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特許7513233アレルゲン検出用マーカーおよびそれを用いたアレルゲン検出方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-07-01
(45)【発行日】2024-07-09
(54)【発明の名称】アレルゲン検出用マーカーおよびそれを用いたアレルゲン検出方法
(51)【国際特許分類】
G01N 30/88 20060101AFI20240702BHJP
G01N 30/06 20060101ALI20240702BHJP
G01N 30/72 20060101ALI20240702BHJP
C12Q 1/37 20060101ALN20240702BHJP
【ＦＩ】
G01N30/88 J
G01N30/06 E
G01N30/72 C
C12Q1/37 ZNA
【請求項の数】
15
(21)【出願番号】P 2021542605
(86)(22)【出願日】2020-07-09
(86)【国際出願番号】 JP2020026896
(87)【国際公開番号】W WO2021039147
(87)【国際公開日】2021-03-04
【審査請求日】2023-06-19
(31)【優先権主張番号】P 2019158119
(32)【優先日】2019-08-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】597128004
【氏名又は名称】国立医薬品食品衛生研究所長
(73)【特許権者】
【識別番号】000226998
【氏名又は名称】株式会社日清製粉グループ本社
(74)【代理人】
【識別番号】110000084
【氏名又は名称】弁理士法人アルガ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】穐山 浩
(72)【発明者】
【氏名】菊地 博之
(72)【発明者】
【氏名】関 友輔
(72)【発明者】
【氏名】有本 千里
【審査官】大瀧 真理
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１８／１６５５１（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１４－５２５５８８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００６－１２６０８３（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２００３／６６０７９（ＷＯ，Ａ２）
【文献】JIRA, W., MUNCH,S.，A sensitive HPLC-MS/MS screening method for the simultaneous detection of barley, maize, oats, rice, tye and wheat proteins in meat ptoducts，Food Chemistry，2019年，Vol.275，pp.214-223
【文献】MARTINEZ-ESTESO, M. J. et al.，Defining the wheat gluten peptide fingerprint via a discovery and targeted proteomics approach，Journal of Proteomics，2016年，Vol.147，pp.156-168
【文献】YOSHIOKA, H. et al.，Expression and epitope analysis of the major allergenic protein Fag e 1 from buckwheat，Journal of Plant Physiology，2004年，Vol.161，pp.761-767
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ ３０／０６
Ｇ０１Ｎ ３０／７２
Ｇ０１Ｎ ３０／８８
Ｃ１２Ｑ １／３７
Ｇ０１Ｎ ２７／６２
Ｇ０１Ｎ ３３／１０
Ｇ０１Ｎ ３３／６８
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
試料中のアレルゲンを検出する方法であって、試料をタンパク質分解酵素で処理すること、および
クロマトグラフィー分離を利用した分析により、該酵素処理した試料中におけるアレルゲン由来ポリペプチドの存在の有無を検出することを含み、
該アレルゲン由来ポリペプチドが、配列番号１、２、５、６および７のアミノ酸配列からなるポリペプチドからなる群より選択される１種以上を含む、
方法。
【請求項2】
前記クロマトグラフィー分離を利用した分析が液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）である、請求項１記載の方法。【請求項3】
前記アレルゲンが小麦であり、前記アレルゲン由来ポリペプチドが配列番号１および２のアミノ酸配列からなるポリペプチドからなる群より選択される１種以上を含む、請求項１又は２記載の方法。【請求項4】
前記アレルゲン由来ポリペプチドが、さらに配列番号３および４のアミノ酸配列からなるポリペプチドからなる群より選択される１種以上を含む、請求項３記載の方法。【請求項5】
前記アレルゲン由来ポリペプチドが、さらに配列番号６７～７０のアミノ酸配列からなるポリペプチドからなる群より選択される１種以上を含む、請求項３又は４のいずれか１項記載の方法。【請求項6】
前記アレルゲンがソバであり、前記アレルゲン由来ポリペプチドが配列番号５～７のアミノ酸配列からなるポリペプチドからなる群より選択される１種以上を含む、請求項１又は２記載の方法。【請求項7】
前記アレルゲン由来ポリペプチドが、さらに配列番号８～１０のアミノ酸配列からなるポリペプチドからなる群より選択される１種以上を含む、請求項６記載の方法。【請求項8】
前記アレルゲンが小麦およびソバであり、前記アレルゲン由来ポリペプチドが、配列番号１～２のアミノ酸配列からなるポリペプチドのいずれか１種以上と、配列番号５～７のアミノ酸配列からなるポリペプチドのいずれか１種以上とを含む、請求項１又は２記載の方法。【請求項9】
前記アレルゲン由来ポリペプチドが、さらに配列番号３および４のアミノ酸配列からなるポリペプチドからなる群より選択される１種以上を含む、請求項８記載の方法。【請求項10】
前記アレルゲン由来ポリペプチドが、さらに配列番号６７～７０のアミノ酸配列からなるポリペプチドからなる群より選択される１種以上を含む、請求項８又は９記載の方法。【請求項11】
前記アレルゲン由来ポリペプチドが、さらに配列番号８～１０のアミノ酸配列からなるポリペプチドからなる群より選択される１種以上を含む、請求項８～１０のいずれか１項記載の方法。【請求項12】
前記アレルゲン由来ポリペプチドが、配列番号１、２、５、６および７のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む、請求項８記載の方法。【請求項13】
配列番号１または２のアミノ酸配列からなる小麦アレルゲン検出用マーカー。【請求項14】
配列番号５、６または７のアミノ酸配列からなるソバアレルゲン検出用マーカー。【請求項15】
配列番号６７～７０のいずれかのアミノ酸配列からなる小麦アレルゲン検出用マーカー。 【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、試料中のアレルゲンを検出するためのマーカーおよびそれを用いたアレルゲン検出方法に関する。
【背景技術】
【0002】
食物アレルギーは食品中のアレルゲン（アレルギー性物質）に対する過剰な免疫応答により引き起こされる。アレルゲンを含む食品の喫食による健康被害事例が多数報告されている。我が国では、食物アレルギーの発症数、症状の重篤性が高い特定原材料７品目（卵、乳、小麦、落花生、エビ、ソバ、カニ）について、食品における表示が義務付けられている。
【0003】
現在、アレルゲン性タンパク質を分析する方法として、ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロット法、ＰＣＲ法が公定試験法として使用されている。しかし、ＥＬＩＳＡ法は、抗体の特異性や交差反応性に起因する偽陰性や偽陽性が出ることがある。ウエスタンブロット法は、検査法が煩雑である。またＰＣＲ法は、ＤＮＡを含まない食材には適用できない。これらの既存の試験法の欠点を克服できる迅速、簡便かつ頑健性の高い新たなアレルゲン検出方法の開発が求められている。
【0004】
近年、ＬＣ－ＭＳによるアレルゲンの分析が、高感度で選択性の高いアレルゲンの検出手法として開発されている。特許文献１には、オボアルブミン、リゾチーム、カゼイン、ラクトグロブリン、高分子量グルテニン、低分子量グルテニン、コムギタンパク質、ライムギタンパク質、カラスムギタンパク質、オオムギタンパク質、カラシナタンパク質、ゴマタンパク質、マカダミアナッツタンパク質、ピスタチオナッツタンパク質、ブラジルナッツタンパク質、クルミタンパク質、ラッカセイタンパク質およびヘーゼルナッツタンパク質からなる群より選択されるアレルゲンを酵素分解して得られる特定の配列のペプチドをＬＣ－ＭＳ／ＭＳで検出する、試料中の上記アレルゲンを検出する方法が記載されている。特許文献２には、試料組成物からアレルゲンを含む抽出液を形成し、該抽出液中のアレルゲンの量をＬＣ－ＵＶ／ＭＳまたはＬＣ－ＭＳを使用して測定する、組成物中のアレルゲン含有量を測定する方法が記載されている。特許文献３には、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用して試料中のソバ、甲殻類、乳、卵またはラッカセイ由来のアレルゲンポリペプチドを検出する方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【文献】特表２０１４－５２５５８８号公報
【文献】特表２０１３－５３９０３９号公報
【文献】国際公開公報第２０１８／０１６５５１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
食品等の試料中におけるアレルゲンをより簡便かつ高感度に検出できる方法が求められている。特に、小麦由来アレルゲンである低分子量（ＬＭＷ）グルテニンについては、従来感度、特異性ともに充分な検出法が見つかっていなかったため、これを高感度に検出する方法が求められていた。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者らは、小麦グルテニンまたはソバに含まれる特定のアミノ酸配列が、小麦またはソバ由来アレルゲンのマーカーとして使用できること、したがって、当該アミノ酸配列を検出することにより、アレルゲンである小麦またはソバを高感度に検出できることを見出した。
【0008】
一実施形態において、本発明は、以下を提供する。
〔１〕試料中のアレルゲンを検出する方法であって、
試料をタンパク質分解酵素で処理すること、および
クロマトグラフィー分離を利用した分析により、該酵素処理した試料中におけるアレルゲン由来ポリペプチドの存在の有無を検出することを含み、
該アレルゲン由来ポリペプチドが、配列番号１、２、５、６および７のアミノ酸配列からなるポリペプチドからなる群より選択される１種以上を含む、
方法。
〔２〕前記クロマトグラフィー分離を利用した分析が液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）である、〔１〕記載の方法。
〔３〕前記アレルゲンが小麦であり、前記アレルゲン由来ポリペプチドが配列番号１および２のアミノ酸配列からなるポリペプチドからなる群より選択される１種以上を含む、〔１〕又は〔２〕記載の方法。
〔４〕前記アレルゲン由来ポリペプチドが、さらに配列番号３および４のアミノ酸配列からなるポリペプチドからなる群より選択される１種以上を含む、〔３〕記載の方法。
〔５〕前記アレルゲン由来ポリペプチドが、さらに配列番号６７～７０のアミノ酸配列からなるポリペプチドからなる群より選択される１種以上を含む、〔３〕又は〔４〕記載の方法。
〔６〕前記アレルゲンがソバであり、前記アレルゲン由来ポリペプチドが配列番号５～７のアミノ酸配列からなるポリペプチドからなる群より選択される１種以上を含む、〔１〕又は〔２〕記載の方法。
〔７〕前記アレルゲン由来ポリペプチドが、さらに配列番号８～１０のアミノ酸配列からなるポリペプチドからなる群より選択される１種以上を含む、〔６〕記載の方法。
〔８〕前記アレルゲンが小麦およびソバであり、前記アレルゲン由来ポリペプチドが、配列番号１～２のアミノ酸配列からなるポリペプチドのいずれか１種以上と、配列番号５～７のアミノ酸配列からなるポリペプチドのいずれか１種以上とを含む、〔１〕又は〔２〕記載の方法。
〔９〕前記アレルゲン由来ポリペプチドが、さらに配列番号３および４のアミノ酸配列からなるポリペプチドからなる群より選択される１種以上を含む、〔８〕記載の方法。
〔１０〕前記アレルゲン由来ポリペプチドが、さらに配列番号６７～７０のアミノ酸配列からなるポリペプチドからなる群より選択される１種以上を含む、〔８〕又は〔９〕記載の方法。
〔１１〕前記アレルゲン由来ポリペプチドが、さらに配列番号８～１０のアミノ酸配列からなるポリペプチドからなる群より選択される１種以上を含む、〔８〕～〔１０〕のいずれか１項記載の方法。
〔１２〕前記アレルゲン由来ポリペプチドが、配列番号１、２、５、６および７のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む、〔８〕記載の方法。
〔１３〕配列番号１または２のアミノ酸配列からなる小麦アレルゲン検出用マーカー。
〔１４〕配列番号５、６または７のアミノ酸配列からなるソバアレルゲン検出用マーカー。
〔１５〕配列番号６７～７０のいずれかのアミノ酸配列からなる小麦アレルゲン検出用マーカー。
〔１〕試料中のアレルゲンを検出する方法であって、
試料をタンパク質分解酵素で処理すること、および
クロマトグラフィー分離を利用した分析により、該酵素処理した試料中におけるアレルゲン由来ポリペプチドの存在の有無を検出することを含み、
該アレルゲン由来ポリペプチドが、配列番号１、２、５、６および７のアミノ酸配列からなるポリペプチドからなる群より選択される１種以上を含む、
方法。
〔２〕前記クロマトグラフィー分離を利用した分析が液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）である、〔１〕記載の方法。
〔３〕前記アレルゲンが小麦であり、前記アレルゲン由来ポリペプチドが配列番号１および２のアミノ酸配列からなるポリペプチドからなる群より選択される１種以上を含む、〔１〕又は〔２〕記載の方法。
〔４〕前記アレルゲン由来ポリペプチドが、さらに配列番号３および４のアミノ酸配列からなるポリペプチドからなる群より選択される１種以上を含む、〔３〕記載の方法。
〔５〕前記アレルゲン由来ポリペプチドが、さらに配列番号６７～７０のアミノ酸配列からなるポリペプチドからなる群より選択される１種以上を含む、〔３〕又は〔４〕記載の方法。
〔６〕前記アレルゲンがソバであり、前記アレルゲン由来ポリペプチドが配列番号５～７のアミノ酸配列からなるポリペプチドからなる群より選択される１種以上を含む、〔１〕又は〔２〕記載の方法。
〔７〕前記アレルゲン由来ポリペプチドが、さらに配列番号８～１０のアミノ酸配列からなるポリペプチドからなる群より選択される１種以上を含む、〔６〕記載の方法。
〔８〕前記アレルゲンが小麦およびソバであり、前記アレルゲン由来ポリペプチドが、配列番号１～２のアミノ酸配列からなるポリペプチドのいずれか１種以上と、配列番号５～７のアミノ酸配列からなるポリペプチドのいずれか１種以上とを含む、〔１〕又は〔２〕記載の方法。
〔９〕前記アレルゲン由来ポリペプチドが、さらに配列番号３および４のアミノ酸配列からなるポリペプチドからなる群より選択される１種以上を含む、〔８〕記載の方法。
〔１０〕前記アレルゲン由来ポリペプチドが、さらに配列番号６７～７０のアミノ酸配列からなるポリペプチドからなる群より選択される１種以上を含む、〔８〕又は〔９〕記載の方法。
〔１１〕前記アレルゲン由来ポリペプチドが、さらに配列番号８～１０のアミノ酸配列からなるポリペプチドからなる群より選択される１種以上を含む、〔８〕～〔１０〕のいずれか１項記載の方法。
〔１２〕前記アレルゲン由来ポリペプチドが、配列番号１、２、５、６および７のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む、〔８〕記載の方法。
〔１３〕配列番号１または２のアミノ酸配列からなる小麦アレルゲン検出用マーカー。
〔１４〕配列番号５、６または７のアミノ酸配列からなるソバアレルゲン検出用マーカー。
〔１５〕配列番号６７～７０のいずれかのアミノ酸配列からなる小麦アレルゲン検出用マーカー。
【発明の効果】
【0009】
本発明は、食品等の試料中における微量のアレルゲン（小麦またはソバ）の存在を検出することができる、高感度なアレルゲン検出方法を提供する。特に、本発明によれば、これまで高感度検出が困難であったＬＭＷグルテニンの検出が可能である。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1】８種類の小麦試料から検出された配列番号１のペプチドのピークを示すクロマトグラム。
【発明を実施するための形態】
【0011】
本発明は、試料中のアレルゲンを検出する方法を提供する。本発明において、アレルゲン検出に供する対象物の例としては、食品、化粧品、医薬品、それらの原材料、それらの製造工程で使用する機器類、などが挙げられるが、これらに限定されない。これらの対象物を、通常の前処理、例えば粉砕、溶解、懸濁、抽出等、もしくはそれらの組み合わせにかけたものを、本発明の方法の試料として用いることができる。あるいは、対象物が機器類の場合、その洗浄液やふき取り検体など、またはそれらを粉砕、溶解、懸濁、抽出等、もしくはそれらの組み合わせにかけたものを、本発明の方法の試料として用いることができる。なお、本発明の方法に用いる試料の調製方法は、上記に限定されず、次に述べるタンパク質分解酵素処理のための試料の調製に用いることができるあらゆる方法を包含し得る。
【0012】
本発明の方法においては、調製した試料を、タンパク質分解酵素で処理する。本発明の方法で用いられるタンパク分解酵素の例としては、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、テルモリシンなどが挙げられ、好ましくはトリプシンまたはキモトリプシンである。例えば、全ての試料をトリプシンもしくはキモトリプシンのいずれかで処理してもよく、またはトリプシン処理した試料とキモトリプシン処理した試料をそれぞれ調製してもよい。より好ましくは、後述する配列番号１～１０のアミノ酸配列からなるポリペプチドを検出する場合にはトリプシンが用いられ、一方、後述する配列番号６７～７０のアミノ酸配列からなるポリペプチドを検出する場合にはキモトリプシンが用いられる。処理の条件は、酵素の種類に応じて適宜選択すればよいが、例えばトリプシンの場合、酵素濃度１０００～２００００Ｕ、２５～４５℃、ｐＨ７～９程度で４～２４時間が好ましい。キモトリプシンの場合も同様の条件が好ましい。当該酵素処理は、標的のアレルゲンのタンパク質分子を分解して、該アレルゲンに由来するポリペプチドを生成する。したがって、試料中に標的のアレルゲンが含まれていれば、上記酵素処理後の試料は、標的アレルゲンに由来するポリペプチドを含む。一方、試料中に標的のアレルゲンが含まれていなければ、上記酵素処理後の試料は、標的アレルゲンに由来するポリペプチドを含まない。
【0013】
したがって、上記タンパク分解酵素で処理した試料中における１種以上の標的アレルゲン由来ポリペプチドの存在の有無を検出することにより、該試料中における標的アレルゲンの存在の有無を判定することができる。本発明の方法で検出する標的アレルゲンとしては、小麦およびソバが挙げられる。
【0014】
標的アレルゲンが小麦の場合、本発明の方法においては、γ-グリアジン、低分子量（ＬＭＷ）グルテニン、および高分子量（ＨＭＷ）グルテニンのいずれか１種以上の分解産物をアレルゲン由来ポリペプチドとして検出する。本発明の方法の一実施形態においては、下記に示す配列番号１のアミノ酸配列からなるＬＭＷグルテニン由来ポリペプチドおよび配列番号２のアミノ酸配列からなるＨＭＷグルテニン由来ポリペプチドの一方または両方を、アレルゲン由来ポリペプチドとして検出する。好ましくは、少なくとも配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドを、アレルゲン由来ポリペプチドとして検出する。さらに、配列番号１または２のアミノ酸配列からなるポリペプチドに加えて、下記に示す配列番号３のアミノ酸配列からなるポリペプチドおよび配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチドからなる群より選択される１種以上をアレルゲン由来ポリペプチドとして検出してもよい。したがって、本発明において、配列番号１～４のポリペプチドの各々は、小麦アレルゲンを検出するためのポリペプチドマーカーとして使用され得る。
QIPEQSR （配列番号１）：ＬＭＷグルテニン由来ポリペプチド
GGSFYPGETTPPQQLQQR（配列番号２）：ＨＭＷグルテニン由来ポリペプチド
SVAVSQVAR （配列番号３）：ＨＭＷグルテニン由来ポリペプチド
ELQELQER （配列番号４）：ＨＭＷグルテニン由来ポリペプチド
QIPEQSR （配列番号１）：ＬＭＷグルテニン由来ポリペプチド
GGSFYPGETTPPQQLQQR（配列番号２）：ＨＭＷグルテニン由来ポリペプチド
SVAVSQVAR （配列番号３）：ＨＭＷグルテニン由来ポリペプチド
ELQELQER （配列番号４）：ＨＭＷグルテニン由来ポリペプチド
【0015】
標的アレルゲンが小麦の場合、本発明の方法の別の一実施形態においては、下記に示す配列番号６７のアミノ酸配列からなるγ-グリアジン由来ポリペプチドおよび配列番号６８～７０のアミノ酸配列からなるＬＭＷグルテニン由来ポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種を、アレルゲン由来ポリペプチドとして検出する。好ましくは、配列番号６７～７０のアミノ酸配列からなるポリペプチドの２種以上、より好ましくは全部が、アレルゲン由来ポリペプチドとして検出される。したがって、本発明において、配列番号６７～７０のポリペプチドの各々は、小麦アレルゲンを検出するためのポリペプチドマーカーとして使用され得る。
EGIRSL （配列番号６７）：γ-グリアジン由来ポリペプチド
ARSQML （配列番号６８）：ＬＭＷグルテニン由来ポリペプチド
EAIRAIIY （配列番号６９）：ＬＭＷグルテニン由来ポリペプチド
VQQQIPVVQPSIL（配列番号７０）：ＬＭＷグルテニン由来ポリペプチド
EGIRSL （配列番号６７）：γ-グリアジン由来ポリペプチド
ARSQML （配列番号６８）：ＬＭＷグルテニン由来ポリペプチド
EAIRAIIY （配列番号６９）：ＬＭＷグルテニン由来ポリペプチド
VQQQIPVVQPSIL（配列番号７０）：ＬＭＷグルテニン由来ポリペプチド
【0016】
あるいは、配列番号１～４のアミノ酸配列からなるポリペプチドからなる群より選択される１種以上と、配列番号６７～７０のアミノ酸配列からなるポリペプチドからなる群より選択される１種以上を組み合わせて、小麦アレルゲン由来ポリペプチドとして検出してもよい。組み合わせの例としては、配列番号１～２のアミノ酸配列からなるポリペプチドからなる群より選択される１種以上と、配列番号６７～７０のアミノ酸配列からなるポリペプチドからなる群より選択される１種以上との組み合わせ；配列番号１～２のアミノ酸配列からなるポリペプチドからなる群より選択される１種以上と、配列番号３～４のアミノ酸配列からなるポリペプチドからなる群より選択される１種以上と、配列番号６７～７０のアミノ酸配列からなるポリペプチドからなる群より選択される１種以上との組み合わせ；配列番号１および２のアミノ酸配列からなるポリペプチドの全てと、配列番号６７～７０のアミノ酸配列からなるポリペプチドの全てとの組み合わせ；配列番号１～４および６７～７０のアミノ酸配列からなるポリペプチドの組み合わせ、などが挙げられる。
【0017】
標的アレルゲンがソバの場合、本発明の方法においては、１１Ｓグロブリンおよび／または１３Ｓグロブリンの分解産物をアレルゲン由来ポリペプチドとして検出する。より詳細には、下記に示す配列番号５のアミノ酸配列からなる１１Ｓグロブリンおよび１３Ｓグロブリン由来ポリペプチド、配列番号６のアミノ酸配列からなる１１Ｓグロブリンおよび１３Ｓグロブリン由来ポリペプチド、ならびに配列番号７のアミノ酸配列からなる１３Ｓグロブリン由来ポリペプチドからなる群より選択される１種以上を、アレルゲン由来ポリペプチドとして検出する。好ましくは、配列番号５～７のアミノ酸配列からなるポリペプチドの全てを、アレルゲン由来ポリペプチドとして検出する。さらに、配列番号５、６または７のアミノ酸配列からなるポリペプチドに加えて、下記に示す配列番号８～１０のアミノ酸配列からなるポリペプチドからなる群より選択される１種以上を、アレルゲン由来ポリペプチドとして検出してもよい。したがって、本発明において、配列番号５～１０のポリペプチドの各々は、ソバアレルゲンを検出するためのポリペプチドマーカーとして使用され得る。
NAIIGPR （配列番号５）：１１Ｓグロブリン／１３Ｓグロブリン由来ポリペプチド
NAILGPR （配列番号６）：１１Ｓグロブリン／１３Ｓグロブリン由来ポリペプチド
ADVFNPR （配列番号７）：１３Ｓグロブリン由来ポリペプチド
GFIVQAR （配列番号８）：１３Ｓグロブリン由来ポリペプチド
SVFDDNVQR（配列番号９）：１３Ｓグロブリン由来ポリペプチド
VQVVGDEGR（配列番号１０）：１３Ｓグロブリン由来ポリペプチド
NAIIGPR （配列番号５）：１１Ｓグロブリン／１３Ｓグロブリン由来ポリペプチド
NAILGPR （配列番号６）：１１Ｓグロブリン／１３Ｓグロブリン由来ポリペプチド
ADVFNPR （配列番号７）：１３Ｓグロブリン由来ポリペプチド
GFIVQAR （配列番号８）：１３Ｓグロブリン由来ポリペプチド
SVFDDNVQR（配列番号９）：１３Ｓグロブリン由来ポリペプチド
VQVVGDEGR（配列番号１０）：１３Ｓグロブリン由来ポリペプチド
【0018】
一実施形態において、標的アレルゲンが小麦およびソバの場合、検出されるアレルゲン由来ポリペプチドは、好ましくは配列番号１～２のアミノ酸配列からなるポリペプチドのいずれか１種以上と、配列番号５～７のアミノ酸配列からなるポリペプチドのいずれか１種以上とを含み、より好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドと、配列番号５～７のアミノ酸配列からなるポリペプチドのいずれか１種以上とを含み、さらに好ましくは、配列番号１、２、５、６および７のアミノ酸配列からなるポリペプチドの全てを含む。検出されるアレルゲン由来ポリペプチドには、さらに配列番号３～４のアミノ酸配列からなるポリペプチドのいずれか１種以上が含まれていてもよい。例えば、本発明の方法の標的アレルゲンが小麦およびソバの場合、検出されるアレルゲン由来ポリペプチドの好ましい例としては、配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドと、配列番号５～７のアミノ酸配列からなるポリペプチドのいずれか１種以上との組み合わせ；配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドと、配列番号５～７のアミノ酸配列からなるポリペプチドの全てとの組み合わせ；配列番号１～２のアミノ酸配列からなるポリペプチドの全てと、配列番号５～７のアミノ酸配列からなるポリペプチドの全てとの組み合わせ；配列番号１～４のアミノ酸配列からなるポリペプチドの全てと、配列番号５～７のアミノ酸配列からなるポリペプチドの全てとの組み合わせ；配列番号１～２のアミノ酸配列からなるポリペプチドの全てと、配列番号５～１０のアミノ酸配列からなるポリペプチドの全てとの組み合わせ、などが挙げられ、より好ましい例は、配列番号１～１０のアミノ酸配列からなるポリペプチドの全てである。
【0019】
別の一実施形態において、標的アレルゲンが小麦およびソバの場合、検出されるアレルゲン由来ポリペプチドは、好ましくは配列番号６７～７０のアミノ酸配列からなるポリペプチドのいずれか１種以上と、配列番号５～７のアミノ酸配列からなるポリペプチドのいずれか１種以上とを含み、より好ましくは、配列番号６７～７０、５、６および７のアミノ酸配列からなるポリペプチドの全てを含む。例えば、本発明の方法の標的アレルゲンが小麦およびソバの場合、検出されるアレルゲン由来ポリペプチドの好ましい例としては、配列番号６７～７０のアミノ酸配列からなるポリペプチドのいずれか１種以上と、配列番号５～７のアミノ酸配列からなるポリペプチドのいずれか１種以上との組み合わせ；配列番号６７～７０のアミノ酸配列からなるポリペプチドの全てと、配列番号５～７のアミノ酸配列からなるポリペプチドの全てとの組み合わせ；配列番号６７～７０のアミノ酸配列からなるポリペプチドの全てと、配列番号５～１０のアミノ酸配列からなるポリペプチドの全てとの組み合わせ、などが挙げられ、より好ましい例は、配列番号６７～７０および５～１０のアミノ酸配列からなるポリペプチドの全てである。
【0020】
さらに別の一実施形態において、標的アレルゲンが小麦およびソバの場合、検出されるアレルゲン由来ポリペプチドは、好ましくは配列番号１～２のアミノ酸配列からなるポリペプチドのいずれか１種以上と、配列番号６７～７０のアミノ酸配列からなるポリペプチドのいずれか１種以上と、配列番号５～７のアミノ酸配列からなるポリペプチドのいずれか１種以上とを含み、より好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドと、配列番号６７～７０のアミノ酸配列からなるポリペプチドのいずれか１種以上と、配列番号５～７のアミノ酸配列からなるポリペプチドのいずれか１種以上を含み、さらに好ましくは、配列番号１、２、６７～７０、５、６および７のアミノ酸配列からなるポリペプチドの全てを含む。検出されるアレルゲン由来ポリペプチドには、さらに配列番号３～４のアミノ酸配列からなるポリペプチドのいずれか１種以上が含まれていてもよい。例えば、本発明の方法の標的アレルゲンが小麦およびソバの場合、検出されるアレルゲン由来ポリペプチドの好ましい例としては、配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドと、配列番号６７～７０のアミノ酸配列からなるポリペプチドのいずれか１種以上と、配列番号５～７のアミノ酸配列からなるポリペプチドのいずれか１種以上との組み合わせ；配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドと、配列番号３～４のアミノ酸配列からなるポリペプチドのいずれか１種以上と、配列番号６７～７０のアミノ酸配列からなるポリペプチドのいずれか１種以上と、配列番号５～７のアミノ酸配列からなるポリペプチドのいずれか１種以上との組み合わせ；配列番号１～２のアミノ酸配列からなるポリペプチドの全てと、配列番号６７～７０のアミノ酸配列からなるポリペプチドのいずれか１種以上と、配列番号５～７のアミノ酸配列からなるポリペプチドのいずれか１種以上との組み合わせ；配列番号１～２のアミノ酸配列からなるポリペプチドの全てと、配列番号３～４のアミノ酸配列からなるポリペプチドのいずれか１種以上と、配列番号６７～７０のアミノ酸配列からなるポリペプチドのいずれか１種以上と、配列番号５～７のアミノ酸配列からなるポリペプチドのいずれか１種以上との組み合わせ；配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドと、配列番号６７～７０のアミノ酸配列からなるポリペプチドのいずれか１種以上と、配列番号５～７のアミノ酸配列からなるポリペプチドの全てとの組み合わせ；配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドと、配列番号６７～７０のアミノ酸配列からなるポリペプチドの全てと、配列番号５～７のアミノ酸配列からなるポリペプチドの全てとの組み合わせ；配列番号１～２および６７～７０のアミノ酸配列からなるポリペプチドの全てと、配列番号５～７のアミノ酸配列からなるポリペプチドの全てとの組み合わせ；配列番号１～４および６７～７０のアミノ酸配列からなるポリペプチドの全てと、配列番号５～７のアミノ酸配列からなるポリペプチドの全てとの組み合わせ；配列番号１～２および６７～７０のアミノ酸配列からなるポリペプチドの全てと、配列番号５～１０のアミノ酸配列からなるポリペプチドの全てとの組み合わせ；配列番号１～１０および６７～７０のアミノ酸配列からなるポリペプチドの全て、などが挙げられる。
【0021】
本発明の方法では、上記配列番号１～１０および６７～７０から選択されるポリペプチド以外の他の小麦またはソバ由来ポリペプチドを、標的アレルゲン由来ポリペプチドとしてさらに検出してもよい。そのような他のポリペプチドの例としては、小麦については、特許文献１に開示されるコムギタンパク質に特異的なポリペプチド（本明細書において配列番号１１～６２のアミノ酸配列からなるポリペプチドとして開示される）から選択される１種以上が挙げられ、ソバについては、特許文献３に開示されるソバタンパク質に特異的なポリペプチド（本明細書において配列番号６３～６６のアミノ酸配列からなるポリペプチドとして開示される）から選択される１種以上が挙げられる。
【0022】
さらに本発明の方法においては、小麦およびソバに加えて、他のアレルゲンを標的アレルゲンとしてさらに検出してもよい。そのような他のアレルゲンの好ましい例としては、カニ、エビなどの甲殻類、乳、卵、および落花生が挙げられる。
【0023】
カニ、エビなどの甲殻類については、トロポミオシンの分解産物を、アレルゲン由来ポリペプチドとして検出することができる。検出すべきポリペプチドの例としては、特許文献３に配列番号８～１２として開示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドから選択される１種以上が挙げられる。
【0024】
乳については、カゼインまたはβラクトグロブリンの分解産物を、アレルゲン由来ポリペプチドとして検出することができる。検出すべきポリペプチドの例としては、特許文献１に配列番号１２～２９として開示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドから選択される１種以上、ならびに特許文献３に配列番号１３～１７として開示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドから選択される１種以上が挙げられる。
【0025】
卵については、オボアルブミンの分解産物を、アレルゲン由来ポリペプチドとして検出することができる。検出すべきポリペプチドの例としては、特許文献１に配列番号１～７として開示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドから選択される１種以上、ならびに特許文献３に配列番号１８～２１として開示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドから選択される１種以上が挙げられる。
【0026】
ラッカセイについては、Ara h1-3の分解産物を、アレルゲン由来ポリペプチドとして検出することができる。検出すべきポリペプチドの例としては、特許文献１に配列番号１８２～１８７として開示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドから選択される１種以上、ならびに特許文献３に配列番号２２～２４として開示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドから選択される１種以上が挙げられる。
【0027】
上記タンパク分解酵素で処理した試料中における標的アレルゲン由来ポリペプチドの存在の有無を検出する手段としては、クロマトグラフィー分離を利用した分析が好適である。クロマトグラフィー分離を利用した分析としては、液体クロマトグラフィー質量分析、例えば、液体クロマトグラフィータンデム型質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）、液体クロマトグラフィー飛行時間型質量分析（ＬＣ－ＴＯＦ／ＭＳ）などが挙げられる。測定精度（Ｓ／Ｎ比）が高くかつ複数ペプチドを一度に検出できることから、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを用いた多重反応モニタリング（ＭＲＭ）が好ましい。
【0028】
本発明の方法において、標的アレルゲン由来ポリペプチドの検出に用いるクロマトグラフィーとしては、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）が好ましく、逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）がより好ましい。また好ましくは、該ＬＣは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）であり、さらに好ましくはＲＰ－ＨＰＬＣである。ＲＰＬＣ用の担体としては、シリカゲルやポリマーゲル基材に炭化水素鎖（好ましくはオクタデシル基）を結合した充填剤を有する担体、例えばＣ１８カラム、Ｃ８カラムなどが挙げられる。該ＬＣの移動相（溶離液）は、目的の各アレルゲン由来ポリペプチドを個別に分離することができるものであればよく、例えば、ギ酸水溶液（Ａ）とギ酸／アセトニトリル水溶液（Ｂ）との１００：０～０：１００（体積比）グラジエント溶液が挙げられるが、これに限定されない。
【0029】
液体クロマトグラフィー質量分析においては、上記ＬＣの溶出物を質量分析（ＭＳ／ＭＳ、ＴＯＦ／ＭＳ等）にかける。質量分析は、タンデム四重極型質量分析装置、飛行時間型質量分析装置等の公知の質量分析装置を用いて、ペプチドの検出に用いられる通常の条件に従って実施することができる。例えば、エレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ）または大気圧化学イオン化法（ＡＰＣＩ）を用いた多重反応モニタリング（ＭＲＭ）が好ましい。質量分析では、溶出物中の各ポリペプチドは、質量数／電荷（ｍ／ｚ）に従って分離される。例えば、目的のポリペプチドのｍ／ｚ値を予めデータベース化しておくことにより、測定されたｍ／ｚ値に基づいて、試料中における目的のポリペプチドの有無を検出することができる。
【実施例】
【0030】
以下に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【0031】
（試薬）
トリプシン（シグマアルドリッチ、分子生物学研究用）
キモトリプシン（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、ブタ膵臓由来、生化学分析用）
ヨードアセトアミド（ＩＡ）（シグマアルドリッチ、分子生物学研究用）
ジチオスレイトール（ＤＴＴ）（シグマアルドリッチ、分子生物学研究用）
炭酸水素ナトリウム（純正化学 特級）
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）（富士フイルム和光純薬、特級）
尿素（富士フイルム和光純薬、特級）
トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（純正化学、特級）
アセトニトリル（富士フイルム和光純薬、ＨＰＬＣ用）
メタノール（富士フイルム和光純薬、ＨＰＬＣ用）
ギ酸（関東化学、ＬＣ／ＭＳ用）
トリプシン（シグマアルドリッチ、分子生物学研究用）
キモトリプシン（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、ブタ膵臓由来、生化学分析用）
ヨードアセトアミド（ＩＡ）（シグマアルドリッチ、分子生物学研究用）
ジチオスレイトール（ＤＴＴ）（シグマアルドリッチ、分子生物学研究用）
炭酸水素ナトリウム（純正化学 特級）
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）（富士フイルム和光純薬、特級）
尿素（富士フイルム和光純薬、特級）
トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（純正化学、特級）
アセトニトリル（富士フイルム和光純薬、ＨＰＬＣ用）
メタノール（富士フイルム和光純薬、ＨＰＬＣ用）
ギ酸（関東化学、ＬＣ／ＭＳ用）
【0032】
（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ装置）
ＨＰＬＣ：Ｎｅｘｅｒａ Ｘ２（島津製作所）
ＭＳ／ＭＳ：ＱＴＲＡＰ ５５００（ＳＣＩＥＸ）
（ＨＰＬＣ条件）
カラム：Ｋｉｎｅｔｅｋ Ｃ１８（２．１×１５０ｍｍ、粒径２．６μｍ；Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）
カラム温度：５０℃
カラム流速：０．３ｍＬ／ｍｉｎ
注入量２μＬ
移動相：溶離液Ａ ０．１ｖｏｌ％ギ酸
溶離液Ｂ ０．１ｖｏｌ％ギ酸／アセトニトリル
グラジエント：Ａ：Ｂ＝９９：１（０ｍｉｎ）→９９：１（４ｍｉｎ）→４０：６０（１６．５ｍｉｎ）→５：９５（２０ｍｉｎ）→５：９５（２５ｍｉｎ）→９９：１（２５．１ｍｉｎ）→９９：１（３５ｍｉｎ）
（質量分析条件）
測定モード：ｓＭＲＭ
イオン化法：エレクトロスプレーイオン化法
極性：ポジティブ
スプレー電圧：４．５ｋＶ
ターボガス温度：５００℃
カーテンガス：２０ｐｓｉ
ネブライザーガス：５０ｐｓｉ
ターボガス：８０ｐｓｉ
コリジョンガス：窒素
ＨＰＬＣ：Ｎｅｘｅｒａ Ｘ２（島津製作所）
ＭＳ／ＭＳ：ＱＴＲＡＰ ５５００（ＳＣＩＥＸ）
（ＨＰＬＣ条件）
カラム：Ｋｉｎｅｔｅｋ Ｃ１８（２．１×１５０ｍｍ、粒径２．６μｍ；Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）
カラム温度：５０℃
カラム流速：０．３ｍＬ／ｍｉｎ
注入量２μＬ
移動相：溶離液Ａ ０．１ｖｏｌ％ギ酸
溶離液Ｂ ０．１ｖｏｌ％ギ酸／アセトニトリル
グラジエント：Ａ：Ｂ＝９９：１（０ｍｉｎ）→９９：１（４ｍｉｎ）→４０：６０（１６．５ｍｉｎ）→５：９５（２０ｍｉｎ）→５：９５（２５ｍｉｎ）→９９：１（２５．１ｍｉｎ）→９９：１（３５ｍｉｎ）
（質量分析条件）
測定モード：ｓＭＲＭ
イオン化法：エレクトロスプレーイオン化法
極性：ポジティブ
スプレー電圧：４．５ｋＶ
ターボガス温度：５００℃
カーテンガス：２０ｐｓｉ
ネブライザーガス：５０ｐｓｉ
ターボガス：８０ｐｓｉ
コリジョンガス：窒素
【0033】
（試験溶液の調製）
試料０．５ｇに４ｍｏｌ／Ｌ尿素および０．１ｍｏｌ／Ｌ ＤＴＴを含む１００ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８．２）を５ｍＬ加え、３７℃で３時間加温した。加温した溶液を遠心し（１，５００×ｇ、５分間）、得られた上清０．５ｍＬに４０ｍｇ／ｍＬ ＩＡ溶液５０μＬを添加して３７℃で３０分間反応させ、タンパク質をアルキル化した。反応液は、１０ｍｇ／ｍＬトリプシン０．１ｍＬおよび５０ｍｍｏｌ／Ｌ炭酸水素ナトリウム溶液０．５ｍＬを加えて一晩消化した。消化後の溶液を、ＴＦＡ０．０２ｍＬを添加して遠心分離し（６，０００×ｇ、５分間）、上清を回収した。Ｏａｓｉｓ ＨＬＢミニカラム（Ｗａｔｅｒｓ）は、予めメタノール２ｍＬおよび水５ｍＬでコンディショニングした。該カラムに上清を負荷し、４ｍＬの０．５％ＴＦＡで２回洗浄した後、６ｍＬの７０％アセトニトリル溶液で溶出した。溶出液をエバポレーターで濃縮し、５％アセトニトリル溶液０．５ｍＬに溶解させて試験溶液を得た。
試料０．５ｇに４ｍｏｌ／Ｌ尿素および０．１ｍｏｌ／Ｌ ＤＴＴを含む１００ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８．２）を５ｍＬ加え、３７℃で３時間加温した。加温した溶液を遠心し（１，５００×ｇ、５分間）、得られた上清０．５ｍＬに４０ｍｇ／ｍＬ ＩＡ溶液５０μＬを添加して３７℃で３０分間反応させ、タンパク質をアルキル化した。反応液は、１０ｍｇ／ｍＬトリプシン０．１ｍＬおよび５０ｍｍｏｌ／Ｌ炭酸水素ナトリウム溶液０．５ｍＬを加えて一晩消化した。消化後の溶液を、ＴＦＡ０．０２ｍＬを添加して遠心分離し（６，０００×ｇ、５分間）、上清を回収した。Ｏａｓｉｓ ＨＬＢミニカラム（Ｗａｔｅｒｓ）は、予めメタノール２ｍＬおよび水５ｍＬでコンディショニングした。該カラムに上清を負荷し、４ｍＬの０．５％ＴＦＡで２回洗浄した後、６ｍＬの７０％アセトニトリル溶液で溶出した。溶出液をエバポレーターで濃縮し、５％アセトニトリル溶液０．５ｍＬに溶解させて試験溶液を得た。
【0034】
（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析）
得られた試験溶液を０．２２μｍフィルターでろ過した後、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析にかけた。
得られた試験溶液を０．２２μｍフィルターでろ過した後、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析にかけた。
【0035】
実施例１ ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析による小麦およびソバアレルゲン検出法の構築
１）ＭＲＭトランジッション条件の最適化
小麦については、ＨＭＷグルテニン（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｎｏ：Ｐ１０３８７およびＰ１０３８８）およびＬＭＷグルテニン（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｎｏ：Ｐ１０３８５およびＰ１０３８６）を検出すべき標的タンパク質とした。ソバについては、１３Ｓ グロブリン（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｎｏ：Ｏ２３８７８）および１１Ｓグロブリン（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｎｏ：Ａ９ＮＪＧ２）を標的タンパク質とした。ワシントン大学で開発されたプロテオーム解析用ソフトウェア「Skyline」を用いて、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳの測定条件の最適化を行った。具体的には、上記標的タンパク質をトリプシン消化して得られるペプチドについて、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）のトランジッション条件を求め、また該ＭＲＭにより検出されるペプチドから構築され得るタンパク質を調べることで、標的タンパク質を検出できる最適なトランジッション条件の候補を抽出した。各標的タンパク質について見出されたトランジッション条件の候補を表１に示す。
１）ＭＲＭトランジッション条件の最適化
小麦については、ＨＭＷグルテニン（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｎｏ：Ｐ１０３８７およびＰ１０３８８）およびＬＭＷグルテニン（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｎｏ：Ｐ１０３８５およびＰ１０３８６）を検出すべき標的タンパク質とした。ソバについては、１３Ｓ グロブリン（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｎｏ：Ｏ２３８７８）および１１Ｓグロブリン（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｎｏ：Ａ９ＮＪＧ２）を標的タンパク質とした。ワシントン大学で開発されたプロテオーム解析用ソフトウェア「Skyline」を用いて、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳの測定条件の最適化を行った。具体的には、上記標的タンパク質をトリプシン消化して得られるペプチドについて、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）のトランジッション条件を求め、また該ＭＲＭにより検出されるペプチドから構築され得るタンパク質を調べることで、標的タンパク質を検出できる最適なトランジッション条件の候補を抽出した。各標的タンパク質について見出されたトランジッション条件の候補を表１に示す。
【0036】
【表1】
【0037】
２）検量線の作成
表１に示した小麦およびソバのペプチドの標準溶液を用いて検量線を作成し、その直線性および定量限界濃度を評価した。検量線は、１、２、５、１０、２０、５０および１００ｐｐｂ（配列番号２のみ１０～５００ｐｐｂ）の範囲で作成した。その結果、表２～３に示すとおり、全ての検量線において、決定係数Ｒ2が０．９９０以上の良好な直線性が認められた。各検量線の最小点の検量溶液から得られたピークのＳ／Ｎ比を指標として定量限界濃度を推定したところ、ＨＭＷグルテニン由来のペプチドGGSFYPGETTPPQQLQQR（配列番号２）（定量限界濃度：１０ｐｐｂ）を除き、１ｐｐｂの定量が可能と判断された。以上のことから、表１に示すペプチドが、極微量の小麦またはソバ由来標的タンパク質の検出を可能にすることが示された。さらに、配列番号１、２のペプチドは、これまで小麦アレルゲンの検出に用いられていない新規小麦アレルゲンマーカーであることが明らかになった。また配列番号５、６および７のペプチドは、これまでソバアレルゲンの検出に用いられていない新規ソバアレルゲンマーカーであることが明らかになった。
表１に示した小麦およびソバのペプチドの標準溶液を用いて検量線を作成し、その直線性および定量限界濃度を評価した。検量線は、１、２、５、１０、２０、５０および１００ｐｐｂ（配列番号２のみ１０～５００ｐｐｂ）の範囲で作成した。その結果、表２～３に示すとおり、全ての検量線において、決定係数Ｒ2が０．９９０以上の良好な直線性が認められた。各検量線の最小点の検量溶液から得られたピークのＳ／Ｎ比を指標として定量限界濃度を推定したところ、ＨＭＷグルテニン由来のペプチドGGSFYPGETTPPQQLQQR（配列番号２）（定量限界濃度：１０ｐｐｂ）を除き、１ｐｐｂの定量が可能と判断された。以上のことから、表１に示すペプチドが、極微量の小麦またはソバ由来標的タンパク質の検出を可能にすることが示された。さらに、配列番号１、２のペプチドは、これまで小麦アレルゲンの検出に用いられていない新規小麦アレルゲンマーカーであることが明らかになった。また配列番号５、６および７のペプチドは、これまでソバアレルゲンの検出に用いられていない新規ソバアレルゲンマーカーであることが明らかになった。
【0038】
【表2】
【0039】
【表3】
【0040】
実施例２ 検出特異性の評価
試料として、小麦８種類（(1) １ＣＷ、(2) ＨＲＷ、(3) ＷＷ、(4) ＡＳＷ、(5) フランス産小麦（ＦＢＷ）、(6) 春よ恋、(7) きたほなみ（ＨＫＨ）、(8) シロガネ）、ソバ５種類（(1) キタワセ、(2) 中国産在来、(3) ジクーリ、(4) マンカン、(5) 北海３号）、および穀類７種類（米、ひえ、あわ、ライ麦、大麦、燕麦、はと麦）を用いた。実施例１で構築した方法を用いて、試料中における配列番号１～１０の小麦またはソバ由来ペプチドの有無を調べた。結果を表４～５に示す。また、小麦試料についてのクロマトグラムの一例を図１に示す。図１には、配列番号１のペプチドのピークが示されている。
試料として、小麦８種類（(1) １ＣＷ、(2) ＨＲＷ、(3) ＷＷ、(4) ＡＳＷ、(5) フランス産小麦（ＦＢＷ）、(6) 春よ恋、(7) きたほなみ（ＨＫＨ）、(8) シロガネ）、ソバ５種類（(1) キタワセ、(2) 中国産在来、(3) ジクーリ、(4) マンカン、(5) 北海３号）、および穀類７種類（米、ひえ、あわ、ライ麦、大麦、燕麦、はと麦）を用いた。実施例１で構築した方法を用いて、試料中における配列番号１～１０の小麦またはソバ由来ペプチドの有無を調べた。結果を表４～５に示す。また、小麦試料についてのクロマトグラムの一例を図１に示す。図１には、配列番号１のペプチドのピークが示されている。
【0041】
【表4】
【0042】
【表5】
【0043】
実施例３ 市販食品への適用
実施例１で構築した方法の市販食品への適用性を検証した。試料として市販の食品１２種（製品番号Ａ～Ｌ）を用いた。試料とした食品の種類および該食品に表示されている含有アレルゲンを表６に、食品試料からの配列番号１～１０の小麦またはソバ由来ペプチドの検出結果を表７に示す。
実施例１で構築した方法の市販食品への適用性を検証した。試料として市販の食品１２種（製品番号Ａ～Ｌ）を用いた。試料とした食品の種類および該食品に表示されている含有アレルゲンを表６に、食品試料からの配列番号１～１０の小麦またはソバ由来ペプチドの検出結果を表７に示す。
【0044】
【表6】
【0045】
【表7】
【0046】
表７に示すとおり、配列番号１～４の小麦由来ペプチドは、小麦の含有が表示されていない製品Ａ～Ｆからは検出されなかった一方で、小麦を含む食品Ｇ～Ｉ、ＫおよびＬからは検出された。配列番号５～１０のソバ由来ペプチドは、ソバを含むことが表示されている食品Ｊ～Ｌからのみ検出された。製品Ｊは、ソバを含む食品であるが、小麦の混入が否定されていない。本実施例では、製品Ｊからは、調べた全てのソバ由来ペプチドのピークが検出されたが、小麦由来ペプチドについての一つのトランジッションでもピークが検出され、これは、製品に表示されている通り、製品Ｊへの極微量の小麦タンパクの混入を示唆した。以上の結果から、配列番号１～１０の小麦またはソバ由来ペプチドをＬＣ－ＭＳ／ＭＳで検出することによって、食品に含まれる小麦およびソバアレルゲンの存在を高精度かつ高感度で検出できることが示された。
【0047】
実施例４ ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析による小麦アレルゲン検出法の構築－２
γ-グリアジン（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ２１２９２）およびＬＭＷグルテニン（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ１０３８５およびＮｏ．Ｐ１０３８６）を検出すべき標的タンパク質とした。該標的タンパク質をキモトリプシン消化して得られるペプチドについて、実施例１と同様の手順でＬＣ－ＭＳ／ＭＳの測定条件の最適化を行った。各標的タンパク質について見出されたトランジッション条件の候補を表８に示す。表８記載の配列番号６７～７０のペプチドが小麦の検出を可能にすることが示された。さらに、配列番号６７～７０のペプチドは、これまで小麦アレルゲンの検出に用いられていない新規小麦アレルゲンマーカーであった。
γ-グリアジン（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ２１２９２）およびＬＭＷグルテニン（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ１０３８５およびＮｏ．Ｐ１０３８６）を検出すべき標的タンパク質とした。該標的タンパク質をキモトリプシン消化して得られるペプチドについて、実施例１と同様の手順でＬＣ－ＭＳ／ＭＳの測定条件の最適化を行った。各標的タンパク質について見出されたトランジッション条件の候補を表８に示す。表８記載の配列番号６７～７０のペプチドが小麦の検出を可能にすることが示された。さらに、配列番号６７～７０のペプチドは、これまで小麦アレルゲンの検出に用いられていない新規小麦アレルゲンマーカーであった。
【0048】
【表8】
【0049】
実施例５ 検出特異性の評価
実施例２と同じ試料を用いて、実施例４で構築した方法により、試料中における配列番号６７～７０の小麦由来ペプチドの有無を調べた。結果を表９に示す。
実施例２と同じ試料を用いて、実施例４で構築した方法により、試料中における配列番号６７～７０の小麦由来ペプチドの有無を調べた。結果を表９に示す。
【0050】
【表9】
【0051】
実施例６ 市販食品への適用
実施例４で構築した方法の市販食品への適用性を検証した。試料として実施例３で用いた市販の食品のうち１１種を用いた。該食品試料からの配列番号６７～７０の小麦由来ペプチドの検出結果を表１０に示す。
実施例４で構築した方法の市販食品への適用性を検証した。試料として実施例３で用いた市販の食品のうち１１種を用いた。該食品試料からの配列番号６７～７０の小麦由来ペプチドの検出結果を表１０に示す。
【0052】
【表10】
【0053】
以上の結果から、配列番号６７～７０の小麦由来ペプチドをＬＣ－ＭＳ／ＭＳで検出することによって、食品に含まれる小麦アレルゲンの存在を検出できることが示された。
【図1】
【配列表】