌を促進するための組成物

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-06-21

(45)【発行日】2024-07-01

(54)【発明の名称】細胞外小胞の分泌を促進するための組成物

(51)【国際特許分類】

C12N 1/00 20060101AFI20240624BHJP

C12N 5/07 20100101ALI20240624BHJP

C12N 5/077 20100101ALI20240624BHJP

C12N 5/0775 20100101ALI20240624BHJP

C12N 5/078 20100101ALI20240624BHJP

A61K 31/11 20060101ALI20240624BHJP

A61K 31/05 20060101ALI20240624BHJP

A61K 31/165 20060101ALI20240624BHJP

A61K 31/404 20060101ALI20240624BHJP

A61K 31/4025 20060101ALI20240624BHJP

A61P 43/00 20060101ALI20240624BHJP

A61P 35/00 20060101ALI20240624BHJP

A61P 9/00 20060101ALI20240624BHJP

A61P 25/00 20060101ALI20240624BHJP

A61P 37/02 20060101ALI20240624BHJP

A61K 31/575 20060101ALI20240624BHJP

C07D 403/14 20060101ALN20240624BHJP

C07D 207/36 20060101ALN20240624BHJP

C07J 9/00 20060101ALN20240624BHJP

【ＦＩ】

C12N1/00 G

C12N5/07

C12N5/077

C12N5/0775

C12N5/078

A61K31/11

A61K31/05

A61K31/165

A61K31/404

A61K31/4025

A61P43/00 111

A61P35/00

A61P9/00

A61P25/00

A61P37/02

A61K31/575

C07D403/14

C07D207/36

C07J9/00

【請求項の数】 12

(21)【出願番号】P 2021512320

(86)(22)【出願日】2020-04-03

(86)【国際出願番号】 JP2020015310

(87)【国際公開番号】W WO2020204161

(87)【国際公開日】2020-10-08

【審査請求日】2023-03-09

(31)【優先権主張番号】P 2019071759

(32)【優先日】2019-04-04

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】000003986

【氏名又は名称】日産化学株式会社

(73)【特許権者】

【識別番号】504160781

【氏名又は名称】国立大学法人金沢大学

(74)【代理人】

【識別番号】110001508

【氏名又は名称】弁理士法人津国

(72)【発明者】

【氏名】的場一隆

(72)【発明者】

【氏名】木田克彦

(72)【発明者】

【氏名】西野泰斗

(72)【発明者】

【氏名】華山力成

(72)【発明者】

【氏名】吉田孟史

【審査官】太田雄三

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１８／１８２０１６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１８／２２５４４０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１５／１２０１５０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】山下竜幸，他，硫酸化糖脂質サルファタイドによる間葉系幹細胞のエクソソーム分泌促進効果，日本再生医療学会雑誌再生医療，2017年02月01日，第16巻／増刊号［通巻69号］，pp. 367, P-01-023

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ１／００

Ｃ１２Ｎ５／００

Ｃ０７Ｄ４０３／００

Ｃ０７Ｄ２０７／００

Ｃ０７Ｊ９／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

細胞外小胞の分泌を促進するための組成物であって、式Ｉ

【化1】

［式中
Ｒ_１は、ヒドロキシ、ハロゲン、アミノ、ニトロ若しくはシアノで置換されていてもよいＣ_１－Ｃ_６アルキル、又は－Ｃ（Ｏ）－Ｒ_７であり、
Ｒ_２は、水素、ヒドロキシ、Ｃ_１－Ｃ_６アルキル又は－Ｃ（Ｏ）－Ｒ_５であり、
Ｒ_３は、ヒドロキシ、ハロゲン、アミノ、ニトロ若しくはシアノで置換されていてもよいＣ_１－Ｃ_６アルキル、又は－Ｃ（Ｏ）－Ｒ_８であり、
Ｒ_４は、水素、ヒドロキシ、Ｃ_１－Ｃ_６アルキル又は－Ｃ（Ｏ）－Ｒ_６であり、
Ｒ_５及びＲ_６は、独立して、水素；ヒドロキシ；ヒドロキシ、ハロゲン、アミノ、ニトロ若しくはシアノで置換されていてもよいＣ_１－Ｃ_６アルキル；又はヒドロキシ、ハロゲン、アミノ、ニトロ若しくはシアノで置換されていてもよいＣ_１－Ｃ_６アルコキシであり、
Ｒ_７及びＲ_８は、独立して、水素、ヒドロキシ又は－ＮＲ_９Ｒ_１０であり、
Ｒ_９及びＲ_１０は、独立して、水素、又はヒドロキシ、ハロゲン、アミノ、ニトロ、シアノ若しくはフェニルで置換されていてもよいＣ_１－Ｃ_６アルキルである］
の構造を有する化合物、そのラセミ体若しくはその立体異性体、又はその塩
を含む、組成物。

【請求項2】

Ｒ_１が、Ｃ_１－Ｃ_６アルキルであり、Ｒ_３が、Ｃ_１－Ｃ_６アルキルである、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

Ｒ_２が、－Ｃ（Ｏ）－Ｒ_５であり、Ｒ_４が、－Ｃ（Ｏ）－Ｒ_６である、請求項１又は２に記載の組成物。

【請求項4】

Ｒ_５が、水素であり、Ｒ_６が、水素である、請求項３に記載の組成物。

【請求項5】

式Ｉの構造を有する化合物が以下：

【化4】

からなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。

【請求項6】

式Ｉの構造を有する化合物が、（±）－ゴシポール、（Ｓ）－ゴシポール、（＋）－アポゴシポール、（Ｒ）－（－）－ゴシポール及びサブトクラックスからなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。

【請求項7】

脂肪組織由来の細胞からの細胞外小胞の分泌を促進するための、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項8】

間葉系幹細胞からの細胞外小胞の分泌を促進するための、請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項9】

培地組成物である、請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項10】

請求項９に記載の組成物を用いる、ｉｎｖｉｔｒｏ又はｅｘｖｉｖｏで細胞からの細胞外小胞の分泌を促進するための方法。

【請求項11】

請求項１～９のいずれか一項に記載の組成物を用いる、ｉｎｖｉｔｒｏ又はｅｘｖｉｖｏで細胞外小胞を製造するための方法。

【請求項12】

請求項１～９のいずれか一項に記載の組成物と細胞とを接触させる工程を含む、請求項１１に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、細胞からの細胞外小胞の分泌を促進するための組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

細胞外小胞は、細胞から分泌される小胞であり、その膜構造は細胞自身や細胞内小器官と同様に脂質二重層からなっており、唾液、血液、尿、羊水等のあらゆる体液中や細胞培養液中に安定して存在することが知られている。

【0003】

細胞外小胞としては、例えば、Ｅｘｏｓｏｍｅｓ（エクソソーム）、Ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅｓ（ＭＶ；微小小胞体）、ＡｐｏｐｔｏｔｉｃＢｏｄｉｅｓ（アポトーシス小体）等が知られている。エクソソームは、エンドサイト－シス・パスウエイに由来する約２０～約２００ｎｍの小胞であり、その構成成分としてタンパク質、核酸（ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ノン・コーティングＲＮＡ等）等が知られており、細胞間コミュニケーションを司る機能等を有しうる。微小小胞体（ＭＶ）は、細胞質膜に由来する約５０～約１０００ｎｍの小胞であり、その構成成分としてタンパク質、核酸（ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ノン・コーティングＲＮＡ等）等が知られており、細胞間コミュニケーションを司る機能等を有しうる。アポトーシス小体は、細胞質膜に由来する約５００～約２０００ｎｍの小胞であり、その構成成分として断片化された核、細胞小器官（オルガネラ）等が知られており、ファゴサイトーシスを誘導する機能等を有しうる。

【0004】

近年、細胞外小胞は、種々の細胞（例えば、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）等）から分泌されることが報告されており、生体内の細胞間コミュニケーションの媒介役として機能することや、ガンや神経変性疾患等の疾患との関連性が注目されている。例えば、非特許文献１では、エクソソームの分泌により、ミクログリアによるアミロイドβタンパク質の除去機能が促進されることが示唆されている。また、非特許文献２では、エクソソームが、脳内のアミロイドβの代謝に関与していることが示唆されている。

【0005】

間葉系幹細胞（ＭＳＣ）が分泌する細胞外小胞は、抗炎症作用、細胞保護作用等の多面的な機能により、ガン、心疾患、神経変性疾患、免疫系疾患等の多くの疾患に対する治療への応用が検討されている。例えば、特許文献１には、間葉系幹細胞由来のエクソソ一ムが、心不全等の疾患を治療するために使用されうることが記載されている。また、特許文献２には、間葉系幹細胞由来の細胞外小胞が、種々の角膜上皮疾患を予防及び/又は治療するために用いられうることが記載されている。

【0006】

このような背景から、近年、細胞外小胞の分泌を促進する物質について研究が進められている。例えば、特許文献３では、トロンビンを含む培地で幹細胞を培養することにより、幹細胞からのエクソソームの生成を促進する方法が報告されている。また、特許文献４では、セラミドがエクソソームの産生を促進することが報告されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【文献】特表２０１１－５１３２１７号公報

【文献】国際公開第２０１７／０２２８０９号

【文献】国際公開第２０１５／０８８２８８号

【文献】特開２０１８－１５０２９０号公報

【非特許文献】

【0008】

【文献】ＹｕｙａｍａＫｅｔａｌ．，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ．，２８９（３５），２４４８８－９８（２０１４）

【文献】ＹｕｙａｍａＫｅｔａｌ．，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ．，２８７（１４），１０９７７－８９（２０１２）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

しかしながら、細胞外小胞の分泌を促進する物質に関しては、その報告数が限られており、細胞外小胞の分泌を促進するための新たな組成物の開発が望まれている。

【0010】

したがって、本発明の課題は、細胞外小胞の分泌を促進するための組成物を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0011】

上記課題に鑑み、鋭意検討を重ねたところ、本発明者は、意外にも、特定の化合物を含む組成物が、細胞外小胞の分泌を促進することを見出し、本発明を完成するに至った。

【0012】

したがって、本発明は、要旨、以下のものを提供する。
〔１〕細胞外小胞の分泌を促進するための組成物であって、式Ｉ

【化1】

【化2】

であり、
Ｂは、

【化3】

であり、
これらの式中、
各Ｒａ～Ｒｃは、独立して、水素、ヒドロキシ、ハロゲン、又はＣ_１－Ｃ_６アルキル、ヒドロキシ、ハロゲン、アミノ、ニトロ若しくはシアノで置換されていてもよいＣ_１－Ｃ_６アルキルであり、
各Ｒｄは、独立して、水素、ヒドロキシ、Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、又はヒドロキシ、ハロゲン、アミノ、ニトロ若しくはシアノで置換されていてもよいＣ_１－Ｃ_６アルコキシである］
の構造を有する化合物、若しくはその立体異性体、又はその塩
を含む、組成物。
〔３〕細胞外小胞の分泌を促進するための組成物であって、ククルビタシン、若しくはその立体異性体、又はその塩を含む、組成物。
〔４〕Ｒ_１が、Ｃ_１－Ｃ_６アルキルであり、Ｒ_３が、Ｃ_１－Ｃ_６アルキルである、〔１〕に記載の組成物。
〔５〕Ｒ_２が、－Ｃ（Ｏ）－Ｒ_５であり、Ｒ_３が、－Ｃ（Ｏ）－Ｒ_６である、〔１〕又は〔４〕に記載の組成物。
〔６〕Ｒ_５が、水素であり、Ｒ_６が、水素である、〔５〕に記載の組成物。
〔７〕式Ｉの構造を有する化合物が以下：

【化4】

からなる群より選択される、〔１〕に記載の組成物。
〔８〕式Ｉの構造を有する化合物が、（±）－ゴシポール、（Ｓ）－ゴシポール、（＋）－アポゴシポール、（Ｒ）－（－）－ゴシポール及びサブトクラックスからなる群より選択される、〔１〕に記載の組成物。
〔９〕Ａが、以下：

【化5】

である、〔２〕に記載の組成物。
〔１０〕Ｂが、以下：

【化6】

である、〔２〕又は〔９〕に記載の組成物。
〔１１〕Ｒｄが、Ｃ_１－Ｃ_６アルコキシである、〔２〕、〔９〕及び〔１０〕のいずれかに記載の組成物。
〔１２〕式ＩＩの構造を有する化合物が以下：

【化7】

からなる群より選択される、〔２〕に記載の組成物。
〔１３〕式ＩＩの構造を有する化合物が、オバトクラックス、プロジギオシン及びウンデシルプロジギオシンからなる群より選択される、〔２〕に記載の組成物。
〔１４〕ククルビタシンが、ククルビタシンＡ、ククルビタシンＢ、ククルビタシンＣ、ククルビタシンＤ、ククルビタシンＥ、ククルビタシンＦ、ククルビタシンＧ、ククルビタシンＨ、ククルビタシンＩ、ククルビタシンＪ、ククルビタシンＫ、ククルビタシンＬ、ククルビタシンＭ、ククルビタシンＮ、ククルビタシンＯ、ククルビタシンＰ、ククルビタシンＱ、ククルビタシンＲ、ククルビタシンＳ、及びククルビタシンＴからなる群より選択される、〔３〕に記載の組成物。
〔１５〕ククルビタシンが、ククルビタシンＢである、〔３〕又は〔１４〕に記載の組成物。
〔１６〕脂肪組織由来の細胞からの細胞外小胞の分泌を促進するための、〔１〕～〔１５〕のいずれかに記載の組成物。
〔１７〕間葉系幹細胞からの細胞外小胞の分泌を促進するための、〔１〕～〔１６〕のいずれかに記載の組成物。
〔１８〕培地組成物である、〔１〕～〔１７〕のいずれかに記載の組成物。
〔１９〕〔１８〕に記載の組成物を用いる、ｉｎｖｉｔｒｏ又はｅｘｖｉｖｏで細胞からの細胞外小胞の分泌を促進するための方法。
〔２０〕〔１９〕に記載の方法により得られてなる、培養上清。
〔２１〕〔２０〕に記載の培養上清中から得られてなる、細胞外小胞。
〔２２〕〔１〕～〔１８〕のいずれかに記載の組成物を用いる、ｉｎｖｉｔｒｏ又はｅｘｖｉｖｏで細胞外小胞を製造するための方法。
〔２３〕〔１〕～〔１８〕のいずれかに記載の組成物と細胞とを接触させる工程を含む、〔２２〕に記載の方法。

【発明の効果】

【0013】

本発明によれば、細胞外小胞の分泌を促進するための組成物を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1A】試験例１において、実施例１，５の化合物をＵ－８７ＭＧ細胞に添加した際の細胞外小胞の分泌量をＴｉｍ４－ＣＤ９ＥＬＩＳＡ法で評価し、溶媒のみ（ｃｏｎｔｒｏｌ）を添加した際の細胞外小胞の分泌量に対する相対的な分泌量として表した結果を示す。

【図1B】試験例１において、実施例１，５の化合物をＵ－８７ＭＧ細胞に添加した際の細胞外小胞の分泌量をＴｉｍ４－ＣＤ６３ＥＬＩＳＡ法で評価し、溶媒のみ（ｃｏｎｔｒｏｌ）を添加した際の細胞外小胞の分泌量に対する相対的な分泌量として表した結果を示す。

【図2】試験例２において、実施例１，５の化合物をＵ－８７ＭＧ細胞に添加した際の細胞傷害性を、培養上清中のＬＤＨ量で評価した結果を示す。

【図3A】試験例３において、実施例１，５の化合物をヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞に添加した際の細胞外小胞の分泌量をＴｉｍ４－ＣＤ６３ＥＬＩＳＡ法で評価した結果を示す。

【図3B】試験例３において、実施例１～４，６～８の化合物をヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞に添加した際の細胞外小胞の分泌量をＴｉｍ４－ＣＤ６３ＥＬＩＳＡ法で評価した結果を示す。

【図4A】試験例４において、実施例１，５の化合物をヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞に添加した際の細胞傷害性を、培養上清中のＬＤＨ量で評価した結果を示す。

【図4B】試験例４において、実施例１～４，６～８の化合物をヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞に添加した際の細胞傷害性を、培養上清中のＬＤＨ量で評価した結果を示す。

【図5A】試験例５において、実施例１，５の化合物をヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞に添加した際の細胞増殖活性（細胞生存率）を評価した結果を示す。

【図5B】試験例５において、実施例１～４，６～８の化合物をヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞に添加した際の細胞増殖活性（細胞生存率）を評価した結果を示す。

【図6】試験例６において、実施例２，５の化合物をヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞に処置することにより得られたエクソソームを、低酸素処置下のＨ９Ｃ２細胞に添加した際の生細胞数を評価した結果を示す。

【図7A】試験例７において、実施例１～８の化合物をヒト骨髄由来間葉系幹細胞に添加した際の細胞外小胞の分泌量をＴｉｍ４－ＣＤ６３ＥＬＩＳＡ法で評価した結果を示す。

【図7B】試験例７において、実施例１～８の化合物をヒト臍帯マトリックス由来間葉系幹細胞に添加した際の細胞外小胞の分泌量をＴｉｍ４－ＣＤ６３ＥＬＩＳＡ法で評価した結果を示す。

【図7C】試験例８において、実施例１～８の化合物をヒト骨髄由来間葉系幹細胞に添加した際の細胞傷害性を、培養上清中のＬＤＨ量で評価した結果を示す。

【図7D】試験例８において、実施例１～８の化合物をヒト臍帯マトリックス由来間葉系幹細胞に添加した際の細胞傷害性を、培養上清中のＬＤＨ量で評価した結果を示す。

【図7E】試験例９において、実施例１～８の化合物をヒト骨髄由来間葉系幹細胞に添加した際の細胞増殖活性（細胞生存率）を評価した結果を示す。

【図7F】試験例９において、実施例１～８の化合物をヒト臍帯マトリックス由来間葉系幹細胞に添加した際の細胞増殖活性（細胞生存率）を評価した結果を示す。

【図8A】試験例１０において、実施例１，５，９の化合物を２９３細胞に添加した際の細胞外小胞の分泌量をＴｉｍ４－ＣＤ６３ＥＬＩＳＡ法で評価した結果を示す。

【図8B】試験例１０において、実施例１，５，９の化合物を２９３Ｔ細胞に添加した際の細胞外小胞の分泌量をＴｉｍ４－ＣＤ６３ＥＬＩＳＡ法で評価した結果を示す。

【図8C】試験例１０において、実施例１，５，９の化合物を２９３細胞に添加した際の細胞外小胞の分泌量をＴｉｍ４－ＣＤ８１ＥＬＩＳＡ法で評価した結果を示す。

【図8D】試験例１０において、実施例１，５，９の化合物を２９３Ｔ細胞に添加した際の細胞外小胞の分泌量をＴｉｍ４－ＣＤ８１ＥＬＩＳＡ法で評価した結果を示す。

【図8E】試験例１１において、実施例１，５，９の化合物を２９３細胞に添加した際の細胞外小胞の分泌量をナノ粒子解析システムで評価した結果を示す。

【図8F】試験例１１において、実施例１，５，９の化合物を２９３Ｔ細胞に添加した際の細胞外小胞の分泌量をナノ粒子解析システムで評価した結果を示す。

【図8G】試験例１２において、実施例１，５，９の化合物を２９３細胞に添加した際の細胞傷害性を、培養上清中のＬＤＨ量で評価した結果を示す。

【図8H】試験例１２において、実施例１，５，９の化合物を２９３Ｔ細胞に添加した際の細胞傷害性を、培養上清中のＬＤＨ量で評価した結果を示す。

【図8I】試験例１３において、実施例１，５，９の化合物を２９３細胞に添加した際の細胞増殖活性を評価した結果を示す。

【図8J】試験例１３において、実施例１，５，９の化合物を２９３細胞に添加した際の細胞増殖活性を評価した結果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0015】

本発明は、細胞外小胞の分泌を促進するための組成物であって、式Ｉ

【化8】

【化9】

であり、
Ｂは、

【化10】

【0016】

本発明はまた、細胞外小胞の分泌を促進するための、式Ｉの構造を有する化合物、そのラセミ体若しくはその立体異性体、又はその塩、或いは式ＩＩの構造を有する化合物、若しくはその立体異性体、又はその塩、或いは、ククルビタシン、若しくはその立体異性体、又はその塩を提供する。

【0017】

本発明はまた、細胞外小胞の分泌を促進するための組成物を製造するための使用であって、式Ｉの構造を有する化合物、そのラセミ体若しくはその立体異性体、又はその塩、或いは式ＩＩの構造を有する化合物、若しくはその立体異性体、又はその塩、或いは、ククルビタシン、若しくはその立体異性体、又はその塩の、使用を提供する。

【0018】

本発明はまた、細胞外小胞の分泌を促進するための方法であって、それを必要とする被験体に式Ｉの構造を有する化合物、そのラセミ体若しくはその立体異性体、又はその塩、或いは式ＩＩの構造を有する化合物、若しくはその立体異性体、又はその塩、或いは、ククルビタシン、若しくはその立体異性体、又はその塩を投与することを含む、方法を提供する。

【0019】

本明細書中で用いられる「ヒドロキシ」とは、式「－ＯＨ」で表される基を意味する。

【0020】

本明細書中で用いられる「ハロゲン」とは、これらに限定されるものではないが、例えば、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素等を意味する。

【0021】

本明細書中で用いられる「アミノ」とは、式「－ＮＨ_２」で表される基を意味する。

【0022】

本明細書中で用いられる「ニトロ」とは、式「－ＮＯ_２」で表される基を意味する。

【0023】

本明細書中で用いられる「シアノ」とは、式「－ＣＮ」で表される基を意味する。

【0024】

本明細書中で用いられる「Ｃ_１－Ｃ_６アルキル」とは、１～６個の炭素原子を含む飽和の直鎖又は分岐鎖の炭化水素基（これらに限定されるものではないが、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、ｉ－ブチル、ｔ－ブチル、ペンチル、へキシル等を含む）を意味する。好ましいＣ_１－Ｃ_６アルキルは、Ｃ_１－４アルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、イソプロピル等を含む）であり、より好ましくは、メチル、イソプロピルである。

【0025】

本明細書中で用いられる「ヒドロキシ、ハロゲン、アミノ、ニトロ若しくはシアノで置換されていてもよいＣ_１－Ｃ_６アルキル」とは、Ｃ_１－Ｃ_６アルキルの１つ以上の水素原子が、ヒドロキシ、ハロゲン、アミノ、ニトロ又はシアノにより置換されていてもよいし、置換されていなくてもよい基を意味する。

【0026】

本明細書中で用いられる「Ｃ_１－Ｃ_６アルコキシ」とは、式「－Ｏ－Ｃ_１－Ｃ_６アルキル」で表される基を意味する。Ｃ_１－Ｃ_６アルコキシとしては、これらに限定されるものではないが、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、ｔ－ブトキシ等が挙げられ、好ましくは、メトキシである。

【0027】

本明細書中で用いられる「ヒドロキシ、ハロゲン、アミノ、ニトロ若しくはシアノで置換されていてもよいＣ_１－Ｃ_６アルコキシ」とは、Ｃ_１－Ｃ_６アルコキシの１つ以上の水素原子が、ヒドロキシ、ハロゲン、アミノ、ニトロ又はシアノにより置換されていてもよいし、置換されていなくてもよい基を意味する。

【0028】

本明細書中で用いられる「ヒドロキシ、ハロゲン、アミノ、ニトロ、シアノ若しくはフェニルで置換されていてもよいＣ_１－Ｃ_６アルキル」とは、Ｃ_１－Ｃ_６アルキルの１つ以上の水素原子が、ヒドロキシ、ハロゲン、アミノ、ニトロ、シアノ若しくはフェニルにより置換されていてもよいし、置換されていなくてもよい基を意味する。

【0029】

本明細書中で用いられる「Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、ヒドロキシ、ハロゲン、アミノ、ニトロ若しくはシアノで置換されていてもよいＣ_１－Ｃ_６アルキル」とは、Ｃ_１－Ｃ_６アルキルの１つ以上の水素原子が、Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、ヒドロキシ、ハロゲン、アミノ、ニトロ又はシアノにより置換されていてもよいし、置換されていなくてもよい基を意味する。

【0030】

本明細書中の化学構造式中に示される、結合と交差する破線は、該化学構造において破線が接続されている原子の、分子の残部又は分子の断片の残部への結合点を示す。

【0031】

本明細書中で用いられる「ラセミ体」とは、２つのエナンチオマーの等モル混合物であり、光学活性を有しないものを意味する。

【0032】

本明細書中で用いられる「立体異性体」には、エナンチオマー、ジアステレオマー等が包含される。

【0033】

本明細書中で用いられる「塩」とは、これらに限定されるものではないが、例えば、無機酸又は有機酸との酸付加塩、金属との塩、有機塩基との塩等が挙げられる。本明細書中で用いられる「塩」は、好ましくは、薬学的に許容し得る塩である。

【0034】

本明細書中で用いられる「薬学的に許容し得る塩」とは、これらに限定されるものではないが、例えば、無機酸（これらに限定されるものではないが、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、炭酸、リン酸等）又は有機酸（これらに限定されるものではないが、例えば、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、グルコン酸、乳酸、メシル酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、アスパラギン酸、アスコルビン酸、グルタミン酸、アントラニル酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、エンボン酸、フェニル酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、サリチル酸等）との酸付加塩；金属（これらに限定されるものではないが、例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、銅、マンガン等）との塩；アンモニウム塩；有機塩基（これらに限定されるものではないが、例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、２－ジエチルアミノエタノール、トリメタミン、ジシクロへキシルアミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、プロカイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、エチレンジアミン、グルコサミン、メチルグルカミン、テオブロミン、プリン類、ピペラジン、ピペリジン、Ｎ－エチルピペリジン等）との塩等が挙げられる。

【0035】

本明細書中で用いられる「ククルビタシン」としては、これらに限定されるものではないが、例えば、ククルビタシンＡ、ククルビタシンＢ、ククルビタシンＣ、ククルビタシンＤ、ククルビタシンＥ、ククルビタシンＦ、ククルビタシンＧ、ククルビタシンＨ、ククルビタシンＩ、ククルビタシンＪ、ククルビタシンＫ、ククルビタシンＬ、ククルビタシンＭ、ククルビタシンＮ、ククルビタシンＯ、ククルビタシンＰ、ククルビタシンＱ、ククルビタシンＲ、ククルビタシンＳ、ククルビタシンＴ、これらの誘導体（例えば、配糖体、ジヒドロ体、オキソ体、デオキソ体等）等が挙げられる。

【0036】

本明細書中で用いられる「配糖体」とは、糖の水酸基が非糖質化合物と結合してできる化合物をいう。配糖体における糖は、単糖であってもよいし、二糖又はそれ以上の複数の糖であってもよい。配糖体を構成する糖としては、これらに限定されるものではないが、例えば、グルコース、マンノース、ガラクトース、フコース、ラムノース、アラビノース、キシロース等のアルドース、フルクトース等のケトース、グルクロン酸、ガラクツロン酸、マンヌロン酸等のウロン酸、アピオース、ルチノース等が挙げられる。また、配糖体を構成する糖は、Ｄ体、Ｌ体、又はＤ体とＬ体との混合物（ＤＬ体）であってもよい。

【0037】

本明細書中に記載の組成物に含まれる式Ｉの構造を有する化合物、そのラセミ体若しくはその立体異性体、又はその塩、或いは式ＩＩの構造を有する化合物、若しくはその立体異性体、又はその塩、或いは、ククルビタシン、若しくはその立体異性体、又はその塩には、その溶媒和物（例えば、その水和物）、その結晶多形、異性体混合物等も包含される。

【0038】

本明細書中で用いられる「溶媒和物」とは、１つ以上の溶媒分子と、式Ｉの構造を有する化合物、そのラセミ体若しくはその立体異性体、又はその塩、或いは式ＩＩの構造を有する化合物、若しくはその立体異性体、又はその塩、或いは、ククルビタシン、若しくはその立体異性体、又はその塩との会合体、複合体等を意味する。溶媒としては、これらに限定されるものではないが、例えば、水、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ＤＭＳＯ、酢酸、酢酸エチル等が挙げられる。

【0039】

本発明の一実施態様では、式Ｉの構造を有する化合物、そのラセミ体若しくはその立体異性体、又はその塩を含む、本明細書中に記載の組成物を提供する。

【0040】

本発明の一実施態様では、Ｒ_１が、Ｃ_１－Ｃ_６アルキルである、本明細書中に記載の組成物（或いは、化合物、使用、方法）を提供する。

【0041】

本発明の一実施態様では、Ｒ_３が、Ｃ_１－Ｃ_６アルキルである、本明細書中に記載の組成物（或いは、化合物、使用、方法）を提供する。

【0042】

本発明の一実施態様では、Ｒ_１が、Ｃ_１－Ｃ_６アルキルであり、Ｒ_３が、Ｃ_１－Ｃ_６アルキルである、本明細書中に記載の組成物（或いは、化合物、使用、方法）を提供する。

【0043】

本発明の好ましい一実施態様では、Ｒ_１が、イソプロピルである、本明細書中に記載の組成物（或いは、化合物、使用、方法）を提供する。

【0044】

本発明の好ましい一実施態様では、Ｒ_３が、イソプロピルである、本明細書中に記載の組成物（或いは、化合物、使用、方法）を提供する。

【0045】

本発明のより好ましい一実施態様では、Ｒ_１が、イソプロピルであり、Ｒ_３が、イソプロピルである、本明細書中に記載の組成物（或いは、化合物、使用、方法）を提供する。

【0046】

本発明の一実施態様では、Ｒ_２が、－Ｃ（Ｏ）－Ｒ_５である、本明細書中に記載の組成物（或いは、化合物、使用、方法）を提供する。

【0047】

本発明の一実施態様では、Ｒ_４が、－Ｃ（Ｏ）－Ｒ_６である、本明細書中に記載の組成物（或いは、化合物、使用、方法）を提供する。

【0048】

本発明の好ましい一実施態様では、Ｒ_２が、－Ｃ（Ｏ）－Ｒ_５であり、Ｒ_４が、－Ｃ（Ｏ）－Ｒ_６である、本明細書中に記載の組成物（或いは、化合物、使用、方法）を提供する。

【0049】

本発明の一実施態様では、Ｒ_５が、水素である、本明細書中に記載の組成物（或いは、化合物、使用、方法）を提供する。

【0050】

本発明の一実施態様では、Ｒ_６が、水素である、本明細書中に記載の組成物（或いは、化合物、使用、方法）を提供する。

【0051】

本発明の好ましい一実施態様では、Ｒ_５が、水素であり、Ｒ_６が、水素である、本明細書中に記載の組成物（或いは、化合物、使用、方法）を提供する。

【0052】

本発明の一実施態様では、式ＩＩの構造を有する化合物、若しくはその立体異性体、又はその塩を含む、本明細書中に記載の組成物を提供する。

【0053】

本発明の一実施態様では、Ａが、以下：

【化11】

である、本明細書中に記載の組成物（或いは、化合物、使用、方法）を提供する。

【0054】

本発明の一実施態様では、Ｂが、以下：

【化12】

である、本明細書中に記載の組成物（或いは、化合物、使用、方法）を提供する。

【0055】

本発明の好ましい一実施態様では、Ａが、以下：

【化13】

であり、Ｂが、以下：

【化14】

である、本明細書中に記載の組成物（或いは、化合物、使用、方法）を提供する。

【0056】

本発明の好ましい一実施態様では、Ａ－Ｂが、以下：

【化15】

である、本明細書中に記載の組成物（或いは、化合物、使用、方法）を提供する。

【0057】

本発明の一実施態様では、Ａが、以下：

【化16】

である、本明細書中に記載の組成物（或いは、化合物、使用、方法）を提供する。

【0058】

本発明の一実施態様では、Ｂが、以下：

【化17】

である、本明細書中に記載の組成物（或いは、化合物、使用、方法）を提供する。

【0059】

本発明の好ましい一実施態様では、Ａが、以下：

【化18】

であり、Ｂが、以下：

【化19】

である、本明細書中に記載の組成物（或いは、化合物、使用、方法）を提供する。

【0060】

本発明の好ましい一実施態様では、Ａ－Ｂが、以下：

【化20】

である、本明細書中に記載の組成物（或いは、化合物、使用、方法）を提供する。

【0061】

本発明の好ましい一実施態様では、Ａが、以下：

【化21】

であり、Ｂが、以下：

【化22】

である、本明細書中に記載の組成物（或いは、化合物、使用、方法）を提供する。

【0062】

本発明の好ましい一実施態様では、Ａ－Ｂが、以下：

【化23】

である、本明細書中に記載の組成物（或いは、化合物、使用、方法）を提供する。

【0063】

本発明の一実施態様では、Ｒｄが、Ｃ_１－Ｃ_６アルコキシである、本明細書中に記載の組成物（或いは、化合物、使用、方法）を提供する。

【0064】

本発明の好ましい一実施態様では、Ｒｄが、メトキシである、本明細書中に記載の組成物（或いは、化合物、使用、方法）を提供する。

【0065】

本発明の一実施態様では、式Ｉの構造を有する化合物又は式ＩＩの構造を有する化合物が、以下：

【化24-1】

【化24-2】

からなる群より選択される、本明細書中に記載の組成物（或いは、化合物、使用、方法）を提供する。

【0066】

本発明の好ましい一実施態様では、式Ｉの構造を有する化合物又は式ＩＩの構造を有する化合物が、（±）－ゴシポール、（Ｓ）－ゴシポール、（＋）－アポゴシポール、（Ｒ）－（－）－ゴシポール、サブトクラックス、オバトクラックス、プロジギオシン及びウンデシルプロジギオシンからなる群より選択される、本明細書中に記載の組成物（或いは、化合物、使用、方法）を提供する。

【0067】

本発明の一実施態様では、ククルビタシン、若しくはその立体異性体、又はその塩を含む、本明細書中に記載の組成物（或いは、化合物、使用、方法）を提供する。

【0068】

本発明の一実施態様では、ククルビタシンが、ククルビタシンＡ、ククルビタシンＢ、ククルビタシンＣ、ククルビタシンＤ、ククルビタシンＥ、ククルビタシンＦ、ククルビタシンＧ、ククルビタシンＨ、ククルビタシンＩ、ククルビタシンＪ、ククルビタシンＫ、ククルビタシンＬ、ククルビタシンＭ、ククルビタシンＮ、ククルビタシンＯ、ククルビタシンＰ、ククルビタシンＱ、ククルビタシンＲ、ククルビタシンＳ、及びククルビタシンＴからなる群より選択される、本明細書中に記載の組成物（或いは、化合物、使用、方法）を提供する。

【0069】

本発明の好ましい一実施態様では、ククルビタシンが、ククルビタシンＢである、本明細書中に記載の組成物（或いは、化合物、使用、方法）を提供する。

【0070】

式Ｉの構造を有する化合物、そのラセミ体若しくはその立体異性体、又はその塩、或いは式ＩＩの構造を有する化合物、若しくはその立体異性体、又はその塩、或いは、ククルビタシン、若しくはその立体異性体、又はその塩は、市販されているか、或いは公知若しくは周知の方法により又はこれに類似する方法により製造することができる。例えば、これらの化合物は、ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ社から購入することができる。

【0071】

本明細書中で用いられる「細胞外小胞」とは、細胞から分泌される小胞である限り特段限定されるものではないが、例えば、Ｅｘｏｓｏｍｅｓ（エクソソーム）、Ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅｓ（ＭＶ；微小小胞体）、ＡｐｏｐｔｏｔｉｃＢｏｄｉｅｓ（アポトーシス小体）等が挙げられる。

【0072】

本明細書中で用いられる「エクソソーム」とは、エンドサイト－シス・パスウエイに由来する、約２０～約２００ｎｍの小胞を意味する。エクソソームの構成成分としては、例えば、タンパク質、核酸（ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ノン・コーティングＲＮＡ）等が挙げられる。エクソソームは、細胞間コミュニケーションを司る機能を有しうる。エクソソームのマーカー分子としては、例えば、Ａｌｉｘ、Ｔｓｇ１０１、テトラスパニン（ＣＤ８１、ＣＤ６３、ＣＤ９）、ｆｌｏｔｉｌｌｉｎ、フォスファチジルセリン等が挙げられる。

【0073】

本明細書中で用いられる「微小小胞体」とは、細胞質膜に由来する、約５０～約１０００ｎｍの小胞を意味する。微小小胞体の構成成分としては、例えば、タンパク質、核酸（ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ノン・コーティングＲＮＡ等）等が挙げられる。微小小胞体は、細胞間コミュニケーションを司る機能等を有しうる。微小小胞体のマーカー分子としては、例えば、インテグリン、セレクチン、ＣＤ４０、ＣＤ１５４等が挙げられる。

【0074】

本明細書中で用いられる「アポトーシス小体」とは、細胞質膜に由来する、約５００～約２０００ｎｍの小胞を意味する。アポトーシス小体の構成成分としては、例えば、断片化された核、細胞小器官（オルガネラ）等が挙げられる。アポトーシス小体は、ファゴサイトーシスを誘導する機能等を有しうる。アポトーシス小体のマーカー分子としては、例えば、ＡｎｎｅｘｉｎＶ、フォスファチジルセリン等が挙げられる。

【0075】

本発明の一実施態様では、細胞外小胞が、エクソソームである、本明細書中に記載の組成物（或いは、化合物、使用、方法）を提供する。

【0076】

細胞外小胞を分泌する細胞は、細胞外小胞を分泌できる細胞である限り特段限定されるものではないが、例えば、表皮細胞（ケラチノサイト等）、色素細胞（メラノサイト等）、基底細胞、有棘細胞、顆粒細胞、角質細胞、線維芽細胞、肥満細胞等の皮膚細胞；神経幹細胞、神経膠細胞、神経細胞、ミクログリア等の脳細胞；脂肪細胞（白色脂肪細胞、褐色脂肪細胞等を含む）、間葉系幹細胞等の脂肪組織由来の細胞；これら以外の、リンパ球、上皮細胞、内皮細胞、筋肉細胞、神経細胞、線維芽細胞、毛細胞、肝細胞、胃粘膜細胞、腸細胞、脾細胞、膵細胞（膵外分泌細胞等）、肺細胞、腎細胞、間葉系細胞等；組織前駆細胞；造血幹細胞、間葉系幹細胞（骨髄由来のもの、胎盤組織由来のもの、臍帯組織由来のもの、歯髄由来のもの、滑膜由来のもの等を含む）、その他の組織幹細胞（体性幹細胞）；等の動物由来細胞、或いは、柔組織細胞、厚角組織細胞、厚壁組織細胞、木部細胞、師部細胞、表皮細胞等の植物由来細胞が挙げられ、これらは、生体内の細胞であってもよいし、初代培養細胞であっても、継代細胞であっても、株化細胞であってもよく、これらは正常細胞であっても、ガン化又は腫瘍化した細胞を含む病変細胞であってもよい。細胞外小胞を分泌する細胞は、動物由来細胞であることが好ましく、脳細胞、脂肪組織由来の細胞、間葉系幹細胞であることがより好ましく、脂肪組織由来の細胞、間葉系幹細胞であることが更に好ましく、間葉系幹細胞であることがより更に好ましい。

【0077】

本発明の一実施態様では、動物由来細胞からの細胞外小胞の分泌を促進するための、本明細書中に記載の組成物（或いは、化合物、使用、方法）である。

【0078】

本発明の一実施態様では、脳細胞からの細胞外小胞の分泌を促進するための、本明細書中に記載の組成物（或いは、化合物、使用、方法）である。

【0079】

本発明の一実施態様では、脂肪組織由来の細胞からの細胞外小胞の分泌を促進するための、本明細書中に記載の組成物（或いは、化合物、使用、方法）である。

【0080】

本発明の一実施態様では、間葉系幹細胞からの細胞外小胞の分泌を促進するための、本明細書中に記載の組成物（或いは、化合物、使用、方法）である。

【0081】

本発明の組成物（或いは、化合物）は、細胞外小胞の分泌を促進することができるため、細胞外小胞が関与しうる疾患の治療及び／又は予防に使用することができる。

【0082】

細胞外小胞が関与しうる疾患としては、これらに限定されるものではないが、例えば、神経疾患（神経変性疾患、神経障害等を含む）、ガン、心疾患、免疫系疾患、腎臓疾患、線維化疾患、代謝疾患、眼疾患等に加え、創傷、変形性関節症、骨損傷、筋骨格欠損、脱毛症等の細胞外小胞が関与しうるその他の疾患等が挙げられる。

【0083】

本発明の一実施態様では、神経疾患（神経変性疾患、神経障害等を含む）、ガン、心疾患、免疫系疾患、腎臓疾患、線維化疾患、代謝疾患、眼疾患、創傷、変形性関節症、骨損傷、筋骨格欠損又は脱毛症を治療及び／又は予防するための、本明細書中に記載の組成物（或いは、化合物、使用、方法）を提供する。

【0084】

本発明の別の実施態様では、神経疾患（神経変性疾患、神経障害等を含む）、ガン、心疾患、免疫系疾患、腎臓疾患、線維化疾患、代謝疾患、眼疾患、創傷、変形性関節症、骨損傷、筋骨格欠損又は脱毛症を治療及び／又は予防するための医薬を製造するための、本明細書中に記載の化合物の使用を提供する。

【0085】

本発明の別の実施態様では、神経疾患（神経変性疾患、神経障害等を含む）、ガン、心疾患、免疫系疾患、腎臓疾患、線維化疾患、代謝疾患、眼疾患、創傷、変形性関節症、骨損傷、筋骨格欠損又は脱毛症を治療及び／又は予防するための方法であって、それを必要とする被験体に本明細書中に記載の化合物を投与することを含む、方法を提供する。

【0086】

神経変性疾患としては、これらに限定されるものではないが、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、脳萎縮性側索硬化症、脊髄小脳変性症、前頭側頭葉変性症、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、ハンチントン病、ジストニア、プリオン病、多系統委縮症、レビー小体病、ポリグルタミン病等が挙げられる。

【0087】

神経障害としては、これらに限定されるものではないが、例えば、外傷性脳障害、脊髄損傷、脳梗塞による障害等が挙げられる。

【0088】

ガンとしては、何れの固形ガン及び血液ガンが含まれ、これらに限定されるものではないが、例えば、小細胞肺ガン、非小細胞肺ガン、乳ガン、食道ガン、胃ガン、小腸ガン、大腸ガン、結腸ガン、直腸ガン、膵臓ガン、前立腺ガン、骨髄ガン、腎臓ガン（腎細胞ガン等を含む）、副甲状腺ガン、副腎ガン、尿管ガン、肝ガン、胆管ガン、子宮頸ガン、卵巣ガン（例えば、その組織型が、漿液性腺ガン、粘液性腺ガン、明細胞腺ガン等）、精巣ガン、膀胱ガン、外陰部ガン、陰茎ガン、甲状腺ガン、頭頸部ガン、頭蓋咽頭ガン、咽頭ガン、舌ガン、皮膚ガン、メルケル細胞ガン、黒色腫（悪性黒色腫等）、上皮ガン、扁平上皮細胞ガン、基底細胞ガン、小児ガン、原発不明ガン、繊維肉腫、粘膜肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原生肉腫、脊索腫、血管肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、精上皮腫、ウィルムス腫瘍、脳腫瘍、神経膠腫、膠芽腫、星状細胞腫、骨髄芽腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、髄芽腫、網膜芽細胞腫、脊椎腫瘍、悪性リンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫等）、単球性白血病（慢性又は急性）、慢性又は急性リンパ球性白血病、成人Ｔ細胞白血病等が挙げられる。

【0089】

心疾患としては、これらに限定されるものではないが、例えば、心筋梗塞、虚血性心疾患、うっ血性心不全、不整脈、肥大型心筋症、拡張型心筋症、心筋炎、弁膜症等が挙げられる。

【0090】

免疫系疾患としては、これらに限定されるものではないが、例えば、移植片対宿主病（ＧｉｅｂｅｌＢｅｔａｌ．ＳｔｅｍＣｅｌｌＩｎｖｅｓｔｉｇ．２０１７Ｏｃｔ２４；４：８４等を参照）、炎症性腸疾患、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス等が挙げられる。

【0091】

腎臓疾患としては、これらに限定されるものではないが、例えば、急性腎障害、腎炎、慢性腎臓病、糖尿病性腎症、多発性嚢胞等が挙げられる。

【0092】

線維化疾患としては、これらに限定されるものではないが、例えば、肝線維症、肝硬変、肺線維症、特発性肺線維症、腎線維症等が挙げられる。

【0093】

代謝疾患としては、これらに限定されるものではないが、例えば、肥満、糖尿病等が挙げられる。

【0094】

眼疾患としては、これらに限定されるものではないが、例えば、視力障害、近視、加齢黄斑変性症等が挙げられる。

【0095】

本明細書中に記載の組成物（或いは、化合物）は、被験体において細胞外小胞の分泌を促進するために（好ましくは、細胞外小胞が関与しうる疾患を治療又は予防するために）、被験体に直接投与してもよい。

【0096】

細胞外小胞の分泌を促進する対象となる被験体は、これらに限定されるものではないが、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類；ウサギ等のウサギ目；ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の有蹄類；イヌ、ネコ等のネコ目；ヒト、サル、アカゲザル、カニクイザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジー等の霊長類；等の哺乳動物等の動物、或いは植物が挙げられるが、好ましくは動物であり、より好ましくはげっ歯類又は霊長類であり、更に好ましくは霊長類であり、より更に好ましくはヒトである。

【0097】

本明細書中に記載の組成物（或いは、化合物）は、ｉｎｖｉｔｒｏ又はｅｘｖｉｖｏ等で細胞等に接触させてもよい。或いは、ｉｎｖｉｔｒｏ又はｅｘｖｉｖｏ等において、本明細書中に記載の組成物（或いは、化合物）中で細胞を培養してもよい。

【0098】

したがって、本発明の一実施態様では、本明細書中に記載の組成物は、培地組成物である。

【0099】

例えば、本明細書中に記載の組成物を培地組成物として用いる場合、式Ｉの構造を有する化合物、そのラセミ体若しくはその立体異性体、又はその塩、或いは式ＩＩの構造を有する化合物、若しくはその立体異性体、又はその塩、或いは、ククルビタシン、若しくはその立体異性体、又はその塩の他に、本発明の目的を達成できる限り、必要に応じて、例えば、基礎培地や、血清、成長因子、鉄源、ポリアミン、微量金属、糖類、有機酸、アミノ酸及びその誘導体、還元剤、ビタミン及びその誘導体、ステロイド、抗生物質、緩衝剤、無機塩、ｐＨ調整剤、タンパク質（酵素等を含む）、各種の活性化剤・阻害剤等の添加剤を加えることができる。基礎培地や添加剤の添加量は、本発明の目的を達成できる限り特段限定されるものではなく、当業者が適宜選択することができる。

【0100】

基礎培地としては、これらに限定されるものではないが、例えば、ＤＭＥＭ、ＥＭＥＭ、ＩＭＤＭ（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｅｄｉｕｍ）、ＧＭＥＭ（Ｇｌａｓｇｏｗ’ｓＭＥＭ）、ＲＰＭＩ－１６４０、α－ＭＥＭ、Ｈａｍ’ｓｍｅｄｉｕｍＦ－１０、Ｈａｍ’ｓｍｅｄｉｕｍＦ－１２、Ｈａｍ’ｓｍｅｄｉｕｍＦ１２Ｋ、Ｍｅｄｉｕｍ１９９、ＡＴＣＣ－ＣＲＣＭ３０、ＤＭ－１６０、ＤＭ－２０１、ＢＭＥ、Ｆｉｓｃｈｅｒ、ＭｃＣｏｙ’ｓ５Ａ、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓＬ－１５、ＲＩＴＣ８０－７、ＭＣＤＢ１０５、ＭＣＤＢ１０７、ＭＣＤＢ１３１、ＭＣＤＢ１５３、ＭＣＤＢ２０１、ＮＣＴＣ１０９、ＮＣＴＣ１３５、Ｗａｙｍｏｕｔｈ’ｓＭＢ７５２／１、ＣＭＲＬ－１０６６、Ｗｉｌｌｉａｍｓ’ ｍｅｄｉｕｍＥ、Ｂｒｉｎｓｔｅｒ’ｓＢＭＯＣ－３ｍｅｄｉｕｍ、Ｅ８ｍｅｄｉｕｍ（ＮａｔｕｒｅＭｅｔｈｏｄｓ，２０１１，８，４２４－４２９）、ＲｅｐｒｏＦＦ、ＲｅｐｒｏＦＦ２等が挙げられ、これらは単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

【0101】

血清としては、これらに限定されるものではないが、例えば、ウシ胎仔血清、仔ウシ血清、ウマ血清、ヒト血清等の哺乳類動物由来の血清が挙げられ、これらは単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

【0102】

成長因子としては、これらに限定されるものではないが、例えば、インスリン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ－β）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）等が挙げられ、これらは単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

【0103】

鉄源としては、これらに限定されるものではないが、例えば、トランスフェリン、フェリチン、硫酸鉄（ＩＩ）等が挙げられ、これらは単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

【0104】

ポリアミンとしては、これらに限定されるものではないが、例えば、スペルミン、スペルミジン、ノルスペルミン、ノルスペルミジン、ホモスペルミン、ホモスペルミジン、カダベリン、プトレシン、アグマチン、オルニチン等が挙げられ、これらは単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

【0105】

微量金属としては、これらに限定されるものではないが、例えば、マグネシウム、亜鉛、コバルト、スズ、モリブデン、ニッケル、セレン及びその関連物質（亜セレン酸ナトリウム等を含む）等が挙げられ、これらは単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

【0106】

糖類としては、これらに限定されるものではないが、例えば、グルコース、ガラクトース、フルクトース、スクロース等が挙げられ、これらは単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

【0107】

有機酸としては、これらに限定されるものではないが、例えば、ピルビン酸、乳酸、リノレイン酸、リノール酸等が挙げられ、これらは単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

【0108】

アミノ酸及びその誘導体としては、これらに限定されるものではないが、例えば、グリシン、Ｌ－アラニン、Ｌ－セリン、Ｌ－バリン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－リシン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－グルタミン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－メチオニン、Ｌ－システイン、Ｌ－プロリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－チロシン、Ｌ－カルニチン、Ｌ－オルニチン、グルタチオン（還元型を含む）等が挙げられ、これらは単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

【0109】

還元剤としては、これらに限定されるものではないが、例えば、２－メルカプトエタノール、ジチオトレイトール等が挙げられ、これらは単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

【0110】

ビタミン及びその誘導体としては、これらに限定されるものではないが、例えば、ビタミンＡ及びその誘導体（ビタミンＡ酢酸エステル等を含む）、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ及びその誘導体（酢酸ＤＬ－α－トコフェロール等を含む）、ビタミンＫ、ビオチン、葉酸等が挙げられ、これらは単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

【0111】

ステロイドとしては、これらに限定されるものではないが、例えば、β－エストラジオール、プロゲステロン、コルチコステロン等が挙げられ、これらは単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

【0112】

抗生物質としては、これらに限定されるものではないが、例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン等が挙げられ、これらは単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

【0113】

緩衝剤としては、これらに限定されるものではないが、例えば、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、ＨＥＰＥＳ等が挙げられ、これらは単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

【0114】

無機塩としては、これらに限定されるものではないが、例えば、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化カリウム、硫酸銅、硝酸鉄（ＩＩ）、硫酸鉄、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム等が挙げられ、これらは単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

【0115】

ｐＨ調整剤としては、これらに限定されるものではないが、例えば、塩酸、硝酸、リン酸、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸水素ナトリウム等が挙げられ、これらは単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

【0116】

タンパク質（酵素等を含む）としては、これらに限定されるものではないが、例えば、ヒトアルブミン、ウシ血清アルブミン、スーパーオキシドジムスターゼ、カタラーゼ等が挙げられ、これらは単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

【0117】

各種の活性化剤・阻害剤としては、これらに限定されるものではないが、例えば、Ｗｎｔ－３ａ、Ｗｎｔ－５ａ、塩化リチウム、補体分子Ｃ１ｑ等のＷｎｔシグナル活性化剤；Ｙ－２７６３２、Ｋ－１１５（リパスジル塩酸塩水和物）、ＨＡ１０７７（塩酸ファスジル）等のＲｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤；等が挙げられ、これらは単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

【0118】

本発明の別の実施態様では、本明細書中に記載の組成物（好ましくは、培地組成物）（或いは、化合物）を用いる、ｉｎｖｉｔｒｏ又はｅｘｖｉｖｏで細胞からの細胞外小胞の分泌を促進するための方法を提供する。

【0119】

本発明の別の好ましい実施態様では、本明細書中に記載の組成物（好ましくは、培地組成物）（或いは、化合物）を細胞に接触させる工程を含む、ｉｎｖｉｔｒｏ又はｅｘｖｉｖｏで細胞からの細胞外小胞の分泌を促進するための方法を提供する。

【0120】

本明細書中に記載の方法を用いることにより、例えば、培養上清中に細胞から細胞外小胞が分泌されうる。

【0121】

したがって、本発明の別の実施態様では、本明細書中に記載の方法により得られてなる、培養上清を提供する。

【0122】

本明細書中に記載の培養上清には、細胞外小胞が含まれうる。

【0123】

したがって、本発明の別の実施態様では、本明細書中に記載の培養上清から得られてなる、細胞外小胞を提供する。

【0124】

上述したとおり、本明細書中に記載の組成物（或いは、化合物）と共にｉｎｖｉｔｒｏ又はｅｘｖｉｖｏで細胞を培養すると、例えば培養上清中に細胞外小胞が分泌されうる。したがって、本発明の別の実施態様では、本明細書中に記載の組成物（或いは、化合物）を用いる、ｉｎｖｉｔｒｏ又はｅｘｖｉｖｏで細胞外小胞を製造するための方法を提供する。また、本発明の好ましい別の実施態様では、本明細書中に記載の組成物（或いは、化合物）と細胞とを接触させること（好ましくは、本明細書中に記載の組成物（或いは、化合物）と共に細胞を培養すること）を含む、細胞外小胞を製造するための方法を提供する。

【0125】

例えば、培養上清等に細胞外小胞が含まれる場合、該細胞外小胞は、公知又は周知の方法（例えば、遠心分離、限外濾過、抗体を用いた精製、カラムを用いた精製等）により、精製、濃縮、単離等をすることができる。

【0126】

本明細書中に記載の方法により得られた細胞外小胞（又は、これを含む培養上清等）は、神経疾患（神経変性疾患、神経障害等を含む）、ガン、心疾患、免疫系疾患、腎臓疾患、線維化疾患、代謝疾患、眼疾患等に加え、創傷、変形性関節症、骨損傷、筋骨格欠損、脱毛症等の細胞外小胞が関与しうるその他の疾患の治療及び／又は予防に有用でありうる。

【0127】

本発明の一実施態様では、神経疾患（神経変性疾患、神経障害等を含む）、ガン、心疾患、免疫系疾患、腎臓疾患、線維化疾患、代謝疾患、眼疾患、創傷、変形性関節症、骨損傷、筋骨格欠損又は脱毛症を治療及び／又は予防するための、本明細書中に記載の方法により得られた細胞外小胞（又は、これを含む培養上清等）を含む組成物（例えば、医薬組成物）を提供する。

【0128】

本明細書中に記載の組成物は、医薬又は化粧組成物として用いてもよい。また、本明細書中に記載の培養上清は、医薬や化粧用途に用いてもよい。或いは、例えば、公知の方法等により本明細書中に記載の培養上清から細胞外小胞を精製、濃縮、単離等したものや、これを製剤化等したものを医薬や化粧用途に用いてもよい。

【0129】

本明細書中に記載の組成物を例えば医薬又は化粧組成物等として用いる場合、本明細書中に記載の組成物には、これらに限定されるものではないが、例えば、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、ｐＨ調整剤、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤、界面活性剤等の添加剤を含むことができる。

【0130】

また、本明細書中に記載の培養上清、又はこれから細胞外小胞を精製、濃縮、単離等したものを、例えば医薬又は化粧組成物として用いる場合、該培養上清、又はこれから細胞外小胞を精製、濃縮、単離等したものには、これらに限定されるものではないが、例えば、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、ｐＨ調整剤、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤、界面活性剤等の添加剤を添加してもよい。

【0131】

賦形剤としては、これらに限定されるものではないが、例えば、乳糖水和物、白糖、ブドウ糖、デンプン、ショ糖、結晶セルロース、マンニトール等が挙げられ、これらは、単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

【0132】

滑沢剤としては、これらに限定されるものではないが、例えば、軽質無水ケイ酸、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ショ糖脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール、タルク等が挙げられ、これらは、単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

【0133】

結合剤としては、これらに限定されるものではないが、例えば、アラビアゴム、結晶セルロース、白糖、マンニトール、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等が挙げられ、これらは、単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

【0134】

崩壊剤としては、これらに限定されるものではないが、例えば、デンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、クロスカルメロースカルシウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、クロスポビドン、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース等が挙げられ、これらは、単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

【0135】

ｐＨ調整剤としては、これらに限定されるものではないが、例えば、酢酸、乳酸、酒石酸、シュウ酸、グリコール酸、リンゴ酸、クエン酸、コハク酸、フマル酸、リン酸、塩酸、硫酸、硝酸及びこれらの塩、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム等が挙げられ、これらは、単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

【0136】

溶剤としては、これらに限定されるものではないが、例えば、水道水、常水、蒸留水、精製水、注射用水等の水；メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール等のアルコール；アセトン；酢酸、プロパン酸、ブタン酸、ペンタン酸、ヘキサン酸、ヘプタン酸、ミリスチン酸、ステアリン酸、オレイン酸等の単一の脂肪酸又はそのエステル；ゴマ油、ピーナッツ油、ヤシ油、パーム油、大豆油、オリーブ油、ココナッツ油、コーン油、綿実油、ヒマシ油、ナタネ油、ヒマワリ油等の植物性油；プロピレングリコール；マクロゴール等が挙げられ、これらは、単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

【0137】

溶解補助剤としては、これらに限定されるものではないが、例えば、ポリエチレングリコール；プロピレングリコール；シクロデキストリン；マンニトール等の糖アルコール；安息香酸ベンジル；トリスアミノメタン；コレステロール；トリエタノールアミン；炭酸ナトリウム；クエン酸ナトリウム；メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール等のアルコール；酢酸、プロパン酸、ブタン酸、ペンタン酸、ヘキサン酸、ヘプタン酸、ミリスチン酸、ステアリン酸、オレイン酸等の単一の脂肪酸又はそのエステル；ゴマ油、ピーナッツ油、ヤシ油、パーム油、大豆油、オリーブ油、ココナッツ油、コーン油、綿実油、ヒマシ油、ナタネ油、ヒマワリ油等の植物性油等が挙げられ、これらは、単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

【0138】

懸濁化剤としては、これらに限定されるものではないが、例えば、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、モノステアリン酸グリセリン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等が挙げられ、これらは、単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

【0139】

等張化剤としては、これらに限定されるものではないが、例えば、塩化ナトリウム、グリセリン、マンニトール等が挙げられ、これらは、単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

【0140】

緩衝剤としては、これらに限定されるものではないが、例えば、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩等、及びこれらを含有する緩衝液等が挙げられ、これらは、単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

【0141】

無痛化剤としては、これらに限定されるものではないが、例えば、ベンジルアルコール等が挙げられる。

【0142】

防腐剤としては、これらに限定されるものではないが、例えば、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸カルシウム、安息香酸、安息香酸ナトリウム、プロピオン酸、プロピオン酸ナトリウム、プロピオン酸カルシウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、ナタマイシン、ピマリシン、ポリリジン、ナイシン、パラオキシ安息香酸イソプロピル、パラハイドロキシ安息香酸イソプロピル、イソプロピルパラベン等が挙げられ、これらは、単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

【0143】

抗酸化剤としては、これらに限定されるものではないが、例えば、亜硫酸塩、アスコルビン酸等が挙げられ、これらは、単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

【0144】

着色剤としては、これらに限定されるものではないが、例えば、黄色三二酸化鉄、黒色酸化鉄、食用黄色４号、食用赤色３号、タール色素、カラメル、酸化チタン、リボフラビン類等が挙げられ、これらは、単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

【0145】

甘味剤としては、これらに限定されるものではないが、例えば、ショ糖、フルクトース等の糖類；キシリトール、ソルビトール等の糖アルコール；アスパルテーム、アセスルファカリウム、スクラロース等の人工甘味料等が挙げられ、これらは、単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

【0146】

界面活性剤としては、これらに限定されるものではないが、例えば、ポリソルベート類、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油等が挙げられ、これらは、単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

【0147】

本明細書中に記載の組成物、又は本明細書中に記載の培養上清若しくはこれから細胞外小胞を精製、濃縮、単離等したものは、上述した添加剤と共に、自体公知の方法により、例えば、錠剤、被覆錠剤、口腔内崩壊錠、チュアブル剤、丸剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、液剤（例えば、シロップ剤、注射剤、ローション剤等を含む）、懸濁剤、乳剤、ゼリー剤、貼付剤、軟膏剤、クリーム剤、吸入剤、坐剤等に製剤化することができる。これらは、経口剤であってもよいし、非経口剤であってもよい。製剤化されたものは、式Ｉの構造を有する化合物、そのラセミ体若しくはその立体異性体、又はその塩、或いは式ＩＩの構造を有する化合物、若しくはその立体異性体、又はその塩、或いは、ククルビタシン、若しくはその立体異性体、又はその塩、或いは、本明細書中に記載の培養上清又はこれから細胞外小胞を精製、濃縮、単離等したものだけではなく、その目的に応じて、有益な他の成分（例えば、治療上又は化粧上有益な他の成分）を含んでもよい。

【0148】

錠剤の場合であれば、例えば、以下のようにして製剤化することができる。
式Ｉの構造を有する化合物、そのラセミ体若しくはその立体異性体、又はその塩、或いは式ＩＩの構造を有する化合物、若しくはその立体異性体、又はその塩、或いは、ククルビタシン、若しくはその立体異性体、又はその塩、或いは、本明細書中に記載の培養上清又はこれから細胞外小胞を精製、濃縮、単離等したものと、賦形剤、崩壊剤、結合剤等とを混合し、水と共に造粒する。得られた顆粒を乾燥し、該顆粒を必要に応じて粉砕する。そして、これに滑沢剤等を加えて更に混合し、これを圧縮成形することで錠剤を得ることができる。

【0149】

硬カプセル剤の場合であれば、例えば、以下のようにして製剤化することができる。
式Ｉの構造を有する化合物、そのラセミ体若しくはその立体異性体、又はその塩、或いは式ＩＩの構造を有する化合物、若しくはその立体異性体、又はその塩、或いは、ククルビタシン、若しくはその立体異性体、又はその塩、或いは、本明細書中に記載の培養上清又はこれから細胞外小胞を精製、濃縮、単離等したものと、賦形剤等とを混合し、これに滑沢剤等を加え、更に混合する。そして、得られた混合物を硬カプセル（例えば、ゼラチンカプセル等）に充填することで、硬カプセル剤を得ることができる。

【0150】

注射剤であれば、例えば、以下のようにして製剤化することができる。
式Ｉの構造を有する化合物、そのラセミ体若しくはその立体異性体、又はその塩、或いは式ＩＩの構造を有する化合物、若しくはその立体異性体、又はその塩、或いは、ククルビタシン、若しくはその立体異性体、又はその塩、或いは、本明細書中に記載の培養上清又はこれから細胞外小胞を精製、濃縮、単離等したものと、溶解補助剤、水等とを混合し、ここに、ｐＨ調整剤等を加えた後、更に水を加えて所望の容量に調節する。これを、必要に応じて、ろ過、滅菌等することで、注射剤を得ることができる。

【0151】

本明細書中に記載の組成物中又はこれを製剤化したもの中の、式Ｉの構造を有する化合物、そのラセミ体若しくはその立体異性体、又はその塩、或いは式ＩＩの構造を有する化合物、若しくはその立体異性体、又はその塩、或いは、ククルビタシン、若しくはその立体異性体、又はその塩の含有量は、例えば、該組成物又はこれを製剤化したもの全体に対して、約０．０１～約９９．９質量％、好ましくは約０．１～約８０質量％、より好ましくは約１％～約５０質量％であることができる。或いは、本明細書中に記載の組成物中又はこれを製剤化したもの中の、式Ｉの構造を有する化合物、そのラセミ体若しくはその立体異性体、又はその塩、或いは式ＩＩの構造を有する化合物、若しくはその立体異性体、又はその塩、或いは、ククルビタシン、若しくはその立体異性体、又はその塩の含有量は、例えば、該組成物又はこれを製剤化したもの全体に対して、約０．００１～約１０００μｍｏｌ、好ましくは約０．０１～約１００μｍｏｌ、より好ましくは約０．１～約５０μｍｏｌであることができる。

【0152】

本明細書中に記載の培養上清若しくはこれから細胞外小胞を精製、濃縮、単離等したもの、或いはこれを製剤化したもの中の細胞外小胞の含有量は、例えば、本明細書中に記載の培養上清若しくはこれから細胞外小胞を精製、濃縮、単離等したもの、或いはこれらを製剤化したもの全体に対して、約０．０１～約９９．９質量％、好ましくは約０．１～約８０質量％、より好ましくは約１～約５０質量％であることができる。

【0153】

本明細書中に記載の組成物又はこれを製剤化したものの投与量は、投与する被験体の性別、年齢、体重、健康状態、病状の程度若しくは食事；投与時間；投与方法；他の薬物との組み合わせ；その他の要因を考慮して適宜決定することができる。
本明細書中に記載の組成物又はこれを製剤化したものの投与量は、特段限定されるものではないが、例えば、式Ｉの構造を有する化合物、そのラセミ体若しくはその立体異性体、又はその塩、或いは式ＩＩの構造を有する化合物、若しくはその立体異性体、又はその塩、或いは、ククルビタシン、若しくはその立体異性体、又はその塩として、一日当たり約０．０１～約１０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．０５～約５ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約０．１～約１ｍｇ／ｋｇ体重であることができる。これらは、単回投与してもよいし、２回以上に分けて投与してもよい。但し、必要に応じて、上述した投与量の範囲を超えてもよい。
投与スケジュールとしては、投与する被験体の性別、年齢、体重、健康状態、病状の程度若しくは食事；投与時間；投与方法；他の薬物との組み合わせ；その他の要因を考慮して決定することができるが、例えば、毎日、二日に１回、三日に１回、一週に１回、一月に１回、三月に１回、六月に１回等が挙げられる。

【0154】

本明細書中に記載の培養上清若しくはこれから細胞外小胞を精製、濃縮、単離等したもの又はこれを製剤化したものの投与量は、投与する被験体の性別、年齢、体重、健康状態、病状の程度若しくは食事；投与時間；投与方法；他の薬物との組み合わせ；その他の要因を考慮して適宜決定することができる。
本明細書中に記載の培養上清若しくはこれから細胞外小胞を精製、濃縮、単離等したもの又はこれを製剤化したものの投与量は、特段限定されるものではない。これらは、単回投与してもよいし、２回以上に分けて投与してもよい。
投与スケジュールとしては、投与する被験体の性別、年齢、体重、健康状態、病状の程度若しくは食事；投与時間；投与方法；他の薬物との組み合わせ；その他の要因を考慮して決定することができるが、例えば、毎日、二日に１回、三日に１回、一週に１回、一月に１回、三月に１回、六月に１回等が挙げられる。

【実施例】

【0155】

以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、これら実施例は、本発明の範囲を何ら限定するものではない。

【0156】

［実施例１］（±）－ゴシポール酢酸塩

【化25】

実施例１の化合物は、ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ社製のもの（商品コード：ＨＹ－１７５１０、ＣＡＳ登録番号：１２５４２－３６－８）を用いた。

【0157】

［実施例２］（Ｓ）－ゴシポール酢酸塩

【化26】

実施例２の化合物は、ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ社製のもの（商品コード：ＨＹ－１５４６Ｄ、ＣＡＳ登録番号：１１８９５６１－６６－７）を用いた。

【0158】

［実施例３］（＋）－アポゴシポール

【化27】

実施例３の化合物は、ＡｐｅｘＢｉｏ社製のもの（商品コード：Ｂ４９０２、ＣＡＳ登録番号：６６３８９－７４－０）を用いた。

【0159】

［実施例４］（Ｒ）－（－）－ゴシポール

【化28】

実施例４の化合物は、Ｓｉｇｍａ社製のもの（商品コード：ＳＭＬ０４３３、ＣＡＳ登録番号：９０１４１－２２－３）を用いた。

【0160】

［実施例８］サブトクラックス

【化29】

実施例８の化合物は、ＡｐｅｘＢｉｏ社製のもの（商品コード：Ａ４１９９、ＣＡＳ登録番号：１２２８１０８－６５－３）を用いた。

【0161】

［実施例５］オバトクラックスメシル酸塩

【化30】

実施例５の化合物は、Ｓａｎｔａｃｒｕｚ社製のもの（商品コード：ｓｃ－３６４２２１、ＣＡＳ登録番号：８０３７１２－７９－０）を用いた。

【0162】

［実施例６］プロジギオシン塩酸塩

【化31】

実施例６の化合物は、Ｓｉｇｍａ社製のもの（商品コード：Ｐ０１０３、ＣＡＳ登録番号：５６１４４－１７－３）を用いた。

【0163】

［実施例７］ウンデシルプロジギオシン塩酸塩

【化32】

実施例７の化合物は、Ｓｉｇｍａ社製のもの（商品コード：ＳＭＬ１５７６、ＣＡＳ登録番号：５６２４７－０２－０）を用いた。

【0164】

［実施例９］ククルビタシンＢ

【化33】

実施例９の化合物は、ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ社製のもの（商品コード：ＨＹ－Ｎ０４１６、ＣＡＳ登録番号：６１９９－６７－３）を用いた。

【0165】

［試験例１：細胞外小胞の分泌促進の評価１］
＜培養上清の調製＞
１０ｍＬの非働化処理ＦＢＳと２ｍＬの５０％（ｗ／ｖ％）Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）１０，０００溶液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製、＃８１２８０）を４℃、２時間撹拌した後に、１５００×ｇ、４℃、３０分間の遠心条件で細胞外小胞を沈殿させ、上清を回収することで、Ｅｘｏｓｏｍｅ－ｆｒｅｅＦＢＳを調製した。次に、Ｕ－８７ＭＧ細胞（ＡＴＣＣ社製、ＨＴＢ－１４ＴＭ）を、０．０３％（ｗ／ｖ％）ＳｐｈｅｒｅＭａｘ（商標）（日産化学社製）（国際公開第２０１６／１６７３７３号の試験例１０に記載の低分子寒天含有培地組成物）及び２％（ｖ／ｖ％）Ｅｘｏｓｏｍｅ－ｆｒｅｅＦＢＳを含有するＡｄｖａｎｃｅｄＤＭＥＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、＃１２４９１０１５）中で２×１０^４ｃｅｌｌｓ／８１μＬに懸濁し、超低接着表面３８４ウェル黒クリアボトムプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、＃３８２７）に播種した。播種したＵ－８７ＭＧ細胞に、ＡｄｖａｎｃｅｄＤＭＥＭ（２％（ｖ／ｖ％）Ｅｘｏｓｏｍｅ－ｆｒｅｅＦＢＳを含有）中に調製した実施例１，５の化合物溶液９μＬ（終濃度；実施例１：１０μＭ、実施例５：５μＭ）を添加し、２４時間培養した。その後、プレートを１２００×ｇ、４℃、１時間の遠心条件で遠心することで細胞を沈殿させ、培養上清を回収した。培養上清中に含まれる細胞外小胞の検出には、後述するＴｉｍ４－ＣＤ６３ＥＬＩＳＡ法又はＴｉｍ４－ＣＤ９ＥＬＩＳＡ法を用いた。
結果を図１Ａ及び図１Ｂに示す。
＜Ｔｉｍ４－ＣＤ６３ＥＬＩＳＡ法＞
ＣａｒｂｏｎａｔｅＢｕｆｆｅｒ（７１．４ｍＭＮａＨＣＯ_３、及び２８．６ｍＭＮａ_２ＣＯ_３を含有する溶液）中に調製した１μｇ／ｍＬＴｉｍ４タンパク質を３８４ウェルプレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、＃４６４７１８）に添加し、固相化した。３８４ウェルプレートを０．０５％（ｖ／ｖ％）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＴＢＳ（Ｔｒｉｓ－ＢｕｆｆｅｒＳａｌｉｎｅ）溶液（以下、「ＴＢＳＴ溶液」と称することもある。）で洗浄した後に、１％（ｗ／ｖ％）ＢＳＡを含有するＴＢＳＴ溶液５０μＬ／ｗｅｌｌを添加して１時間のブロッキング処理を行った。次に、上記で回収した培養上清３０μＬをウェルに添加し、更に８ｍＭＣａＣｌ_２溶液１０μＬを添加することでＴｉｍ４タンパク質に細胞外小胞を結合させた。この際、比較対象として、化合物未処置の培養上清（溶媒のみ、ｃｏｎｔｒｏｌ）を同様にＴｉｍ４タンパク質固相化プレートに添加した。続いて、２ｍＭＣａＣｌ_２を含有するＴＢＳＴ溶液で希釈した１μｇ／ｍＬＡｎｔｉ－ｈｕｍａｎＣＤ６３Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製、＃３５３０１４）３０μＬ／ｗｅｌｌを添加し、１時間反応させた。２ｍＭＣａＣｌ_２を含有するＴＢＳＴ溶液５０μＬ／ｗｅｌｌを添加し、その後、ＴＢＳＴ溶液を除去した。この操作を３回繰り返した後、２ｍＭＣａＣｌ_２を含有するＴＢＳＴ溶液で希釈した８０ｎｇ／ｍＬＨＲＰ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄＡｎｔｉ－ｍｏｕｓｅＩｇＧ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製、＃４０５３０６）３０μＬ／ｗｅｌｌを添加し、１時間反応させた。最後に、ＴＭＢ溶液（ナカライテスク社製、＃０５２９８－８０）３０μＬ／ｗｅｌｌを添加し、３０分間反応させた後、１ＭＨ_２ＳＯ_４溶液３０μＬ／ｗｅｌｌを添加することで反応を停止させ、４５０ｎｍの吸光度を測定することにより細胞外小胞量を定量した。化合物未処置群（ｃｏｎｔｒｏｌ）を１とした際の相対値を算出した。
＜Ｔｉｍ４－ＣＤ９ＥＬＩＳＡ法＞
Ｔｉｍ４－ＣＤ９ＥＬＩＳＡ法は、上述したＴｉｍ４－ＣＤ６３ＥＬＩＳＡ法において、１μｇ／ｍＬＡｎｔｉ－ｈｕｍａｎＣＤ６３Ａｎｔｉｂｏｄｙを０．５μｇ／ｍＬＡｎｔｉ－ｈｕｍａｎＣＤ９Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製、＃３１２１０２）に置き換えた以外、同様の方法で行った。

【0166】

［試験例２：細胞傷害性の評価１］
１０ｍＬの非働化処理ＦＢＳと２ｍＬの５０％（ｗ／ｖ％）Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）１０，０００溶液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製、＃８１２８０）を４℃、２時間撹拌した後に、１５００×ｇ、４℃、３０分間の遠心条件で細胞外小胞を沈殿させ、上清を回収することで、Ｅｘｏｓｏｍｅ－ｆｒｅｅＦＢＳを調製した。Ｕ－８７ＭＧ細胞（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ－１４ＴＭ）を、ＳｐｈｅｒｅＭａｘ（商標）（日産化学社製）（国際公開第２０１６／１６７３７３号の試験例１０に記載の低分子寒天含有培地組成物）を０．０３％（ｗ／ｖ％）含有させた２％（ｖ／ｖ％）Ｅｘｏｓｏｍｅ－ｆｒｅｅＦＢＳ含有ＡｄｖａｎｃｅｄＤＭＥＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、＃１２４９１０１５）中で２×１０^４ｃｅｌｌｓ／８１μＬに懸濁し、超低接着表面３８４ウェル黒クリアボトムプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、＃３８２７）に播種した。播種したＵ－８７ＭＧ細胞にＡｄｖａｎｃｅｄＤＭＥＭ（２％（ｖ／ｖ％）Ｅｘｏｓｏｍｅ－ｆｒｅｅＦＢＳを含有）中に調製した実施例１，５の化合物溶液９μＬ（終濃度；実施例１：１０μＭ、実施例５：５μＭ）を添加し、２４時間培養した。２４時間後、プレートを１２００×ｇ、４℃、１時間の遠心条件で細胞を沈殿させ、２０μＬの培養上清を３８４ウェルマイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒｂｉｏ－ｏｎｅ社製、＃７８１１０１）に移した。培養上清中に含まれる乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の活性は、ＣｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙＬＤＨＡｓｓａｙＫｉｔ－ＷＳＴ（同仁化学研究所社製、＃ＣＫ１２）を用いて測定した。５００ｔｅｓｔｓ分のＤｙｅＭｉｘｔｕｒｅに５ｍＬのＡｓｓａｙＢｕｆｆｅｒを加えて溶解し、ＷｏｒｋｉｎｇＳｏｌｕｔｉｏｎを調製した。２０μＬの培養上清を移した３８４ウェルマイクロプレートに２０μＬのＷｏｒｋｉｎｇＳｏｌｕｔｉｏｎを添加し、よく混和した後に、室温で３０分間呈色反応を行った。１０μＬのＳｔｏｐＳｏｌｕｔｉｏｎを添加することで反応を停止させ、４９０ｎｍの吸光度を測定することで細胞傷害性を評価した。死細胞群（培養上清回収の１５分前に、化合物未処置細胞に９μＬのＬｙｓｉｓＢｕｆｆｅｒを添加したサンプル（Ｌｙｓｅｄｃｅｌｌｓ））及び化合物を添加せずに培養した際の培養上清も同様にＬＤＨの活性を測定し、ポジティブコントロール（Ｌｙｓｅｄｃｅｌｌｓ）の測定値を１００％の細胞傷害性として、化合物による細胞傷害性を評価した。
結果を図２に示す。

【0167】

［試験例３：細胞外小胞の分泌促進の評価２］
＜培養液の調製＞
ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞（タカラバイオ社製、＃Ｃ－１２９７７）を８×１０^４ｃｅｌｌｓ／１．８ｍＬとなるように間葉系幹細胞増殖培地２（タカラバイオ社製、Ｃ－２８００９）中に懸濁し、６ウェル細胞培養処理プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、３５１６）に播種した。播種したヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞に、間葉系幹細胞増殖培地２で１０倍濃度に希釈した実施例１～８の化合物溶液、又は間葉系幹細胞増殖培地２のみ（ｃｏｎｔｒｏｌ）を２００μＬ添加し、２４時間培養した後、培養液を回収した。続いて、回収した培養液を２００００×ｇ、４℃、６０分間遠心することで、細胞断片及びＬａｒｇｅＥｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒＶｅｓｉｃｌｅｓを除いた培養液を調製した。細胞外小胞の検出には、ＰＳＣａｐｔｕｒｅ（商標）エクソソームＥＬＩＳＡキット（抗マウスＩｇＧＰＯＤ）（富士フイルム和光純薬社製、＃２９７－７９２０１）を用いた。
＜ＰＳＣａｐｔｕｒｅ（商標）エクソソームＥＬＩＳＡキットによる検出＞
Ｒｅａｃｔｉｏｎ／ＷａｓｈｉｎｇＢｕｆｆｅｒ（１０×）を精製水で１０倍希釈したものに１００分の１量のＥｘｏｓｏｍｅＢｉｎｄｉｎｇＥｎｈａｎｃｅｒ（１００×）を添加し、反応／洗浄液（１×）を調製した。上記で調製した培養液は、反応／洗浄液（１×）で５倍に希釈した。ＥｘｏｓｏｍｅＣａｐｔｕｒｅ９６ウェルプレートを３００μＬの反応／洗浄液（１×）で３回洗浄した後、５倍希釈した各培養液、又は細胞を培養していない間葉系幹細胞増殖培地２のみを各ウェルに添加し、マイクロプレート振とう器で振とうしながら、室温で２時間反応させた。反応終了後に反応液を捨て、各ウェルを３００μＬの反応／洗浄液（１×）で３回洗浄した後、反応／洗浄液（１×）で１０００倍希釈したＣｏｎｔｒｏｌＰｒｉｍａｒｙＡｎｔｉｂｏｄｙＡｎｔｉ－ＣＤ６３（×１００）を１００μＬ添加し、マイクロプレート振とう器で振とうしながら、室温で１時間反応させた。反応終了後に反応液を捨て、各ウェルを３００μＬの反応／洗浄液（１×）で３回洗浄した後、反応／洗浄液（１×）で１０００倍希釈したＳｅｃｏｎｄａｒｙＡｎｔｉｂｏｄｙＨＲＰ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄＡｎｔｉ－ｍｏｕｓｅＩｇＧ（１００×）を１００μＬ添加し、マイクロプレート振とう器で振とうしながら、室温で１時間反応させた。反応終了後に反応液を捨て、各ウェルを３００μＬの反応／洗浄液（１×）で５回洗浄した後、ＴＭＢＳｏｌｕｔｉｏｎを１００μＬ添加し、マイクロプレート振とう器で１分間振とうした後に、室温で３０分間反応させた。反応終了後、ＳｔｏｐＳｏｌｕｔｉｏｎを１００μＬ添加し、マイクロプレート振とう器で５秒間振とうした後、Ｅｎｓｐｉｒｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）で４５０ｎｍ及び６２０ｎｍの吸光度を測定し、各ウェルについて、４５０ｎｍにおける吸光度から６２０ｎｍにおける吸光度を減算した。
結果を、表１及び表２、並びに図３Ａ及び図３Ｂに示す。

【0168】

【表1】

【0169】

【表2】

【0170】

［試験例４：細胞傷害性の評価２］
ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞（タカラバイオ社製、＃Ｃ－１２９７７）を８×１０^４ｃｅｌｌｓ／１．８ｍＬとなるように間葉系幹細胞増殖培地２（タカラバイオ社製、Ｃ－２８００９）中に懸濁し、６ウェル細胞培養処理プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、３５１６）に播種した。播種したヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞に、間葉系幹細胞増殖培地２で１０倍濃度に希釈した実施例１～８の化合物溶液、又は間葉系幹細胞増殖培地２のみ（ｃｏｎｔｒｏｌ）を２００μＬ添加し、２４時間培養後、培養液を回収した。回収した培養液中に含まれる乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の活性は、ＬＤＨＣｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙＤｅｔｅｃｔｉｏｎＫｉｔ（タカラバイオ社製、ＭＫ４０１）を用いて以下のように測定した。ＳｏｌｕｔｉｏｎＡの凍結乾燥品に精製水１ｍＬを添加して完全に溶解させた後、２５０μＬのＳｏｌｕｔｉｏｎＡと１１．２５ｍＬのＳｏｌｕｔｉｏｎＢを混合し、ＳｏｌｕｔｉｏｎＣを調製した。回収した培養液１００μＬにＳｏｌｕｔｉｏｎＣを１００μＬ添加し、室温で３０分間反応させた。Ｅｎｓｐｉｒｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を用いて、４９０ｎｍの吸光度を測定した。
結果を、表３及び表４、並びに図４Ａ及び図４Ｂに示す。

【0171】

【表3】

【0172】

【表4】

【0173】

［試験例５：細胞増殖活性の評価１］
ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞（タカラバイオ社製、＃Ｃ－１２９７７）を２×１０^３ｃｅｌｌｓ／９０μＬとなるように間葉系幹細胞増殖培地２（タカラバイオ社製、Ｃ－２８００９）中に懸濁し、９６ウェル細胞培養処理プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、３５８５）に播種した。播種したヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞に、間葉系幹細胞増殖培地２で１０倍濃度に希釈した実施例１～８の化合物溶液、又は間葉系幹細胞増殖培地２のみ（ｃｏｎｔｒｏｌ）を１０μＬ添加し、２４時間培養した。続いて、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）ＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔＣｅｌｌＶｉａｂｉｌｉｔｙＡｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、Ｇ７５７０）を用いて、以下のように生細胞数の測定を行った。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（商標）ＢｕｆｆｅｒにＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（商標）Ｓｕｂｓｔｒａｔｅを溶解させた溶液１００μＬ／ウェルを、上記９６ウェル細胞培養処理プレートの各ウェルに添加した後、１００μＬを９６ウェル細胞培養処理白色プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、３５６７０１）に移し、Ｅｎｓｐｉｒｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）で発光度を測定した。
結果を、表５及び表６、並びに図５Ａ及び図５Ｂに示す。

【0174】

【表5】

【0175】

【表6】

【0176】

［試験例６：細胞外小胞の薬理評価（低酸素処理下の細胞に対する薬理評価）］
＜ヒト脂肪組織由来間葉系細胞に由来する細胞外小胞の調製＞
ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞（タカラバイオ社製、＃Ｃ－１２９７７）を４×１０^５ｃｅｌｌｓ／１０ｍＬとなるように間葉系幹細胞増殖培地２（タカラバイオ社製、Ｃ－２８００９）に懸濁し、１００ｍｍ細胞培養表面処理済みディッシュ（コーニング社製、＃４３０１６７）に播種して、３７℃、５％ＣＯ_２下で４日間培養した。４日後にＰＢＳ（－）（富士フイルム和光純薬社製、＃１６６－２３５５５）で洗浄後、実施例２及び５の化合物を終濃度がそれぞれ２μＭ及び５０ｎＭとなるようにＤ－ＭＥＭ（低グルコース）（Ｌ-グルタミン、フェノールレッド含有）（富士フイルム和光純薬社製、＃０４１－２９７７５）培地中に調製し、これを１０ｍＬ添加して更に２日間培養した。対照として、ジメチルスルホキシドを同濃度含有するＤ－ＭＥＭ（低グルコース）（Ｌ-グルタミン、フェノールレッド含有）培地も調製し、添加したものも用意した。２日後に、それぞれの培養上清を回収した。細胞外小胞の精製にはＣａｐｔｕｒｅｍ（商標）ＥｘｏｓｏｍｅＩｓｏｌａｔｉｏｎＫｉｔ（ＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅ）（タカラバイオ社製、＃６３５７２３）を用いた。回収した培養上清を５０ｍＬの遠沈管に移した後、２０００×ｇで１０分間遠心した。続いて、ＥｘｏｓｏｍｅＩｓｏｌａｔｉｏｎＰｒｅ－ＣｌｅａｎｉｎｇＣｏｌｕｍｎに培養上清を移し、１０００×ｇで４分間遠心した。遠心後の培養上清をＣａｐｔｕｒｅｍＭａｘｉｐｒｅｐＥｘｏｓｏｍｅＩｓｏｌａｔｉｏｎＣｏｌｕｍｎに移し、１０００×ｇで４分間遠心した。遠心後、ＥｘｏｓｏｍｅＩｓｏｌａｔｉｏｎＣｏｌｕｍｎを新しい５０ｍＬ遠沈管に移し、１０ｍＬのＥｘｏｓｏｍｅＩｓｏｌａｔｉｏｎＷａｓｈＢｕｆｆｅｒを添加して１０００×ｇで２分間遠心した。最後にＥｘｏｓｏｍｅＩｓｏｌａｔｉｏｎＣｏｌｕｍｎを新しい５０ｍＬ遠沈管に移し、５００μＬのＥｘｏｓｏｍｅＩｓｏｌａｔｉｏｎＥｌｕｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒを添加して、１０００×ｇで２分間遠心した。回収した細胞外小胞溶液を、アミコンウルトラ（ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ）－０．５、ＰＬＧＣウルトラセル（Ｕｌｔｒａｃｅｌ）－１０メンブレン、１０ｋＤａを用いてＰＢＳ（－）に置換した。回収した細胞外小胞溶液中に含まれる細胞外小胞の検出には、ＰＳＣａｐｔｕｒｅ（商標）エクソソームＥＬＩＳＡキット（抗マウスＩｇＧＰＯＤ）（富士フイルム和光純薬社製、＃２９７－７９２０１）を用いた。
結果を、表７に示す。
＜ＰＳＣａｐｔｕｒｅ（商標）エクソソームＥＬＩＳＡキット＞
Ｒｅａｃｔｉｏｎ／ＷａｓｈｉｎｇＢｕｆｆｅｒ（１０×）を精製水で１０倍に希釈して調製したＲｅａｃｔｉｏｎ／ＷａｓｈｉｎｇＢｕｆｆｅｒ（１×）に、１００分の１量のＥｘｏｓｏｍｅＢｉｎｄｉｎｇＥｎｈａｎｃｅｒ（１００×）を添加することにより、反応／洗浄液（１×）を調製した。各細胞外小胞溶液を、反応／洗浄液（１×）で４００倍に希釈した。ＥｘｏｓｏｍｅＣａｐｔｕｒｅ９６ウェルプレートを３００μＬの反応／洗浄液（１×）で３回洗浄した後、５倍希釈した各細胞外小胞溶液、又は細胞を培養していない間葉系幹細胞増殖培地２（ネガティブコントロール）を各ウェルに添加し、マイクロプレート振とう器で振とうさせながら室温で２時間反応させた。反応終了後に反応液を捨て、各ウェルを３００μＬの反応／洗浄液（１×）で３回洗浄した後、反応／洗浄液（１×）で１０００倍希釈したＣｏｎｔｒｏｌＰｒｉｍａｒｙＡｎｔｉｂｏｄｙＡｎｔｉ－ＣＤ６３（×１００）を１００μＬ添加し、マイクロプレート振とう器で振とうさせながら室温で１時間反応させた。反応終了後に反応液を捨て、各ウェルを３００μＬの反応／洗浄液（１×）で３回洗浄した後、反応／洗浄液（１×）で１０００倍希釈したＳｅｃｏｎｄａｒｙＡｎｔｉｂｏｄｙＨＲＰ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄＡｎｔｉ－ｍｏｕｓｅＩｇＧ（１００×）を１００μＬ添加し、マイクロプレート振とう器で振とうさせながら室温で１時間反応させた。反応終了後に反応液を捨て、各ウェルを３００μＬの反応／洗浄液（１×）で５回洗浄した後、ＴＭＢＳｏｌｕｔｉｏｎを１００μＬ添加し、マイクロプレート振とう器で１分間振とうさせた後に室温で３０分間反応させた。反応終了後、ＳｔｏｐＳｏｌｕｔｉｏｎを１００μＬ添加し、マイクロプレート振とう器で５秒間振とうさせた後、Ｅｎｓｐｉｒｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）で４５０ｎｍ及び６２０ｎｍの吸光度を測定した。得られた測定値をもとに、４５０ｎｍの吸光度から６２０ｎｍの吸光度を差し引いた値（ΔＡｂｓ）を算出した。

【0177】

【表7】

【0178】

＜生細胞数の評価＞
Ｈ９Ｃ２細胞（ＡＴＣＣ社製、＃ＣＲＬ－１４４６）を、１０％ｅｘｏｓｏｍｅｄｅｐｌｅｔｅｄＦＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、＃Ａ２７２０８０３）含有Ｄ－ＭＥＭ（高グルコース）（Ｌ－グルタミン、フェノールレッド、ピルビン酸ナトリウム含有）で５００００ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁し、９６ウェル透明平底細胞培養表面処理プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、＃３５８５）に１００μＬ／ウェルで播種し、３７℃、５％ＣＯ_２下で１日間培養した。１日後、Ｄ－ＭＥＭ（高グルコース）（Ｌ－グルタミン、フェノールレッド、ピルビン酸ナトリウム含有）で調製した１Ｍ塩化コバルト溶液（富士フイルム和光純薬社製、＃０３６－０３６８２）を終濃度が１ｍＭとなるように５０μＬ／ウェルで添加し、更に３７℃、５％ＣＯ_２下で１日培養した（ｄａｙ２）。１日後に培地を除去し、新鮮培地１５０μＬ、又は新鮮培地１００μＬと上記で調製した各細胞外小胞溶液５０μＬとを混合したものを添加し、４日間培養した（ｄａｙ６）。４日後、細胞生存率を測定するために、ＡＴＰ試薬１５０μＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）ＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔＣｅｌｌＶｉａｂｉｌｉｔｙＡｓｓａｙ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を各ウェルに添加して混合した後、１０分間静置した。１０分後に各ウェルから１００μＬを測定用のプレートに移し、Ｅｎｓｐｉｒｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定した。各測定値から培地のみの発光値を差し引くことで、生細胞の数を測定した。
結果を、表８及び図６に示す。

【0179】

【表8】

【0180】

［試験例７：細胞外小胞の分泌促進の評価３］
＜培養液の調製＞
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞又はヒト臍帯マトリックス由来間葉系幹細胞（タカラバイオ社製、＃Ｃ－１２９７４、＃Ｃ－１２９７１）を８×１０^４ｃｅｌｌｓ／１．８ｍＬとなるように間葉系幹細胞増殖培地２（タカラバイオ社製、Ｃ－２８００９）に懸濁し、６ウェル細胞培養処理プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、３５１６）に播種した。播種した間葉系幹細胞に、間葉系幹細胞増殖培地２で１０倍濃度に希釈した実施例１～８の化合物を２００μＬ添加し、２４時間培養した後に培養液を回収した。続いて、回収した培養液を２００００×ｇ、４℃、６０分間遠心し、細胞断片及びＬａｒｇｅＥｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒＶｅｓｉｃｌｅｓを除いた培養液を調製した。細胞外小胞の検出には、ＰＳＣａｐｔｕｒｅ（商標）エクソソームＥＬＩＳＡキット（抗マウスＩｇＧＰＯＤ）（富士フイルム和光純薬社製、＃２９７－７９２０１）を用いた。
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞の結果を表９及び図７Ａに、ヒト臍帯マトリックス由来間葉系幹細胞の結果を表１０及び図７Ｂに示す。
＜ＰＳＣａｐｔｕｒｅ（商標）エクソソームＥＬＩＳＡキット＞
Ｒｅａｃｔｉｏｎ／ＷａｓｈｉｎｇＢｕｆｆｅｒ（１０×）を精製水で１０倍に希釈して調製したＲｅａｃｔｉｏｎ／ＷａｓｈｉｎｇＢｕｆｆｅｒ（１×）に１００分の１量のＥｘｏｓｏｍｅＢｉｎｄｉｎｇＥｎｈａｎｃｅｒ（１００×）を添加することにより、反応／洗浄液（１×）を調製した。各培養液を、反応／洗浄液（１×）で５倍に希釈した。ＥｘｏｓｏｍｅＣａｐｔｕｒｅ９６ウェルプレートを３００μＬの反応／洗浄液（１×）で３回洗浄した後、５倍希釈した各培養液、又は細胞を培養していない間葉系幹細胞増殖培地２（ネガティブコントロール）を各ウェルに添加し、マイクロプレート振とう器で振とうさせながら室温で２時間反応させた。反応終了後に反応液を捨て、各ウェルを３００μＬの反応／洗浄液（１×）で３回洗浄した後、反応／洗浄液（１×）で１０００倍希釈したＣｏｎｔｒｏｌＰｒｉｍａｒｙＡｎｔｉｂｏｄｙＡｎｔｉ－ＣＤ６３（×１００）を１００μＬ添加し、マイクロプレート振とう器で振とうさせながら室温で１時間反応させた。反応終了後に反応液を捨て、各ウェルを３００μＬの反応／洗浄液（１×）で３回洗浄した後、反応／洗浄液（１×）で１０００倍希釈したＳｅｃｏｎｄａｒｙＡｎｔｉｂｏｄｙＨＲＰ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄＡｎｔｉ－ｍｏｕｓｅＩｇＧ（１００×）を１００μＬ添加し、マイクロプレート振とう器で振とうさせながら室温で１時間反応させた。反応終了後に反応液を捨て、各ウェルを３００μＬの反応／洗浄液（１×）で５回洗浄した後、ＴＭＢＳｏｌｕｔｉｏｎを１００μＬ添加し、マイクロプレート振とう器で１分間振とうさせた後に室温で３０分間反応させた。反応終了後、ＳｔｏｐＳｏｌｕｔｉｏｎを１００μＬ添加し、マイクロプレート振とう器で５秒間振とうさせた後、Ｅｎｓｐｉｒｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）で４５０ｎｍ及び６２０ｎｍの吸光度を測定した。得られた測定値をもとに、４５０ｎｍの吸光度から６２０ｎｍの吸光度を差し引いた値を算出し、化合物未処置群（ｃｏｎｔｒｏｌ）を１とした際の相対値を算出した。

【0181】

【表9】

【0182】

【表10】

【0183】

［試験例８：細胞傷害性の評価３］
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞又はヒト臍帯マトリックス由来間葉系幹細胞（タカラバイオ社製、＃Ｃ－１２９７４、＃Ｃ－１２９７１）を８×１０^４ｃｅｌｌｓ／１．８ｍＬとなるように間葉系幹細胞増殖培地２（タカラバイオ社製、Ｃ－２８００９）に懸濁し、６ウェル細胞培養処理プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、３５１６）に播種した。播種した間葉系幹細胞に、間葉系幹細胞増殖培地２で１０倍濃度に希釈した実施例１～８の化合物を２００μＬ添加し、２４時間培養した後に培養液を回収した。回収した培養液中に含まれる乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の活性を、ＬＤＨＣｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙＤｅｔｅｃｔｉｏｎＫｉｔ（タカラバイオ社製、ＭＫ４０１）を用いて測定した。ＳｏｌｕｔｉｏｎＡの凍結乾燥品に精製水１ｍＬを添加して、完全に溶解させた後、２５０μＬのＳｏｌｕｔｉｏｎＡと１１．２５ｍＬのＳｏｌｕｔｉｏｎＢを混合し、ＳｏｌｕｔｉｏｎＣを調製した。回収した培養液１００μＬにＳｏｌｕｔｉｏｎＣを１００μＬ添加し、室温で３０分間反応させた。Ｅｎｓｐｉｒｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を用いて、４９０ｎｍの吸光度を測定した。得られた測定値をもとに、化合物未処置群（ｃｏｎｔｒｏｌ）の値を１とした際の相対値を算出した。
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞の結果を表１１及び図７Ｃに、ヒト臍帯マトリックス由来間葉系幹細胞の結果を表１２及び図７Ｄに示す。

【0184】

【表11】

【0185】

【表12】

【0186】

［試験例９：細胞増殖活性の評価２］
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞又はヒト臍帯マトリックス由来間葉系幹細胞（タカラバイオ社製、＃Ｃ－１２９７４、＃Ｃ－１２９７１）を２×１０^３ｃｅｌｌｓ／９０μＬとなるように間葉系幹細胞増殖培地２（タカラバイオ社製、Ｃ－２８００９）に懸濁し、９６ウェル細胞培養処理プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、３５８５）に播種した。播種した間葉系幹細胞に、間葉系幹細胞増殖培地２で１０倍濃度に希釈した実施例１～８の化合物を１０μＬ添加し、２４時間培養した。次に、以下の方法により、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）ＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔＣｅｌｌＶｉａｂｉｌｉｔｙＡｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、Ｇ７５７０）を用いて生細胞数を測定した。
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）ＢｕｆｆｅｒにＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｓｕｂｓｔｒａｔｅを溶解させた。調製した溶液を１００μＬ／ウェルで各ウェルに添加した後、１００μＬを９６ウェル細胞培養処理白色プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、３５６７０１）に分注し、Ｅｎｓｐｉｒｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）で発光度を測定した。化合物未処置群（ｃｏｎｔｒｏｌ）を１とした際の相対値を算出した。
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞の結果を表１３及び図７Ｅに、ヒト臍帯マトリックス由来間葉系幹細胞の結果を表１４及び図７Ｆに示す。

【0187】

【表13】

【0188】

【表14】

【0189】

［試験例１０：細胞外小胞の分泌促進の評価４］
＜培養上清の調製＞
１０ｍＬの非働化処理ＦＢＳと２ｍＬの５０％（ｗ／ｖ％）Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）１０，０００溶液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製、＃８１２８０）を４℃、２時間撹拌した後に、１５００×ｇ、４℃、３０分間の遠心条件で細胞外小胞を沈殿させ、上清を回収することで、Ｅｘｏｓｏｍｅ－ｆｒｅｅＦＢＳを調製した。次に、２９３細胞（ＡＴＣＣ社製、ＣＲＬ－１５７３ＴＭ）又は２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ社製、ＣＲＬ－３２１６ＴＭ）を２％（ｖ／ｖ％）Ｅｘｏｓｏｍｅ－ｆｒｅｅＦＢＳを含有するＡｄｖａｎｃｅｄＤＭＥＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、＃１２４９１０１５）中で２×１０^４ｃｅｌｌｓ／２００μＬに懸濁し、接着表面９６ウェルプレート（ＣＯＲＮＩＮＧ社製、＃３５９５）に播種し、２４時間の前培養を行った。２４時間後、培養液を除去し、２％（ｖ／ｖ％）Ｅｘｏｓｏｍｅ－ｆｒｅｅＦＢＳ含有するＡｄｖａｎｃｅｄＤＭＥＭ１９９．５μＬと、ＤＭＳＯ中に調製した実施例１、５又は９の化合物０．５μＬ（終濃度：０～１μＭ）との混合液を添加し、２４時間培養した。その後、培養液を１．５ｍＬチューブに回収し、３００×ｇ、４℃、５分間の遠心条件で細胞を沈殿させ、培養上清を回収した。続いて、回収した培養上清を２０００×ｇ、４℃、２０分間の遠心条件で細胞断片を沈殿させ、上清を回収した。更に、回収した上清を１００００×ｇ、４℃、３０分間の条件で遠心し、上清を回収した。１００００×ｇの遠心後の上清中に含まれる細胞外小胞の検出には、後述するＴｉｍ４－ヒトＣＤ６３ＥＬＩＳＡ法及びＴｉｍ４－ヒトＣＤ８１ＥＬＩＳＡ法を用いた。
２９３細胞の結果を図８Ａに、２９３Ｔ細胞の結果を図８Ｂに示す。
＜Ｔｉｍ４－ヒトＣＤ６３ＥＬＩＳＡ法＞
ＣａｒｂｏｎａｔｅＢｕｆｆｅｒ（７１．４ｍＭＮａＨＣＯ_３、２８．６ｍＭＮａ_２ＣＯ_３を含有する溶液）中で調製した１μｇ／ｍＬＴｉｍ４タンパク質を９６ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ社製、＃３８０１－０９６）に１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、固相化した。９６ウェルプレートをＴＢＳＴ溶液で洗浄した後に、１％（ｗ／ｖ％）ＢＳＡを含有するＴＢＳＴ溶液２００μＬ／ｗｅｌｌを添加して１時間のブロッキング処理を行った。次に、上記で回収した上清９０μＬをウェルに添加し、更に２０ｍＭＣａＣｌ_２溶液１０μＬを添加することでＴｉｍ４タンパク質に細胞外小胞を結合させた。続いて、２ｍＭＣａＣｌ_２を含有するＴＢＳＴ溶液で希釈した１μｇ／ｍＬＡｎｔｉ－ｈｕｍａｎＣＤ６３Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製、＃３５３０１４）１００μＬ／ｗｅｌｌを添加し、１時間反応させた。２ｍＭＣａＣｌ_２を含有するＴＢＳＴ溶液２００μＬ／ｗｅｌｌを添加し、その後、ＴＢＳＴ溶液を除去した。この操作を３回繰り返した後、２ｍＭＣａＣｌ_２を含有するＴＢＳＴ溶液で希釈した８０ｎｇ／ｍＬＨＲＰ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄＡｎｔｉ－ｍｏｕｓｅＩｇＧ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製、＃４０５３０６）１００μＬ／ｗｅｌｌを添加し、１時間反応させた。最後に、ＴＭＢ溶液（Ｎａｃａｌａｉｔｅｓｑｕｅ社製、＃０５２９８－８０）１００μＬ／ｗｅｌｌを添加し、３０分間反応させた後、１ＭＨ_２ＳＯ_４溶液１００μＬ／ｗｅｌｌを添加することで反応を停止させ、４５０ｎｍの吸光度を測定することにより細胞外小胞の量を定量した。
＜Ｔｉｍ４－ヒトＣＤ８１ＥＬＩＳＡ法＞
Ｔｉｍ４－ヒトＣＤ８１ＥＬＩＳＡ法は、上述したＴｉｍ４－ヒトＣＤ６３ＥＬＩＳＡ法において、１μｇ／ｍＬＡｎｔｉ－ｈｕｍａｎＣＤ６３Ａｎｔｉｂｏｄｙを０．５μｇ／ｍＬＡｎｔｉ－ｈｕｍａｎＣＤ８１Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製、＃３４９５０２）に置き換えた以外、同様の方法で行った。

【0190】

［試験例１１：細胞外小胞の分泌促進の評価５］
１０ｍＬの非働化処理ＦＢＳと２ｍＬの５０％（ｗ／ｖ％）Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）１０，０００溶液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製、＃８１２８０）を４℃、２時間撹拌した後に、１５００×ｇ、４℃、３０分間の遠心条件で細胞外小胞を沈殿させ、上清を回収することで、Ｅｘｏｓｏｍｅ－ｆｒｅｅＦＢＳを調製した。次に、２９３細胞（ＡＴＣＣ社製、ＣＲＬ－１５７３ＴＭ）又は２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ社製、ＣＲＬ－３２１６ＴＭ）を２％（ｖ／ｖ％）Ｅｘｏｓｏｍｅ－ｆｒｅｅＦＢＳを含有するＡｄｖａｎｃｅｄＤＭＥＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、＃１２４９１０１５）中で２×１０^５ｃｅｌｌｓ／１０００μＬに懸濁し、接着表面１２ウェルプレート（ＣＯＲＮＩＮＧ社製、＃３５１３）に播種し、２４時間の前培養を行った。２４時間後、培養液を除去し、２％（ｖ／ｖ％）Ｅｘｏｓｏｍｅ－ｆｒｅｅＦＢＳ含有するＡｄｖａｎｃｅｄＤＭＥＭ９９９μＬと、ＤＭＳＯ中に調製した実施例１、５又は９の化合物１μＬ（終濃度：０～１μＭ）との混合液を添加し、２４時間培養した。その後、培養液を１．５ｍＬチューブに回収し、３００×ｇ、４℃、５分間の遠心条件で細胞を沈殿させ、培養上清を回収した。続いて、回収した培養上清を２０００×ｇ、４℃、２０分間の遠心条件で細胞断片を沈殿させ、上清を回収した。更に、回収した上清を１００００×ｇ、４℃、３０分間の条件で遠心し、上清を回収した。１００００×ｇの遠心後の上清５００μＬ中に含まれる細胞外小胞の量を、ナノ粒子解析システム（ＭａｌｖｅｒｎＰａｎａｌｙｔｉｃａｌ社製、＃ＮａｎｏＳＩＧＨＴＬＭ１０）を用いて定量した。
２９３細胞の結果を図８Ｃに、２９３Ｔ細胞の結果を図８Ｄに示す。

【0191】

［試験例１２：細胞傷害性の評価４］
１０ｍＬの非働化処理ＦＢＳと２ｍＬの５０％（ｗ／ｖ％）Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）１０，０００溶液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製、＃８１２８０）を４℃、２時間撹拌した後に、１５００×ｇ、４℃、３０分間の遠心条件で細胞外小胞を沈殿させ、上清を回収することで、Ｅｘｏｓｏｍｅ－ｆｒｅｅＦＢＳを調製した。次に、２９３細胞（ＡＴＣＣ社製、ＣＲＬ－１５７３ＴＭ）又は２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ社製、ＣＲＬ－３２１６ＴＭ）を２％（ｖ／ｖ％）Ｅｘｏｓｏｍｅ－ｆｒｅｅＦＢＳを含有するＡｄｖａｎｃｅｄＤＭＥＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、＃１２４９１０１５）中で２×１０^４ｃｅｌｌｓ／２００μＬに懸濁し、接着表面９６ウェルプレート（ＣＯＲＮＩＮＧ社製、＃３５９５）に播種し、２４時間の前培養を行った。２４時間後、培養液を除去し、２％（ｖ／ｖ％）Ｅｘｏｓｏｍｅ－ｆｒｅｅＦＢＳ含有するＡｄｖａｎｃｅｄＤＭＥＭ１９９．５μＬと、ＤＭＳＯ中に調製した実施例１、５又は９の化合物０．５μＬ（終濃度：０～１μＭ）との混合液を添加し、２４時間培養した。その後、プレートを１２００×ｇ、４℃、１時間の遠心条件で細胞を沈殿させ、５０μＬの培養上清を９６ウェルマイクロプレート（ＷＡＴＳＯＮ社製、＃１９５－９６Ｆ）に移した。培養上清中に含まれる乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の活性は、ＣｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙＬＤＨＡｓｓａｙＫｉｔ－ＷＳＴ（同仁化学研究所社製、＃ＣＫ１２）を用いて測定した。５００ｔｅｓｔｓ分のＤｙｅＭｉｘｔｕｒｅに５ｍＬのＡｓｓａｙＢｕｆｆｅｒを加えて溶解し、ＷｏｒｋｉｎｇＳｏｌｕｔｉｏｎを調製した。５０μＬの培養上清を移した９６ウェルマイクロプレートに、５０μＬのＷｏｒｋｉｎｇＳｏｌｕｔｉｏｎを添加し、よく混和した後に、室温で３０分間、呈色反応を行った。２５μＬのＳｔｏｐＳｏｌｕｔｉｏｎを添加することで反応を停止させ、４９０ｎｍの吸光度を測定することで、細胞傷害性を評価した。死細胞群（培養液回収の１５分前に、化合物未処置細胞に２０μＬのＬｙｓｉｓＢｕｆｆｅｒを添加したサンプル）及び培養液（細胞培養をしていない培養液）も同様にＬＤＨの活性を測定し、化合物による細胞傷害性を評価した。
２９３細胞の結果を図８Ｅに、２９３Ｔ細胞の結果を図８Ｆに示す。

【0192】

［試験例１３：細胞増殖活性の評価３］
１０ｍＬの非働化処理ＦＢＳと２ｍＬの５０％（ｗ／ｖ％）Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）１０，０００溶液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製、＃８１２８０）を４℃、２時間撹拌した後に、１５００×ｇ、４℃、３０分間の遠心条件で細胞外小胞を沈殿させ、上清を回収することで、Ｅｘｏｓｏｍｅ－ｆｒｅｅＦＢＳを調製した。次に、２９３細胞（ＡＴＣＣ社製、ＣＲＬ－１５７３ＴＭ）又は２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ社製、ＣＲＬ－３２１６ＴＭ）を２％（ｖ／ｖ％）Ｅｘｏｓｏｍｅ－ｆｒｅｅＦＢＳを含有するＡｄｖａｎｃｅｄＤＭＥＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、＃１２４９１０１５）中で２×１０^４ｃｅｌｌｓ／２００μＬに懸濁し、接着表面９６ウェルプレート（ＣＯＲＮＩＮＧ社製、＃３５９５）に播種し、２４時間の前培養を行った。２４時間後、培養液を除去し、２％（ｖ／ｖ％）Ｅｘｏｓｏｍｅ－ｆｒｅｅＦＢＳ含有するＡｄｖａｎｃｅｄＤＭＥＭ１９９．５μＬと、ＤＭＳＯ中に調製した実施例１、５又は９の化合物０．５μＬ（終濃度：０～１μＭ）との混合液を添加し、２４時間培養した。２４時間後、プレートを１２００×ｇ、４℃、１時間の遠心条件で細胞を沈殿させ培養上清を除去し、ＡｄｖａｎｃｅｄＤＭＥＭ９０μＬと生細胞数測定試薬ＳＦ（ナカライテスク社製、＃０７５５３）１０μＬの混合液を添加し、３０分間培養した。３０分後、４５０ｎｍの吸光度を測定し、細胞増殖活性を評価した。
２９３細胞の結果を図８Ｇに、２９３Ｔ細胞の結果を図８Ｈに示す。

【0193】

［結果］
試験例１の結果より、実施例１，５の化合物は、Ｕ－８７ＭＧ細胞からの、ＣＤ９及び／又はＣＤ６３陽性の細胞外小胞の分泌量を促進したことが分かる。特に、実施例１の化合物はＣＤ９及び／又はＣＤ６３陽性の細胞外小胞の、実施例５の化合物はＣＤ６３陽性の細胞外小胞の分泌を強く促進したと考えられる。
試験例２の結果より、実施例１の化合物は、少なくとも約２μＭ以下の濃度で、実施例５の化合物は、少なくとも約５０ｎＭ以下の濃度で、培養上清中のＬＤＨ量の顕著な上昇が認められなかったことから、Ｕ－８７ＭＧ細胞に対して細胞傷害性が低いものと考えられる。
したがって、実施例１，５の化合物（或いは、これを含む組成物）は、Ｕ－８７ＭＧ細胞からの細胞外小胞の分泌を促進するものである。更に、実施例１，５の化合物（或いは、）これを含む組成物）は、Ｕ－８７ＭＧ細胞に対して細胞傷害性が低いにもかかわらず、Ｕ－８７ＭＧ細胞からの細胞外小胞の分泌を促進するものである。

【0194】

試験例３，７の結果より、実施例１～８の化合物は、ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞、及びヒト臍帯マトリックス由来間葉系幹細胞からの、ＣＤ６３陽性の細胞外小胞の分泌量を促進したことが分かる。
試験例４，８の結果より、実施例１～４，８の化合物は、少なくとも約２μＭ以下の濃度で、実施例５～７の化合物は、少なくとも約５０ｎＭ以下の濃度で、培養上清中のＬＤＨ量の顕著な上昇が認められなかったことから、ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞、及びヒト臍帯マトリックス由来間葉系幹細胞に対して細胞傷害性が低いことが分かる。
試験例５，９の結果より、実施例１～４，８の化合物は、少なくとも約２μＭ以下の濃度で、実施例５～７の化合物は、少なくとも約５０ｎＭ以下の濃度で、ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞、及びヒト臍帯マトリックス由来間葉系幹細胞の増殖活性に対して大きな影響を与えないことが分かる。
したがって、実施例１～８の化合物（或いは、これを含む組成物）は、ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞、及びヒト臍帯マトリックス由来間葉系幹細胞からの細胞外小胞の分泌を促進するものである。或いは、実施例１～８の化合物（或いは、これを含む組成物）は、ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞、及びヒト臍帯マトリックス由来間葉系幹細胞に対して細胞傷害性が低いにもかかわらず、ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞、及びヒト臍帯マトリックス由来間葉系幹細胞からの細胞外小胞の分泌を促進するものである。或いは、実施例１～８の化合物（或いは、これを含む組成物）は、ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞、及びヒト臍帯マトリックス由来間葉系幹細胞の増殖に対して大きな影響を与えないにもかかわらず、ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞、及びヒト臍帯マトリックス由来間葉系幹細胞からの細胞外小胞の分泌を促進するものである。或いは、実施例１～８の化合物（或いは、これを含む組成物）は、ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞、及びヒト臍帯マトリックス由来間葉系幹細胞に対して細胞傷害性が低く、かつ、ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞、及びヒト臍帯マトリックス由来間葉系幹細胞の増殖に対して大きな影響を与えないにもかかわらず、ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞、及びヒト臍帯マトリックス由来間葉系幹細胞からの細胞外小胞の分泌を促進するものである。

【0195】

試験例６の結果より、実施例２，５の化合物を処置したヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞から得られた細胞外小胞は、ジメチルスルホキシドを処置したヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞から得られた細胞外小胞と比較して、高い吸光度が得られた。更に、実施例２，５の化合物を処置したヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞から得られた細胞外小胞を処置した群は、細胞外小胞未処置群、又はジメチルスルホキシドを処置したヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞から得られた細胞外小胞を処置した群と比較して、塩化コバルト処置下（即ち、低酸素処置下）のＨ９Ｃ２細胞の生細胞数が多いことが分かる。
したがって、実施例２，５の化合物（又はこれを含む組成物）を処置したヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞から得られた細胞外小胞は、低酸素処置下のＨ９Ｃ２細胞に対して細胞保護作用を有するものと考えられる。

【0196】

試験例１０，１１の結果より、実施例１，５，９の化合物は、２９３細胞及び２９３Ｔ細胞からの、ＣＤ６３及び／又はＣＤ８１陽性の細胞外小胞の分泌量を促進したことが分かる。
試験例１２の結果より、実施例１の化合物は、少なくとも約０．３μＭ以下の濃度で、実施例５の化合物は、少なくとも約０．０３μＭ（３０ｎＭ）以下の濃度で、実施例９の化合物は、少なくとも約１μＭ以下の濃度で、培養上清中のＬＤＨ量の顕著な上昇が認められなかったことから、２９３細胞及び２９３Ｔ細胞に対して細胞傷害性が低いものと考えられる。
試験例１３の結果より、実施例１の化合物は、少なくとも約０．３μＭ以下の濃度で、実施例５の化合物は、少なくとも約０．０３μＭ（３０ｎＭ）以下の濃度で、実施例９の化合物は、少なくとも約１μＭ以下の濃度で、２９３細胞及び２９３Ｔ細胞の増殖活性に対して大きな影響を与えないことが分かる。
したがって、実施例１，５，９の化合物（或いは、これを含む組成物）は、２９３細胞及び２９３Ｔ細胞からの細胞外小胞の分泌を促進するものである。或いは、実施例１，５，９の化合物（或いは、これを含む組成物）は、２９３細胞及び２９３Ｔ細胞に対して細胞傷害性が低いにもかかわらず、２９３細胞及び２９３Ｔ細胞からの細胞外小胞の分泌を促進するものである。或いは、実施例１，５，９の化合物（或いは、これを含む組成物）は、２９３細胞及び２９３Ｔ細胞の増殖に対して大きな影響を与えないにもかかわらず、２９３細胞及び２９３Ｔ細胞からの細胞外小胞の分泌を促進するものである。或いは、実施例１，５，９の化合物（或いは、これを含む組成物）は、２９３細胞及び２９３Ｔ細胞に対して細胞傷害性が低く、かつ、２９３細胞及び２９３Ｔ細胞に対して大きな影響を与えないにもかかわらず、２９３細胞及び２９３Ｔ細胞からの細胞外小胞の分泌を促進するものである。

【0197】

以上、試験例１、３、７、１０及び１１の結果より、実施例１～９の化合物は、様々な細胞由来の細胞外小胞（好ましくは、間葉系幹細胞由来の細胞外小胞）の分泌を促進することが分かる。したがって、本明細書中に記載の組成物（或いは、化合物）は、様々な細胞由来の細胞外小胞（好ましくは、間葉系幹細胞由来の細胞外小胞）の分泌を促進するものである。
更に、試験例２、４、８及び１２の結果より、実施例１～９の化合物は、培養上清中のＬＤＨ量の顕著な上昇が認められなかった。したがって、本明細書中に記載の組成物（或いは、化合物）は、様々な細胞に対する細胞傷害性（好ましくは、間葉系幹細胞に対する細胞傷害性）が低く、安全なものである。
更に、試験例５、９及び１３の結果より、実施例１～９の化合物は、様々な細胞に対する細胞増殖活性（好ましくは、間葉系幹細胞に対する細胞増殖活性）に大きな影響を与えなかった。したがって、本明細書中に記載の組成物（或いは、化合物）は、様々な細胞に対する細胞増殖活性（好ましくは、間葉系幹細胞に対する細胞増殖活性）に大きな影響がなく、安全なものである。
更に、試験例６の結果より、実施例２，５の化合物を処置した間葉系幹細胞（好ましくは、ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞）から得られた細胞外小胞（好ましくは、エクソソーム）は、低酸素処置等のストレス下にある細胞（例えば、心臓に由来する細胞）の生細胞数を増加させた。したがって、本明細書中に記載の組成物（或いは、化合物）を処置した細胞（好ましくは、間葉系幹細胞）から得られた細胞外小胞（好ましくは、エクソソーム）は、低酸素処置等のストレス下にある細胞に対して細胞保護作用を有するものと考えられる。

【図1A】