特許 7522449 植物体を食害する有害節足動物を防除する方法及びキット

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-07-17

(45)【発行日】2024-07-25

(54)【発明の名称】植物体を食害する有害節足動物を防除する方法及びキット

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/113 20100101AFI20240718BHJP

   A01N 57/16 20060101ALN20240718BHJP

   A01P 7/00 20060101ALN20240718BHJP

   C12N 15/55 20060101ALN20240718BHJP

   C12N 15/54 20060101ALN20240718BHJP

【ＦＩ】

C12N15/113 Z ZNA

C12N15/113 130Z

A01N57/16 104C

A01P7/00

C12N15/55

C12N15/54

【請求項の数】 5

(21)【出願番号】P 2021035616

(22)【出願日】2021-03-05

(65)【公開番号】P2022135668

(43)【公開日】2022-09-15

【審査請求日】2023-04-04

(73)【特許権者】

【識別番号】501203344

【氏名又は名称】国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構

(74)【代理人】

【識別番号】100088155

【弁理士】

【氏名又は名称】長谷川 芳樹

(74)【代理人】

【識別番号】100128381

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 義憲

(74)【代理人】

【識別番号】100211199

【弁理士】

【氏名又は名称】原田 さやか

(72)【発明者】

【氏名】田中 良明

【審査官】三谷 直也

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０２０／０６９１０９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】中国特許出願公開第１１０１４４３５１（ＣＮ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２０２０／０１８１６３９（ＵＳ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２０１３／０３３３０７０（ＵＳ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１０／１４０６７５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】中国特許出願公開第１０５６１３５６８（ＣＮ，Ａ）

【文献】Katterinne PRENTICE et al.，Insect Biochemistry and Molecular Biology，2019年，Vol. 110，pp. 80-89

【文献】Xiaolong DONG et al.，SCIENTIFIC REPORTS，2017年，Vol. 7, Article number 5584，(pp. 1-11)

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

Ａ０１Ｍ １／００－９９／００

Ａ０１Ｈ １／００－１７／００

Ａ０１Ｎ １／００－６５／４８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＰｕｂＭｅｄ

Ｇｏｏｇｌｅ／Ｇｏｏｇｌｅ Ｓｃｈｏｌａｒ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

植物体を食害する有害節足動物を防除する方法であって、
有害節足動物の発育、生存、発生及び／又は生殖に関与する少なくとも一つの遺伝子の発現を抑制する低分子二本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と、
有害節足動物のＲＮＡ分解酵素をコードする少なくとも一つの遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡと、
有害節足動物の脂肪酸合成酵素をコードする少なくとも一つの遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡとを含む溶液を有害節足動物の食害対象の植物体の細胞内に導入することを含み、
前記有害節足動物の発育、生存、発生及び／又は生殖に関与する少なくとも一つの遺伝子が、抑制することで有害節足動物の発育阻害若しくは致死を誘導又は増殖を抑制する遺伝子である、方法。

【請求項2】

前記溶液を前記植物体の細胞内に導入することが、前記溶液を植物体の損傷部位より直接導入することである、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

ｓｉＲＮＡを有害節足動物の食害対象の植物体の細胞内に導入することで植物体を食害する有害節足動物を防除するためのキットであって、
有害節足動物の発育、生存、発生及び／又は生殖に関与する少なくとも一つの遺伝子の発現を抑制する低分子二本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と、
有害節足動物のＲＮＡ分解酵素をコードする少なくとも一つの遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡと、
有害節足動物の脂肪酸合成酵素をコードする少なくとも一つの遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡと
を含み、
前記有害節足動物の発育、生存、発生及び／又は生殖に関与する少なくとも一つの遺伝子が、抑制することで有害節足動物の発育阻害若しくは致死を誘導又は増殖を抑制する遺伝子である、キット。

【請求項4】

ｓｉＲＮＡを食害対象の植物体の細胞内に導入することが、植物体の損傷部位より直接導入することである、請求項３に記載のキット。

【請求項5】

すべてのｓｉＲＮＡを一つの混合溶液の形態で含む、請求項３又は４に記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、植物体を食害する有害節足動物を防除する方法及びキットに関する。

【背景技術】

【0002】

有害節足動物防除の分野では、近年化学農薬に対する抵抗性系統の出現が大きな問題となっており、抵抗性を打破する新規防除技術の開発が望まれている。特に既存薬剤とは異なる作用点や作用機作をもつ薬剤の開発が求められている。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、有害節足動物の特定の遺伝子発現だけを抑制するため、防除対象の有害節足動物だけを標的として周辺環境に対する影響が低い新防除技術として期待されている。しかし、有害節足動物は摂食による二本鎖ＲＮＡの取込み効率が著しく低いため、遺伝子組換えトウモロコシを用いた方法以外は実用化に至っていない。

【0003】

また、ＲＮＡ干渉を利用してｄｓＲＮＡ／ｓｉＲＮＡを植物において発現させる技術として、宿主誘導遺伝子サイレンシング（Ｈｏｓｔ－Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｇｅｎｅ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ （ＨＩＧｓ））があるが（非特許文献１）、外来のｄｓＲＮＡ／ｓｉＲＮＡを発現させる組換え植物を作出することになるため、規制により栽培が困難であったり、遺伝子組換え植物に抵抗感を覚えたりする人々には受け入れられにくかったりという問題が存在する。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0004】

【文献】Qi et al, “Host-Induced GeneSilencing: A Powerful Strategy to Control Diseases of Wheat and Barley”,International Journal of Molecular Sciences, 20, 206, 2019

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明は、遺伝子組換え植物の作出を必要とせず、ＲＮＡ干渉により効果的に有害節足動物を防除できる方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明者は、特定の３種類の遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡを食害対象の植物体又はバンカー植物体の細胞内に導入することにより、植物体においてＲＮＡ干渉により植物体を食害する有害節足動物を防除することができることを見出し、本発明を完成するに至った。

【0007】

すなわち、本発明は、例えば、以下の発明を提供する。
［１］
植物体を食害する有害節足動物を防除する方法であって、
有害節足動物の発育、生存、発生及び／又は生殖に関与する少なくとも一つの遺伝子、又は天敵節足動物における有害節足動物捕食能力に関与する少なくとも一つの遺伝子の発現を抑制する低分子二本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と、
有害節足動物又は有害節足動物の天敵節足動物のＲＮＡ分解酵素をコードする少なくとも一つの遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡと、
有害節足動物又は有害節足動物の天敵節足動物の脂肪酸合成酵素をコードする少なくとも一つの遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡとを含む溶液を有害節足動物の食害対象の植物体又はバンカー植物体の細胞内に導入することを含む、方法。
［２］
上記溶液が、
有害節足動物の発育、生存、発生及び／又は生殖に関与する少なくとも一つの遺伝子を抑制するｓｉＲＮＡと、
有害節足動物のＲＮＡ分解酵素をコードする少なくとも一つの遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡと、
有害節足動物の脂肪酸合成酵素をコードする少なくとも一つの遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡと
を含む、［１］に記載の方法。
［３］
上記溶液を上記植物体又はバンカー植物体の細胞内に導入することが、上記溶液を植物体の損傷部位より直接導入することである、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］
ｓｉＲＮＡを有害節足動物の食害対象の植物体又は天敵のバンカー植物体の細胞内に導入することで植物体を食害する有害節足動物を防除するためのキットであって、
有害節足動物の発育、生存、発生及び／又は生殖に関与する少なくとも一つの遺伝子、又は天敵節足動物における有害節足動物捕食能力に関与する少なくとも一つの遺伝子の発現を抑制する低分子二本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と、
有害節足動物又は有害節足動物の天敵節足動物のＲＮＡ分解酵素をコードする少なくとも一つの遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡと、
有害節足動物又は有害節足動物の天敵節足動物の脂肪酸合成酵素をコードする少なくとも一つの遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡと
を含む、キット。
［５］
有害節足動物の発育、生存、発生及び／又は生殖に関与する少なくとも一つの遺伝子を抑制するｓｉＲＮＡと、
有害節足動物のＲＮＡ分解酵素をコードする少なくとも一つの遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡと、
有害節足動物の脂肪酸合成酵素をコードする少なくとも一つの遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡと
を含む、［４］に記載のキット。
［６］
ｓｉＲＮＡを食害対象の植物体又はバンカー植物体の細胞内に導入することが、植物体の損傷部位より直接導入することである、［４］又は［５］に記載のキット。
［７］
すべてのｓｉＲＮＡを一つの混合溶液の形態で含む、［４］～［６］のいずれかに記載のキット。

【発明の効果】

【0008】

本発明によれば、遺伝子組換え植物の作出を必要とせず、ＲＮＡ干渉により有害節足動物を防除できる方法を提供することができる。また、本発明によれば、ｓｉＲＮＡ溶液を植物に適用することにより、有害節足動物防除のタイミングの制御も可能となる。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】実施例１の各試験区における、ミナミキイロアザミウマの成虫化率を示す。

【図2】実施例１の各試験区における、キュウリ葉のミナミキイロアザミウマによる食害の様子を示す写真である。

【図3】実施例１において、Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ法により、ミナミキイロアザミウマ幼虫のｉａｐ１遺伝子及びｉａｐ２遺伝子の発現が抑制されたことを確認したグラフである。

【図4】実施例２において、Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ法により、ネギアザミウマのｃｙｐ６ｋ１遺伝子の発現が抑制されたことを確認したグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0010】

［植物体を食害する有害節足動物を防除する方法］
本発明は一実施形態において、植物体を食害する有害節足動物を防除する方法（以下、「本防除方法」ともいう）であって、
有害節足動物の発育、生存、発生及び／又は生殖に関与する少なくとも一つの遺伝子、又は天敵節足動物における有害節足動物捕食能力に関与する少なくとも一つの遺伝子の発現を抑制する低分子二本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と、
有害節足動物又は有害節足動物の天敵節足動物のＲＮＡ分解酵素をコードする少なくとも一つの遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡと、
有害節足動物又は有害節足動物の天敵節足動物の脂肪酸合成酵素をコードする少なくとも一つの遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡとを含む溶液を、有害節足動物の食害対象の植物体又はバンカー植物体の細胞内に導入することを含む、方法を提供する。

【0011】

本防除方法は、有害節足動物の発育、生存、発生及び／又は生殖に関与する少なくとも一つの遺伝子を抑制するｓｉＲＮＡと、有害節足動物のＲＮＡ分解酵素をコードする遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡと、有害節足動物の脂肪酸合成酵素をコードする遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡとを含む溶液を、食害対象の植物体の細胞内に導入することで、例えば、有害節足動物の発育阻害若しくは致死が誘導され、当該植物体を食害対象とする有害節足動物を防除することができる。有害節足動物防除の効果は、例えば、成体（例えば、成虫）率の減少、有害節足動物（例えば、幼生又は成体、昆虫であれば幼虫又は成虫）の数の減少、有害節足動物の死骸の数の増加等によりはかることができる。

【0012】

また、本防除方法は、天敵節足動物における有害節足動物捕食能力に関与する少なくとも一つの遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡと、有害節足動物の天敵節足動物のＲＮＡ分解酵素をコードする遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡと、有害節足動物の天敵節足動物の脂肪酸合成酵素をコードする遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡとを含む溶液を、バンカー植物体の細胞内に導入することで、例えば、天敵節足動物の有害節足動物捕食能力を向上させ、天敵節足動物による捕食により有害節足動物を防除することもできる。天敵節足動物による捕食の効果は、例えば、有害節足動物（幼虫又は成虫）の数の減少によりはかることができる。

【0013】

本明細書において、植物体は、特に制限されず、裸子植物又は被子植物であってもよく、単子葉植物又は双子葉植物であってもよく、果菜類、根菜類、葉菜類、穀物類、花き類等の農作物であってもよい。植物体としては、例えば、トマト、ピーマン、ジャガイモ、ナス等のナス科植物、キュウリ、カボチャ、メロン、スイカ等のウリ科植物、キャベツ、アブラナ、カブ、ダイコン、ワサビ、カリフラワー、クレソン、コマツナ、ハクサイ、タカナ、ブロッコリー、ミズナ等のアブラナ科植物、インゲンマメ、エダマメ、ダイズ、エンドウマメ、ソラマメ、アズキ、ラッカセイ、シロツメクサ等のマメ科植物、サツマイモ等のヒルガオ科植物、ネギ、ワケギ、ニンニク、タマネギ、ラッキョウ等のヒガンバナ科植物、イチゴ、バラ、ナシ、リンゴ、サクラ等のバラ科植物、ビート等のアカザ科植物、クワイ等のオモダカ科植物、ゴボウ、キクイモ、シュンギク、フキ、レタス、ヨモギ、キク等のキク科植物、サトイモ等のサトイモ科植物、ショウガ等のショウガ科植物、ニンジン、セリ、セルリー、パセリー、ミツバ等のセリ科植物、ヤマノイモ等のヤマノイモ科植物、ホウレンソウ等のヒユ科植物、ウド等のウコギ科植物、ミョウガ、ショウガ等のショウガ科植物、アスパラガス等のキジカクシ科植物、カーネーション等のナデシコ科植物、ウンシュウミカン等のミカン科植物、ブドウ等のブドウ科植物、イネ、コムギ、オオムギ、ライムギ、エンバク、モロコシ（ソルゴー）、エンバク等のイネ科植物、オオバコ等のオオバコ科植物、カタバミ、ムラサキカタバミ等のカタバミ科植物、ギシギシ等のタデ科植物、キスゲ等のススキノキ科植物、が挙げられる。有害節足動物の食害から防除する対象である植物体は、例えば、上記に挙げられた植物からなる群から選択されるものであってもよく、上記に挙げられた植物のうち、果菜類、根菜類、葉菜類、穀物類、花き類に該当する植物からなる群から選択されるものであってもよく、キュウリ、ナス、インゲン、ネギ、ピーマン、キャベツ、トマト、イチゴ、メロン、スイカ、ジャガイモ、サツマイモ、キク、カーネーション、イネ、麦、ミカン、及びブドウからなる群から選択されるものであってもよく、ウリ科植物であってもよい。また、植物体は遺伝子組み換え植物でない植物であってもよい。

【0014】

バンカー植物体とは、おとり植物とも呼ばれ、天敵節足動物を温存するために防除対象である植物の周囲に植える植物を意味する。バンカー植物体としては、例えば、ソルゴー、オオバコ、エンバク、ヨモギ、ギシギシ、キスゲ、シロツメクサ等が挙げられる。

【0015】

ｓｉＲＮＡを含む溶液を細胞内に導入する植物体の器官は、特に制限されず、例えば、葉、茎、蕾、根、花又は実であってよく、これらの組み合わせであってもよい。

【0016】

本明細書において、植物体を食害する有害節足動物は、植物体を食害する昆虫類、甲殻類、クモ類、ムカデ類等が含まれる。食害する植物体の器官は特に限定されず、害虫の種類によって異なるが、例えば、葉、茎、蕾、根、花又は実であってよい。また、害虫の食害の形態も害虫の種類のよって異なるが、例えば、植物体の器官を直接食する形態、及び植物の器官を吸汁する形態が挙げられる。例えば、後述するチョウ目昆虫の幼虫は、直接植物体の器官をかじって食べる昆虫であるが、アザミウマ目昆虫、カメムシ目昆虫及びアブラムシ類昆虫は植物の器官に口針を突き刺して中身を吸汁する形態で植物体を食害する吸汁性昆虫である。本実施形態の防除方法は、植物体の細胞内にｓｉＲＮＡを導入する方法であるため、ＲＮＡ干渉を誘導する二本鎖ＲＮＡ等の植物体の表面への散布では効果が期待できない吸汁性昆虫に対しても防除効果を発揮できる。

【0017】

植物体を食害する有害節足動物としては、例えば、ミカンキイロアザミウマ、ミナミキイロアザミウマ及びネギアザミウマ等のアザミウマ目昆虫、カメムシ目昆虫、モモアカアブラムシ及びワタアブラムシ等のアブラムシ類昆虫、ツマグロヨコバイ等のヨコバイ類昆虫、トビイロウンカ及びセジロウンカ等のウンカ類昆虫、チャバネアオカメムシ及びホソヘリカメムシ等のカメムシ類昆虫、オンシツコナジラミ等のコナジラミ類昆虫、コナガ、ヨトウムシ、ハスモンヨトウ、シロイチモジヨトウ、コドリンガ、ボールワーム、タバコバッドワーム、マイマイガ、タバコガ及びスズメガ等のチョウ目昆虫、コロラドハムシ、ウリハムシ、アリモドキゾウムシ、マメコガネ及びニジュウヤホシテントウ等のコウチュウ目昆虫、トノサマバッタ及びサバクトビバッタ等のバッタ目昆虫、ハナバエ及びハモグリバエ等のハエ目昆虫、ハキリアリ及びハバチ等のハチ目昆虫、並びにナミハダニ等のダニ類等が挙げられる。防除対象となる植物体を食害する有害節足動物は、例えば、上記に挙げられた種からなる群から選択されるものであってもよく、アザミウマ目昆虫であってもよい。

【0018】

植物体を食害する昆虫の天敵節足動物には、昆虫類、甲殻類、クモ類及びムカデ類等が含まれ、防除すべき有害節足動物の種類から適宜選択することができる。例えば、ハナカメムシ科に属する種、カスミカメムシ科に属する雑食性の種、ナガカメムシ科に属する種、サシガメ科に属する種、寄生バチ下目に属する種、ヤドリバエ科に属する種、ヒラタアブ亜科に属する種、テントウムシ科に属する肉食性の種、及びダニ目に属する肉食性の種は好適な天敵である。いずれの天敵を使用するかは、防除すべき対象生物の種類により適宜定まる。例えば、アザミウマ目やアブラムシ上科に属する種の天敵としては、ハナカメムシ科に属する種が挙げられる。特にアザミウマ目に属する種の天敵としては、ヒメハナカメムシ属に属する種、例えば、タイリクヒメハナカメムシ、ナミヒメハナカメムシ、コヒメハナカメムシ、ツヤヒメハナカメムシ、ミナミヒメハナカメムシ、シノビハナカメムシ、トリスチコロルヒメハナカメムシ又はオウシュウヒメハナカメムシが好適な天敵昆虫となる。また、アブラムシ上科に属する種やカイガラムシ上科に属する種の天敵としては、テントウムシ科に属する肉食性の種、例えば、ナミテントウ、フタモンテントウ、ナナホシテントウ、ダンダラテントウ、アカホシテントウ、ヒメアカホシテントウ、ヒメカメノコテントウ、オオテントウ、ヨツボシテントウ、ベダリアテントウ、アカヘリテントウ、ベニヘリテントウ又はシロジュウシホシテントウが好適な天敵昆虫となる。さらに、ハダニ科に属する種やアザミウマ目に属する種の天敵としては、カブリダニ科に属する種、例えば、スワルスキーカブリダニ、ミヤコカブリダニ、ケナガカブリダニ、ニセラーゴカブリダニ、ククメリスカブリダニ、キイカブリダニ、ヘアカブリダニ又はチリカブリダニが好適な天敵節足動物となる。また、ハダニ科に属する種、アザミウマ目に属する種及びアブラムシ上科に属する種のいずれにも好適な天敵節足動物としては、ナガカメムシ科に属する種、例えば、オオメカメムシが挙げられる。そして、コナジラミ科に属する種の天敵としては、カスミカメムシ科に属する種、例えば、タバコカスミカメ、クロヒョウタンカスミカメ又はコミドリチビトビカスミカメが好適な天敵昆虫となる。天敵昆虫は、例えば、上記に挙げられた種からなる群から選択されるものであってもよく、例えば、ヒメハナカメムシ属に属する種、カスミカメムシ科に属する種及びテントウムシ科に属する肉食性の種からなる群から選択されてもよく、ヒメハナカメムシ、タバコカスミカメ及びヒメカメノコテントウからなる群から選択されてもよい。

【0019】

本防除方法は、標的とする遺伝子（標的遺伝子）の転写産物の分解を介してその遺伝子の発現を抑制する配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングであるＲＮＡ干渉（ＲＮＡ ｉｎｔｅｆｅｒｅｎｃｅ（ＲＮＡｉ））を利用した防除方法である。

【0020】

低分子二本鎖ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ））は、標的遺伝子の塩基配列の一部に相当する塩基配列で構成されるセンス鎖（パッセンジャー鎖）、及びそのアンチセンス鎖（ガイド鎖）からなる小分子二本鎖リボ核酸（ＲＮＡ）である。ｓｉＲＮＡを真核細胞に導入することによってＲＮＡ干渉を誘導することができる。ｓｉＲＮＡの長さは通常１８～２５ヌクレオチド長（ｂｐ）である。例えば、ｓｉＲＮＡは、発現を抑制する遺伝子の部分配列と同一の塩基配列で構成されるｓｉＲＮＡであってもよい。

【0021】

本防除方法における有害節足動物又は有害節足動物の天敵節足動物の遺伝子発現を抑制するｓｉＲＮＡは、標的遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて公知の方法により設計することができる。例えば、Ｋｏｓｔｅｒにより開発された「亜りん酸トリエステル法」等が挙げられる。

【0022】

本防除方法は、上記特定の３種類の遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡを準備する工程、及び／又は上記特定の３種類の遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡを混合する工程をさらに含んでもよい。上記混合する工程は、乾燥状態で行われてもよく、溶液中で行われてもよい。ｓｉＲＮＡは、例えば、以下のように設計することができる。標的遺伝子のセンス鎖の塩基配列として、１５～３５塩基等の連続した塩基配列を選択領域として選択する。アンチセンス鎖の塩基配列は、選択したセンス鎖の塩基配列に相補的な塩基配列とする。センス鎖の選択領域は、標的遺伝子において特異的な配列であれば特に限定されない。ｓｉＲＮＡの設計は、ウェブサイト上でも多数公開されており、標的遺伝子の塩基配列を入力すれば、有効且つ適切なｓｉＲＮＡをウェブ上で設計することができる。ｓｉＲＮＡの一方の末端又は両末端には、標的遺伝子の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列とは関連しない一以上のＤＮＡ、ＲＮＡ、及び／又は核酸類似体からなる塩基配列が存在していてもよい。このようなｓｉＲＮＡの末端に存在する塩基数は、特に限定はしないが、１～２０個の範囲内であることが好ましい。具体的には、例えば、ｓｉＲＮＡのセンス鎖側及びｓｉＲＮＡアンチセンス鎖側の３’末端側にＴＴ（チミン‐チミン）又はＵＵ（ウラシル‐ウラシル）等を付加する場合が挙げられる。設計したｓｉＲＮＡは、、当該技術分野における公知の化学合成（例えば、ホスホロアミダイト法）により合成することができる。

【0023】

また、標的遺伝子の全体又は部分配列に対する二本鎖ＲＮＡを（例えば、インビトロ転写により）合成し、合成した二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を二本鎖ＲＮＡ切断酵素によりランダムに切断することにより得られた、様々な配列のｓｉＲＮＡ混合物を利用することもできる。本防除方法において、各標的遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡとして、このように準備されたｓｉＲＮＡ混合物の形で用いることもできる。標的遺伝子の部分配列は、標的遺伝子の種類及び遺伝子のＤＮＡの長さにもよるが、例えば、２００ｂｐ～１０００ｂｐ又は３００ｂｐ～６００ｂｐであってよい。標的遺伝子の全体又は部分配列に対する二本鎖ＲＮＡは、例えば、標的遺伝子の全体又は部分配列のオリゴヌクレオチドを鋳型ＤＮＡとして、インビトロ転写システムにより合成することができる。このような二本鎖ＲＮＡ合成のための市販キット、例えば、Ｔ７ ＲｉｂｏＭＡＸ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ ＲＮＡｉ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を使用してもよい。合成した二本鎖ＲＮＡを、ランダムに短く切断する二本鎖ＲＮＡ切断酵素としては、例えば、ＲＮａｓｅＩＩＩ及びＤｉｃｅｒが挙げられる。このような二本鎖ＲＮＡをランダムに短く切断するための市販キット、例えば、ＳｈｏｒｔＣｕｔ（登録商標）ＲＮａｓｅＩＩＩを使用してもよい。得られた様々な配列のｓｉＲＮＡ混合物に含まれるｓｉＲＮＡの長さは、例えば、１８ｂｐ～２５ｂｐであってよい。

【0024】

本防除方法において、ｓｉＲＮＡにより発現が抑制される少なくとも３種の標的遺伝子は、有害節足動物の発育、生存、発生及び／若しくは生殖に関与する遺伝子、又は天敵節足動物における有害節足動物捕食能力に関与する遺伝子と、有害節足動物又は有害節足動物の天敵節足動物のＲＮＡ分解酵素をコードする遺伝子と、有害節足動物又は有害節足動物の天敵節足動物の脂肪酸合成酵素をコードする遺伝子である。

【0025】

有害節足動物の発育、生存、発生及び／又は生殖に関与する遺伝子としては、例えば、抑制することで有害節足動物の発育阻害若しくは致死を誘導又は増殖を抑制する遺伝子が挙げられる。このような遺伝子としては、例えば、アポトーシス阻害遺伝子、解毒酵素遺伝子、神経ペプチド及びその受容体をコードする遺伝子、液胞型ＡＴＰａｓｅ（Ｖ－ＡＴＰａｓｅ）サブユニットをコードする遺伝子、リボソームタンパク質の構造サブユニットであるタンパク質をコードする遺伝子、膜小胞膜を形成する多量体複合体のサブユニットであるタンパク質をコードする遺伝子等が挙げられる。有害節足動物の発育、生存、発生及び／又は生殖に関与する少なくとも一つの遺伝子は、アポトーシス阻害遺伝子、解毒酵素遺伝子、神経ペプチド及びその受容体をコードする遺伝子、液胞型ＡＴＰａｓｅサブユニットをコードする遺伝子、リボソームタンパク質の構造サブユニットであるタンパク質をコードする遺伝子、並びに膜小胞膜を形成する多量体複合体のサブユニットであるタンパク質をコードする遺伝子からなる群から選択される１以上の遺伝子であってよい。

【0026】

アポトーシス阻害遺伝子は、細胞死を阻害する遺伝子であり、発現を抑制すると細胞死が起こり、発育阻害又は致死が誘導される。アポトーシス阻害遺伝子としては、例えば、Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ １（ＩＡＰ１）及びＩｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ２（ＩＡＰ２）が挙げられる。本防除方法において、アポトーシス阻害遺伝子は、ＩＡＰ１又はＩＡＰ２を含んでもよく、ＩＡＰ１及びＩＡＰ２の両方を含んでもよい。

【0027】

解毒酵素遺伝子は、生体外異物の解毒代謝を担う。例えば、植物防御物質及び殺虫剤等の薬剤に対して解毒作用を持つ酵素の遺伝子が含まれ、具体例としては、シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）遺伝子が挙げられる。例えば、解毒酵素ＣＹＰ６ｋ１は、ネギアザミウマで薬剤抵抗性に関与することが知られている。

【0028】

神経ペプチド及びその受容体は、Ｇタンパク質共役型受容体に作用するニューロンによって生成される小さなタンパク質であり、シナプス伝達の遅発性で長期的な調節を担うペプチドとその受容体である。神経ペプチド及びその受容体としては、例えば、神経ペプチドＣＡＰＡ受容体（ｃａｐａＲ）、脱皮行動誘導ホルモン（Ｅｃｄｙｓｉｓ ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ（ＥＴＨ））及びその受容体（ＥＴＨＲ）の遺伝子が挙げられる。ｃａｐａＲは、昆虫の水分調節に関わる遺伝子であり、抑制することで昆虫が干からびて死亡する。また、ＥＴＨ及びＥＴＨＲは、脱皮及び変態を誘導する遺伝子であり、抑制することで脱皮及び変態が抑制されるため、昆虫の発育阻害若しくは致死が誘導される。実際に、ＲＮＡ干渉によりＥＴＨ及びＥＴＨＲの発現を抑制することでミカンキイロアザミウマが致死したことが報告されている（特開２０１７－１３１２０１）。

【0029】

液胞型ＡＴＰａｓｅ（Ｖ－ＡＴＰａｓｅ）サブユニットとしては、例えば、Ｖ－ＡＴＰａｓｅ－Ｂ（ｖａｓｃｕｏｌａｒ ＡＴＰ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｓｕｂｕｎｉｔ Ｂ）が挙げられる。実際に、この遺伝子の発現をＲＮＡｉにより抑制することでミカンキイロアザミウマが致死することが報告されている。

【0030】

タンパク質合成に関与する構造成分であるリボソームタンパク質としては、例えば、細胞質のリボソーム小サブユニットの成分であるＳ４（ＲｐＳ４）及びＳ９（ＲｐＳ９）、リボソームに局在するＬ９およびＬ１９等が挙げられる。

【0031】

膜小胞膜を形成する多量体複合体のサブユニットであるタンパク質をコードする遺伝子としては、例えば、β－ｃｏａｔａｍｅｒ遺伝子が挙げられる。

【0032】

有害節足動物の発育、生存、発生及び／又は生殖に関与する少なくとも一つの遺伝子は、例えば、ＩＡＰ１をコードする遺伝子、ＩＡＰ２をコードする遺伝子、シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）をコードする遺伝子、Ｐ－４５０モノオキシゲナーゼをコードする遺伝子、ｃａｐａＲをコードする遺伝子、ＥＴＨをコードする遺伝子、ＥＴＨＲをコードする遺伝子、Ｖ－ＡＴＰａｓｅサブユニットをコードする遺伝子、ＲｐＳ４をコードする遺伝子、ＲｐＳ９をコードする遺伝子、β－ｃｏａｔａｍｅｒをコードする遺伝子、ニトロフェリン２をコードする遺伝子、カルボキシエステラーゼをコードする遺伝子、フェロモン結合タンパク質をコードする遺伝子、及びＴｓｅｔｓｅＥＰをコードする遺伝子からなる群から選択されてもよく、ＩＡＰ１をコードする遺伝子、ＩＡＰ２をコードする遺伝子及びシトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）をコードする遺伝子からなる群から選択されてもよい。

【0033】

ミナミキイロアザミウマのＩＡＰ１遺伝子の配列としては、配列番号１に示される配列が挙げられ、ミナミキイロアザミウマのＩＡＰ２遺伝子の配列としては、配列番号２に示される配列が挙げられる。ＩＡＰ１遺伝子は、配列番号１に示される配列と少なくとも８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する配列からなるポリヌクレオチドを含んでよく、ＩＡＰ２遺伝子は、配列番号２に示される配列と少なくとも８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する配列からなるポリヌクレオチドを含んでもよい。上述した、ｄＲＮＡを二本鎖ＲＮＡ切断酵素によりランダムに切断することにより得られた、様々な配列のｓｉＲＮＡ混合物を利用する場合、ｄｓＲＮＡの合成に使用するＩＡＰ１遺伝子の部分配列は、例えば、配列番号６に示される配列と少なくとも８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する配列からなるポリヌクレオチドを含んでよく、ｄｓＲＮＡの合成に使用するＩＡＰ２遺伝子の部分配列は、例えば、配列番号７に示される配列と少なくとも８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する配列からなるポリヌクレオチドを含んでよい。また、合成されたｄｓＩＡＰ１遺伝子のｄｓＲＮＡは、配列番号１１に示される配列と少なくとも８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する配列からなるポリヌクレオチドを含んでもよく、合成されたｄｓＩＡＰ２遺伝子のｄｓＲＮＡは、配列番号１２に示される配列と少なくとも８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する配列からなるポリヌクレオチドを含んでもよい。

【0034】

有害節足動物の発育、生存、発生及び／又は生殖に関与する少なくとも一つの遺伝子は、複数選択されてもよく、少なくとも２つの遺伝子であってもよい。複数の遺伝子である場合には、有害節足動物の発育、生存、発生及び／又は生殖に関与する少なくとも一つの遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡは、複数の遺伝子を同時に抑制するｓｉＲＮＡであってもよく、それぞれの遺伝子を抑制するｓｉＲＮＡであってもよい。

【0035】

天敵節足動物における有害節足動物捕食能力に関与する少なくとも一つの遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡと、有害節足動物の天敵節足動物のＲＮＡ分解酵素をコードする遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡと、有害節足動物の天敵昆虫の脂肪酸合成酵素をコードする遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡとを含む溶液を、食害対象のバンカー植物体の細胞内に導入することで、例えば、天敵節足動物の有害節足動物捕食能力を向上させ、天敵節足動物による捕食により植物体を食害する有害節足動物を防除することができる。天敵節足動物における有害節足動物捕食能力に関与する遺伝子としては、例えば、抑制することで有害節足動物捕食能力を向上する天敵節足動物の遺伝子が挙げられる。このような遺伝子としては、例えば、抑制することで天敵節足動物の食性を肉食に変更する遺伝子、及び抑制することで天敵節足動物の食欲を高める遺伝子が挙げられる。

【0036】

有害節足動物防除に天敵を使う上では、最初から有害節足動物ばかり食べる天敵では維持が大変である。そこで、普段は天敵節足動物には、バンカー植物とよばれる作物の近くにある植物を食べさせ増殖させる。例えば、植物を食害する有害節足動物が当該植物において増殖し出したところで、バンカー植物の細胞内にｓｉＲＮＡを導入することで天敵節足動物の食性を肉食に変更したり、天敵節足動物を飢餓状態にさせたりすることで、天敵節足動物の有害節足動物捕食能力を向上することが期待できる。抑制することで天敵節足動物の食性を肉食に変更する遺伝子としては、例えば、植物成分を受容する味覚受容体遺伝子が挙げられる。植物成分を受容する味覚受容体遺伝子の発現を抑制することにより、草食から肉食（アザミウマやアブラムシ等の害虫）へと食性の好みを変化することが考えられる。また、抑制することで天敵節足動物を飢餓状態にする遺伝子としては、例えば、インシュリン様ペプチド遺伝子が挙げられる。インシュリン様ペプチド遺伝子の発現を抑制することで昆虫を飢餓状態にさせ、食欲を高めることができることがショウジョウバエで報告されている。

【0037】

本防除方法は、天敵の有害節足動物捕食能力向上のタイミングをコントロールできるという利点を有する。例えば、天敵の有害節足動物捕食能力向上する遺伝子を導入した組換え植物体を用いる場合には、最初から天敵の有害節足動物捕食能力が向上されることとなり、望ましいタイミングで天敵の有害節足動物捕食能力を向上させるということは困難である。

【0038】

天敵節足動物における有害節足動物捕食能力に関与する少なくとも一つの遺伝子は、複数選択されてもよく、少なくとも２つの遺伝子であってもよい。複数の遺伝子である場合には、天敵節足動物における有害節足動物捕食能力に関与する少なくとも一つの遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡは、複数の遺伝子を同時に抑制するｓｉＲＮＡであってもよく、それぞれの遺伝子を抑制するｓｉＲＮＡであってもよい。

【0039】

有害節足動物又は有害節足動物の天敵節足動物のＲＮＡ分解酵素（ＲＮａｓｅ）をコードする遺伝子としては、例えば、ｄｓＲＮａｓｅ１及びｄｓＲＮａｓｅ２が挙げられる。これらの遺伝子は、消化管等で二本鎖ＲＮＡを分解する作用を持つ。

【0040】

ミナミキイロアザミウマのｄｓＲＮａｓｅ１遺伝子の配列としては、配列番号３に示される配列が挙げられ、ミナミキイロアザミウマのｄｓＲＮａｓｅ２遺伝子の配列としては、配列番号４に示される配列が挙げられる。ｄｓＲＮａｓｅ１遺伝子は、配列番号３に示される配列と少なくとも８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する配列からなるポリヌクレオチドを含んでよく、ｄｓＲＮａｓｅ２遺伝子は、配列番号４に示される配列と少なくとも８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する配列からなるポリヌクレオチドを含んでもよい。上述した、ｄＲＮＡを二本鎖ＲＮＡ切断酵素によりランダムに切断することにより得られた、様々な配列のｓｉＲＮＡ混合物を利用する場合、ｄｓＲＮＡの合成に使用するｄｓＲＮａｓｅ１遺伝子の部分配列は、例えば、配列番号８に示される配列と少なくとも８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する配列からなるポリヌクレオチドを含んでよく、ｄｓＲＮＡの合成に使用するｄｓＲＮａｓｅ２遺伝子の部分配列は、例えば、配列番号９に示される配列と少なくとも８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する配列からなるポリヌクレオチドを含んでよい。また、合成されたｄｓＲＮａｓｅ１遺伝子のｄｓＲＮＡは、配列番号１３に示される配列と少なくとも８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する配列からなるポリヌクレオチドを含んでもよく、合成されたｄｓＲＮａｓｅ２遺伝子のｄｓＲＮＡは、配列番号１４に示される配列と少なくとも８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する配列からなるポリヌクレオチドを含んでもよい。

【0041】

有害節足動物又は有害節足動物の天敵節足動物のＲＮＡ分解酵素をコードする少なくとも一つの遺伝子は、複数選択されてもよく、少なくとも２つの遺伝子であってもよい。複数の遺伝子である場合には、有害節足動物又は有害節足動物の天敵節足動物のＲＮＡ分解酵素をコードする少なくとも一つの遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡは、複数の遺伝子を同時に抑制するｓｉＲＮＡであってもよく、それぞれの遺伝子を抑制するｓｉＲＮＡであってもよい。有害節足動物又は有害節足動物の天敵節足動物のＲＮＡ分解酵素をコードする少なくとも一つの遺伝子は、ｄｓＲＮａｓｅ１、ｄｓＲＮａｓｅ２又はこれらの組み合わせを含んでよい。

【0042】

有害節足動物又は有害節足動物の天敵節足動物の脂肪酸合成酵素（Ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｓｙｎｔｈａｓｅ，ｆａｓｎ）は、二本鎖ＲＮＡの細胞内への取込みを阻害する（Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ｖｏｌｕｍｅ ７， Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ： ５５８４ （２０１７））。

【0043】

ミナミキイロアザミウマの脂肪酸合成酵素をコードする遺伝子の配列としては、配列番号５に示される配列が挙げられる。脂肪酸合成酵素をコードする遺伝子は、配列番号５に示される配列と少なくとも８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する配列からなるポリヌクレオチドを含んでよい。上述した、ｄＲＮＡを二本鎖ＲＮＡ切断酵素によりランダムに切断することにより得られた、様々な配列のｓｉＲＮＡ混合物を利用する場合、ｄｓＲＮＡの合成に使用する脂肪酸合成酵素をコードする遺伝子の部分配列は、例えば、配列番号１０に示される配列と少なくとも８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する配列からなるポリヌクレオチドを含んでよい。また、合成された脂肪酸合成酵素をコードする遺伝子のｄｓＲＮＡは、配列番号１５に示される配列と少なくとも８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する配列からなるＤＮＡにコードされたポリヌクレオチドを含んでもよい。

【0044】

有害節足動物又は有害節足動物の天敵節足動物の脂肪酸合成酵素をコードする少なくとも一つの遺伝子は、複数選択されてもよく、少なくとも２つの遺伝子であってもよい。複数の遺伝子である場合には、有害節足動物又は有害節足動物の天敵節足動物の脂肪酸合成酵素をコードする少なくとも一つの遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡは、複数の遺伝子を同時に抑制するｓｉＲＮＡであってもよく、それぞれの遺伝子を抑制するｓｉＲＮＡであってもよい。

【0045】

ｓｉＲＮＡを含む溶液の種類は、ｓｉＲＮＡが植物細胞内で作用する限り特に制限されないが、例えば、水、ＴＥ、展着剤及びこれらの組み合わせ等が挙げられる。展着剤は、農薬が植物表面に吸着、浸透するのを促進する薬剤である。従来、二本鎖ＲＮＡをナノカプセルに入れて保護する等により有害節足動物体内への取込み効率を改善することが図られていたが、ナノカプセルを用いるとコストがさらに上昇することが問題であった。本防除方法によれば、少なくとも３種の遺伝子に対するｓｉＲＮＡを組み合わせて植物の細胞内に導入することで、有害節足動物の細胞内へのｓｉＲＮＡ取込み効率が改善されるため、Ｌｉｐｉｄや糖、ペプチドなどと共役させたり（Ｘ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｓｉＲＮＡ）、特別なナノカプセルを用いたり、特別な溶液を用いたりする必要はなく、簡便である。

【0046】

溶液は、有害節足動物の発育、生存、発生及び／又は生殖に関与する少なくとも一つの遺伝子を抑制するｓｉＲＮＡと、有害節足動物のＲＮＡ分解酵素をコードする少なくとも一つの遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡと、有害節足動物の脂肪酸合成酵素をコードする少なくとも一つの遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡとを含むものであってもよい。

【0047】

上記溶液に含まれるｓｉＲＮＡの総量は、植物の種類や器官によって適宜調整できるが、例えば、６ｎｇ～２０００ｎｇであってよく、１０ｎｇ～１０００ｎｇであってよく、３０ｎｇ～５００ｎｇであってよく、２０ｎｇ以上、４０ｎｇ以上又は５０ｎｇ以上であってよく、５０００ｎｇ以下、３０００ｎｇ以下、２０００ｎｇ以下、１０００ｎｇ以下又は５００ｎｇであってもよい。上記ｓｉＲＮＡの総量は、導入（例えば、塗布）１回分当たりの量であってもよく、植物体の葉１枚に相当する面積当たりの量であってもよく、例えば、５～１００ｃｍ^２当たりの量であってもよく、１０～７０ｃｍ^２当たりの量であってもよく、１０～５０ｃｍ^２当たりの量であってもよい。有害節足動物に直接接触させる目的で植物体の表面に二本鎖ＲＮＡを散布するという方法もあるが、効果を得るためには、例えば葉全体（表裏含む）に二本鎖ＲＮＡを散布する必要があり、大量散布が必要となる。例えば、ｄｓＲＮＡを１０～５０ｃｍ^２の葉全体に散布する方法では、１μＬ／０．０１ｃｍ^２で葉表面に散布するとすると、濃度が１μｇ／μＬの場合、２０００～１００００μＬの液量（裏表に散布）、重量では２×１０^６～１０×１０^６ｎｇのｄｓＲＮＡが必要になる。本防除方法によれば、葉の一部の細胞内にｓｉＲＮＡを導入することにより葉全体に防除効果を及ぼすことができるため、必要量を大幅に減らすことができる。

【0048】

ｓｉＲＮＡを含む溶液を植物体の細胞内に導入する方法としては、例えば、植物体の損傷部位より直接導入する方法、及び加圧により導入する方法等が挙げられる。植物の損傷部位より直接導入する方法としては、例えば、ハサミの先又は紙やすりにより植物体の器官（例えば、葉）の表面の一部又は全体を損傷し、ｓｉＲＮＡを含む溶液を塗布又は噴霧する方法が挙げられる。

【0049】

［植物体を食害する有害節足動物を防除するためのキット］
本発明は一実施形態において、
ｓｉＲＮＡを有害節足動物の食害対象の植物体又は天敵のバンカー植物体の細胞内に導入することで植物体を食害する有害節足動物を防除するためのキット（以下、「本キット」ともいう）であって、
有害節足動物の発育、生存、発生及び／又は生殖に関与する少なくとも一つの遺伝子、又は天敵節足動物における有害節足動物捕食能力に関与する少なくとも一つの遺伝子の発現を抑制する低分子二本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と、
有害節足動物又は有害節足動物の天敵節足動物のＲＮＡ分解酵素をコードする少なくとも一つの遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡと、
有害節足動物又は有害節足動物の天敵節足動物の脂肪酸合成酵素をコードする少なくとも一つの遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡと
を含む、、キットも提供する。

【0050】

本キットは、
有害節足動物の発育、生存、発生及び／又は生殖に関与する少なくとも一つの遺伝子を抑制するｓｉＲＮＡと、有害節足動物のＲＮＡ分解酵素をコードする少なくとも一つの遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡと、有害節足動物の脂肪酸合成酵素をコードする少なくとも一つの遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡと
を含むものであってもよい。

【0051】

ｓｉＲＮＡを植物体の細胞内に導入することが、植物体の損傷部位より直接導入することである場合には、例えば、紙やすり、ハサミ等の損傷させるための器具をさらに含んでもよい。

【0052】

ｓｉＲＮＡが含まれる形態としては、ｓｉＲＮＡの活性を維持する限り、特に限定されず、乾燥状態で含まれても、溶液に含まれてもよい。ｓｉＲＮＡが乾燥状態で含まれる場合には、ｓｉＲＮＡの種類により別々に包装されても、複数種がまとめて包装されてもよい。ｓｉＲＮＡが溶液に含まれる場合には、ｓｉＲＮＡの種類により別々の溶液の形態で含まれてもよく、複数種又はすべてのｓｉＲＮＡを一つの混合溶液の形態で含んでもよい。

【0053】

ｓｉＲＮＡが含まれる溶液は、例えば、水、ＴＥ、展着剤及びこれらの組み合わせであってよい。

【0054】

本キットは、キットを用いて有害節足動物を防除する方法が記載された説明書をさらに含んでもよい。

【0055】

植物体、有害節足動物、各遺伝子及びｓｉＲＮＡ等、本キットにおける具体的な態様等は、上述した具体的な態様等を制限なく適用できる。

【実施例】

【0056】

［実施例１ ＳＩＧｓによるミナミキイロアザミウマの防除］
（１）標的遺伝子の探索及び部分配列の人工合成
防除対象となるミナミキイロアザミウマ（Ｔｈｒｉｐｓ ｐａｌｍｉ）の標的遺伝子をＧｅｎｂａｎｋを用いて探索し、以下に示す部分配列（４００ｂｐ）を株式会社ファスマックに委託して化学合成した。

【0057】

【表1】

【0058】

（２）ｄｓＲＮＡの合成
上記部分配列のＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより部分配列を増幅し（ｓｅｔ１，２）、Ｔ７ ＲｉｂｏＭＡＸ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ ＲＮＡｉ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用い、製品添付のプロトコルに従ってｄｓＲＮＡを合成した。

【0059】

合成したｄｓＲＮＡの配列を以下に示す。

【0060】

【表2】

【0061】

（３）ｓｉＲＮＡの合成
合成したｄｓＲＮＡを１０μｇ用いて、ＳｈｏｒｔＣｕｔ（登録商標）ＲＮａｓｅＩＩＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）のプロトコルに従って、１８ｂｐ～２５ｂｐの長さのｓｉＲＮＡの混合物を得た。作製したｓｉＲＮＡをエタノール沈殿を行って濃縮した後、ＴＥバッファーに溶解して－８０℃で保存した。使用の際には、４℃で解凍した後、各ｓｉＲＮＡを目的量採って混合した。

【0062】

（４）キュウリ葉への塗布
図１に示すように各ｓｉＲＮＡ量を調整したｓｉＲＮＡ混合液を作製し、キュウリ本葉の表面をハサミの先又は紙やすりで傷つけ、ｓｉＲＮＡ混合液を傷口に滴下（５－２０μＬ）し、そのまま一晩風乾した。なお、キュウリ本葉１枚の大きさは約５０ｃｍ^２であった。

【0063】

（５）ミナミキイロアザミウマに対する発育阻害効果の判定
ミナミキイロアザミウマ１，２齢幼虫を処理した葉につけて、１０日間の間に成虫化した虫体の割合で効果を判定した。

【0064】

その結果を図１に示す。ｄｓＲＮａｓｅ１，２、Ｆａｓｎ及びＩＡＰ１，２の３種のｓｉＲＮＡ混合液（各５０ｎｇ以上）を葉の傷口に塗布すると成虫化阻害が誘導される（成虫化が約２０％～６０％に低下する）ことが示された（＊；Ｐ＜０．０５、＊＊；Ｐ＜０．０１）。一方、葉の表面を傷つけずにｓｉＲＮＡを塗布した試験区（試験区６）、及びｓｉＲＮＡに代えてｄｓＲＮＡを塗布した試験区（試験区７）では、成虫化の阻害率は低かった。また、ＩＡＰ１，２のｓｉＲＮＡのみ使用した試験区（試験区５）においても、成虫化の阻害率は低かった。ｓｉＲＮＡによるＲＮＡ干渉の効果を昆虫に作用させるためには、昆虫の防除に直接寄与する遺伝子（本実施例ではＩＡＰ１，２）を抑制するｓｉＲＮＡだけでは足らず、ｄｓＲＮａｓｅ及びＦａｓｎの遺伝子の抑制も必要であることが示唆された。

【0065】

また、処理後１０日目におけるキュウリ葉のミナミキイロアザミウマによる食害の様子を図２に示す。矢印は葉の表面を傷つけてｓｉＲＮＡ又はｄｓＲＮＡを塗布した部分を示す。それ以外の白くなっている部分は、ミナミキイロアザミウマに食害された部分である。ｄｓＲＮａｓｅ１，２、Ｆａｓｎ及びＩＡＰ１，２の３種のｓｉＲＮＡ混合液を塗布した葉において、ミナミキイロアザミウマにより食害された部分が顕著に少なかった。

【0066】

（６）遺伝子発現抑制効果の判定
葉につけてから２～４日後に幼虫を採取し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＲＮＡ（タカラバイオ社）のプロトコルに従いＲＮＡを抽出した。ＲＮＡはＰｒｉｍｅｓｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｒｅａｇｅｎｔ ｋｉｔ（タカラバイオ社）のプロトコルに従いＤＮＡに逆転写し、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ－ＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）のプロトコルにしたがってＲｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ法により遺伝子発現抑制効果を判定した。

【0067】

その結果を図３に示す。ｄｓＲＮａｓｅ１，２、Ｆａｓｎ及びＩＡＰ１，２に対するｓｉＲＮＡを含むｓｉＲＮＡ混合液を処理した場合において、ミナミキイロアザミウマ幼虫のｉａｐ１遺伝子及びｉａｐ２遺伝子の発現が抑制されていることが確認された（＊＊；Ｐ＜０．０１）。なお、図３において、＋ｇｆｐはｄｓＲＮａｓｅ１，２、Ｆａｓｎ及びＧＦＰに対するｓｉＲＮＡを含むｓｉＲＮＡ混合液を処理した結果、＋ｉａｐ１，２はｄｓＲＮａｓｅ１，２、Ｆａｓｎ及びＩＡＰ１，２に対するｓｉＲＮＡを含むｓｉＲＮＡ混合液を処理した結果、無処理は葉を傷つける処理も含め何も処理をしていない結果、を意味する。

【0068】

［実施例２ ＳＩＧｓによるネギアザミウマにおける解毒酵素遺伝子発現の抑制］
実施例１と同様の方法により、ＧＦＰ、ネギアザミウマのＣｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ ６ｋ１（ＣＹＰ６Ｋ１）、ｄｓＲＮａｓｅ１，２及びＦａｓｎの部分配列を用いてｄｓＲＮＡを合成し、次いでｓｉＲＮＡを合成してｓｉＲＮＡ混合液を作製した。ｓｉＲＮＡ混合液は、ＧＦＰ、ｄｓＲＮａｓｅ１，２及びＦａｓｎに対するｓｉＲＮＡを含むものと、ＣＹＰ６Ｋ１、ｄｓＲＮａｓｅ１，２及びＦａｓｎに対するｓｉＲＮＡを含むものを作製した。キュウリ本葉の表面をハサミの先又は紙やすりで傷つけ、ｓｉＲＮＡ混合液を傷口に滴下（５－２０μＬ）し、そのまま一晩風乾した。

【0069】

ネギアザミウマ薬剤抵抗性系統（成虫）を処理した葉につけ、４日後に雌成虫を採取し、ＲＮＡを抽出した。実施例１と同様の方法により、Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ法により
ｃｙｐ６ｋ１遺伝子の発現を比較した。

【0070】

その結果を図４に示す。ＣＹＰ６Ｋ１、ｄｓＲＮａｓｅ１，２及びＦａｓｎに対するｓｉＲＮＡを含むｓｉＲＮＡ混合液を処理した試験区において、ｃｙｐ６ｋ１遺伝子の発現が約６０％低下したことが示された（＊＊；Ｐ＜０．０１）。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【配列表】

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