特許 7517124 アフィニティクロマトグラフィにおける１点検量線法による糖化ヘモグロビン定量方法及び分析装置

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-07-08

(45)【発行日】2024-07-17

(54)【発明の名称】アフィニティクロマトグラフィにおける１点検量線法による糖化ヘモグロビン定量方法及び分析装置

(51)【国際特許分類】

   G01N 30/88 20060101AFI20240709BHJP

   B01J 20/281 20060101ALI20240709BHJP

   G01N 30/26 20060101ALI20240709BHJP

   G01N 30/86 20060101ALI20240709BHJP

【ＦＩ】

G01N30/88 Q

B01J20/281 R

G01N30/26 A

G01N30/86 C

G01N30/86 G

G01N30/86 J

【請求項の数】 2

(21)【出願番号】P 2020203208

(22)【出願日】2020-12-08

(65)【公開番号】P2022090732

(43)【公開日】2022-06-20

【審査請求日】2023-11-13

(73)【特許権者】

【識別番号】000003300

【氏名又は名称】東ソー株式会社

(72)【発明者】

【氏名】植松 原一

【審査官】北条 弥作子

(56)【参考文献】

【文献】特開２０１２－１０８１１８（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１５－０２１９３１（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１３－１９５１３９（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ ３０／８８

Ｇ０１Ｎ ３０／８６

Ｇ０１Ｎ ３３／４８～３３／９８

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

第一の溶離液により糖化ヘモグロビンを特異的に吸着させ、非糖化ヘモグロビンを溶出させ、一定時間経過後、第二の溶離液により前記吸着された糖化ヘモグロビンを溶出させるアフィニティクロマトグラフィにおいて、
糖化ヘモグロビン含有割合を算出するのに必要なマスターカーブを作成する第一の工程と、日常的に、糖化ヘモグロビン含有割合を算出するのに必要な検量線を作成する第二の工程と、実際の検体を測定し、糖化ヘモグロビン含有割合を算出する第三の工程からなり、
前記第一の工程では、
糖化ヘモグロビン含有割合が既知の２種類以上の１次標準試料を測定し、全ピーク面積に対する糖化ヘモグロビンピーク面積割合と、前記糖化ヘモグロビン含有割合との、１次式の検量線を作成し、前記検量線の係数ａ（傾き）および係数ｂ（切片）を算出および記憶し、前記１次標準試料とは異なる１種類の２次標準試料を測定し、全ピーク面積に対する糖化ヘモグロビンピーク面積割合を、前記検量線を用いて糖化ヘモグロビン含有割合を算出および記憶し、
前記第二の工程では、
第一の工程で用いた１種類の２次標準試料を測定し、全ピーク面積に対する糖化ヘモグロビンピーク面積割合と、第一の工程で得られた前記係数ｂと、第一の工程で得られた前記２次標準試料糖化ヘモグロビン含有割合から、現時点での係数ａを算出し、前記係数ａと第一の工程で得られた前記係数ｂとからなる、新たな検量線（ｙ＝ａｘ＋ｂ）を作成し、
第三の工程では、
実際の検体を測定し、全ピーク面積に対する糖化ヘモグロビンピーク面積割合を第二の工程で作成された検量線を用いて、糖化ヘモグロビン含有割合を算出することからなる、糖化ヘモグロビン分析方法。

【請求項2】

請求項１に記載の方法により糖化ヘモグロビン含有割合を算出する、糖化ヘモグロビン分析装置。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、アフィニティを基にしたクロマトグラフィで糖化ヘモグロビンを測定する方法において、１種類の標準品により既知の検量線を補正し、糖化ヘモグロビン含有量を計算する方法及び分析装置に関するものである。

【背景技術】

【0002】

糖尿病の判断基準の指標として、血液中の糖化ヘモグロビン（以降、簡易的にＡ１ｃと記することがある）の割合を基に診断することが多い。Ａ１ｃ％の測定法として、測定原理の異なる複数の測定法が用いられる。その代表的な手法は、液体クロマトグラフィによるものである。液体クロマトグラフィ法でも、分離モードの違いによりイオン交換法クロマトグラフィ法、アフィニティクロマトグラフィ法がある。いずれの方法でも、塩濃度や組成の異なる複数のバッファを切替えて（ステップグラジエント）、目的である糖化ヘモグロビンを分離し、Ａ１ｃの全体の占める割合からＡ１ｃ％を算出するものである。ステップグラジエントは、事前に設定された各バッファの溶出容量に関するタイムテーブルに従い、バッファの切替えが実施される。

【0003】

一般的に、イオン交換法クロマトグラフィ法では電荷の違いにより糖化ヘモグロビンＡ１ｃを他の複数成分と分離し、Ａ１ｃの面積比率算出するものである。一方、アフィニティクロマトグラフィ法では糖化されたヘモグロビンと非糖化のヘモグロビン（以降、簡易的にＡ０と記することがある）を分離し、糖化ヘモグロビンの面積比率から算出するものである。

【0004】

そのため、イオン交換法クロマトグラフィ法では異常ヘモグロビン種の検体では、電荷の値が異なるため、正確に糖化されたヘモグロビンの量を算出できないことがあるとされる。また、検体中に含まれる共存物質影響も受けやすいとされている。

【0005】

一方、アフィニティクロマトグラフィ法では、糖化／非糖化で分離するため、前記のような影響を受けにくいとされている。何れの分離法においても、全ピーク面積に対してのＡ１ｃピーク面積の比率から、実際のＡ１ｃ％を算出する。その際には、Ａ１ｃ％の異なる最低２種類（高値、低値）の標準試料（キャリブレータ）を用いてたてられた検量線から、検体のＡ１ｃ％を算出することになる。検量線は必要に応じて更新する必要があり、より、頻繁に更新した方が正確なＡ１ｃ％の算出が可能となる。しかしながら、この作業は凍結乾燥状態の標準試料の調製等、手間のかかる作業であり、また、最低２濃度以上の標準試料を用いることからランニングコストの上昇にもつながる。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明の目的は、前述課題を解決するためになされたものであり、日常的な検量線作成時には、１種類の標準試料の測定のみで行うことができ、検体のＡ１ｃ％を算出できる方法を提供するものである。

【課題を解決するための手段】

【0007】

上記課題を解決するために、本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、本発明に到達した。

【0008】

すなわち本発明は、
第一の溶離液により糖化ヘモグロビンを特異的に吸着させ、非糖化ヘモグロビンを溶出させ、一定時間経過後、第二の溶離液により前記吸着された糖化ヘモグロビンを溶出させるアフィニティクロマトグラフィにおいて、
糖化ヘモグロビン含有割合を算出するのに必要なマスターカーブを作成する第一の工程と、日常的に、糖化ヘモグロビン含有割合を算出するのに必要な検量線を作成する第二の工程と、実際の検体を測定し、糖化ヘモグロビン含有割合を算出する第三の工程からなり、
前記第一の工程では、
糖化ヘモグロビン含有割合が既知の２種類以上の１次標準試料を測定し、全ピーク面積に対する糖化ヘモグロビンピーク面積割合と、前記糖化ヘモグロビン含有割合との、１次式の検量線を作成し、前記検量線の係数ａ（傾き）および係数ｂ（切片）算出および記憶し、前記１次標準試料とは異なる１種類の２次標準試料を測定し、全面積に対する糖化ヘモグロビンピーク面積割合を、前記検量線を用いて糖化ヘモグロビン含有割合を算出および記憶し、
前記第二の工程では、
第一の工程で用いた１種類の２次標準試料を測定し、全ピーク面積に対する糖化ヘモグロビンピーク面積割合と、第一の工程で得られた前記係数ｂと、第一の工程で得られた前記２次標準試料糖化ヘモグロビン含有割合から、現時点での係数ａを算出し、前記係数ａと第一の工程で得られた前記係数ｂとからなる、新たな検量線（ｙ＝ａｘ＋ｂ）を作成し、
第三の工程では、
実際の検体を測定し、全ピーク面積に対する糖化ヘモグロビンピーク面積割合を第二の工程で作成された検量線を用いて、糖化ヘモグロビン含有割合を算出、
することからなる、糖化ヘモグロビン分析方法である。

【0009】

アフィニティクロマトグラフィによる糖化ヘモグロビン分析においては、糖化ヘモグロビンを吸着させる第一のバッファと、前記吸着された糖化ヘモグロビンを脱着させる第二のバッファにより、非糖化ヘモグロビンおよび糖化ヘモグロビンを分離する方法である。

【0010】

非糖化ヘモグロビンは、第一のバッファではカラムにほとんど保持されないため、ほぼボイドの位置に溶出する。一方、糖化ヘモグロビンは第二のバッファにて即座に脱着するため、第二のバッファに切り替えた直後に溶出する。

【0011】

一般的なクロマトグラフィでは、僅かなバッファの組成が変動したり、カラムの劣化等が生じた場合、溶出時間の変動につながる。しかしながら、２種のバッファを切り替えるステップグラジエントによる、アフィニティクロマトグラフィ／糖化ヘモグロビン分析においては、非糖化ヘモグロビン、糖化ヘモグロビンのピークの溶出時間への影響は少なく、ほぼ同じ時間に溶出する。症状としては、非糖化ヘモグロビンピークのテーリング状態が変動することが多い（図１参照）。

【0012】

そのため、初期の状態では、非糖化ヘモグロビンピークと糖化ヘモグロビンピークは完全に分離できていても、次第に、非糖化ヘモグロビンピークのテーリングの度合いが大きくなり、両ピークの分離が不十分となり、その結果、各ピークの面積値に変動が生じることとなる（図２参照）。これらのことから、一定期間ごとに検量線を再取得しないと、正確な測定結果を得ることができなくなる。検量線作成には、Ａ１ｃ％が既知である２種以上の標準試料（キャリブレータ）を用いて検量線を取得する。通常、Ａ１ｃ％が５％程度の標準試料（低値）、Ａ１ｃ％が１０％程度の標準試料（高値）の２種を使用することが一般的である。これらの標準試料をそれぞれ測定し、全ピーク面積に対する糖化ヘモグロビン（Ａ１ｃ）ピークの面積比率を算出する。前記で得られたＡ１ｃ面積％を横軸（ｘ）、値付けされた標準試料のＡ１ｃ％を縦軸（ｙ）にとり、一次式（ｙ＝ａｘ＋ｂ）を作成し検量線とする。

【0013】

実際の検体を測定し、Ａ１ｃ面積％をｘとして、糖化ヘモグロビン比率（Ａ１ｃ％）ｙを算出する（図３参照）。また、定期的に２次標準試料（コントロール）を同様に測定し、測定結果の精度管理に用いることもされている。これらの検量線作成の操作は、時間と手間を要する作業であり、また、使用するキャリブレータも高価であることから、できるだけ、同じ検量線を長期間、使用できることが望まれる。

【0014】

本願発明者は、鋭意検討を重ねた結果、アフィニティクロマトグラフィにより糖化ヘモグロビンの測定系においては、極端に条件が変化しない限り、検量線（ｙ＝ａｘ+ｂ）の係数ａ、ｂの内、係数ａの変動が大きく、係数ｂはほぼ一定であることを見出した。従って、カラム等が初期状態（分離が良好な状態）で従来の手法により少なくとの２種類以上のＡ１ｃ％が既知である標準試料により検量線（ｙ＝ａｘ＋ｂ）を作成すれば、以降、日常的には、１種類のＡ１ｃ％が既知である２次標準の測定のみで、検量線係数ａを算出でき、係数ｂは前記の初期の値を用いることで、補正検量線を取得できることを見出した。日常的には高価であるキャリブレータを使用しないことから、ランニングコストの大幅な削減に寄与し、また、作業の効率化に寄与する手法を提供するものである。

【0015】

詳細な手順を以下に示す。大まかな流れを図４に示す。本発明は、マスターカーブを取得する第一の工程、Ａ１ｃ％が既知である１種類の２次標準試料を測定し、検量線を補正する第二の工程、実検体を測定し、クロマトグラムの面積％からＡ１ｃ％を算出するする第三の工程からなる。

【0016】

まず、マスターカーブを取得する第一の工程について説明する。図５は第一の工程を更に詳細に示したフロー図である。Ａ１ｃ％が既知であり値の異なる２つのキャリブレータ（一般的にはＡ１ｃ％が５％程度の低値検体と１０％程度の高値検体）を測定し、得られたクロマトグラムのＡ１ｃ面積％を計算する。前記Ａ１ｃ面積％をｘ、値付けされたＡ１ｃ％をｙとし、検量線（１次式 ｙ＝ａｘ＋ｂ）の係数ａ、ｂを取得する。また、前記キャリブレータとは異なるＡ１ｃ％が既知の１種類の２次標準試料を測定し、前記検量線によりＡ１ｃ％を算出する。前記２次標準試料はＡ１ｃ％が既知の試料であればよく、特に限定されるものではない。しかしながら、健常人検体でのＡ１ｃ％に近い標準試料または、検量線作成に使用する２種のキャリブレータの中間的なＡ１ｃ％の標準試料を用いることが好適である。ここで得られた、検量線の係数ａ、ｂおよび２次標準試料のＡ１ｃ％がマスターカーブを構成する。この工程はカラムの劣化が極端に進行しないかぎり再取得を行う必要はない。

【0017】

工程２以降は、日常的に操作する工程となる。第二の工程では、マスターカーブを作成した際に用いたＡ１ｃ％が既知である１種類の２次標準試料のみを測定し、その時点での検量線を作成する工程である。得られたクロマトグラムから、Ａ１ｃピークの面積％を算出し、第一の工程で得られたマスターカーブを用いて検量線を補正する。

【0018】

第三の工程では、実際の検体を測定する。得られた検体のクロマトグラムからＡ１ｃピークの面積％を算出し、前記工程で得られた検量線からＡ１ｃ％を導き出す。

【0019】

第二の工程の補正方法を分かりやすくするために、三角波の組み合わせによる疑似クロマトグラムを用いて説明する。

【0020】

非糖化ヘモグロビンを模した０．２分に頂点がある大きな三角波と、糖化ヘモグロビンを模した０．４５分に頂点がある小さな三角波を合成し、糖化ヘモグロビン分離パターンとする。２種のキャリブレータを表現するために、糖化ヘモグロビン面積％が５．６２％、１１．５９％となるように、強度を合わせている。

【0021】

アフィニティクロマトグラフィによるヘモグロビン分離では、第一の溶離液にて非糖化ヘモグロビンの分画はほとんど保持されず、ボイドの位置に溶出する。糖化ヘモグロビンの分画は第二の溶離液にて溶出する。そのため、アフィニティクロマトグラフィによるヘモグロビン分離では、カラムの劣化等が進んでも、各分画の溶出時間はほとんど変わらず、非糖化ヘモグロビンピークの形状が変化する傾向がある。つまり、非糖化ヘモグロビンピークが徐々にテーリングがひどくなり、非糖化ヘモグロビンピークと糖化ヘモグロビンピークの分離が変化していく。この状態を表現するため、両者の三角波のピーク面積を一定にして、非糖化ヘモグロビンピークのテーリング度合いを変化させた８パターンの三角波合成波形を作成した。図６は８パターンの三角波合成波形を個別に表示した図である。図８の左図は低値、右図は高値の標準試料を模した波形である。ここから分かるように、非糖化ヘモグロビンのピークのテーリングがひどくなると、糖化ヘモグロビンのピークとの分離が悪くなり、正確に各ピークの面積が算出できなくなることが分かる。表１は低値、表２は高値検体を模した波形の各ピークの面積、面積の増減（＃１を基準）、およびピーク２（Ａ１ｃを模した）の面積％を計算した表である。このように、ピーク１（Ａ０を模した）のテーリングが少なく、完全に分離されている状態では、前記面積に関する値に変化はないが、テーリングの進行とともに差が出てくる。低値検体を模した波形では＃６以降で、高値検体を模した波形では＃５以降で真の面積との差が出てくる。ピーク１（Ａ０を模した）は真の面積より小さくなり、ピーク２（Ａ１ｃを模した）は大きくなる傾向にあり、その結果、ピーク２の面積％（Ａ１ｃ面積％）は真の値より大きくなっていく。

【0022】

【表1】

【0023】

【表2】

【0024】

次に、低値を模した波形のＡ１ｃ％（ピーク２％）を６．０％、高値を模した波形のＡ１ｃ％（ピーク２％）を１２．０％と仮定し、各状態での検量線を作成した（図９参照）。横軸（ｘ）はＡ１ｃピーク（ピーク２）面積％、縦軸（ｙ）は前記で仮定したＡ１ｃ％を示している。表３は、各セットで計算された検量線（ｙ＝ａｘ＋ｂ）の係数を示した表である。

【0025】

【表3】

【0026】

図９から分かるように、非糖化ヘモグロビンピークのテーリング状態により検量線が変化していくことがわかる。ただし、極端にテーリングしない限り、検量線の係数ｂ、つまり切片はほとんど変化せず、検量線の係数ａ、つまり傾きのみの差が大きいことが分かる。この場合、＃１～７の範囲では、係数ａの寄与が大きいと判断できる。
このことから、工程１で得られた検量線の係数ａ、ｂのうち、日常的には係数ａのみを決定すれば、その時点での検量線を取得できることとなる。係数ａを算出するには、下記式で求めることができる。

【0027】

【数1】

【0028】

ｙは工程１で得られた２次標準試料のＡ１ｃ％、ｘはその時点（工程２）で得られた２次標準試料のＡ１ｃ面積％ととなる。係数ｂは工程１で得られた係数ｂをそのまま用いれば良い。ここでは、工程１で算出された２次標準試料のＡ１ｃ％が「１０．０」と仮定した場合の計算結果を示す。図１０は本発明の補正の流れを模式的に示した図である。また、図１１は検量線補正の効果を示した図である。図中、凡例●は初回の検量線でＡ１ｃ％を算出した結果、凡例〇は各セット毎に得られた検量線にて２次標準試料のＡ１ｃ％を算出した結果、凡例△は本発明の補正方法で取得した検量線にてＡ１ｃ％を算出した結果を示している。ここから分かるように、初回の検量線でＡ１ｃ％を算出した場合、非糖化ヘモグロビンのテーリングがひどくなるにつれて、Ａ１ｃ％が上昇していく。一方本発明の補正方法で取得した検量線にてＡ１ｃ％を算出した場合は、＃１～７では、ほぼ一定の値を得ることができている。

【0029】

【表4】

【0030】

【表5】

【発明の効果】

【0031】

本発明により、日常的な検量線作成時には、１種類の標準試料の測定のみで行うことができ、検体のＡ１ｃ％を算出できることが可能となる。

【図面の簡単な説明】

【0032】

【図1】アフィニティクロマトグラフィによるクロマトグラムの経時変化を模式的に示した図である。

【図2】カラムの経時変化によるピーク面積への影響を模式的に示した図である。

【図3】一般的な検量線の作成、検体の測定の流れを示した図である。

【図4】本発明の検量線の作成、検体の測定の流れを示した図である。

【図5】本発明の検量線の作成の基となる「マスターカーブ」の取得の流れを示した図である。

【図6】本発明の効果を説明する為に使用した疑似クロマトグラムを示した図である。左図は低値、右図は高値キャリブレータを模している。なお、図中、実線は合成波形を示している。

【図7】図６の合成波形を重ね書き、拡大した図である。

【図8】図６の初期状態（＃１）と劣化状態（＃８）を拡大した図である。なお、図中、実線は合成波形を示している。なお、図中、実線は合成波形、塗りつぶしはピーク２（糖化ヘモグロビンピークを模した）の面積を示している。

【図9】本発明の効果を説明する為に使用した疑似クロマトグラムで得られた検量線を示した図である。

【図10】本発明の検量線の補正方法を模式的に示した図である。

【図11】本発明の効果を説明する為に使用した疑似クロマトグラムで得られた検量線から、２次標準試料のＡ１ｃ％を算出した結果を示した図である。凡例〇は各セットで得られた検量線により計算した結果、凡例●は初回（＃１）で得られた検量線により計算した結果、凡例△は本発明の方法により補正検量線により計算した結果を示している。

【図12】本発明の効果を示すために使用したシステム構成である。

【図13】アフィニティクロマトグラフィによる糖化ヘモグロビンの分離過程を模式的に示した図である。

【図14】実施例１で取得した初期状態のクロマトグラムを示した図である。

【図15】実施例１でのクロマトグラムの経時変化を示した図である。中央図は全体、上図は非糖化ヘモグロビン部（Ａ０）、下図は糖化ヘモグロビン部（Ａ１ｃ）を拡大した図である。

【図16】実施例１での、各日での検量線を示した図である。

【図17】実施例１での、検量線の補正の手順を示した図である。なお、図ａは補正のための試料として、低値のコントロール試料、図ｂは補正のための試料として、高値のコントロール試料を用いた場合の結果である。

【図18】実施例１での、実検体のＡ１ｃ％算出結果を示した図である。凡例●は全ての日で初回の検量線にて定量、凡例▲は本発明の補正検量線にて定量した結果を示している。なお、図ａは補正のための試料として、低値のコントロール試料、図ｂは補正のための試料として、高値のコントロール試料を用いた場合の結果である。

【実施例】

【0033】

以下に本発明の実施例を説明するが、本発明はこれら実施例により何ら制限されるものではない。図１２に本検証で使用したシステム構成を示す。

【0034】

（実施例１）
検証には、東ソー（株）製グリコヘモグロビン分析計ＨＬＣ－７２３ＧＸを使用した。本装置はイオン交換クロマトグラフィを用いた測定装置であるが、設定、バッファ種等を変更し、アフィニティクロマトグラフィで使用できるように改造して使用した。その他の測定条件は下表（右欄）の通りである。

【0035】

【表6】

【0036】

検体として、東ソー（株）製のキャリブレータ（Ｃａｌ＿１：ＨｂＡ１ｃ ５．８５％［ＮＧＳＰ］、Ｃａｌ＿２：ＨｂＡ１ｃ １１．０２％［ＮＧＳＰ］））を使用した。使用する際は、同取扱説明書の手順で溶解・希釈して用いた。併せて、実際の血液検体も使用した。使用する際は、東ソー（株）製グリコヘモグロビン分析計（ＨＬＣ－７２３ＧＸ）専用の溶血／洗浄液にて溶解・希釈して用いた。分離は、検体注入から０．５５分までバッファ１、０．５５分～１．２５分までバッファ２が流れるステップグラジエントを実施し、アフィニティでの分離を行った（２．２分サイクル）。図１３はアフィニティクロマトグラフィによる糖化ヘモグロビンの分離を模式的に示し、図１４に典型的なクロマトグラムを示す。図から分かるように、非糖化ヘモグロビンは試料注入後、カラムに保持されず、ほぼボイドの時間に溶出する。一方、糖化ヘモグロビンはバッファ２により即座に溶出する。図１５は、１日に１００～１５０件程度、連続８日間、連続して実検体（全血を希釈）を測定した場合のクロマトグラムの変化を示した図である（一部抜粋）。ここから分かるように、糖化ヘモグロビンピークは、経時変化の影響を受けにくく、非糖化ヘモグロビンピークは、徐々にピーク形状が変化していく。

【0037】

本発明の効果を検証するために、Ａ１ｃ％が既知のキャリブレータ低値／高値標準試料を測定しその測定結果から、検量線を作成する。次に２次標準試料であるコントロールを３回測定、更に実検体を１００～１５０回程度測定することを１セットとし、８セット測定を行った。

【0038】

表８～１０に各セットで得られた結果を示す。なお、キャリブレータおよびコントロールはその平均値、実検体は、最初の１０測定の平均値を記載してある。

【0039】

表８は、各測定で得られたＡ１ｃピークの面積％、表９は、各セットのキャリブレータによる検量線（ｙ＝ａｘ＋ｂ）の各係数を示している。また、図１６、表１０は、各セットで算出した検量線からＡ１ｃ％を計算した結果を示している。なお、表１はキャリブレータ及びコントロールの基準値（取扱説明書記載の値）、実検体はラテックス凝集免疫比濁法であるＡ１ｃＧｅａｒ（（株）三和化学研究所製）で得られたＡ１ｃ％を記載してある（各基準値は表７参照）。

【0040】

まず、ここから、１００～１５０検体測定ごとに、検量線を更新することで、正確にＡ１ｃ％を算出できることがわかる。低値コントロールは４．８２～５．０９％の範囲、高値コントロールは９．２９～９．８０％の範囲、実検体は５．５１～５．８２％の範囲で一定の値を得ることができる。

【0041】

【表7】

【0042】

【表8】

【0043】

【表9】

【0044】

【表10】

【0045】

しかしながら、初回の検量線、
ｙ＝０．９８４９０×ｘ＋１．８８１４８（ｙ：Ａ１ｃ％、ｘ：Ａ１ｃ面積％）
を、＃１～＃８の測定結果に適用した場合は、低値コントロールは４．９１～６．５４％、高値コントロールは９．２９～１３．１０％、実検体は５．６４～７．４５％と大きく変動し、実際の検査に用いることは不可能な状態となる。１００～１５０検体測定ごとに検量線を更新する必要があることが分かる（表１１参照）。

【0046】

【表11】

【0047】

さらに、検量線を立てるのに用いるキャリブレータ（低値／高値）は高価であり、検査コストの上昇にもつながる。また、この操作も煩雑であり、作業性を悪くすることにつながる。

【0048】

本発明の手法は、前記課題を解決するためになされたものである。分析カラムを交換したり、測定システムをメンテナンスした時など、変動要素が大きい時にのみキャリブレータ（低値／高値）により検量線を立て、日常的には１種類の２次標準試料のみを測定し、検量線を補正するものである。表９、図１６から分かるように、測定状態が大きく変わらない範囲では、各セットでの検量線（ｙ＝ａｘ＋ｂ）の係数の変動は、係数ａの寄与が大きく、係数ｂの寄与は少ない。つまり、各測定セットで、検量線係数ｂは固定値とし、検量線計数ａのみを算出すれば、検量線を策定できることを意味している。検量線の算出過程を以下に説明する。

【0049】

第一の工程として、分析カラム等の初期状態で、通常の手順で少なくとも２種以上のＡ１ｃ％が既知のキャリブレータ試料を測定し、得られたクロマトグラムからＡ１ｃピークの面積％を算出し、各キャリブレータＡ１ｃ％との検量線（ｙ＝ａｘ＋ｂ）を作成する。次に、１種類の２次標準試料を測定し、得られたクロマトグラムからＡ１ｃピークの面積％を算出し、前記検量線（ｙ＝ａｘ＋ｂ）からＡ１ｃ％を算出する。

【0050】

以降は、通常の検体の測定を順次行い、前記検量線からＡ１ｃ％を算出する。一定期間経過、検量線の更新時期になった場合、以下のようにして検量線を更新する。前記で使用した２次標準試料（１種類）を測定し、得られたクロマトグラムからＡ１ｃピーク面積％を算出する。下式は初期状態での検量線（ｙ＝ａｘ＋ｂ）である。

【0051】

【数2】

【0052】

本式において、係数ｂは固定値であるため、係数ａの部分を算出すれば良いこととなる。
２次標準試料のＡ１ｃ％は同じであることから、ｙの値は初期状態で得られた２次標準試料のＡ１ｃ％となる。また、ｘはこの時点で得られたＡ１ｃ面積％に当たる。つまり、以下の関係となり、この時点での係数ａの値が算出できる。
（初期状態のＡ１ｃ％）＝ａ×（この時点のＡ１ｃ面積％）＋１．８８１４８
ａ＝〔（初期状態のＡ１ｃ％）－１．８８１４８〕／（この時点のＡ１ｃ面積％）
ここでは、２次標準試料として低値コントロールまたは、高値コントロールを用いて検証を行った。まず、２次標準試料として低値コントロールを使用した結果を示す。
セット＃２を例に計算過程を示す。
初期状態での低値コントロールのＡ１ｃ％は４．９１％（表１０参照）
セット＃２で得られた低値コントロールのＡ１ｃ面積％は３．３６％（表８参照）
ａ＝（４．９１２５－１．８８１４８）／３．３６３８０
となる。つまり、この時点での検量線（ｙ＝ａｘ＋ｂ）は以下となる。
ｙ＝０．９０１０８×ｘ＋１．８８１４８
同様にセット３では、
ａ＝（４．９１２５－１．８８１４８）／３．３８１８１＝０．８９６２８
セット４では、
ａ＝（４．９１２５－１．８８１４８）／３．９８７２４＝０．７６０１９
セット５では、
ａ＝（４．９１２５－１．８８１４８）／３．９１８００＝０．７７３２７
セット６では、
ａ＝（４．９１２５－１．８８１４８）／４．２２７２３＝０．７１７０３
セット７では、
ａ＝（４．９１２５－１．８８１４８）／４．６６５９５＝０．６４９６１
セット８では、
ａ＝（４．９１２５－１．８８１４８）／４．７３１９０＝０．６４０５６
このようにして得られた各セットでの検量線（ｙ＝ａｘ＋ｂ）を用いて、各セットでの低値コントロール、高値コントロールおよび実検体のＡ１ｃ％を算出すると表１３にようになる。

【0053】

【表12】

【0054】

【表13】

【0055】

同様に、２次標準試料として高値コントロールを使用した検証も実施した。計算過程は省略するが、各セットでの検量線係数は表１４のように算出され、それを基にしたＡ１ｃ％は表１５のように算出された。

【0056】

【表14】

【0057】

【表15】

【0058】

このように、低値のコントロールを基準試料として採用した場合、８日間（１００～１５０検体測定／１日）と言う長期間の測定においても、実検体のＡ１ｃ％は５．５０～５．６５％の範囲に収めることが可能となった。高値のコントロールを基準試料として採用した場合でも、５．５１～５．７２％の範囲に収めることが可能となった。

【0059】

以上説明したように、本発明の方法により、日常の測定操作においては、１種類の２次標準試料を測定するのみで、検量性を取得することが可能となった。前記２次標準試料は公的機関等によりＡ１ｃ％が値付けされているものを使用することが好適であるが、Ａ１ｃ％の値が一定である試料であれば良く、同じ効果が得られ、試料が限定されるものではない。

【符号の説明】

【0060】

１．バッファ１
２．バッファ２
３．脱気装置
４．バッファ１ 開閉機構
５．バッファ２ 開閉機構
６．送液ポンプ
７．試料注入機構
８．ラインフィルタ
９．プレヒートコイル
１０．分析カラム
１１．恒温槽
１２．可視光検出器

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】