特許 7526396 パーティクルボンバードメント法において用いられる、細胞内へ導入される物質で被覆された微粒子が担持された担体の製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-07-24

(45)【発行日】2024-08-01

(54)【発明の名称】パーティクルボンバードメント法において用いられる、細胞内へ導入される物質で被覆された微粒子が担持された担体の製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/87 20060101AFI20240725BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20240725BHJP

【ＦＩ】

C12N15/87 Z

C12N15/09 110

【請求項の数】 4

(21)【出願番号】P 2020029814

(22)【出願日】2020-02-25

(65)【公開番号】P2021132547

(43)【公開日】2021-09-13

【審査請求日】2022-10-27

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成３０年度、国立研究開発法人科学技術振興機構、研究成果最適展開支援プログラム Ａ－ＳＴＥＰ、産学共同フェーズ シーズ育成タイプＦＳ、受託研究 産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願

(73)【特許権者】

【識別番号】000231637

【氏名又は名称】株式会社ニップン

(73)【特許権者】

【識別番号】504139662

【氏名又は名称】国立大学法人東海国立大学機構

(73)【特許権者】

【識別番号】504171134

【氏名又は名称】国立大学法人 筑波大学

(73)【特許権者】

【識別番号】503335179

【氏名又は名称】株式会社ファスマック

(74)【代理人】

【識別番号】110001047

【氏名又は名称】弁理士法人セントクレスト国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】皆川 吉

(72)【発明者】

【氏名】栗原 陽子

【審査官】小倉 梢

(56)【参考文献】

【文献】Nat. Commun.，2017年，Vol. 8: 14261，p. 1-5

【文献】Nat. Protoc.，2018年，Vol. 13，p. 413-430

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００ － １５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

パーティクルボンバードメント法において用いられる、物質で被覆された微粒子が担持された担体を、製造する方法であって、
前記物質は、パーティクルボンバードメント法によって細胞に導入される、ペプチドとヌクレオチドとの複合体であり、
（１）前記ペプチド及び前記ヌクレオチドを、無機塩及び／又は糖を含有する中性緩衝液に溶解させる工程、
（２）工程（１）にて得られた溶解液から、緩衝液交換により、前記無機塩及び前記糖を除去する工程、
（３）工程（２）にて得られた溶解液と微粒子とを混合する工程、
（４）工程（３）にて得られた混合液を、担体の表面上に塗布する工程、及び
（５）工程（４）にて前記混合液が塗布された担体を、脱気乾燥法により乾燥させる工程を含み、
前記無機塩が、ナトリウム塩、カリウム塩又はアンモニウム塩であり、
前記糖が、スクロース、マルトース又はトレハロースであり、
前記ペプチドがＣａｓ９タンパク質であり、かつ、前記ヌクレオチドがガイドＲＮＡである、方法。

【請求項2】

前記中性緩衝液が、ｐＨ７～８のＴｒｉｓ緩衝液又はｐＨ７～８のＨＥＰＥＳ緩衝液である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

パーティクルボンバードメント法により細胞に物質を導入する方法であって、
請求項１又は２に記載の方法により、前記物質で被覆された微粒子が担持された担体を製造する工程、及び
前記工程にて製造された担体に圧力を加えることにより、当該担体から放出された前記微粒子が、前記細胞に撃ち込まれる工程を含む、方法。

【請求項4】

下記（Ａ）～（Ｆ）に記載の物質からなる群から選択される少なくとも１種を含む、請求項１又は２に記載の方法において用いられるためのキット
（Ａ）前記ペプチド及び前記ヌクレオチド
（Ｂ）前記無機塩及び／又は糖を含有する中性緩衝液
（Ｃ）前記緩衝液交換のために用いられる、限外ろ過膜、透析膜又はクロマトグラフィーの固定化相
（Ｄ）前記工程（１）にて得られた溶解液と前記緩衝液交換を行なうために用いられる、溶液
（Ｅ）前記微粒子
（Ｆ）前記混合液が塗布される、担体
（但し、前記無機塩は、ナトリウム塩、カリウム塩又はアンモニウム塩であり、前記糖は、スクロース、マルトース又はトレハロースであり、前記ペプチドはＣａｓ９タンパク質であり、かつ、前記ヌクレオチドはガイドＲＮＡである）。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、パーティクルボンバードメント法において用いられる、細胞内へ導入される物質で被覆された微粒子が担持された担体の製造方法に関する。また本発明は、当該担体、及び当該担体を用いたパーティクルボンバードメント法による細胞内への物質導入方法に関する。

【背景技術】

【0002】

ヌクレオチド、ペプチド等の物質を、細胞内に導入することは、基礎研究のみならず、様々な産業用途においても非常に意義のあることである。しかしながら、これら物質の活性を維持させなから、細胞内に導入することは困難である。特に、植物は固い細胞壁を持ち、動物等に比べ、外部から物質を導入することが非常に困難となる。

【0003】

植物細胞へ物質を導入する方法として、化学的方法（ポリエチレングリコール法）、物理的方法（エレクトロポレーション法、パーティクルボンバードメント法）等がある。このうち、パーティクルボンバードメント法は、金やタングステン等からなる微粒子にＤＮＡやタンパク質等をコーティングしたものを弾丸として、高速で射出して細胞内に導入する方法である。この方法は、簡便で広範な植物に適用可能なことから、多くの組織・細胞、植物細胞への物質導入方法として、一般的に使用されている（非特許文献１～３、及び特許文献１）。しかも、この方法は、特に固い細胞壁を持つ成熟花粉等に有効であることが、様々な被子植物で報告されている（非特許文献４）。

【0004】

また、パーティクルボンバードメント法は、近年のゲノム編集技術の到来により、植物の形質転換が容易に行なえる技術として注目されている。例えば、ゲノム編集を目的としてＣａｓ９タンパク質とガイドＲＮＡの複合体をパーティクルボンバードメント法により導入する場合、Ｃａｓ９タンパク質とガイドＲＮＡとを、Ｃａｓ９反応バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．５ｍＭ ＤＴＴ）中にて混合し、次いで金微粒子を混合することにより、当該微粒子を前記複合体にて被覆し、さらに、当該混合液を担体（キャリア）に塗布し、風乾させることによって、前記微粒子を担体に担持させる方法が開示されている（非特許文献３）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【文献】米国特許出願公開第２０１４／９６２８４号明細書

【非特許文献】

【0006】

【文献】Ｊ Ｆｉｎｅｒ，Ｊ．ら、Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９９年、２４０巻、５９～８０ページ

【文献】Ｍａｒｔｉｎ－Ｏｒｔｉｇｏｓａ Ｓ．ら、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．２０１４年、２３巻、５号、７４３～７５６ページ

【文献】Ｌｉａｎｇ Ｚ．ら、Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．、２０１７年、８：１４２６１

【文献】Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｄ．Ｎ．ら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ、２００３年、１巻、３１～４１ページ

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明は、パーティクルボンバードメント法において用いられる、細胞内への導入物質（ヌクレオチド‐ペプチド複合体）がその活性を維持したまま微粒子を覆っており、かつ当該微粒子が安定的に担持されている担体の製造方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

上述のとおり、パーティクルボンバードメント法は、一般的に細胞、組織へのＤＮＡ導入技術として広く知られている。特に、近年のゲノム編集技術の到来により、植物へ形質転換が容易に行なえる技術として注目されている。

【0009】

しかしながら、かかる従来の方法(非特許文献３に記載の方法）にて、ゲノム編集系であるＣａｓ９タンパク質とガイドＲＮＡとの複合体で被覆された微粒子が担持された担体を調製すると、後述の参考例３及び４に示すとおり、担体の乾燥工程において、無機塩（ＫＣｌ）が析出してしまい、担体の表面に担持された前記微粒子層が脆くなることを、本発明者らは初めて見出した。さらに、当該析出物は１００μｍ以上のものが多く存在し、また析出物以外の部分は金粒子が不均一に、担体表面に存在していた。通常、細胞の大きさは１００μｍ以下のため、析出物による細胞への物質の導入は不可能であるばかりか、その衝撃によりダメージとなり得ることが推定される。一方、前記Ｃａｓ９反応バッファーから無機塩を除いてしまうと、Ｃａｓ９タンパク質やガイドＲＮＡ等の物質の溶解が困難となり、また当該物質の活性が低下してしまうことが懸念される。

【0010】

さらに、後述の参考例３に示すとおり、本発明者らは、風乾による乾燥ではＣａｓ９タンパク質‐ガイドＲＮＡ複合体の活性が低下することも見出した。

【0011】

そこで、上記のとおり初めて明らかにした従来技術における問題点を解消すべく、すなわち、Ｃａｓ９タンパク質‐ガイドＲＮＡ複合体等のヌクレオチド‐ペプチド複合体がその活性を維持したまま微粒子を覆っており、かつ当該微粒子が安定的に担持されている担体を製造すべく、本発明者らは鋭意研究を重ねた。その結果、前記ヌクレオチド及びペプチドを一旦、無機塩及び／又は糖を含む中性緩衝液に溶解させた上で、前記析出に大きく影響を与える無機塩及び糖の含量を最小化させることを、先ず着想した。

【0012】

そして実際に、Ｃａｓ９タンパク質‐ガイドＲＮＡ複合体を含む前記溶解液から、緩衝液交換によって、前記無機塩及び前記糖を除去した結果、当該複合体の活性は、維持されていることを明らかにした。さらに、後述の参考例３に示すとおり、風乾や凍結乾燥法による乾燥では、Ｃａｓ９タンパク質‐ガイドＲＮＡ複合体の活性の維持や担体の安定性において問題があるものの、脱気乾燥ではこれら問題が解消されることを見出し、本発明を完成するに至った。

【0013】

すなわち、本発明は、パーティクルボンバードメント法において用いられる、細胞内へ導入される物質で被覆された微粒子が担持された担体の製造方法に関し、より詳しくは、以下に記載の方法等を提供する。
＜１＞ パーティクルボンバードメント法において用いられる、物質で被覆された微粒子が担持された担体を、製造する方法であって、
前記物質は、パーティクルボンバードメント法によって細胞に導入される、ペプチドとヌクレオチドとの複合体であり、下記工程（１）～（５）を含む方法
（１）前記ペプチド及び前記ヌクレオチドを、無機塩及び／又は糖を含有する中性緩衝液に溶解させる工程、
（２）工程（１）にて得られた溶解液から、緩衝液交換により、前記無機塩及び前記糖を除去する工程、
（３）工程（２）にて得られた溶解液と微粒子とを混合する工程、
（４）工程（３）にて得られた混合液を、担体の表面上に塗布する工程、
（５）工程（４）にて前記混合液が塗布された担体を、脱気乾燥法により乾燥させる工程。
＜２＞ 前記無機塩がカリウム塩であり、前記糖がスクロースである、＜１＞に記載の方法。
＜３＞ 前記中性緩衝液が、ｐＨ７～８のＴｒｉｓ緩衝液又はｐＨ７～８のＨＥＰＥＳ緩衝液である、＜１＞又は＜２＞に記載の方法。
＜４＞ 前記ペプチドがＣａｓ９タンパク質であり、前記ヌクレオチドがガイドＲＮＡである、＜１＞～＜３＞のうちのいずれか一項に記載の方法。
＜５＞ パーティクルボンバードメント法において用いられる、物質で被覆された微粒子が担持された担体であって、
前記物質は、パーティクルボンバードメント法によって細胞に導入される、ペプチドとヌクレオチドとの複合体であり、かつ、
前記微粒子が担持された表面において、中心から１０ｍｍ以内の領域における析出物が１００μｍ未満である、担体。
＜６＞ ＜１＞～＜４＞のうちのいずれか一項に記載の方法によって製造される、物質で被覆された微粒子を担持した担体。
＜７＞ パーティクルボンバードメント法により細胞に物質を導入する方法であって、
＜５＞又は＜６＞に記載の担体に圧力を加えることにより、当該担体から放出された前記微粒子が、前記細胞に撃ち込まれる工程を含む、方法。
＜８＞ 下記（Ａ）～（Ｆ）に記載の物質からなる群から選択される少なくとも１種を含む、＜１＞～＜４＞のうちのいずれか一項に記載の方法において用いられるためのキット
（Ａ）前記ペプチド及び前記ヌクレオチド
（Ｂ）前記無機塩及び／又は糖を含有する中性緩衝液
（Ｃ）前記緩衝液交換のために用いられる、限外ろ過膜、透析膜又はクロマトグラフィーの固定化相
（Ｄ）前記工程（１）にて得られた溶解液と前記緩衝液交換を行なうために用いられる、溶液
（Ｅ）前記微粒子
（Ｆ）前記混合液が塗布される、担体。

【発明の効果】

【0014】

本発明によれば、パーティクルボンバードメント法において用いられる、細胞内へ導入される物質（ヌクレオチド‐ペプチド複合体）がその活性を維持したまま微粒子を覆っており、かつ当該微粒子が安定的に担持されている担体の製造方法を提供することが可能となる。さらに、前記微粒子を安定的に担持できるため、輸送や保存等も可能となる前記担体の製造及び提供が可能となる。また、前記担体表面に塩が析出することが低減され、当該析出物による損傷を抑えつつ、前記複合体を細胞内に導入し、機能させることが可能となる。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1A】本発明のパーティクルボンバードメント法（物質を細胞に撃ち込む前）の概要を示す図である。

【図1B】本発明のパーティクルボンバードメント法（物質を細胞に撃ち込む時）の概要を示す図である。

【図2】参考例２に示す条件１～６にて調製したＣａｓ９タンパク質又はＣａｓ９タンパク質‐ガイドＲＮＡ複合体について切断活性を評価した結果を示す図である。図中、上部は、ＳＹＢＲ ｓａｆｅによって染色することにより、ｔｅｍｐｌａｔｅ ＤＮＡの切断状況を検出した結果を示すゲル電気泳道写真であり、三角はＣａｓ９タンパク質によって切断されたｔｅｍｐｌａｔｅ ＤＮＡの位置を示し、数字（％）は切断率を示す。下部は、ＣＢＢ染色によってＣａｓ９タンパク質を検出した結果を示すＳＤＳ－ＰＡＧＥの写真である。また、各写真における「Ｍ」はＤＮＡ又はタンパク質のマーカーを泳動した結果を示す。

【図3】参考例３に示す条件１～４にて調製したＣａｓ９タンパク質‐ガイドＲＮＡ複合体について切断活性を評価した結果を示す図である（図中の表記等については、図２のそれらと同様である）。

【図4】参考例３に示す条件１を用いて作製した、パーティクルボンバードメント法におけるＣａｓ９タンパク質‐ガイドＲＮＡ複合体担持ディスクを観察した結果を示す、写真である。図中、「（ａ）」にて示す中心領域が、担体の中心に円状に塗布されているのが、本発明にかかる「物質で被覆された微粒子」であり、その中央部分に白い析出物が生じていることを、図中の三角にて示す。

【図5】実施例１に記載の条件にて作製した、パーティクルボンバードメント法におけるＣａｓ９タンパク質‐ガイドＲＮＡ複合体担持ディスクを観察した結果を示す、写真である。図中、「（ａ）」にて示す中心領域が、担体の中心に円状に塗布されているのが、本発明にかかる「物質で被覆された微粒子」である。

【図6】参考例３に示す条件１を用いて作製した、パーティクルボンバードメント法におけるＣａｓ９タンパク質‐ガイドＲＮＡ複合体担持ディスク（図中の「１」）、実施例１に記載の条件にて作製した、パーティクルボンバードメント法におけるＣａｓ９タンパク質‐ガイドＲＮＡ複合体担持ディスク（図中「２」）について切断活性を評価した結果を示す図である。図中「３」及び「４」は、各々ｔｅｍｐｌａｔｅ ＤＮＡのみ、Ｃａｓ９タンパク質のみを泳動した結果を示す。図中の表記等については、図２のそれらと同様であるが、下部に示す数字（％）は、切断効率を示す。

【図7】実施例１に記載の条件にて作製した、パーティクルボンバードメント法におけるＣａｓ９タンパク質‐ガイドＲＮＡ複合体担持ディスクを、光学顕微鏡にて観察した結果を示す、写真である。

【図8】非特許文献３に記載の条件にて作製した、パーティクルボンバードメント法におけるＣａｓ９タンパク質‐ガイドＲＮＡ複合体担持ディスクを、光学顕微鏡にて観察した結果を示す、写真である。

【発明を実施するための形態】

【0016】

＜本発明の製造方法＞
後述の実施例に示すとおり、下記工程（１）～（５）をとることにより、パーティクルボンバードメント法において用いられる、細胞内へ導入される物質（ヌクレオチド‐ペプチド複合体）がその活性を維持したまま微粒子を覆っており、かつ当該微粒子が安定的に担持されている担体の製造方法を提供することが可能となる。

【0017】

したがって、本発明は、
前記物質は、パーティクルボンバードメント法によって細胞に導入される、ペプチドとヌクレオチドとの複合体であり、
（１）前記ペプチド及び前記ヌクレオチドを、無機塩及び／又は糖を含有する中性緩衝液に溶解させる工程、
（２）工程（１）にて得られた溶解液から、緩衝液交換により、前記無機塩及び前記糖を除去する工程、
（３）工程（２）にて得られた溶解液と微粒子とを混合する工程、
（４）工程（３）にて得られた混合液を、担体の表面上に塗布する工程、
（５）工程（４）にて前記混合液が塗布された担体を、脱気乾燥法により乾燥させる工程
を含む、パーティクルボンバードメント法において、物質で被覆された微粒子が担持された担体を製造する方法を、提供する。

【0018】

本発明の製造方法においては先ず、細胞内に導入される複合体を構成するペプチド及び前記ヌクレオチドを、無機塩及び／又は糖を含有する中性緩衝液に溶解させる。

【0019】

（細胞内へ導入される物質）
本発明において、パーティクルボンバードメント法によって細胞に導入される物質は、ペプチドとヌクレオチドとの複合体である。本発明にかかる「ペプチド」には、オリゴペプチド、ポリペプチド及びタンパク質が含まれ、ヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡ等）には、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド及び核酸が含まれる。かかるヌクレオチド及びペプチドによって構成される複合体としては特に制限はなく、例えば、ＲＮＡタンパク質複合体、ＤＮＡタンパク質複合体が挙げられ、より具体的には、Ｃａｓタンパク質とガイドＲＮＡとの複合体、リボソーム、スプライソソーム、クロマチンが挙げられる。なお、これら物質の少なくともいずれか一方には標識物質が結合していてもよい。かかる標識物質としては、蛍光化合物（フルオレセイン、ＦＩＴＣ、インドシアニングリーン、蛍光放出金属（^１５２Ｅｕ、ランタン系列等）等、ＩＲＤｙｅ８００シリーズ）、マーカータンパク質（例えば、ＧＦＰ等の蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ等の発光酵素タンパク質）、タグタンパク質（Ｈｉｓタグペプチド、ＧＳＴタンパク質等）が挙げられる。また、かかる標識物質とペプチド又はヌクレオチドとの間にはプロテアーゼ認識部位を介在させることにより、当該プロテアーゼによる切断によって分離し得る態様であってもよい。

【0020】

本発明において、「Ｃａｓタンパク質」は、ＣＲＩＳＰＥＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔ、クリスパー）関連酵素（ヌクレアーゼ）であり、クラス１ＣＲＩＳＰＥＲ関連酵素（例えば、Ｃａｓ３等のＩ型、IV型、Ｃａｓ１０等のIII型）であってもよく、クラス２ＣＲＩＳＰＥＲ関連酵素（例えば、Ｃａｓ９等のII型、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１），Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）、Ｃａｓ１２ｅ（ＣａｓＸ）及びＣａｓ１４等のＶ型、Ｃａｓ１３等のVI型）であってもよいが、好ましくはクラス２ＣＲＩＳＰＥＲ関連酵素であり、より好ましくはII型ＣＲＩＳＰＥＲ関連酵素であり、さらに好ましくはＣａｓ９である
なお、Ｃａｓタンパク質の典型的なアミノ酸配列及び塩基配列は公開されたデータベース、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）に登録されており、本発明においてはこれらを利用することができる。

【0021】

本発明において「Ｃａｓ９タンパク質」は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムにおいて使用できるものであればよく、ガイドＲＮＡと結合して複合体を形成し、標的ＤＮＡ領域に標的化されて標的二本鎖ＤＮＡを切断する。種々の由来のＣａｓ９タンパク質は公知であり、ＷＯ２０１４／１３１８３３に例示されるものを利用することができる。好ましくは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９タンパク質（ＳｐＣａｓ９）を利用する。Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列及び塩基配列は公開されたデータベース、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）に登録されており（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ：Ｑ９９ＺＷ２）、本発明においてはこれらを利用することができる。

【0022】

また、データベース上に登録されている天然型のアミノ酸配列のみならず、本発明においてＣａｓ９タンパク質には、天然型のアミノ酸配列に対して、１～複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列を含む変異体を用いることもできる。ここで「複数個」とは１～５０個、好ましくは１～３０個、さらに好ましくは１～１０個である。さらに、本発明においてＣａｓ９タンパク質には、元のタンパク質の活性を保持する限り、天然型のアミノ酸配列と８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、当該アミノ酸配列からなるポリペプチドも含む。アミノ酸配列の比較は公知の手法によって行うことができ、例えば、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ ａｔ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等を例えば、デフォルトの設定で用いて実施できる。

【0023】

このような変異体としては、例えば、触媒部位の１つに変異が導入されニッカーゼ活性を示すＣａｓ９タンパク質（ｎＣａｓタンパク質）が挙げられる。ｎＣａｓタンパク質を利用することにより、オフターゲット作用を減少させることができる。また、核移行シグナルを付加することによって、細胞内で核への局在が促進され、その結果、ＤＮＡの編集を効率的に行なうことができる。

【0024】

本発明にかかる「ガイドＲＮＡ」は、Ｃａｓ９タンパク質と相互作用するヌクレオチド配列と標的ＤＮＡ領域の配列に対して相補的なヌクレオチド配列（標的化ヌクレオチド配列）とを含むＲＮＡである。本発明において「ガイドＲＮＡ」は、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡを含む一分子ガイドＲＮＡでも、ｃｒＲＮＡ断片とｔｒａｃｒＲＮＡ断片とからなる二分子ガイドＲＮＡ（ｄｕａｌ－ＲＮＡ）であってもよい。

【0025】

ｃｒＲＮＡ中の標的化ヌクレオチド配列は、通常、１２～５０ヌクレオチド、好ましくは、１７～３０ヌクレオチド、より好ましくは１７～２５ヌクレオチドからなる塩基配列であり、ＰＡＭ（ｐｒｏｔｏ－ｓｐａｃｅｒ ａｄｊａｃｅｎｔ ｍｏｔｉｆ）配列と隣接する領域を標的化するように選択される。

【0026】

ｃｒＲＮＡは、更に、ｔｒａｃｒＲＮＡと相互作用（ハイブリダイズ）が可能なヌクレオチド配列を３’側に含む。一方、ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡの一部のヌクレオチド配列と相互作用（ハイブリダイズ）が可能なヌクレオチド配列を５’側に含む。これらヌクレオチド配列の相互作用により形成された二重鎖ＲＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質と相互作用する。

【0027】

（無機塩及び／又は糖を含有する中性緩衝液）
上述のペプチド及びヌクレオチドを溶解させることによって、これら物質の複合体を形成させるための緩衝液は、当該複合体の活性を維持するために、ｐＨの範囲は中性（例えばｐＨ６．５～８．０、好ましくはｐＨ７．０～８．０、より好ましくはｐＨ７．５）となる。また、緩衝液のｐＨを前記範囲とするために含有される緩衝作用を有する物質（緩衝剤）としては、当該作用を有する限り特に制限はないが、例えば、Ｔｒｉｓ（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）、ＨＥＰＥＳ（ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ）、リン酸（ＮａＨ_２ＰＯ_４－Ｎａ_２ＨＰＯ_４）、ＭＯＰＳ（ＭＯＰＳ－ＮａＯＨ）が挙げられる。これら緩衝剤において、植物、特に花粉細胞に導入する上では、Ｔｒｉｓ又はＨＥＰＥＳが、本発明において好適に用いられる。また、緩衝剤の濃度としては、ｐＨの範囲は中性とする限り特に制限はないが、好ましくは２～２００ｍＭ、より好ましくは５～１００ｍＭ、さらに好ましくは１０～５０ｍＭ、特に好ましくは２０ｍＭである。

【0028】

本発明にかかる「緩衝液」には、ヌクレオチド‐ペプチド複合体を溶解させ、またその活性を維持するために、無機塩及び／又は糖が更に含まれる。無機塩としては、例えば、カリウム塩（塩化カリウム、リン酸カリウム、硝酸カリウム、水酸化カリウム等）、ナトリウム塩（塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、硝酸ナトリウム等）、カルシウム塩（塩化カルシウム、硫酸カルシウム、酢酸カルシウム等）、マグネシウム塩（塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム等）、アンモニウム塩（炭酸アンモニウム等）が挙げられるが、植物、特に花粉細胞に導入する上では、カリウム塩が好ましい。糖としては、例えば、スクロース、フルクトース、ラクトース、マンニトール、グリセロール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、トレハロース、グリシン、グルコース、デキストラン、エリスリトール、マルトースが挙げられるが、上記ヌクレオチド‐ペプチド複合体の安定性を保持しつつ、乾燥させ易いという観点から、トレハロース、スクロースが好ましく、スクロースがより好ましい。

【0029】

本発明にかかる緩衝液においては、これら化合物が少なくとも１種含まれていればよい（例えば、塩化カリウムのみ、又はスクロースのみ含まれていればよい）が、上記ヌクレオチド‐ペプチド複合体の安定性を保持しつつ、乾燥させ易いという観点から、カリウム塩及びスクロースが含まれていることが好ましい。また、緩衝液における無機塩又は糖の含有量としては特に制限はないが、ヌクレオチド‐ペプチド複合体をより溶解させ、当該複合体の沈殿をより抑え易いという観点から、無機塩の含有量は、好ましくは１００～５００ｍＭ、より好ましくは２００～３００ｍＭであり、糖の含有量は、好ましくは０．５～５％、１～２％である。

【0030】

また、本発明にかかる緩衝液においては、前記緩衝剤、無機塩及び糖の他、他の物質が含まれていてもよい。かかる他の物質としては、例えば、還元剤（ＤＴＴ等）、プロテアーゼ阻害剤（ＰＳＤＦ等）が挙げられる。

【0031】

さらに、本発明にかかる緩衝液中の前記ペプチド及びヌクレオチドの溶解濃度としては特に制限はないが、ヌクレオチド－ペプチド複合体を形成させ易く、細胞に適した量にて当該複合体を導入し易くなるという観点から、ペプチドの濃度は、好ましくは１０～１０００ｎｇ／μｌ、より好ましくは５０～５００ｎｇ／μｌ、さらに好ましくは１００～２００ｎｇ／μｌであり、ヌクレオチドの濃度は、好ましくは１～１００ｎｇ／μｌ、より好ましくは１０～５０ｎｇ／μｌ、さらに好ましくは２０～３０ｎｇ／μｌである。

【0032】

（無機塩及び糖の除去）
本発明においては、上述のヌクレオチド‐ペプチド複合体の溶解液から、緩衝液交換によって、前記無機塩及び前記糖を除去することにより、後述の担体表面におけるこれら無機塩及び糖の析出を抑え、後述の微粒子を安定的に担持することが可能となる。

【0033】

本発明において「緩衝液交換」とは、ヌクレオチド‐ペプチド複合体を含む溶解液中の無機塩、糖、緩衝剤等を他の溶解液（以下「緩衝液交換用溶液」とも称する）のそれらと一部又は全部交換することにより、ヌクレオチド‐ペプチド複合体を残しつつ、当該複合体を含む溶解液中の前記無機塩及び／又は前記糖の濃度を低減させることを意味する。また、ヌクレオチド‐ペプチド複合体の溶解液からの前記無機塩及び前記糖の「除去」とは、当該溶解液において前記無機塩及び前記糖が実質的に含まれていない状態にすることを意味する。無機塩のかかる状態としては、ヌクレオチド‐ペプチド複合体の溶解液中の濃度が、好ましくは０．１ｍＭ以下であり、より好ましくは０．０１ｍＭ以下、特に好ましくは０ｍＭである。糖のかかる状態としては、ヌクレオチド‐ペプチド複合体の溶解液中の濃度が、好ましくは０．０１％以下であり、さらに好ましくは０．００１％以下、特に好ましくは０％である。

【0034】

「緩衝液交換」の方法としては、公知の脱塩及び／又はバッファー交換の方法を用いることができる。かかる方法としては、例えば、限外ろ過法、透析法、クロマトグラフィー法が挙げられる。

【0035】

本発明にかかる「限外ろ過」は、ヌクレオチド‐ペプチド複合体が通過せず、かつ無機塩及び糖等の低分子が通過するような分画分子量を有する限外ろ過膜を用いて行うことができる。限外ろ過膜の分離性能は、当業者であれば対象とするヌクレオチド、ペプチドの分子量を考慮し適宜選択することができるが、好ましくは分画分子量５～１５０ｋＤａであり、より好ましくは分画分子量１０～１００ｋＤａ、さらに好ましくは分画分子量２０～７０ｋＤａ、特に好ましくは分画分子量５０ｋＤａである。

【0036】

限外ろ過膜は、例えば、セルロース系、ポリスルホン系、ポリアクリロニトリル系、ポリフッ化炭化水素系の高分子膜が挙げられる。セルロース系高分子膜としては、例えば、再生セルロース、酢酸セルロース、ニトロセルロース、セルロース混合エステルが挙げられる。ポリスルホン系高分子膜としては、例えば、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリフェニルスルホン、ポリアリールスルホンが挙げられる。ポリフッ化炭化水素系高分子膜としては、例えば、ポリフッ化ビニリデンが挙げられる。また、限外ろ過膜の構造としては、例えば、平膜、スパイラル膜、中空糸膜が挙げられる。

【0037】

このような限外ろ過膜として、例えば、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５ ｕｌｔｒａｃｅｌ（再生セルロース、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）、１０Ｋマイクローザ ＳＩＰ－００１３（ポリスルホン膜、旭化成ケミカルズ社製）等の市販品を使用することができる。また、限外ろ過は、公知の方法により行うことができる。かかる公知の方法としては、例えば、遠心ろ過、クロスフローろ過が挙げられる。

【0038】

本発明にかかる「透析」は、ヌクレオチド‐ペプチド複合体が通過せず、かつ無機塩及び糖等の低分子が通過するようなポアサイズを有する透析膜を用いて行うことができる。透析膜のポアサイズは、当業者であれば対象とするヌクレオチド、ペプチドの分子量を考慮し適宜選択することができるが、好ましくは分画分子量５～１５０ｋＤａであり、より好ましくは分画分子量１０～１００ｋＤａ、さらに好ましくは分画分子量２０～７０ｋＤａ、特に好ましくは分画分子量５０ｋＤａである。

【0039】

透析膜は、例えば、前記限外ろ過膜同様の材質（セルロース系等）からなる高分子膜及び構造をとり得る。また、このような透析膜としては、例えば、ＭＦ－ミリポアメンブレン（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、カタログ番号：ＶＳＷＰ０２５００、ポアサイズ：０．０２５μｍ、材質：セルロース混合エステル）、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ７．Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｅ－ｔｒｅａｔｅｄ ＲＣ Ｔｕｂｉｎｇ（フナコシ社製、カタログ番号：１３２１１２、ポアサイズ：３．５ｋＤａ、材質：再生セルロース）等の市販品を使用することができる。また、透析は、公知の方法により行うことができる。かかる公知の方法としては、例えば、前記透析膜を備えた透析チューブ又は透析カセットを、外液として緩衝液交換用溶液に浸す方法が挙げられる。

【0040】

本発明にかかる「クロマトグラフィー」は、ヌクレオチド‐ペプチド複合体と無機塩及び糖等の低分子とを分離できるものであればよく、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー（ゲル濾過クロマトグラフィー、ゲル浸透クロマトグラフィー等）、吸着クロマトグラフィー（アフィニティクロマトグラフィー等）、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーが挙げられる。また、当業者であれば、ヌクレオチド‐ペプチド複合体と、無機塩及び糖等の低分子とにおける、大きさ、質量、吸着力、疎水性、親水性、電荷等の違いに基づき分離可能な、クロマトグラフィー、並びにそれを構成する固定相及び移動相を、適宜選択、調製することができる。

【0041】

本発明において、ヌクレオチド‐ペプチド複合体溶解液から、より緩慢に前記無機塩及び前記糖を除去することにより、ヌクレオチド‐ペプチド複合体の活性がより維持し易く、後述の微粒子をより安定的に担持し易くなるという観点から、緩衝液交換を多段階にて行なってもよい。その回数としては最終的に無機塩及び糖が実質的に含まれていない状態になればよく、特に制限はないが、例えば２回、３回、４回、５回が挙げられる。また、多段階の緩衝液交換にて用いられる方法は同一であってもよく、異なっていてもよい。

【0042】

「緩衝液交換用溶液」は、特に制限はなく、当業者であれば適宜調製することができ、通常、無機塩及び糖を含有しない緩衝液（以下「緩衝液のみ」とも称する）が用いられる。また、無機塩及び糖の双方が含まれる緩衝液を、多段階の緩衝液交換に供する場合には、例えば、最初に、糖のみを含む緩衝液との間で緩衝液交換することによって無機塩のみを除去し、次に、緩衝液のみとの間で緩衝液交換することによって糖を除去してもよい。また、最初に、無機塩のみを含む緩衝液との間で緩衝液交換することによって糖のみを除去し、次に、緩衝液のみとの間で緩衝液交換することによって無機塩を除去してもよい。さらに、無機塩及び／又は糖の濃度を段階的に下げた緩衝液との間で緩衝液交換することによって、最終的に無機塩及び糖を除去してもよい（より具体的には、２００ｍＭの無機塩及び２％の糖が含まれる緩衝液を多段階にて緩衝液交換する場合には、最初に、１００ｍＭの無機塩及び１％の糖が含まれる緩衝液との間で緩衝液交換し、次に、緩衝液のみとの間で緩衝液交換することによって最終的に無機塩及び糖を除去してもよい）。

【0043】

またこのような多段階の緩衝液交換は連続的に行なうこともできる。例えば、連続式透析装置を用い、緩衝液交換用溶液中の無機塩及び／又は糖の濃度を徐々に低減させていくことによって行なうことができる。また、アフィニティクロマトグラフィーにおいて、ヌクレオチド‐ペプチド複合体が結合している固定相に、無機塩及び／又は糖の濃度を徐々に低減させた緩衝液交換用溶液（所謂、グラジエントバッファー）を通すことによっても、多段階の緩衝液交換は連続的に行なうことができる。

【0044】

（ヌクレオチド‐ペプチド複合体で被覆した微粒子の調製）
無機塩及び糖が除去されたヌクレオチド‐ペプチド複合体溶解液を、パーティクルボンバードメント法において用いられる微粒子と混合することによって、当該微粒子は前記複合体によって覆われる。

【0045】

微粒子の素材は、特に制限されず、例えば、金、タングステン、磁性粒子（四酸化三鉄等）等の金属からなる微粒子（金属微粒子）が挙げられる。これらの中でも、金粒子が好ましい。微粒子の粒子径は、特に制限されないが、例えば０．０５～５μｍであり、好ましくは０．１～３μｍであり、より好ましくは０．２～ｌ．５μｍであり、さらに好ましくは０．４～０．８μｍである。

【0046】

本発明に係る「被覆」には、微粒子表面の全部が前記物質によって覆われていることのみならず、その一部が覆われている〈微粒子表面の一部に前記物質が付着している）状態も含まれる。ここで「一部」としては、微粒子表面の５０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくはほぼ全面（例えば、９５％以上）である。また「物質で被覆した微粒子」は、物質と微粒子との混合物の形態であってもよい。

【0047】

（微粒子の担体への塗布）
ヌクレオチド‐ペプチド複合体によって被覆された微粒子は、これらを含む混合液をパーティクルボンバードメント法において用いられる担体に担持させるため、塗布される。

【0048】

担体は、通常、パーティクルボンバードメント法においてマクロキャリアとも称される物質である。担体の素材は、特に制限されず、前記微粒子を担持させることが可能であり、またパーティクルボンバードメント法において圧力が加わった際には、前記微粒子を放出できるほど薄くできる素材であれば特に制限はなく、例えば、ポリイミド、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリテトラフルオロエチレン、ポリフェニレンサルファイド等の、所謂工業用フィルムに用いられる素材が挙げられる。担体の形状及びサイズとしては、後述のパーティクルボンバードメント装置に装着できる限り特に制限はないが、通常、直径２．５ｃｍの円板（ディスク）状である。その厚みとしては、上記素材の種類に応じて前記微粒子を放出できる程度に適宜変更され得るが、通常５～１００μｍ、好ましくは２５～７５μｍである。本発明にかかる担体として、好適にはＰＤＳ－１０００／Ｈｅ 用マクロキャリア（ＢｉｏＲａｄ社製、直径２．５ｃｍ、厚さ５０μｍ、材質：東レデュポン社製 カプロン（登録商標）（ポリイミド））等の市販品が挙げられる。また、担体への塗布は、通常、マイクロピペット等を用いて均一に行なうことができる。

【0049】

（脱気乾燥）
前記担体における、ヌクレオチド‐ペプチド複合体によって被覆された微粒子の担持は、脱気乾燥を施すことによって行なわれる。これにより、後述の実施例に示すとおり、風乾又は凍結乾燥による乾燥では生じる、ヌクレオチド‐ペプチド複合体の活性の低減や担体の不安定性が解消される。

【0050】

脱気乾燥は、例えば、後述の実施例に示すとおり、前記担体を入れた系内を減圧にすることによって行なうことができる。かかる減圧脱気の処理条件として、系内圧は、好ましくは５００ｈＰａ以下、より好ましくは３００ｈＰａ以下、さらに好ましくは１００ｈＰａ以下である。系内の温度は好ましくは１０～４０℃、より好ましくは１５～３０℃、さらに好ましくは室温（２２～２８℃）である。処理時間は、好ましくは５～６０分、さらに好ましくは１０～３０分である。また、このような条件での脱気は、市販の脱気装置（例えば、連続式真空脱気装置）を用いて行なうことができる。

【0051】

＜本発明のキット＞
本発明においては、上述の製造方法において用いられるキットを提供することもできる。かかるキットは下記物質の少なくとも１種を含むものである。
（Ａ）前記ペプチド及び前記ヌクレオチド
（Ｂ）無機塩及び／又は糖を含有する中性緩衝液
（Ｃ）前記緩衝液交換のために用いられる、限外ろ過膜、透析膜又はクロマトグラフィーの固定化相
（Ｄ）緩衝液交換用溶液（前記工程（１）にて得られた溶解液と緩衝液交換を行なうために用いられる、溶液）
（Ｅ）前記微粒子
（Ｆ）前記混合液が塗布される、担体。

【0052】

本発明のキットは、例えば、前記（Ａ）、（Ｃ）、（Ｄ）及び（Ｅ）を含むことが好ましく、また前記（Ｂ）～（Ｅ）を含むことが好ましく、前記（Ａ）～（Ｆ）の全てを含むことが特に好ましい。さらに、本発明のキットには、上述の製造方法等を示した説明書が含まれ得る。

【0053】

＜本発明の担体＞
上述のとおり、本発明の製造方法によれば、パーティクルボンバードメント法において用いられる、細胞内への導入物質（ヌクレオチド‐ペプチド複合体）がその活性を維持したまま微粒子を覆っており、かつ当該微粒子が安定的に担持されている担体を製造することができる。したがって、本発明は上記方法によって製造される担体も提供することができる。

【0054】

また言い換えれば、本発明は、後述の実施例に示すとおり、パーティクルボンバードメント法において用いられる、物質で被覆された微粒子が担持された担体であって、前記物質は、パーティクルボンバードメント法によって細胞に導入される、ペプチドとヌクレオチドとの複合体であり、かつ、前記微粒子が担持された表面において、中心から１０ｍｍ以内の領域における析出物が１００μｍ未満である、担体を、提供するものである。

【0055】

「析出物」は、無機塩類及び／又は糖から構成され、担体において前記微粒子が担持された表面に析出される物質であり、緩衝剤、前記導入物質及び微粒子が混在していてもよい。大きさとしては、１００μｍ未満、好ましくは２０μｍ以下であり、より好ましくは５μｍ以下である。なお、析出物の大きさは、当該物質の最長径を意味する。また、前記析出物は、担体の中心から１０ｍｍ以内の領域において、好ましくは１０個以内、より好ましくは５個以内、さらに好ましくは３個以内、特に好ましくは０個である。なお、「中心」とは幾何中心を意味する。

【0056】

また、本発明の担体が表面に備える、物質で被覆された微粒子及び緩衝剤からなる層において、緩衝剤と当該微粒子との重量比率は通常、緩衝剤：微粒子＝１：１～１：１０であり、好ましくは１：２～１：５である。

【0057】

＜本発明のパーティクルボンバードメント法＞
上述のとおり、本発明によれば、前記担体表面に塩等が析出することなく、さらにヌクレオチド‐ペプチド複合体の活性を維持できるため、当該析出物による損傷を抑えつつ、前記複合体を細胞内に導入し、機能させることが可能となる。

【0058】

したがって、本発明は、パーティクルボンバードメント法により細胞にヌクレオチド‐ペプチド複合体を導入する方法であって、前記本発明の担体に圧力を加えることにより、当該担体から放出された前記微粒子が、前記細胞に撃ち込まれる工程を含む、方法も提供する。

【0059】

以下、図１Ａ及び１Ｂを参照しながら本発明のパーティクルボンバードメント法の実施態様の例について説明する。

【0060】

パーティクルボンバードメント法においては、例えば、ヌクレオチド‐ペプチド複合体を撃ち込む前に、パーティクルボンバードメント装置１内を陰圧にした上で、ガス加速管２にガスをラプチャーディスク３が破壊圧力に達するまで供給される。次いで、図１Ｂに示すとおり、ラプチャーディスク３が破裂すること（破裂後のラプチャーディスク３ａ及び３ｂ）によって発生するガス衝撃圧力により、上述のヌクレオチド‐ペプチド複合体で被覆した微粒子５を下面に担持している担体４が、対象（細胞７）の方向に移動することとなる。そして、担体４がストッピングスクリーン６で停止し、担持されていた前記微粒子５のみが、支持体８に載せた対象（細胞７）へ撃ち込まれることとなる。

【0061】

なお、本発明は、当該図に示した形態のパーティクルボンバードメント装置に限定されることなく、前記担体に担持された微粒子を高速で射出できる装置であれば、その形態、射出形式等を問わず、当業者であれば、適宜その装置に合わせた条件等を設定し、本発明を実施し得る。

【0062】

本発明において、ヌクレオチド‐ペプチド複合体が導入される「細胞」としては、特に制限されることなく、動物由来のものであってもよく、植物由来のものであってもよい。

【0063】

細胞の由来となる「植物」については特に制限はなく、例えば、双子葉植物及び単子葉植物を含む被子植物、裸子植物、草本植物、並びに木本植物が挙げられる。植物のより具体的な例としては、トマト、タバコ、ピーマン、トウガラシ、ナス等のナス類；キュウリ、カボチャ、スイカ等のウリ類；キャベツ、ブロッコリー、ハクサイ、シロイヌナズナ等の菜類；セルリ一、パセリ一、レタス等の生菜・香辛菜類；ネギ、タマネギ、ニンニク等のネギ類；ダイズ、ラッカセイ、インゲン、エンドウ、アズキ、リョクトウ、ササゲ、ソラマメ等の豆類；イチゴ、メロン等のその他果菜類；ダイコン、カブ、ニンジン、ゴボウ等の直根類；サトイモ、キャッサバ、ジャガイモ、サツマイモ、ナガイモ等のイモ類；イネ、トウモロコシ、コムギ、ソルガム、オオムギ、ライムギ、ミナトカモジグサ、ソバ等の穀類；アスパラガス、ホウレンソウ、ミツバ等の柔菜類；ユリ、トルコギキョウ、ストック、カーネーション、キク等の花弁類；ベントグラス、コウライシバ等の芝類；ナタネ、ラッカセイ、セイヨウアブラナ、ナンヨウアブラギリ等の油料作物類；ワ夕、イグサ等の繊維料作物類；クローバー、デントコーン、タルウマゴヤシ等の飼料作物類；リンゴ、ナシ、ブドウ、モモ、キウイフルーツ等の落葉性果樹類；ウンシュウミカン、オレンジ、レモン、グレープフルーツ等の柑橘類；サツキ、ツツジ、スギ、ポプラ、パラゴムノキ、イチョウ、マツ等の木本類等が挙げられる。

【0064】

かかる植物に由来する細胞には、任意の組織中に存在する植物細胞又は任意の組織に由来する植物細胞が含まれる。このような組織としては、例えば、葉、根、根端、葯、花、種子、さや、茎、茎頂、胚、花粉が挙げられる。さらに、本発明の方法においては、人為的に処理された植物細胞（例えば、培養細胞、カルス、懸濁培養細胞）も対象とすることができる。また、本発明において「花粉」には、成熟花粉のみならず、未成熟花粉も含まれる。さらに、花粉を構成する細胞（雄原細胞、精細胞、花粉管細胞（栄養細胞）等）も、本発明の物質導入の対象となる花粉に含まれる。

【実施例】

【0065】

以下、実施例及び参考例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

【0066】

（参考例１） 凍結乾燥タンパク質の調製及びその評価
パーティクルボンバードメント法を用いてＲＮＡタンパク質複合体（以下「ＲＮＰ」とも称する）を花粉へ導入させるためには、ＲＮＰを金粒子と混合し、乾燥化しなければならない。そこで、先ずはＲＮＰを構成するタンパク質としてＣａｓ９タンパク質を用い、当該タンパク質を凍結乾燥化するための溶液組成について以下の方法にて検討した。

【0067】

（タンパク質溶液のバッファー置換及び凍結乾燥）
市販品である濃度５μｇ／μｌのＣａｓ９タンパク質（株式会社ファスマック）の組成を、所望の溶液の組成にすべく透析をおこなった。具体的には、分画分子量３．５ＫＤａの透析膜（富士フィルム和光純薬株式会社）内へＣａｓ９タンパク質を充填し、前記溶液を透析バッファーとして透析を行い、バッファー置換した。前記所望の溶液の組成に置換されたＣａｓ９タンパク質溶液を－８０℃にて凍結した後、凍結乾燥をおこなった。凍結乾燥法は、凍結乾燥機（型番：ＰＦＲ－１０００、ＥＹＥＬＡ 東京理化器械株式会社製）を用い、その使用法に準じて行なった。また、当該市販品を陽性コントロールとして使用した。ｐＨは全て７．５とした。

【0068】

（切断活性評価）
各組成で凍結乾燥したＣａｓ９タンパク質の活性を評価するために、凍結乾燥したＣａｓ９へ超純水を加えることで、５μｇ／μｌのＣａｓ９タンパク質へ戻し、そのうち３５００ｎｇ分を用いて当タンパク質の活性を評価すべく切断活性を確認した。

【0069】

切断活性を評価するための反応系として、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１００ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２及び１ｍＭ ＤＴＴからなる溶液中に、前記Ｃａｓ９タンパク質３５００ｎｇを、ゲノム編集のターゲット配列を含む２本鎖ＤＮＡ（配列番号：１に記載の配列からなるＤＮＡ）をｔｅｍｐｌａｔｅとして３００ｎｇ、ターゲット配列に有効なｃｒＲＮＡ（配列番号：２に記載の配列からなるＲＮＡ） ２８０ｎｇ、ｔｒａｃｒＲＮＡ ４６７ｎｇと共に添加し、調製した。また、ゲノム編集系の代わりに前記ｔｅｍｐｌａｔｅ ＤＮＡ ３００ｎｇのみを前記溶液に添加したものを、陰性コントロールとして使用した。

【0070】

そして、前記反応系を３７℃で１時間静置した後、ＳＴＯＰ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（３０％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ，１．２％ ＳＤＳ，２５０ｍＭ ＥＤＴＡ）を反応量の１／１０量添加し、３７℃，１５分反応させることで反応を停止した。

【0071】

更に６０℃ ５分間、次に氷上に５分間静置させ、各反応量のうちの１０μｌ分を５－２０％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ用ゲルにロードし、Ｔｒｉｓ－ａｃｅｔａｔｅ ＥＤＴＡ Ｂｕｆｆｅｒ（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ａｃｅｒａｒｅ，１ｍＭ ＥＤＴＡ）にて電気泳動した。そして、電気泳動後のゲルをＳＹＢＲ ｓａｆｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）にて染色して、ゲル中のＤＮＡを検出した。また、各反応系において検出されたｔｅｍｐｌａｔｅ ＤＮＡ量を、陰性コントロールにおけるｔｅｍｐｌａｔｅ ＤＮＡ量を１００とした場合の相対値として換算し、得られた値をｔｅｍｐｌａｔｅ ＤＮＡの切断率とした。

【0072】

また前記Ｔｒｉｓ－ａｃｅｔａｔｅ ＥＤＴＡ Ｂｕｆｆｅｒの代わりに、ＳＤＳ Ｂｕｆｆｅｒ（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ，０．１％ ＳＤＳ，１９１ｍＭ Ｇｌｙｃｉｎｅ）を用い、前記ゲルを電気泳動に供し、その後、ＣＢＢ染色にてゲル中のＣａｓ９タンパク質の量を検出した。

【0073】

その結果、図には示さないが、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、２００ｍＭ ＫＣｌ及び２％ スクロースからなる溶液にてＣａｓ９タンパク質を凍結乾燥させた場合、当該乾燥後も切断活性を維持していることが明らかとなった（陽性コントロール（市販品）における切断率が８６．１％であるのに対し、当該乾燥後のＣａｓ９タンパク質におけるそれは８９．４％であった）。

【0074】

なお、前記２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌの代わりに２０ｍＭ ＨＥＰＥＳを用いても同様の結果が得られた。また、前記凍結乾燥の前後においてＣａｓ９タンパク質量の有意な変化は認められなかった。

【0075】

（参考例２） 塩や糖を除いた場合のＲＮＰの安定性についての検討
参考例１において、凍結乾燥においてタンパク質の安定性を維持するための溶液の例を示したが、当該溶液中の塩濃度が高い。そのため、パーティクルボンバードメント法では多量の塩は析出してしまい、導入時に問題となることが懸念される（後述の参考例４ 参照）。

【0076】

そこで、タンパク質の安定性を維持しつつ、塩を除去するための条件について検討した。具体的には、Ｃａｓ９タンパク質 ３０００ｎｇを含む、３０μｌの前記溶液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，２００ｍＭ ＫＣｌ，２％ スクロース）を調製し、以下の異なる条件で膜透析法により塩や糖を除いていった。また、Ｃａｓ９タンパク質３０００ｎｇのみならず、ｃｒＲＮＡ（２４０ｎｇ）及びｔｒａｃｒＲＮＡ（４００ｎｇ）（これらＲＮＡを「ＲＮＡｍｉｘ」とも称する）も含む、前記溶液を調製し、ＲＮＰを複合体の状態のまま、以下に示す条件で膜透析法により塩や糖を除いていった。
（条件）
１：Ｃａｓ９ ３０００ｎｇを含む溶液から、膜透析法により、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌへ置換した。
２：Ｃａｓ９ ３０００ｎｇを含む溶液から、膜透析法により、純水（Ｈ_２Ｏ）へ置換した。
３：Ｃａｓ９タンパク質 ３０００ｎｇ及びＲＮＡｍｉｘを含む溶液から、膜透析法により、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌへ置換した。
４：Ｃａｓ９タンパク質 ３０００ｎｇ及びＲＮＡｍｉｘを含む溶液から、膜透析法により、純水（Ｈ_２Ｏ）へ置換した。
５：Ｃａｓ９タンパク質 ３０００ｎｇ及びＲＮＡｍｉｘを含む溶液から、膜透析法により、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ及び２％スクロースからなる溶液へ置換した。
６：Ｃａｓ９タンパク質 ３０００ｎｇ及びＲＮＡｍｉｘを含む溶液から、２ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ及び０．２％スクロースからなる溶液へ置換した。

【0077】

膜はＭＦ－Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｆｉｌｔｅｒ ０．０２５μｍ，ＶＳＷＰ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を使用した。置換したいバッファーを容器に満たし、水面に膜を浮かせて膜上にＣａｓ９タンパク質溶液を静置した。バッファー置換後、Ｎｏ１，２の条件にはｃｒＲＮＡ，ｔｒａｃｒＲＮＡ及びｔｅｍｐｌａｔｅ ＤＮＡを混合し、Ｎｏ３－６の条件にはｔｅｍｐｌａｔｅ ＤＮＡのみを添加して、参考例１と同様に切断活性評価をおこなった。得られた結果を図２に示す。

【0078】

その結果、図２に示すとおり、Ｃａｓ９タンパク質単独での塩、糖の除去は、切断活性が著しく低下した。一方、ＲＮＰでは、活性の低下が生じることなく、Ｎｏ３，５，６の条件において塩、糖濃度の減少・除去をおこなうことができた。しかしながら、Ｈ_２Ｏへ置換した場合では、ＲＮＰであっても活性を保持することができず、切断活性の低下が生じてしまった。

【0079】

（参考例３） 塩や糖を除く場合のバッファー置換法及び乾燥法についての検討
参考例２に示した結果から、最終的に糖も除いた２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌのみで、活性を保持したままＲＮＰの乾燥化が可能であることが示唆される。そこで、より安定的に塩や糖を除去する方法としてのバッファー置換法の検討、及び乾燥法についての検討を行なった。

【0080】

具体的には、Ｃａｓ９タンパク質 ３５００ｎｇ、ｃｒＲＮＡ ２８０ｎｇ及びｔｒａｃｒＲＮＡ ４６７ｎｇを含む、３０μｌの前記溶液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，２００ｍＭ ＫＣｌ，２％ スクロース）を調製し、ＲＮＰを複合体の状態としたまま、以下に示す条件で限外ろ過法により塩や糖を除いていった。
１：限外ろ過法により、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ及び２％スクロースからなる溶液に置換し、その後２０ｍＭ Ｔｒｉｓへの置換を行い、その後凍結乾燥を行なった。
２：限外ろ過法により、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ及び２％スクロースからなる溶液に置換し、その後２０ｍＭ Ｔｒｉｓへの置換を行い、その後風乾した。
３：Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＤＮＡのみ（陰性コントロール）
４：Ｃａｓ９タンパク質 ３５００ｎｇ のみ
なお、限外ろ過法ではＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５ ｕｌｔｒａｃｅｌ，５０ｋＤａ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）のカラムを使用した。また、乾燥法について検討するため、前記のとおり、凍結乾燥（参考例２と同様）、又は風乾（Ａｉｒ－Ｄｒｙ）を行なった。また、乾燥後は、参考例１同様に、乾燥体へ超純水を加え、ｔｅｍｐｌａｔｅ ＤＮＡを加えて、切断活性評価を行なった。得られた結果を図３に示す。

【0081】

その結果、図３に示すとおり、条件１、すなわち限外ろ過により緩衝液交換した後、凍結乾燥した場合において極めて高い切断活性が認められた。一方、条件２における切断活性が示すとおり、前記緩衝液交換を施した後であっても風乾した場合には、切断活性が半減してしまった。したがって、緩衝液交換後の乾燥方法は、風乾より凍結乾燥の方が望ましいことも明らかとなった。

【0082】

そこで、次に、条件１を用いてパーティクルボンバードメント法におけるＲＮＰ担持ディスクを作製した。

【0083】

具体的には先ず、Ｃａｓ９ ３５００ｎｇ、ｔｒａｃｒＲＮＡ ４６７ｎｇ及びｃｒＲＮＡ ２８０ｎｇを３０μｌの前記溶液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，２００ｍＭ ＫＣｌ，２％ スクロース）において混合し、ＲＮＰを調製した。次いで、限外ろ過法により、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ及び２％スクロースからなる溶液に置換し、その後２０ｍＭ Ｔｒｉｓへの置換を行なった。一方、０．６μｍ径の金粒子（ＢＩＯ－ＲＡＤ社製）を１００％エタノールで洗浄し、滅菌水で懸濁して３０ｍｇ／ｍｌ金溶液を調製した。そして、前記緩衝液交換後のＲＮＰ溶液２０μｌへ、金溶液を１回の撃ち込みにつき１０μｌを加え、パーティクルボンバードメント用マクロキャリア（ＢｉｏＲａｄ社製 ＰＤＳ－１０００／Ｈｅ 用マクロキャリア）１枚に、３０μｌ分を装填し、－８０℃にて凍結させた。その後凍結乾燥を行い、ディスクを作製した。

【0084】

その結果、図４に示すとおり、このようにして調製した、ＲＮＰを装填・乾燥後のディスク表面の中央部分には白い析出物が認められ（図中、三角にて指し示す箇所）、崩れやすいことが明らかになった。

【0085】

（実施例１） 乾燥法についての検討２
上記のとおり、凍結乾燥法はＲＮＰの活性を維持するという観点からは望ましい乾燥法と言えるが、パーティクルボンバードメント法への適用において不安定であることが明らかになった。

【0086】

そこで、脱気乾燥法により風乾と凍結乾燥の間の状態での乾燥を試みた。具体的には、参考例３における凍結乾燥法の代わりに脱気乾燥法を用いてＲＮＰ担持ディスクを調製した。当該脱気乾燥法においては、ＲＮＰと金粒子の混合溶液をマクロキャリアに装填し、凍結乾燥機を用いて、約１００ｈＰａの減圧下にて（１気圧の約１／１０）、キャリア上のＲＮＰ及び金粒子が溶液中に存在したまま、２５℃、約２０分で乾燥する条件で乾燥を行なった。この条件下では、試料は乾燥時凍結することなく、液体から徐々に乾燥する。

【0087】

一方、比較対象として、参考例３に示したとおり、凍結乾燥法においては、試料を凍結させ、その後可能な限り真空状態で吸引することで、凍結した状態で試料を乾燥させ、ＲＮＰ担持ディスクを調製した。

【0088】

その結果、上述のとおり、凍結乾燥法により調製したディスクにおいては、中央に溶液が析出したものとみられる粉のようなものが生じ（図中、三角にて指し示す箇所）その周囲も脆くなっていた（図４ 参照）。一方、脱気乾燥により調製したディスクにおいては、図５に示すとおり、凍結乾燥法において認められたような析出が生じることなく、また、試料（ＲＮＰと金粒子の混合物等）はマクロキャリア上において、均一に装填・乾燥化しており、図４にて示すものと比較すると脆くなく、試料もしっかりと担持されていた。

【0089】

また、Ｃａｓ９タンパク質 ３５００ｎｇ、ｃｒＲＮＡ ２８０ｎｇ及びｔｒａｃｒＲＮＡ ４６７ｎｇを含む、３０μｌの前記溶液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，２００ｍＭ ＫＣｌ，２％ スクロース）を調製し、ＲＮＰを複合体の状態にて、前記緩衝液交換により塩及び糖を除去した後、下記条件にて凍結乾燥又は脱気乾燥を行い、乾燥後は、参考例１同様に、乾燥体へ超純水を加え、ｔｅｍｐｌａｔｅ ＤＮＡを加えて、切断活性評価をおこなった。

【0090】

その結果、図６に示すとおり、乾燥法を凍結乾燥から脱気乾燥に変更しても、ＲＮＰの切断活性は高いまま維持されていた。

【0091】

（参考例４） 溶液組成についての検討
上記実施例１において、パーティクルボンバードメント法におけるＲＮＰ担持ディスクの安定性を維持するという観点から、脱気乾燥法が有効であることが明らかになった。

【0092】

次に、以下に示すとおり、ＲＮＰ溶液の組成を変更してＲＮＰ担持ディスクを調製し、蛍光顕微鏡にて観察した。
１．実施例１に示す条件
Ｃａｓ９ ３５００ｎｇ、ｔｒａｃｒＲＮＡ ４６７ｎｇ及びｃｒＲＮＡ ２８０ｎｇを、３０μｌの前記溶液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，２００ｍＭ ＫＣｌ，２％ スクロース）において混合し、ＲＮＰを調製した。次いで、限外ろ過法により、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ及び２％スクロースからなる溶液と緩衝液交換し、その後２０ｍＭ Ｔｒｉｓとの緩衝液交換を行なった。一方、０．６μｍ径の金粒子（ＢＩＯ－ＲＡＤ社製）を１００％エタノールで洗浄し、滅菌水で懸濁して３０ｍｇ／ｍｌ金溶液を調製した。そして、前記緩衝液交換後のＲＮＰ溶液２０μｌへ、金溶液を１回の撃ち込みにつき１０μｌを加え、パーティクルボンバードメント用マクロキャリア１枚に、３０μｌ分を装填し、前記脱気乾燥法によりＲＮＰ担持ディスクを調製した。
２．非特許文献３に記載の条件に相当する条件
前記溶液の代わりに、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）及び１５０ｍＭ ＫＣｌからなる溶液を用い、さらに限外ろ過法による２段階交換を行なわずにＲＮＰ溶液を調製した以外は前記実施例１に示す条件にて、ＲＮＰ担持ディスクを調製した。

【0093】

図７に示すとおり、図５の試料装填部分を光学顕微鏡にて観察した結果、実施例１に示す条件では、装填された混合物は、脱気乾燥により乾燥化し、非常に細かく密で均一な状態で担持されていることが明らかになった。すなわち、図中（カラー表示下）赤線内に囲まれた、略４分の１円の黒い領域にて、黒い微粒子が均一に担持されており、物質に被覆された金粒子がだまになることなく、一面に存在している状態が認められた。

【0094】

一方、非特許文献３に相当する条件にて作製したディスクでは、図８に示すとおり、塩の影響からか、１００μｍ以上の析出物が多く存在し（図中、三角にて指し示す箇所）、また大きな析出物も存在していた、なお、図８に示す円の端側は、物質に被覆された金粒子が寄ってしまい、析出物中に取り込まれ黒い析出物となっている（図中（ｂ）で示す領域）。通常、細胞の大きさは１００μｍ以下であるため、このような担体では、析出物によって、細胞へのＲＮＰの導入は困難となるばかりか、それら析出物の衝撃により細胞に多大な障害をもたらすことが推定される。

【0095】

以上のことから、析出に大きく影響を与える塩や糖含量を最小化させるためには、限外ろ過法等の緩衝液交換によって塩等を除去することが必要であることが明らかになった。さらに、その後の乾燥法として脱気乾燥法を用いることにより前記析出が抑えられ、細胞へのダメージ少なく、ヌクレオチド‐ペプチド複合体を導入し得るカセットを作製することが可能。また、表面の脆さも解消することができたことから、輸送や保存も可能なカセットの作製が可能となった。

【産業上の利用可能性】

【0096】

以上説明したように、本発明によれば、物質（ヌクレオチド‐ペプチド複合体）を細胞内へ導入することにより新たな機能が付加された細胞を提供することができる。このため、バイオマス、機能性食材、医薬品材料等の生産・開発の場としても非常に有用であり、本発明は、様々な産業用途においても多大な貢献をもたらすものである。

【符号の説明】

【0097】

１…パーティクルボンバードメント装置、２…ガス加速管、３…ラプチャーディスク、３ａ…破裂後のラプチャーディスク、３ｂ…破裂後のラプチャーディスク、４…担体、５…物質で被覆した微粒子、６…ストッピングスクリーン、７…細胞、８…支持体。

【図1A】

【図1B】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【配列表】

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