特許 7516745 アンドロゲン受容体遺伝子スプライシングバリアント検出用プローブおよび当該プローブを用いた前記バリアントの検出方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-07-08

(45)【発行日】2024-07-17

(54)【発明の名称】アンドロゲン受容体遺伝子スプライシングバリアント検出用プローブおよび当該プローブを用いた前記バリアントの検出方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6883 20180101AFI20240709BHJP

   C12Q 1/6844 20180101ALI20240709BHJP

   C12Q 1/6886 20180101ALI20240709BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20240709BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/6883 Z ZNA

C12Q1/6844 Z

C12Q1/6886 Z

C12N15/11 Z

【請求項の数】 4

(21)【出願番号】P 2019209344

(22)【出願日】2019-11-20

(65)【公開番号】P2021078433

(43)【公開日】2021-05-27

【審査請求日】2022-10-13

(73)【特許権者】

【識別番号】000003300

【氏名又は名称】東ソー株式会社

(72)【発明者】

【氏名】熊木 勇一

【審査官】高山 敏充

(56)【参考文献】

【文献】PloS ONE，2008年07月20日，Vol.13/No.7，e0200613

【文献】GenBANK，FJ235919.1，2009年03月03日

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｑ

Ｃ１２Ｎ

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ）

Ｊａｐｉｏ－ＧＦＧ／ＦＸ

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

試料中に含まれるアンドロゲン受容体（ＡＲ）遺伝子スプライシングバリアントを検出するためのオリゴヌクレオチドプローブであって、
前記スプライシングバリアントがＡＲ遺伝子のスプライシングバリアント４（ＡＲ－Ｖ４）であり、
前記プローブが配列番号１０の相補配列からなる塩基配列を含むか、配列番号１、２に記載の塩基配列を含む、
前記オリゴヌクレオチドプローブ。

【請求項2】

ＡＲ遺伝子スプライシングバリアントの特定塩基配列の一部と相同的な配列を有する第一のプライマーと、前記特定塩基配列の一部と相補的な配列を有する第二のプライマーとを用いて前記特定塩基配列を増幅する工程と、
増幅した特定核酸配列の一部と特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドプローブを用いて前記特定核酸配列を検出する工程とを含む、
試料中に含まれるＡＲ遺伝子スプライシングバリアントの検出方法であって、
前記スプライシングバリアントがＡＲ－Ｖ４であり、
前記第一のプライマーがｅｘｏｎ ３領域の一部と相同的な塩基配列を有する配列番号４から６のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、
前記第二のプライマーがｃｒｙｐｔｉｃ ｅｘｏｎ ４領域の一部と相補的な塩基配列を有する配列番号８または９に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、
前記プローブが請求項１に記載のオリゴヌクレオチドプローブである、前記検出方法。

【請求項3】

試料中に含まれるＡＲ遺伝子スプライシングバリアントを検出するための試薬であって、
前記スプライシングバリアントがＡＲ－Ｖ４であり、
配列番号４から６のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号８または９に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号１０の相補配列からなる塩基配列を含むか、配列番号１、２に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプローブとを少なくとも含む、前記試薬。

【請求項4】

去勢抵抗性前立腺がんの検出を補助する方法であって、
請求項１に記載のオリゴヌクレオチドプローブを用いて試料中に含まれるＡＲ－Ｖ４を検出する工程を含む、前記検出を補助する方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、試料中に含まれるアンドロゲン受容体（ＡＲ）遺伝子スプライシングバリアントを特異的に検出するためのプローブおよび当該プローブを用いた前記バリアントの検出方法に関する。特に本発明は、ＡＲ遺伝子スプライシングバリアントのうちバリアント４（ＡＲ－Ｖ４）を特異的に検出するためのプローブおよび当該プローブを用いたＡＲ－Ｖ４の検出方法に関する。

【背景技術】

【0002】

前立腺がんは、中高年の男性において注意すべきがんである。前立腺がんは初期には自覚症状がほとんどないため、発見が遅れることがある。また発見が遅れ、がんが進行すると骨やほかの臓器に転移することがある。したがって早期にがんを診断し、適切な治療を施すことが必要である。

【0003】

前立腺がんの増殖および生存は男性ホルモンであるアンドロゲンのシグナルに依存する。転写因子であるアンドロゲン受容体（ＡＲ）は、アンドロゲンが結合することで、転写活性を発揮する。ヒトＡＲ遺伝子はＸ染色体上に存在し、８つのエクソン（ｅｘｏｎ）から構成されている。イントロンを含むヒトＡＲ遺伝子の全長は約１８５ｋｂにおよぶ（図１）。全長ヒトＡＲタンパク質は、主にＮＴＤ（ＮＨ２末端ドメイン）、ＤＢＤ（ＤＮＡ結合ドメイン）、ＬＢＤ（リガンド結合ドメイン）、ＤＢＤとＬＢＤをつなぐヒンジ、の４つのドメインで構成されている。ＮＴＤはエクソン１によってコードされている。ＤＢＤはエクソン２およびエクソン３によってコードされている。ヒンジはエクソン３およびエクソン４によってコードされている。ＬＢＤはエクソン５、エクソン６、エクソン７およびエクソン８によってコードされている（非特許文献１）。リガンドであるアンドロゲンがＡＲのＬＢＤドメインに結合すると、ＡＲが活性型となって細胞質から細胞核に移行し、ゲノムＤＮＡに結合することで、アンドロゲン応答遺伝子の転写を活性化する。

【0004】

ＡＲは８つのエクソンから構成される全長ＡＲ以外にも、複数のスプライシングバリアントが存在することが報告されている（非特許文献１および非特許文献２）。スプライシングバリアントの中でも、図２に示すＡＲ－Ｖ３、ＡＲ－Ｖ４、ＡＲ－Ｖ７およびＡＲ－Ｖ９は恒常活性型であることが報告されており、リガンドであるアンドロゲンが無い状態でも、アンドロゲン応答遺伝子活性を有すると考えられている。実際、恒常活性型であるＡＲ－Ｖ７が発現している去勢抵抗性前立腺がん患者では、アンドロゲンのシグナルを阻害する薬剤であるアビラテロン（Ａｂｉｒａｔｅｒｏｎｅ）およびエンザルタミド（Ｅｎｚａｌｕｔａｍｉｄｅ）に抵抗性を示し、予後が不良であることが報告されている（非特許文献３、特許文献１）。したがって前立腺がん患者に対し、恒常活性型ＡＲ（ＡＲ－Ｖ３、ＡＲ－Ｖ４、ＡＲ－Ｖ７、ＡＲ－Ｖ９）発現の有無およびその発現量を測定することは重要である。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【文献】Ｗａｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ－Ｒｅｌａｔｅｄ Ｃａｎｃｅｒ，２１，Ｔ８７－Ｔ１０３（２０１４）

【文献】Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ａｎｄｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｕｒｏｌｏｇｙ，２（３），１７８－１８６（２０１３）

【文献】Ａｎｔｏｎａｒａｋｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３７１（１１），１０２８－１０３８（２０１４）

【特許文献】

【0006】

【文献】特表２０１７－５３４２４８号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明の課題は、アンドロゲン受容体（ＡＲ）遺伝子スプライシングバリアントのうちバリアント４（ＡＲ－Ｖ４）を特異的に検出するためのプローブおよびそれを用いたＡＲ－Ｖ４の検出方法を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者らは、上記目的に鑑みて鋭意研究を重ねた結果、アンドロゲン受容体（ＡＲ）遺伝子スプライシングバリアント４（ＡＲ－Ｖ４）（図２）のうち、ｅｘｏｎ ３の３’末端側からｃｒｙｐｔｉｃ ｅｘｏｎ（ＣＥ） ４の５’末端側の領域に、オリゴヌクレオチドプローブを設計することで前記課題を解決し、本発明を完成するに至った。すなわち本発明は、以下の通り例示できる。

【0009】

［１］試料中に含まれるアンドロゲン受容体（ＡＲ）遺伝子スプライシングバリアントを検出するためのオリゴヌクレオチドプローブであって、
前記スプライシングバリアントがＡＲ遺伝子のスプライシングバリアント４（ＡＲ－Ｖ４）であり、
前記プローブの塩基配列が配列番号１０に記載の塩基配列またはその相補配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能な配列を含む、
前記プローブ。

【0010】

［２］オリゴヌクレオチドプローブの塩基配列が配列番号１０に記載の塩基配列またはその相補配列を少なくとも含む、前記［１］に記載のプローブ。

【0011】

［３］オリゴヌクレオチドプローブの塩基配列が配列番号１または２に記載の塩基配列またはその相補配列からなる、前記［２］に記載のプローブ。

【0012】

［４］試料中に含まれるＡＲ遺伝子スプライシングバリアントの特定塩基配列の一部と相同的な配列を有する第一のプライマーと、前記特定塩基配列の一部と相補的な配列を有する第二のプライマーとを用いて前記特定塩基配列を増幅する工程と、
増幅した特定核酸配列の一部とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドプローブを用いて前記特定核酸配列を検出する工程とを含む、
試料中に含まれるＡＲ遺伝子スプライシングバリアントの検出方法であって、
前記スプライシングバリアントがＡＲ－Ｖ４であり、
前記第一のプライマーがｅｘｏｎ ３領域の一部と相同的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであり、
前記第二のプライマーがｃｒｙｐｔｉｃ ｅｘｏｎ ４領域の一部と相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであり、
前記プローブが前記［１］から［３］のいずれかに記載のプローブである、前記検出方法。

【0013】

［５］第一のプライマーが配列番号３に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーが配列番号７に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである、前記［４］に記載の検出方法。

【0014】

［６］第一のプライマーが配列番号４から６のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーが配列番号８または９に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、前記［５］に記載の検出方法。

【0015】

［７］試料中に含まれるＡＲ遺伝子スプライシングバリアントを検出するための試薬であって、
前記スプライシングバリアントがＡＲ－Ｖ４であり、
配列番号４から６のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号８または９に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号１または２に記載の塩基配列またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドプローブとを少なくとも含む、前記試薬。

【0016】

［８］去勢抵抗性前立腺がんの検査方法であって、
前記［１］から［３］のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブを用いて試料中に含まれるＡＲ－Ｖ４を検出する工程を含む、前記検査方法。

【0017】

以下、本発明を詳細に説明する。

【0018】

本発明において試料とは、患者などから採取される腫瘍細胞を含む組織や全血、腹水等に限定されるものではなく、当該組織や全血、腹水等を適切な緩衝液で希釈した試料、血清、血漿、臍帯血、成分採血液などの全血由来の成分、肝臓、肺、脾臓、腎臓、腫瘍、リンパ節などの血液を含む組織の一片を適切な緩衝液で懸濁させた懸濁液も含まれる。さらにこれらの試料や懸濁液を遠心分離などにより分離回収して得られた、腫瘍細胞を含む画分も、本発明における試料に含まれる。

【0019】

本発明のオリゴヌクレオチドプローブ（以下、単に本発明のプローブとも表記する）の塩基配列は、アンドロゲン受容体（ＡＲ）遺伝子スプライシングバリアントのうちバリアント４（ＡＲ－Ｖ４）特異的に見出される塩基配列であり、かつ、他のＡＲ遺伝子スプライシングバリアントに存在しない塩基配列である。具体的には、ＡＲ－Ｖ４（図２）のうちｅｘｏｎ ３の３’末端側からｃｒｙｐｔｉｃ ｅｘｏｎ（ＣＥ） ４の５’末端側の領域に位置する、配列番号１０（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＣ＿００００２３．１１の６７６８６１１１番目から６７６８６１２６番目および６７６８０７２０番目から６７６８０７２５番目までの領域）に記載の塩基配列またはその相補配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能な配列である。

【0020】

本発明における「ストリンジェントな条件」の例としては、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性（例えば、同一性や類似性）が高いポリヌクレオチド同士、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチド同士がハイブリダイズし、それより低い相同性を示すポリヌクレオチド同士がハイブリダイズしない条件である。限定されないが、具体的には、ハイブリダイゼーション条件として、本明細書の実施例に記載の核酸増幅条件や、４２℃において、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン、０．１％（ｗ／ｖ）フィコール、０．１％（ｗ／ｖ）のポリビニルピロリドン、５０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムが存在する条件があげられる。また、洗浄条件として、６０℃、１ｘＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、好ましくは０．１ｘＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、さらに好ましくは６５℃、０．１ｘＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、より好ましくは６８℃、０．１ｘＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ等のストリンジェントな条件に相当する塩濃度および温度で、１回、好ましくは２～３回洗浄する条件等が挙げられる。さらに、当業者であれば、本明細書の記載、および、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ３ｒｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｗｏｏｄｂｕｒｙ， ＮＹ （２００１））等を参照し、本発明のプローブ（配列番号１０に記載の塩基配列またはその相補配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド）を容易に取得することができる。

【0021】

また、前述したストリンジェントな条件下で、前記特定塩基配列またはその相補配列と、十分に特異的かつ高効率にハイブリダイゼーション可能であり、かつ、前記特定塩基配列またはその相補配列を増幅可能であれば、プローブの塩基配列は、前記特定塩基配列またはその相補配列と比較して、１または数個程度（例えば、プローブ配列の塩基数の１０％以下程度）の置換、欠失、挿入、付加および／または修飾があってもよい。

【0022】

本発明のプローブの好ましい塩基配列の一例として、配列番号１０に記載の塩基配列またはその相補配列を少なくとも含む配列があげられ、より好ましい配列として、配列番号１（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＣ＿００００２３．１１の６７６８６１１１番目から６７６８６１２６番目および６７６８０７２０番目から６７６８０７３０番目までの領域）または配列番号２（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＣ＿００００２３．１１の６７６８６１０８番目から６７６８６１２６番目および６７６８０７２０番目から６７６８０７２５番目までの領域）に記載の塩基配列またはその相補配列を少なくとも含む配列があげられ、さらにより好ましい配列として、配列番号１または２に記載の塩基配列またはその相補配列があげられる。これらプローブは単独で用いてもよく、２種以上を用いることもできる。

【0023】

本発明のプローブを用いたＡＲ－Ｖ４の検出は、例えば本発明のプローブを構成するオリゴヌクレオチドに標識物質と結合させた後、当該標識物質に基づきハイブリダイゼーション法により検出を行なえばよい。前記標識物質として例えば、酵素、蛍光色素、放射性同位元素、発光色素等、公知のものを使用できる。標識物質と結合した本発明のプローブの好ましい態様として、検出操作を簡便に行なえる、ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎ（米国特許５９２５５１７号、米国特許６１０３４７６号）、ＴａｑＭａｎプローブ（米国特許５２１００１５号、米国特許５４８７９７２号）、Ｑ－Ｐｒｏｂｅ（特許３４３７８１６号）、サイクリングプローブ（米国特許５０１１７６９号、米国特許５４０３７１１号）、インターカレーター性蛍光色素標識プローブ（特開２０００－０１４４００号公報）があげられる。なお前記ハイブリダイゼーション法による検出に、電気泳動や液体クロマトグラフィーなどを組み合わせてもよい。

【0024】

通常、試料中にＡＲ－Ｖ４が存在したとしても、その存在量は僅かである。そのため、前述した本発明のプローブを用いたＡＲ－Ｖ４の検出工程に加え、ＡＲ－Ｖ４の特定塩基配列を増幅する工程も実施すると好ましい。なお本発明において特定塩基配列とは、ＡＲ－Ｖ４遺伝子のうち、第一のプライマーとの相同領域の５’末端から第二のプライマーとの相補領域の３’末端までの塩基配列のことをいう。すなわち本発明では前記特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸が増幅されることになる。

【0025】

前述した通り、本発明のプローブはｅｘｏｎ ３の３’末端側からＣＥ４の５’末端側の領域に位置している。したがって、第一のプライマーはＡＲ－Ｖ４のうちｅｘｏｎ ３の一部と相同的な塩基配列を有するプライマーであり、第二のプライマーはＡＲ－Ｖ４のうちＣＥ４の一部と相補的な塩基配列を有するプライマーである。

【0026】

本発明における第一のプライマーの好ましい態様として、配列番号３に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＣ＿００００２３．１１の６７６８６０７８番目から６７６８６１０９番目までの領域の相補鎖）とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドがあげられ、より好ましい態様として配列番号４（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＣ＿００００２３．１１の６７６８６０８７番目から６７６８６１０９番目までの領域）、配列番号５（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＣ＿００００２３．１１の６７６８６０７８番目から６７６８６１００番目までの領域）および配列番号６（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＣ＿００００２３．１１の６７６８６０８２番目から６７６８６１０５番目までの領域）のいずれかに記載の塩基配列を少なくとも含むオリゴヌクレオチドがあげられ、さらにより好ましい態様として配列番号４から６のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。

【0027】

なおプライマーにおける「ストリンジェントな条件」ついても前述のプローブにおける「ストリンジェントな条件」が適用される。

【0028】

本発明における第二のプライマーの好ましい態様として、配列番号７に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＣ＿００００２３．１１の６７６８０７５６番目から６７６８０８１４番目までの領域）とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドがあげられ、より好ましい態様として配列番号８（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＣ＿００００２３．１１の６７６８０７５６番目から６７６８０７７６番目までの領域の相補鎖）または配列番号９（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＣ＿００００２３．１１の６７６８０７９２番目から６７６８０８１４番目までの領域の相補鎖）に記載の塩基配列を少なくとも含むオリゴヌクレオチドがあげられ、さらにより好ましい態様として配列番号８または９に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。

【0029】

ＡＲ－Ｖ４の特定塩基配列を増幅する工程に採用し得る核酸増幅方法としては、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＲＣ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｒｅｖｅｒｓｅ－ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ）法、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ－Ｂａｓｅｄ． Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法が例示できる。

【0030】

本発明のプローブで検出できるＡＲ－Ｖ４は恒常活性型ＡＲである。したがって本発明のプローブを用いて試料中に含まれるＡＲ－Ｖ４を検出することで、去勢抵抗性前立腺がんを検査できる。例えば、患者由来の試料に対し、本発明のプローブを用いてＡＲ－Ｖ４を検出できた場合、当該患者が去勢抵抗性前立腺がんに罹患していると判断できる（定性的な検出）。また別の例として、患者由来の試料に対し、本発明のプローブを用いてＡＲ－Ｖ４存在量を測定し、その量が閾値を超えた場合、当該患者が去勢抵抗性前立腺がんに罹患していると判断できる（定量的な検出）。前記閾値は例えば、本発明のプローブを用いて、去勢抵抗性前立腺がんに罹患していない複数の健常者由来の試料中に含まれるＡＲ－Ｖ４存在量をそれぞれ測定し、その平均値、または当該平均値にＳＤ（標準偏差）値の１倍、２倍もしくは３倍加算した値を閾値とすればよい。

【発明の効果】

【0031】

本発明は、ＡＲ－Ｖ４のうち、ｅｘｏｎ ３の３’末端側からｃｒｙｐｔｉｃ ｅｘｏｎ（ＣＥ） ４の５’末端側の領域の塩基配列またはその相補配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能な配列を含む塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブに関する発明であり、当該プローブにより試料中に含まれるＡＲ－Ｖ４を特異的に検出できる。

【0032】

さらに前記プローブによるＡＲ－Ｖ４の検出工程に、ｅｘｏｎ ３の一部と相同的な塩基配列を有する第一のプライマーとＣＥ４の一部と相補的な塩基配列を有する第二のプライマーを用いたＡＲ－Ｖ４特定塩基配列の増幅工程を追加することで、試料中に含まれるＡＲ－Ｖ４存在量が僅かであったとしても、ＡＲ－Ｖ４を特異的に検出できる。

【図面の簡単な説明】

【0033】

【図1】アンドロゲン受容体（ＡＲ）遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＣ＿００００２３．１１の６７５４４０２１番目から６７７３０６１９番目までの領域）におけるｅｘｏｎおよびｃｒｙｐｔｉｃ ｅｘｏｎ（ＣＥ）の位置を示した図（模式図）である。

【図2】ＡＲ全長および主要なスプライシングバリアントの構造を示した図である。なおＣＥはｃｒｙｐｔｉｃ ｅｘｏｎを意味する。

【実施例】

【0034】

以下、実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は当該例に限定されるものではない。

【0035】

実施例１ 前立腺がん細胞株におけるアンドロゲン受容体（ＡＲ）遺伝子スプライシングバリアント４（ＡＲ－Ｖ４）のリアルタイムＰＣＲによる検出（その１）
ヒト前立腺癌細胞２２Ｒｖ１を試料として用い、リアルタイムＰＣＲによるＡＲ－Ｖ４の検出を試みた。２２Ｒｖ１は完全長ＡＲおよびＡＲ－Ｖ４の両方を発現する癌細胞株である。

【0036】

（１）癌細胞株２２Ｒｖ１を１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（ウシ胎児血清）を含むＲＰＭＩ－１６４０培地を用いて、５％ＣＯ_２環境下３７℃で培養した。培養後、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて培養皿から細胞を剥離することで癌細胞を回収した。

【0037】

（２）回収した細胞を、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを回収した。Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ １０ｎｇからＳＭＡＲＴ－Ｓｅｑ ｖ４ Ｕｌｔｒａ Ｌｏｗ Ｉｎｐｕｔ ＲＮＡ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）によりｃＤＮＡを合成した。

【0038】

（３）（２）で合成した２２Ｒｖ１ ｃＤＮＡを鋳型として、第一および第二のプライマーを用いたＡＲ－Ｖ４特定塩基配列の増幅、およびオリゴヌクレオチドプローブによる当該増幅した特定塩基配列の検出を、リアルタイムＰＣＲで行なった。なお各ｃＤＮＡ量に対し、ｎ＝３で行なった。
反応試薬：ＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
第一のプライマー：配列番号４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを最終濃度３００ｎＭで使用
第二のプライマー：配列番号８に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを最終濃度３００ｎＭで使用
オリゴヌクレオチドプローブ：配列番号１に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（ＦＡＭ蛍光色素およびクエンチャーで標識したＴａｑＭａｎプローブ）を最終濃度２５０ｎＭで使用
鋳型ｃＤＮＡ量：４０ｐｇ、８ｐｇ、１．６ｐｇ、０．３２ｐｇ、０．０６４ｐｇ、０．０１２８ｐｇのいずれか
検出機器：７３００ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
反応条件：５０℃２分、９５℃１０分の後、９５℃１５秒と６０℃１分を４０回繰り返すＰＣＲ反応において、リアルタイムにＦＡＭ蛍光シグナルを検出した。

【0039】

実施例２ 前立腺がん細胞株におけるＡＲ－Ｖ４のリアルタイムＰＣＲによる検出（その２）
第一のプライマーを配列番号５に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドに変更した他は、実施例１と同様な方法で２２Ｒｖ１ ｃＤＮＡ中に含まれるＡＲ－Ｖ４特定塩基配列の増幅および検出を行なった。

【0040】

実施例３ 前立腺がん細胞株におけるＡＲ－Ｖ４のリアルタイムＰＣＲによる検出（その３）
第一のプライマーを配列番号６に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドに、第二のプライマーを配列番号９に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドに、それぞれ変更した他は、実施例１と同様な方法で２２Ｒｖ１ ｃＤＮＡ中に含まれるＡＲ－Ｖ４特定塩基配列の増幅および検出を行なった。

【0041】

実施例１から３の結果をまとめて表１に示す。なお表中のＣｔ値はＴｈｒｅｓｈｏｌｄ Ｃｙｃｌｅを意味する。配列番号１に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブを用いることで２２Ｒｖ１ ｃＤＮＡ中に含まれるＡＲ－Ｖ４を検出できた。なお検出感度は、ＡＲ－Ｖ４特定塩基配列の増幅に用いた第一および第二のプライマーの組み合わせによって異なった。具体的には、実施例１および２では１．６ｐｇ以上の２２Ｒｖ１ ｃＤＮＡからＡＲ－Ｖ４が検出でき、実施例３では０．３２ｐｇ以上の２２Ｒｖ１ ｃＤＮＡからＡＲ－Ｖ４が検出できた。

【0042】

【表1】

【0043】

実施例４ 前立腺がん細胞株におけるＡＲ－Ｖ４のドロップレットデジタルＰＣＲによる検出（その１）
ヒト前立腺癌細胞２２Ｒｖ１、ＶＣａＰおよびＬＮＣａＰを試料として用い、ドロップレットデジタルＰＣＲによるＡＲ－Ｖ４の検出を試みた。なおＶＣａＰおよびＬＮＣａＰは、完全長ＡＲは発現する一方、ＡＲ－Ｖ４は発現しない癌細胞株である。

【0044】

（１）癌細胞株をそれぞれ以下に示す培地を用いて、５％ＣＯ_２環境下３７℃で培養した。培養後、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて培養皿から細胞を剥離することで癌細胞を回収した。
２２Ｒｖ１およびＬＮＣａＰ：１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含むＲＰＭＩ－１６４０培地
ＶＣａＰ：１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含むＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ）培地
（２）回収した各細胞を、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを回収した。Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ １０ｎｇからＳＭＡＲＴ－Ｓｅｑ ｖ４ Ｕｌｔｒａ Ｌｏｗ Ｉｎｐｕｔ ＲＮＡ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）によりｃＤＮＡを合成した。

【0045】

（３）（２）で合成した２２Ｒｖ１ ｃＤＮＡ、ＶＣａＰ ｃＤＮＡおよびＬＮＣａＰ ｃＤＮＡを鋳型として、第一および第二のプライマーを用いたＡＲ－Ｖ４特定塩基配列の増幅、およびオリゴヌクレオチドプローブによる当該増幅した特定塩基配列の検出を、ドロップレットデジタルＰＣＲで行なった。
反応試薬：ｄｄＰＣＲ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ ｆｏｒ Ｐｒｏｂｅｓ （ｎｏ ｄＵＴＰ）（ＢＩＯ－ＲＡＤ）
第一のプライマー：配列番号５に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを最終濃度９００ｎＭで使用
第二のプライマー：配列番号８に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを最終濃度９００ｎＭで使用
オリゴヌクレオチドプローブ：配列番号１に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（ＦＡＭ蛍光色素およびクエンチャーで標識したＴａｑＭａｎプローブ）を最終濃度２５０ｎＭで使用
鋳型ｃＤＮＡ量：４０ｐｇ
検出機器：ＱＸ２００ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲシステム（ＢＩＯ－ＲＡＤ）
反応条件：反応溶液から検出機器に含まれるＤｒｏｐｌｅｔ Ｇｅｎｅｒａｔｏｒにより液滴を生成し、９５℃１０分の後、９４℃３０秒と５５℃１分を４０回繰り返し、最後に９８℃１０分間保温するＰＣＲ反応を行い、検出機器に含まれるＤｒｏｐｌｅｔ Ｒｅａｄｅｒにおいて液滴のＦＡＭ蛍光シグナルを検出した。

【0046】

実施例５ 前立腺がん細胞株におけるＡＲ－Ｖ４のドロップレットデジタルＰＣＲによる検出（その２）
第一のプライマーを配列番号６に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドに、第二のプライマーを配列番号９に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドに、鋳型ｃＤＮＡ量を２００ｐｇに、それぞれ変更した他は、実施例４と同様な方法で２２Ｒｖ１ ｃＤＮＡ、ＶＣａＰ ｃＤＮＡおよびＬＮＣａＰ ｃＤＮＡ中に含まれるＡＲ－Ｖ４特定塩基配列の増幅および検出を行なった。

【0047】

実施例６ 前立腺がん細胞株におけるＡＲ－Ｖ４のドロップレットデジタルＰＣＲによる検出（その３）
第一のプライマーを配列番号６に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドに、第二のプライマーを配列番号９に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドに、オリゴヌクレオチドプローブを配列番号２に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（ＴａｑＭａｎプローブ）に、鋳型ｃＤＮＡ量を２００ｐｇに、それぞれ変更した他は、実施例４と同様な方法で２２Ｒｖ１ ｃＤＮＡ、ＶＣａＰ ｃＤＮＡおよびＬＮＣａＰ ｃＤＮＡ中に含まれるＡＲ－Ｖ４特定塩基配列の増幅および検出を行なった。

【0048】

実施例４から６の結果をまとめて表２に示す。これら実施例で用いたオリゴヌクレオチドプローブ（具体的には、配列番号１および２に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブ）は、いずれも２２Ｒｖ１ ｃＤＮＡ中に含まれるＡＲ―Ｖ４を検出できた一方、ＡＲ－Ｖ４を発現しないＶＣａＰおよびＬＮＣａＰ由来のｃＤＮＡではいずれも０コピーであった。すなわち本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、ＡＲ－Ｖ４を発現する癌細胞株由来のｃＤＮＡ中に含まれるＡＲ－Ｖ４を特異的に検出できることがわかる。

【0049】

【表2】

【図1】

【図2】

【配列表】

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