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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-07-16
(45)【発行日】2024-07-24
(54)【発明の名称】カウンターセレクションマーカー
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/06 20060101AFI20240717BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20240717BHJP
C12Q 1/68 20180101ALI20240717BHJP
C12Q 1/25 20060101ALI20240717BHJP
C12N 9/16 20060101ALI20240717BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/06
C12N15/11 Z
C12Q1/68
C12Q1/25
C12N9/16 Z
【請求項の数】
5
(21)【出願番号】P 2021015667
(22)【出願日】2021-02-03
(65)【公開番号】P2021136997
(43)【公開日】2021-09-16
【審査請求日】2023-04-20
(31)【優先権主張番号】P 2020039295
(32)【優先日】2020-03-06
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】501203344
【氏名又は名称】国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構
(74)【代理人】
【識別番号】110001047
【氏名又は名称】弁理士法人セントクレスト国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】加藤 祐輔
【審査官】斉藤 貴子
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２００９／０３８１９５（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２０１６－０３２４４０（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１４－１６１２２９（ＪＰ，Ａ）
【文献】SCHUSTER, C. F. et al.，Use of the counter selectable marker PheS* for genome engineering in Staphylococcus aureus，Microbiology，2019年，Vol. 165，P. 572-584
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｑ
Ｃ１２Ｎ
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
細胞において機能するカウンターセレクションマーカーをスクリーニングする方法であって、
（１）前記細胞に、
特定のコドンを認識し、かつ非天然アミノ酸に結合し得る、被検ピロリジンｔＲＮＡと、
前記非天然アミノ酸と前記被検ピロリジンｔＲＮＡの結合を特異的に触媒するアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼとを、発現させる工程、
（２）前記細胞を、前記非天然アミノ酸存在下にて培養し、生細胞数を検出する工程、及び、
（３）前記工程にて検出された生細胞数が、前記非天然アミノ酸非存在下にて培養した際の生細胞数と比較して少ない場合、前記被検ピロリジンｔＲＮＡは、前記細胞において機能するカウンターセレクションマーカーであると判定する工程を、含み、
前記非天然アミノ酸が、Ｎ ε －ベンジルオキシカルボニル－Ｌ－リジンである、方法。
【請求項2】
（Ａ）保持するアンチコドンが異なる複数種の前記被検ピロリジンｔＲＮＡからなるライブラリーをコードするＤＮＡ構築物と、（Ｂ）前記アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼをコードするＤＮＡ構築物と、（Ｄ）前記非天然アミノ酸との組み合わせ、又は、
（Ｃ）保持するアンチコドンが異なる複数種の前記被検ピロリジンｔＲＮＡからなるライブラリー及び前記アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼをコードするＤＮＡ構築物と、（Ｄ）前記非天然アミノ酸との組み合わせを、含み、
前記非天然アミノ酸が、Ｎ ε －ベンジルオキシカルボニル－Ｌ－リジンである、請求項１に記載の方法に用いられるためのキット。
【請求項3】
細胞においてカウンターセレクションマーカーとして機能するｔＲＮＡをコードするＤＮＡを含み、前記ｔＲＮＡが、特定のコドンを認識し、かつ非天然アミノ酸に結合し得る、ピロリジンｔＲＮＡであり、
前記細胞が大腸菌であり、
前記特定のコドンが、ＡＵＧ、ＵＵＵ、ＵＣＵ、ＵＣＣ、ＵＣＡ、ＵＣＧ、ＵＡＣ、ＵＧＣ、ＵＧＧ、ＣＵＵ、ＣＵＣ、ＣＵＡ、ＣＣＵ、ＣＣＣ、ＣＣＡ、ＣＣＧ、ＣＡＵ、ＣＡＣ、ＣＡＡ、ＣＡＧ、ＣＧＵ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＡＵＣ、ＡＣＵ、ＡＣＣ、ＡＣＡ、ＡＣＧ、ＡＡＣ、ＡＡＧ、ＧＵＵ、ＧＵＣ、ＧＵＡ、ＧＵＧ、ＧＣＵ、ＧＣＣ、ＧＣＡ、ＧＣＧ、ＧＡＵ、ＧＡＣ、ＧＡＧ、ＧＧＵ、ＧＧＣ及びＧＧＡから選択される、少なくとも１のコドンであり、
前記非天然アミノ酸が、Ｎ ε －ベンジルオキシカルボニル－Ｌ－リジンである、ＤＮＡ構築物。
【請求項4】
細胞をカウンターセレクションする方法であって、
（１）前記細胞に、請求項３に記載のＤＮＡ構築物を導入して前記ピロリジンｔＲＮＡを発現させ、かつ非天然アミノ酸と前記ピロリジンｔＲＮＡの結合を特異的に触媒するアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを発現させる工程、及び、
（２）前記細胞を、前記非天然アミノ酸存在下にて培養し、生細胞を回収する工程を、含み、
前記細胞が大腸菌であり、
前記非天然アミノ酸が、Ｎ ε －ベンジルオキシカルボニル－Ｌ－リジンである、方法。
【請求項5】
（Ａ）請求項３に記載のＤＮＡ構築物と、
（Ｂ）前記アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼをコードするＤＮＡ構築物と、
（Ｄ）前記非天然アミノ酸との組み合わせ、又は、
（Ｃ）前記アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼをコードするＤＮＡを更に含む、請求項３に記載のＤＮＡ構築物と、
（Ｄ）前記非天然アミノ酸との組み合わせ
を含み、
前記非天然アミノ酸が、Ｎ ε －ベンジルオキシカルボニル－Ｌ－リジンである、
請求項４に記載の方法に用いられるためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、カウンターセレクションマーカー、そのスクリーニング方法、及びその利用方法に関する。
【背景技術】
【0002】
遺伝子組換え等の遺伝子工学は、生命現象を研究する上で極めて重要な技術である。また、新たな食物、医薬品、化学物質等の開発においても多大な貢献をもたらしている。しかしながら、多くの場合、遺伝子組換え等が成功した形質転換体と非形質転換体では外観上に差はない。また、その効率は非常に低いため、大量の細胞の中から形質転換体を効率よく検出する必要がある。そのため、遺伝子組換え等の有無を確認するための目印となるマーカー遺伝子の利用は、遺伝子工学において必須である。
【0003】
マーカー遺伝子には、その遺伝子を含むＤＮＡ構築物（プラスミド等）が導入された細胞に、生存能力等を付与することにより、当該細胞の選択、検出を容易にするもの（所謂、ポジティブセレクションマーカー遺伝子）がある。アンピシリン耐性等の薬剤耐性遺伝子、トリプトファン合成酵素等の栄養要求性遺伝子、ＧＦＰ等のレポーター遺伝子などなど、様々なものが開発され、多様な生物種を対象として利用されている。
【0004】
その一方で、マーカー遺伝子には、逆に生育等を阻害することにより、ＤＮＡ構築物導入の有無の判断を可能にするマーカー遺伝子（所謂、カウンターセレクションマーカー遺伝子、ネガティブセレクションマーカー遺伝子）も存在する。かかる遺伝子は、一度細胞内に導入されたＤＮＡ構築物又はその断片の脱落、例えば、プラスミドキュアリング（ｐｌａｓｍｉｄ ｃｕｒｉｎｇ）、ゲノム編集等における２段階選抜（ｄｏｕｂｌｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｙ）を行なう上で利用される。
【0005】
カウンターセレクションマーカー遺伝子についても、例えば、非特許文献１の表１に示してあるとおり、いくつか報告はあるが、その多くは、変異導入や遺伝子組換え等により、特殊な遺伝子型を有するように改変された宿主にしか適用できない。
【0006】
例えば、ｒｐｓＬ遺伝子がコードするタンパク質にストレプトマイシン（Ｓｍ）が結合することによって、生育等の阻害が引き起こされるため、この遺伝子はカウンターセレクションマーカー遺伝子として用いられている。しかしながら、この遺伝子は、大腸菌等の細菌が生来保持しているため、これをカウンターセレクションマーカー遺伝子として利用するためには、Ｓｍ耐性を有するよう、大腸菌等の内在性ｒｐｓＬ＋遺伝子を改変する必要がある（非特許文献２ 参照）。
【0007】
また、カウンターセレクションマーカー遺伝子は、ポジティブセレクションマーカー遺伝子ほど充実はしていないため、適用できる細胞（微生物等）の種類も限られる。
【0008】
そのため、宿主の遺伝子を改変せず、また様々な生物種に対応する、汎用性の高いカウンターセレクションマーカーの提供が求められているが、そのような提供方法は未だ開発されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0009】
【文献】Ｒｅｙｒａｔ ＪＭ．ら、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．、１９９８年、６６巻、９号、４０１１～４０１７ページ
【文献】Ｄｅａｎ Ｄ．、Ｇｅｎｅ．、１９８１年、１５巻、１号、９９～１０２ページ
【文献】Ｙａｎａｇｉｓａｗａ Ｔ．ら、Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．、２００８年、１５巻、１１号、１１８７～１１９７ページ
【文献】Ｐ Ｋａｓｔ、Ｇｅｎｅ、１９９４年、１３８（１－２）、１０９～１１４ページ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
本発明は、前記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、細胞種に応じたカウンターセレクションマーカーを提供できる、汎用性の高い方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0011】
本発明者らは、前記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、細菌から多細胞真核生物まで保存されている、コドンとアミノ酸の対応に着目した。そして、この保存性の高い対応関係を乱せば、様々な細胞においても、それらの生育等を阻害できるのではないかと着想した。すなわち、特定のコドンに、それが定義するアミノ酸とは異なる化合物を導入し、タンパク質を合成させた場合に、当該タンパク質の中で、細胞に対して毒性を示し得るものも生じてくるのではと考えた。
【0012】
また、コドンとアミノ酸の対応関係を乱す手段として、非天然アミノ酸のタンパク質への導入技術（非特許文献３等 参照）を用いることも着想した。この技術は、タンパク質合成（翻訳）の過程にて、人為的に改変したｔＲＮＡ及びアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ａａＲＳ）を用い、非天然アミノ酸とｍＲＮＡ内のコドンとを対応させ、該非天然アミノ酸をタンパク質に導入するものである。しかしながら、当該技術において、通常用いられるコドンは、終止コドン（ＵＡＧ等）や、対応する天然アミノ酸をコードするコドンに限られる（図１、並びに非特許文献３及び４等 参照）。
【0013】
そこで、本発明者らは、ｔＲＮＡのコドン認識部位であるアンチコドンの配列をランダムに変更したライブラリーを調製し、それを非天然アミノ酸と前記ｔＲＮＡとの結合を特異的に触媒するアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼと共に大腸菌において発現させた。そして、当該非天然アミノ酸存在下にて培養することにより、特定のコドンにおいて非天然アミノ酸が導入されたタンパク質を、各大腸菌株に発現させ、その毒性を評価した。
【0014】
その結果、６４種あるコドンにおいて、非天然アミノ酸が導入されたタンパク質が発現しても、大腸菌の生存等に殆ど影響しないコドンがある一方で、強い毒性を示すコドンがあることが明らかになった。そして、このように選抜した強い毒性を示すコドンが、カウンターセレクション、ひいてはプラスミドキュアリングにおいて有効であることを確認し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、以下＜１＞～＜６＞を提供するものである。
＜１＞ 細胞において機能するカウンターセレクションマーカーをスクリーニングする方法であって、下記（１）～（３）の工程を含む方法
（１）前記細胞に、
特定のコドンを認識し、かつ非天然アミノ酸に結合し得る、被検ｔＲＮＡと、
前記非天然アミノ酸と前記被検ｔＲＮＡの結合を特異的に触媒するアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼとを、発現させる工程、
（２）前記細胞を、前記非天然アミノ酸存在下にて培養し、生細胞数を検出する工程、
（３）前記工程にて検出された生細胞数が、前記非天然アミノ酸非存在下にて培養した際の生細胞数と比較して少ない場合、前記被検ｔＲＮＡは、前記細胞において機能するカウンターセレクションマーカーであると判定する工程。
＜２＞ 下記（Ａ）～（Ｄ）から選択される少なくとも１の物品を含み、＜１＞に記載の方法に用いられるためのキット
（Ａ）前記被検ｔＲＮＡをコードするＤＮＡ構築物
（Ｂ）前記アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼをコードするＤＮＡ構築物
（Ｃ）前記被検ｔＲＮＡ及び前記アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼをコードするＤＮＡ構築物
（Ｄ）前記非天然アミノ酸。
＜３＞ 細胞においてカウンターセレクションマーカーとして機能するｔＲＮＡをコードするＤＮＡを含み、前記ｔＲＮＡが、特定のコドンを認識し、かつ非天然アミノ酸に結合し得る、ピロリジンｔＲＮＡである、ＤＮＡ構築物。
＜４＞ 前記細胞が大腸菌であり、
前記特定のコドンが、ＡＵＧ、ＵＵＵ、ＵＣＵ、ＵＣＣ、ＵＣＡ、ＵＣＧ、ＵＡＣ、ＵＧＣ、ＵＧＧ、ＣＵＵ、ＣＵＣ、ＣＵＡ、ＣＣＵ、ＣＣＣ、ＣＣＡ、ＣＣＧ、ＣＡＵ、ＣＡＣ、ＣＡＡ、ＣＡＧ、ＣＧＵ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＡＵＣ、ＡＣＵ、ＡＣＣ、ＡＣＡ、ＡＣＧ、ＡＡＣ、ＡＡＧ、ＧＵＵ、ＧＵＣ、ＧＵＡ、ＧＵＧ、ＧＣＵ、ＧＣＣ、ＧＣＡ、ＧＣＧ、ＧＡＵ、ＧＡＣ、ＧＡＧ、ＧＧＵ、ＧＧＣ及びＧＧＡから選択される、少なくとも１のコドンであり、かつ
前記非天然アミノ酸が、Ｎε－ベンジルオキシカルボニル－Ｌ－リジンである、＜３＞に記載のＤＮＡ構築物。
＜５＞ 細胞をカウンターセレクションする方法であって、下記（１）～（２）の工程を含む方法
（１）前記細胞に、＜３＞又は＜４＞に記載のＤＮＡ構築物を導入して前記ピロリジンｔＲＮＡを発現させ、かつ前記非天然アミノ酸と前記ピロリジンｔＲＮＡの結合を特異的に触媒するアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを発現させる工程、
（２）前記細胞を、前記非天然アミノ酸存在下にて培養し、生細胞を回収する工程。
＜６＞ 下記（Ａ）～（Ｅ）から選択される少なくとも１の物品を含み、＜５＞に記載の方法に用いられるためのキット
（Ａ）＜３＞又は＜４＞に記載のＤＮＡ構築物
（Ｂ）前記アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼをコードするＤＮＡ構築物
（Ｃ）前記アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼをコードするＤＮＡを更に含む、＜３＞又は＜４＞に記載のＤＮＡ構築物
（Ｄ）前記非天然アミノ酸
（Ｅ）前記細胞。
＜１＞ 細胞において機能するカウンターセレクションマーカーをスクリーニングする方法であって、下記（１）～（３）の工程を含む方法
（１）前記細胞に、
特定のコドンを認識し、かつ非天然アミノ酸に結合し得る、被検ｔＲＮＡと、
前記非天然アミノ酸と前記被検ｔＲＮＡの結合を特異的に触媒するアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼとを、発現させる工程、
（２）前記細胞を、前記非天然アミノ酸存在下にて培養し、生細胞数を検出する工程、
（３）前記工程にて検出された生細胞数が、前記非天然アミノ酸非存在下にて培養した際の生細胞数と比較して少ない場合、前記被検ｔＲＮＡは、前記細胞において機能するカウンターセレクションマーカーであると判定する工程。
＜２＞ 下記（Ａ）～（Ｄ）から選択される少なくとも１の物品を含み、＜１＞に記載の方法に用いられるためのキット
（Ａ）前記被検ｔＲＮＡをコードするＤＮＡ構築物
（Ｂ）前記アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼをコードするＤＮＡ構築物
（Ｃ）前記被検ｔＲＮＡ及び前記アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼをコードするＤＮＡ構築物
（Ｄ）前記非天然アミノ酸。
＜３＞ 細胞においてカウンターセレクションマーカーとして機能するｔＲＮＡをコードするＤＮＡを含み、前記ｔＲＮＡが、特定のコドンを認識し、かつ非天然アミノ酸に結合し得る、ピロリジンｔＲＮＡである、ＤＮＡ構築物。
＜４＞ 前記細胞が大腸菌であり、
前記特定のコドンが、ＡＵＧ、ＵＵＵ、ＵＣＵ、ＵＣＣ、ＵＣＡ、ＵＣＧ、ＵＡＣ、ＵＧＣ、ＵＧＧ、ＣＵＵ、ＣＵＣ、ＣＵＡ、ＣＣＵ、ＣＣＣ、ＣＣＡ、ＣＣＧ、ＣＡＵ、ＣＡＣ、ＣＡＡ、ＣＡＧ、ＣＧＵ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＡＵＣ、ＡＣＵ、ＡＣＣ、ＡＣＡ、ＡＣＧ、ＡＡＣ、ＡＡＧ、ＧＵＵ、ＧＵＣ、ＧＵＡ、ＧＵＧ、ＧＣＵ、ＧＣＣ、ＧＣＡ、ＧＣＧ、ＧＡＵ、ＧＡＣ、ＧＡＧ、ＧＧＵ、ＧＧＣ及びＧＧＡから選択される、少なくとも１のコドンであり、かつ
前記非天然アミノ酸が、Ｎε－ベンジルオキシカルボニル－Ｌ－リジンである、＜３＞に記載のＤＮＡ構築物。
＜５＞ 細胞をカウンターセレクションする方法であって、下記（１）～（２）の工程を含む方法
（１）前記細胞に、＜３＞又は＜４＞に記載のＤＮＡ構築物を導入して前記ピロリジンｔＲＮＡを発現させ、かつ前記非天然アミノ酸と前記ピロリジンｔＲＮＡの結合を特異的に触媒するアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを発現させる工程、
（２）前記細胞を、前記非天然アミノ酸存在下にて培養し、生細胞を回収する工程。
＜６＞ 下記（Ａ）～（Ｅ）から選択される少なくとも１の物品を含み、＜５＞に記載の方法に用いられるためのキット
（Ａ）＜３＞又は＜４＞に記載のＤＮＡ構築物
（Ｂ）前記アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼをコードするＤＮＡ構築物
（Ｃ）前記アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼをコードするＤＮＡを更に含む、＜３＞又は＜４＞に記載のＤＮＡ構築物
（Ｄ）前記非天然アミノ酸
（Ｅ）前記細胞。
【発明の効果】
【0015】
本発明によれば、細胞種に応じ、汎用性高く、カウンターセレクションマーカー、及びそれを利用したカウンターセレクション法を提供することが可能となる。また、このようにして提供される本発明のマーカーは、導入するだけで細胞において機能する、優性型のカウンターセレクションマーカーである。そのため、従前のカウンターセレクションマーカー（ｒｐｓＬ等）の利用において必要となる、宿主細胞における遺伝子改変を要さない。
【0016】
なお、非特許文献４に示すとおり、非天然アミノ酸を、特定のセンスコドンに導入し、異常タンパク質を作らせることにより、毒性を発揮させるカウンターセレクションについての報告はある。しかしながら、当該方法において、非天然アミノ酸が導入されるセンスコドンは、予めフェニルアラニンを定義するコドンに限定されている。そのため、汎用性に乏しい。また、導入される非天然アミノ酸も、フェニルアラニンの類縁体（パラクロロフェニルアラニン）であり、本来定義されているフェニルアラニンと類似の構造をとるため、毒性の発揮が困難となる。一方、本発明によれば、本来定義される天然のアミノ酸とかけ離れた構造を有する非天然アミノ酸を任意のコドンに導入できるため、強い毒性の発揮は容易である。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【図1】タンパク質合成（翻訳）の過程にて、ｔＲＮＡ及びアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ａａＲＳ）を用い、非天然アミノ酸（図中「ｕｎＡＡ」）とｍＲＮＡ内のコドン（図中、ＵＡＧ）とを対応させ、該非天然アミノ酸をタンパク質に導入する工程を示す、概略図である。
【図2A】標的ＤＮＡを含むゲノムＤＮＡと、改変された標的ＤＮＡ配列及びポジティブセレクションマーカー（ＰＳ）、並びにその両側に相同配列及びカウンターセレクションマーカー（ＣＳ）を含むＤＮＡ構築物との、相同組み換えを示す、概略図である。
【図3A】標的ＤＮＡを含むゲノムＤＮＡと、ＰＳ及びＣＳ、並びにその両側に相同配列を含むＤＮＡ構築物との、相同組み換えを示す、概略図である。
【図4A】ＣＡＧコドンに相補的なアンチコドンを保持するピロリジンｔＲＮＡを発現させた大腸菌株を、Ｚ－リジン非存在下（図中（－））又は存在下（図中（＋））にて培養した結果を示す写真である。
【図4B】ＡＣＣコドンに相補的なアンチコドンを保持するピロリジンｔＲＮＡを発現させた大腸菌株を、Ｚ－リジン非存在下（図中（－））又は存在下（図中（＋））にて培養した結果を示す写真である。
【図5】ＧＧＣコドンに相補的なアンチコドンを保持するピロリジンｔＲＮＡ発現させた大腸菌株を、Ｚ－リジン非存在下（図中（－））若しくは存在下（図中（＋））、又はクロラムフェニコール非存在下（図中（－））若しくは存在下（図中（＋））にて培養した結果を示す写真である。
【図6】異なる特定のコドンを各々認識する２種のピロリジンｔＲＮＡを発現させた大腸菌株を、Ｚ－リジン非存在下（図中「－ＺＫ」）又は存在下（図中「＋ＺＫ」）にて培養した結果を示す写真である。
【図7】本発明のカウンターセレクションマーカーを利用し、同種プラスミドの交換が出来たことを示す写真である。交換する２つの同種プラスミド（ｐＡＣＹＣ１８４及びｐＴＫ２－１ ＺＬｙｓＲＳ１－ＧＧＵ＋ＣＧＣ（ｐＴＫ２－１－ＧＧＵ＋ＣＧＣ））を識別できる２種のコロニーＰＣＲ反応を行った結果を示す。図中、「Ｍ」は分子量マーカー（日本ジーン、Ｍａｒｋｅｒ ６）を示し、「１～２４」は、分離した大腸菌コロニーの識別番号を示し、「Ｃ１」及び「Ｃ２」は各々、ポジティブコントロール（ｐＡＣＹＣ１８４及びｐＴＫ２－１－ＧＧＵ＋ＣＧＣ）を示す。また、上部のアガロースゲル電気泳動写真は、ｐＡＣＹＣ１８４のみを検出した結果を示し、下部のそれは、ｐＴＫ２－１－ＧＧＵ＋ＣＧＣのみを検出した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0018】
＜カウンターセレクションマーカーのスクリーニング方法＞
後述の実施例において示すとおり、アンチコドンの配列をランダムに改変した、非天然アミノ酸に結合し得るｔＲＮＡと、前記非天然アミノ酸と前記ｔＲＮＡの結合を特異的に触媒するアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼとを、大腸菌において発現させ、前記非天然アミノ酸の存在下で培養した。その結果、合成されるタンパク質において、本来導入されるアミノ酸の代わりに非天然アミノ酸が導入されることにより、当該タンパク質が大腸菌に対して毒性を示すものが生じた。そして、それら毒性が示された大腸菌に導入された、ｔＲＮＡのアンチコドンの配列を解析することにより、非天然アミノ酸を導入することにより、前記毒性を発揮するコドンを選抜することができた。
後述の実施例において示すとおり、アンチコドンの配列をランダムに改変した、非天然アミノ酸に結合し得るｔＲＮＡと、前記非天然アミノ酸と前記ｔＲＮＡの結合を特異的に触媒するアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼとを、大腸菌において発現させ、前記非天然アミノ酸の存在下で培養した。その結果、合成されるタンパク質において、本来導入されるアミノ酸の代わりに非天然アミノ酸が導入されることにより、当該タンパク質が大腸菌に対して毒性を示すものが生じた。そして、それら毒性が示された大腸菌に導入された、ｔＲＮＡのアンチコドンの配列を解析することにより、非天然アミノ酸を導入することにより、前記毒性を発揮するコドンを選抜することができた。
【0019】
したがって、本発明は、
細胞において機能するカウンターセレクションマーカーをスクリーニングする方法であって、下記（１）～（３）の工程を含む方法を、提供する。
（１）前記細胞に、
特定のコドンを認識し、かつ非天然アミノ酸に結合し得る、被検ｔＲＮＡと、
前記非天然アミノ酸と前記被検ｔＲＮＡの結合を特異的に触媒するアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼとを、発現させる工程、
（２）前記細胞を、前記非天然アミノ酸存在下にて培養し、生細胞数を検出する工程、
（３）前記工程にて検出された生細胞数が、前記非天然アミノ酸非存在下にて培養した際の生細胞数と比較して少ない場合、前記被検ｔＲＮＡは、前記細胞において機能するカウンターセレクションマーカーであると判定する工程。
細胞において機能するカウンターセレクションマーカーをスクリーニングする方法であって、下記（１）～（３）の工程を含む方法を、提供する。
（１）前記細胞に、
特定のコドンを認識し、かつ非天然アミノ酸に結合し得る、被検ｔＲＮＡと、
前記非天然アミノ酸と前記被検ｔＲＮＡの結合を特異的に触媒するアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼとを、発現させる工程、
（２）前記細胞を、前記非天然アミノ酸存在下にて培養し、生細胞数を検出する工程、
（３）前記工程にて検出された生細胞数が、前記非天然アミノ酸非存在下にて培養した際の生細胞数と比較して少ない場合、前記被検ｔＲＮＡは、前記細胞において機能するカウンターセレクションマーカーであると判定する工程。
【0020】
（カウンターセレクションマーカー）
本発明において、「カウンターセレクションマーカー」とは、細胞においてその機能を発現することにより、生育等（生育、若しくは増殖）を阻害、又は細胞死を誘導する等、選択条件下における適応性を阻害し得る分子を意味する。また当該分子は、脱落等することにより、それが発現しない細胞を選択するためのマーカーとしても機能する。
本発明において、「カウンターセレクションマーカー」とは、細胞においてその機能を発現することにより、生育等（生育、若しくは増殖）を阻害、又は細胞死を誘導する等、選択条件下における適応性を阻害し得る分子を意味する。また当該分子は、脱落等することにより、それが発現しない細胞を選択するためのマーカーとしても機能する。
【0021】
（非天然アミノ酸）
本発明において、「非天然アミノ酸」とは、天然アミノ酸（遺伝的にコードされるα－アミノ酸。アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン）以外のアミノ酸を意味し、前記天然アミノ酸の類縁体（修飾体、置換体、標識化合物が付加されたもの等）含まれる。
本発明において、「非天然アミノ酸」とは、天然アミノ酸（遺伝的にコードされるα－アミノ酸。アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン）以外のアミノ酸を意味し、前記天然アミノ酸の類縁体（修飾体、置換体、標識化合物が付加されたもの等）含まれる。
【0022】
本発明にかかる「非天然アミノ酸」としては、例えば、リジン類縁体（Ｎε－ベンジルオキシカルボニル－Ｌ－リジン（Ｚ－リジン、ＺＬｙｓ）、Ｎε－アセチル－Ｌ－リジン（ＡｃＬｙｓ）、Ｎε－ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル－Ｌ－リジン（ＢｏｃＬｙｓ）、Ｎε－アリルオキシカルボニル－Ｌ－リジン（ＡｌｏｃＬｙｓ）、Ｎε－ニコチノイル－Ｌ－リジン（ＮｉｃＬｙｓ）、Ｎε－Ｎ－Ｍｅ－アントラニロイル－Ｌ－リジン（ＮｍａＬｙｓ）、Ｎε－シクロペンチルオキシカルボニル－Ｌ－リジン（ＣｙｃＬｙｓ）、Ｎε－ｏ－アジドベンジルオキシカルボニル－Ｌ－リジン（ＡｚＺＬｙｓ）、Ｎε－ｏ－ヨード－ベンジルオキシカルボニル－リジン、Ｎε－ｏ－エチニル－ベンジルオキシカルボニル－リジン、Ｎε－プロパルギルオキシカルボニル－Ｌ－リジン、Ｎε－２－アジドエトキシカルボニル－Ｌ－リジン、Ｎε－Ｄ－プロリル－Ｌ－リジン、Ｎε－σ－ビオチニル－Ｌ－リジン、Ｎε－９－フルオレニルメトキシカルボニル－Ｌ－リジン、Ｎε－メチル－Ｌ－リジン、Ｎε－ジメチル－Ｌ－リジン、Ｎε－トリメチル－Ｌ－リジン、Ｎε－イソプロピル－Ｌ－リジン、Ｎε－ダンシル－Ｌ－リジン、Ｎε－ｏ，ｐ－ジニトロフェニル－Ｌ－リジン、Ｎε－ｐ－トルエンスルホニル－Ｌ－リジン、Ｎε－ＤＬ－２－アミノ－２カルボキシエチル－Ｌ－リジン、Ｎε－フェニルピルバミド－Ｌ－リジン、Ｎε－ピルバミド－Ｌ－リジン等）、チロシン類縁体（３－ハロゲン置換チロシン、３－ヒドロキシチロシン、３－アジドチロシン）、フェニルアラニン類縁体（パラベンゾイルフェニルアラニン、ｐ－ヨードフェニルアラニン、ｐ－アジドフェニルアラニン、ｐ－ブロモフェニルアラニン、アジドフェニルアラニン、アセチルフェニルアラニン、エチニルフェニルアラニン等）、アラニン類縁体（アジドホモアラニン等）、グリシン類縁体（アリルグリシン、プロパルギルグリシン、ホモプロパルギルグリシン、ホモアリルグリシン、ビニルグリシン等）、システイン類縁体（ベンジルオキシカルボニル－アミノエチル－セレノシステイン等）、ヒスチジン類縁体、ピロリジン類縁体が挙げられる。
【0023】
また、本発明にかかる非天然アミノ酸として、例えば、Ｒｏｂｉｎ Ｂｒａｂｈａｍ，Ｍａｒｔｉｎ Ａ Ｆａｓｃｉｏｎｅ、Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ、２０１７年、１８（２０），１９７３～１９８３ページ等において開示されている非天然アミノ酸も挙げられる。
【0024】
（ｔＲＮＡ）
本発明にかかるｔＲＮＡ（転移ＲＮＡ）としては、特定のコドンを認識し、かつ前述の非天然アミノ酸に結合し得るものであれば特に制限はされない。
本発明にかかるｔＲＮＡ（転移ＲＮＡ）としては、特定のコドンを認識し、かつ前述の非天然アミノ酸に結合し得るものであれば特に制限はされない。
【0025】
なお、本発明において、「コドン」とは、２０種のアミノ酸のいずれかに対応したヌクレオチド３個の配列、又はいずれのアミノ酸にも対応せず、ペプチド鎖合成の終了を示すヌクレオチド３個の配列（所謂、終止コドン）を意味する。「特定のコドン」とは、４種のヌクレオチド３個によって構成される４×４×４＝６４種のコドンのうちの１のコドンを意味する。
【0026】
本発明にかかるｔＲＮＡとしては、導入される細胞が保有する通常のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの基質として認識されにくいｔＲＮＡ（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｔＲＮＡ）であることが好ましく、また、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼが対合するｔＲＮＡを認識する過程において、該ｔＲＮＡに含まれるアンチコドンの配列が関与しないものが好ましく、例えば、ピロリジンｔＲＮＡ、より好ましくは古細菌由来のピロリジンｔＲＮＡ、さらに好ましくは、メタノサルシナ・マゼイ由来のピロリジンｔＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：５ＵＤ５＿Ｃ）が挙げられる（Ｔａｔｅｋｉ Ｓｕｚｕｋｉら、Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．、２０１７年、１３（１２），１２６１～１２６６ページ 参照）。
【0027】
しかしながら、かかる古細菌由来のピロリジンｔＲＮＡが認識するコドンは、ＵＡＧ（アンバー）コドンのみである。そのため、かかるｔＲＮＡを本発明において用いるためには、アンチコドンをコードする配列を他のコドンを認識できるよう、適宜変更する必要がある。かかる変更は、後述の実施例に示すように、ランダム化したアンチコドン配列を有するプライマーを用い、公知の部位特異的変異誘発法（ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）により、当業者であれば行なうことができる。
【0028】
また、本発明のスクリーニング方法において発現させるｔＲＮＡ（被検ｔＲＮＡ）としては、後述の実施例に示すような、異なる特定のコドンを各々認識する、複数種のｔＲＮＡの集合（ライブラリー）であってもよい。
【0029】
（アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ）
本発明にかかるアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼとしては、上述の非天然アミノ酸とｔＲＮＡとの結合を特異的に触媒し得るものであれば特に制限はされないが、好ましくは、本発明にかかるｔＲＮＡを認識する過程において該ｔＲＮＡに含まれるアンチコドンの配列が関与しないものであり、例えば、ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素（ＰｙｌＲＳ）、より好ましくは古細菌由来のＰｙｌＲＳ、さらに好ましくはメタン生成古細菌由来のＰｙｌＲＳ、より好ましくは、メタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ）由来のＰｙｌＲＳ、メタノサルシナ・バルケリ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｂａｒｋｅｒｉ）由来のＰｙｌＲＳ又はメタノサルシナ・アセチボランス（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ）由来のＰｙｌＲＳ、さらに好ましくはメタノサルシナ・マゼイ由来のＰｙｌＲＳが挙げられる。
本発明にかかるアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼとしては、上述の非天然アミノ酸とｔＲＮＡとの結合を特異的に触媒し得るものであれば特に制限はされないが、好ましくは、本発明にかかるｔＲＮＡを認識する過程において該ｔＲＮＡに含まれるアンチコドンの配列が関与しないものであり、例えば、ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素（ＰｙｌＲＳ）、より好ましくは古細菌由来のＰｙｌＲＳ、さらに好ましくはメタン生成古細菌由来のＰｙｌＲＳ、より好ましくは、メタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ）由来のＰｙｌＲＳ、メタノサルシナ・バルケリ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｂａｒｋｅｒｉ）由来のＰｙｌＲＳ又はメタノサルシナ・アセチボランス（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ）由来のＰｙｌＲＳ、さらに好ましくはメタノサルシナ・マゼイ由来のＰｙｌＲＳが挙げられる。
【0030】
なお、メタノサルシナ・マゼイ由来のＰｙｌＲＳの典型的な例として、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＡＭ３１１４１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられ、メタノサルシナ・バルケリ由来のＰｙｌＲＳの典型的な例として、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＡＬ４０８６７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられ、メタノサルシナ・アセチボランス由来のＰｙｌＲＳの典型的な例として、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＡＭ０３６０８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。
【0031】
また、タンパク質のアミノ酸配列は、自然界において（すなわち、非人工的に）変異し得る。また、人為的に変異を導入することもできる。そのため、前記典型的なアミノ酸配列からなるＰｙｌＲＳに限らず、このような相同体、改変体も、ｔＲＮＡとの結合を特異的に触媒し得る限り、本発明において用いることができる。
【0032】
かかる相同体、改変体としては、例えば、上記典型的なアミノ酸配列と６０％以上であり、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上（例えば、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。なお、配列の相同性は、ＢＬＡＳＴＰ（アミノ酸レベル）のプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３－４１０，１９９０）を利用して決定することができる。ＢＬＡＳＴＰによってアミノ酸配列を解析する方法の具体的な手法は公知であり、当業者であれば、例えば、当該プログラムのデフォルトパラメーターを用いて解析を行なうことができる。
【0033】
本発明にかかるアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼとしては、非天然アミノ酸とｔＲＮＡとの結合を特異的に触媒する活性を増強するという観点から、例えば、メタノサルシナ・マゼイ由来のＰｙｌＲＳの３８４位のチロシンが、フェニルアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン又はヒスチジン置換されたものが好ましく、より好ましくはフェニルアラニン又はヒスチジンであり、さらに好ましくはフェニルアラニンである。また、１３１位のグリシンがグルタミン酸に置換されていてもよい。さらに、前記３８４位における置換に加え、３０６位若しくは３０９位のアミノ酸置換との二重変異体、又は３０９位及び３４８位のアミノ酸置換との三重変異体であることが好ましく、３０６位及び３８４位のチロシンが、各々アラニン及びフェニルアラニンに置換された変異体ＰｙｌＲＳがより好ましい。なお、このような変異体の作製は、当業者であれば、公知の部位特異的突然変異導入方法によって行うことができる。
【0034】
（細胞）
本発明は、上述のとおり又は後述の実施例に示すとおり、細菌から多細胞真核生物まで保存されている、コドンとアミノ酸の対応を乱すことによって、細胞に毒性をもたらすものである。したがって、本発明の対象となる「細胞」としては特に制限はされず、原核細胞であってもよく、真核細胞であってもよい。原核細胞とは、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）等のリゾビウム属に属する細菌が挙げられる。また、真核細胞としては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）等の酵母、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等の動物細胞、植物細胞、昆虫細胞が挙げられる。
本発明は、上述のとおり又は後述の実施例に示すとおり、細菌から多細胞真核生物まで保存されている、コドンとアミノ酸の対応を乱すことによって、細胞に毒性をもたらすものである。したがって、本発明の対象となる「細胞」としては特に制限はされず、原核細胞であってもよく、真核細胞であってもよい。原核細胞とは、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）等のリゾビウム属に属する細菌が挙げられる。また、真核細胞としては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）等の酵母、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等の動物細胞、植物細胞、昆虫細胞が挙げられる。
【0035】
（細胞における発現）
本発明の方法においては、前記細胞にて、上述の本発明にかかるｔＲＮＡ及びアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを発現させる。これら分子の発現は、目的に応じて、一過性の発現であってもよく、恒常的な発現であってもよい。かかる発現は、後述の本発明にかかるＤＮＡ構築物を後述の細胞に導入することにより行うことができる。細胞にＤＮＡ構築物を導入する公知の手法としては、大腸菌に対しては、熱ショック法（例えば、塩化カルシウム法、塩化ルビジウム法）、電気穿孔法等が挙げられる。酵母に対しては、酢酸リチウム法、電気穿孔法、スフェロプラスト法等が挙げられる。動物細胞に対しては、リポフェクション法、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ－デキストラン法、ウィルス（アデノウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス等）を利用した方法等が挙げられる。昆虫細胞に対しては、動物細胞に用いられる方法に加え、バキュロウィルスを利用した方法等が挙げられる。また、植物細胞に対しては、アグロバクテリウム法、電気穿孔法、パーティクルガン法等が挙げられる。
本発明の方法においては、前記細胞にて、上述の本発明にかかるｔＲＮＡ及びアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを発現させる。これら分子の発現は、目的に応じて、一過性の発現であってもよく、恒常的な発現であってもよい。かかる発現は、後述の本発明にかかるＤＮＡ構築物を後述の細胞に導入することにより行うことができる。細胞にＤＮＡ構築物を導入する公知の手法としては、大腸菌に対しては、熱ショック法（例えば、塩化カルシウム法、塩化ルビジウム法）、電気穿孔法等が挙げられる。酵母に対しては、酢酸リチウム法、電気穿孔法、スフェロプラスト法等が挙げられる。動物細胞に対しては、リポフェクション法、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ－デキストラン法、ウィルス（アデノウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス等）を利用した方法等が挙げられる。昆虫細胞に対しては、動物細胞に用いられる方法に加え、バキュロウィルスを利用した方法等が挙げられる。また、植物細胞に対しては、アグロバクテリウム法、電気穿孔法、パーティクルガン法等が挙げられる。
【0036】
（培養）
本発明の方法においては、本発明にかかるｔＲＮＡ及びアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを発現させた細胞を、前記非天然アミノ酸存在下にて培養する。「非天然アミノ酸存在下」の状態とは、例えば、非天然アミノ酸の培地への添加等によって、非天然アミノ酸が本発明にかかる細胞内に導入された状態が挙げられる。
本発明の方法においては、本発明にかかるｔＲＮＡ及びアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを発現させた細胞を、前記非天然アミノ酸存在下にて培養する。「非天然アミノ酸存在下」の状態とは、例えば、非天然アミノ酸の培地への添加等によって、非天然アミノ酸が本発明にかかる細胞内に導入された状態が挙げられる。
【0037】
かかる「培地」としては、特に制限はなく、当業者であれば、各種細胞に合わせた公知の培地を選択することができる。例えば、大腸菌に対してはＬＢ培地、酵母に対してはＹＰＤ培地、動物細胞に対してはＤＭＥＭ培地、ＭＥＭ培地、Ｆ１２培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、昆虫細胞に対してはグレース培地、植物細胞に対してはムラシゲ・スクーグ培地が挙げられる。また、その形態についても特に制限はなく、固形培地であってもよく、液体培地であってもよい。
【0038】
非天然アミノ酸の培地への添加濃度も、各種細胞及び用いる非天然アミノ酸の種類等に合わせて適宜調整し得るが、通常、０．００１～１００ｍＭ、好ましくは０．００１～１０ｍＭ、より好ましくは０．００１～５ｍＭ、さらに好ましくは０．００１～２ｍＭである。
【0039】
非天然アミノ酸存在下での培養期間としては、当該非天然アミノ酸導入によって細胞の生育等を抑制又は細胞が死滅する期間であれば、特に制限はないが、通常１２時間～1週間である。
【0040】
（生細胞数の検出）
前記培養後に検出される「生細胞数」としては、生細胞の絶対数であってもよく、またそれを反映する測定値（例えば、下記コロニー数、吸光度等）であってもよい。生細胞数の検出方法としては、各種細胞に併せて公知の手法が適宜採用される。例えば、後述の実施例において示すように、固形培地にて形成されたコロニー数を測定すること（コロニー形成法）が挙げられる。液体培養の場合には、その培地の濁度（吸光度）を測定することも挙げられる。さらに、［３Ｈ］チミジン取り込み法、ＭＴＴ法、ＷＳＴ法等が挙げられるが、これらに制限されるものではない。
前記培養後に検出される「生細胞数」としては、生細胞の絶対数であってもよく、またそれを反映する測定値（例えば、下記コロニー数、吸光度等）であってもよい。生細胞数の検出方法としては、各種細胞に併せて公知の手法が適宜採用される。例えば、後述の実施例において示すように、固形培地にて形成されたコロニー数を測定すること（コロニー形成法）が挙げられる。液体培養の場合には、その培地の濁度（吸光度）を測定することも挙げられる。さらに、［３Ｈ］チミジン取り込み法、ＭＴＴ法、ＷＳＴ法等が挙げられるが、これらに制限されるものではない。
【0041】
そして、本発明のスクリーニング方法においては、このようにして検出される生細胞数が、非天然アミノ酸の非存在下にて培養した際の生細胞数と比較して少ない場合、被検ｔＲＮＡは、前記細胞において機能するカウンターセレクションマーカーであると判定される。
【0042】
以上、本発明のスクリーニング方法の好適な態様について説明したが、本発明のスクリーニング方法は上記に限定されるものではなく、例えば、以下のような態様もとり得る。
【0043】
特定の非天然アミノ酸の存在下において標的となる細胞に毒性を示すｔＲＮＡをスクリーニングする方法であって、
前記ｔＲＮＡが、特定のコドンを認識し、かつ非天然アミノ酸に結合し得るｔＲＮＡであり、下記（１）～（３）の工程を含む方法。
（１）被検細胞に、前記ｔＲＮＡと、前記非天然アミノ酸と前記被検ｔＲＮＡの結合を特異的に触媒するアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼとを、発現させる工程、
（２）前記被検細胞を、前記非天然アミノ酸存在下にて培養し、生細胞数を検出する工程、
（３）前記工程にて検出された生細胞数が、前記非天然アミノ酸非存在下にて培養した際の生細胞数と比較して少ない場合、前記被検細胞は、前記ｔＲＮＡに対して感受性を示すと判定する工程。
前記ｔＲＮＡが、特定のコドンを認識し、かつ非天然アミノ酸に結合し得るｔＲＮＡであり、下記（１）～（３）の工程を含む方法。
（１）被検細胞に、前記ｔＲＮＡと、前記非天然アミノ酸と前記被検ｔＲＮＡの結合を特異的に触媒するアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼとを、発現させる工程、
（２）前記被検細胞を、前記非天然アミノ酸存在下にて培養し、生細胞数を検出する工程、
（３）前記工程にて検出された生細胞数が、前記非天然アミノ酸非存在下にて培養した際の生細胞数と比較して少ない場合、前記被検細胞は、前記ｔＲＮＡに対して感受性を示すと判定する工程。
【0044】
＜カウンターセレクション法＞
上述のとおり、本発明においては、細胞においてカウンターセレクションマーカーとして機能するｔＲＮＡを提供することが可能となる。したがって、本発明は、かかるｔＲＮＡを利用した、下記カウンターセレクション法も提供される。
上述のとおり、本発明においては、細胞においてカウンターセレクションマーカーとして機能するｔＲＮＡを提供することが可能となる。したがって、本発明は、かかるｔＲＮＡを利用した、下記カウンターセレクション法も提供される。
【0045】
細胞をカウンターセレクションする方法であって、下記（１）～（２）の工程を含む方法
（１）前記細胞に、
細胞においてカウンターセレクションマーカーとして機能するｔＲＮＡをコードするＤＮＡを含み、前記ｔＲＮＡが、特定のコドンを認識し、かつ非天然アミノ酸に結合し得る、ピロリジンｔＲＮＡである、ＤＮＡ構築物を導入して、
前記ピロリジンｔＲＮＡを発現させ、かつ
前記非天然アミノ酸と前記ピロリジンｔＲＮＡの結合を特異的に触媒するアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを発現させる工程、
（２）前記細胞を、前記非天然アミノ酸存在下にて培養し、生細胞を回収する工程。
（１）前記細胞に、
細胞においてカウンターセレクションマーカーとして機能するｔＲＮＡをコードするＤＮＡを含み、前記ｔＲＮＡが、特定のコドンを認識し、かつ非天然アミノ酸に結合し得る、ピロリジンｔＲＮＡである、ＤＮＡ構築物を導入して、
前記ピロリジンｔＲＮＡを発現させ、かつ
前記非天然アミノ酸と前記ピロリジンｔＲＮＡの結合を特異的に触媒するアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを発現させる工程、
（２）前記細胞を、前記非天然アミノ酸存在下にて培養し、生細胞を回収する工程。
【0046】
細胞と、ピロリジンｔＲＮＡ及びアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ、並びにそれらの発現方法とについては上述のとおりであるが、後述の実施例に示すとおり、カウンターセレクションマーカーとしての機能を増強するために、異なる特定のコドンを各々認識する、複数種のピロリジンｔＲＮＡを用いていてもよい。複数種としては、特に制限はなく、例えば、２種以上（例えば、３種、４種）、５種以上（例えば、６種、７種、８種、９種）、１０種以上（例えば、１５種以上、２０種以上）が挙げられる。また、非天然アミノ酸存在下での培養についても上述のとおりである。
【0047】
当該培養後の生細胞の回収方法としては特に制限はなく、公知の手法が適宜採用される。かかる方法としては、コロニー形成方法、フローサイトメトリーによる回収等が挙げられる。
【0048】
そして、このようにして回収される生細胞は、一度細胞内に導入された本発明にかかるＤＮＡ構築物又はその一部（本発明にかかるｔＲＮＡをコードするＤＮＡを含む断片）が除去（脱落）されたものである。したがって、本発明のカウンターセレクション法は、所謂、プラスミドキュアリング（ｐｌａｓｍｉｄ ｃｕｒｉｎｇ）としても用いることができる。
【0049】
また、例えば、図２Ａに示すような、相同組み換えにより、標的ＤＮＡの配列を改変する方法において、標的ＤＮＡの両側にある相同配列の外側の少なくとも一方に、本発明にかかるカウンターセレクションマーカー（ＣＳ）を配置することによって、当該相同配列において組み換えが適切に生じた細胞を選抜することができる。
【0050】
すなわち、ポジティブセレクションマーカー（ＰＳ）によって、改変された標的ＤＮＡの配列が挿入されたことは確認できるものの、図２Ｂに示すようなランダムに挿入された細胞も生じ得る。しかしながら、非天然アミノ酸下で培養することにより、これらＰＳ等と共にＣＳがゲノムに挿入された細胞は、ＣＳによる毒性によって細胞死等が誘導されるため、排除される。そして、図２Ａに示すような、前記相同配列において組み換えが適切に生じ、標的ＤＮＡの配列が改変された細胞が、選抜されることになる。
【0051】
また、本発明のカウンターセレクション法は、図３Ａ及び３Ｂに示す２段階選抜においても有用である。かかる方法においては、先ず図３Ａに示すように、本発明にかかるＣＳをＰＳと共に相同組み換えにより挿入することにより、ＰＳを利用したポジティブセレクションによって、該挿入が生じた細胞を選抜する。次に、図３Ｂに示すように、前後に相同配列を配置した、改変された標的ＤＮＡ配列と、相同組み換えを生じさせる。そして、かかる細胞を、非天然アミノ酸下で培養することにより、ＣＳが残存している細胞を除去し、ＣＳ及びＰＳが、改変された標的ＤＮＡ配列に置換された細胞が選抜されることになる。
【0052】
＜ＤＮＡ構築物＞
本発明にかかるＤＮＡ構築物としては、本発明にかかる細胞において導入されることにより、挿入されたＤＮＡを発現（転写及び／又は翻訳）するのに必要な制御配列を含むものであればよく、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、エピソーマルベクター、ウィルスベクターが挙げられる。
本発明にかかるＤＮＡ構築物としては、本発明にかかる細胞において導入されることにより、挿入されたＤＮＡを発現（転写及び／又は翻訳）するのに必要な制御配列を含むものであればよく、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、エピソーマルベクター、ウィルスベクターが挙げられる。
【0053】
かかる制御配列としては、プロモーター（例えば、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ｔａｃプロモーター等）、エンハンサー、サイレンサー、ターミネーター（ｒｒｎＣターミネーター等）、ポリＡテール、リボソーム結合配列（シャイン・ダルガノ（ＳＤ）配列）が挙げられる。
【0054】
さらに、本発明にかかるベクターにおいては、薬剤耐性遺伝子、栄養要求性遺伝子、レポーター遺伝子等を、例えば、上述のポジティブセレクションマーカー（ＰＳ）遺伝子として含んでいてもよい。薬剤耐性遺伝子としては、例えば、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、除草剤耐性遺伝子、スルホニル尿素系耐性遺伝子が挙げられる。栄養要求性遺伝子としては、例えば、トリプトファン合成酵素遺伝子が挙げられる。レポーター遺伝子としては、例えば、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）遺伝子、ＹＦＰ（黄色蛍光タンパク質）遺伝子、ＲＦＰ（赤色蛍光タンパク質）遺伝子、エクオリン遺伝子等の蛍光タンパク質遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子等の発色酵素遺伝子、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子、βガラクトシダーゼ遺伝子、アルカリフォスファターゼ遺伝子、ＳＥＡＰ遺伝子等の発色酵素遺伝子が挙げられる。
【0055】
本発明にかかるＤＮＡ構築物においてコードされるｔＲＮＡ及び／又はアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼとしては、これら分子の発現効率をより向上させるという観点から、発現させる細胞の種類に合わせてコドンを最適化したＤＮＡが、本発明にかかるＤＮＡ構築物には、挿入されていてもよい。
【0056】
また、ＩＲＥＳ等を用いることにより、本発明にかかるｔＲＮＡ及びアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼは、１のＤＮＡ構築物においてポリシストロニックに発現させてもよい。同様に、本発明にかかるｔＲＮＡを複数種用いる場合には、これらｔＲＮＡを１のＤＮＡ構築物においてポリシストロニックに発現させてもよい。
【0057】
さらに、本発明にかかるＤＮＡ構築物には、任意のＤＮＡの挿入を可能にするクローニング部位」を含むものであってもよい。かかる部位としては、例えば、１又は複数の制限酵素認識部位を含むマルチクローニング部位、ＴＡクローニング部位、ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）クローニング部位が挙げられる。
【0058】
また、本発明において、「任意のＤＮＡ」としては、特に制限はされないが、細胞において発現を所望する任意のタンパク質、ＲＮＡをコードするＤＮＡ、上述の改変した標的遺伝子の配列、相同配列等が挙げられる。
【0059】
＜キット＞
本発明においては、上述のとおり、下記物品が用いられる。したがって、本発明は、下記（Ａ）～（Ｅ）から選択される少なくとも１の物品を含むキットも提供される。
（Ａ）前記ｔＲＮＡをコードするＤＮＡ構築物
（Ｂ）前記アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼをコードするＤＮＡ構築物
（Ｃ）前記被検ｔＲＮＡ及び前記アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼをコードするＤＮＡ構築物
（Ｄ）前記非天然アミノ酸
（Ｅ）前記細胞。
本発明においては、上述のとおり、下記物品が用いられる。したがって、本発明は、下記（Ａ）～（Ｅ）から選択される少なくとも１の物品を含むキットも提供される。
（Ａ）前記ｔＲＮＡをコードするＤＮＡ構築物
（Ｂ）前記アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼをコードするＤＮＡ構築物
（Ｃ）前記被検ｔＲＮＡ及び前記アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼをコードするＤＮＡ構築物
（Ｄ）前記非天然アミノ酸
（Ｅ）前記細胞。
【0060】
例えば、本発明のスクリーニング方法においては、前記（Ａ）～（Ｄ）から選択される少なくとも１の物品を含み、前記（Ａ）及び（Ｂ）、又は（Ｃ）と、（Ｄ）とを含むことが好ましい。
【0061】
また、本発明のカウンターセレクション法においては、前記（Ａ）～（Ｅ）から選択される少なくとも１の物品を含み、前記（Ａ）及び（Ｂ）、又は（Ｃ）と、（Ｄ）及び（Ｅ）とを含むことが好ましい。
【0062】
さらに、本発明のカウンターセレクション法において、対象とする細胞が大腸菌であり、非天然アミノ酸としてＮε－ベンジルオキシカルボニル－Ｌ－リジンを用いる場合に、本発明にかかるｔＲＮＡは、後述の実施例に示すとおり、ＡＵＧ、ＵＵＵ、ＵＣＵ、ＵＣＣ、ＵＣＡ、ＵＣＧ、ＵＡＣ、ＵＧＣ、ＵＧＧ、ＣＵＵ、ＣＵＣ、ＣＵＡ、ＣＣＵ、ＣＣＣ、ＣＣＡ、ＣＣＧ、ＣＡＵ、ＣＡＣ、ＣＡＡ、ＣＡＧ、ＣＧＵ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＡＵＣ、ＡＣＵ、ＡＣＣ、ＡＣＡ、ＡＣＧ、ＡＡＣ、ＡＡＧ、ＧＵＵ、ＧＵＣ、ＧＵＡ、ＧＵＧ、ＧＣＵ、ＧＣＣ、ＧＣＡ、ＧＣＧ、ＧＡＵ、ＧＡＣ、ＧＡＧ、ＧＧＵ、ＧＧＣ及びＧＧＡから選択される、少なくとも１のコドンを認識するピロリジンｔＲＮＡが好ましく、ＡＵＧを認識するピロリジンｔＲＮＡがより好ましい。
【0063】
本発明のキットには、さらに使用説明書を含むものであってもよい。使用説明書は、前記ＤＮＡ構築物及び非天然アミノ酸等を本発明の方法に利用するための説明書である。説明書は、例えば、本発明の方法の実験手法や実験条件、及び本発明にかかる物品に関する情報（例えば、ＤＮＡ構築物の塩基配列やクローニングサイト等が示されているマップ等の情報、細胞の由来、性質、培養条件等の情報）を含むことができる。
【実施例】
【0064】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【0065】
（実施例１） カウンターセレクションマーカーのスクリーニング
カウンターセレクションマーカーとして大腸菌において機能するｔＲＮＡ（ピロリジンｔＲＮＡ）のスクリーニングを、以下のとおり行なった。
カウンターセレクションマーカーとして大腸菌において機能するｔＲＮＡ（ピロリジンｔＲＮＡ）のスクリーニングを、以下のとおり行なった。
【0066】
（ランダムアンチコドンライブラリーの構築）
ピロリジンｔＲＮＡ及びＺ－リジルｔＲＮＡ合成酵素をコードするＤＮＡが挿入されている、プラスミドＤＮＡ ｐＴＫ２－１ ＺＬｙｓＲＳ１を鋳型として、配列をランダム化したアンチコドン配列及び末端に共通配列をもつプライマーを用い、インバースＰＣＲを行い、前記プラスミドＤＮＡ全体を増幅した。
ピロリジンｔＲＮＡ及びＺ－リジルｔＲＮＡ合成酵素をコードするＤＮＡが挿入されている、プラスミドＤＮＡ ｐＴＫ２－１ ＺＬｙｓＲＳ１を鋳型として、配列をランダム化したアンチコドン配列及び末端に共通配列をもつプライマーを用い、インバースＰＣＲを行い、前記プラスミドＤＮＡ全体を増幅した。
【0067】
得られたＰＣＲ産物を、ＩｎＦｕｓｉｏｎ法（タカラバイオ株式会社）を用いて、前記プライマーに含まれる共通配列の組換えによる再環状化を行い、ピロリジンｔＲＮＡのアンチコドン配列をランダムに変化させたプラスミドＤＮＡライブラリーを作成した。
【0068】
なお、前記ｐＴＫ２－１ ＺＬｙｓＲＳ１を基にするプラスミドＤＮＡライブラリーにおいて、アンチコドン配列がランダムに変化しているピロリジンｔＲＮＡは、大腸菌ｌｐｐプロモーター及びｒｒｎＣターミネーターの制御下で発現される。Ｚ－リジルｔＲＮＡ合成酵素は、大腸菌ＴｙｒＲＳプロモーター及びターミネーターの制御下で発現される。Ｚ－リジルｔＲＮＡ合成酵素は、古細菌（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ）由来のピロリジルｔＲＮＡ合成酵素のＹ３０６Ａ／Ｙ３８４Ｆ変異体であり、当該変異酵素によって、非天然アミノ酸 Ｚ－リジン（Ｈ－Ｌｙｓ（Ｚ）－ＯＨ）をピロリジンｔＲＮＡに結合させることが可能となる。また、前記ｐＴＫ２－１ ＺＬｙｓＲＳ１には、ポジティブマーカー遺伝子として、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子が含まれているため、このプラスミドが導入された宿主細胞は、クロラムフェニコール耐性を獲得する（Ｙａｎａｇｉｓａｗａ ｅｔ ａｌ，Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ １５，１１８７－１１９７，２００８ 参照）。
【0069】
（スクリーニング）
前記プラスミドＤＮＡライブラリーを、エレクトロポレーション法により、大腸菌 ＢＬ２１－ＡＩ株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に導入し、６４種のアンチコドンのうち、無作為のひとつを保持するピロリジンｔＲＮＡを発現させる大腸菌株を、多種調製し、各々シングルコロニーとした。そして、各大腸菌株を培地で１０００倍に希釈し、その２５０μｌを、１ｍＭ Ｚ－リジン（Ｂａｃｈｅｍ社製）を含む又は含まない固形培地に播種した。
前記プラスミドＤＮＡライブラリーを、エレクトロポレーション法により、大腸菌 ＢＬ２１－ＡＩ株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に導入し、６４種のアンチコドンのうち、無作為のひとつを保持するピロリジンｔＲＮＡを発現させる大腸菌株を、多種調製し、各々シングルコロニーとした。そして、各大腸菌株を培地で１０００倍に希釈し、その２５０μｌを、１ｍＭ Ｚ－リジン（Ｂａｃｈｅｍ社製）を含む又は含まない固形培地に播種した。
【0070】
なお、大腸菌株の培養は、ＬＢ培地（１％ Ｂａｃｔｏ－ｔｒｙｐｔｏｎ，０．５％ Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ，１％ ＮａＣｌ）又はその固形培地（２％ 寒天含有）を用い、３７℃にて行なった。また適宜、選択マーカーとしてクロラムフェニコール（終濃度：５０μｇ／ｍｌ）を加えた。
【0071】
固形培地にて一夜培養した後、発生したコロニー数を、Ｚ－リジンを含む培地と含まない培地とで比較し、発生したコロニー数がＺ－リジン添加によって、殆ど変化しない、減少が認められる（＞１／１０００）、顕著な減少が認められる（＜１／１０００）、完全に消失する、の４段階で評価した。さらに、それぞれの大腸菌株から、プラスミドＤＮＡを分離して、サンガー法でアンチコドンの配列を決定し、示した毒性との対応を明らかにした。
【0072】
その結果、ＡＵＧ（Ｍｅｔをコード）に相補的なアンチコドンを保持するピロリジンｔＲＮＡを発現させた大腸菌株のコロニーは、Ｚ－リジン存在下、完全に消失した。
【0073】
また、ＵＵＵ（Ｐｈｅをコード）、ＵＣＵ、ＵＣＣ、ＵＣＡ及びＵＣＧ（Ｓｅｒをコード）、ＵＡＣ（Ｔｙｒをコード）、ＵＧＣ（Ｃｙｓをコード）、ＵＧＧ（Ｔｒｐをコード）、ＣＵＵ、ＣＵＣ及びＣＵＡ（Ｌｅｕをコード）、ＣＣＵ、ＣＣＣ、ＣＣＡ及びＣＣＧ（Ｐｒｏをコード）、ＣＡＵ及びＣＡＣ（Ｈｉｓをコード）、ＣＡＡ及びＣＡＧ（Ｇｌｎをコード）、ＣＧＵ、ＣＧＣ及びＣＧＧ（Ａｒｇをコード）、ＡＵＣ（Ｉｌｅをコード）、ＡＣＵ、ＡＣＣ、ＡＣＡ及びＡＣＧ（Ｔｈｒをコード）、ＡＡＣ（Ａｓｎをコード）、ＡＡＧ（Ｌｙｓをコード）、ＧＵＵ、ＧＵＣ、ＧＵＡ及びＧＵＧ（Ｖａｌをコード）、ＧＣＵ、ＧＣＣ、ＧＣＡ及びＧＣＧ（Ａｌａをコード）、ＧＡＵ及びＧＡＣ（Ａｓｐをコード）、ＧＡＧ（Ｇｌｕをコード）、並びにＧＧＵ、ＧＧＣ及びＧＧＡ（Ｇｌｙをコード）の各々に相補的なアンチコドンを保持するピロリジンｔＲＮＡを発現させた大腸菌株において、コロニー数の顕著な減少が認められた（例として、ＣＡＧコドン及びＡＣＣコドンを各々認識するピロリジンｔＲＮＡを発現させた大腸菌株のコロニーを、図４Ａ及び図４Ｂに示す）。
【0074】
したがって、上記コドンを認識し、かつＺ－リジンに結合し得る、ピロリジンｔＲＮＡは、当該Ｚ－リジンの存在下、カウンターセレクションマーカーとして機能することが明らかになった。
【0075】
また、このような方法により、細胞の種類に応じ、カウンターセレクションマーカーとして有用なｔＲＮＡを選抜できることも明らかになった。
【0076】
（実施例２） プラスミドキュアリングの実証
実施例１において顕著なコロニー数の減少（＜１０－６）が認められたアンチコドンＧＣＣ（対応するコドン：ＧＧＣ）を保持する大腸菌株を、選択マーカーであるクロラムフェニコール及びＺ－リジンを含まない培地で、一夜培養（約１１世代）した。
実施例１において顕著なコロニー数の減少（＜１０－６）が認められたアンチコドンＧＣＣ（対応するコドン：ＧＧＣ）を保持する大腸菌株を、選択マーカーであるクロラムフェニコール及びＺ－リジンを含まない培地で、一夜培養（約１１世代）した。
【0077】
次いで、新鮮な培地で１０，０００倍に希釈し、その２５０μｌを、１ｍＭ Ｚ－リジンを含む又は含まない固形培地（クロラムフェニコールは含まない）に播種した。そして、Ｚ－リジンを含む培地に生じたコロニー（総菌数の約２％）を、前記プラスミドを喪失した菌と評価した（図５ 参照）。
【0078】
さらに、これらから任意に分離した６４のＺ－リジン抵抗性コロニーは、全てクロラムフェニコール感受性を示したため、大腸菌に当該薬剤の抵抗性を付与する前記プラスミドが喪失していることが確認された。
【0079】
したがって、実施例１にて選抜されたｔＲＮＡをカウンターセレクションマーカーとしてコードするプラスミドが導入された大腸菌を、Ｚ－リジン非存在下にて培養し、さらにＺ－リジン存在下にて培養することによって、前記プラスミドを除去（プラスミドキュアリング）できることが明らかになった。
【0080】
（実施例３） 複数種のｔＲＮＡを用いたプラスミドキュアリングの実証
本発明において、非天然アミノ酸をタンパク質に導入するために必要な酵素とｔＲＮＡのうち、ｔＲＮＡを複数種用いることによって、カウンターセレクションマーカーとしての機能を増強できるかにつき、検証した。
本発明において、非天然アミノ酸をタンパク質に導入するために必要な酵素とｔＲＮＡのうち、ｔＲＮＡを複数種用いることによって、カウンターセレクションマーカーとしての機能を増強できるかにつき、検証した。
【0081】
具体的には、先ず、実施例１において顕著なコロニー数の減少（＜１０－６）が認められたアンチコドンＧＧＵ（対応するコドン：ＡＣＣ）及びＣＧＣ（対応するコドン：ＧＣＧ）をそれぞれｌｐｐプロモーターによって恒常的に発現する、プラスミドＤＮＡ ｐＴＫ２－１ ＺＬｙｓＲＳ１－ＧＧＵ＋ＣＧＣ（ｐＴＫ２－１－ＧＧＵ＋ＣＧＣ）の変異体を、調製した。そして、実施例１に記載の方法と同様にして、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、Ｚ－リジン感受性を調べた。
【0082】
その結果、図６に示した結果から明らかなように、エスケーパー（Ｚ－リジン存在下でも生き残る確率）の発生率は極めて低く（＜１ｐｐｍ）、良好な成績が確認された。
【0083】
（実施例４） 同じ選択マーカーしか持たない類似のプラスミドの交換に応用した例
実施例３において調製した大腸菌株に、実施例１と同じ手順で、プラスミド ｐＡＣＹＣ１８４をエレクトロポレーション法により導入した。この操作により得られたのは、多数のｐＴＫ２－１－ＧＧＵ＋ＣＧＣのみを保持する元株に混じる、少数のｐＴＫ２－１－ＧＧＵ＋ＣＧＣ及びｐＡＣＹＣ１８４の両方をもつ大腸菌が得られた。なお、ｐＴＫ２－１－ＧＧＵ＋ＣＧＣとｐＡＣＹＣ１８４とは、共にクロラムフェニコール耐性遺伝子及びｐ１５Ａプラスミド複製起点をもつ同種のプラスミドである。
実施例３において調製した大腸菌株に、実施例１と同じ手順で、プラスミド ｐＡＣＹＣ１８４をエレクトロポレーション法により導入した。この操作により得られたのは、多数のｐＴＫ２－１－ＧＧＵ＋ＣＧＣのみを保持する元株に混じる、少数のｐＴＫ２－１－ＧＧＵ＋ＣＧＣ及びｐＡＣＹＣ１８４の両方をもつ大腸菌が得られた。なお、ｐＴＫ２－１－ＧＧＵ＋ＣＧＣとｐＡＣＹＣ１８４とは、共にクロラムフェニコール耐性遺伝子及びｐ１５Ａプラスミド複製起点をもつ同種のプラスミドである。
【0084】
次に、得られた大腸菌を、ＳＯＣ培地中、３７℃において２時間ヒーリングを行った。及びさらにクロラムフェニコール（終濃度：５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地で１０００倍希釈の後、３７℃において一夜前培養した。その後、３ｍＭのＺ－リジン及びクロラムフェニコール（終濃度：５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地で１００倍（１０μＬ／１ｍＬ）に希釈し、更に３７℃で８時間培養した。培養後、１０－６倍に希釈して、その希釈培養液２５０μＬを、３ｍＭのＺ－リジン及びクロラムフェニコール（終濃度：５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天培地に播種した。
【0085】
そして、生じたコロニーを、新しいＺ－リジン及びクロラムフェニコールを含む寒天培地に、番号を付けて識別できるようにして、スロットレプリカを作製した。それぞれのスロットについて、ｐＴＫ２－１－ＧＧＵ＋ＣＧＣ及びｐＡＣＹＣ１８４を識別できるＰＣＲ反応を行い、いずれのプラスミドを保持しているかを、アガロースゲルに電気泳動にて展開し、分析した。
【0086】
その結果、図７に示すとおり、分離した２４クローンの大腸菌の全てが、プラスミド交換に成功したクローンとして同定された。
【0087】
したがって、本方法により、同じ選択マーカー及び同じ複製起点をもつ同種のプラスミドの交換ができることが明らかになった。
【0088】
このような同種のプラスミドの交換は、実施例２に示した、プラスミドを完全に除去するプラスミドキュアリングとは異なる。また、ゲノム上の必須遺伝子を破壊し、プラスミド上に同じ遺伝子で救済する手法を用いて、プラスミドを強制的に維持する場合、実施例２のようにいったん全てのプラスミドを除去することは許されず、常にプラスミドが存在しなければならない。そのため、このような本発明による同種のプラスミド交換は有用である。
【産業上の利用可能性】
【0089】
以上説明したように、本発明によれば、細胞種に応じたカウンターセレクションマーカーを提供できる、汎用性の高い方法を提供することが可能となる。
【0090】
したがって、本発明は、一度細胞内に導入されたＤＮＡ構築物又はその断片の脱落、例えば、プラスミドキュアリング、ゲノム編集等における２段階選抜を行なう上で有用であり、ひいては遺伝子工学を通して、新たな食物、医薬品、化学物質等の開発においても多大な貢献をもたらすものである。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図5】
【図6】
【図7】
