特許 7508689 抗－ＬＩＬＲＢ１抗体およびその用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-06-21

(45)【発行日】2024-07-01

(54)【発明の名称】抗－ＬＩＬＲＢ１抗体およびその用途

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/28 20060101AFI20240624BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240624BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20240624BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240624BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240624BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240624BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240624BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20240624BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240624BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20240624BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240624BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240624BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20240624BHJP

【ＦＩ】

C07K16/28

C12N15/63 Z

C12N15/62 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/08

A61P35/00

A61P37/02

A61K39/395 E

A61K39/395 T

A61K48/00

C12N15/13 ZNA

【請求項の数】 12

(21)【出願番号】P 2023503488

(86)(22)【出願日】2021-07-27

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2023-08-31

(86)【国際出願番号】 KR2021009696

(87)【国際公開番号】W WO2022025585

(87)【国際公開日】2022-02-03

【審査請求日】2023-01-18

(31)【優先権主張番号】10-2020-0094053

(32)【優先日】2020-07-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(73)【特許権者】

【識別番号】500239823

【氏名又は名称】エルジー・ケム・リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(74)【代理人】

【識別番号】100122161

【弁理士】

【氏名又は名称】渡部 崇

(72)【発明者】

【氏名】ユン・ア・チェ

(72)【発明者】

【氏名】ハン・ビョル・キム

(72)【発明者】

【氏名】シンヨン・カン

(72)【発明者】

【氏名】ジュン・ア・キム

(72)【発明者】

【氏名】ヒハン・キム

(72)【発明者】

【氏名】ミンスン・キム

(72)【発明者】

【氏名】ジュンヘン・チョ

【審査官】坂崎 恵美子

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１９／１４４０５２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１３／１８１４３８（ＷＯ，Ａ２）

【文献】特表２０１７－５１７２５９（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／１３

Ｃ０７Ｋ １６／２８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下の相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ；ＣＤＲｓ）を含む、抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片：
配列番号９７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、
配列番号９８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、
配列番号９９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３、
配列番号１００のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、
配列番号１０１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および
配列番号１０２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３
（Ｋａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇを基準とする。）

【請求項2】

配列番号１０３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および
配列番号１０５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片。

【請求項3】

ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４抗体である、請求項１に記載の抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片。

【請求項4】

前記抗原結合断片は、前記抗－ＬＩＬＲＢ１抗体のｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）_２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、ｓｃＦｖが免疫グロブリンのＦｃと融合した融合ポリペプチド、またはｓｃＦｖが軽鎖の不変領域と融合した融合ポリペプチドである、請求項１に記載の抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片。

【請求項5】

請求項１～４のいずれか一項に記載の抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片を含む、癌の予防または治療用薬学組成物。

【請求項6】

前記癌は、ＭＨＣクラスＩが過剰発現される特性を有する、請求項５に記載の薬学組成物。

【請求項7】

前記組成物は、癌細胞の免疫回避を阻害する活性を有する、請求項５に記載の薬学組成物。

【請求項8】

請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片をコードする、核酸分子。

【請求項9】

請求項８に記載の核酸分子を含む、組換えベクター。

【請求項10】

請求項８に記載の核酸分子またはこれを含む組換えベクターを含む、組換え細胞。

【請求項11】

請求項１０に記載の組換え細胞を培養する段階を含む、抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片の製造方法。

【請求項12】

請求項１～４のいずれか一項に記載の抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片を含む、癌細胞の免疫回避阻害用薬学組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

[関連出願の相互参照]
本出願は、２０２０年７月２８日付の韓国特許出願第１０－２０２０－００９４０５３号に基づく優先権の利益を主張し、当該韓国特許出願の文献に開示された全ての内容は本明細書の一部として含まれる。

【0002】

本発明は、抗－ＬＩＬＲＢ１抗体およびその用途に関し、具体的には、抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片、およびその癌治療用途に関する。

【背景技術】

【0003】

Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｂｆａｍｉｌｙ Ｂ ｍｅｍｂｅｒ １（ＬＩＬＲＢ１、またはＩＬＴ２、ＣＤ８５ｊ、ＬＩＲ－１）はＢ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、マクロファージおよびその他の免疫細胞などに発現する活性抑制受容体（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）である。ＬＩＬＲＢ１は、ｃｌａｓｓｉｃａｌおよびｎｏｎ－ｃｌａｓｓｉｃａｌ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ－Ｉと結合して、免疫細胞の活性を抑制させるシグナル伝達作用を有する。

【0004】

したがって、ＬＩＬＲＢ１を標的とする物質の開発が求められる。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明の一実施形態は、ＬＩＬＲＢ１に結合する抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片を提供する。前記抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片は、癌細胞の免疫回避を阻害する活性を有し得る。また、前記抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片は優れた抗癌活性を有し得る。前記癌は、表面にＭＨＣクラスＩを発現または過剰発現するものであり得る。

【0006】

本発明の他の実施形態は、前記抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片を含む薬学的癌の治療および／または予防用薬学組成物を提供する。他の実施形態は、前記抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片の薬学的有効量を癌の治療および／または予防を必要とする対象に投与する段階を含む、癌の治療および／または予防方法を提供する。他の実施形態は、前記抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片の癌の治療および／または予防に用いるための用途または癌の治療および／または予防用薬学組成物の製造に用いるための用途を提供する。

【0007】

本発明の他の実施形態は、前記抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片を含む癌細胞の免疫回避阻害用薬学組成物を提供する。他の実施形態は、前記抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片の薬学的有効量を癌細胞の免疫回避阻害を必要とする対象に投与する段階を含む、癌細胞の免疫回避阻害方法を提供する。他の実施形態は、前記抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片の癌細胞の免疫回避阻害に用いるための用途または癌細胞の免疫回避阻害用薬学組成物の製造に用いるための用途を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明の一実施形態は、ＬＩＬＲＢ１に結合する抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片を提供する。前記抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片は、癌細胞の免疫回避を阻害する活性を有するものであり得る。また、前記抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片は優れた抗癌活性を有するものであり得る。

【0009】

前記抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片は、以下の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むものであり得る：

【0010】

Ｋａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇによるＣＤＲ定義（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，Ｗｕ，Ｔ．Ｔ．，Ｐｅｒｒｙ，Ｈ．，Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｋ．ａｎｄ Ｆｏｅｌｌｅｒ，Ｃ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ．ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｂｙｓｉｓ．ｏｒｇ／）を基準にして、
配列番号１、１３、２５、３７、４９、６１、７３、８５、９７、１０９、１２１、１３３、１４５、１５７、１６９、１８１、１９３、２０５または２１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、
配列番号２、１４、２６、３８、５０、６２、７４、８６、９８、１１０、１２２、１３４、１４６、１５８、１７０、１８２、１９４、２０６または２１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、
配列番号３、１５、２７、３９、５１、６３、７５、８７、９９、１１１、１２３、１３５、１４７、１５９、１７１、１８３、１９５、２０７または２１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３、
配列番号４、１６、２８、４０、５２、６４、７６、８８、１００、１１２、１２４、１３６、１４８、１６０、１７２、１８４、１９６、２０８または２２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、
配列番号５、１７、２９、４１、５３、６５、７７、８９、１０１、１１３、１２５、１３７、１４９、１６１、１７３、１８５、１９７、２０９または２２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および
配列番号６、１８、３０、４２、５４、６６、７８、９０、１０２、１１４、１２６、１３８、１５０、１６２、１７４、１８６、１９８、２１０または２２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むものであり得る。

【0011】

一実施形態において、本明細書で提供される抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片に含むことが可能な６個のＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２およびＣＤＲ－Ｈ３）の組み合わせを下記の表１に示す：

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【表1-4】

【表1-5】

【0012】

一例において、前記抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片は、前記のような、
ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域、並びに
ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、およびＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域を含むものであり得る。

【0013】

実施形態において、前記抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片は、
配列番号７、１９、３１、４３、５５、６７、７９、９１、１０３、１１５、１２７、１３９、１５１、１６３、１７５、１８７、１９９、２１１または２２３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および
配列番号９、２１、３３、４５、５７、６９、８１、９３、１０５、１１７、１２９、１４１、１５３、１６５、１７７、１８９、２０１、２１３または２２５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含むものであり得る。

【0014】

本明細書で提供される抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片に含むことが可能な軽鎖可変領域および重鎖可変領域の組み合わせを下記の表２に示す：

【表2-1】

【表2-2】

【表2-3】

【表2-4】

【0015】

本明細書において、抗体（例えば、ＣＤＲ、可変領域、または重鎖／軽鎖）が「特定のアミノ酸配列を含むまたは特定のアミノ酸配列からなる」とは、前記アミノ酸配列を必ず含む場合、および／または前記アミノ酸配列に抗体活性に影響を与えない無意味な変異（例えば、アミノ酸残基の置換、欠失、および／または付加）が導入された場合を全て意味するものであり得る。

【0016】

本明細書で提供される抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片は、ＬＩＬＲＢ１（例えば、ヒトＬＩＬＲＢ１）に対する結合親和性（Ｋ_Ｄ）は、例えば、表面プラズモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ、ＳＰＲ）で測定したものを基準にして、１０ｍＭ以下、５ｍＭ以下、１ｍＭ以下、０．５ｍＭ以下、０．２ｍＭ、または０．１５ｍＭ以下であり得、例えば、０．００１ｎＭ～１０ｍＭ、０．００５ｎＭ～１０ｍＭ、０．０１ｎＭ～１０ｍＭ、０．０５ｎＭ～１０ｍＭ、０．１ｎＭ～１０ｍＭ、０．５ｎＭ～１０ｍＭ、１ｎＭ～１０ｍＭ、０．００１ｎＭ～５ｍＭ、０．００５ｎＭ～５ｍＭ、０．０１ｎＭ～５ｍＭ、０．０５ｎＭ～５ｍＭ、０．１ｎＭ～５ｍＭ、０．５ｎＭ～５ｍＭ、１ｎＭ～５ｍＭ、０．００１ｎＭ～１ｍＭ、０．００５ｎＭ～１ｍＭ、０．０１ｎＭ～１ｍＭ、０．０５ｎＭ～１ｍＭ、０．１ｎＭ～１ｍＭ、０．５ｎＭ～１ｍＭ、１ｎＭ～１ｍＭ、０．００１ｎＭ～０．５ｍＭ、０．００５ｎＭ～０．５ｍＭ、０．０１ｎＭ～０．５ｍＭ、０．０５ｎＭ～０．５ｍＭ、０．１ｎＭ～０．５ｍＭ、０．５ｎＭ～０．５ｍＭ、１ｎＭ～０．５ｍＭ、０．００１ｎＭ～０．２ｍＭ、０．００５ｎＭ～０．２ｍＭ、０．０１ｎＭ～０．２ｍＭ、０．０５ｎＭ～０．２ｍＭ、０．１ｎＭ～０．２ｍＭ、０．５ｎＭ～０．２ｍＭ、１ｎＭ～０．２ｍＭ、０．００１ｎＭ～０．１５ｍＭ、０．００５ｎＭ～０．１５ｍＭ、０．０１ｎＭ～０．１５ｍＭ、０．０５ｎＭ～０．１５ｍＭ、０．１ｎＭ～０．１５ｍＭ、０．５ｎＭ～０．１５ｍＭ、または１ｎＭ～０．１５ｍＭであり得る。

【0017】

他の例は、前記抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片を含む薬学組成物を提供する。例えば、前記薬学組成物は、癌の治療および／または予防のための薬学組成物であり得る。一例において、前記薬学組成物は、癌細胞の免疫回避を阻害する活性を有するものであり得る。前記癌細胞は、表面にＭＨＣクラスＩを発現または過剰発現したものであり得る。

【0018】

他の例は、前記抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片の薬学的有効量を癌の治療および／または予防を必要とする対象（例えば、ヒトを含む哺乳類）に投与（経口または非経口投与）する段階を含む、癌を治療および／または予防する方法を提供する。

【0019】

本明細書で提供される方法は、前記投与する段階前に、癌の治療および／または予防を必要とする対象、および／または癌細胞の免疫回避阻害を必要とする対象を確認する段階をさらに含み得る。

【0020】

他の例は、前記抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片の癌の治療および／または予防に用いるための用途または癌の治療および／または予防用薬学組成物の製造に用いるための用途を提供する。さらに他の例は、前記抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片の癌細胞の免疫回避阻害に用いるための用途または癌細胞の免疫回避阻害用薬学組成物の製造に用いるための用途を提供する。

【0021】

他の例は、前記抗－ＬＩＬＲＢ１抗体のＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、またはＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３の組み合わせ、またはＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、およびＣＤＲ－Ｈ３の組み合わせ）；ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域；ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、およびＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域；前記軽鎖可変領域を含む軽鎖；および前記重鎖可変領域を含む重鎖からなる群より選択される１つ以上のポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。

【0022】

他の例は、前記核酸分子を含む組換えベクターを提供する。一例において、前記組換えベクターは、前記軽鎖可変領域または軽鎖、および前記重鎖可変領域または重鎖を（例えば、２つのベクターに）をそれぞれ含むか、（例えば、１つのベクターに）共に含むものであり得る。前記組換えベクターは、前記軽鎖可変領域または軽鎖、および前記重鎖可変領域または重鎖を適切な細胞で発現させるための発現ベクターであり得る。

【0023】

他の例は、前記組換えベクターを含む組換え細胞を提供する。

【0024】

他の例は、前記組換え細胞を発現させる段階を含む、抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片の製造方法を提供する。

【0025】

本明細書に記載された抗－ＬＩＬＲＢ１抗体の抗原結合断片は、前記抗－ＬＩＬＲＢ１抗体に由来し、抗原（ＬＩＬＲＢ１）に対する結合力を保有する断片を意味し、前記抗－ＬＩＬＲＢ１抗体の６個のＣＤＲを含む任意のポリペプチド、例えば、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、ｓｃＦｖ－Ｃｋ（カッパ不変領域）、ｓｃＦｖ－Ｃλ（ラムダ不変領域）、（ｓｃＦｖ）_２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）_２であり得るが、これらに限定されるものではない。

【0026】

前記抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片は、ＬＩＬＲＢ１タンパク質に対して調節作用、例えば、拮抗作用（ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ）または作働作用（ａｇｏｎｉｓｍ）を有するものであり得る。また、前記抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片は、癌細胞の免疫回避を阻害する活性を有するものであり得る。また、前記抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片は、優れた抗癌活性を有するものであり得る。

【0027】

本明細書で提供される抗体または抗原結合断片の抗原として作用するＬＩＬＲＢ１は哺乳類由来のものであり得、例えば、ヒト由来ＬＩＬＲＢ１（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒｓ ＮＰ_００１２６５３２８．２、ＮＰ_００１２６５３２７．２、ＮＰ_００１０７５１０８．２、ＮＰ_００１０７５１０７．２、ＮＰ_００１０７５１０６．２、ＮＰ_００６６６０．４、ＮＭ_００１０８１６３７．２、ＮＭ_００１０８１６３８．３、ＮＭ_００１０８１６３９．３、ＮＭ_００１２７８３９８．２、ＮＭ_００１２７８３９９．２など）であり得るが、これらに限定されるものではない。

【0028】

本明細書に記載されたＭＨＣクラスＩは、ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ（ＭＨＣ）分子の一分類である。一例において、前記ＭＨＣクラスＩはヒト由来のものであり得、ＨＬＡ（ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ）－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、およびＨＬＡ－Ｇからなる群より選択される１種以上であり得るが、これらに限定されるものではない。

【0029】

本明細書において「抗体」とは、特定の抗原に特異的に結合するタンパク質の総称であって、免疫系で抗原刺激によって作られるタンパク質またはこれを組換えまたは化学的合成で製造したタンパク質であり得、その種類は特に限定されない。前記抗体は非天然に生成されたもの、例えば、組換えまたは合成的に生成されたものであり得る。前記抗体は、動物抗体（例えば、マウス抗体など）、キメリック抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体であり得る。前記抗体は、単クローン抗体または多クローン抗体であり得る。

【0030】

本明細書で提供される抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片で先に定義した重鎖ＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲ部位、または重鎖可変領域および軽鎖可変領域を除いた残りの部位は、すべてのサブタイプの免疫グロブリン（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）、ＩｇＭなど）に由来するものであり得、例えば、前記すべてのサブタイプの免疫グロブリンのフレームワーク部位、および／または軽鎖不変領域および／または重鎖不変領域に由来するものであり得る。一例において、本明細書で提供される抗－ＬＩＬＲＢ１抗体はヒトＩｇＧ型抗体、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４形態の抗体であり得るが、これらに限定されるものであはない。

【0031】

完全な抗体（例えば、ＩｇＧ型）は、２本の全長（ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ）軽鎖および２本の全長重鎖を有する構造であり、それぞれの軽鎖は、重鎖と二硫化結合で連結されている。抗体の不変領域は、重鎖不変領域と軽鎖不変領域に分けられ、重鎖不変領域は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）およびイプシロン（ε）タイプを有し、サブクラスとしてガンマ１（γ１）、ガンマ２（γ２）、ガンマ３（γ３）、ガンマ４（γ４）、アルファ１（α１）およびアルファ２（α２）を有する。軽鎖の不変領域は、カッパ（κ）およびラムダ（λ）タイプを有する。

【0032】

用語「重鎖（ｈｅａｖｙｃ ｈａｉｎ）」は、抗原に特異性を付与するために十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶ_Ｈおよび３個の不変領域ドメインＣ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３とヒンジ（ｈｉｎｇｅ）を含む全長重鎖およびその断片を全て含む意味に解釈される。また、用語「軽鎖（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）」は、抗原に特異性を付与するための十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶ_Ｌおよび不変領域ドメインＣ_Ｌを含む全長軽鎖およびその断片を全て含む意味に解釈される。

【0033】

用語「ＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）」は、抗体の可変部位中で抗原との結合特異性を付与する部位を意味し、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の高可変領域（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）のアミノ酸配列を意味する。重鎖および軽鎖は、それぞれ３個のＣＤＲを含み得る（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３およびＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３）。前記ＣＤＲは、抗体が抗原またはエピトープに結合するにあたって主な接触残基を提供することができる。一方、本明細書において、用語「特異的に結合」または「特異的に認識」は、当業者に通常知られている意味と同じであり、抗原および抗体が特異的に相互作用して免疫学的に反応することを意味する。

【0034】

本明細書において、抗体は、特別な言及がない限り、抗原結合能を持った抗体の抗原結合断片を含むものとして理解され得る。

【0035】

用語「抗原結合断片」は、抗原と結合できる部分（例えば、本明細書において定義された６個のＣＤＲ）を含むすべての形態のポリペプチドを意味する。例えば、抗体のｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）_２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）_２であり得るが、これらに限定されない。また、上述した通り、前記抗原結合断片はｓｃＦｖ、またはｓｃＦｖが免疫グロブリン（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＭなど）のＦｃ部位または軽鎖不変領域（例えば、カッパまたはラムダ）と融合した融合ポリペプチドであり得る。

【0036】

前記抗原結合断片のうち、Ｆａｂは、軽鎖および重鎖の可変領域と軽鎖の不変領域および重鎖の最初の不変領域（Ｃ_Ｈ１）を有する構造であって、１個の抗原結合部位を有する。

【0037】

Ｆａｂ’は、重鎖Ｃ_Ｈ１ドメインのＣ－末端に１つ以上のシステイン残基を含むヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ ｒｅｇｉｏｎ）を有するという点でＦａｂと異なる。

【0038】

Ｆ（ａｂ’）_２抗体は、Ｆａｂ’のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合を形成しながら生成される。Ｆｖは、重鎖可変部位および軽鎖可変部位のみを有している最小の抗体断片であり、Ｆｖ断片を生成する組換え技術は当業界に幅広く知られている。

【0039】

二重鎖Ｆｖ（ｔｗｏ－ｃｈａｉｎ Ｆｖ）は、非共有結合で重鎖可変部位と軽鎖可変部位とが連結されており、単鎖Ｆｖ（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ Ｆｖ）は、一般にペプチドリンカーを介して重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域とが共有結合で連結されるか、またはＣ－末端で直接連結されているので、二重鎖Ｆｖと同様に、ダイマーのような構造を形成することができる。

【0040】

前記抗原結合断片は、タンパク質加水分解酵素を用いて得ることができ（例えば、全体抗体をパパインで制限切断すればＦａｂを得ることができ、ペプシンで切断すればＦ（ａｂ’）_２断片を得ることができる。）、遺伝子組換え技術を用いて作られる。

【0041】

用語「ヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ ｒｅｇｉｏｎ）」は、抗体の重鎖に含まれている領域であって、ＣＨ１とＣＨ２領域の間に存在し、抗体内抗原結合部位の柔軟性（ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ）を提供する機能を果たす領域を意味する。

【0042】

前記抗－ＬＩＬＲＢ１抗体は、単クローン抗体であり得る。単クローン抗体は、当業界で公知の方法により製造することができる。例えば、ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ技法を利用して製造することができる。または、抗－ＬＩＬＲＢ１抗体は、通常の方法によってマウス由来の単クローン抗体で製造することができる。

【0043】

一方、典型的なＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）フォーマットを利用してＬＩＬＲＢ１との結合能に基づいて個別の単クローン抗体をスクリーニングすることができる。結合体に対して分子的相互作用を検定するための競合ＥＬＩＳＡ（Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＥＬＩＳＡ）のような機能性分析またはセルベースアッセイ（ｃｅｌｌ－ｂａｓｅｄ ａｓｓａｙ）のような機能性分析により阻害活性に対して検定することができる。その後、強い阻害活性に基づいて選択された単クローン抗体メンバーに対してＬＩＬＲＢ１に対するそれぞれの親和性（Ｋｄ ｖａｌｕｅｓ）を検定することができる。

【0044】

最終的に選択された抗体は、抗原結合部を除いた残りの部分がヒト免疫グロブリンの抗体化された抗体だけでなく、ヒト化抗体として製造して使用することができる。ヒト化抗体の製造方法は当業界でよく知られている。

【0045】

本明細書で提供される薬学組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含み得る。前記薬学的に許容可能な担体は、製剤時に通常利用されるものであり、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム、およびミネラルオイルなどからなる群より選択される１種以上であり得るが、これらに限定されるものではない。前記薬学組成物はまた、薬学組成物の製造に通常使用される希釈剤、賦形剤、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などからなる群より選択される１種以上をさらに含み得る。

【0046】

前記薬学組成物、または前記抗体またはその抗原結合断片の有効量は、経口または非経口で投与することができる。非経口投与の場合には、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、内皮投与、鼻内投与、肺内投与、直腸内投与、または病変部位への局所投与などで投与可能である。経口投与時、タンパク質またはペプチドは消化されるため、経口用組成物は、活性薬剤をコーティングするか、胃での分解から保護されるように剤形化されなければならない。また、前記組成物は、活性物質が標的細胞に移動できる任意の装置により投与することができる。

【0047】

前記薬学組成物中の抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片の含有量、または抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片の投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、飲食、投与時間、投与間隔、投与経路、排泄速度、反応感応性などの要因によって多様に処方可能である。例えば、前記抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片の１日投与量は、０．００５μｇ／ｋｇ～１０００ｍｇ／ｋｇ、０．００５μｇ／ｋｇ～５００ｍｇ／ｋｇ、０．００５μｇ／ｋｇ～２５０ｍｇ／ｋｇ、０．００５μｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ、０．００５μｇ／ｋｇ～７５ｍｇ／ｋｇ、０．００５μｇ／ｋｇ～５０ｍｇ／ｋｇ、０．０１μｇ／ｋｇ～１０００ｍｇ／ｋｇ、０．０１μｇ／ｋｇ～５００ｍｇ／ｋｇ、０．０１μｇ／ｋｇ～２５０ｍｇ／ｋｇ、０．０１μｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ、０．０１μｇ／ｋｇ～７５ｍｇ／ｋｇ、０．０１μｇ／ｋｇ～５０ｍｇ／ｋｇ、０．０５μｇ／ｋｇ～１０００ｍｇ／ｋｇ、０．０５μｇ／ｋｇ～５００ｍｇ／ｋｇ、０．０５μｇ／ｋｇ～２５０ｍｇ／ｋｇ、０．０５μｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ、０．０５μｇ／ｋｇ～７５ｍｇ／ｋｇ、または０．０５μｇ／ｋｇ～５０ｍｇ／ｋｇの範囲であり得るが、これらに限定されるものではない。前記１日投与量は、単位容量形態で１つの製形で製剤化するか、または適切に分量して製剤化するか、または多用量容器内に入れ込んで製造することができる。

【0048】

前記薬学組成物は、オイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液、シロップ剤または乳化液形態であるか、エキス剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤またはカプセル剤などの形態に剤形化されてもよいし、剤形化のために分散剤または安定化剤をさらに含み得る。

【0049】

本発明の適用対象患者は、ヒト、サルなどを含む霊長類、マウス、ラットなどを含む齧歯類などを含む哺乳類であり得る。

【0050】

前記癌は、固形癌または血液癌であってもよく、これらに限定されないが、肺癌（例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌など）、腹膜癌、皮膚癌、皮膚または眼内黒色腫、直膓癌、肛門部癌、食道癌、小腸癌、内分泌腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、白血病（例えば、慢性または急性白血病）、リンパ腫、肝細胞癌、胃癌、膵臓癌、膠芽腫、頸部癌、卵巣ガン、肝癌、膀胱癌、肝腫瘍、乳癌、結腸癌、大腸癌、子宮内膜または子宮癌、唾液腺癌、腎細胞癌、腎臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、頭頸部癌、脳癌、骨肉腫などからなる群より選択される１種以上であり得る。前記癌は、原発性癌または転移性癌であり得る。前記癌は、表面にＭＨＣクラスＩが発現または過剰発現されたものであり得、例えば、大腸癌（ｃｏｌｏｎ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、小細胞肺癌（ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、非小細胞肺癌（Ｎｏｎ－ｓｍａｌｌ－ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、乳癌（ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ）、膵臓癌（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、皮膚癌（ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｍｅｌａｎｏｍａ）、骨肉腫（ｂｏｎｅ ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ）、腎細胞癌（ｒｅｎａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）であり得る。前記ＭＨＣクラスＩの過剰発現は、正常細胞と比較して、前記抗体適用対象癌細胞で過剰発現されたものを意味する。一例において、前記癌は、Ｔ－細胞媒介免疫治療で抗癌効果が現れない（抵抗性がある）癌腫であり得る。

【0051】

本明細書において癌の治療は、癌細胞増殖の抑制、癌細胞死滅、転移抑制などの癌の症状の悪化を防止するか緩和または好転させるか、または癌を部分的または全部を消滅させるすべての抗癌作用を意味する。

【0052】

本明細書で提供される抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片は他の薬物、例えば、通常使用可能な免疫治療剤、抗癌剤、細胞毒性製剤などからなる群より選択される１種以上と併用することができる。したがって、一例として、（１）抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片、および（２）免疫治療剤、抗癌剤、細胞毒性製剤などからなる群より選択される１種以上の薬物を含む、癌の予防および／または治療のための併用投与用薬学組成物を提供する。他の例は、癌の予防および／または治療を必要とする患者に（１）抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片、および（２）免疫治療剤、抗癌剤、細胞毒性製剤などからなる群より選択される１種以上の薬物を投与する段階を含む、癌の予防および／または治療方法が提供される。前記免疫治療剤、抗癌剤および細胞毒性製剤は、通常、癌治療、および／または細胞毒性活性を有するすべての薬物を包括するもので、抗体などのタンパク質、ｓｉＲＮＡなどの核酸分子、および／またはパクリタキセル、ドセタキセルなどの小分子化合物の中から１種以上選択されるが、これらに限定されるものではない。

【0053】

他の例として、先に説明した抗－ＬＩＬＲＢ１抗体の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、またはこれらの組み合わせ）、軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３、またはこれらの組み合わせ）、またはこれらの組み合わせ；または重鎖可変領域、軽鎖可変領域、またはこれらの組み合わせを含むポリペプチド分子が提供される。前記ポリペプチド分子は、抗体の前駆体として抗体作製に用いられるだけでなく、抗体と類似した構造を有するタンパク質骨格（ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｃａｆｆｏｌｄ；例えば、ペプチボディ）、二重特異抗体、多重特異抗体の構成成分として含まれる。さらに他の例として、前記抗－ＬＩＬＲＢ１抗体の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、またはこれらの組み合わせ）、軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３、またはこれらの組み合わせ）、またはこれらの組み合わせ；または重鎖可変領域、軽鎖可変領域、またはこれらの組み合わせを含むポリペプチド分子は、ＣＡＲ－Ｔなどの標的細胞治療剤において標的（抗原）認識部、分泌される抗体、前記抗－ＬＩＬＲＢ１抗体を分泌するように作製された細胞治療剤などとして使用可能である。

【0054】

他の例として、抗－ＬＩＬＲＢ１抗体の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、またはこれらの組み合わせ）、重鎖可変領域または重鎖をコードする核酸分子を提供する。

【0055】

他の例として、抗－ＬＩＬＲＢ１抗体の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３、またはこれらの組み合わせ）、軽鎖可変領域または軽鎖をコードする核酸分子を提供する。

【0056】

他の例として、前記抗－ＬＩＬＲＢ１抗体の重鎖相補性決定領域、重鎖可変領域または重鎖をコードする核酸分子および抗－ＬＩＬＲＢ１抗体の軽鎖相補性決定領域、軽鎖可変領域または軽鎖をコードする核酸分子を１つのベクターに共に含むか、それぞれ別個のベクターに含む組換えベクターを提供する。

【0057】

他の例として、前記組換えベクターを含む組換え細胞を提供する。

【0058】

用語「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」は、宿主細胞で目的遺伝子を発現させるための発現手段を意味する。例えば、プラスミドベクター、コスミドベクター、およびバクテリオファージベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクターおよびアデノ－関連ウイルスベクターなどのウイルスベクターを含む。前記組換えベクターに使用可能なベクターは、当業界で頻用されるプラスミド（例えば、ｐＳＣ１０１、ｐＧＶ１１０６、ｐＡＣＹＣ１７７、ＣｏｌＥ１、ｐＫＴ２３０、ｐＭＥ２９０、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ８／９、ｐＵＣ６、ｐＢＤ９、ｐＨＣ７９、ｐＩＪ６１、ｐＬＡＦＲ１、ｐＨＶ１４、ｐＧＥＸシリーズ、ｐＥＴシリーズおよびｐＵＣ１９など）、ファージ（例えば、λｇｔ４λＢ、λ－Ｃｈａｒｏｎ、λΔｚ１およびＭ１３など）またはウイルス（例えば、ＳＶ４０など）を操作して作製することができる。

【0059】

前記組換えベクターで前記核酸分子は、プロモーターに作動的に連結され得る。用語「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」は、ヌクレオチド発現調節配列（例えば、プロモーター配列）と他のヌクレオチド配列との間の機能的な結合を意味する。前記調節配列は「作動可能に連結（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」されることで他のヌクレオチド配列の転写および／または翻訳を調節することができる。

【0060】

前記組換えベクターは、典型的にクローニングのためのベクターまたは発現のためのベクターとして構築することができる。前記発現用ベクターは当業界において植物、動物または微生物で外来のタンパク質を発現するのに使用される通常のものを使用することができる。前記組換えベクターは、当業界に公知の多様な方法により構築することができる。

【0061】

前記組換えベクターは、原核細胞または真核細胞を宿主として構築することができる。例えば、使用されるベクターが発現ベクターであり、原核細胞を宿主とする場合には、転写を進行させる強力なプロモーター（例えば、ｐＬ^λプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーターなど）、翻訳の開始のためのリボゾーム結合サイトおよび転写／翻訳終結配列を含むことが一般的である。真核細胞を宿主とする場合には、ベクターに含まれる真核細胞で作動する複製起点は、ｆ１複製起点、ＳＶ４０複製起点、ｐＭＢ１複製起点、アデノ複製起点、ＡＡＶ複製起点およびＢＢＶ複製起点などを含むが、これらに限定されるものではない。また、哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオニンプロモーター）、または哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクチニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーターなど）が用いられ、転写終結配列としてポリアデニル化配列を一般的に有する。

【0062】

他の例として、前記組換えベクターを含む組換え細胞を提供する。

【0063】

前記組換え細胞は、前記組換えベクターを適切な宿主細胞に導入させることによって得られたものであり得る。前記宿主細胞は、前記組換えベクターを安定的かつ連続的にクローニングまたは発現させる細胞であって当業界に公知されているいかなる宿主細胞も用いることができ、原核細胞としては、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１、Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＲ１、Ｅ．ｃｏｌｉ ＬＥ３９２、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｘ１７７６、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０、バチルスサブティリス、バチルスチューリンゲンシスなどのバチルス属菌株、そしてサルモネラチフィリウム、セラチアマルセッセンスおよび多様なシュードモナス種などの腸内菌と菌株などがあり、真核細胞に形質転換させる場合には宿主細胞として、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、昆虫細胞、植物細胞、および動物細胞、例えば、Ｓｐ２／０、ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ）Ｋ１、ＣＨＯ ＤＧ４４、ＣＨＯ Ｓ、ＣＨＯ ＤＸＢ１１、ＣＨＯ ＧＳ－ＫＯ、ＰＥＲ．Ｃ６、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ－７、２９３、ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ７、３Ｔ３、ＲＩＮ、ＭＤＣＫ細胞株などが用いられるが、これらに限定されるものではない。

【0064】

前記核酸分子またはこれを含む組換えベクターの宿主細胞内への運搬（導入）は、当業界に広く知られた運搬方法を使用することができる。前記運搬方法は、例えば、宿主細胞が原核細胞の場合、ＣａＣｌ_２方法または電気穿孔方法などを使用することができ、宿主細胞が真核細胞の場合には、微細注入法、カルシウムホスフェート沈殿法、電気穿孔法、リポゾーム－媒介形質感染法および遺伝子ボンバードメントなどを使用することができるが、これらに限定されない。

【0065】

前記形質転換された宿主細胞を選別する方法は、選択標識によって発現する表現型を用いて、当業界に広く知られた方法により容易に実施可能である。例えば、前記選択標識が特定の抗生剤耐性遺伝子の場合には、前記抗生剤が含有された培地で形質転換体を培養することによって、形質転換体を容易に選別することができる。

【0066】

他の例として、前記核酸分子またはこれを含む組換えベクターを宿主細胞で発現させる段階を含む抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片の製造方法を提供する。前記製造方法は、前記組換えベクターを含む組換え細胞を培養する段階、および任意に培養培地から抗体または抗原結合断片を分離および／または精製する段階を含むものであり得る。

【発明の効果】

【0067】

本発明で提供される抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片は、癌細胞の免疫回避作用を阻害し、免疫細胞の抗癌効能を阻害せずによく発揮できるようにすることによって優れた抗癌活性を示すことができる。

【図面の簡単な説明】

【0068】

【図1】一実施形態において精製された抗－ＬＩＬＲＢ１抗体のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル分析結果を示す電気泳動写真である。

【図2】一実施形態による抗－ＬＩＬＲＢ１抗体１３に対するＳＰＲ（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）ｓｅｎｓｏｒｇｒａｍ結果を示す図である。

【図3】一実施形態による抗－ＬＩＬＲＢ１抗体８、抗体１０、抗体１１、抗体１３、および抗体１８のＬＩＬＲＢ１過剰発現ＣＨＯ細胞に対する結合力を示すグラフである。

【図4】一実施形態による抗－ＬＩＬＲＢ１抗体（抗体１０、抗体１１および抗体１３）またはｈｕｍａｎ ＩｇＧ４ ｉｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌ抗体（陰性対照群）の処理時のＮＫ細胞ＫＨＹＧ－１によるＨＬＡ－Ｇ過剰発現ＨＥＫ２９３細胞死滅能をＩｎｃｕＣｙｔｅ Ｓ３で分析した結果を示すグラフである。

【図5】一実施形態による抗－ＬＩＬＲＢ１抗体１０、抗体１１および抗体１３のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍効果を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0069】

以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、これは例示的なものに過ぎず本発明の範囲を制限しようとするものではない。以下に記載された実施例は発明の本質的な要旨を逸脱しない範囲で変形できることは当業者にとって自明である。

【0070】

実施例１．ＬＩＬＲＢ１に対するヒト抗体の生産
１．１．ファージディスプレイ（ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ）を用いたＬＩＬＲＢ１に対するヒト抗体の選別
ヒトＬＩＬＲＢ１を特異的に認識する抗体を選別するために、ヒト合成Ｆａｂ抗体からなるライブラリーを用いてファージディスプレイ選別法を行った。抗原は、ＲｎＤ ｓｙｓｔｅｍｓ社製のｈｕｍａｎ ＬＩＬＲＢ１－Ｆｃ（Ｃａｔ．Ｎｏ．２０１７－Ｔ２）を用いてファージパニングを４ラウンドまで行った。さらに、抗原がＦｃ ｆｕｓｉｏｎ形態であるため、パニング段階でＦｃ ｂｉｎｄｅｒを除去するＦｃ ｃｏｎｔｒｏｌパニングも併行した。選別された産出物は、ファージＥＬＩＳＡによって抗原に対する結合を確認した。

【0071】

１．２．単クローンファージＥＬＩＳＡ
前記実施例１．１でパニングにより得られたファージの中に抗原に特異的に結合するクローンを選別するために単クローンファージＥＬＩＳＡを行った。前記実施例１．１の抗原に対して吸光度（Ａ_{４５０ｎｍ}）がカットオフ値０．４以上を決定して陽性であるクローンを確認し、当該遺伝子の配列を分析した。抗原の特異性を確認するために、抗原に対するｕｎｉｑｕｅ Ｆａｂクローンのｐｕｒｉｆｉｅｄ ｐｈａｇｅ ＥＬＩＳＡを行い、ＥＣ_５０（ｐｆｕ）値を求めた。

【0072】

１．３．単クローンｓｏｌｕｂｌｅ Ｆａｂ分析
前記実施例１．２でパニングにより得られた抗原に結合する４７種の特異的クローン（ｕｎｉｑｕｅ ｃｌｏｎｅ）の中で、ｐｈａｇｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ＥＬＩＳＡでのＥＣ_５０基準上位１９種のクローンＦａｂをコードする遺伝子をＰＣＲで増幅して発現ベクターを作製した。ＴＢ ｍｅｄｉａを利用して抗体を発現した後、ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎによってｓｏｌｕｂｌｅタンパク質を確保した。Ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙを用いて精製した後、ＥＬＩＳＡを行い、抗原に対する結合を確認した。

【0073】

実施例２．選別された抗体のＩｇＧへの変換
前記実施例１．３で選別されたＦａｂ形態のファージディスプレイライブラリーで選別された遺伝子に対して、それぞれの重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）に相当する配列をＰＣＲで増幅した。一部の発現量が低いクローンの場合、軽鎖可変領域（ＶＬ）は同様にＰＣＲで増幅し、重鎖可変領域（ＶＨ）に相当する遺伝子配列は、発現量が高いクローンの構造形成部位（ＦＲ）に相当する配列にＣＤＲを移植して作製した。作製された重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）の遺伝子配列は、ＩｇＧ４形態のヒト抗体（ＩｇＧ４ Ｆｃ：配列番号２２９、Ｋａｐｐａ不変領域：配列番号２３０）をコードするように作製された発現ベクター（ｐＣＢ－ＬＩＲ－ｍＡＢ、その他にもＣＭＶ ｐｒｏｍｏｔｅｒ、またはＣＭＶ／ＣＨＯ ｂｅｔａ－ａｃｔｉｎ融合プロモーター（ＫＲ１０－１０３８１２６Ｂ１）を有し、ｈｕｍａｎ ＩｇＧ４のｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉｏｎとｋａｐｐａ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎのｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉｏｎ配列を含むベクターの中でどちらを用いても構わない）に挿入した。前記発現ベクターは、ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇによってそのＤＮＡ配列を確認した。

【0074】

下記表３～表２１に選別された抗体１９種のＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、軽鎖可変領域、重鎖可変領域、軽鎖および重鎖のアミノ酸配列と、軽鎖可変領域遺伝子と重鎖可変領域遺伝子の核酸配列を示した。各クローンに対してクローン番号を付与した。以下、単純にクローン番号のみを表記した。

【表3-1】

【表3-2】

【表4-1】

【表4-2】

【表5-1】

【表5-2】

【表6-1】

【表6-2】

【表7-1】

【表7-2】

【表8-1】

【表8-2】

【表9-1】

【表9-2】

【表10-1】

【表10-2】

【表11-1】

【表11-2】

【表12-1】

【表12-2】

【表13-1】

【表13-2】

【表14-1】

【表14-2】

【表15-1】

【表15-2】

【表16-1】

【表16-2】

【表17-1】

【表17-2】

【表18-1】

【表18-2】

【表19-1】

【表19-2】

【表20-1】

【表20-2】

【表21-1】

【表21-2】

【0075】

実施例３．選別された抗体の製造
前記実施例２で構築されたベクターは、Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｌｕｓ Ｍａｘｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて増幅された。該ベクターは、ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ^ＴＭ細胞を用いて抗体の発現に使用された。該ベクターをＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ^ＴＭ細胞（Ｇｉｂｃｏ）（１．２×１０^９ｃｅｌｌｓ／Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｖｏｌｕｍｅ ２００ｍＬ）にＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ^ＴＭ ＣＨＯ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を６４０μＬ添加してトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）した。Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ１日後、ＥｘｐｉＣＨＯ^ＴＭ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉａ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で３２℃、５％ＣＯ_２の条件下で７～１１日間培養した。一日目にＥｘｐｉＣＨＯ^ＴＭ Ｅｎｈａｎｃｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）１２００μＬとＥｘｐｉＣＨＯ^ＴＭ Ｆｅｅｄ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）４８ｍＬを添加した。
前記培養した細胞を４℃、３５００ｒｐｍで２０分間遠心分離した後、０．２２ｕｍのｂｏｔｔｌｅ－ｔｏｐ ｆｉｌｔｅｒ ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を用いてろ過した。回収した培養液をＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ Ｌ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製した。ＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ ＬにＨｉｔｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅ ５ｍＬカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を装着し、培養液を５ｍＬ／ｍｉｎの流速で流した後、１Ｘ ＰＢＳで１０ ｃｏｌｕｍｎ ｖｏｌｕｍｅ（ＣＶ）で洗浄した。溶出バッファー（０．１Ｍ ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ ｐＨ３．４ ｂｕｆｆｅｒ）を流して目的タンパク質を溶出させた。溶出液はＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ Ｆｉｌｔｅｒ Ｄｅｖｉｃｅ（ＭＷＣＯ １０Ｋ、Ｍｅｒｃｋ）と遠心分離機を用いて濃縮を行った後、１Ｘ ＰＢＳ緩衝溶液でバッファー交換を実施した。

【0076】

精製した抗体試料は、１Ｘ ＰＢＳで希釈して約１ｍｇ／ｍＬとなるように用意した。Ｒｅｄｕｃｉｎｇ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（３Ｘ）またはＮｏｎ－ｒｅｄｕｃｉｎｇ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（３Ｘ）１０ｕｌと精製した抗体試料２０ｕＬを混合した後、９５℃のｈｅａｔｉｎｇ ｂａｔｈに２分間静置した後、取り出して冷却させた。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｇｅｌ（４～１２％）を電気泳動装置に装着した後、ｗｅｌｌ当たり１０μｇの試料を注入し、ｇｅｌを展開した。試料の分子量分析のためにＰｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ^ＴＭ Ｄｕａｌ Ｃｏｌｏｒ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）を別途のｗｅｌｌに注入した。Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎでｇｅｌをｓｔａｉｎｉｎｇし、ｄｅｓｔａｉｎｉｎｇした後、ｇｅｌ写真を撮影した（図１）。

【0077】

実施例４．選別された抗体の結合親和性の分析
前記実施例３で製造された１９種の抗体のＬＩＬＲＢ１抗原に対する親和力をＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて測定した。Ｓｅｒｉｅｓ Ｓ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＢＲ－１００５－３０）上にＡｍｉｎｅ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｋｉｔ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＢＲ－１０００－５０８）を用いてａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｆｃ）抗体（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＢＲ－１００８－３９、最終濃度２５ｕｇ／ｍＬ）を５ｕｌ／ｍｉｎで３６０秒間流して約５０００～７０００ＲＵで固定させた。抗原であるヒトＬＩＬＲＢ１タンパク質（ＬＩＬＲＢ１－Ｈｉｓ、ＲｎＤ ｓｙｓｔｅｍｓ Ｃａｔ．Ｎｏ．８９８９－Ｔ２）を２５ｎＭから４００ｎＭまでの濃度範囲内で互いに異なる５個の濃度で３０ｕｌ／ｍｉｎの速度で注入して、下記の表の通りｋ_ａとｋ_ｄ値を求め、これからＫ_Ｄ値を計算した。抗体１０は、ＬＩＬＲＢ１抗原に対して約２４．１３ｎＭの結合力を示し、抗体１３は、ＬＩＬＲＢ１抗原に対して約３０．２７ｎＭの結合力を示した（表２２）。抗体１３に対するｓｅｎｓｏｒｇｒａｍ結果を図２に示す。

【表22】

【0078】

実施例５：選別された抗体の生体内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）での生物学的活性分析
５．１．細胞表面結合アッセイ（Ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａｙ）
前記実施例４で選別された抗体が細胞表面に発現したＬＩＬＲＢ１とも結合するかどうかを確認するために細胞表面結合アッセイ（Ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａｙ）を行った。ＬＩＬＲＢ１を過剰発現させたＣＨＯ細胞をＣｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｆｉｎｅｄ Ｍｅｄｉｕｍで培養し、２×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるようにＵ－ｂｏｔｔｏｍ ９６－ｗｅｌｌ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅ（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）に分注した。各ｗｅｌｌ当たり最終濃度が１０μｇ／ｍＬとなるように抗体を加え、４℃で３０分間静置した。ＬＩＬＲＢ１に特異的結合を示すために、 ｈｕｍａｎ ＩｇＧ４ ｉｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）も同様に処理した。ＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒで洗浄した後、各ｗｅｌｌにａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ Ｆｃ－ｂｉｏｔｉｎ抗体（ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を加え、４℃で１時間静置した。ＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒで洗浄した後、各ｗｅｌｌにｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ＰＥ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）を加え、４℃で３０分間静置した。ＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒで洗浄した後、懸濁してｉＱｕｅ ｓｃｒｅｅｎｅｒ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）で分析した。図３に示すように、抗体８、抗体１０、抗体１１、抗体１３、抗体１８の場合、ｈｕｍａｎ ＩｇＧ４ ｉｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌ抗体に比べてより多くの結合程度を示した。

【0079】

５．２．ＮＫ細胞による癌細胞死滅能増加分析
前記実施例４で選別された抗体がＮＫ細胞による癌細胞死滅能を増加させるかどうかを確認するために、ＮＫ細胞ＫＨＹＧ－１によるＨＬＡ－Ｇ過剰発現ＨＥＫ２９３細胞の死滅率を分析した。ＫＨＹＧ－１細胞を４×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ（２×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）となるように９６－ｗｅｌｌ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅ（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）に分注した。選別された抗体をＨＬＡ－Ｇ過剰発現ＨＥＫ２９３細胞処理後、最終濃度が１０μｇ／ｍＬとなるように加え、３７℃で１時間静置した。陰性対照群としてｈｕｍａｎ ＩｇＧ４ ｉｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）も同様に処理した。ＨＬＡ－Ｇ過剰発現ＨＥＫ２９３細胞をＩｎｃｕＣｙｔｅ ＣｙｔｏＬｉｇｈｔ Ｒａｐｉｄ Ｒｅｄ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いて製造会社の説明書に従って染色した。１時間後、ＨＬＡ－Ｇ過剰発現ＨＥＫ２９３細胞を４×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ（２×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）となるように加えた。プレートを３７℃、５％ＣＯ_２培養器に設けられたＩｎｃｕＣｙｔｅ Ｓ３（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）に入れ、７２時間イメージを撮影した。

【0080】

各抗体の効能を比較するために、Ｉｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｔｉｂｏｄｙのＮｏｒｍａｌｉｚｅｄ ｒｅｄ ａｒｅａ ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ値が１であるときのＲｅｌａｔｉｖｅ ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ（Ｉｓｏｔｙｐｅ＝１）を次の数式１で求めた。
［数式１］
Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ＝［各抗体のＮｏｒｍａｌｉｚｅｄ ｒｅｄ ａｒｅａ ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ値］／［ＩｓｏｔｙｐｅのＮｏｒｍａｌｉｚｅｄ ｒｅｄ ａｒｅａ ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ値］

【0081】

上記で得られた結果を図４に示す。図４においてＲｅｌａｔｉｖｅ ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙが低いほどＡｎｔｉ－ＬＩＬＲＢ１ ｍＡｂによるＮＫ Ｃｅｌｌ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙが高いと解釈され得る。図４に示すように、試験したすべての抗体（抗体１０、抗体１１、抗体１３）は、ｈｕｍａｎ ＩｇＧ４ Ｉｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌに比べてＨＬＡ－Ｇ過剰発現ＨＥＫ２９３細胞の死滅を増加させた。このような結果は、本発明で提供される抗体は癌細胞に対して高いＣｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙを示す。

【0082】

実施例６．試験抗体の生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）での生物学的活性分析
前記実施例３で抗原に対する結合力が確認された３種の抗体（抗体１０、抗体１１、抗体１３）の抗癌効能の改善要否を確認するために、Ｂｉｏｗａｒｅ Ｂｒｉｔｅ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ ＨＣＴ１１６ Ｒｅｄ－Ｆｌｕｃ大腸癌細胞（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）およびＴＨＰ－１由来マクロファージ（ＴＨＰ－１ ｄｅｒｉｖｅｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）と、抗体を投与した異種移植大腸癌マウス動物モデルを対象として生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）で３種の抗体投与によって腫瘍の大きさが減少するかどうかを確認した。陰性対照群としてｈｕｍａｎ ＩｇＧ１ ｉｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌ抗体（ＢｉｏＸｃｅｌｌ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＢＰ０２９７）を使用した。

【0083】

６．１．ＴＨＰ－１由来マクロファージ（ＴＨＰ－１ ｄｅｒｉｖｅｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）の製造
ＴＨＰ－１由来マクロファージは、ＴＨＰ－１細胞（ＡＴＣＣ）に１５０ｎＭ ｐｈｏｒｂｏｌ １２－ｍｙｒｉｓｔａｔｅ １３－ａｃｅｔａｔｅ（ＰＭＡ、Ｓｉｇｍａ）および２０ｎｇ／ｍＬ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｇａｍｍａ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、１０ｐｇ／ｍＬ ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ（ＬＰＳ、Ｓｉｇｍａ）を加えて分化させて使用した。

【0084】

６．２．マウス動物モデルでの抗体の抗癌効能分析
マウス動物モデルは、３×１０^６個のＨＣＴ１１６ Ｒｅｄ－Ｆｌｕｃ大腸癌細胞と３×１０^６個のＴＨＰ－１由来マクロファージ、および抗体（１匹当たり２０μｇ）を５週齢の雌性ＣＩＥＡ ＮＯＧ Ｍｏｕｓｅ（ＮＯＧ免疫不全マウス、公益財団法人実験動物中央研究所）に皮下注射して使用した。また、各抗体は細胞移植後、４日目から腹腔注射によって５ｍｇ／ｋｇの用量で週２回投与した。

【0085】

抗体投与による腫瘍の大きさの変化を測定して、図５に示す。図５に示すように、ＨＣＴ１１６大腸癌細胞およびＴＨＰ－１由来マクロファージを移植したマウス動物モデルにおいて、試験したすべての抗体（抗体１０、抗体１１、抗体１３）は明確な腫瘍成長抑制効能を示し、陰性対照群と統計学的に有意な差を示した。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【配列表】

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