特許 7515624 核酸分析用フローセル及び核酸分析装置

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-07-04

(45)【発行日】2024-07-12

(54)【発明の名称】核酸分析用フローセル及び核酸分析装置

(51)【国際特許分類】

   C12M 1/00 20060101AFI20240705BHJP

   C12M 1/34 20060101ALI20240705BHJP

   G01N 37/00 20060101ALI20240705BHJP

   G01N 35/08 20060101ALI20240705BHJP

   G01N 35/00 20060101ALI20240705BHJP

   G01N 21/64 20060101ALI20240705BHJP

   G01N 21/05 20060101ALI20240705BHJP

【ＦＩ】

C12M1/00 A

C12M1/34

G01N37/00 101

G01N35/08 A

G01N35/00 F

G01N21/64 Z

G01N21/05

【請求項の数】 9

(21)【出願番号】P 2022570772

(86)(22)【出願日】2020-12-21

(86)【国際出願番号】 JP2020047668

(87)【国際公開番号】W WO2022137281

(87)【国際公開日】2022-06-30

【審査請求日】2023-06-07

(73)【特許権者】

【識別番号】501387839

【氏名又は名称】株式会社日立ハイテク

(74)【代理人】

【識別番号】110001829

【氏名又は名称】弁理士法人開知

(72)【発明者】

【氏名】海老根 典子

(72)【発明者】

【氏名】田村 輝美

(72)【発明者】

【氏名】奈良原 正俊

【審査官】▲高▼ 美葉子

(56)【参考文献】

【文献】特開２０１９－１２０８２（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１５／１５１７３８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特開２０１２－１４３２０５（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１０－４８７５６（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１０－１１２７４８（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２００６－１１９１２８（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｍ １／００

Ｇ０１Ｎ ３７／００

Ｇ０１Ｎ ２１／６４

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

核酸試料が流入される流路を有する流路形成体と、前記流路に流入された前記核酸試料中の核酸を吸着させる領域を有する流路形成体支持部材と、を備える核酸分析用フローセルにおいて、
前記流路形成体支持部材は、
前記核酸を吸着させる核酸吸着領域と、
前記核酸吸着領域と分離し、蛍光粒子が吸着される蛍光粒子吸着領域と、
を有し、
前記蛍光粒子吸着領域には、前記蛍光粒子吸着領域に特異的に吸着するブロッキング物質が吸着されていることを特徴とする核酸分析用フローセル。

【請求項2】

請求項１に記載の核酸分析用フローセルにおいて、
前記流路形成体支持部材は、前記流路形成体を間に挟んで支持するカバー板と、ベース板とからなり、前記核酸吸着領域及び前記蛍光粒子吸着領域は、前記カバー板の前記流路形成体に対向する面に形成されていることを特徴とする核酸分析用フローセル。

【請求項3】

請求項２に記載の核酸分析用フローセルにおいて、
前記ブロッキング物質は、カルボン酸化合物であることを特徴とする核酸分析用フローセル。

【請求項4】

請求項２に記載の核酸分析用フローセルにおいて、
前記ブロッキング物質は、リン酸化合物であることを特徴とする核酸分析用フローセル。

【請求項5】

請求項２に記載の核酸分析用フローセルにおいて、
前記カバー板は、蛍光を透過する材質からなることを特徴とする核酸分析用フローセル。

【請求項6】

請求項２に記載の核酸分析用フローセルにおいて、
前記蛍光粒子吸着領域には、無機酸化物が堆積されていることを特徴とする核酸分析用フローセル。

【請求項7】

請求項２に記載の核酸分析用フローセルにおいて、
前記ベース板に、前記核酸試料を前記流路に流入する液体流入口と、前記核酸試料を前記流路から流出する液体流出口とが形成され、前記蛍光粒子吸着領域は、前記液体流入口と対向して配置されることを特徴とする核酸分析用フローセル。

【請求項8】

核酸分析用フローセルと、励起光源と、蛍光検出部と、送液ユニットと、動作制御及び蛍光画像分析を行うデータ処理制御部と、を備える核酸分析装置において、
前記核酸分析用フローセルは、核酸試料が流入される流路を有する流路形成体と、前記流路に流入された前記核酸試料中の核酸を吸着させる領域を有する流路形成体支持部材と、を備え、
前記流路形成体支持部材は、
前記核酸を吸着させる核酸吸着領域と、
前記核酸吸着領域と分離し、蛍光粒子が吸着される蛍光粒子吸着領域と、
を有し、前記蛍光粒子吸着領域には、前記蛍光粒子吸着領域に特異的に吸着するブロッキング物質が吸着されていることを特徴とする核酸分析装置。

【請求項9】

請求項８に記載の核酸分析装置において、
前記蛍光検出部は対物レンズを有し、前記蛍光検出部は前記対物レンズを介して前記蛍光粒子吸着領域を撮像し、前記データ処理制御部は、撮像された前記蛍光粒子吸着領域の画像を用いて、蛍光粒子の粒子数、粒子間距離、蛍光画像コントラスト、蛍光信号強度を分析し、前記蛍光粒子吸着領域の画像取得時の前記対物レンズの位置により、前記励起光源及び前記蛍光検出部の動作が正常であるか否かを判断することを特徴とする核酸分析装置。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、核酸分析用フローセル及び核酸分析装置に関する。

【背景技術】

【0002】

ＤＮＡの塩基配列を解析するための装置として、ＤＮＡシーケンサが知られている。ＤＮＡシーケンサは、ＤＮＡ断片を変性させて１本鎖にし、これを型として蛍光標識を付けた核酸を１塩基ずつ順次伸長させ、顕微鏡による蛍光観察でＤＮＡの塩基配列を順次解析する装置である。

【0003】

解析を行うには、一部又は全体が透明な材質の板、例えば、ガラス板に流路を設けたフローセルを用意し、その流路内に、変性させて一本鎖とされたＤＮＡ断片のクローンのコロニーを複数生成させる。この流路に対して、ＤＮＡを構成する４種類のヌクレオチド（Ａ，Ｔ，Ｇ，Ｃ）を識別可能にする蛍光色素が付加されたヌクレオチドを流す。

【0004】

このとき、このヌクレオチドには次の塩基の伸長を阻害する官能基が付加されている。伸長反応により取り込まれた蛍光色素を識別した後、新たな試薬を流して伸長を阻害する官能基を離脱させる。フローセルの流路には、１本鎖化されたＤＮＡ断片の数μｍサイズのコロニーが複数設けられており、前述の伸長反応と離脱反応のサイクルを繰り返すことで、１本鎖されたＤＮＡ断片が２本鎖に復元していく過程を蛍光顕微鏡観察し、ＤＮＡ塩基配列を逐次読み取る。

【0005】

次世代シーケンサによる遺伝子検査では、検体不良、判定不能症例が一定数存在することが報告されている。なお、遺伝子検査は、検体採取・保管、前処理、シーケンシング、データ解析、結果の審議、判定と、検体採取から判定までのプロセスが多段階である。判定不能症例の原因究明のため、次世代シーケンサ単体での装置動作保証が必要である。

【0006】

特許文献１には、標準遺伝子を用いた遺伝子検査全体に関する品質評価方法が示されている。シーケンサで標準遺伝子を測定し、シーケンサが出力した情報を解析し、解析の結果得られる、例えば、遺伝子配列中の各塩基の正確さ、各遺伝子のクラスターの近接度合を遺伝子検査の指標とする。

【0007】

特許文献２には、シーケンサの構成のうち、励起光照射および蛍光光検出部の検査のために使用されるデバイスにいて記載されている。既知のフォトンエネルギーおよび既知の蛍光を発光する材料を備えており、シーケンサにおいて、励起光照射および蛍光検出部の調整および検査に使用される。

【0008】

また、既知のフォトンエネルギーおよび既知の励起光を発光する材料の形状が、微小蛍光粒子であっても、励起光照射および蛍光検出部の調整および検査が実施できることが記載されている。

【0009】

特許文献３には、サンプル固定層からの核酸試料のはがれを防止するため、核酸試料もしくは担体とサンプル固定層が結合する領域以外の領域を覆うブロッキング層が記載されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0010】

【文献】特開２０１９－０８０５０１号公報

【文献】米国特許出願公開第２０１８／０１９５９６１号

【文献】特開２０１２－１３２７７８公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0011】

上記特許文献１に記載の方法では、標準遺伝子をシーケンサの計測エリアに配置させることが必要であり、計測エリアのうち、検査対象の遺伝子に使用する面積を減少させ、装置スループットを低下させるという課題がある。

【0012】

また、上記特許文献２に記載の方法では、既知のフォトンエネルギーの励起光を発光する材料の形状が蛍光粒子の場合、公知例では、エポキシ、ポリマー、その他の材料で封入されると示されている。このため、蛍光粒子の周囲は、試薬と異なる物質である。検査対象の遺伝子を計測時、検査対象の周囲は試薬である。照射光が蛍光物質の周囲部材にも入射するため、基準蛍光物質の周囲の光学特性（透過率、反射率等）の違いにより、取得した画像に対し、例えば、信号量の補正が必要になり、データ処理が煩雑になる課題がある。

【0013】

また、上記特許文献３に記載の方法は、検査対象のサンプルとその他の物質の２種類の担体を、ある区画１にサンプルのみ、区画２にその他の物質のみ、とそれぞれ分けて配置することができない。このため、検査対象の遺伝子に使用する領域にも既知のフォトンエネルギーの励起光を発光する材料を配置することになり、検査対象の遺伝子に使用する面積を減少させ、装置スループットを低下させるという課題を解決できない。

【0014】

本発明の目的は、スループットを低下させること無く、かつ、データ処理の煩雑化を抑制可能な核酸分析用フローセル及び核酸分析装置を実現することである。

【課題を解決するための手段】

【0015】

上記目的を達成するため、本発明は、次の様に構成される。

【0016】

核酸試料が流入される流路を有する流路形成体と、前記流路に流入された前記核酸試料中の核酸を吸着させる領域を有する流路形成体支持部材と、を備える核酸分析用フローセルにおいて、前記流路形成体支持部材は、前記核酸を吸着させる核酸吸着領域と、前記核酸吸着領域と分離し、蛍光粒子が吸着される蛍光粒子吸着領域と、を有し、前記蛍光粒子吸着領域には、前記蛍光粒子吸着領域に特異的に吸着するブロッキング物質が吸着されている。

【0017】

核酸分析用フローセルと、励起光源と、蛍光検出部と、送液ユニットと、動作制御及び蛍光画像分析を行うデータ処理制御部と、を備える核酸分析装置において、前記核酸分析用フローセルは、核酸試料が流入される流路を有する流路形成体と、前記流路に流入された前記核酸試料中の核酸を吸着させる領域を有する流路形成体支持部材と、を備え、前記流路形成体支持部材は、前記核酸を吸着させる核酸吸着領域と、前記核酸吸着領域と分離し、蛍光粒子が吸着される蛍光粒子吸着領域と、を有し、前記蛍光粒子吸着領域には、前記蛍光粒子吸着領域に特異的に吸着するブロッキング物質が吸着されている。

【発明の効果】

【0018】

本発明によれば、スループットを低下させること無く、かつ、データ処理の煩雑化を抑制可能な核酸分析用フローセル及び核酸分析装置を実現することができる。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1A】本発明の実施例１である核酸分析用フローセル説明するための図である。

【図1B】図１ＡのＡ－Ａ線に沿った断面図である。

【図1C】図１ＡのＢ－Ｂ線に沿った断面図である。

【図2】本発明の実施例１である核酸分析用フローセル製造方法の一例を説明するための図である。

【図3】本発明の実施例１である核酸分析用フローセル製造方法の一例を説明するための図である。

【図4A】本発明の実施例１核酸分析用フローセル製造方法の一例を説明するための図である。

【図4B】図４ＡのＣ－Ｃ線に沿った断面図である。

【図5】本発明の実施例１の核酸分析用フローセル製造方法の一例を説明するための図である。

【図6A】本発明の実施例１の核酸分析用フローセル製造方法の一例を説明するための図である。

【図6B】図６ＡのＤ－Ｄ線に沿った断面図である。

【図7】本発明の実施例１の核酸分析用フローセル製造方法の一例を説明するための図である。

【図8】本発明の実施例１の核酸分析用フローセル製造方法の一例を説明するための図である。

【図9】本発明の実施例１の核酸分析用フローセル製造方法の一例を説明するための図である。

【図10】本発明の実施例１の核酸分析用フローセル製造方法の一例を説明するための図である。

【図11】本発明の実施例１の核酸分析用フローセル製造方法の一例を説明するための図である。

【図12】本発明の実施例１の核酸分析用フローセル製造方法の一例を説明するための図である。

【図13】本発明の実施例２の核酸分析装置の構成例を説明するための図である。

【図14】本発明の実施例２の核酸分析装置の制御系統の一例を説明する図である。

【図15】本発明の実施例２の核酸分析装置の制御フローの一例を説明するための図である。

【図16】本発明の実施例２の核酸分析装置の制御フローの一例を説明するための図である。

【図17】本発明の実施例２の核酸分析装置の制御フローの一例を説明するための図である。

【図18】本発明の実施例２の核酸分析装置の制御フローの一例を説明するための図である。

【発明を実施するための形態】

【0020】

本発明の発明者は、鋭意研究の結果、シーケンサの励起光照射および蛍光検出部の検査に使用するデバイスとして、装置スループットを低下させず、蛍光粒子の計測結果に対し、周辺物質についての補正が不要で、検査対象の遺伝子と異なる区画に蛍光粒子が配置されることを同時に実現する核酸分析用フローセル、および前述の核酸分析用フローセルを搭載する核酸分析装置を完成させた。

【0021】

本発明は、流路内の蛍光物質を測定するフローセルであって、流路内に試料のみを測定する領域と、測定試料とは異なる蛍光粒子のみが存在する領域を備え、前記蛍光粒子のみの領域には、測定試料が付着しないブロッキング層が積層されていることを特徴としたフローセルを提供する。

【0022】

本発明は、フローセルの流路内で、計測で使用しない位置に蛍光粒子が固定されたフローセルである。既知のフォトンエネルギーで蛍光を発する蛍光粒子を固定する。前述の蛍光粒子の蛍光を撮像した輝度画像より、シーケンサの励起光照射および蛍光検出部の動作確認ができる。核酸の計測でも同様に、蛍光の輝度画像を用いるため、核酸の計測と同条件で動作確認ができる。

【0023】

蛍光粒子のみが存在する領域にカルボン酸化合物、リン酸化合物、またはそれらの塩等からなるブロッキング層を積層する。前述のブロッキング層の存在により、蛍光粒子のみが存在する領域に、検査対象の遺伝子（核酸）は吸着されない。

【0024】

よって、流路内の同一平面上に蛍光粒子のみが存在する領域と核酸のみが存在する領域を形成することができる。また、蛍光粒子を流路内に配置できるため、蛍光粒子を撮像するとき、流路に試薬を充填し、撮像対象の蛍光粒子の周辺物質を試薬とすることができる。

【0025】

つまり、検査対象の核酸を検査するときと周辺物質を同一にできる。よって、蛍光粒子の蛍光の輝度画像を動作確認に用いる場合、周囲物質の差を考慮するための補正を不要にすることができる。

【0026】

また、蛍光粒子のみが存在する領域および計測対象のみが存在する領域はブロッキング層で覆われており、反応液が送液されても、蛍光粒子および計測対象が固定面からはがれにくい。

【0027】

蛍光粒子は、フローセル流路構造のうち、液体流入部および液体流出部付近に配置する。液体流入部および液体流出部付近は、反応液の流量が不均一になる位置であり、計測に用いない領域である。このため、計測対象を配置する領域を減らすことなく、装置動作確認できる。

【0028】

また、本発明は、前述のフローセルを使用して、流路内の蛍光物質の画像を取得する装置であって、前記蛍光粒子の蛍光画像を撮像し、前記画像を用いて、蛍光粒子の粒子数、粒子間距離、蛍光画像コントラスト、蛍光信号強度を測定し、さらに、または、前記の蛍光画像取得時の対物レンズ位置により、機器の動作が正常であるか否かを判断する核酸分析装置を提供する。

【0029】

動作確認用の蛍光粒子と計測対象が同一流路内に配置されたフローセルを使用する。これによって、シーケンス中、ユーザがフローセルを交換するという介在なしに、核酸分析装置が自動で光学系の動作確認をすることができる。

【0030】

また、動作確認用の蛍光粒子と計測対象の高さ方向の位置が同一である。このため、動作確認用の蛍光粒子の蛍光画像撮像のため合焦する対物レンズ高さと計測対象の蛍光画像撮像のため合焦する対物レンズ高さが同じである。このため、合焦する対物レンズ高さを光学系の動作確認の指標に使用できる。

【0031】

以下、本発明の実施例について図面を参照して説明する。

【実施例】

【0032】

（実施例１）
図１Ａは、本発明の実施例１による核酸分析用フローセル１１を示す図である。また、図１Ｂは、図１ＡのＡ―Ａ線に沿った断面図であり、図１Ｃは、図１ＡのＢ―Ｂ線に沿った断面図である。

【0033】

核酸分析用フローセル１１は、カバー板１２、スペーサ１３、ベース板１４を備える。核酸分析用フローセル１１は、内部の空洞部に、検査対象の遺伝子１５および装置動作確認用蛍光粒子１６を配置する。検査対象の遺伝子１５および装置動作確認用の蛍光粒子１６は、カバー板１２、もしくはベース板１４の片方、もしくはその両方の空洞側に固定される。

【0034】

図２はカバー板１２に核酸が吸着する面である核酸の吸着面（核酸吸着領域）２２と蛍光粒子１６が吸着する面２３が積層された状態を示す。カバー板１２は、蛍光を透過し得るガラス、アクリル樹脂などの樹脂製の材質からなる。核酸の吸着面（核酸吸着領域）２２および蛍光粒子の吸着面（蛍光粒子吸着領域）２３は、スパッタリングもしくは蒸着法により、酸素を含む官能基が特異的に吸着することが知られている無機酸化物を堆積させる。無機酸化物の例には、ジルコニア、アルミナがある。核酸吸着領域２２および蛍光粒子の吸着領域２３は同じ物質を用いてもよい。または、核酸吸着領域２２および蛍光粒子の吸着領域２３で異なる物質を用いてもよい。

【0035】

核酸の吸着領域２２と蛍光粒子１６の吸着領域２３とは互いに分離している。

【0036】

また、蛍光粒子１６が吸着する領域２３は、核酸分析用フローセル１１を組み立てたとき、核酸試料や試薬が流路７３に流入する液体流入部（後述する液体流入口８１）もしくは核酸試料や試薬が流路７３から流出する液体流出部（後述する液体排出口８２）に対向する位置に配置する。具体的には、試薬の流量が不均一になり、核酸の計測に用いない位置に配置する。

【0037】

図３は、図２のカバー板１２が蛍光粒子１６の懸濁液３１へ浸漬された状態を示す。なお、蛍光粒子１６の吸着領域２３にのみ懸濁液が浸漬される。蛍光粒子１６には、官能基が結合されており、官能基を介して蛍光粒子１６が吸着領域２３に固定される。官能基として、リン酸、カルボン酸などが挙げられる。

【0038】

図４Ａは、図３で示した懸濁液からカバー板１２を引き上げた状態を示す。図４Ｂは、図４ＡのＣ－Ｃ線に沿った断面図である。蛍光粒子１６の吸着領域２３に蛍光粒子１６が固定されている。

【0039】

図５は、図４Ａで示したカバー板１２がブロッキング物質５２の懸濁液５１に浸漬される状態を示す。ブロッキング物質５２には、カルボン酸化合物、リン酸化合物、またはそれらの塩等を用いて形成する。これらの化合物は、蛍光粒子１６の吸着面２３に特異的に吸着する。

【0040】

図６Ａは、図５で示したカバー板１２について、ブロッキング物質５２の懸濁液から引き上げた状態を示す。図６Ｂは、図６ＡのＤ－Ｄ線に沿った断面図である。蛍光粒子の吸着領域２３において、蛍光粒子１６が吸着していない領域は、ブロッキング物質５２で覆われる。官能基として、リン酸、カルボン酸などを有する物質が、ブロッキング物質５２で覆われた箇所に浸漬したとしても、ブロッキング物質５２で覆われた箇所に、リン酸、カルボン酸などの官能基を有する物質は固定されない。

【0041】

図７は、図６Ａに示したカバー板１２を用いたフローセルの構成を示す。カバー板１２の蛍光粒固定面７１に蛍光粒子１６が固定されている。スペーサ１３は中央部がくり抜かれた構造とする。スペーサー１３は流路形成体である。くり抜かれた部分は、フローセルに組み立てたとき、液体が通過する領域である流路７３になる。例えば、スペーサ１３は両面接着テープでよい。ベース板１４は、２箇所の貫通孔を有する板である。２つの貫通孔は、フローセル外部からの液体流入口とフローセル外部への液体排出口として使用する。カバー板１２に形成された核酸９２が吸着する面（核酸吸着領域）２２及び蛍光粒子１６が吸着する面（蛍光粒子吸着領域）２３がスペーサ１３（流路形成体）に対向するように構成される。

【0042】

図８は、図７で示した構成品を組み立てた後の状態を示す。液体流入口８１から流入した液体は、液体排出口８２から排出される。また、液体流入口８１と液体排出口８２との間に形成された流路７３を液体が通過するとき、核酸の吸着面２２、および蛍光粒子１６の吸着領域２３に接液できる構造である。

【0043】

図９は、図８に示した核酸分析用フローセル１１に計測対象の核酸９２を含む核酸試料液体を送液する状態を示す。計測対象の核酸試料とは、シーケンシング反応をさせ、塩基配列を測定する核酸である。計測対象の核酸には官能基が結合されており、官能基が核酸の吸着領域２２に吸着し、官能基を介して計測対象の核酸がカバー板１２の核酸の吸着領域２２に吸着される。官能基として、リン酸、カルボン酸などが挙げられる。蛍光粒子１６の吸着領域２３には、ブロッキング物質５２が形成されているため、計測対象の核酸は固定されない。

【0044】

図１０は、図９の核酸分析用フローセル１１に緩衝液１０１を送液する状態を示す。緩衝液１０１の送液により、核酸が吸着する領域２２に吸着せず、流路内に浮遊する核酸を核酸分析用フローセル１１外に排出する。

【0045】

図１１は、図１０の核酸分析用フローセル１１にブロッキング物質５２の懸濁液をフローセル１１に送液する状態を示す。ブロッキング物質５２には、カルボン酸化合物、リン酸化合物、またはそれらの塩を用いて形成する。これらの化合物は、蛍光粒子の吸着領域２３に特異的に吸着する。

【0046】

図１２は、図１１の核酸分析用フローセル１１に緩衝液１０１を送液する状態を示す。緩衝液１０１の送液により、核酸の吸着領域２２に吸着せず、流路内に浮遊しているブロッキング物質５２を核酸分析用フローセル１１外に排出する。

【0047】

本発明の実施例１における核酸分析用フローセル１１を用いたＤＮＡシーケンサの光学系の動作確認において、計測で使用しない位置に配置した蛍光粒子１６を用いて、ＤＮＡシーケンサの励起光照射および蛍光検出部の動作を確認することができ、装置スループットの低下を抑制することができる。

【0048】

また、蛍光粒子１６の周辺物質を計測対象の核酸と同一の試薬とすることができ、異物質だった際に必要な信号量補正が不要で、データ処理を簡便にできる。

【0049】

また、検査対象のサンプルとその他の物質を、ある一つの区画にサンプルのみ、他の区画にその他のみ、とそれぞれ分けて配置することにより、計測で使用しない位置に蛍光粒子１６を配置することができる。

【0050】

つまり、本発明の実施例１によれば、ＤＮＡシーケンサのスループットを低下させること無く、かつ、データ処理の煩雑化を抑制可能な核酸分析用フローセル１１を実現することができる。

【0051】

（実施例２）
次に、本発明の実施例２について説明する。

【0052】

図１３は、実施例２によるＤＮＡシーケンサ（核酸分析装置）の構成例を示す。ｘｙ方向に駆動するステージ１３１上のヒータ機能を備えた温調ユニット１３２に接するように核酸分析用フローセル１３３が配置されている。

【0053】

核酸分析用フローセル１３３は、実施例１の核酸分析用フローセル１１と同等の構成である。

【0054】

核酸分析用フローセル１３３に対し、励起光光源および蛍光検出ユニット１３４がｚ方向に駆動し、核酸の蛍光標識もしくは装置動作確認用蛍光粒子の蛍光画像を取得する。

【0055】

温調ユニット１３２は、温度センサを備えており、温調ユニット１３２の温度調整が仕様内であるか検査し、核酸分析用フローセル１３３に与える熱量を管理する。核酸分析用フローセル１３３に接続される配管には、試薬・洗浄液槽１３５から試薬・洗浄液を吸引し、廃液ユニット１３６へ吐出する送液ユニット１３７を備える。また、廃液ユニット１３６には、廃液の重量を測定する重量センサを備え、廃液の重量が仕様以内であることを検査し、核酸分析用フローセル１３３に仕様を満足する液量が送液されていることを管理する。

【0056】

図１４は、ＤＮＡシーケンサの制御系の系統図を示す。ＤＮＡシーケンサの操作者は、タッチパネル２０1よりシーケンサを操作し、操作に従い、タッチパネル２０１にＵＩ画面が表示される。また、ＵＩ表示、シーケンサの駆動系の制御、および蛍光画像分析等のデータ処理のためデータ処理ＰＣ（動作制御及び蛍光画像分析を行うデータ処理制御部）２０２を備える。駆動系の制御として、例えば、励起光源１３８および蛍光検出部１３９の対物レンズのｚ移動、励起光源１３８の励起光ＯＮ／ＯＦＦ、蛍光検出部１３９による蛍光検出の制御を行う。また、励起光源１３８及び蛍光検出部１３９を有する励起光源および蛍光検出ユニット１３４を備える。

【0057】

また、ステージ１３１及び温調ユニット１３２のステージｘｙ移動および核酸分析用フローセル１３３の温調を行うステージ移動及び温調部１４０を備える。また、送液ユニット１３７の液体吸引・吐出を行う送液ユニット制御部１４１を備える。また、廃液ユニット１３６の廃液重量測定を行う廃液ユニット制御部１４２を備える。

【0058】

図１５は、ＤＮＡシーケンサについて、処理の全体フローを示す。なお、図１５において、実線で示したステップは、装置による逐次処理であり、破線で示したステップは、操作者による操作である。

【0059】

アイドル状態（ステップＳ３０１）のＤＮＡシーケンサにおいて、操作者により、シーケンシング開始が選択されると（ステップＳ３０２）、以下の逐次処理を装置が自動で行う。

【0060】

まず、駆動系のイニシャライズ（原点復帰）処理をする（ステップＳ３０３）。次に、核酸分析用フローセル１３３を用いて、ＤＮＡシーケンサの光学系の動作確認処理をする（ステップＳ３０４）。光学系の動作確認処理において実施される判定処理の結果、仕様を満足していると、送液性能の確認（ステップＳ３０５）、フローセル温調性能の確認（ステップＳ３０７）をする。

【0061】

ステップＳ３０５において、送液性能は、前述の重量計により、廃液の重量を測定し、送液量が仕様内かを判定する。送液性能確認の結果、仕様外であれば、送液系のエラーをユーザーインターフェースへ出力し（ステップＳ３０６）、仕様外の状態でシーケンシング処理をしない。

【0062】

ステップＳ３０７において、核酸分析用フローセル１３３の温度調整性能の確認は、前述の温度センサにより、温調ユニット１３２のフローセル接触部の温度を測定し、仕様内であるか判定する。フローセル温調確認の結果が仕様外であれば、温調系のエラーを出力し（ステップＳ３０８）、仕様外の状態でシーケンシング処理をしない。

【0063】

光学系、送液、およびフローセル温度調整の動作確認の結果、全てが仕様内であれば、シーケンシング処理を行う（ステップＳ３０９）。シーケンシング処理後、光学系の動作確認を行う（ステップＳ３１０）。シーケンシングの前後で光学系の動作確認処理を行い、シーケンシング中に正常動作していたとみなす。

【0064】

図１６は、図１５における、光学系の動作確認処理（ステップＳ３０４）についてのフローチャートを示す。

【0065】

光学系の動作検査処理がスタートすると、例えば、核酸分析用フローセル１３３が搭載されているステージ１３１が移動し、撮像位置へ移動する（ステップＳ４０１）。撮像位置は、核酸分析用フローセル１３３の装置動作確認領域である蛍光粒子１６の吸着領域２３である。励起光光源および蛍光検出ユニット１３４の蛍光検出部１３９は、対物レンズを有し、吸着領域２３を対物レンズを介して撮像できるように対物レンズを移動してオートフォーカスする（ステップＳ４０２）。焦点が合ったとき（蛍光粒子吸着領域の画像取得時）の対物レンズのｚ位置をデータ処理部であるデータ処理ＰＣ２０２に格納する（ステップＳ４０３）。

【0066】

対物レンズのｚ位置を判定し（ステップＳ４０４）、仕様外であれば、エラーを出力し（ステップＳ４０５）、アイドル状態に遷移する（ステップＳ４０６）。ステップＳ４０４において、仕様内であれば、画像センサで、２次元の輝度情報を撮像する（ステップＳ４０７）。２次元の輝度情報を用いて、画像コントラストを計算し、計算値をデータ処理部へ格納する（ステップＳ４０８）。

【0067】

画像コンストラスト値の判定を行い（ステップＳ４０９）、画像コントラストが、仕様外であれば、エラー出力する（ステップＳ４１０）。そして、画像保存（ステップＳ４１１）した後、アイドル状態へ遷移する（ステップＳ４１２）。

【0068】

ステップＳ４０９において、コントラスト値が仕様内であれば、撮像した画像を用いて、粒子数をカウントし、カウント数を格納する（ステップＳ４１３）。カウント数の判定を行い（ステップＳ４１４）、カウント値が仕様外であれば、エラー出力し（ステップＳ４１５）、画像を保存する（ステップＳ４１６）。その後、アイドル状態に遷移する（ステップＳ４１７）。

【0069】

ステップＳ４１４において、粒子数が仕様内であれば、撮像した画像を用いて、粒子間の距離を計算し、計算値を格納する（ステップＳ４１８）する。粒子間距離の判定を行い（ステップ４１９）、計算値が仕様外であれば、エラーを出力し（ステップＳ４２０）、画像を保存する（ステップＳ４２１）。その後、アイドル状態へ遷移する（ステップＳ４２２）。ステップＳ４１９において、粒子間距離が仕様内であれば、光学系の動作確認を終了する。

【0070】

図１７は、図１５における、シーケンシング処理（ステップＳ３０９）のフローチャートを示す。シーケンシング処理がスタート（ステップＳ５０１）すると、核酸分析用フローセル１３３への試薬送液及びフローセル温調処理（ステップＳ５０３）、並びに撮像処理（ステップＳ５０４）を設定サイクル数の回数繰り返し（ステップＳ５０１）、塩基配列を特定する。

【0071】

図１８は、図１７における、撮像処理（ステップＳ５０４）のフローチャートを示す。撮像処理がスタートすると、例えば、核酸分析用フローセル１３３が搭載されているステージ１３１が移動し、撮像位置へ移動する（ステップＳ５０４１）。撮像位置は、核酸分析用フローセル１３３の核酸計測領域（核酸の吸着領域２２）である。装置は、撮像できるようにオートフォーカスする（ステップＳ５０４２）。焦点が合ったときの対物レンズのｚ位置をデータ処理部２０２に格納する（ステップＳ５０４３）。

【0072】

次に、対物レンズのｚ位置を判定し（ステップＳ５０４４）、仕様外であれば、エラーを出力し（ステップＳ５０４５）、アイドル状態に遷移する（ステップＳ５０４６）。

【0073】

ステップＳ５０４４において、仕様内であれば、図１６のステップＳ４０７と同様に、撮像する（ステップＳ５０４７）。２次元の輝度情報を用いて、画像コントラストを計算し、計算値をデータ処理部へ格納する（ステップＳ５０４８）。

【0074】

次に、画像コントラスト値の判定を行い（ステップＳ５０４９）、画像コントラスト値が仕様外であれば、エラー出力する（ステップＳ５０５１）。そして、画像を保存する（ステップＳ５０５１）。その後、アイドル状態に遷移する（ステップＳ５０５２）。

【0075】

ステップＳ５０４９において、画像コントラスト値が仕様内であれば、画像データの解析をし、輝度データから塩基配列への変換処理を行う（ステップＳ５０５３）。

【0076】

本発明の実施例２によれば、核酸計測用フローセル１３３の蛍光粒子３２を用いて、励起光照射および蛍光検出部の動作を確認することができ、装置スループットの低下を抑制することができる。

【0077】

また、蛍光粒子１６の周辺物質を計測対象の核酸と同一の試薬とすることができ、異物質だった際に必要な信号量補正が不要で、データ処理を簡便にできる。

【0078】

つまり、本発明の実施例２によれば、スループットを低下させること無く、かつ、データ処理の煩雑化を抑制可能な核酸分析装置を実現することができる。

【0079】

なお、カバー板１２とベース板１４とは、流路形成体（スペーサ１３）を間に挟んで支持する流路形成体支持部材と総称することができる。流路形成体支持部材は、カバー板１２とベース板１４とから形成される。

【0080】

ここで、本発明の他の実施例として、以下の核酸分析装置のシーケンシング処理方法がある。

【0081】

核酸分析用フローセル１３３への試薬送液及びフローセル温調処理、並びに撮像処理を設定サイクル数の回数繰り返し、塩基配列を特定する核酸分析装置のシーケンシング処理方法において、対物レンズを介して蛍光粒子吸着領域２３を撮像するステップと、撮像された蛍光粒子吸着領域２３の画像を用いて、蛍光粒子の粒子数、粒子間距離、蛍光画像コントラスト、蛍光信号強度を分析するステップと、蛍光粒子吸着領域２３の画像取得時の対物レンズの位置により、励起光源１３８及び蛍光検出部１３９の動作が正常であるか否かを判断するステップとを備える。

【符号の説明】

【0082】

１１、１３３・・・核酸分析用フローセル、１２・・・カバー板、１３・・・スペーサ（流路形成体）、１４・・・ベース板、１５・・・検査対象の遺伝子、１６・・・蛍光粒子、２２・・・核酸が吸着する面（核酸吸着領域）、２３・・・蛍光粒子が吸着する面（蛍光粒子吸着領域）、３１・・・蛍光粒子の懸濁液、５１・・・ブロッキング物質の懸濁液、５２・・・ブロッキング物質、７１・・・蛍光粒子固定面、７３・・・流路、８１・・・液体流入口、８２・・・液体排出口、９２・・・核酸、１０１・・・緩衝液、１３１・・・ステージ、１３２・・・温調ユニット、１３４・・・励起光光源および蛍光検出ユニット、１３５・・・試薬・洗浄液槽、１３６・・・廃液ユニット、１３７・・・送液ユニット、１３８・・・励起光源、１３９・・・蛍光検出部、１４０・・・ステージ移動及び温調部、１４１・・・送液ユニット制御部、１４２・・・廃液ユニット制御部、２０１・・・タッチパネル、２０２・・・データ処理ＰＣ（動作制御及び蛍光画像分析を行うデータ処理制御部）

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】