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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-07-16
(45)【発行日】2024-07-24
(54)【発明の名称】ＲＮＡの製造方法
(51)【国際特許分類】
C07H 1/00 20060101AFI20240717BHJP
C07H 21/02 20060101ALI20240717BHJP
C40B 40/12 20060101ALI20240717BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20240717BHJP
【ＦＩ】
C07H1/00 ZNA
C07H21/02
C40B40/12
C12N15/11 Z
【請求項の数】
8
(21)【出願番号】P 2021511250
(86)(22)【出願日】2020-02-28
(86)【国際出願番号】 JP2020008313
(87)【国際公開番号】W WO2020202949
(87)【国際公開日】2020-10-08
【審査請求日】2022-11-14
(31)【優先権主張番号】P 2019067993
(32)【優先日】2019-03-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】000002093
【氏名又は名称】住友化学株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100106518
【弁理士】
【氏名又は名称】松谷 道子
(74)【代理人】
【識別番号】100150500
【弁理士】
【氏名又は名称】森本 靖
(72)【発明者】
【氏名】宮川 卓也
(72)【発明者】
【氏名】和泉 延明
【審査官】早川 裕之
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１７／１１９５０３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】米国特許第０７２０５３９９（ＵＳ，Ｂ１）
【文献】今田清久 ほか，多孔質ガラスの表面状態とその化学修飾，日本化学会誌，1990年，4，407-414
【文献】TONG,G. et al.，The synthesis of oligonucleotide-polyamide conjugate molecules suitable as PCR primers，Journal of Organic Chemistry，1993年，58，2223-2231
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｈ
Ｃ４０Ｂ ４０／
Ｃ１２Ｎ １５／
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
第１級アミノ基を含む無機多孔質担体を用いて、ホスホロアミダイト固相合成法により、１００ｍｅｒ以上のＲＮＡを製造する方法であって、前記無機多孔質担体が、無機多孔質体に、下記式（ｓ１）で表されるシランカップリング剤を反応させることにより調製されたものであり、前記無機多孔質担体に含まれる第１級アミノ基の量が、下記式（１）を満たす、ＲＮＡの製造方法。【化1】
【数1】
Ｒ：無機多孔質担体に含まれる全アミノ基中の第１級アミノ基の割合（第１級アミノ基量／全アミノ基量）、
Ｓ：窒素吸着法により測定される無機多孔質担体の比表面積（ｍ２／ｇ）
【請求項2】
前記無機多孔質担体に含まれる第１級アミノ基の量が、下記式（１’）を満たす、請求項１に記載のＲＮＡの製造方法。【数2】
Ｒ：無機多孔質担体に含まれる全アミノ基中の第１級アミノ基の割合（第１級アミノ基量／全アミノ基量）、
Ｓ：窒素吸着法により測定される無機多孔質担体の比表面積（ｍ２／ｇ）
【請求項3】
前記無機多孔質担体の無機多孔質体が、多孔質ガラスである、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項4】
前記無機多孔質担体の細孔径（モード径）が、９０～１２０ｎｍである、請求項１～３のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項5】
前記無機多孔質担体の細孔径（モード径）が、１２０～２００ｎｍである、請求項１～３のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項6】
前記製造方法が、下記の工程１～４を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の製造方法：工程１）前記第１級アミノ基を含む無機多孔質担体と、ヒドロキシル基が保護されたヌクレオシドを含むリンカーとを反応させて、前記無機多孔質担体に前記保護されたヌクレオシドを導入する工程；
工程２）前記ヌクレオシドを導入した無機多孔質担体を核酸固相合成機のカラムに充填する工程；
工程３）前記核酸固相合成機を使用して、脱保護、アミダイト化合物を用いたカップリング、及び酸化を含むサイクルを、複数回繰り返す工程；および
工程４）前記工程３の後、無機多孔質担体から、ヒドロキシル基が保護されたＲＮＡを切り出し、脱保護する工程。
【請求項7】
前記リンカーが、スクシニルリンカーである、請求項６に記載の製造方法。
【請求項8】
前記工程３）におけるサイクルを１００回以上繰り返す、請求項６又は７に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本特許出願は、日本国特許出願２０１９－０６７９９３号（２０１９年３月２９日出願）に基づくパリ条約上の優先権および利益を主張するものであり、ここに引用することによって、上記出願に記載された内容の全体が、本明細書中に組み込まれるものとする。
本発明は、ＲＮＡの製造方法に関する。
本発明は、ＲＮＡの製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
核酸の化学合成法としては、ホスホロアミダイト法による固相合成法が広く用いられている。この方法では、まず、シランカップリング剤等を用いて固相担体上にアミノ基等の官能基を導入し、前記官能基に核酸の３’末端となるヌクレオシドを結合させる。その後、前記ヌクレオシドを起点として、固相担体上で核酸伸長反応を行う。
【0003】
固相合成法では、合成する核酸の鎖長が長くなると、合成効率が急速に低下し、多量の副生成物が混入する結果になりがちである。これは、固相担体表面上で伸長する核酸分子どうしが干渉し、伸長反応の阻害や副反応等が生じているためと考えられる。
固相担体表面上での核酸分子どうしの干渉を防ぐためには、固相担体上に導入する官能基の量を制限することが考えられる。例えば、特許文献１には、アルキルアミノ基を、ピクリン酸による定量値として０．３～２．５μｍｏｌ／ｍ２の割合で導入した固相担体を用いることにより、１５ｍｅｒのＤＮＡの合成収率が向上したことが記載されている。
固相担体表面上での核酸分子どうしの干渉を防ぐためには、固相担体上に導入する官能基の量を制限することが考えられる。例えば、特許文献１には、アルキルアミノ基を、ピクリン酸による定量値として０．３～２．５μｍｏｌ／ｍ２の割合で導入した固相担体を用いることにより、１５ｍｅｒのＤＮＡの合成収率が向上したことが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【文献】特許第２９５８３３８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
固相担体が担持するアミノ基の量を制限すれば、核酸分子どうしの干渉を防ぎ、合成収率の向上や副生成物量の低減化が図れると考えられる。しかしながら、固相担体におけるアミノ基の担持量が低すぎると、核酸の生産性が低下する。そのため、核酸の生産性を維持しつつ、収率や純度を向上させるためには、固相担体のアミノ基担持量を適切な範囲に設定する必要がある。
また、一般的に、ＤＮＡ合成と比較して、ＲＮＡ合成は難しい。特に、長鎖ＲＮＡの合成においては、固相担体が担持するアミノ基量を最適な範囲に制御することが求められる。
また、一般的に、ＤＮＡ合成と比較して、ＲＮＡ合成は難しい。特に、長鎖ＲＮＡの合成においては、固相担体が担持するアミノ基量を最適な範囲に制御することが求められる。
【0006】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、中鎖～長鎖ＲＮＡ合成においても純度を向上させることができる、ＲＮＡの製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明の一態様にかかるＲＮＡの製造方法は、第１級アミノ基を含む無機多孔質担体を用いて、ホスホロアミダイト固相合成法により、ＲＮＡを製造する方法であって、前記無機多孔質担体に含まれる第１級アミノ基の量が、下記式（１）を満たす、ＲＮＡの製造方法である（以下、「本発明の製造方法」と称する）。
【0008】
【数1】
Ｒ：無機多孔質担体に含まれる全アミノ基中の第１級アミノ基の割合（第１級アミノ基量／全アミノ基量）
Ｓ：窒素吸着法により測定される無機多孔質担体の比表面積（ｍ２／ｇ）
【0009】
本発明の一態様にかかるＲＮＡの製造方法は、前記無機多孔質担体に含まれる第１級アミノ基の量が、下記式（１’）を満たす。
Ｉ：２－ニトロベンゼンスルホン酸吸着法により測定される無機多孔質担体の単位質量当たりのアミノ基量（μｍｏｌ／ｇ）
Ｒ：無機多孔質担体に含まれる全アミノ基中の第１級アミノ基の割合（第１級アミノ基量／全アミノ基量）
Ｓ：窒素吸着法により測定される無機多孔質担体の比表面積（ｍ２／ｇ）
【数2】
Ｒ：無機多孔質担体に含まれる全アミノ基中の第１級アミノ基の割合（第１級アミノ基量／全アミノ基量）
Ｓ：窒素吸着法により測定される無機多孔質担体の比表面積（ｍ２／ｇ）
【0010】
本発明の一態様にかかるＲＮＡの製造方法は、前記無機多孔質担体の無機多孔質体が、多孔質ガラスである方法であってもよい。
本発明の一態様にかかるＲＮＡの製造方法は、前記無機多孔質担体の細孔径（モード径）が、９０～１２０ｎｍである方法であってもよい。
本発明の一態様にかかるＲＮＡの製造方法は、前記無機多孔質担体の細孔径（モード径）が、１２０～２００ｎｍである方法であってもよい。
本発明の一態様にかかるＲＮＡの製造方法は、下記の工程１～４を含む方法であってよい：
工程１）前記第１級アミノ基を含む無機多孔質担体と、ヒドロキシル基が保護されたヌクレオシドを含むリンカーとを反応させて、前記無機多孔質担体に前記保護されたヌクレオシドを導入する工程；
工程２）前記ヌクレオシドを導入した無機多孔質担体を核酸固相合成機のカラムに充填する工程；
工程３）前記核酸固相合成機を使用して、脱保護、アミダイト化合物を用いたカップリング、及び酸化を含むサイクルを、複数回繰り返す工程；および
工程４）前記工程３の後、無機多孔質担体から、ヒドロキシル基が保護されたＲＮＡを切り出し、脱保護する工程。
本発明の一態様にかかるＲＮＡの製造方法は、前記リンカーが、スクシニルリンカーである方法であってもよい。
本発明の一態様にかかるＲＮＡの製造方法は、前記工程３）におけるサイクルを４０回以上繰り返す方法であってもよい。
本発明の一態様にかかるＲＮＡの製造方法は、前記無機多孔質担体の細孔径（モード径）が、９０～１２０ｎｍである方法であってもよい。
本発明の一態様にかかるＲＮＡの製造方法は、前記無機多孔質担体の細孔径（モード径）が、１２０～２００ｎｍである方法であってもよい。
本発明の一態様にかかるＲＮＡの製造方法は、下記の工程１～４を含む方法であってよい：
工程１）前記第１級アミノ基を含む無機多孔質担体と、ヒドロキシル基が保護されたヌクレオシドを含むリンカーとを反応させて、前記無機多孔質担体に前記保護されたヌクレオシドを導入する工程；
工程２）前記ヌクレオシドを導入した無機多孔質担体を核酸固相合成機のカラムに充填する工程；
工程３）前記核酸固相合成機を使用して、脱保護、アミダイト化合物を用いたカップリング、及び酸化を含むサイクルを、複数回繰り返す工程；および
工程４）前記工程３の後、無機多孔質担体から、ヒドロキシル基が保護されたＲＮＡを切り出し、脱保護する工程。
本発明の一態様にかかるＲＮＡの製造方法は、前記リンカーが、スクシニルリンカーである方法であってもよい。
本発明の一態様にかかるＲＮＡの製造方法は、前記工程３）におけるサイクルを４０回以上繰り返す方法であってもよい。
【発明の効果】
【0011】
本発明により、中鎖～長鎖のＲＮＡ合成においても純度を向上させることができる、ＲＮＡの製造方法が提供される。
【発明を実施するための形態】
【0012】
本明細書中、ある数値範囲について、「ＡからＢ」または「Ａ～Ｂ］という場合には、特に断らない限り、「Ａ以上から（～）Ｂ以下」の範囲を意味する。
【0013】
本発明の一態様にかかるＲＮＡの製造方法は、第１級アミノ基を含む無機多孔質担体を用いて、ホスホロアミダイト固相合成法により、ＲＮＡを製造する方法であって、前記無機多孔質担体に含まれる第１級アミノ基の量が、下記式（１）を満たす、ＲＮＡの製造方法である。
【0014】
【数3】
Ｒ：無機多孔質担体に含まれる全アミノ基中の第１級アミノ基の割合（第１級アミノ基量／全アミノ基量）
Ｓ：窒素吸着法により測定される無機多孔質担体の比表面積（ｍ２／ｇ）
【0015】
＜無機多孔質担体＞
本実施形態の製造方法で用いられる無機多孔質担体は、第１級アミノ基が導入された無機多孔質担体であって、第１級アミノ基の量が前記式（１）を満たす担体である。
無機多孔質担体は、例えば第１級アミノ基を無機多孔質体の表面に何らかの化学結合を介して共有結合させてなる担体であり、例えば、表面にシラノール基を有する無機多孔質体に、アミノ基（又は保護されたアミノ基）を有するシランカップリング剤を反応させて得られる無機多孔質担体が挙げられる。
本実施形態の製造方法で用いられる無機多孔質担体は、第１級アミノ基が導入された無機多孔質担体であって、第１級アミノ基の量が前記式（１）を満たす担体である。
無機多孔質担体は、例えば第１級アミノ基を無機多孔質体の表面に何らかの化学結合を介して共有結合させてなる担体であり、例えば、表面にシラノール基を有する無機多孔質体に、アミノ基（又は保護されたアミノ基）を有するシランカップリング剤を反応させて得られる無機多孔質担体が挙げられる。
【0016】
（無機多孔質体）
無機多孔質体としては、特に限定されず、核酸固相合成用担体の基材として一般的に用いられるものを使用することができる。中でも、シリカゲルやゼオライトや多孔質ガラスが好ましく、多孔質ガラスがさらに好ましい。
前記多孔質ガラスとしては、例えば、一般にＣＰＧ（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｐｏｒｅ Ｇｌａｓｓ）などの名称にて市販されている多孔質ガラスが挙げられる。
無機多孔質体としては、特に限定されず、核酸固相合成用担体の基材として一般的に用いられるものを使用することができる。中でも、シリカゲルやゼオライトや多孔質ガラスが好ましく、多孔質ガラスがさらに好ましい。
前記多孔質ガラスとしては、例えば、一般にＣＰＧ（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｐｏｒｅ Ｇｌａｓｓ）などの名称にて市販されている多孔質ガラスが挙げられる。
【0017】
無機多孔質体の形状は、特に限定されず、略球状、多面体形状、略柱状、破砕状等いずれの形状であってもよいが、カラムへの充填効率等の観点から、破砕状であることが好ましい。
【0018】
無機多孔質体の粒子径は、特に限定されないが、カラム充填効率及びカラム充填時の送液速度等の観点から、レーザー回折（散乱式）により測定される平均粒径が１～１０００μｍであることが好ましく、５～５００μｍであることがより好ましく、１０～２００μｍであることがさらに好ましい。
【0019】
無機多孔質体における細孔径は、特に限定されず、合成するＲＮＡの鎖長に応じて、適宜選択することができる。一般的に、合成するＲＮＡの鎖長が長い場合には、細孔径の大きいものを選択することが好ましい。例えば、４０ｍｅｒ以上のＲＮＡを合成する場合、細孔径としては、５０ｎｍ以上が挙げられる。例えば、４０～２００ｍｅｒのＲＮＡを合成する場合、細孔径としては、５０～３００ｎｍが挙げられる。例えば、５０～２００ｍｅｒのＲＮＡを合成する場合、細孔径としては、７０～３００ｎｍが挙げられる。例えば、１００～２００ｍｅｒのＲＮＡを合成する場合、細孔径としては、１００～３００ｎｍが挙げられる。前記の細孔径は、水銀圧入法により測定されるものである。
細孔径（モード径）は、水銀圧入法により得られる細孔径分布（Ｘ軸を細孔径の値とし、Ｙ軸を細孔容積を細孔径で微分した値としたグラフ）において、ピークトップのＸ軸の値から求められる。
好ましい態様において、無機多孔質体の細孔径（モード径）としては、９０～１２０ｎｍが挙げられる。別の好ましい態様において、無機多孔質体の細孔径（モード径）としては、１２０～２００ｎｍが挙げられる。
細孔径（モード径）は、水銀圧入法により得られる細孔径分布（Ｘ軸を細孔径の値とし、Ｙ軸を細孔容積を細孔径で微分した値としたグラフ）において、ピークトップのＸ軸の値から求められる。
好ましい態様において、無機多孔質体の細孔径（モード径）としては、９０～１２０ｎｍが挙げられる。別の好ましい態様において、無機多孔質体の細孔径（モード径）としては、１２０～２００ｎｍが挙げられる。
【0020】
無機多孔質体における比表面積は、特に限定されない。一般的に、比表面積が大きいと細孔径が小さくなる傾向にある。比表面積としては、一般的に、１０～１００ｍ２／ｇが挙げられる。例えば、４０ｍｅｒ以上（例、４０～２００ｍｅｒ）のＲＮＡを合成する場合、比表面積は１０～４０ｍ２／ｇが好ましく、２０～４０ｍ２／ｇがより好ましい。本発明における無機多孔質体の比表面積は、窒素吸着法により測定されるものである。窒素吸着法による比表面積の測定は、具体的には以下のように行うことができる。
【0021】
〔窒素吸着法による比表面積の測定法〕
本明細書の実施例に記載した無機多孔質体の窒素吸着法による比表面積の測定は、以下の手順に従って行った。無機多孔質担体の比表面積は、以下の手順に従って求められる値が、上記記載した範囲内であることが好ましい。
試料の前処理として、真空加熱前処理装置（例えば、ＢＥＬＰＲＥＰ－ｖａｃＩＩ（マイクロトラック・ベル株式会社製））を使用して１２０℃で３時間、真空脱気を行う。前記処理を行った試料０．３ｇを、細孔分布測定装置（例えば、ＢＥＬＳＯＲＰ－ｍｉｎｉ（マイクロトラック・ベル株式会社製））を使用して、真空脱気しながら温度７７Ｋで試料に窒素ガスを吸着後、脱着させ、吸着等温線を作成する。得られた吸着等温線から、ＢＥＴ法により比表面積を算出する。
本明細書の実施例に記載した無機多孔質体の窒素吸着法による比表面積の測定は、以下の手順に従って行った。無機多孔質担体の比表面積は、以下の手順に従って求められる値が、上記記載した範囲内であることが好ましい。
試料の前処理として、真空加熱前処理装置（例えば、ＢＥＬＰＲＥＰ－ｖａｃＩＩ（マイクロトラック・ベル株式会社製））を使用して１２０℃で３時間、真空脱気を行う。前記処理を行った試料０．３ｇを、細孔分布測定装置（例えば、ＢＥＬＳＯＲＰ－ｍｉｎｉ（マイクロトラック・ベル株式会社製））を使用して、真空脱気しながら温度７７Ｋで試料に窒素ガスを吸着後、脱着させ、吸着等温線を作成する。得られた吸着等温線から、ＢＥＴ法により比表面積を算出する。
【0022】
（無機多孔質担体に含まれる第１級アミノ基の量）
無機多孔質担体は、前記無機多孔質体に第１級アミノ基が導入されたものであり、第１級アミノ基を含む。本実施形態の製造方法において、無機多孔質担体に含まれる第１級アミノ基の量は、下記式（１）満たす。
無機多孔質担体は、前記無機多孔質体に第１級アミノ基が導入されたものであり、第１級アミノ基を含む。本実施形態の製造方法において、無機多孔質担体に含まれる第１級アミノ基の量は、下記式（１）満たす。
【0023】
【数4】
Ｒ：無機多孔質担体に含まれる全アミノ基中の第１級アミノ基の割合（第１級アミノ基量／全アミノ基量）
Ｓ：窒素吸着法により測定される無機多孔質担体の比表面積（ｍ２／ｇ）
【0024】
無機多孔質担体に含まれる第１級アミノ基の量は、下記式（１’）を満たすことが好ましい。
【0025】
【数5】
【0026】
〔アミノ基量：Ｉ〕
前記式（１）及び（１’）中、Ｉは、２－ニトロベンゼンスルホン酸吸着法により測定される無機多孔質担体の単位質量当たりのアミノ基量により測定される固相担体の単位質量当たりのアミノ基量（μｍｏｌ／ｇ）を表す。「２－ニトロベンゼンスルホン酸吸着法」とは、アミノ基にイオン結合する２－ニトロベンゼンスルホン酸の量に基づき、アミノ基を定量する方法を意味する。
前記式（１）及び（１’）中、Ｉは、２－ニトロベンゼンスルホン酸吸着法により測定される無機多孔質担体の単位質量当たりのアミノ基量により測定される固相担体の単位質量当たりのアミノ基量（μｍｏｌ／ｇ）を表す。「２－ニトロベンゼンスルホン酸吸着法」とは、アミノ基にイオン結合する２－ニトロベンゼンスルホン酸の量に基づき、アミノ基を定量する方法を意味する。
【0027】
２－ニトロベンゼンスルホン酸吸着法によるアミノ基量の測定は、以下のように行うことができる。
３０ｍｇ程度の無機多孔質担体を、脱脂綿で栓をしたパスツールピペット等に採取し、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）溶液（ＤＩＰＥＡ ５容量％）１ｍＬを通液して洗浄する。次いで、２－ニトロベンゼンスルホン酸のＴＨＦ溶液（２－ニトロベンゼンスルホン酸 ５０ｍＭ）１ｍＬで４回通液した後、１ｍＬのＴＨＦで４回通液洗浄する。次いで、１０ｍＬメスフラスコ等の容器を受器として、希アンモニア水（２８％アンモニア水と水とを体積比１：１００で混合した溶液）とアセトニトリルとを体積比１：１で混合した混合溶液を通液する。受器に受けた流出液に、アセトニトリルの水溶液（アセトニトリル １５容量％）を添加して１０ｍＬとし、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて分析し、２－ニトロベンゼンスルホン酸のピーク面積値を測定する。ＨＰＬＣの分析条件は、２－ニトロベンゼンスルホン酸を測定可能な条件であれば、特に限定されないが、例えば、後述の実施例に示す分析条件等が例示される。
前記２－ニトロベンゼンスルホン酸のピーク面積値をＢ、分析に用いた無機多孔質担体の質量をＭ、２－ニトロベンゼンスルホン酸の標準溶液を用いて作成した検量線の傾きをａ、検量線の切片をｂとすると、アミノ基量は、以下のように算出することができる。下記式中、「２０３．１７」は、２－ニトロベンゼンスルホン酸無水物（Ｃ６Ｈ５ＮＯ５Ｓ）の分子量である。
アミノ基量Ｉ＝（Ｂ－ｂ）／（２０３．１７Ｍａ）×１０
３０ｍｇ程度の無機多孔質担体を、脱脂綿で栓をしたパスツールピペット等に採取し、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）溶液（ＤＩＰＥＡ ５容量％）１ｍＬを通液して洗浄する。次いで、２－ニトロベンゼンスルホン酸のＴＨＦ溶液（２－ニトロベンゼンスルホン酸 ５０ｍＭ）１ｍＬで４回通液した後、１ｍＬのＴＨＦで４回通液洗浄する。次いで、１０ｍＬメスフラスコ等の容器を受器として、希アンモニア水（２８％アンモニア水と水とを体積比１：１００で混合した溶液）とアセトニトリルとを体積比１：１で混合した混合溶液を通液する。受器に受けた流出液に、アセトニトリルの水溶液（アセトニトリル １５容量％）を添加して１０ｍＬとし、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて分析し、２－ニトロベンゼンスルホン酸のピーク面積値を測定する。ＨＰＬＣの分析条件は、２－ニトロベンゼンスルホン酸を測定可能な条件であれば、特に限定されないが、例えば、後述の実施例に示す分析条件等が例示される。
前記２－ニトロベンゼンスルホン酸のピーク面積値をＢ、分析に用いた無機多孔質担体の質量をＭ、２－ニトロベンゼンスルホン酸の標準溶液を用いて作成した検量線の傾きをａ、検量線の切片をｂとすると、アミノ基量は、以下のように算出することができる。下記式中、「２０３．１７」は、２－ニトロベンゼンスルホン酸無水物（Ｃ６Ｈ５ＮＯ５Ｓ）の分子量である。
アミノ基量Ｉ＝（Ｂ－ｂ）／（２０３．１７Ｍａ）×１０
【0028】
検量線の作成方法
２－ニトロベンゼンスルホン酸の検量線は、以下のように作成することができる。
まず、中和滴定により、２－ニトロベンゼンスルホン酸の含量を求める（市販品は水和物のため）。次いで、異なる濃度の２－ニトロベンゼンスルホン酸溶液を少なくとも３種類調製し、ＨＰＬＣ分析を行う。ＨＰＬＣ分析におけるピークの面積値を縦軸、２－ニトロベンゼンスルホン酸濃度を横軸にとってプロットし、線形近似により検量線を得ることができる。
２－ニトロベンゼンスルホン酸の検量線は、以下のように作成することができる。
まず、中和滴定により、２－ニトロベンゼンスルホン酸の含量を求める（市販品は水和物のため）。次いで、異なる濃度の２－ニトロベンゼンスルホン酸溶液を少なくとも３種類調製し、ＨＰＬＣ分析を行う。ＨＰＬＣ分析におけるピークの面積値を縦軸、２－ニトロベンゼンスルホン酸濃度を横軸にとってプロットし、線形近似により検量線を得ることができる。
【0029】
本実施形態の製造方法で用いる無機多孔質担体において、アミノ基量は、本実施形態の製造方法の効果を損なわない限り、特に限定されず、合成するＲＮＡの鎖長に応じて、適宜選択することができる。一般的に、合成するＲＮＡの鎖長が長くなるほど、アミノ基量Ｉは低い方が好ましい。例えば、４０ｍｅｒ以上（例、４０～２００ｍｅｒ）のＲＮＡを合成する場合、アミノ基量Ｉとしては、２０～１１０μｍｏｌ／ｇが挙げられる。例えば、１００ｍｅｒ以上（例、１００～２００ｍｅｒ）のＲＮＡを合成する場合、アミノ基量Ｉとしては、２０～６０μｍｏｌ／ｇが挙げられる。
【0030】
〔第１級アミノ基の割合：Ｒ〕
前記式（１）中、Ｒは、無機多孔質担体に含まれる全アミノ基中の第１級アミノ基の割合を表す。例えば、無機多孔質担体に含まれる全アミノ基のモル数をＡ１、第１級アミノ基のモル数をＡ２とすると、Ｒ＝Ａ２／Ａ１により、Ｒを求めることができる。
前記式（１）中、Ｒは、無機多孔質担体に含まれる全アミノ基中の第１級アミノ基の割合を表す。例えば、無機多孔質担体に含まれる全アミノ基のモル数をＡ１、第１級アミノ基のモル数をＡ２とすると、Ｒ＝Ａ２／Ａ１により、Ｒを求めることができる。
【0031】
例えば、下記式（Ｌｃａａ（ｃ９）－ＳＰ１）～（Ｌｃａａ（ｃ９）－ＳＰ６）のいずれかで表されるＬｃａａ（Ｃ９）リンカーを担持する無機多孔質担体の場合、Ｌｃａａ（Ｃ９）リンカー中の全アミノ基数が２、第１級アミノ基数が１であるため、Ｒ＝１／２となる。
【0032】
【化1】
【0033】
また、例えば、下記式（Ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ－ＳＰ１）～（Ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ－ＳＰ６）のいずれかで表されるＡｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌリンカーを担持する無機多孔質担体の場合、Ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌリンカー中の全アミノ基数が１、第１級アミノ基数が１であるため、Ｒ＝１／１となる。
【0034】
【化2】
【0035】
〔無機多孔質担体の比表面積：Ｓ〕
前記式（１）及び（１’）中、Ｓは、窒素吸着法により測定される無機多孔質担体の比表面積（ｍ２／ｇ）を表す。比表面積Ｓの測定は、上記「〔窒素吸着法による比表面積の測定法〕」で記載した方法と同様に行うことができる。
前記式（１）及び（１’）中、Ｓは、窒素吸着法により測定される無機多孔質担体の比表面積（ｍ２／ｇ）を表す。比表面積Ｓの測定は、上記「〔窒素吸着法による比表面積の測定法〕」で記載した方法と同様に行うことができる。
【0036】
（無機多孔質担体の作製方法）
本実施形態の製造方法で用いる無機多孔質担体は、例えば、無機多孔質体に、第１級アミノ基又は保護された第１級アミノ基を有するシランカップリング剤等を反応させることにより作製することができる。以下、無機多孔質体に、第１級アミノ基又は保護された第１級アミノ基を有するシランカップリング剤を反応させて、無機多孔質担体を調製する方法を説明する。
本実施形態の製造方法で用いる無機多孔質担体は、例えば、無機多孔質体に、第１級アミノ基又は保護された第１級アミノ基を有するシランカップリング剤等を反応させることにより作製することができる。以下、無機多孔質体に、第１級アミノ基又は保護された第１級アミノ基を有するシランカップリング剤を反応させて、無機多孔質担体を調製する方法を説明する。
【0037】
前記シランカップリング剤としては、特に限定されないが、例えば、下記式（ｓ１）で表されるシランカップリング剤が挙げられる。
【0038】
【化3】
【0039】
具体的には、例えば、アミノプロピルトリメトキシシラン、アミノプロピルトリエトキシシラン、アミノエチルトリメトキシシランなどの１個の第１級アミノ基を有するアミノアルキルアルコキシシラン；Ｎ－２－（アミノエチル）－３－アミノプロピルメチルジメトキシシラン、Ｎ－２－（アミノエチル）－３－アミノプロピルトリメトキシシラン、［３－（６－アミノヘキシルアミノ）プロピル］トリメトキシシラン（Ｌｃａａ（Ｃ９））などの１個の第１級アミノ基と１個の第２級アミノ基とを有するアミノアルキルアルコキシシラン等が挙げられるが、これらに限定されない。
【0040】
無機多孔質体と第１級アミノ基を有するシランカップリング剤との反応は、通常、乾燥した有機溶媒、例えば、アセトニトリル、トルエン、キシレン、アニソール、２－ヘプタノン、プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、またはこれらの２種以上中で実施する。前記シランカップリング剤との反応を妨げる水分を除く為に、無機多孔質体に含まれる水分を予め除いておくことが好ましく、無機多孔質体をトルエンやキシレンなどの有機溶媒中に分散させた後、脱水処理をすることにより、水分を除去することができる。無機多孔質体の脱水を有機溶媒中で実施した場合には、脱水処理後の混合物に前記シランカップリング剤を加えて、引き続き無機多孔質体とシランカップリング剤との反応を実施することができる。
前記シランカップリング剤と無機多孔質体との反応における反応温度は、例えば、０～１１０℃、好ましくは１００～１１０℃であるが、通常、シランカップリング剤と無機多孔質体によっては、用いる有機溶媒の沸点近くの温度、すなわち、還流温度で反応を実施してもよい。また、反応時間は、通常、２～６時間程度であるが、用いる無機多孔質体とシランカップリング剤によっては、適宜、反応時間を短縮しても延長してもよい。
使用する前記シランカップリング剤の量は、無機多孔質体の比表面積および目標とする第１級アミノ基の量を勘案して、適宜設定することができる。
上述の反応により得られた無機多孔質担体は、常法によって、分離、洗浄、乾燥し、ＲＮＡ合成用の固相担体として使用することができる。
前記シランカップリング剤と無機多孔質体との反応における反応温度は、例えば、０～１１０℃、好ましくは１００～１１０℃であるが、通常、シランカップリング剤と無機多孔質体によっては、用いる有機溶媒の沸点近くの温度、すなわち、還流温度で反応を実施してもよい。また、反応時間は、通常、２～６時間程度であるが、用いる無機多孔質体とシランカップリング剤によっては、適宜、反応時間を短縮しても延長してもよい。
使用する前記シランカップリング剤の量は、無機多孔質体の比表面積および目標とする第１級アミノ基の量を勘案して、適宜設定することができる。
上述の反応により得られた無機多孔質担体は、常法によって、分離、洗浄、乾燥し、ＲＮＡ合成用の固相担体として使用することができる。
【0041】
また、無機多孔質体とシランカップリング剤との反応後、さらに、アミン化合物を反応させて、リンカーを伸長させてもよい。例えば、前記式（ｓ１）においてｍ＝１であり、ｎ＝２であり、Ｌが、単結合を表すとき、公知の方法により、前記式（ｓ１）で表されるシランカップリング剤を無機多孔質体と反応させて、第１級アミノ基を含む無機多孔質担体を得た後、前記末端の１級アミノ基をさらにｐ－ニトロフェニルギ酸クロライドと反応させ、反応性のカルボニル基を導入し、これに種々のアルカンジアミンを反応させて、下記のリンカー（Ｌ－１）又は（Ｌ－２）を有する無機多孔質担体を調製することができる。
【0042】
【化4】
【0043】
上記のように製造した無機多孔質担体は、上記で説明した方法によりアミノ基量を算出し、第１アミノ基量が上記式（１）を満たすことを確認すればよい。そして、上記式（１）を満たすことが確認された無機多孔質担体を用いて、ＲＮＡ固相合成を行う。
また、かかる無機多孔質担体にスクシニル基を介してヌクレオシドを結合させた固相担体を合成してＲＮＡの固相合成に使用することができる。
また、かかる無機多孔質担体にスクシニル基を介してヌクレオシドを結合させた固相担体を合成してＲＮＡの固相合成に使用することができる。
【0044】
＜ＲＮＡ合成＞
本実施形態の製造方法では、上記説明した無機多孔質担体を用いて、ホスホロアミダイト法により、ＲＮＡの固相合成を行う。ホスホロアミダイト法は、公知の方法により行うことができる。ホスホロアミダイト法によるＲＮＡ合成の具体例を以下に示す。
本実施形態の製造方法では、上記説明した無機多孔質担体を用いて、ホスホロアミダイト法により、ＲＮＡの固相合成を行う。ホスホロアミダイト法は、公知の方法により行うことができる。ホスホロアミダイト法によるＲＮＡ合成の具体例を以下に示す。
【0045】
第１級アミノ基を含む無機多孔質担体と、ヒドロキシル基が保護されたヌクレオシドを含むリンカーとを反応させて、固相担体を製造し、これを用いた固相合成法により、所望のアミダイト化合物と、例えば、核酸合成機（ＡＫＴＡ Ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ１００ｐｌｕｓ（ＧＥヘルスケア社製）等）を用いた反応を繰り返すことにより、ＲＮＡを合成することができる。なお、本明細書において、「アミダイト化合物」とは、アミダイトの構造を含む化合物を意味し、例えば、ヒドロキシル基が保護されたヌクレオシドホスホロアミダイト等が挙げられる。
【0046】
かかるＲＮＡ固相合成法で使用するアミダイト化合物としては、特に制限されず、たとえば、下記構造式（２）中の、保護基Ｒ５がｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）基、ビス（２－アセトキシ）メチル（ＡＣＥ）基、（トリイソプロピルシリロキシ）メチル（ＴＯＭ）基、（２－シアノエトキシ）エチル（ＣＥＥ）基、（２－シアノエトキシ）メチル（ＣＥＭ）基、パラ－トルイルスルホニルエトキシメチル（ＴＥＭ）基、（２－シアノエトキシ）メトキシメチル（ＥＭＭ）基などである、ＴＢＤＭＳアミダイト（ＴＢＤＭＳ ＲＮＡ Ａｍｉｄｉｔｅｓ、商品名、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ＡＣＥアミダイト、ＴＯＭアミダイト、ＣＥＥアミダイト、ＣＥＭアミダイト、ＴＥＭアミダイト（Chakhmakhchevaの総説：Protective Groups in the Chemical Synthesis of Oligoribonucleotides、Russian Journal of Bioorganic Chemistry, 2013, Vol. 39, No. 1, pp. 1-21.）、ＥＭＭアミダイト（国際公開第２０１３／０２７８４３号に記載）等を使用することもできる。
【0047】
【化5】
【0048】
アミダイト化合物としては、下記構造式（３）に示されるプロリン骨格を有するアミダイト（Ａｍｉｄｉｔｅ Ｐ）を使用することもできる（ＷＯ２０１２／０１７９１９の実施例Ａ４参照）。また、構造式（ＩＩＩ－ｃ）、（ＩＩＩ－ｄ）および（ＩＩＩ－ｅ）で表される下記のアミダイト（ＷＯ２０１３／１０３１４６の実施例Ａ１～Ａ３参照）を使用して核酸を合成することもできる。
【0049】
【化6】
【0050】
【化7】
【0051】
アミダイト化合物中のヌクレオチドを構成する塩基は、通常は、核酸、典型的にはＲＮＡを構成する天然の塩基であるが、非天然の塩基を場合によっては、使用してもよい。かかる非天然の塩基としては、天然又は非天然の塩基の修飾アナログが例示される。
【0052】
塩基の例としては、例えば、前記式（２）において、Ｒ４が、アデニンおよびグアニン等のプリン塩基、シトシン、ウラシルおよびチミン等のピリミジン塩基等が挙げられる。塩基は、この他に、イノシン、チミン、キサンチン、ヒポキサンチン、ネブラリン（ｎｅｂｕｌａｒｉｎｅ）、イソグアニシン（ｉｓｏｇｕａｎｉｓｉｎｅ）、ツベルシジン（ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎｅ）等が挙げられる。前記塩基は、例えば、２－アミノアデニン、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン等のアミノ誘導体；５－メチルウラシル、５－メチルシトシン、７－メチルグアニン、６－メチルプリン、２－プロピルプリン等のアルキル誘導体；５－ハロウラシル及び５－ハロシトシン；５－プロピニルウラシル及び５－プロピニルシトシン；６－アザウラシル、６－アザシトシン及び６－アザチミン；５－ウラシル（シュードウラシル）、４－チオウラシル、５－（２－アミノプロピル）ウラシル、５－アミノアリルウラシル；８－ハロ化、アミノ化、チオール化、チオアルキル化、ヒドロキシル化及び他の８－置換プリン；５－トリフルオロメチル化及び他の５－置換ピリミジン；６－アザピリミジン；Ｎ－２、Ｎ－６及びＯ－６置換プリン（２－アミノプロピルアデニンを含む）；ジヒドロウラシル；３－デアザ－５－アザシトシン；７－デアザアデニン；Ｎ６－メチルアデニン、Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデニン；５－アミノ－アリル－ウラシル；Ｎ３－メチルウラシル；置換１，２，４－トリアゾール；２－ピリジノン；５－ニトロインドール；３－ニトロピロール；５－メトキシウラシル；ウラシル－５－オキシ酢酸；５－メトキシカルボニルメチルウラシル；２－チオウラシル、５－メチル－２－チオウラシル；５－メトキシカルボニルメチル－２－チオウラシル；５－メチルアミノメチル－２－チオウラシル；３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）ウラシル；３－メチルシトシン；Ｎ４－アセチルシトシン；２－チオシトシン；Ｎ６－メチルアデニン；Ｎ６－イソペンチルアデニン；２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン；Ｎ－メチルグアニン；Ｏ－アルキル化塩基等；およびこれらの２種以上が挙げられる。また、プリンおよびピリミジンは、例えば、米国特許第３，６８７，８０８号、「Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」、８５８～８５９頁、クロシュビッツ・ジェー・アイ（Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ Ｊ．Ｉ．）編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、１９９０、およびイングリッシュら（Ｅｎｇｌｉｓｃｈら）、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９１、３０巻、ｐ．６１３に開示されるものが含まれる。
【0053】
無機多孔質担体の第１級アミノ基に対して、核酸伸長反応の起点となるヒドロキシル基を含むヌクレオシドを結合させる工程について説明する。この工程の反応には、公知の核酸固相合成用のリボヌクレオシドリンカー又はユニバーサルリンカーを用いることができる。リボヌクレオシドリンカー及びユニバーサルリンカーは、公知のものを特に制限なく使用することができる。リボヌクレオシドリンカーを用いる場合、合成するＲＮＡの配列に応じて、３’末端の塩基に対応するリボヌクレオシドリンカーを選択する。
前記リボヌクレオシドリンカー又はユニバーサルリンカーとしては、第１級アミノ基と反応する官能基としてスクシニル基を有するもの（スクシニルリンカー）が挙げられる。また、核酸伸長反応の起点となるヒドロキシル基が、ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）基等の保護基により保護されたものが挙げられる。
前記リボヌクレオシドリンカー又はユニバーサルリンカーとしては、第１級アミノ基と反応する官能基としてスクシニル基を有するもの（スクシニルリンカー）が挙げられる。また、核酸伸長反応の起点となるヒドロキシル基が、ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）基等の保護基により保護されたものが挙げられる。
【0054】
（核酸伸長反応）
本明細書において、「核酸伸長反応」とは、ホスホジエステル結合を介して、ヌクレオチドを順次結合させることにより、核酸鎖、特にＲＮＡ鎖を伸長させる反応を意味する。核酸伸長反応は、一般的なホスホロアミダイト法の手順に従い行うことができる。核酸伸長反応は、ホスホロアミダイト法を採用する核酸自動合成装置等を用いて行ってもよい。
本明細書において、「核酸伸長反応」とは、ホスホジエステル結合を介して、ヌクレオチドを順次結合させることにより、核酸鎖、特にＲＮＡ鎖を伸長させる反応を意味する。核酸伸長反応は、一般的なホスホロアミダイト法の手順に従い行うことができる。核酸伸長反応は、ホスホロアミダイト法を採用する核酸自動合成装置等を用いて行ってもよい。
【0055】
ホスホロアミダイト法では、一般的に、脱保護工程、縮合工程、及び酸化工程の各工程を繰り返し行うことにより、核酸伸長反応を行う。
【0056】
脱保護反応は、固相担体上に担持されるＲＮＡ鎖末端の５’ヒドロキシル基の保護基を脱保護する工程である。一般的な保護基としては、ＤＭＴｒ基が用いられる。脱保護は、酸を用いて行うことができる。脱保護用の酸としては、例えば、トリフルオロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリクロロ酢酸、メタンスルホン酸、塩酸、酢酸、ｐ－トルエンスルホン酸等、またはこれらの２種以上が挙げられる。
【0057】
縮合工程は、前記脱保護工程により脱保護したＲＮＡ鎖末端の５’ヒドロキシル基に対して、ヌクレオシドホスホロアミダイトを結合させる反応である。前記ヌクレオシドホスホロアミダイトとしては、５’ヒドロキシル基が保護基（例、ＤＭＴｒ基）で保護されたものを用いる。縮合工程は、前記ヌクレオシドホスホロアミダイトを活性化する活性化剤を用いて行うことができる。活性化剤としては、例えば、５－ベンジルチオ－１Ｈ－テトラゾール（ＢＴＴ）、１Ｈ－テトラゾール、４，５－ジシアノイミダゾール（ＤＣＩ）、５－エチルチオ－１Ｈ－テトラゾール（ＥＴＴ）、Ｎ－メチルベンズイミダゾリウムトリフラート（Ｎ－ＭｅＢＩＴ）、ベンズイミダゾリウムトリフラート（ＢＩＴ）、Ｎ－フェニルイミダゾリウムトリフラート（Ｎ－ＰｈＩＭＴ）、イミダゾリウムトリフラート（ＩＭＴ）、５－ニトロベンズイミダゾリウムトリフラート（ＮＢＴ）、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）又は５－（ビス－３，５－トリフルオロメチルフェニル）－１Ｈ－テトラゾール（Ａｃｔｉｖａｔｏｒ－４２）等、またはこれらの２種以上が挙げられる。
縮合工程の後は、適宜、未反応の５’ヒドロキシル基をキャッピングしてもよい。キャッピングは、無水酢酸－テトラヒドロフラン溶液、フェノキシ酢酸／Ｎ－メチルイミダゾール溶液等の公知のキャッピング溶液を用いて行うことができる。
縮合工程の後は、適宜、未反応の５’ヒドロキシル基をキャッピングしてもよい。キャッピングは、無水酢酸－テトラヒドロフラン溶液、フェノキシ酢酸／Ｎ－メチルイミダゾール溶液等の公知のキャッピング溶液を用いて行うことができる。
【0058】
酸化工程は、前記縮合工程により形成された亜リン酸エステルを酸化する工程である。酸化工程は、酸化剤を用いて行うことができる。酸化剤としては、ヨウ素、ｍ－クロロ過安息香酸、ｔｅｒｔ－ブチルヒドロペルオキシド、２－ブタノンペルオキシド、ビス（トリメチルシリル）ペルオキシド、１，１－ジヒドロペルオキシシクロドデカン、過酸化水素等、またはこれらの２種以上が挙げられる。酸化工程は、前記キャッピング操作の後で行ってもよいし、逆に、酸化工程の後でキャッピング操作を行ってもよいし、この順番は限定されない。
【0059】
酸化工程後は、脱保護工程に戻り、合成するＲＮＡ鎖の鎖長に応じて、上記工程を繰り返すことにより、所望の配列を有するＲＮＡを合成することができる。
所望の配列を有するＲＮＡ鎖の合成が完了した後は、アンモニア又はアミン類等を用いて、固相担体からＲＮＡ鎖を切断して回収する。アミン類としては、例えば、メチルアミン、エチルアミン、イソプロピルアミン、エチレンジアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン等、またはこれらの２種以上が挙げられる。
回収したＲＮＡは、適宜、公知の方法で精製してもよい。
所望の配列を有するＲＮＡ鎖の合成が完了した後は、アンモニア又はアミン類等を用いて、固相担体からＲＮＡ鎖を切断して回収する。アミン類としては、例えば、メチルアミン、エチルアミン、イソプロピルアミン、エチレンジアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン等、またはこれらの２種以上が挙げられる。
回収したＲＮＡは、適宜、公知の方法で精製してもよい。
【0060】
ＲＮＡの合成は、ＤＮＡの合成と比較して難易度が高く、特に長鎖ＲＮＡの合成においては、収率や純度が大きく低下する。しかしながら、本実施形態の製造方法では、上記の固相担体を用いることにより、長鎖ＲＮＡの合成においても、高い収率及び純度を維持し得る。
本実施形態の製造方法により合成されるＲＮＡとしては、例えば、４０ｍｅｒ以上又は５０ｍｅｒ以上のＲＮＡが挙げられる。ＲＮＡ鎖の鎖長の上限は、特に限定されないが、例えば、２００ｍｅｒ以下又は１５０ｍｅｒ以下とすることができる。
本実施形態の製造方法により得られるＲＮＡは、純度が高く品質が良好であるため、医薬品等に好適に用いることができる。
本実施形態の製造方法により合成されるＲＮＡとしては、例えば、４０ｍｅｒ以上又は５０ｍｅｒ以上のＲＮＡが挙げられる。ＲＮＡ鎖の鎖長の上限は、特に限定されないが、例えば、２００ｍｅｒ以下又は１５０ｍｅｒ以下とすることができる。
本実施形態の製造方法により得られるＲＮＡは、純度が高く品質が良好であるため、医薬品等に好適に用いることができる。
【0061】
本実施形態の製造方法は、下記の工程１～４を含む方法であってもよい：
工程１）前記第１級アミノ基を含む無機多孔質担体と、ヒドロキシル基が保護されたヌクレオシドを含むリンカーとを反応させて、前記無機多孔質担体に前記保護されたヌクレオシドを導入する工程；
工程２）前記ヌクレオシドを導入した無機多孔質担体を核酸固相合成機のカラムに充填する工程；
工程３）前記核酸固相合成機を使用して、脱保護、アミダイト化合物を用いたカップリング、及び酸化を含むサイクルを、複数回繰り返す工程；および
工程４）前記工程３の後、無機多孔質担体から、ヒドロキシル基が保護されたＲＮＡを切り出し、脱保護する工程。
上記工程３）におけるサイクル数は、合成するＲＮＡの長さに応じて設定すればよく、例えば、４０回以上、又は５０回以上等とすることができる。また、サイクル数の上限は、例えば、２００回以下、又は１５０回以下等とすることができる。
工程１）前記第１級アミノ基を含む無機多孔質担体と、ヒドロキシル基が保護されたヌクレオシドを含むリンカーとを反応させて、前記無機多孔質担体に前記保護されたヌクレオシドを導入する工程；
工程２）前記ヌクレオシドを導入した無機多孔質担体を核酸固相合成機のカラムに充填する工程；
工程３）前記核酸固相合成機を使用して、脱保護、アミダイト化合物を用いたカップリング、及び酸化を含むサイクルを、複数回繰り返す工程；および
工程４）前記工程３の後、無機多孔質担体から、ヒドロキシル基が保護されたＲＮＡを切り出し、脱保護する工程。
上記工程３）におけるサイクル数は、合成するＲＮＡの長さに応じて設定すればよく、例えば、４０回以上、又は５０回以上等とすることができる。また、サイクル数の上限は、例えば、２００回以下、又は１５０回以下等とすることができる。
【0062】
本発明は、他の態様において、（ａ）第１級アミノ基を含む無機多孔質担体であって、第１級アミノ基の量が、下記式（１）を満たす、無機多孔質担体を選択する工程と、（ｂ）前記無機多孔質担体を用いて、ホスホロアミダイト法により、ＲＮＡを合成する工程と、を含む、ＲＮＡの製造方法もまた提供する。
【0063】
【数6】
Ｒ：無機多孔質担体に含まれる全アミノ基中の第１級アミノ基の割合（第１級アミノ基量／全アミノ基量）
Ｓ：窒素吸着法により測定される無機多孔質担体の比表面積（ｍ２／ｇ）
【実施例】
【0064】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
【0065】
＜測定方法＞
以下の試験で用いた各測定方法を以下に示す。
以下の試験で用いた各測定方法を以下に示す。
【0066】
（測定方法１：ＣＰＧ上に担持されたアミノ基の測定方法）
ａ． ２－ニトロベンゼンスルホン酸吸着法
無機多孔質担体４０～５０ｍｇを、脱脂綿で栓をしたパスツールピペットに採取し、５容量％のＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）／テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）溶液１ｍＬを通液して洗浄した。次に、５０ｍＭ ２－ニトロベンゼンスルホン酸／ＴＨＦ溶液１ｍＬで４回通液した後、１ｍＬのＴＨＦで４回通液して洗浄した。次いで、１０ｍＬメスフラスコを受器として、希アンモニア水（２８％アンモニア水１容を水１００容にて希釈した溶液）とアセトニトリルとの１対１（容量比）混合液を通液した。メスフラスコに受けた流出液を１５容量％アセトニトリル／水溶液にて１０ｍＬに希釈し、分析試料とした。当該試料を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて、下記の条件に従って分析した。さらに、下記に従って作成した検量線から、無機多孔質担体に担持されたアミノ基量Ｉを求めた。
ａ． ２－ニトロベンゼンスルホン酸吸着法
無機多孔質担体４０～５０ｍｇを、脱脂綿で栓をしたパスツールピペットに採取し、５容量％のＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）／テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）溶液１ｍＬを通液して洗浄した。次に、５０ｍＭ ２－ニトロベンゼンスルホン酸／ＴＨＦ溶液１ｍＬで４回通液した後、１ｍＬのＴＨＦで４回通液して洗浄した。次いで、１０ｍＬメスフラスコを受器として、希アンモニア水（２８％アンモニア水１容を水１００容にて希釈した溶液）とアセトニトリルとの１対１（容量比）混合液を通液した。メスフラスコに受けた流出液を１５容量％アセトニトリル／水溶液にて１０ｍＬに希釈し、分析試料とした。当該試料を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて、下記の条件に従って分析した。さらに、下記に従って作成した検量線から、無機多孔質担体に担持されたアミノ基量Ｉを求めた。
【0067】
〔高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析条件〕
カラム：Ｓｃｈｅｒｚｏ ＳＭ－Ｃ１８（Ｉｍｔａｋｔ製），４．６ｍｍφ×１５０ｍｍ，３μｍ
移動相：Ａ液 １０ｍＭ ギ酸アンモニウム水溶液
Ｂ液 アセトニトリル
グラジエント条件：Ａ／Ｂ＝８５％／１５％（一定）
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
検出波長：２１０ｎｍ
注入量：１０μＬ
カラム：Ｓｃｈｅｒｚｏ ＳＭ－Ｃ１８（Ｉｍｔａｋｔ製），４．６ｍｍφ×１５０ｍｍ，３μｍ
移動相：Ａ液 １０ｍＭ ギ酸アンモニウム水溶液
Ｂ液 アセトニトリル
グラジエント条件：Ａ／Ｂ＝８５％／１５％（一定）
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
検出波長：２１０ｎｍ
注入量：１０μＬ
【0068】
〔検量線の作成〕
上記２－ニトロベンゼンスルホン酸吸着法に用いた２－ニトロベンゼンスルホン酸試薬（２－ニトロベンゼンスルホン酸水和物）の中和滴定を行い、試薬中の２－ニトロベンゼンスルホン酸の含有量を求めた。次に、異なる濃度の２－ニトロベンゼンスルホン酸溶液を３種類調製し、ＨＰＬＣを用いて、上記の条件に従って分析した。ＨＰＬＣによるピーク面積値を縦軸に、２－ニトロベンゼンスルホン酸濃度を横軸にとってプロットし、線形近似により検量線を得た。
上記２－ニトロベンゼンスルホン酸吸着法に用いた２－ニトロベンゼンスルホン酸試薬（２－ニトロベンゼンスルホン酸水和物）の中和滴定を行い、試薬中の２－ニトロベンゼンスルホン酸の含有量を求めた。次に、異なる濃度の２－ニトロベンゼンスルホン酸溶液を３種類調製し、ＨＰＬＣを用いて、上記の条件に従って分析した。ＨＰＬＣによるピーク面積値を縦軸に、２－ニトロベンゼンスルホン酸濃度を横軸にとってプロットし、線形近似により検量線を得た。
【0069】
（測定方法２：ＣＰＧ比表面積の測定方法）
ＣＰＧ比表面積の測定は、窒素吸着法により、以下の手順に従って行った。
試料の前処理として、ＢＥＬＰＲＥＰ－ｖａｃＩＩ（マイクロトラック・ベル株式会社製）を使用して１２０℃で３時間、真空脱気を行った。前記処理を行った試料０．３ｇを、ＢＥＬＳＯＲＰ－ｍｉｎｉ（マイクロトラック・ベル株式会社製）を使用して真空脱気しながら温度７７Ｋで試料に窒素ガスを吸着後、脱着させ、得られた吸着等温線から、ＢＥＴ法により比表面積Ｓを算出した。
ＣＰＧ比表面積の測定は、窒素吸着法により、以下の手順に従って行った。
試料の前処理として、ＢＥＬＰＲＥＰ－ｖａｃＩＩ（マイクロトラック・ベル株式会社製）を使用して１２０℃で３時間、真空脱気を行った。前記処理を行った試料０．３ｇを、ＢＥＬＳＯＲＰ－ｍｉｎｉ（マイクロトラック・ベル株式会社製）を使用して真空脱気しながら温度７７Ｋで試料に窒素ガスを吸着後、脱着させ、得られた吸着等温線から、ＢＥＴ法により比表面積Ｓを算出した。
【0070】
（測定方法３：ヌクレオシド担持量の測定方法）
７０％過塩素酸をメタノールで希釈し、３０％過塩素酸溶液を調製した。ヌクレオシドを担持させた無機多孔質担体４０～５０ｍｇをメスフラスコに採取し、３０％過塩素酸溶液で２０ｍＬに希釈した。この溶液を３０％過塩素酸溶液でさらに１０倍に希釈した後、脱離したＤＭＴｒカチオンの４９８ｎｍでの吸光度を測定し、ヌクレオシド担持量を算出した。
７０％過塩素酸をメタノールで希釈し、３０％過塩素酸溶液を調製した。ヌクレオシドを担持させた無機多孔質担体４０～５０ｍｇをメスフラスコに採取し、３０％過塩素酸溶液で２０ｍＬに希釈した。この溶液を３０％過塩素酸溶液でさらに１０倍に希釈した後、脱離したＤＭＴｒカチオンの４９８ｎｍでの吸光度を測定し、ヌクレオシド担持量を算出した。
【0071】
（測定方法４－ａ：オリゴヌクレオチドの純度の測定方法）
固相合成後のオリゴヌクレオチド粗生成物の純度の測定は、ＨＰＬＣにより行った。粗生成物をＨＰＬＣ（波長２６０ｎｍ、カラムＤＮＡＰａｃＴＭ ＰＡ１００ ４×２５０ｍｍ）によって各成分に分離し、得られたクロマトグラムの総面積値における主生成物の面積値からオリゴヌクレオチドの純度を算出した。
固相合成後のオリゴヌクレオチド粗生成物の純度の測定は、ＨＰＬＣにより行った。粗生成物をＨＰＬＣ（波長２６０ｎｍ、カラムＤＮＡＰａｃＴＭ ＰＡ１００ ４×２５０ｍｍ）によって各成分に分離し、得られたクロマトグラムの総面積値における主生成物の面積値からオリゴヌクレオチドの純度を算出した。
【0072】
（測定方法４－ｂ：オリゴヌクレオチドの純度の測定方法）
固相合成後のオリゴヌクレオチド粗生成物の純度の測定は、ＨＰＬＣにより行った。粗生成物をＨＰＬＣ（波長２６０ｎｍ、カラムＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｏｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＢＨＥ Ｃ１８，２．１ｍｍ×１００ｍｍ）によって各成分に分離し、得られたクロマトグラムの総面積値における主生成物の面積値からオリゴヌクレオチドの純度を算出した。
固相合成後のオリゴヌクレオチド粗生成物の純度の測定は、ＨＰＬＣにより行った。粗生成物をＨＰＬＣ（波長２６０ｎｍ、カラムＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｏｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＢＨＥ Ｃ１８，２．１ｍｍ×１００ｍｍ）によって各成分に分離し、得られたクロマトグラムの総面積値における主生成物の面積値からオリゴヌクレオチドの純度を算出した。
【0073】
＜第１級アミノ基を含む無機多孔質担体の作製＞
以下のようにＣＰＧのアミノ基修飾を行い、実施例１～１７、比較例１～６の無機多孔質担体を作製した。表１および２に、各例で用いたＣＰＧ（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｐｏｒｅ Ｇｌａｓｓ）の物性とそれに対応する第１級アミノ基を含む無機多孔質担体のアミノ基量をまとめて示す。
以下のようにＣＰＧのアミノ基修飾を行い、実施例１～１７、比較例１～６の無機多孔質担体を作製した。表１および２に、各例で用いたＣＰＧ（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｐｏｒｅ Ｇｌａｓｓ）の物性とそれに対応する第１級アミノ基を含む無機多孔質担体のアミノ基量をまとめて示す。
【0074】
（実施例１～９）
実施例１～９の無機多孔質担体として、アミノ基修飾されたＣＰＧをそれぞれ用意した。実施例１～９で用いたＣＰＧの物性及び無機多孔質担体に担持されたアミノ基量を、表１に示した。
実施例１～９の無機多孔質担体として、アミノ基修飾されたＣＰＧをそれぞれ用意した。実施例１～９で用いたＣＰＧの物性及び無機多孔質担体に担持されたアミノ基量を、表１に示した。
【0075】
（実施例１０）アミノ基修飾
Ｄｅａｎ－Ｓｔａｒｋ装置を用い、トルエン共沸にて脱水処理を予め施したＣＰＧ（６．０７ｇ）を、２００ｍＬ４つ口フラスコに入れ、トルエン（４０．６ｍＬ）を加えた。更に［３－（６－Ａｍｉｎｏｈｅｘｙｌａｍｉｎｏ）－ｐｒｏｐｙｌ］ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ（１２１μＬ，４２５．８μｍｏｌ）を加え、４時間１１０℃で加熱還流した。その後、室温まで冷却した反応液を濾過除去し、トルエン、メタノール、水で順次洗浄した後、１Ｎ塩酸で中和した。更に、中和液を濾過除去後、水、メタノールで順次洗浄し、減圧下で乾燥させ、アミノ基修飾したＣＰＧを白色粉末状固体（アミノ基を含む無機多孔質担体）として得た。ＣＰＧの物性とともにアミノ基量を表１に記す。
Ｄｅａｎ－Ｓｔａｒｋ装置を用い、トルエン共沸にて脱水処理を予め施したＣＰＧ（６．０７ｇ）を、２００ｍＬ４つ口フラスコに入れ、トルエン（４０．６ｍＬ）を加えた。更に［３－（６－Ａｍｉｎｏｈｅｘｙｌａｍｉｎｏ）－ｐｒｏｐｙｌ］ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ（１２１μＬ，４２５．８μｍｏｌ）を加え、４時間１１０℃で加熱還流した。その後、室温まで冷却した反応液を濾過除去し、トルエン、メタノール、水で順次洗浄した後、１Ｎ塩酸で中和した。更に、中和液を濾過除去後、水、メタノールで順次洗浄し、減圧下で乾燥させ、アミノ基修飾したＣＰＧを白色粉末状固体（アミノ基を含む無機多孔質担体）として得た。ＣＰＧの物性とともにアミノ基量を表１に記す。
【0076】
（実施例１１）アミノ基修飾
実施例１０の方法において、ＣＰＧ（６．３６ｇ）、トルエン（４２．５ｍＬ）、［３－（６－Ａｍｉｎｏｈｅｘｙｌａｍｉｎｏ）－ｐｒｏｐｙｌ］ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ（７２．３μＬ，２５４．４μｍｏｌ）を使用する以外は、実施例１０と同様の方法で、アミノ基修飾したＣＰＧを白色粉末状固体（アミノ基を含む無機多孔質担体）として得た。ＣＰＧの物性とともにアミノ基量を表１に記す。
実施例１０の方法において、ＣＰＧ（６．３６ｇ）、トルエン（４２．５ｍＬ）、［３－（６－Ａｍｉｎｏｈｅｘｙｌａｍｉｎｏ）－ｐｒｏｐｙｌ］ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ（７２．３μＬ，２５４．４μｍｏｌ）を使用する以外は、実施例１０と同様の方法で、アミノ基修飾したＣＰＧを白色粉末状固体（アミノ基を含む無機多孔質担体）として得た。ＣＰＧの物性とともにアミノ基量を表１に記す。
【0077】
（実施例１２）アミノ基修飾
ＣＰＧ（３．００ｇ）を、２００ｍＬ４つ口フラスコに入れ、トルエン（２３．１ｍＬ）を加えた。更に３－（Ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌｙｌ）ｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｅ（２７．５μＬ，１５６．５μｍｏｌ）を加え、４時間１１０℃で加熱還流した。その後、室温まで冷却した反応液を濾過除去し、トルエン、メタノール、水で順次洗浄した後、１Ｎ塩酸で中和した。更に、中和液を濾過除去後、水、メタノールで順次洗浄し、減圧下で乾燥させ、アミノ基修飾したＣＰＧを白色粉末状固体（アミノ基を含む無機多孔質担体）として得た。ＣＰＧの物性とともにアミノ基量を表１に記す。
ＣＰＧ（３．００ｇ）を、２００ｍＬ４つ口フラスコに入れ、トルエン（２３．１ｍＬ）を加えた。更に３－（Ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌｙｌ）ｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｅ（２７．５μＬ，１５６．５μｍｏｌ）を加え、４時間１１０℃で加熱還流した。その後、室温まで冷却した反応液を濾過除去し、トルエン、メタノール、水で順次洗浄した後、１Ｎ塩酸で中和した。更に、中和液を濾過除去後、水、メタノールで順次洗浄し、減圧下で乾燥させ、アミノ基修飾したＣＰＧを白色粉末状固体（アミノ基を含む無機多孔質担体）として得た。ＣＰＧの物性とともにアミノ基量を表１に記す。
【0078】
（実施例１３）アミノ基修飾
実施例１０の方法において、ＣＰＧ（６．９０ｇ）、トルエン（４６．２ｍＬ）、［３－（６－Ａｍｉｎｏｈｅｘｙｌａｍｉｎｏ）－ｐｒｏｐｙｌ］ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ（５８μＬ，２０４．１μｍｏｌ）を使用する以外は、実施例１０と同様の方法で、アミノ基修飾したＣＰＧを白色粉末状固体（アミノ基を含む無機多孔質担体）として得た。ＣＰＧの物性とともにアミノ基量を表２に記す。
実施例１０の方法において、ＣＰＧ（６．９０ｇ）、トルエン（４６．２ｍＬ）、［３－（６－Ａｍｉｎｏｈｅｘｙｌａｍｉｎｏ）－ｐｒｏｐｙｌ］ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ（５８μＬ，２０４．１μｍｏｌ）を使用する以外は、実施例１０と同様の方法で、アミノ基修飾したＣＰＧを白色粉末状固体（アミノ基を含む無機多孔質担体）として得た。ＣＰＧの物性とともにアミノ基量を表２に記す。
【0079】
（実施例１４）アミノ基修飾
実施例１０の方法において、ＣＰＧ（６．９２ｇ）、トルエン（４６．３ｍＬ）、［３－（６－Ａｍｉｎｏｈｅｘｙｌａｍｉｎｏ）－ｐｒｏｐｙｌ］ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ（５８μＬ，２０４．１μｍｏｌ）とＴｒｉｍｅｔｈｏｘｙ（ｍｅｔｈｙｌ）ｓｉｌａｎｅ（８７．０μＬ，６１３．１μｍｏｌ）とを用いる以外は、実施例１０と同様の方法で、アミノ基修飾したＣＰＧを白色粉末状固体（アミノ基を含む無機多孔質担体）として得た。ＣＰＧの物性とともにアミノ基量を表２に記す。
実施例１０の方法において、ＣＰＧ（６．９２ｇ）、トルエン（４６．３ｍＬ）、［３－（６－Ａｍｉｎｏｈｅｘｙｌａｍｉｎｏ）－ｐｒｏｐｙｌ］ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ（５８μＬ，２０４．１μｍｏｌ）とＴｒｉｍｅｔｈｏｘｙ（ｍｅｔｈｙｌ）ｓｉｌａｎｅ（８７．０μＬ，６１３．１μｍｏｌ）とを用いる以外は、実施例１０と同様の方法で、アミノ基修飾したＣＰＧを白色粉末状固体（アミノ基を含む無機多孔質担体）として得た。ＣＰＧの物性とともにアミノ基量を表２に記す。
【0080】
（実施例１５）アミノ基修飾
実施例１０の方法において、ＣＰＧ（６．８２ｇ）、トルエン（５２．５ｍＬ）、［３－（６－Ａｍｉｎｏｈｅｘｙｌａｍｉｎｏ）－ｐｒｏｐｙｌ］ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ（４６μＬ，１６３．３μｍｏｌ）を使用する以外は、実施例１０と同様の方法で、アミノ基修飾したＣＰＧを白色粉末状固体（アミノ基を含む無機多孔質担体）として得た。ＣＰＧの物性とともにアミノ基量を表２に記す。
実施例１０の方法において、ＣＰＧ（６．８２ｇ）、トルエン（５２．５ｍＬ）、［３－（６－Ａｍｉｎｏｈｅｘｙｌａｍｉｎｏ）－ｐｒｏｐｙｌ］ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ（４６μＬ，１６３．３μｍｏｌ）を使用する以外は、実施例１０と同様の方法で、アミノ基修飾したＣＰＧを白色粉末状固体（アミノ基を含む無機多孔質担体）として得た。ＣＰＧの物性とともにアミノ基量を表２に記す。
【0081】
（実施例１６）アミノ基修飾
実施例１０の方法において、ＣＰＧ（６．８７ｇ）、トルエン（４５．９ｍＬ）、［３－（６－Ａｍｉｎｏｈｅｘｙｌａｍｉｎｏ）－ｐｒｏｐｙｌ］ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ（４４μＬ，１５３．８μｍｏｌ）とＴｒｉｍｅｔｈｏｘｙ（ｍｅｔｈｙｌ）ｓｉｌａｎｅ（２９μＬ，２０５．１μｍｏｌ）とを使用する以外は、実施例１０と同様の方法で、アミノ基修飾したＣＰＧを白色粉末状固体（アミノ基を含む無機多孔質担体）として得た。ＣＰＧの物性とともにアミノ基量を表２に記す。
実施例１０の方法において、ＣＰＧ（６．８７ｇ）、トルエン（４５．９ｍＬ）、［３－（６－Ａｍｉｎｏｈｅｘｙｌａｍｉｎｏ）－ｐｒｏｐｙｌ］ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ（４４μＬ，１５３．８μｍｏｌ）とＴｒｉｍｅｔｈｏｘｙ（ｍｅｔｈｙｌ）ｓｉｌａｎｅ（２９μＬ，２０５．１μｍｏｌ）とを使用する以外は、実施例１０と同様の方法で、アミノ基修飾したＣＰＧを白色粉末状固体（アミノ基を含む無機多孔質担体）として得た。ＣＰＧの物性とともにアミノ基量を表２に記す。
【0082】
（実施例１７）アミノ基修飾
実施例１０の方法において、ＣＰＧ（６．９５ｇ）、トルエン（４６．５ｍＬ）、［３－（６－Ａｍｉｎｏｈｅｘｙｌａｍｉｎｏ）－ｐｒｏｐｙｌ］ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ（８１．５μＬ，２８６．８μｍｏｌ）を使用する以外は、実施例１０と同様の方法で、アミノ基修飾したＣＰＧを白色粉末状固体（アミノ基を含む無機多孔質担体）として得た。ＣＰＧの物性とともにアミノ基量を表２に記す。
実施例１０の方法において、ＣＰＧ（６．９５ｇ）、トルエン（４６．５ｍＬ）、［３－（６－Ａｍｉｎｏｈｅｘｙｌａｍｉｎｏ）－ｐｒｏｐｙｌ］ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ（８１．５μＬ，２８６．８μｍｏｌ）を使用する以外は、実施例１０と同様の方法で、アミノ基修飾したＣＰＧを白色粉末状固体（アミノ基を含む無機多孔質担体）として得た。ＣＰＧの物性とともにアミノ基量を表２に記す。
【0083】
（比較例１、２）
比較例１及び２の無機多孔質担体として、表１に記載のとおりのアミノ基量でＬｃａａ（Ｃ９）を担持したＣＰＧをそれぞれ使用した。
比較例１及び２の無機多孔質担体として、表１に記載のとおりのアミノ基量でＬｃａａ（Ｃ９）を担持したＣＰＧをそれぞれ使用した。
【0084】
（比較例３）アミノ基修飾
表１に記載のとおりの物性を有するＣＰＧ（６．１７ｇ）を、２００ｍＬ４つ口フラスコに入れ、トルエン（４１．１ｍＬ）を加えた。更に［３－（６－Ａｍｉｎｏｈｅｘｙｌａｍｉｎｏ）－ｐｒｏｐｙｌ］ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ（２３８μＬ，８３７．６μｍｏｌ）を加え、４時間１１０℃で加熱還流した。その後、室温まで冷却した反応液を濾過除去し、トルエン、メタノール、水で順次洗浄した後、１Ｎ塩酸で中和した。更に、中和液を濾過除去後、水、メタノールで順次洗浄し、減圧下で乾燥させ、アミノ基修飾したＣＰＧを白色粉末状固体（アミノ基を含む無機多孔質担体）として得た。ＣＰＧの物性とともにアミノ基量を表１に記す。
表１に記載のとおりの物性を有するＣＰＧ（６．１７ｇ）を、２００ｍＬ４つ口フラスコに入れ、トルエン（４１．１ｍＬ）を加えた。更に［３－（６－Ａｍｉｎｏｈｅｘｙｌａｍｉｎｏ）－ｐｒｏｐｙｌ］ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ（２３８μＬ，８３７．６μｍｏｌ）を加え、４時間１１０℃で加熱還流した。その後、室温まで冷却した反応液を濾過除去し、トルエン、メタノール、水で順次洗浄した後、１Ｎ塩酸で中和した。更に、中和液を濾過除去後、水、メタノールで順次洗浄し、減圧下で乾燥させ、アミノ基修飾したＣＰＧを白色粉末状固体（アミノ基を含む無機多孔質担体）として得た。ＣＰＧの物性とともにアミノ基量を表１に記す。
【0085】
（比較例４）アミノ基修飾
ＣＰＧ（７．００ｇ）を、２００ｍＬ４つ口フラスコに入れ、トルエン（５３．９ｍＬ）を加えた。更に３－（Ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌｙｌ）ｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｅ（３３５．０μＬ，１９０５．９μｍｏｌ）を加え、４時間１１０℃で加熱還流した。その後、室温まで冷却した反応液を濾過除去し、トルエン、メタノール、水で順次洗浄した後、１Ｎ塩酸で中和した。更に、中和液を濾過除去後、水、メタノールで順次洗浄し、減圧下で乾燥させ、アミノ基修飾したＣＰＧを白色粉末状固体（アミノ基を含む無機多孔質担体）として得た。ＣＰＧの物性とともにアミノ基量を表１に記す。
ＣＰＧ（７．００ｇ）を、２００ｍＬ４つ口フラスコに入れ、トルエン（５３．９ｍＬ）を加えた。更に３－（Ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌｙｌ）ｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｅ（３３５．０μＬ，１９０５．９μｍｏｌ）を加え、４時間１１０℃で加熱還流した。その後、室温まで冷却した反応液を濾過除去し、トルエン、メタノール、水で順次洗浄した後、１Ｎ塩酸で中和した。更に、中和液を濾過除去後、水、メタノールで順次洗浄し、減圧下で乾燥させ、アミノ基修飾したＣＰＧを白色粉末状固体（アミノ基を含む無機多孔質担体）として得た。ＣＰＧの物性とともにアミノ基量を表１に記す。
【0086】
（比較例５）アミノ基修飾
表２に記載のとおりの物性を有するＣＰＧ（５．００ｇ）を、２００ｍＬ４つ口フラスコに入れ、トルエン（３３．５ｍＬ）を加えた。更に［３－（６－Ａｍｉｎｏｈｅｘｙｌａｍｉｎｏ）－ｐｒｏｐｙｌ］ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ（２８６μＬ，１００６．４μｍｏｌ）を加え、４時間１１０℃で加熱還流した。その後、室温まで冷却した反応液を濾過除去し、トルエン、メタノール、水で順次洗浄した後、１Ｎ塩酸で中和した。更に、中和液を濾過除去後、水、メタノールで順次洗浄し、減圧下で乾燥させ、アミノ基修飾したＣＰＧを白色粉末状固体（アミノ基を含む無機多孔質担体）として得た。ＣＰＧの物性とともにアミノ基量を表２に記す。
表２に記載のとおりの物性を有するＣＰＧ（５．００ｇ）を、２００ｍＬ４つ口フラスコに入れ、トルエン（３３．５ｍＬ）を加えた。更に［３－（６－Ａｍｉｎｏｈｅｘｙｌａｍｉｎｏ）－ｐｒｏｐｙｌ］ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ（２８６μＬ，１００６．４μｍｏｌ）を加え、４時間１１０℃で加熱還流した。その後、室温まで冷却した反応液を濾過除去し、トルエン、メタノール、水で順次洗浄した後、１Ｎ塩酸で中和した。更に、中和液を濾過除去後、水、メタノールで順次洗浄し、減圧下で乾燥させ、アミノ基修飾したＣＰＧを白色粉末状固体（アミノ基を含む無機多孔質担体）として得た。ＣＰＧの物性とともにアミノ基量を表２に記す。
【0087】
（比較例６）アミノ基修飾
表２に記載のとおりの物性を有するＣＰＧ（５．０９ｇ）を、２００ｍＬ４つ口フラスコに入れ、トルエン（３３．５ｍＬ）を加えた。更に［３－（６－Ａｍｉｎｏｈｅｘｙｌａｍｉｎｏ）－ｐｒｏｐｙｌ］ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ（１８６μＬ，６５２．８μｍｏｌ）を加え、４時間１１０℃で加熱還流した。その後、室温まで冷却した反応液を濾過除去し、トルエン、メタノール、水で順次洗浄した後、１Ｎ塩酸で中和した。更に、中和液を濾過除去後、水、メタノールで順次洗浄し、減圧下で乾燥させ、アミノ基修飾したＣＰＧを白色粉末状固体（アミノ基を含む無機多孔質担体）として得た。ＣＰＧの物性とともにアミノ基量を表２に記す。
表２に記載のとおりの物性を有するＣＰＧ（５．０９ｇ）を、２００ｍＬ４つ口フラスコに入れ、トルエン（３３．５ｍＬ）を加えた。更に［３－（６－Ａｍｉｎｏｈｅｘｙｌａｍｉｎｏ）－ｐｒｏｐｙｌ］ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ（１８６μＬ，６５２．８μｍｏｌ）を加え、４時間１１０℃で加熱還流した。その後、室温まで冷却した反応液を濾過除去し、トルエン、メタノール、水で順次洗浄した後、１Ｎ塩酸で中和した。更に、中和液を濾過除去後、水、メタノールで順次洗浄し、減圧下で乾燥させ、アミノ基修飾したＣＰＧを白色粉末状固体（アミノ基を含む無機多孔質担体）として得た。ＣＰＧの物性とともにアミノ基量を表２に記す。
【0088】
［比表面積当たりのアミノ基担持量（（Ｉ×Ｒ）／Ｓ）］
〔アミノ基担持量Ｉの測定〕
上記測定方法１の方法に従って、実施例１～１７、比較例１～６の無機多孔質担体のアミノ基担持量を測定した。その結果を「アミノ基量Ｉ」として表１及び表２に示した。
〔アミノ基担持量Ｉの測定〕
上記測定方法１の方法に従って、実施例１～１７、比較例１～６の無機多孔質担体のアミノ基担持量を測定した。その結果を「アミノ基量Ｉ」として表１及び表２に示した。
【0089】
〔ＣＰＧの比表面積の測定〕
上記測定方法２の方法に従って、実施例１～１７、比較例１～６の無機多孔質担体に用いたＣＰＧの比表面積を測定した。その結果を「比表面積Ｓ」として表１及び表２に示した。
上記測定方法２の方法に従って、実施例１～１７、比較例１～６の無機多孔質担体に用いたＣＰＧの比表面積を測定した。その結果を「比表面積Ｓ」として表１及び表２に示した。
【0090】
〔比表面積当たりの第１級アミノ基量（（Ｉ×Ｒ）／Ｓ）の算出〕
上記測定されたアミノ基担持量Ｉ及びＣＰＧの比表面積Ｓから、実施例１～１７、比較例１～６の比表面積当たりのアミノ基担持量（（Ｉ×Ｒ）／Ｓ）それぞれ算出した。その結果を「比表面積当たりの１級アミノ基量（（Ｉ×Ｒ）／Ｓ）」として表１及び表２に示した。なお、実施例１～１１、１３～１７、及び比較例１～３、５、６では、アミノ基担持用リンカーとして用いたＬｃａａ（Ｃ９）を用いており、無機多孔質担体に含まれる全アミノ基中の第１級アミノ基の割合Ｒは、１／２（すなわち０．５）である。また、実施例１２及び比較例４では、アミノ基担持用リンカーとして用いたＡｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌを用いており、無機多孔質担体に含まれる全アミノ基中の第１級アミノ基の割合Ｒは、１／１（すなわち１）である。
上記測定されたアミノ基担持量Ｉ及びＣＰＧの比表面積Ｓから、実施例１～１７、比較例１～６の比表面積当たりのアミノ基担持量（（Ｉ×Ｒ）／Ｓ）それぞれ算出した。その結果を「比表面積当たりの１級アミノ基量（（Ｉ×Ｒ）／Ｓ）」として表１及び表２に示した。なお、実施例１～１１、１３～１７、及び比較例１～３、５、６では、アミノ基担持用リンカーとして用いたＬｃａａ（Ｃ９）を用いており、無機多孔質担体に含まれる全アミノ基中の第１級アミノ基の割合Ｒは、１／２（すなわち０．５）である。また、実施例１２及び比較例４では、アミノ基担持用リンカーとして用いたＡｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌを用いており、無機多孔質担体に含まれる全アミノ基中の第１級アミノ基の割合Ｒは、１／１（すなわち１）である。
【0091】
＜無機多孔質担体へのヌクレオシドの担持＞
（実施例１の無機多孔質担体）
ｒＧ－ｓｕｃｃｉｎａｔｅ １５４．９ｍｇ、ＨＢＴＵ（1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-benzotriazolium 3-Oxide Hexafluorophosphate） ６３．１ｍｇ、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン３９．５μＬおよびアセトニトリル１２ｍＬを混合し、アミノ基を担持した、実施例１の無機多孔質担体約３．０ｇを加えた。２５℃で２０時間静置した後ろ過し、固体をアセトニトリル１００ｍＬで洗浄した。洗浄後の固体に０．３５ｍｏｌ／Ｌ フェノキシ酢酸無水物溶液（テトラヒドロフラン／ピリジン混合溶媒、容量比８／１）２５ｍＬを加えた。３時間静置した後にろ過し、固体をアセトニトリル１００ｍＬで洗浄した後、乾燥して、ヌクレオシドを担持したＣＰＧを白色粉末状固体（ヌクレオシドを含む無機多孔質担体）として得た。
（実施例１の無機多孔質担体）
ｒＧ－ｓｕｃｃｉｎａｔｅ １５４．９ｍｇ、ＨＢＴＵ（1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-benzotriazolium 3-Oxide Hexafluorophosphate） ６３．１ｍｇ、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン３９．５μＬおよびアセトニトリル１２ｍＬを混合し、アミノ基を担持した、実施例１の無機多孔質担体約３．０ｇを加えた。２５℃で２０時間静置した後ろ過し、固体をアセトニトリル１００ｍＬで洗浄した。洗浄後の固体に０．３５ｍｏｌ／Ｌ フェノキシ酢酸無水物溶液（テトラヒドロフラン／ピリジン混合溶媒、容量比８／１）２５ｍＬを加えた。３時間静置した後にろ過し、固体をアセトニトリル１００ｍＬで洗浄した後、乾燥して、ヌクレオシドを担持したＣＰＧを白色粉末状固体（ヌクレオシドを含む無機多孔質担体）として得た。
【0092】
（実施例２の無機多孔質担体）
上記実施例１の無機多孔質担体で用いた方法において、ｒＧ－ｓｕｃｃｉｎａｔｅ １７４．１ｍｇ、ＨＢＴＵ ８４．０ｍｇ、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン７２．３μＬおよびアセトニトリル１２ｍＬを混合し、アミノ基を担持した、実施例２の無機多孔質担体約３．０ｇを用いる以外は、実施例１の無機多孔質担体で用いた方法と同様の方法で、ヌクレオシドを担持したＣＰＧを白色粉末状固体（ヌクレオシドを含む無機多孔質担体）として得た。
上記実施例１の無機多孔質担体で用いた方法において、ｒＧ－ｓｕｃｃｉｎａｔｅ １７４．１ｍｇ、ＨＢＴＵ ８４．０ｍｇ、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン７２．３μＬおよびアセトニトリル１２ｍＬを混合し、アミノ基を担持した、実施例２の無機多孔質担体約３．０ｇを用いる以外は、実施例１の無機多孔質担体で用いた方法と同様の方法で、ヌクレオシドを担持したＣＰＧを白色粉末状固体（ヌクレオシドを含む無機多孔質担体）として得た。
【0093】
（実施例３の無機多孔質担体）
実施例１の無機多孔質担体で用いた方法において、ｒＧ－ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ２２４．５ｍｇ、ＨＢＴＵ １００．６ｍｇ、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン８６．１μＬおよびアセトニトリル１２ｍＬを混合し、アミノ基を担持した、実施例３の無機多孔質担体約３．０ｇを用いる以外は、実施例１の無機多孔質担体で用いた方法と同様の方法で、ヌクレオシドを担持したＣＰＧを白色粉末状固体（ヌクレオシドを含む無機多孔質担体）として得た。
実施例１の無機多孔質担体で用いた方法において、ｒＧ－ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ２２４．５ｍｇ、ＨＢＴＵ １００．６ｍｇ、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン８６．１μＬおよびアセトニトリル１２ｍＬを混合し、アミノ基を担持した、実施例３の無機多孔質担体約３．０ｇを用いる以外は、実施例１の無機多孔質担体で用いた方法と同様の方法で、ヌクレオシドを担持したＣＰＧを白色粉末状固体（ヌクレオシドを含む無機多孔質担体）として得た。
【0094】
（実施例４の無機多孔質担体）
実施例１の無機多孔質担体で用いた方法において、ｒＧ－ｓｕｃｃｉｎａｔｅ １１４．３ｍｇ、ＨＢＴＵ ４６．７ｍｇ、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン２４．０μＬおよびアセトニトリル１２ｍＬを混合し、アミノ基を担持した、実施例４の無機多孔質担体約３．０ｇを用いる以外は、実施例１の無機多孔質担体で用いた方法と同様の方法で、ヌクレオシドを担持したＣＰＧを白色粉末状固体（ヌクレオシドを含む無機多孔質担体）として得た。
実施例１の無機多孔質担体で用いた方法において、ｒＧ－ｓｕｃｃｉｎａｔｅ １１４．３ｍｇ、ＨＢＴＵ ４６．７ｍｇ、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン２４．０μＬおよびアセトニトリル１２ｍＬを混合し、アミノ基を担持した、実施例４の無機多孔質担体約３．０ｇを用いる以外は、実施例１の無機多孔質担体で用いた方法と同様の方法で、ヌクレオシドを担持したＣＰＧを白色粉末状固体（ヌクレオシドを含む無機多孔質担体）として得た。
【0095】
（実施例５の無機多孔質担体）
実施例１の無機多孔質担体で用いた方法において、ｒＧ－ｓｕｃｃｉｎａｔｅ １６０．０ｍｇ、ＨＢＴＵ ６５．７ｍｇ、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン３２．９μＬおよびアセトニトリル１２ｍＬを混合し、アミノ基を担持した、実施例５の無機多孔質担体約３．０ｇを用いる以外は、実施例１の無機多孔質担体で用いた方法と同様の方法で、ヌクレオシドを担持したＣＰＧを白色粉末状固体（ヌクレオシドを含む無機多孔質担体）として得た。
実施例１の無機多孔質担体で用いた方法において、ｒＧ－ｓｕｃｃｉｎａｔｅ １６０．０ｍｇ、ＨＢＴＵ ６５．７ｍｇ、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン３２．９μＬおよびアセトニトリル１２ｍＬを混合し、アミノ基を担持した、実施例５の無機多孔質担体約３．０ｇを用いる以外は、実施例１の無機多孔質担体で用いた方法と同様の方法で、ヌクレオシドを担持したＣＰＧを白色粉末状固体（ヌクレオシドを含む無機多孔質担体）として得た。
【0096】
（実施例６の無機多孔質担体）
実施例１の無機多孔質担体で用いた方法において、ｒＧ－ｓｕｃｃｉｎａｔｅ １９３．２ｍｇ、ＨＢＴＵ ９３．４ｍｇ、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン８０．０μＬおよびアセトニトリル１２ｍＬを混合し、アミノ基を担持した、実施例６の無機多孔質担体約３．０ｇを用いる以外は、実施例１の無機多孔質担体で用いた方法と同様の方法で、ヌクレオシドを担持したＣＰＧを白色粉末状固体（ヌクレオシドを含む無機多孔質担体）として得た。
実施例１の無機多孔質担体で用いた方法において、ｒＧ－ｓｕｃｃｉｎａｔｅ １９３．２ｍｇ、ＨＢＴＵ ９３．４ｍｇ、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン８０．０μＬおよびアセトニトリル１２ｍＬを混合し、アミノ基を担持した、実施例６の無機多孔質担体約３．０ｇを用いる以外は、実施例１の無機多孔質担体で用いた方法と同様の方法で、ヌクレオシドを担持したＣＰＧを白色粉末状固体（ヌクレオシドを含む無機多孔質担体）として得た。
【0097】
（実施例７の無機多孔質担体）
実施例１の無機多孔質担体で用いた方法において、ｒＧ－ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ２０６．２ｍｇ、ＨＢＴＵ ９２．８ｍｇ、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン７９．３μＬおよびアセトニトリル１２ｍＬを混合し、アミノ基を担持した、実施例７の無機多孔質担体約３．０ｇを用いる以外は、実施例１の無機多孔質担体で用いた方法と同様の方法で、ヌクレオシドを担持したＣＰＧを白色粉末状固体（ヌクレオシドを含む無機多孔質担体）として得た。
実施例１の無機多孔質担体で用いた方法において、ｒＧ－ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ２０６．２ｍｇ、ＨＢＴＵ ９２．８ｍｇ、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン７９．３μＬおよびアセトニトリル１２ｍＬを混合し、アミノ基を担持した、実施例７の無機多孔質担体約３．０ｇを用いる以外は、実施例１の無機多孔質担体で用いた方法と同様の方法で、ヌクレオシドを担持したＣＰＧを白色粉末状固体（ヌクレオシドを含む無機多孔質担体）として得た。
【0098】
（実施例８の無機多孔質担体）
実施例１無機多孔質担体で用いた方法において、ｒＧ－ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ２１１．２ｍｇ、ＨＢＴＵ ９４．８ｍｇ、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン８１．１μＬおよびアセトニトリル１２ｍＬを混合し、アミノ基を担持した、実施例８の無機多孔質担体約３．０ｇを用いる以外は、実施例１の無機多孔質担体で用いた方法と同様の方法で、ヌクレオシドを担持したＣＰＧを白色粉末状固体（ヌクレオシドを含む無機多孔質担体）として得た。
実施例１無機多孔質担体で用いた方法において、ｒＧ－ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ２１１．２ｍｇ、ＨＢＴＵ ９４．８ｍｇ、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン８１．１μＬおよびアセトニトリル１２ｍＬを混合し、アミノ基を担持した、実施例８の無機多孔質担体約３．０ｇを用いる以外は、実施例１の無機多孔質担体で用いた方法と同様の方法で、ヌクレオシドを担持したＣＰＧを白色粉末状固体（ヌクレオシドを含む無機多孔質担体）として得た。
【0099】
（実施例９の無機多孔質担体）
実施例１の無機多孔質担体で用いた方法において、ｒＧ－ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ２５１．９ｍｇ、ＨＢＴＵ １１３．２ｍｇ、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン９６．７μＬおよびアセトニトリル１２ｍＬを混合し、アミノ基を担持した、実施例９の無機多孔質担体約３．０ｇを用いる以外は、実施例１の無機多孔質担体で用いた方法と同様の方法で、ヌクレオシドを担持したＣＰＧを白色粉末状固体（ヌクレオシドを含む無機多孔質担体）として得た。
実施例１の無機多孔質担体で用いた方法において、ｒＧ－ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ２５１．９ｍｇ、ＨＢＴＵ １１３．２ｍｇ、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン９６．７μＬおよびアセトニトリル１２ｍＬを混合し、アミノ基を担持した、実施例９の無機多孔質担体約３．０ｇを用いる以外は、実施例１の無機多孔質担体で用いた方法と同様の方法で、ヌクレオシドを担持したＣＰＧを白色粉末状固体（ヌクレオシドを含む無機多孔質担体）として得た。
【0100】
（実施例１０の無機多孔質担体）
実施例１の無機多孔質担体で用いた方法において、ｒＧ－ｓｕｃｃｉｎａｔｅ １３５．４ｍｇ、ＨＢＴＵ ５６．０ｍｇ、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン３５．０μＬおよびアセトニトリル１２ｍＬを混合し、アミノ基を担持した、実施例１０の無機多孔質担体約２．５ｇを用いる以外は、実施例１の無機多孔質担体で用いた方法と同様の方法で、ヌクレオシドを担持したＣＰＧを白色粉末状固体（ヌクレオシドを含む無機多孔質担体）として得た。
実施例１の無機多孔質担体で用いた方法において、ｒＧ－ｓｕｃｃｉｎａｔｅ １３５．４ｍｇ、ＨＢＴＵ ５６．０ｍｇ、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン３５．０μＬおよびアセトニトリル１２ｍＬを混合し、アミノ基を担持した、実施例１０の無機多孔質担体約２．５ｇを用いる以外は、実施例１の無機多孔質担体で用いた方法と同様の方法で、ヌクレオシドを担持したＣＰＧを白色粉末状固体（ヌクレオシドを含む無機多孔質担体）として得た。
【0101】
（実施例１１の無機多孔質担体）
実施例１の無機多孔質担体で用いた方法において、ｒＧ－ｓｕｃｃｉｎａｔｅ １６１．９ｍｇ、ＨＢＴＵ ６８．０ｍｇ、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン４５．０μＬおよびアセトニトリル１２ｍＬを混合し、アミノ基を担持した、実施例１１の無機多孔質担体約２．５ｇを用いる以外は、実施例１の無機多孔質担体で用いた方法と同様の方法で、ヌクレオシドを担持したＣＰＧを白色粉末状固体（ヌクレオシドを含む無機多孔質担体）として得た。
実施例１の無機多孔質担体で用いた方法において、ｒＧ－ｓｕｃｃｉｎａｔｅ １６１．９ｍｇ、ＨＢＴＵ ６８．０ｍｇ、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン４５．０μＬおよびアセトニトリル１２ｍＬを混合し、アミノ基を担持した、実施例１１の無機多孔質担体約２．５ｇを用いる以外は、実施例１の無機多孔質担体で用いた方法と同様の方法で、ヌクレオシドを担持したＣＰＧを白色粉末状固体（ヌクレオシドを含む無機多孔質担体）として得た。
【0102】
（実施例１２の無機多孔質担体）
ｒＧ－ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ２５９．４ｍｇ、ＨＢＴＵ ９６．８ｍｇ、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン６５．０μＬおよびアセトニトリル１５ｍＬを混合し、アミノ基を担持した、実施例１２の無機多孔質担体２．３１ｇを加えた。２５℃で２１時間静置した後ろ過し、固体をアセトニトリル８０ｍＬで洗浄した。洗浄後の固体に０．３５ｍｏｌ／Ｌ フェノキシ酢酸無水物溶液（テトラヒドロフラン／ピリジン混合溶媒、容量比８／１）４６ｍＬを加えた。３時間静置した後にろ過し、固体をアセトニトリル８０ｍＬで洗浄した後、乾燥して、ヌクレオシドを担持したＣＰＧを白色粉末状固体（ヌクレオシドを含む無機多孔質担体）として得た。
ｒＧ－ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ２５９．４ｍｇ、ＨＢＴＵ ９６．８ｍｇ、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン６５．０μＬおよびアセトニトリル１５ｍＬを混合し、アミノ基を担持した、実施例１２の無機多孔質担体２．３１ｇを加えた。２５℃で２１時間静置した後ろ過し、固体をアセトニトリル８０ｍＬで洗浄した。洗浄後の固体に０．３５ｍｏｌ／Ｌ フェノキシ酢酸無水物溶液（テトラヒドロフラン／ピリジン混合溶媒、容量比８／１）４６ｍＬを加えた。３時間静置した後にろ過し、固体をアセトニトリル８０ｍＬで洗浄した後、乾燥して、ヌクレオシドを担持したＣＰＧを白色粉末状固体（ヌクレオシドを含む無機多孔質担体）として得た。
【0103】
（比較例１の無機多孔質担体）
実施例１の無機多孔質担体で用いた方法において、ｒＧ－ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ２８６．０ｍｇ、ＨＢＴＵ １２８．１ｍｇ、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン１０９．４μＬおよびアセトニトリル１２ｍＬを混合し、アミノ基を担持した、比較例１の無機多孔質担体約３．０ｇを用いる以外は、実施例１の無機多孔質担体で用いた方法と同様の方法で、ヌクレオシドを担持したＣＰＧを白色粉末状固体（ヌクレオシドを含む無機多孔質担体）として得た。
実施例１の無機多孔質担体で用いた方法において、ｒＧ－ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ２８６．０ｍｇ、ＨＢＴＵ １２８．１ｍｇ、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン１０９．４μＬおよびアセトニトリル１２ｍＬを混合し、アミノ基を担持した、比較例１の無機多孔質担体約３．０ｇを用いる以外は、実施例１の無機多孔質担体で用いた方法と同様の方法で、ヌクレオシドを担持したＣＰＧを白色粉末状固体（ヌクレオシドを含む無機多孔質担体）として得た。
【0104】
（比較例２の無機多孔質担体）
実施例１の無機多孔質担体で用いた方法において、ｒＧ－ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ９４．２ｍｇ、ＨＢＴＵ ４２．２ｍｇ、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン３６．１μＬおよびアセトニトリル１２ｍＬを混合し、アミノ基を担持した、比較例２の無機多孔質担体約３．０ｇを用いる以外は、実施例１の無機多孔質担体で用いた方法と同様の方法で、ヌクレオシドを担持したＣＰＧを白色粉末状固体（ヌクレオシドを含む無機多孔質担体）として得た。
実施例１の無機多孔質担体で用いた方法において、ｒＧ－ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ９４．２ｍｇ、ＨＢＴＵ ４２．２ｍｇ、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン３６．１μＬおよびアセトニトリル１２ｍＬを混合し、アミノ基を担持した、比較例２の無機多孔質担体約３．０ｇを用いる以外は、実施例１の無機多孔質担体で用いた方法と同様の方法で、ヌクレオシドを担持したＣＰＧを白色粉末状固体（ヌクレオシドを含む無機多孔質担体）として得た。
【0105】
（比較例３の無機多孔質担体）
実施例１の無機多孔質担体で用いた方法において、ｒＧ－ｓｕｃｃｉｎａｔｅ １２３．３ｍｇ、ＨＢＴＵ ５０．２ｍｇ、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン３５．０μＬおよびアセトニトリル１２ｍＬを混合し、アミノ基を担持した、比較例３の無機多孔質担体約２．５ｇを用いる以外は、実施例１の無機多孔質担体で用いた方法と同様の方法で、ヌクレオシドを担持したＣＰＧを白色粉末状固体（ヌクレオシドを含む無機多孔質担体）として得た。
実施例１の無機多孔質担体で用いた方法において、ｒＧ－ｓｕｃｃｉｎａｔｅ １２３．３ｍｇ、ＨＢＴＵ ５０．２ｍｇ、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン３５．０μＬおよびアセトニトリル１２ｍＬを混合し、アミノ基を担持した、比較例３の無機多孔質担体約２．５ｇを用いる以外は、実施例１の無機多孔質担体で用いた方法と同様の方法で、ヌクレオシドを担持したＣＰＧを白色粉末状固体（ヌクレオシドを含む無機多孔質担体）として得た。
【0106】
（比較例４の無機多孔質担体）
ｒＧ－ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ６７６．７ｍｇ、ＨＢＴＵ ２５１．２ｍｇ、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン１７０．０μＬおよびアセトニトリル１５ｍＬを混合し、アミノ基を担持した、比較例４の無機多孔質担体３．００ｇを加えた。２５℃で１８時間静置した後ろ過し、固体をアセトニトリル１００ｍＬで洗浄した。洗浄後の固体に０．３５ｍｏｌ／Ｌ フェノキシ酢酸無水物溶液（テトラヒドロフラン／ピリジン混合溶媒、容量比８／１）６０ｍＬを加えた。３時間静置した後にろ過し、固体をアセトニトリル１００ｍＬで洗浄した後、乾燥して、ヌクレオシドを担持したＣＰＧを白色粉末状固体（ヌクレオシドを含む無機多孔質担体）として得た。
ｒＧ－ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ６７６．７ｍｇ、ＨＢＴＵ ２５１．２ｍｇ、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン１７０．０μＬおよびアセトニトリル１５ｍＬを混合し、アミノ基を担持した、比較例４の無機多孔質担体３．００ｇを加えた。２５℃で１８時間静置した後ろ過し、固体をアセトニトリル１００ｍＬで洗浄した。洗浄後の固体に０．３５ｍｏｌ／Ｌ フェノキシ酢酸無水物溶液（テトラヒドロフラン／ピリジン混合溶媒、容量比８／１）６０ｍＬを加えた。３時間静置した後にろ過し、固体をアセトニトリル１００ｍＬで洗浄した後、乾燥して、ヌクレオシドを担持したＣＰＧを白色粉末状固体（ヌクレオシドを含む無機多孔質担体）として得た。
【0107】
上記で使用したｒＧ－ｓｕｃｃｉｎａｔｅの構造を以下に示す。
［式中、Ｒは、水素原子、ピリジン塩（＝ピリジン＋Ｈ）、又はトリエチルアミン塩（＝トリエチルアミン＋Ｈ）を表し、Ｍｅはメチル基を表し、Ｐｈはフェニル基を表し、ＴＢＤＭＳはｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基を表す。］
【化8】
【0108】
（実施例１３の無機多孔質担体）
ｒＵ－ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ９３．０ｍｇ、ＨＢＴＵ ４７．１ｍｇ、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン３１．０μＬおよびアセトニトリル１２ｍＬを混合し、アミノ基を担持した、実施例１３の無機多孔質担体２．５０ｇを加えた。２５℃で１８時間静置した後ろ過し、固体をアセトニトリル８３ｍＬで洗浄した。洗浄後の固体に１０％酢酸無水物溶液（８０％ＴＨＦ／１０％ピリジン混合溶媒）１３ｍＬと１６％ＮＭＩ（１－Ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ）８４％ＴＨＦ溶液１３ｍＬを加えた。１時間静置した後にろ過し、固体をアセトニトリル８３ｍＬで洗浄した後、乾燥して、ヌクレオシドを担持したＣＰＧを白色粉末状固体（ヌクレオシドを含む無機多孔質担体）として得た。
ｒＵ－ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ９３．０ｍｇ、ＨＢＴＵ ４７．１ｍｇ、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン３１．０μＬおよびアセトニトリル１２ｍＬを混合し、アミノ基を担持した、実施例１３の無機多孔質担体２．５０ｇを加えた。２５℃で１８時間静置した後ろ過し、固体をアセトニトリル８３ｍＬで洗浄した。洗浄後の固体に１０％酢酸無水物溶液（８０％ＴＨＦ／１０％ピリジン混合溶媒）１３ｍＬと１６％ＮＭＩ（１－Ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ）８４％ＴＨＦ溶液１３ｍＬを加えた。１時間静置した後にろ過し、固体をアセトニトリル８３ｍＬで洗浄した後、乾燥して、ヌクレオシドを担持したＣＰＧを白色粉末状固体（ヌクレオシドを含む無機多孔質担体）として得た。
【0109】
（実施例１４の無機多孔質担体）
実施例１３の無機多孔質担体で用いた方法において、ｒＵ－ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ８９．１ｍｇ、ＨＢＴＵ ４４．５ｍｇ、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン２９．３μＬおよびアセトニトリル１２ｍＬを混合し、アミノ基を担持した、実施例１４の無機多孔質担体２．５０ｇを用いる以外は、実施例１３と同様の方法で、ヌクレオシドを担持したＣＰＧを白色粉末状固体（ヌクレオシドを含む無機多孔質担体）として得た。
実施例１３の無機多孔質担体で用いた方法において、ｒＵ－ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ８９．１ｍｇ、ＨＢＴＵ ４４．５ｍｇ、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン２９．３μＬおよびアセトニトリル１２ｍＬを混合し、アミノ基を担持した、実施例１４の無機多孔質担体２．５０ｇを用いる以外は、実施例１３と同様の方法で、ヌクレオシドを担持したＣＰＧを白色粉末状固体（ヌクレオシドを含む無機多孔質担体）として得た。
【0110】
（実施例１５の無機多孔質担体）
実施例１３の無機多孔質担体で用いた方法において、ｒＵ－ｓｕｃｃｉｎａｔｅ １３３．４ｍｇ、ＨＢＴＵ ６６．９ｍｇ、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン３９．２μＬおよびアセトニトリル１２ｍＬを混合し、アミノ基を担持した、実施例１５の無機多孔質担体２．５０ｇを用いる以外は、実施例１３の無機多孔質担体で用いた方法と同様の方法で、ヌクレオシドを担持したＣＰＧを白色粉末状固体（ヌクレオシドを含む無機多孔質担体）として得た。
実施例１３の無機多孔質担体で用いた方法において、ｒＵ－ｓｕｃｃｉｎａｔｅ １３３．４ｍｇ、ＨＢＴＵ ６６．９ｍｇ、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン３９．２μＬおよびアセトニトリル１２ｍＬを混合し、アミノ基を担持した、実施例１５の無機多孔質担体２．５０ｇを用いる以外は、実施例１３の無機多孔質担体で用いた方法と同様の方法で、ヌクレオシドを担持したＣＰＧを白色粉末状固体（ヌクレオシドを含む無機多孔質担体）として得た。
【0111】
（実施例１６の無機多孔質担体）
実施例１３の無機多孔質担体で用いた方法において、ｒＵ－ｓｕｃｃｉｎａｔｅ １３７．８ｍｇ、ＨＢＴＵ ６９．２ｍｇ、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン４０．０μＬおよびアセトニトリル１２ｍＬを混合し、アミノ基を担持した、実施例１６の無機多孔質担体２．５０ｇを用いる以外は、実施例１３の無機多孔質担体で用いた方法と同様の方法で、ヌクレオシドを担持したＣＰＧを白色粉末状固体（ヌクレオシドを含む無機多孔質担体）として得た。
実施例１３の無機多孔質担体で用いた方法において、ｒＵ－ｓｕｃｃｉｎａｔｅ １３７．８ｍｇ、ＨＢＴＵ ６９．２ｍｇ、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン４０．０μＬおよびアセトニトリル１２ｍＬを混合し、アミノ基を担持した、実施例１６の無機多孔質担体２．５０ｇを用いる以外は、実施例１３の無機多孔質担体で用いた方法と同様の方法で、ヌクレオシドを担持したＣＰＧを白色粉末状固体（ヌクレオシドを含む無機多孔質担体）として得た。
【0112】
（実施例１７の無機多孔質担体）
実施例１３の無機多孔質担体で用いた方法において、ｒＵ－ｓｕｃｃｉｎａｔｅ １１７．５ｍｇ、ＨＢＴＵ ５８．３ｍｇ、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン４０．０μＬおよびアセトニトリル１２ｍＬを混合し、アミノ基を担持した、実施例１７の無機多孔質担体２．５０ｇを用いる以外は、実施例１３の無機多孔質担体で用いた方法と同様の方法で、ヌクレオシドを担持したＣＰＧを白色粉末状固体（ヌクレオシドを含む無機多孔質担体）として得た。
実施例１３の無機多孔質担体で用いた方法において、ｒＵ－ｓｕｃｃｉｎａｔｅ １１７．５ｍｇ、ＨＢＴＵ ５８．３ｍｇ、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン４０．０μＬおよびアセトニトリル１２ｍＬを混合し、アミノ基を担持した、実施例１７の無機多孔質担体２．５０ｇを用いる以外は、実施例１３の無機多孔質担体で用いた方法と同様の方法で、ヌクレオシドを担持したＣＰＧを白色粉末状固体（ヌクレオシドを含む無機多孔質担体）として得た。
【0113】
（比較例５の無機多孔質担体）
実施例１３の無機多孔質担体で用いた方法において、ｒＵ－ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ４１０．０ｍｇ、ＨＢＴＵ ２１０．０ｍｇ、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン１５０．０μＬおよびアセトニトリル１２ｍＬを混合し、アミノ基を担持した、比較例５の無機多孔質担体２．５０ｇを用いる以外は、実施例１３の無機多孔質担体で用いた方法と同様の方法で、ヌクレオシドを担持したＣＰＧを白色粉末状固体（ヌクレオシドを含む無機多孔質担体）として得た。
実施例１３の無機多孔質担体で用いた方法において、ｒＵ－ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ４１０．０ｍｇ、ＨＢＴＵ ２１０．０ｍｇ、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン１５０．０μＬおよびアセトニトリル１２ｍＬを混合し、アミノ基を担持した、比較例５の無機多孔質担体２．５０ｇを用いる以外は、実施例１３の無機多孔質担体で用いた方法と同様の方法で、ヌクレオシドを担持したＣＰＧを白色粉末状固体（ヌクレオシドを含む無機多孔質担体）として得た。
【0114】
（比較例６の無機多孔質担体）
実施例１３の無機多孔質担体で用いた方法において、ｒＵ－ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ２８０．０ｍｇ、ＨＢＴＵ １４０．０ｍｇ、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン９５．０μＬおよびアセトニトリル１２ｍＬを混合し、アミノ基を担持した、比較例６の無機多孔質担体２．５０ｇを用いる以外は、実施例１３の無機多孔質担体で用いた方法と同様の方法で、ヌクレオシドを担持したＣＰＧを白色粉末状固体（ヌクレオシドを含む無機多孔質担体）として得た。
実施例１３の無機多孔質担体で用いた方法において、ｒＵ－ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ２８０．０ｍｇ、ＨＢＴＵ １４０．０ｍｇ、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン９５．０μＬおよびアセトニトリル１２ｍＬを混合し、アミノ基を担持した、比較例６の無機多孔質担体２．５０ｇを用いる以外は、実施例１３の無機多孔質担体で用いた方法と同様の方法で、ヌクレオシドを担持したＣＰＧを白色粉末状固体（ヌクレオシドを含む無機多孔質担体）として得た。
【0115】
上記で使用したｒＵ－ｓｕｃｃｉｎａｔｅの構造を以下に示す。
［式中、Ｒは、水素原子、ピリジン塩（＝ピリジン＋Ｈ）、又はトリエチルアミン塩（＝トリエチルアミン＋Ｈ）を表し、Ｍｅはメチル基を表し、Ｐｈはフェニル基を表し、ＴＢＤＭＳはｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基を表す。］
【化9】
【0116】
［ヌクレオシド担持量の測定］
上記測定方法３の方法に従って、実施例１～１２、比較例１～４の無機多孔質担体のヌクレオシド基担持量を測定した。その結果を「Ｔｒ担持量」として表１に示した。
上記測定方法３の方法に従って、実施例１～１２、比較例１～４の無機多孔質担体のヌクレオシド基担持量を測定した。その結果を「Ｔｒ担持量」として表１に示した。
【0117】
＜長鎖オリゴヌクレオチドの固相合成＞
（実施例１～１２、比較例１～４の無機多孔質担体）
配列（Ａ）：５’－AGCAGAGUACACACAGCAUAUACC-P-GGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUUC-P-G－３’（配列番号１，２） ５３ｍｅｒ。AGCAGAGUACACACAGCAUAUACC（配列番号１）およびGGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUUC（配列番号２）。
（実施例１～１２、比較例１～４の無機多孔質担体）
配列（Ａ）：５’－AGCAGAGUACACACAGCAUAUACC-P-GGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUUC-P-G－３’（配列番号１，２） ５３ｍｅｒ。AGCAGAGUACACACAGCAUAUACC（配列番号１）およびGGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUUC（配列番号２）。
【0118】
前記配列（Ａ）において、Ｐは、以下の化学式において波線で区切られる部分構造で示される。
【化10】
【0119】
固相担体として、上記で製造した、ヌクレオシドを担持した実施例１～１２、及び比較例１～４のいずれかの無機多孔質担体を使用し、核酸合成機としてＡＫＴＡ Ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ１００ｐｌｕｓ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて、ホスホロアミダイト固相合成法により、上記配列（Ａ）からなるオリゴヌクレオチドを３’側から５’側に向かって合成した。合成には、ＵＳ２０１２／００３５２４６の実施例２に記載のウリジンＥＭＭアミダイト、実施例３に記載のシチジンＥＭＭアミダイト、実施例４に記載のアデノシンＥＭＭアミダイト、実施例５に記載のグアノシンＥＭＭアミダイト、およびＷＯ２０１７／１８８０４２に記載の化合物（３）を使用し、デブロッキング溶液として高純度トリクロロ酢酸トルエン溶液を使用し、縮合剤として５－ベンジルメルカプト－１Ｈ－テトラゾールを使用し、酸化剤としてヨウ素溶液を使用し、キャッピング溶液としてフェノキシ酢酸溶液とＮ－メチルイミダゾール溶液を使用した。
【0120】
（実施例１３～１７、比較例５～６の無機多孔質担体）
配列（Ｂ）：５’－AUAACUCAAUUUGUAAAAAAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU－３’（配列番号３） １０３ｍｅｒ
（Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, Doudna JA, Charpentier E. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 2012 Aug 17;337(6096):816-21.）
配列（Ｂ）：５’－AUAACUCAAUUUGUAAAAAAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU－３’（配列番号３） １０３ｍｅｒ
（Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, Doudna JA, Charpentier E. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 2012 Aug 17;337(6096):816-21.）
【0121】
固相担体として、上記で製造した、ヌクレオシドを担持した実施例１３～１７及び比較例５～６のいずれかの無機多孔質担体を使用し、核酸合成機としてＡＫＴＡ Ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ１００ｐｌｕｓ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて、ホスホロアミダイト固相合成法により、上記配列（Ｂ）からなるオリゴヌクレオチドを３’側から５’側に向かって合成した。合成には、ＵＳ２０１２／００３５２４６の実施例２に記載のウリジンＥＭＭアミダイト、実施例３に記載のシチジンＥＭＭアミダイト、実施例４に記載のアデノシンＥＭＭアミダイトおよび実施例５に記載のグアノシンＥＭＭアミダイトを使用し、デブロッキング溶液として高純度トリクロロ酢酸トルエン溶液を使用し、縮合剤として５－ベンジルメルカプト－１Ｈ－テトラゾールを使用し、酸化剤としてヨウ素溶液を使用し、キャッピング溶液としてフェノキシ酢酸溶液とＮ－メチルイミダゾール溶液を使用した。
【0122】
＜オリゴヌクレオチドの固相担体からの遊離および脱保護＞
（実施例１～１７、比較例１～６の無機多孔質担体）
実施例１～１７及び比較例１～６のいずれかの無機多孔質担体を用いた上記の固相合成終了後、ヌクレオシド担持量として８．１μｍｏｌに相当する量を採取し、アンモニア水、次いでニトロメタンの存在下でフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）を作用させてオリゴヌクレオチドを固相担体から遊離させるとともに脱保護を行い、粗生成物を得た。
（実施例１～１７、比較例１～６の無機多孔質担体）
実施例１～１７及び比較例１～６のいずれかの無機多孔質担体を用いた上記の固相合成終了後、ヌクレオシド担持量として８．１μｍｏｌに相当する量を採取し、アンモニア水、次いでニトロメタンの存在下でフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）を作用させてオリゴヌクレオチドを固相担体から遊離させるとともに脱保護を行い、粗生成物を得た。
【0123】
［オリゴヌクレオチド収量の測定］
前記粗生成物のＯＤ２６０を測定した。ＯＤ２６０とは１ｍＬ溶液（ｐＨ＝７．５）における１０ｍｍ光路長あたりのＵＶ２６０ｎｍの吸光度を表す。一般的にＲＮＡでは１ＯＤ＝４０μｇであることが知られていることから、前記ＯＤ２６０の測定値に基づき、収量を算出した。さらに、無機多孔質担体の単位体積当たりの収量を算出した。実施例１～１２及び比較例１～４については実施例２の収量に対する相対収量を求め、その結果を「単位体積当たりの相対収量」として表１に示した。実施例１３～１７及び比較例５～６については実施例１３の収量に対する相対収量を求め、その結果を「単位体積当たりの相対収量」として表２に示した。
前記粗生成物のＯＤ２６０を測定した。ＯＤ２６０とは１ｍＬ溶液（ｐＨ＝７．５）における１０ｍｍ光路長あたりのＵＶ２６０ｎｍの吸光度を表す。一般的にＲＮＡでは１ＯＤ＝４０μｇであることが知られていることから、前記ＯＤ２６０の測定値に基づき、収量を算出した。さらに、無機多孔質担体の単位体積当たりの収量を算出した。実施例１～１２及び比較例１～４については実施例２の収量に対する相対収量を求め、その結果を「単位体積当たりの相対収量」として表１に示した。実施例１３～１７及び比較例５～６については実施例１３の収量に対する相対収量を求め、その結果を「単位体積当たりの相対収量」として表２に示した。
【0124】
［純度の測定］
（実施例１～１２、比較例１～４の無機多孔質担体）
上記測定方法４－ａの方法に従って、実施例１～１２、比較例１～４の無機多孔質担体を用いて合成したオリゴヌクレオチドの純度を測定した。その結果を「純度」として表１に示した。
（実施例１～１２、比較例１～４の無機多孔質担体）
上記測定方法４－ａの方法に従って、実施例１～１２、比較例１～４の無機多孔質担体を用いて合成したオリゴヌクレオチドの純度を測定した。その結果を「純度」として表１に示した。
【0125】
（実施例１３～１７、比較例５～６の無機多孔質担体）
上記測定方法４－ｂの方法に従って、実施例１３～１７、比較例５～６の無機多孔質担体を用いて合成したオリゴヌクレオチドの純度を測定した。その結果を「純度」として表２に示した。
上記測定方法４－ｂの方法に従って、実施例１３～１７、比較例５～６の無機多孔質担体を用いて合成したオリゴヌクレオチドの純度を測定した。その結果を「純度」として表２に示した。
【0126】
【表1】
【0127】
【表2】
【0128】
表１及び２に示すように、実施例１～１７で用いた無機多孔質担体では、いずれも、無機多孔質担体の比表面積当たりの第１級アミノ基の担持量（（Ｉ×Ｒ）／Ｓ）が０．７～１．８μｍｏｌ／ｍ２の範囲内であった。一方、比較例１～６で用いた無機多孔質担体では、いずれも、（Ｉ×Ｒ）／Ｓ＞１．８μｍｏｌ／ｍ２であり、前記の範囲外であった。実施例１～１２では、比較例１～４と比較して、オリゴ核酸の純度が大きく向上した。また、実施例１３～１７においても、比較例５及び６と比較して、オリゴ核酸の純度が大きく向上した。
【産業上の利用可能性】
【0129】
本発明により、中鎖～長鎖ＲＮＡ合成においても純度を向上させることができる、ＲＮＡの製造方法が提供される。本発明の実施態様にかかる製造方法により得られるＲＮＡは、医薬品の原料として有用である。
【配列表フリーテキスト】
【0130】
配列表の配列番号１～３は、本発明の製造方法に従って製造されるオリゴヌクレオチドの塩基配列を表す。
【配列表】