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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-07-16
(45)【発行日】2024-07-24
(54)【発明の名称】前立腺癌の治療薬のスクリーニング又は評価方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/02 20060101AFI20240717BHJP
C12Q 1/6897 20180101ALI20240717BHJP
G01N 33/15 20060101ALI20240717BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20240717BHJP
G01N 33/68 20060101ALI20240717BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20240717BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/02
C12Q1/6897 Z ZNA
G01N33/15 Z
G01N33/50 Z
G01N33/50 P
G01N33/68
C12N15/12
【請求項の数】
10
(21)【出願番号】P 2020549475
(86)(22)【出願日】2019-09-27
(86)【国際出願番号】 JP2019038348
(87)【国際公開番号】W WO2020067499
(87)【国際公開日】2020-04-02
【審査請求日】2022-07-22
(31)【優先権主張番号】P 2018185339
(32)【優先日】2018-09-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】000002901
【氏名又は名称】株式会社ダイセル
(73)【特許権者】
【識別番号】504176911
【氏名又は名称】国立大学法人大阪大学
(74)【代理人】
【識別番号】110002860
【氏名又は名称】弁理士法人秀和特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】二村 圭祐
(72)【発明者】
【氏名】川村 憲彦
(72)【発明者】
【氏名】金田 安史
(72)【発明者】
【氏名】三木 克哉
(72)【発明者】
【氏名】寺居 和宏
(72)【発明者】
【氏名】山下 邦彦
【審査官】松村 真里
(56)【参考文献】
【文献】欧州特許出願公開第０３２１４４４４（ＥＰ，Ａ１）
【文献】国際公開第２００８／１５３０９１（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２００２／０２９０９９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２００５－０８０５２４（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１７／０９１７０６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１３／０１３０２４１（ＵＳ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１５／０３４４９６５（ＵＳ，Ａ１）
【文献】Genbank Database[online]，Accession Number NM_006842.2，インターネット：<URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/55749530?sat=46&satkey=168586025>，2018年09月15日，[検索日 2019.11.20]
【文献】CAO, H. et al，Medicine，2019年07月，Vol.98(30),e16534，pp.1-10
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｑ １／００－ ３／００
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｇ０１Ｎ ３３／００－３３／９８
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＳＦ３Ｂ２遺伝子を発現する細胞に候補化合物を添加する工程、該候補化合物が添加された細胞においてＳＦ３Ｂ２遺伝子の発現量を測定する工程を含む、去勢抵抗性前立腺癌治療薬のスクリーニング又は評価方法。
【請求項2】
コントロールと比較して、ＳＦ３Ｂ２遺伝子の発現量を低下させる化合物を去勢抵抗性前立腺癌治療薬の候補として選択又は評価する、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
ＳＦ３Ｂ２遺伝子が、（ｉ）配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡ；又は
（ｉｉ）配列番号１に記載する塩基配列の相補配列を有するＤＮＡに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、前記配列番号１の塩基配列の相補配列と特異的に結合でき、且つ前記配列番号１の塩基配列と９０％以上の同一性を有するＤＮＡ
で表される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記ＳＦ３Ｂ２遺伝子の発現量が、前記ＳＦ３Ｂ２遺伝子のプロモーターに連結されたレポーター遺伝子の発現量を測定することによって測定される、請求項１～３の何れか一項に記載の方法。
【請求項5】
ＳＦ３Ｂ２遺伝子を発現する細胞に候補化合物を添加する工程、該候補化合物が添加された細胞においてＡＲ－Ｖ７遺伝子の発現量を測定する工程を含む、前立腺癌治療薬のスクリーニング又は評価方法。
【請求項6】
コントロールと比較して、ＡＲ－Ｖ７遺伝子の発現量を低下させる化合物を前立腺癌治療薬の候補として選択又は評価する、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
ＳＦ３Ｂ２遺伝子が、（ｉ）配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡ；又は
（ｉｉ）配列番号１に記載する塩基配列の相補配列を有するＤＮＡに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、前記配列番号１の塩基配列の相補配列と特異的に結合でき、且つ前記配列番号１の塩基配列と９０％以上の同一性を有するＤＮＡ
で表される、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項8】
前記ＡＲ－Ｖ７遺伝子の発現量が、前記ＡＲ－Ｖ７遺伝子のプロモーターに連結されたレポーター遺伝子の発現量を測定することによって測定される、請求項５～７の何れか一項に記載の方法。
【請求項9】
ＳＦ３Ｂ２タンパク質およびＳＦ３Ｂ２以外のＳＦ３ｂタンパク質複合体形成分子を含むアッセイ系に候補化合物を添加する工程、ＳＦ３ｂタンパク質の複合体形成を阻害させる化合物を去勢抵抗性前立腺癌治療薬の候補として選択する工程を含む、去勢抵抗性前立腺癌治療薬のスクリーニング又は評価方法。
【請求項10】
請求項１～４の何れか一項に記載の方法に使用するための、ＳＦ３Ｂ２遺伝子の発現量を測定する試薬を含む、去勢抵抗性前立腺癌治療薬のスクリーニング又は評価用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、前立腺癌の治療薬のスクリーニング又は評価方法に関する。
【背景技術】
【0002】
前立腺は、外腺（辺縁領域）及び内腺（中心領域及び移行領域）に分かれており、前立腺癌は主として外腺（辺縁領域）において発生する癌である。前立腺癌は、日本及び米国において、男性の部位別罹患者数の上位を占める癌であり、いまなお多数の患者が存在する。日本においては、前立腺癌罹患者数は８万人を超し、そのうちの約１万２千人が死亡すると予測されている（国立がん研究センターがん情報サービス「がん登録・統計」、２０１７年のがん統計予測）。
【0003】
前立腺癌の治療は、外科的治療、放射線治療、化学療法、内分泌療法（ホルモン療法）等がある。これらのうち内分泌療法は、前立腺癌の進行を促進する役割のあるアンドロゲンの分泌を抑制したり、アンドロゲンの機能を阻害したりすることにより、前立腺癌の進行を抑制する治療法である。
しかしながら、内分泌療法の問題点として、長期間の治療によって、内分泌療法で用いられる薬剤に対して抵抗性を有するようになり、内分泌療法による治療効果が低減することがある。このように内分泌療法に対しての抵抗性を有するようになった結果、再び前立腺癌の症状が悪化した前立腺癌を去勢抵抗性前立腺癌という。
しかしながら、内分泌療法の問題点として、長期間の治療によって、内分泌療法で用いられる薬剤に対して抵抗性を有するようになり、内分泌療法による治療効果が低減することがある。このように内分泌療法に対しての抵抗性を有するようになった結果、再び前立腺癌の症状が悪化した前立腺癌を去勢抵抗性前立腺癌という。
【0004】
去勢抵抗性前立腺癌メカニズムには、アンドロゲン受容体（ＡＲ）が関与していることが知られている（非特許文献１）。さらに、ＡＲバリアントの１つであるＡＲ－Ｖ７が、リガンド非依存性に、転写因子として活性化状態にあることによって、去勢状態でも前立腺癌の増殖を促すことができることが知られている（非特許文献２、３）。
【0005】
ここで、完全長のＡＲ遺伝子（ＡＲ－ＦＬ）は、８つのエクソンを有する構造である。一方で、そのバリアントであるＡＲ－Ｖ７は、エクソン１～３及び潜在性エクソンであるＣＥ３しか有さず、リガンド結合部位を有さない構造であるため、リガンド非依存性に転写因子として活性を有することができるのである。すなわち、ＡＲ－Ｖ７の発現量を低下させることが去勢抵抗性前立腺癌の治療につながると考えられている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0006】
【文献】Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｕｒｏｌ． ２０１３；１０（２）；９０－９８
【文献】Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２００８；６８（１３）；５４６９－５４７７
【文献】Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２００９；６９（６）；２３０５－２３１３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明は、上記の問題点に鑑み、前立腺癌の治療薬のスクリーニング及び評価方法を提供する事を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者らは、前述の課題を解決すべく鋭意検討した結果、ＳＦ３Ｂ２（ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ３Ｂ ｓｕｂｕｎｉｔ ２）遺伝子の発現を指標に用いた前立腺癌の治療薬のスクリーニング及び評価方法に関する発明を完成させた。
【0009】
具体的には、ＡＲ－Ｖ７の発現を指標にすることで、去勢抵抗性前立腺癌細胞での投与化合物のＡＲ－Ｖ７スプライシング阻害効果を測定できた。このＡＲ－Ｖ７スプライシング阻害効果が高い薬剤は、去勢抵抗性前立腺癌のマウスモデルに対し著効した。そこでＡＲ－Ｖ７を蛍光タンパク質でモニターできる細胞を開発した。
去勢抵抗性前立腺癌細胞のアンドロゲンレセプター（ＡＲ）のバリアントの１つであるＶ７をコードする、潜在性エクソンであるＣＥ（Ｃｒｙｐｔｉｃ ｅｘｏｎ）３領域に存在するＡＲ－Ｖ７の終止コドンの直前にＧＦＰを導入することで、ＡＲ－Ｖ７の発現をフローサイトメトリでモニターできる細胞を開発した。
この細胞にＰｌａｄｉｅｎｏｌｉｄｅ ＢやＳｐｌｉｃｅｏｓｔａｔｉｎ Ａを添加するとＡＲ－Ｖ７のスプライシングが抑制され、ＧＦＰの発現が低下した。この細胞を用いることで、去勢抵抗性前立腺癌細胞のスプライシングを抑制し、かつ細胞毒性を同時に計測できる。
また、ＳＦ３Ｂ２の発現を抑制することで、ＡＲ－Ｖ７スプライシングを抑制できることから、ＳＦ３Ｂ２の発現を蛍光タンパク質で間接的にモニターできる細胞を開発した。
さらに、ＳＦ３Ｂ２タンパク質およびＳＦ３Ｂ２以外のＳＦ３ｂタンパク質複合体形成分子を含むアッセイ系に対し、Ｐｌａｄｉｅｎｏｌｉｄｅ Ｂを投与することで、ＳＦ３ｂタンパク質複合体形成が阻害されることを見出した。この系を利用することで、ＳＦ３ｂタンパク質複合体形成を阻害を指標として前立腺癌治療薬の候補化合物をスクリーニングすることができる。
去勢抵抗性前立腺癌細胞のアンドロゲンレセプター（ＡＲ）のバリアントの１つであるＶ７をコードする、潜在性エクソンであるＣＥ（Ｃｒｙｐｔｉｃ ｅｘｏｎ）３領域に存在するＡＲ－Ｖ７の終止コドンの直前にＧＦＰを導入することで、ＡＲ－Ｖ７の発現をフローサイトメトリでモニターできる細胞を開発した。
この細胞にＰｌａｄｉｅｎｏｌｉｄｅ ＢやＳｐｌｉｃｅｏｓｔａｔｉｎ Ａを添加するとＡＲ－Ｖ７のスプライシングが抑制され、ＧＦＰの発現が低下した。この細胞を用いることで、去勢抵抗性前立腺癌細胞のスプライシングを抑制し、かつ細胞毒性を同時に計測できる。
また、ＳＦ３Ｂ２の発現を抑制することで、ＡＲ－Ｖ７スプライシングを抑制できることから、ＳＦ３Ｂ２の発現を蛍光タンパク質で間接的にモニターできる細胞を開発した。
さらに、ＳＦ３Ｂ２タンパク質およびＳＦ３Ｂ２以外のＳＦ３ｂタンパク質複合体形成分子を含むアッセイ系に対し、Ｐｌａｄｉｅｎｏｌｉｄｅ Ｂを投与することで、ＳＦ３ｂタンパク質複合体形成が阻害されることを見出した。この系を利用することで、ＳＦ３ｂタンパク質複合体形成を阻害を指標として前立腺癌治療薬の候補化合物をスクリーニングすることができる。
【0010】
ＳＦ３Ｂ２の発現を増加させると、ＡＲ－Ｖ７スプライシングが亢進し、また、腫瘍が増悪化する。逆にＳＦ３Ｂ２の発現を低下させると、ＡＲ－Ｖ７スプライシングが減弱する。このことから、この細胞を用いて、ＳＦ３Ｂ２の発現を制御する化合物をスクリーニングし、かつ細胞毒性を同時に計測できる。
また、ＧＦＰの代わりにルシフェラーゼ遺伝子を導入することで発光によって、よりハイスループットなスクリーニング系を構築することが可能である。
以上のような知見に基づき、発明を完成させた。
また、ＧＦＰの代わりにルシフェラーゼ遺伝子を導入することで発光によって、よりハイスループットなスクリーニング系を構築することが可能である。
以上のような知見に基づき、発明を完成させた。
【0011】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］ＳＦ３Ｂ２遺伝子を発現する細胞に候補化合物を添加する工程、該候補化合物が添加された細胞においてＳＦ３Ｂ２遺伝子の発現量を測定する工程を含む、前立腺癌治療薬のスクリーニング又は評価方法。
［２］コントロールと比較して、ＳＦ３Ｂ２遺伝子の発現量を低下させる化合物を前立腺癌治療薬の候補として選択又は評価する、［１］に記載の方法。
［３］ＳＦ３Ｂ２遺伝子が、配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡ又は配列番号１に記載する塩基配列の相補配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡで表される、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］前記ＳＦ３Ｂ２遺伝子の発現量が、前記ＳＦ３Ｂ２遺伝子のプロモーターに連結されたレポーター遺伝子の発現量を測定することによって測定される、［１］～［３］の何れか一項に記載の方法。
［５］ＳＦ３Ｂ２遺伝子を発現する細胞に候補化合物を添加する工程、該候補化合物が添加された細胞においてＡＲ－Ｖ７遺伝子の発現量を測定する工程を含む、前立腺癌治療薬のスクリーニング又は評価方法。
［６］コントロールと比較して、ＡＲ－Ｖ７遺伝子の発現量を低下させる化合物を前立腺癌治療薬の候補として選択又は評価する、［５］に記載の方法。
［７］ＳＦ３Ｂ２遺伝子が、配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡ又は配列番号１に記載する塩基配列の相補配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズす
るＤＮＡで表される、［５］又は［６］に記載の方法。
［８］前記ＡＲ－Ｖ７遺伝子の発現量が、前記ＡＲ－Ｖ７遺伝子のプロモーターに連結されたレポーター遺伝子の発現量を測定することによって測定される、［５］～［７］の何れか一項に記載の方法。
［９］ＳＦ３Ｂ２タンパク質およびＳＦ３Ｂ２以外のＳＦ３ｂタンパク質複合体形成分子を含むアッセイ系に候補化合物を添加する工程、ＳＦ３ｂタンパク質の複合体形成を阻害させる化合物を前立腺癌治療薬の候補として選択する工程を含む、前立腺癌治療薬のスクリーニング又は評価方法。
［１０］ＳＦ３Ｂ２遺伝子の発現量を測定し得る試薬を含む、前立腺癌治療薬のスクリーニング又は評価用キット。
［１］ＳＦ３Ｂ２遺伝子を発現する細胞に候補化合物を添加する工程、該候補化合物が添加された細胞においてＳＦ３Ｂ２遺伝子の発現量を測定する工程を含む、前立腺癌治療薬のスクリーニング又は評価方法。
［２］コントロールと比較して、ＳＦ３Ｂ２遺伝子の発現量を低下させる化合物を前立腺癌治療薬の候補として選択又は評価する、［１］に記載の方法。
［３］ＳＦ３Ｂ２遺伝子が、配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡ又は配列番号１に記載する塩基配列の相補配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡで表される、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］前記ＳＦ３Ｂ２遺伝子の発現量が、前記ＳＦ３Ｂ２遺伝子のプロモーターに連結されたレポーター遺伝子の発現量を測定することによって測定される、［１］～［３］の何れか一項に記載の方法。
［５］ＳＦ３Ｂ２遺伝子を発現する細胞に候補化合物を添加する工程、該候補化合物が添加された細胞においてＡＲ－Ｖ７遺伝子の発現量を測定する工程を含む、前立腺癌治療薬のスクリーニング又は評価方法。
［６］コントロールと比較して、ＡＲ－Ｖ７遺伝子の発現量を低下させる化合物を前立腺癌治療薬の候補として選択又は評価する、［５］に記載の方法。
［７］ＳＦ３Ｂ２遺伝子が、配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡ又は配列番号１に記載する塩基配列の相補配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズす
るＤＮＡで表される、［５］又は［６］に記載の方法。
［８］前記ＡＲ－Ｖ７遺伝子の発現量が、前記ＡＲ－Ｖ７遺伝子のプロモーターに連結されたレポーター遺伝子の発現量を測定することによって測定される、［５］～［７］の何れか一項に記載の方法。
［９］ＳＦ３Ｂ２タンパク質およびＳＦ３Ｂ２以外のＳＦ３ｂタンパク質複合体形成分子を含むアッセイ系に候補化合物を添加する工程、ＳＦ３ｂタンパク質の複合体形成を阻害させる化合物を前立腺癌治療薬の候補として選択する工程を含む、前立腺癌治療薬のスクリーニング又は評価方法。
［１０］ＳＦ３Ｂ２遺伝子の発現量を測定し得る試薬を含む、前立腺癌治療薬のスクリーニング又は評価用キット。
【発明の効果】
【0012】
本発明により、ＳＦ３Ｂ２遺伝子を用いた前立腺癌の治療薬のスクリーニング及び評価することが可能となる。
癌の異常なスプライシング制御に介入し、かつ細胞毒性が少ない化合物をスクリーニングすることが可能になる。スプライシング制御を標的とした化合物は抗癌剤として開発できる可能性が高いが、このような化合物をスクリーニングできる系はほとんどない。本発明は癌のスプライシング制御に介入する化合物をスクリーニングすることを可能にする。スプライシング制御によって癌が増悪化することを発明者らは見出していることから、スプライシングを抑制するような化合物は、既存の治療法に抵抗性を示す癌に対し、著効する可能性がある。
癌の異常なスプライシング制御に介入し、かつ細胞毒性が少ない化合物をスクリーニングすることが可能になる。スプライシング制御を標的とした化合物は抗癌剤として開発できる可能性が高いが、このような化合物をスクリーニングできる系はほとんどない。本発明は癌のスプライシング制御に介入する化合物をスクリーニングすることを可能にする。スプライシング制御によって癌が増悪化することを発明者らは見出していることから、スプライシングを抑制するような化合物は、既存の治療法に抵抗性を示す癌に対し、著効する可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】ＡＲ－Ｖ７－ＧＦＰ遺伝子を作製するための遺伝子編集の模式図である。
【図2】ＡＲ－Ｖ７－ＧＦＰ遺伝子を導入したＣＷＲ２２Ｒｖ１細胞における、レポータータンパク質（ＧＦＰ）の発現を確認したウェスタンブロット図である（図面代用写真）。
【図3】ＳＦ３Ｂ２遺伝子の機能をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によって抑制することにより、ＡＲ－Ｖ７タンパクの発現レベルの変化を測定したフローサイトメトリ図である。
【図4】ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、ＳＦ３Ｂ２遺伝子を強制発現させた前立腺癌細胞、又はＳＦ３Ｂ２遺伝子を強制発現させ且つＡＲ－Ｖ７遺伝子をノックアウトした前立腺癌細胞をマウスの皮下に接種し、腫瘍増殖の変化を確認した図である。（Ａ）においては前立腺癌細胞ＣＷＲ２２Ｒｖ１（２２Ｒｖ１）を用いており、（Ｂ）においては前立腺癌細胞ＬＮＣａＰ９５を用いた。
【図5】（Ａ）は、ＳＦ３Ｂ２複合体の精製及びＰｌａｄｉｅｎｏｌｉｄｅ Ｂ（ＰＬＡ－Ｂ）処置の模式図を表す。（Ｂ）は、ＳＦ３Ｂ２－ＴＡＰを安定的に発現した２２Ｒｖ１細胞の核抽出物又は細胞質抽出物において、ＳＦ３Ｂ２タンパク質の発現を確認したウェスタンブロット図である（図面代用写真）。（Ｃ）は、上図は２０ｍＭ ＰＬＡ－Ｂ処置の有無に基づく精製ＳＦ３Ｂ２複合体の銀染色の結果図である（図面代用写真）。図の左にマススペクトロメトリーにて同定したタンパク質について記載した。下図は内部標準としての、ＳＦ３Ｂ２のウェスタンブロット図である（図面代用写真）。
【図6】（Ａ）は、Ｐｌａｄｉｅｎｏｌｉｄｅ Ｂ処置を行ったＡＲ－Ｖ７－ＧＦＰ細胞における、ＡＲ－Ｖ７－ＧＦＰ陰性群のフローサイトメトリ―分析を行った図である。（Ｂ）は、Ｐｌａｄｉｅｎｏｌｉｄｅ Ｂ処置を行ったＡＲ－Ｖ７－ＧＦＰ細胞における、ＡＲ－Ｖ７－ＧＦＰのフローサイトメトリ―分析を行った図である。（Ｃ）は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、Ｐｌａｄｉｅｎｏｌｉｄｅ Ｂ（ＰＬＡ－Ｂ）を使用した場合の、ＡＲ－Ｖ７発現量を確認した図である。
【図7】前立腺癌におけるＰｌａｄｉｅｎｏｌｉｄｅ Ｂの治療効果について表す。（Ａ）はｉｎ ｖｉｖｏにおいて、安定的にＳＦ３Ｂ２を過剰発現させた前立腺癌細胞（ＬＮＣａＰ９５）を有する去勢マウスにおける、ＰＬＡ－Ｂ又はビヒクル（ＤＭＳＯ）を投与することによる腫瘍増殖の変化を確認した図である。（Ｂ）は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、安定的にＳＦ３Ｂ２又はＧＦＰを過剰発現させた前立腺癌細胞（ＬＮＣａＰ９５）を有する去勢マウスにおける、ＰＬＡ－Ｂを投与することによる腫瘍増殖の変化を確認した図である。
【発明を実施するための形態】
【0014】
ＳＦ３Ｂ２遺伝子の発現量はＡＲ－Ｖ７の発現量と正の相関を示し、ＡＲ－Ｖ７の発現量は前立腺癌の発症と関与していることがわかっていることより、ＳＦ３Ｂ２遺伝子の発現を低下させる活性を指標にして薬剤をスクリーニング又は評価することにより前立腺癌の治療薬となりうる物質を得ることができる。
【0015】
前立腺癌は、例えばグリソンスコアにより癌の悪性度を判断することや、ＴＮＭ分類により癌の進行度を判断することによって、病期分類される。グリソンスコアの場合は、病理画像を用いて癌細胞の組織構造を顕微鏡観察して癌の悪性度を判断することで分類することができる。また、ＴＮＭ分類の場合は、転移（リンパ節転移、遠隔転移）の有無及び程度によって病期分類される。本発明における前立腺癌は、これらの指標に基づき判断されたいずれの病期分類をも包含するものである。
ここで、ＴＮＭ分類とは、悪性腫瘍の病期分類に用いられる指標の１つであり、Ｔ因子（原発腫瘍の大きさと浸潤度の程度）、Ｎ因子（リンパ節転移の有無及び程度）、及びＭ因子（遠隔転移の有無及び程度）の３つの因子を評価することによる分類である。
また本発明において、前立腺癌は去勢抵抗性前立腺癌を包含する。去勢抵抗性前立腺癌とは、前立腺癌の内分泌療法によって一度は抑制されていた前立腺癌による症状が、長期間にわたる内分泌療法によって、内分泌療法薬に対して抵抗性を有するようになった結果、病態が再び悪化するようになった前立腺癌のことである。
ここで、ＴＮＭ分類とは、悪性腫瘍の病期分類に用いられる指標の１つであり、Ｔ因子（原発腫瘍の大きさと浸潤度の程度）、Ｎ因子（リンパ節転移の有無及び程度）、及びＭ因子（遠隔転移の有無及び程度）の３つの因子を評価することによる分類である。
また本発明において、前立腺癌は去勢抵抗性前立腺癌を包含する。去勢抵抗性前立腺癌とは、前立腺癌の内分泌療法によって一度は抑制されていた前立腺癌による症状が、長期間にわたる内分泌療法によって、内分泌療法薬に対して抵抗性を有するようになった結果、病態が再び悪化するようになった前立腺癌のことである。
【0016】
本発明の一つの実施形態において、前立腺癌とは、好ましくは去勢抵抗性前立腺癌である。
【0017】
ＳＦ３Ｂ２はＡＲ－Ｖ７の正のスプライシング制御因子である。すなわち、ＳＦ３Ｂ２は、ＡＲ－Ｖ７のスプライシングにおいて、ＳＦ３Ｂ２が結合したエクソンを残しつつ、ＳＦ３Ｂ２が結合したイントロンを除去することで、スプライシングの制御を行う。
ＳＦ３Ｂ２遺伝子は、配列番号１に記載する塩基配列を有する遺伝子が例示される。また、ＳＦ３Ｂ２遺伝子には、ＡＲ－Ｖ７の発現を亢進させる機能を有するＳＦ３Ｂ２タンパク質をコードする限り、配列番号１に記載する塩基配列の相補配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが含まれる。ここで、ストリンジェントな条件としては、例えば、０．１×ＳＤＳ、０．１×ＳＳＣ、６８℃の条件で洗浄する条件が挙げられる。ＳＦ３Ｂ２は、ＡＲ－ＦＬのｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列に比べてＡＲ－Ｖ７のｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列に、より結合しやすく、さらにＡＲ－Ｖ７の潜在性エクソンであるＣＥ３領域に直接結合するタンパク質である。
ＳＦ３Ｂ２遺伝子は、配列番号１に記載する塩基配列を有する遺伝子が例示される。また、ＳＦ３Ｂ２遺伝子には、ＡＲ－Ｖ７の発現を亢進させる機能を有するＳＦ３Ｂ２タンパク質をコードする限り、配列番号１に記載する塩基配列の相補配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが含まれる。ここで、ストリンジェントな条件としては、例えば、０．１×ＳＤＳ、０．１×ＳＳＣ、６８℃の条件で洗浄する条件が挙げられる。ＳＦ３Ｂ２は、ＡＲ－ＦＬのｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列に比べてＡＲ－Ｖ７のｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列に、より結合しやすく、さらにＡＲ－Ｖ７の潜在性エクソンであるＣＥ３領域に直接結合するタンパク質である。
【0018】
ＳＦ３Ｂ２遺伝子の発現量を測定するとは、特に限定されることはないが、例えばｍＲＮＡ又はタンパク質の発現量を測定することである。
ＳＦ３Ｂ２遺伝子の発現量は、例えばＲＴ－ＰＣＲ法、定量ＰＣＲ法、マイクロアレイ法、ノーザンブロット法で調べることができる。またＳＦ３Ｂ２遺伝子産物であるＳＦ３Ｂ２タンパク質の発現量は、例えばウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡなどで調べることができる。
ＳＦ３Ｂ２遺伝子のコード領域の塩基配列としては、配列番号１の配列が例示され、この配列等を利用して遺伝子発現解析用のプライマーやプローブ等を設計又は取得することができる。前記塩基配列は、配列番号１の塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上の同一性を有するものであってよい。また、前記プライマーやプローブ等は、前記塩基配列と特異的に結合できる限り、前記塩基配列の相補配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上の同一性を有するものであってよい。
また、抗体は市販の抗体を用いることもできるし、配列番号２で表されるＳＦ３Ｂ２タンパク質のアミノ酸配列の一部を抗原として作製した抗体を用いることもできる。前記アミノ酸配列は、ＡＲ－Ｖ７の発現を亢進させる機能を有するＳＦ３Ｂ２タンパク質である限り、配列番号２のアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上の同一性を有するものであってよい。また、前記抗体等は、前記アミノ酸配列と特異的に結合できる限り、前記アミノ酸配列の相補配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上の同一性を有するものであってよい。
ＳＦ３Ｂ２遺伝子の発現量は、例えばＲＴ－ＰＣＲ法、定量ＰＣＲ法、マイクロアレイ法、ノーザンブロット法で調べることができる。またＳＦ３Ｂ２遺伝子産物であるＳＦ３Ｂ２タンパク質の発現量は、例えばウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡなどで調べることができる。
ＳＦ３Ｂ２遺伝子のコード領域の塩基配列としては、配列番号１の配列が例示され、この配列等を利用して遺伝子発現解析用のプライマーやプローブ等を設計又は取得することができる。前記塩基配列は、配列番号１の塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上の同一性を有するものであってよい。また、前記プライマーやプローブ等は、前記塩基配列と特異的に結合できる限り、前記塩基配列の相補配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上の同一性を有するものであってよい。
また、抗体は市販の抗体を用いることもできるし、配列番号２で表されるＳＦ３Ｂ２タンパク質のアミノ酸配列の一部を抗原として作製した抗体を用いることもできる。前記アミノ酸配列は、ＡＲ－Ｖ７の発現を亢進させる機能を有するＳＦ３Ｂ２タンパク質である限り、配列番号２のアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上の同一性を有するものであってよい。また、前記抗体等は、前記アミノ酸配列と特異的に結合できる限り、前記アミノ酸配列の相補配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上の同一性を有するものであってよい。
【0019】
本発明のスクリーニング又は評価方法としては、ＳＦ３Ｂ２遺伝子を発現する細胞に候補化合物を添加する工程、及び該候補化合物が添加された細胞においてＳＦ３Ｂ２遺伝子の発現量を測定する工程を含む、前立腺癌治療薬のスクリーニング又は評価方法が挙げられる。
例えば、候補化合物の存在下において、ＳＦ３Ｂ２遺伝子の発現量が、候補化合物の添加を行っていないコントロールと比べて、例えば２０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは９０％以上低下する場合に、当該候補化合物を前立腺癌の治療薬の候補として選択することができる。
例えば、候補化合物の存在下において、ＳＦ３Ｂ２遺伝子の発現量が、候補化合物の添加を行っていないコントロールと比べて、例えば２０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは９０％以上低下する場合に、当該候補化合物を前立腺癌の治療薬の候補として選択することができる。
【0020】
細胞としては、ＳＦ３Ｂ２遺伝子を発現する細胞を含む生体試料、ＳＦ３Ｂ２遺伝子を発現する培養細胞株、又はＳＦ３Ｂ２遺伝子を強制発現した培養細胞株の何れを用いてもよいがＳＦ３Ｂ２遺伝子を強制発現した培養細胞株を用いることが好ましい。
生体試料とは、例えば被検対象又は健常対象から採取した、前立腺の細胞又は組織、前立腺周辺の細胞又は組織、その他前立腺癌の転移が考えられ得るあらゆる部位の細胞又は組織等が含まれる。また、生体試料とは、前立腺癌細胞が含まれ得る血液、リンパ液等の体液であってもよい。
ＳＦ３Ｂ２遺伝子を発現する培養細胞株とは、ＳＦ３Ｂ２遺伝子を発現する細胞株であれば特に限定されることはないが、例えば前立腺癌細胞由来の細胞株等が挙げられる。
ＳＦ３Ｂ２遺伝子を強制発現した培養細胞株とは、例えば、ＳＦ３Ｂ２遺伝子を哺乳類細胞に遺伝子を導入するためのプラスミドやウイルスベクターなどに組み込み、リポフェクション等の通常の方法にて細胞にトランスフェクションした培養細胞株等が挙げられる。トランスフェクションは一過的でも安定的でもよい。
生体試料とは、例えば被検対象又は健常対象から採取した、前立腺の細胞又は組織、前立腺周辺の細胞又は組織、その他前立腺癌の転移が考えられ得るあらゆる部位の細胞又は組織等が含まれる。また、生体試料とは、前立腺癌細胞が含まれ得る血液、リンパ液等の体液であってもよい。
ＳＦ３Ｂ２遺伝子を発現する培養細胞株とは、ＳＦ３Ｂ２遺伝子を発現する細胞株であれば特に限定されることはないが、例えば前立腺癌細胞由来の細胞株等が挙げられる。
ＳＦ３Ｂ２遺伝子を強制発現した培養細胞株とは、例えば、ＳＦ３Ｂ２遺伝子を哺乳類細胞に遺伝子を導入するためのプラスミドやウイルスベクターなどに組み込み、リポフェクション等の通常の方法にて細胞にトランスフェクションした培養細胞株等が挙げられる。トランスフェクションは一過的でも安定的でもよい。
【0021】
本発明のスクリーニング又は評価方法の他の態様としては、例えば、ＳＦ３Ｂ２遺伝子のプロモーターに連結されたレポーター遺伝子を発現する細胞に候補化合物を添加する工程、及び該候補化合物が添加された細胞においてレポーター遺伝子の発現量を測定する工程を含む、前立腺癌治療薬のスクリーニング又は評価方法が挙げられる。
例えば、候補化合物の存在下において、ＳＦ３Ｂ２遺伝子のプロモーターに連結されたレポーター遺伝子の発現量が、候補化合物の添加を行っていないコントロールと比べて、例えば２０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは９０％以上低下する場合に、当該候補化合物を前立腺癌の治療薬の候補として選択することができる。
例えば、候補化合物の存在下において、ＳＦ３Ｂ２遺伝子のプロモーターに連結されたレポーター遺伝子の発現量が、候補化合物の添加を行っていないコントロールと比べて、例えば２０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは９０％以上低下する場合に、当該候補化合物を前立腺癌の治療薬の候補として選択することができる。
【0022】
ＳＦ３Ｂ２遺伝子のプロモーターに連結されたレポーター遺伝子を用いる場合、ＳＦ３Ｂ２遺伝子のプロモーターとしては、転写開始点の上流約１ｋｂｐを含む領域が好ましく、上流約２ｋｂｐを含む領域がより好ましい。
レポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ遺伝子、ＧＦＰ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子等を使用する事ができ、好ましくはルシフェラーゼ遺伝子又はＧＦＰ遺伝子を使用する事ができる。
レポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ遺伝子、ＧＦＰ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子等を使用する事ができ、好ましくはルシフェラーゼ遺伝子又はＧＦＰ遺伝子を使用する事ができる。
【0023】
細胞としては、例えばこれらのレポーター遺伝子をＳＦ３Ｂ２遺伝子のプロモーターに連結し、これを哺乳類細胞に遺伝子を導入するためのプラスミドやウイルスベクターなどに組み込み、既知の方法であるリポフェクション等の通常の方法によって細胞にトランスフェクションした、レポーター遺伝子を強制発現した培養細胞株を使用する事ができる。トランスフェクションは一過的でも安定的でもよい。
【0024】
本発明の他の実施形態として、細胞は、ＡＲ－Ｖ７遺伝子を発現する生体試料、ＡＲ－Ｖ７遺伝子を発現する培養細胞株、又はＡＲ－Ｖ７遺伝子を強制発現した培養細胞株の何れかを用い、ＳＦ３Ｂ２遺伝子、またはＳＦ３Ｂ２遺伝子プロモーターに連結したレポーター遺伝子の発現を解析してもよい。
生体試料とは、ＡＲ－Ｖ７遺伝子を発現する細胞を含む生体試料であれば特に限定されることはないが、例えば被検対象又は健常対象から採取した、前立腺の細胞又は組織、前立腺周辺の細胞又は組織、その他前立腺癌の転移が考えられ得るあらゆる部位の細胞又は組織等が含まれる。また、生体試料とは、前立腺癌細胞が含まれ得る血液、リンパ液等の体液であってもよい。
ＡＲ－Ｖ７遺伝子を発現する培養細胞株とは、ＡＲ－Ｖ７遺伝子を発現する細胞株であれば特に限定されることはないが、例えば前立腺癌細胞由来の細胞株等が挙げられる。
ＡＲ－Ｖ７遺伝子を強制発現した培養細胞株とは、例えば、ＡＲ－Ｖ７遺伝子を哺乳類細胞に遺伝子を導入するためのプラスミドやウイルスベクターなどに組み込み、リポフェクション等の通常の方法にて細胞にトランスフェクションした培養細胞株等が挙げられる。
生体試料とは、ＡＲ－Ｖ７遺伝子を発現する細胞を含む生体試料であれば特に限定されることはないが、例えば被検対象又は健常対象から採取した、前立腺の細胞又は組織、前立腺周辺の細胞又は組織、その他前立腺癌の転移が考えられ得るあらゆる部位の細胞又は組織等が含まれる。また、生体試料とは、前立腺癌細胞が含まれ得る血液、リンパ液等の体液であってもよい。
ＡＲ－Ｖ７遺伝子を発現する培養細胞株とは、ＡＲ－Ｖ７遺伝子を発現する細胞株であれば特に限定されることはないが、例えば前立腺癌細胞由来の細胞株等が挙げられる。
ＡＲ－Ｖ７遺伝子を強制発現した培養細胞株とは、例えば、ＡＲ－Ｖ７遺伝子を哺乳類細胞に遺伝子を導入するためのプラスミドやウイルスベクターなどに組み込み、リポフェクション等の通常の方法にて細胞にトランスフェクションした培養細胞株等が挙げられる。
【0025】
本発明のスクリーニング又は評価方法の他の態様としては、ＳＦ３Ｂ２遺伝子を発現する細胞、好ましくはＳＦ３Ｂ２遺伝子を強制発現させた細胞に候補化合物を添加する工程、及び該候補化合物が添加された細胞においてＡＲ－Ｖ７遺伝子の発現量またはＡＲ－Ｖ７遺伝子プロモーターに連結されたレポーター遺伝子の発現量を測定する工程を含む、前立腺癌治療薬のスクリーニング又は評価方法が挙げられる。
例えば、ＳＦ３Ｂ２遺伝子を発現する細胞に候補化合物を添加し、一定期間培養したのちに、ＡＲ－Ｖ７遺伝子またはレポーター遺伝子の発現量を測定し、これらの発現量が、候補化合物の添加を行っていないコントロールと比べて、例えば２０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは９０％以上低下する場合に、当該候補化合物を前立腺癌の治療薬の候補として選択することができる。
例えば、ＳＦ３Ｂ２遺伝子を発現する細胞に候補化合物を添加し、一定期間培養したのちに、ＡＲ－Ｖ７遺伝子またはレポーター遺伝子の発現量を測定し、これらの発現量が、候補化合物の添加を行っていないコントロールと比べて、例えば２０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは９０％以上低下する場合に、当該候補化合物を前立腺癌の治療薬の候補として選択することができる。
【0026】
ＡＲ－Ｖ７遺伝子のプロモーターに連結されたレポーター遺伝子を用いる場合、ＡＲ－Ｖ７遺伝子のプロモーターとしては、転写開始点の上流約１ｋｂｐを含む領域が好ましく、上流約２ｋｂｐを含む領域がより好ましい。
レポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ遺伝子、ＧＦＰ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子等を使用する事ができ、好ましくはルシフェラーゼ遺伝子又はＧＦＰ遺伝子を使用する事ができる。
レポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ遺伝子、ＧＦＰ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子等を使用する事ができ、好ましくはルシフェラーゼ遺伝子又はＧＦＰ遺伝子を使用する事ができる。
【0027】
細胞としては、例えばこれらのレポーター遺伝子をＡＲ－Ｖ７遺伝子のプロモーターに連結し、これを哺乳類細胞に遺伝子を導入するためのプラスミドやウイルスベクターなどに組み込み、既知の方法であるリポフェクション等の通常の方法によって細胞にトランスフェクションした、レポーター遺伝子を強制発現した培養細胞株を使用する事ができる。
【0028】
本発明において、候補化合物とは、高分子化合物又は低分子化合物の何れでもよく、特に限定されることはないが、高分子化合物としてはタンパク質、抗体、ペプチド、非ペプチド性化合物、核酸、又はＲＮＡ等が挙げられる。これらの化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよく、これらの化合物を含む、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液等でもよい。
候補化合物の中から、候補化合物非添加時と比較して、ＳＦ３Ｂ２遺伝子及び／又はＡＲ－Ｖ７遺伝子の発現量を低下させる化合物を選択することで、前立腺癌の治療薬となり得る物質を得ることができる。
候補化合物の中から、候補化合物非添加時と比較して、ＳＦ３Ｂ２遺伝子及び／又はＡＲ－Ｖ７遺伝子の発現量を低下させる化合物を選択することで、前立腺癌の治療薬となり得る物質を得ることができる。
【0029】
候補化合物の濃度添加濃度は、ＳＦ３Ｂ２遺伝子及び／又はＡＲ－Ｖ７遺伝子の発現量を低下することが確認できる濃度であれば特に限定されることはない。また、添加方法、反応時間、反応温度等は、用いる被検体に従って適宜選択することができる。
【0030】
本発明において、スクリーニングで得られた物質は、ＳＦ３Ｂ２遺伝子及び／又はＡＲ－Ｖ７遺伝子の発現低下能を有する物質であると評価することができる。また、該物質は、前立腺癌のモデル動物等を用いて治療効果を評価することができる。
【0031】
本発明のスクリーニング又は評価方法の他の態様としては、ＳＦ３Ｂ２タンパク質およびＳＦ３Ｂ２以外のＳＦ３ｂタンパク質複合体形成分子を含むアッセイ系に候補化合物を添加する工程、ＳＦ３ｂタンパク質の複合体形成を阻害させる化合物を前立腺癌治療薬の候補として選択する工程を含む、前立腺癌治療薬のスクリーニング又は評価方法が挙げられる。
ＳＦ３ｂタンパク質の複合体は、本願実施例４および図５に示されるように、ＳＦ３Ｂ１、ＳＦ３Ｂ２、ＳＦ３Ｂ３、ＳＦ３Ｂ４、ＳＦ３Ａ１及びＳＦ３Ａ３を含む。ＳＦ３ｂタンパク質複合体は、MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY, Oct. 1999, Vol. 19, No. 10, p.6796-6802にも記載されている。
ＳＦ３ｂタンパク質の複合体形成を阻害するとは、ＳＦ３Ｂ２が、ＳＦ３Ｂ１、ＳＦ３Ｂ３、ＳＦ３Ｂ４、ＳＦ３Ａ１及びＳＦ３Ａ３の１種類以上と複合体形成することを阻害すること、好ましくはＳＦ３Ｂ２タンパク質がＳＦ３Ｂ１、ＳＦ３Ｂ３、ＳＦ３Ｂ４、ＳＦ３Ａ１及びＳＦ３Ａ３の全てと複合体形成することを阻害することである。
例えば、ＳＦ３Ｂ２タンパク質およびＳＦ３Ｂ２以外のＳＦ３ｂタンパク質複合体形成分子を含むアッセイ系に候補化合物を添加し、一定期間インキュベートした後、ＳＦ３Ｂ２に対する抗体で免疫沈降した時に、ＳＦ３Ｂ２と共沈するＳＦ３Ｂ３、ＳＦ３Ｂ４、ＳＦ３Ａ１及びＳＦ３Ａ３の１種類以上の量を指標として評価することができる。ある化合物を用いてインキュベートしたときに、ＳＦ３Ｂ２と共沈するＳＦ３Ｂ３、ＳＦ３Ｂ４、ＳＦ３Ａ１及びＳＦ３Ａ３の１種類以上の量が、コントロールと比較して減少したときに、その化合物は前立腺癌治療薬の候補化合物として選択することが可能である。
なお、本発明において、複合体形成を阻害するとは、既に複合体形成したタンパク質同士を解離すること、及び／又はタンパク質同士が会合して新たに複合体形成を阻害することを指す。
アッセイ系はインビトロ系でもよいし、細胞系でもよい。
ＳＦ３ｂタンパク質の複合体は、本願実施例４および図５に示されるように、ＳＦ３Ｂ１、ＳＦ３Ｂ２、ＳＦ３Ｂ３、ＳＦ３Ｂ４、ＳＦ３Ａ１及びＳＦ３Ａ３を含む。ＳＦ３ｂタンパク質複合体は、MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY, Oct. 1999, Vol. 19, No. 10, p.6796-6802にも記載されている。
ＳＦ３ｂタンパク質の複合体形成を阻害するとは、ＳＦ３Ｂ２が、ＳＦ３Ｂ１、ＳＦ３Ｂ３、ＳＦ３Ｂ４、ＳＦ３Ａ１及びＳＦ３Ａ３の１種類以上と複合体形成することを阻害すること、好ましくはＳＦ３Ｂ２タンパク質がＳＦ３Ｂ１、ＳＦ３Ｂ３、ＳＦ３Ｂ４、ＳＦ３Ａ１及びＳＦ３Ａ３の全てと複合体形成することを阻害することである。
例えば、ＳＦ３Ｂ２タンパク質およびＳＦ３Ｂ２以外のＳＦ３ｂタンパク質複合体形成分子を含むアッセイ系に候補化合物を添加し、一定期間インキュベートした後、ＳＦ３Ｂ２に対する抗体で免疫沈降した時に、ＳＦ３Ｂ２と共沈するＳＦ３Ｂ３、ＳＦ３Ｂ４、ＳＦ３Ａ１及びＳＦ３Ａ３の１種類以上の量を指標として評価することができる。ある化合物を用いてインキュベートしたときに、ＳＦ３Ｂ２と共沈するＳＦ３Ｂ３、ＳＦ３Ｂ４、ＳＦ３Ａ１及びＳＦ３Ａ３の１種類以上の量が、コントロールと比較して減少したときに、その化合物は前立腺癌治療薬の候補化合物として選択することが可能である。
なお、本発明において、複合体形成を阻害するとは、既に複合体形成したタンパク質同士を解離すること、及び／又はタンパク質同士が会合して新たに複合体形成を阻害することを指す。
アッセイ系はインビトロ系でもよいし、細胞系でもよい。
【0032】
本発明は、前立腺癌治療薬のスクリーニング又は評価方法に用いるためのキットも含む。キットの内容は、機器又は試薬の組み合わせにより構成されるが、以下に述べる各構成要素と本質的に同一、又はその一部と本質的に同一な物質が含まれていれば、構成又は形態が異なっていても、本発明のキットに包含される。
【0033】
試薬としては、例えば、ＰＣＲ法によりＳＦ３Ｂ２遺伝子の発現量を測定する場合には、ＳＦ３Ｂ２遺伝子を特異的に増幅することが可能なプライマーを含む。また、必要に応じて、逆転写酵素、ポリメラーゼ、緩衝液、蛍光試薬等を含めてもよい。機器としては、例えば、蛍光光度計、サーマルサイクラ―等を使用することができる。
【0034】
また、マイクロアレイ法によりＳＦ３Ｂ２遺伝子の発現量を測定する場合には、ＳＦ３Ｂ２遺伝子断片をスポットしたガラス、プラスチック、シリコン又はメンブレン等の支持体を含む。また、必要に応じて、ラベル化試薬、ハイブリダイゼーション用バッファー、フラグメンテーション用バッファー等を含めてもよい。
【0035】
また、免疫測定法によりＳＦ３Ｂ２タンパク質の発現量を測定する場合には、抗ＳＦ３Ｂ２抗体を含む。また、必要に応じて、生体試料の希釈液、抗体固定化固相、緩衝液、洗浄液、標識二次抗体又はその抗体断片、標識体の検出用試薬、標準物質なども含まれる。生体試料の希釈液としては、例えば、界面活性剤や緩衝液等にＢＳＡやカゼイン等のタンパク質を含む水溶液等が挙げられる。
【0036】
抗体固定化固相としては、各種高分子素材を用途に合うように整形した素材に、抗分子マーカー抗体又はそれらの抗体断片を固相化したものが用いられる。形状としてはチューブ、ビーズ、プレート、ラテックスなどの微粒子、スティック等が、素材としてはポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ゼラチン、アガロース、セルロース、ポリエチレンテレフタレート等の高分子素材、ガラス、セラミックスや金属等が挙げられる。抗体の固相化の方法としては物理的方法と化学的方法又はこれらの併用方法等、公知の方法が挙げられる。例えば、ポリスチレン製９６ウェルの免疫測定用マイクロタープレートに抗体又は抗体断片等を疎水固相化したものが挙げられる。
【0037】
反応緩衝液は、抗体固定化固相の抗体と生体試料中の抗原とが結合反応をする際の溶媒環境を提供するものであればいかなるものでもよいが、界面活性剤、緩衝剤、ＢＳＡやカゼインなどの蛋白質、防腐剤、安定化剤、反応促進剤等を含む反応緩衝液が挙げられる。
【0038】
標識された二次抗体又はその抗体断片としては、本発明に用いられる抗体又は抗体断片に西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ウシ小腸アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼなどの標識用酵素をラベルしたもの、緩衝剤、ＢＳＡやカゼインなどの蛋白質、防腐剤などを混合したものが用いられる。
【0039】
標識体の検出用試薬としては前記の標識用酵素に応じて、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼであれば、テトラメチルベンジジンやオルトフェニレンジアミンなどの吸光測定用基質、ヒドロキシフェニルプロピオン酸やヒドロキシフェニル酢酸などの蛍光基質、ルミノールなどの発光基質が、アルカリホスファターゼであれば、４－ニトロフェニルフォスフェートなどの吸光度測定用基質、４－メチルウンベリフェリルフォスフェートなどの蛍光基質等が挙げられる。
【実施例】
【0040】
以下実施例により、本発明をより詳細に説明するが、本発明の範囲が実施例のみに限定されないことは言うまでもない。
【0041】
＜実施例１＞ＡＲ－Ｖ７－ＧＦＰ発現細胞の作製方法
ＡＲ－Ｖ７遺伝子とＳＦ３Ｂ２遺伝子との関連を調べるために、ＡＲ－Ｖ７遺伝子を発現させた細胞株を使用して、以下の検討を行った。
ＡＲ－Ｖ７－ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子を作製し、前立腺癌細胞であるＣＷＲ２２Ｒｖ１（以下、２２Ｒｖ１と呼ぶ）にノックインした。図１に示すように、ＡＲ－Ｖ７遺伝子上の潜在性エクソン３（ＣＥ３）部分に含まれるストップコドンの直前にＧＦＰ、Ｔ２Ａ、及びＮｅｏ Ｒの塩基配列を組み込むことで、ＡＲ－Ｖ７－ＧＦＰ発現細胞を作製した。遺伝子のノックインは、既知のゲノム編集システムであるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いて行った。ＡＲ－Ｖ７－ＧＦＰ発現細胞作製時に使用したｇＲＮＡ（ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）は、配列番号３で表される塩基配列を有するｇＲＮＡである。
その後、ウェスタンブロット法によってＡＲ－Ｖ７遺伝子とＧＦＰ遺伝子が融合していることを確認し（図２）、ＡＲ－Ｖ７を蛍光タンパク質ＧＦＰでモニターできる細胞を開発できた。
ＡＲ－Ｖ７遺伝子とＳＦ３Ｂ２遺伝子との関連を調べるために、ＡＲ－Ｖ７遺伝子を発現させた細胞株を使用して、以下の検討を行った。
ＡＲ－Ｖ７－ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子を作製し、前立腺癌細胞であるＣＷＲ２２Ｒｖ１（以下、２２Ｒｖ１と呼ぶ）にノックインした。図１に示すように、ＡＲ－Ｖ７遺伝子上の潜在性エクソン３（ＣＥ３）部分に含まれるストップコドンの直前にＧＦＰ、Ｔ２Ａ、及びＮｅｏ Ｒの塩基配列を組み込むことで、ＡＲ－Ｖ７－ＧＦＰ発現細胞を作製した。遺伝子のノックインは、既知のゲノム編集システムであるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いて行った。ＡＲ－Ｖ７－ＧＦＰ発現細胞作製時に使用したｇＲＮＡ（ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）は、配列番号３で表される塩基配列を有するｇＲＮＡである。
その後、ウェスタンブロット法によってＡＲ－Ｖ７遺伝子とＧＦＰ遺伝子が融合していることを確認し（図２）、ＡＲ－Ｖ７を蛍光タンパク質ＧＦＰでモニターできる細胞を開発できた。
【0042】
＜実施例２＞ＳＦ３Ｂ２の発現抑制によるＡＲ－Ｖ７の発現量抑制
ＳＦ３Ｂ２発現量とＡＲ－Ｖ７発現量との間の関連性を調べるために、ＡＲ－Ｖ７－ＧＦＰ細胞において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムによるＳＦ３Ｂ２ ｇＲＮＡ（ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）の遺伝子導入を行った。ＳＦ３Ｂ２発現細胞作製時に使用したｇＲＮＡ（ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）は、配列番号４で表される塩基配列を有するｇＲＮＡである。
図３に示すフローサイトメトリの図に示す通り、ＳＦ３Ｂ２ ｇＲＮＡを導入し、ＳＦ３Ｂ２の遺伝子発現を抑制したＡＲ－Ｖ７－ＧＦＰ細胞は、コントロール細胞と比較してＡＲ－Ｖ７の発現が低下することを確認した。
つまり、ＳＦ３Ｂ２の発現を抑制することで、ＡＲ－Ｖ７のスプライシングを抑制できることが確認できたことより、作成したＡＲ－Ｖ７－ＧＦＰ細胞がＳＦ３Ｂ２の発現を蛍光タンパク質（ＧＦＰ）でモニターできる細胞であることが確認できた。
ＳＦ３Ｂ２発現量とＡＲ－Ｖ７発現量との間の関連性を調べるために、ＡＲ－Ｖ７－ＧＦＰ細胞において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムによるＳＦ３Ｂ２ ｇＲＮＡ（ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）の遺伝子導入を行った。ＳＦ３Ｂ２発現細胞作製時に使用したｇＲＮＡ（ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）は、配列番号４で表される塩基配列を有するｇＲＮＡである。
図３に示すフローサイトメトリの図に示す通り、ＳＦ３Ｂ２ ｇＲＮＡを導入し、ＳＦ３Ｂ２の遺伝子発現を抑制したＡＲ－Ｖ７－ＧＦＰ細胞は、コントロール細胞と比較してＡＲ－Ｖ７の発現が低下することを確認した。
つまり、ＳＦ３Ｂ２の発現を抑制することで、ＡＲ－Ｖ７のスプライシングを抑制できることが確認できたことより、作成したＡＲ－Ｖ７－ＧＦＰ細胞がＳＦ３Ｂ２の発現を蛍光タンパク質（ＧＦＰ）でモニターできる細胞であることが確認できた。
【0043】
＜実施例３＞ｉｎ ｖｉｖｏでのＡＲ－Ｖ７ノックアウトによる腫瘍増殖抑制
ＳＦ３Ｂ２の過剰発現が、ｉｎ ｖｉｖｏでのアンドロゲン枯渇状況下において、ＡＲ－Ｖ７に起因する腫瘍増殖との関係について確認した。
ＳＦ３Ｂ２の過剰発現は、Ｎｅｏｎ（登録商標）システム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を利用したエレクトロポレーションによって、ＳＦ３Ｂ２遺伝子を組み込んだベクターを対象細胞にトランスフェクションすることで行った。ベクターはｐＸ３３０を使用した。
ＡＲ－Ｖ７をノックアウトした細胞は、Ｎｅｏｎ（登録商標）システム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を利用したエレクトロポレーションによって、配列番号３で表される塩基配列を有するｓｇＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ－ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）及びＣａｓ９を対象細胞にトランスフェクションし、この細胞を選択培地で培養し、単一コロニーを分離培養することによって得られた。
マウスへの腫瘍細胞移植は、まず、雄のＮＯＤ／ＳＣＩＤ（ｎｏｎ－ｏｂｅｓｅ ｄｉａｂｅｔｉｃ／ｓｅｖｅｒｅ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｔ）マウスを７週齢において外科的に去勢した。癌細胞（２×１０6細胞）をＰＢＳ／Ｍａｔｒｉｇｅｌ混合液中に懸濁し、深麻酔下において、去勢した８週齢のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの皮下に注射した。その後、そのマウスを温度コントロールされた無菌室で飼育した。腫瘍体積を、次式：腫瘍体積（ｍｍ3）＝腫瘍の長さ×（腫瘍の幅）2／２によって計算した。
図４に示す通り、腫瘍の皮下注射における腫瘍体積の変化を確認した。その結果、２２Ｒｖ１細胞及びＬＮＣａＰ９５細胞の何れにおいても、ＳＦ３Ｂ２を過剰発現させた細胞は、コントロール（ＧＦＰのみ）細胞と比較して、腫瘍体積が有意に増加していることがわかった（Ｐ＝０．０１３３、０．０３７１）。一方で、ＳＦ３Ｂ２を過剰発現させ、且つＡＲ－Ｖ７をノックアウトした細胞は、ＳＦ３Ｂ２を過剰発現させた細胞と比較して腫瘍体積の増加が有意に抑制されていることがわかった（Ｐ＝０．０００２、Ｐ＜０．０００１）。
つまり、ＳＦ３Ｂ２発現に起因する前立腺癌は、ＡＲ－Ｖ７をノックアウトすることによって、抑制されることがわかった。すなわち、ＡＲ－Ｖ７のスプライシングを調節することは、去勢抵抗性前立腺癌における、ＳＦ３Ｂ２の重要な役割の一つであることが示唆された。
ＳＦ３Ｂ２の過剰発現が、ｉｎ ｖｉｖｏでのアンドロゲン枯渇状況下において、ＡＲ－Ｖ７に起因する腫瘍増殖との関係について確認した。
ＳＦ３Ｂ２の過剰発現は、Ｎｅｏｎ（登録商標）システム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を利用したエレクトロポレーションによって、ＳＦ３Ｂ２遺伝子を組み込んだベクターを対象細胞にトランスフェクションすることで行った。ベクターはｐＸ３３０を使用した。
ＡＲ－Ｖ７をノックアウトした細胞は、Ｎｅｏｎ（登録商標）システム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を利用したエレクトロポレーションによって、配列番号３で表される塩基配列を有するｓｇＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ－ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）及びＣａｓ９を対象細胞にトランスフェクションし、この細胞を選択培地で培養し、単一コロニーを分離培養することによって得られた。
マウスへの腫瘍細胞移植は、まず、雄のＮＯＤ／ＳＣＩＤ（ｎｏｎ－ｏｂｅｓｅ ｄｉａｂｅｔｉｃ／ｓｅｖｅｒｅ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｔ）マウスを７週齢において外科的に去勢した。癌細胞（２×１０6細胞）をＰＢＳ／Ｍａｔｒｉｇｅｌ混合液中に懸濁し、深麻酔下において、去勢した８週齢のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの皮下に注射した。その後、そのマウスを温度コントロールされた無菌室で飼育した。腫瘍体積を、次式：腫瘍体積（ｍｍ3）＝腫瘍の長さ×（腫瘍の幅）2／２によって計算した。
図４に示す通り、腫瘍の皮下注射における腫瘍体積の変化を確認した。その結果、２２Ｒｖ１細胞及びＬＮＣａＰ９５細胞の何れにおいても、ＳＦ３Ｂ２を過剰発現させた細胞は、コントロール（ＧＦＰのみ）細胞と比較して、腫瘍体積が有意に増加していることがわかった（Ｐ＝０．０１３３、０．０３７１）。一方で、ＳＦ３Ｂ２を過剰発現させ、且つＡＲ－Ｖ７をノックアウトした細胞は、ＳＦ３Ｂ２を過剰発現させた細胞と比較して腫瘍体積の増加が有意に抑制されていることがわかった（Ｐ＝０．０００２、Ｐ＜０．０００１）。
つまり、ＳＦ３Ｂ２発現に起因する前立腺癌は、ＡＲ－Ｖ７をノックアウトすることによって、抑制されることがわかった。すなわち、ＡＲ－Ｖ７のスプライシングを調節することは、去勢抵抗性前立腺癌における、ＳＦ３Ｂ２の重要な役割の一つであることが示唆された。
【0044】
＜実施例４＞前立腺癌細胞中におけるＳＦ３Ｂ２とＳＦ３ｂとの関与
ＳＦ３Ｂ２がＳＦ３ｂ複合体に含まれることがこれまでに知られているため、ＳＦ３Ｂ２が前立腺癌細胞中においてもＳＦ３ｂの構成要素と関与しているかについて検討した。
図５Ａで示されるように、既知の方法であるタンデムアフィニティ精製（ＴＡＰ）によって、安定的にＳＦ３Ｂ２－ＴＡＰを発現させた２２Ｒｖ１細胞の核抽出物からＳＦ３Ｂ２関連タンパク質を精製した。ＳＦ３Ｂ２－ＴＡＰは、核及び細胞質のいずれにも局在することが分かった（図５Ｂ）。マススペクトロメトリー法により、ＳＦ３Ｂ２が、ＳＦ３Ｂ１、ＳＦ３Ｂ３（ＳＦ３ｂ１３０又はＳＡＰ１３０としても知られる）、ＳＦ３Ｂ４（ＳＦ３ｂ４９又はＳＡＰ４９としても知られる）、ＳＦ３Ａ１（ＳＦ３ａ１２０又はＳＡＰ１１４としても知られる）及びＳＦ３Ａ３（ＳＦ３ａ６０又はＳＡＰ６１としても知られる）と関与することが確認できた（図５Ｃ）。これらの結果より、ＳＦ３Ｂ２がＳＦ３ｂ複合体において重要な構成要素であることが示唆された。
ＳＦ３Ｂ２がＳＦ３ｂ複合体に含まれることがこれまでに知られているため、ＳＦ３Ｂ２が前立腺癌細胞中においてもＳＦ３ｂの構成要素と関与しているかについて検討した。
図５Ａで示されるように、既知の方法であるタンデムアフィニティ精製（ＴＡＰ）によって、安定的にＳＦ３Ｂ２－ＴＡＰを発現させた２２Ｒｖ１細胞の核抽出物からＳＦ３Ｂ２関連タンパク質を精製した。ＳＦ３Ｂ２－ＴＡＰは、核及び細胞質のいずれにも局在することが分かった（図５Ｂ）。マススペクトロメトリー法により、ＳＦ３Ｂ２が、ＳＦ３Ｂ１、ＳＦ３Ｂ３（ＳＦ３ｂ１３０又はＳＡＰ１３０としても知られる）、ＳＦ３Ｂ４（ＳＦ３ｂ４９又はＳＡＰ４９としても知られる）、ＳＦ３Ａ１（ＳＦ３ａ１２０又はＳＡＰ１１４としても知られる）及びＳＦ３Ａ３（ＳＦ３ａ６０又はＳＡＰ６１としても知られる）と関与することが確認できた（図５Ｃ）。これらの結果より、ＳＦ３Ｂ２がＳＦ３ｂ複合体において重要な構成要素であることが示唆された。
【0045】
＜実施例５＞Ｐｌａｄｉｅｎｏｌｉｄｅ ＢのＳＦ３Ｂ２の複合体への関与 ある化合物は、スプライシングを阻害すること及び抗腫瘍剤としての能力を持つことが知られている。また、そのような化合物の一つであるＰｌａｄｉｅｎｏｌｉｄｅ Ｂ（ＰＬＡ－Ｂ）は、商用利用されているマクロライドであり、抗腫瘍活性を有し、ＳＦ３Ｂ３への相互作用を介してＡＲ－Ｖ７のスプライシングを妨害することがこれまでに知られている。前立腺癌において、ＳＦ３Ｂ２はＳＦ３Ｂ３と関与するため、Ｐｌａｄｉｅｎｏｌｉｄｅ Ｂが、高いＳＦ３Ｂ２発現を有する侵攻性癌に対しての治療薬の候補になるかを検討した。
ＳＦ３Ｂ２又はＧＦＰの過剰発現は実施例３に記載した手法と同様の手法により行った。
注目すべきことに、Ｐｌａｄｉｅｎｏｌｉｄｅ Ｂは、ＳＦ３Ｂ２－ＴＡＰとその関連タンパク質との相互作用を減少させた（図５Ａ、５Ｃ）。ＳＦ３Ｂ２関連タンパク質へのＰｌａｄｉｅｎｏｌｉｄｅ Ｂの効果を考慮し、ＡＲ－Ｖ７スプライシングへの効果を検討した（図６Ａ、６Ｂ）。Ｐｌａｄｉｅｎｏｌｉｄｅ Ｂは、ＡＲ－Ｖ７－ＧＦＰ細胞において、用量依存的にＡＲ－Ｖ７－ＧＦＰの発現を減少させた。また、ＬＮＣａＰ９５細胞を用いた場合、Ｐｌａｄｉｅｎｏｌｉｄｅ Ｂを投与することで、ビヒクルと比較して、ＡＲ－Ｖ７の発現を有意に抑制できることが分かった（図６Ｃ、Ｐ＝０．０００５）。この結果は、ＰＬＡ－Ｂによって、スプライシング因子であるタンパク質複合体ＳＦ３ｂの構成タンパク質間における相互作用を減少させ、その結果ＡＲ－Ｖ７のスプライシングが抑制されたことを示唆する。また、２２Ｒｖ１細胞を使用した場合においても同様の結果が得られた（データ示さず）。
ＳＦ３Ｂ２又はＧＦＰの過剰発現は実施例３に記載した手法と同様の手法により行った。
注目すべきことに、Ｐｌａｄｉｅｎｏｌｉｄｅ Ｂは、ＳＦ３Ｂ２－ＴＡＰとその関連タンパク質との相互作用を減少させた（図５Ａ、５Ｃ）。ＳＦ３Ｂ２関連タンパク質へのＰｌａｄｉｅｎｏｌｉｄｅ Ｂの効果を考慮し、ＡＲ－Ｖ７スプライシングへの効果を検討した（図６Ａ、６Ｂ）。Ｐｌａｄｉｅｎｏｌｉｄｅ Ｂは、ＡＲ－Ｖ７－ＧＦＰ細胞において、用量依存的にＡＲ－Ｖ７－ＧＦＰの発現を減少させた。また、ＬＮＣａＰ９５細胞を用いた場合、Ｐｌａｄｉｅｎｏｌｉｄｅ Ｂを投与することで、ビヒクルと比較して、ＡＲ－Ｖ７の発現を有意に抑制できることが分かった（図６Ｃ、Ｐ＝０．０００５）。この結果は、ＰＬＡ－Ｂによって、スプライシング因子であるタンパク質複合体ＳＦ３ｂの構成タンパク質間における相互作用を減少させ、その結果ＡＲ－Ｖ７のスプライシングが抑制されたことを示唆する。また、２２Ｒｖ１細胞を使用した場合においても同様の結果が得られた（データ示さず）。
【0046】
＜実施例６＞ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＰｌａｄｉｅｎｏｌｉｄｅ ＢのＳＦ３Ｂ２に依存する腫瘍の増殖抑制
ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＰｌａｄｉｅｎｏｌｉｄｅ ＢのＳＦ３Ｂ２に依存する腫瘍の増殖が抑制されるかを検討した。
ＳＦ３Ｂ２又はＧＦＰの過剰発現及びマウスへの腫瘍細胞移植は実施例３に記載した手法と同様の手法により行った。
また、腫瘍体積が２２Ｒｖ１細胞においては１００～３００ｍｍ3又はＬＮＣａＰ９５細胞においては２００～４００ｍｍ3に達した時、Ｐｌａｄｉｅｎｏｌｉｄｅ Ｂ誘導体（５ｍｇ／ｋｇ）又はビヒクル（ＤＭＳＯ）を０、２、４、及び６日目において腹腔内投与した。相対的な腫瘍体積は、時間ｔにおける腫瘍体積と処置開始時点の腫瘍体積との間の比によって計算した。
また、ｉｎ ｖｉｖｏにおける抗腫瘍効果を確認するために、ＬＮＣａＰ９５細胞において、去勢マウスにおいて腫瘍サイズが２００～４００ｍｍ3に達した時に、Ｐｌａｄｉｅｎｏｌｉｄｅ Ｂを腹腔内に投与した。その結果、ビヒクル（ＤＭＳＯ）を投与したマウスでは腫瘍体積が時間経過と共に増殖する傾向があるのに対して、ＰＬＡ－Ｂを投与したマウスでは腫瘍体積が有意に減少した（図７Ａ、Ｐ＜０．０１）。この結果は、ＰＬＡ－ＢがＳＦ３Ｂ２の機能を阻害し、ＳＦ３Ｂ２によるＡＲ－Ｖ７のスプライシングを抑制した結果、腫瘍増殖が抑制されたことを示唆する。
さらに、ＳＦ３Ｂ２又はＧＦＰを過剰発現させた前立腺癌細胞（ＬＮＣａＰ９５細胞）を有する去勢マウスにおいて、腫瘍サイズが２００～４００ｍｍ3に達した時に、Ｐｌａｄｉｅｎｏｌｉｄｅ Ｂを腹腔内に投与した。その結果、ＳＦ３Ｂ２を安定的に過剰発現させたＬＮＣａＰ９５細胞を有するマウスは、ＧＦＰのみを過剰発現させたＬＮＣａＰ９５細胞を有するマウスと比較して、Ｐｌａｄｉｅｎｏｌｉｄｅ Ｂ処置を行った場合において、ＳＦ３Ｂ２を安定的に過剰発現させたＬＮＣａＰ９５細胞を有するマウスは腫瘍体積が有意に減少していた（図７Ｂ、Ｐ＜０．０１）。つまり、ＳＦ３Ｂ２を過剰に発現していることでＬＮＣａＰ９５細胞はＰｌａｄｉｅｎｏｌｉｄｅ Ｂへの感受性が高まることがわかった。
また、これらの結果は、２２Ｒｖ１細胞を使用した場合においても同様の結果が得られた（データ示さず）。
つまり、このような細胞を用いた新規化合物のスクリーニング系を利用することで、Ｐｌａｄｉｅｎｏｌｉｄｅ Ｂと同様にＡＲ－Ｖ７のスプライシング制御を標的とする劇的な抗癌増殖効果を生じ、且つ細胞毒性が少ない化合物をスクリーニングすることが可能になる。
ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＰｌａｄｉｅｎｏｌｉｄｅ ＢのＳＦ３Ｂ２に依存する腫瘍の増殖が抑制されるかを検討した。
ＳＦ３Ｂ２又はＧＦＰの過剰発現及びマウスへの腫瘍細胞移植は実施例３に記載した手法と同様の手法により行った。
また、腫瘍体積が２２Ｒｖ１細胞においては１００～３００ｍｍ3又はＬＮＣａＰ９５細胞においては２００～４００ｍｍ3に達した時、Ｐｌａｄｉｅｎｏｌｉｄｅ Ｂ誘導体（５ｍｇ／ｋｇ）又はビヒクル（ＤＭＳＯ）を０、２、４、及び６日目において腹腔内投与した。相対的な腫瘍体積は、時間ｔにおける腫瘍体積と処置開始時点の腫瘍体積との間の比によって計算した。
また、ｉｎ ｖｉｖｏにおける抗腫瘍効果を確認するために、ＬＮＣａＰ９５細胞において、去勢マウスにおいて腫瘍サイズが２００～４００ｍｍ3に達した時に、Ｐｌａｄｉｅｎｏｌｉｄｅ Ｂを腹腔内に投与した。その結果、ビヒクル（ＤＭＳＯ）を投与したマウスでは腫瘍体積が時間経過と共に増殖する傾向があるのに対して、ＰＬＡ－Ｂを投与したマウスでは腫瘍体積が有意に減少した（図７Ａ、Ｐ＜０．０１）。この結果は、ＰＬＡ－ＢがＳＦ３Ｂ２の機能を阻害し、ＳＦ３Ｂ２によるＡＲ－Ｖ７のスプライシングを抑制した結果、腫瘍増殖が抑制されたことを示唆する。
さらに、ＳＦ３Ｂ２又はＧＦＰを過剰発現させた前立腺癌細胞（ＬＮＣａＰ９５細胞）を有する去勢マウスにおいて、腫瘍サイズが２００～４００ｍｍ3に達した時に、Ｐｌａｄｉｅｎｏｌｉｄｅ Ｂを腹腔内に投与した。その結果、ＳＦ３Ｂ２を安定的に過剰発現させたＬＮＣａＰ９５細胞を有するマウスは、ＧＦＰのみを過剰発現させたＬＮＣａＰ９５細胞を有するマウスと比較して、Ｐｌａｄｉｅｎｏｌｉｄｅ Ｂ処置を行った場合において、ＳＦ３Ｂ２を安定的に過剰発現させたＬＮＣａＰ９５細胞を有するマウスは腫瘍体積が有意に減少していた（図７Ｂ、Ｐ＜０．０１）。つまり、ＳＦ３Ｂ２を過剰に発現していることでＬＮＣａＰ９５細胞はＰｌａｄｉｅｎｏｌｉｄｅ Ｂへの感受性が高まることがわかった。
また、これらの結果は、２２Ｒｖ１細胞を使用した場合においても同様の結果が得られた（データ示さず）。
つまり、このような細胞を用いた新規化合物のスクリーニング系を利用することで、Ｐｌａｄｉｅｎｏｌｉｄｅ Ｂと同様にＡＲ－Ｖ７のスプライシング制御を標的とする劇的な抗癌増殖効果を生じ、且つ細胞毒性が少ない化合物をスクリーニングすることが可能になる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【配列表】