特許 7530391 がんの治療のためのＥＧＦＲ阻害剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-07-30

(45)【発行日】2024-08-07

(54)【発明の名称】がんの治療のためのＥＧＦＲ阻害剤

(51)【国際特許分類】

   C07D 487/04 20060101AFI20240731BHJP

   A61K 31/5377 20060101ALI20240731BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240731BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240731BHJP

【ＦＩ】

C07D487/04 138

C07D487/04 CSP

A61K31/5377

A61P35/00

A61P43/00 111

【請求項の数】 12

(21)【出願番号】P 2021576032

(86)(22)【出願日】2020-06-19

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-09-02

(86)【国際出願番号】 EP2020067076

(87)【国際公開番号】W WO2020254562

(87)【国際公開日】2020-12-24

【審査請求日】2023-06-15

(31)【優先権主張番号】19181754.3

(32)【優先日】2019-06-21

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】514099673

【氏名又は名称】エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】ドレンテ， コジモ

(72)【発明者】

【氏名】ゴアグラー， アニック

(72)【発明者】

【氏名】ヘウィングス， デーヴィッド

(72)【発明者】

【氏名】ジェスキー， ゲオルク

(72)【発明者】

【氏名】クーン， ベルント

(72)【発明者】

【氏名】ナゲル， イボンヌ アリス

(72)【発明者】

【氏名】オブスト ザンダー， ウルリーケ

(72)【発明者】

【氏名】リッチ， アントニオ

(72)【発明者】

【氏名】ルーハー， ダニエル

(72)【発明者】

【氏名】シュタイナー， サンドラ

【審査官】谷尾 忍

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１８／１１５２１８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１８／２２０１４９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２０２２－５３７１９１（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０２２－５３７７６９（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０２２－５３８０５５（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０２２－５３７７７２（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０２２－５３７７７１（ＪＰ，Ａ）

【文献】特許第７４１１５８８（ＪＰ，Ｂ２）

【文献】NATURE，2016年，534(7605)，p.129-132

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ０７Ｄ ４８７／０４

Ａ６１Ｋ ３１／５３７７

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

式（Ｉ）

の化合物、またはその薬学的に許容される塩。

【請求項2】

式（Ｉ）

の化合物である、請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物。

【請求項3】

請求項１または２に記載の化合物を含む、治療的に活性な物質として使用するための組成物。

【請求項4】

請求項１または２に記載の化合物と、治療的に不活性な担体とを含む、薬学的組成物。

【請求項5】

請求項１または２に記載の化合物を含む、がんの治療または予防において使用するための組成物。

【請求項6】

請求項１または２に記載の化合物を含む、非小細胞肺がんの治療または予防において使用するための組成物。

【請求項7】

請求項１もしくは２に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩を含む、がんを治療または予防するための医薬。

【請求項8】

請求項１もしくは２に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩を含む、非小細胞肺がんを治療または予防するための医薬。

【請求項9】

がんを治療または予防するための医薬を調製するための、請求項１または２に記載の化合物の使用。

【請求項10】

非小細胞肺がんを治療または予防するための医薬を調製するための、請求項１または２に記載の化合物の使用。

【請求項11】

有効量の請求項１または２に記載の化合物を含む、がんを治療または予防するための医薬。

【請求項12】

有効量の請求項１または２に記載の化合物を含む、非小細胞肺がんを治療または予防するための医薬。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＥＧＦＲ突然変異体を含むＴ７９０Ｍ／Ｌ８５８Ｒ、Ｔ７９０Ｍ／Ｌ８５８Ｒ／Ｃ７９７Ｓ、Ｌ８５８Ｒ、Ｌ８５８Ｒ／Ｃ７９７Ｓの選択的アロステリック阻害剤である化合物、それらの製造、それらを含有する薬学的組成物、および治療的に活性な物質としてのそれらの使用を提供する。

【0002】

本発明は、式（Ｉ）

の新規化合物、またはその薬学的に許容され得る塩を提供する。

【背景技術】

【0003】

ＨＥＲファミリ受容体チロシンキナーゼは、細胞増殖、分化、および生存のメディエータである。この受容体ファミリには、４つの異なるメンバ、すなわち、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ１、またはＨＥＲ１）、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２）、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）、およびＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４）が含まれる。リガンドが結合すると、受容体はホモ二量体およびヘテロ二量体を形成し、続く内因性チロシンキナーゼ活性を活性化することにより、受容体の自己リン酸化および下流シグナル伝達分子が活性化される（Ｙａｒｄｅｎ，Ｙ．，Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉ，ＭＸ．Ｕｎｔａｎｇｌｉｎｇ ｔｈｅ ＥｒｂＢ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｎｅｔｗｏｒｋ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００１ Ｆｅｂ；２（２）：１２７－３７）。過剰発現または突然変異によるＥＧＦＲの脱調節は、結腸直腸がん、膵臓がん、神経膠腫、頭頸部がん、および肺がんを含む多くの種類のヒトがん、特に非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）に関係しており、いくつかのＥＧＦＲ標的化剤が長年にわたって開発されている（（Ｃｉａｒｄｉｅｌｌｏ，Ｆ．，およびＴｏｒｔｏｒａ，Ｇ．（２００８）．ＥＧＦＲ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３５８，１１６０－１１７４）。ＥＧＦＲチロシンキナーゼの可逆的阻害剤であるエルロチニブ（タルセバ（登録商標））は、再発ＮＳＣＬＣの治療として数多くの国で承認されている。

【0004】

腫瘍が体細胞キナーゼドメイン変異を有するＮＳＣＬＣ患者の一部では、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の顕著な単剤活性が観察されるが、野生型ＥＧＦＲ患者における臨床的有益性は大幅に低下する（Ｐａｅｚら）（２００４）。ＥＧＦＲ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ：ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ３０４，１４９７－１５００）。ＥＧＦＲの最も一般的な体細胞変異は、最も一般的な突然変異であるデルタ７４６～７５０によるエキソン１９欠失、および最も高頻度な変異であるＬ８５８Ｒによるエキソン２１アミノ酸置換である（Ｓｈａｒｍａ ＳＶ，Ｂｅｌｌ ＤＷ，Ｓｅｔｔｌｅｍａｎ Ｊ，Ｈａｂｅｒ ＤＡ．Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ．２００７Ｍａｒ；７（３）：１６９－８１）。

【0005】

治療抵抗性は高頻度で発生し、受容体のＡＴＰ部位内の二次的Ｔ７９０Ｍ変異に起因することが多い。いくつかの開発された変異選択的不可逆性阻害剤はＴ７９０Ｍ変異体に対して高度に活性であるが、これらの有効性は、鍵となる共有結合をこれらが形成するシステイン残基であるＣ７９７Ｓの後天性変異によって損なわれる可能性がある（Ｔｈｒｅｓｓ，Ｋ．Ｓ．ら．Ａｃｑｕｉｒｅｄ ＥＧＦＲ Ｃ７９７Ｓ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ＡＺＤ９２９１ ｉｎ ｎｏｎ－ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｈａｒｂｏｒｉｎｇ ＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２１，５６０－５６２（２０１５））Ｃ７９７Ｓ変異は、Ｔ７９０Ｍ標的化ＥＧＦＲ阻害剤に対する耐性の有力なメカニズムであることがＷａｎｇによってさらに報告された（Ｗａｎｇら．ＥＧＦＲ Ｃ ７９７ Ｓ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｔｈｉｒｄ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｉｎ Ｔ７９０Ｍ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｎｏｎ－ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ，Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ．２０１６；９：５９）。オシメルチニブに対する耐性を引き起こす更なる突然変異は、Ｙａｎｇによって説明されており、たとえば、ＮＳＣＬＣ治療におけるＥＧＦＲ^{Ｌ８５８Ｒ／Ｔ７９０Ｍ}およびＥＧＦＲ^{Ｌ８５８Ｒ／Ｔ７９０Ｍ／Ｃ７９７Ｓ}耐性変異の標的化に関する総説におけるＬ７１８Ｑの報告がある（Ｙａｎｇら，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｎｇ Ｎｏｖｅｌ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｔｏ Ｔｈｉｒｄ－Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ＥＧＦＲ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｏｓｉｍｅｒｔｉｎｉｂ ｉｎ Ｎｏｎ－Ｓｍａｌｌ Ｃｅｌｌ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ｐａｔｉｅｎｔｓ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＤＯＩ：１０．１１５８／１０７８－０４３２．ＣＣＲ－１７－２３１０）Ｌｕら（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＥＧＦＲ^{Ｌ８５８Ｒ／Ｔ７９０Ｍ} ａｎｄ ＥＧＦＲ^{Ｌ８５８Ｒ／Ｔ７９０Ｍ／Ｃ７９７Ｓ}ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ＮＳＣＬＣ：Ｃｕｒｒｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｍｅｄ Ｒｅｓ Ｒｅｖ２０１８；１－３２）。

【0006】

最も利用可能なＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤はキナーゼのＡＴＰ部位を標的とするので、例えば薬剤耐性ＥＧＦＲ変異体を標的とすることによる、異なる働きをする新しい治療剤が必要である。

【0007】

最近の研究では、意図的にアロステリック部位を標的にすることにより、変異選択的阻害剤につながる可能性があることが示唆されている（ＪｉａらＯｖｅｒｃｏｍｉｎｇ ＥＧＦＲ（Ｔ７９０Ｍ）ａｎｄ ＥＧＦＲ（Ｃ７９７Ｓ）ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｗｉｔｈ ｍｕｔａｎｔ－ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，Ｊｕｎｅ２０１６，Ｎａｔｕｒｅ５３４，１２９－１３２）。

【0008】

がんの治療処置および／または予防処置に有用なＥＧＦＲ変異体を含有するＴ７９０Ｍ／Ｌ８５８Ｒ、Ｔ７９０Ｍ／Ｌ８５８Ｒ／Ｃ７９７Ｓ、Ｌ８５８Ｒ、Ｌ８５８Ｒ／Ｃ７９７Ｓ、特にＥＧＦＲ突然変異体を含有するＴ７９０ＭおよびＣ７９７Ｓを特異的に阻害する選択的分子の生成が、まさに必要とされている。

【0009】

国際公開第ＷＯ２００９１５８３６９号には、ある特定の複素環式抗菌剤が記載されている。国際公開第ＷＯ２０１６１８３５３４号には、ＥＢＮＡ１阻害剤として好適なある特定の複素環式化合物が記載されている。国際公開第ＷＯ２０１１１２８２７９号には、ｍＧｌｕＲ５修飾物質として好適なある特定の複素環式化合物が記載されている。

【発明の概要】

【0010】

「薬学的に許容され得る塩」との用語は、生物学的にまたは別様に望ましくないものではない、遊離塩基または遊離酸の生物学的有効性および特性を保持する塩を指す。塩は、無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸など、特に塩酸、ならびに有機酸、例えば酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、サリチル酸、Ｎ－アセチルシステインなどにより形成される。また、これらの塩は、遊離酸に無機塩基や有機塩基を添加して調製してもよい。無機塩基に由来する塩には、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウムおよびマグネシウム塩などが含まれるがこれらに限定されない。有機塩基に由来する塩には、第一級、第二級、および第三級アミン、天然に存在する置換アミンを含む置換アミン、環式アミンおよび塩基性イオン交換樹脂、例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、リジン、アルギニン、Ｎ－エチルピペリジン、ピペリジン、ポリイミン樹脂などの塩が含まれるがこれらに限定されない。式（Ｉ）の化合物の特に薬学的に許容され得る塩としては、塩酸塩、メタンスルホン酸塩、クエン酸塩等が挙げられる。

【0011】

略語のｕＭはマイクロモルを意味し、記号μＭに相当する。

【0012】

略語のｕＬはマイクロリットルを意味し、記号μＬに相当する。

【0013】

略語のｕｇはマイクログラムを意味し、記号のμｇに相当する。

【0014】

式（Ｉ）の化合物は、数個の不斉中心を含み得、光学的に純粋なエナンチオマー、例えばラセミ体などのエナンチオマーの混合物、光学的に純粋なジアステレオ異性体、ジアステレオ異性体の混合物、ジアステレオ異性のラセミ体またはジアステレオ異性のラセミ体の混合物として存在し得る。

【0015】

Ｃａｈｎ－Ｉｎｇｏｌｄ－Ｐｒｅｌｏｇ則によれば、不斉炭素原子は、「Ｒ」または「Ｓ」立体配置のものであり得る。

【0016】

また、本発明の一実施形態は、本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物、およびその薬学的に許容され得る塩であり、より詳細には本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物である。

【0017】

本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物を製造するための工程も本発明の対象である。

【0018】

本発明における式Ｉの化合物を官能基で誘導体化して、インビボで親化合物に変換して戻し得る誘導体を提供し得ることが、理解されるであろう。

【0019】

本発明のある特定の実施形態は、治療的に活性な物質として使用するための、本明細書に記載の式Ｉの化合物またはその薬学的に許容され得る塩に関する。

【0020】

本発明のある特定の実施形態は、がん、特に非小細胞肺がんの治療および／または予防治療で使用するための、本明細書に記載の式Ｉの化合物またはその薬学的に許容され得る塩に関する。

【0021】

本発明のある特定の実施形態は、非小細胞肺がんの治療および／または予防治療で使用するための、本明細書に記載の式Ｉの化合物またはその薬学的に許容され得る塩に関する。

【0022】

本発明のある特定の実施形態は、がん、特に非小細胞肺がんの治療および／または予防治療のための薬品を製造するための、本明細書に記載の式Ｉの化合物またはその薬学的に許容され得る塩に関する。

【0023】

本発明のある特定の実施形態は、本明細書に記載の式Ｉの化合物またはその薬学的に許容され得る塩、および薬学的に許容され得る補助物質を含む、薬学的組成物に関する。

【0024】

本発明のある特定の実施形態は、本明細書に記載の式Ｉの化合物またはその薬学的に許容され得る塩を患者に投与することによる、がん、特に非小細胞肺がんの治療および／または予防治療のための方法に関する。

【0025】

本発明のある特定の実施形態は、がん、特に非小細胞肺がんに罹患したＥＧＦＲ活性化突然変異を有する患者の治療処置および／または予防処置において薬品として使用するための、本明細書に記載の式Ｉの化合物またはその薬学的に許容され得る塩に関し、該患者におけるＥＧＦＲ活性化突然変異状態を決定し、次いで、本明細書に記載の式Ｉの化合物またはその薬学的に許容され得る塩を該患者に投与することを含む。

【0026】

本発明のある特定の実施形態は、がん、特に非小細胞肺がんに罹患したＥＧＦＲ突然変異Ｔ７９０Ｍ／Ｌ８５８Ｒ、Ｔ７９０Ｍ／Ｌ８５８Ｒ／Ｃ７９７Ｓ、Ｌ８５８Ｒ、および／またはＬ８５８Ｒ／Ｃ７９７Ｓを有する患者の治療および／または予防治療において薬品として使用するための、本明細書に記載の式Ｉの化合物またはその薬学的に許容され得る塩に関し、該患者におけるＥＧＦＲ活性化突然変異状態を決定し、次いで、本明細書に記載の式Ｉの化合物またはその薬学的に許容され得る塩を該患者に投与することを含む。

【0027】

本発明のある特定の実施形態は、がん、特に非小細胞肺がんに罹患した、ｃｏｂａｓ（登録商標）ＥＧＦＲ変異検出キットｖ２．０で決定されたＥＧＦＲ活性化突然変異を有する患者の治療および／または予防治療において薬品として使用するための、本明細書に記載の式Ｉの化合物またはその薬学的に許容され得る塩に関し、該患者におけるＥＧＦＲ活性化突然変異状態を決定し、次いで、本明細書に記載の式Ｉの化合物またはその薬学的に許容され得る塩を該患者に投与することを含む。

【0028】

更に、本発明は、適用可能な場合はいつでも、式Ｉの化合物の対応する重水素化形態のすべての置換基を含む。

【0029】

式Ｉの化合物は、１つ以上の不斉中心を含み得、したがって、ラセミ体、ラセミ混合物、単一鏡像異性体、ジアステレオ異性混合物、および個々のジアステレオマとして生じ得る。分子上の種々の置換基の性質に応じて、付加的な不斉中心が存在してもよい。このような不斉中心の各々は独立して２つの光学異性体を生成し、混合物および純粋または部分的に精製された化合物として可能性のある光学異性体およびジアステレオマの全てが、本発明に含まれることが意図される。本発明は、これらの化合物のそのような異性体形態の全てを包含することを意味する。これらのジアステレオマの独立した合成またはそれらのクロマトグラフィによる分離は、本明細書で開示された方法を適切に修正することで、当技術分野で公知のように達成することができる。それらの絶対立体化学は、結晶生成物または結晶中間体のＸ線結晶学によって決定することができ、これらは、必要であれば、既知の絶対配置の不斉中心を含む試薬で誘導体化される。所望であれば、化合物のラセミ混合物を分離して、個々の鏡像異性体を単離し得る。分離は、化合物のラセミ混合物を鏡像異性的に純粋な化合物にカップリングさせてジアステレオ異性混合物を形成し、続いて、分別再結晶化またはクロマトグラフィのような標準的方法によって個々のジアステレオマを分離するような、当該技術分野で公知の方法で行うことができる。

【0030】

一実施形態では、光学的に純粋な鏡像異性体が提供される場合、光学的に純粋な鏡像異性体とは、化合物が所望の異性体を９０重量％超、具体的には所望の異性体を９５重量％超、またはより具体的には所望の異性体を９９重量％超含有することを意味し、該重量パーセントは、化合物の異性体の全重量を基準とする。キラル的に純粋なまたはキラルに富む化合物は、キラル選択的合成によって、または鏡像異性体の分離によって調製し得る。鏡像異性体の分離は、最終生成物で、または代替的に好適な中間体に対して行うことができる。

【0031】

また、本発明の一実施形態は、記載された工程のいずれか１つにより製造された場合、本明細書に記載された式（Ｉ）の化合物である。

【発明を実施するための形態】

【0032】

アッセイ手順
ＨＴＲＦ Ｐｈｏｓｐｈｏ ＥＧＦＲ ＴＭＬＲＣＳアッセイ（細胞）
細胞株および培地
ＢａＦ３－ＴＭＬＲＣＳ細胞株を、Ｃｒｏｗｎｂｉｏ（米国カリフォルニア州サンディエゴ）から得た。細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＲＰＭＩ ＡＴＣＣ（Ｇｉｂｃｏ ３１８７０）＋２ｍＭグルタミン＋ピューロマイシン０．５μｇ／ｍＬ中にて、３７℃、５％ＣＯ_２で維持した。

【0033】

プロトコル
プレートが、１２．５ｎｌの試験される化合物（用量反応）のＤＭＳＯ溶液またはＤＭＳＯのみで予め充填された後、１２．５μｌの増殖培地／ウェル中において、２０，０００細胞／ウェルでＧｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅの第７８４－０８号マイクロタイタープレートに上記のように細胞を移す。プレートを３００×ｇで３０秒間回転させた後、細胞を４時間、３７℃、５％ＣＯ２、湿度９５％でインキュベートした。細胞を、４μｌ／ウェルの補充された溶解緩衝液（Ｃｉｓ－ｂｉｏ、リン酸化ＥＧＦＲ ＨＴＲＦキット、６４ＥＧ１ＰＥＨ）の化合物混合物に添加することによって溶解し、続いて、振盪しながら（４００ｒｐｍ）３０分間室温でインキュベートした。次いで、プレートを凍結し、－８０℃で一晩保存した。翌日、プレートを解凍した後に、補充した検出緩衝液中で調製した抗リン酸化ＥＧＦＲクリプテートと抗リン酸化ＥＧＦＲ－ｄ２抗体溶液との混合物４μＬを、各ウェルに加えた。次いで、蓋をしたプレートを４時間室温でインキュベートし、その後、Ｅｎｖｉｓｉｏｎリーダ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて６１６および６６５ｎｍでの蛍光発光を読み取った。データは、６６５対６１６の信号の正規化された比に１０，０００を乗じて、上記と同様の方法で分析した。

【0034】

結果を表１に示す。

【0035】

式（Ｉ）の化合物およびその薬学的に許容され得る塩は、医薬（例えば薬学的調製物の形態の）として使用し得る。本発明の医薬製剤は、経口投与（例えば、錠剤、被覆錠剤、ドラジェ、硬軟ゼラチンカプセル、溶液、乳剤または懸濁液の形）、経鼻投与（例えば、鼻スプレーの形）、直腸投与（例えば、座薬の形）、または眼局所投与（例えば、溶液、軟膏、ゲルまたは水溶性高分子挿入剤の形）などの内服投与が可能である。しかしながら、投与は、筋肉内、静脈内、眼内などの非経口的に（例えば、滅菌注射液の形で）行うこともできる。

【0036】

式（Ｉ）の化合物およびその薬学的に許容され得る塩は、錠剤、コーティングされた錠剤、糖衣錠、硬ゼラチンカプセル、注射液または局所製剤の製造のために、薬学的に不活性な、無機または有機アジュバントで処理し得る。ラクトース、コーンスターチまたはその誘導体、タルク、ステアリン酸またはその塩などは、錠剤、糖衣錠および硬ゼラチンカプセルのためのそのようなアジュバントとして、使用し得る。

【0037】

軟質ゼラチンカプセルに適したアジュバントとしては、例として、植物油、ワックス、油脂、半固形物、液体ポリオール等が挙げられる。

【0038】

液剤およびシロップ剤の生産に適したアジュバントは、例えば、水、ポリオール、サッカロース、転化糖、グルコースなどである。

【0039】

注射液に適したアジュバントは、例えば、水、アルコール、ポリオール、グリセロール、植物油などである。

【0040】

座剤に適したアジュバントは、例えば、天然または硬化油、ワックス、脂肪、半固体または液体ポリオールなどである。

【0041】

眼部外用剤形のための適切なアジュバントは、例として、シクロデキストリン、マンニトール、または当技術分野で知られている多くの他の担体および賦形剤である。

【0042】

さらに、医薬製剤は、防腐剤、可溶化剤、粘度増加物質、安定剤、湿潤剤、乳化剤、甘味剤、着色剤、着香剤、浸透圧を変化させるための塩、緩衝剤、マスキング剤、または酸化防止剤を含むことができる。また、さらに他の治療上有用な物質を含有することもできる。

【0043】

投与量は広範に変化させることができ、当然、各特定の症例における個々の要件に適合させる。一般に、経口投与の場合、体重１ｋｇあたり約０．１ｍｇ～２０ｍｇ、好ましくは体重１ｋｇあたり約０．５ｍｇ～４ｍｇ（例えば、１人あたり約３００ｍｇ）を１日量として、好ましくは１～３回に分けて個別に投与し、適切であれば、例えば、同量で構成し得る。局所投与の場合、製剤は、０．００１％～１５重量％の薬剤を含み得、０．１～２５ｍｇの間であり得る必要量は、１日あたりの単回投与でも、１週間あたりの単回投与でも、１日あたりの複数回の投与（２～４回）でも、１週間あたりの複数回の投与でもよい。ただし、これが示されている場合は、ここに記載されている上限または下限を超える可能性があることは明らかである。

【0044】

本発明の化合物を含む薬学的組成物の調製
以下の組成の錠剤は、通常の方法で製造される。

【0045】

製造手順
１．成分１、２、３および４を混合し、精製水で造粒する。
２．顆粒を５０℃で乾燥させる。
３．顆粒を適切な粉砕装置に通す。
４．材料５を加えて３分間混合し、適当なプレス機で圧縮する。

【0046】

以下の組成のカプセルを製造する。

【0047】

製造手順
１．材料１、２、３を適当なミキサーで３０分間混合する。
２．材料４および５を加えて３分間混合する。
３．適切なカプセルに充填する。

【0048】

式Ｉの化合物、乳糖およびコーンスターチを、まずミキサーで混合し、次に粉砕機で混合する。混合物をミキサーに戻し、そこにタルクを加えてまんべんなく混合する。この混合物を、機械によって適当なカプセル、例えば硬質ゼラチンカプセルに充填する。

【0049】

以下の組成の注射液を製造する。

【0050】

以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

【0051】

分取例がエナンチオマーの混合物として得られる場合、純粋なエナンチオマーは、本明細書に記載されている方法、または当技術分野の当業者に知られている方法、例えばキラルクロマトグラフィーまたは結晶化によって得ることができる。

【実施例】

【0052】

実施例１
２－［４，７－ジクロロ－６－（４－モルホリノフェニル）インダゾール－２－イル］－２－［（６Ｒ）－６－フルオロ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－ピロロ［１，２－ｃ］イミダゾール－１－イル］－Ｎ－チアゾール－２－イル－アセトアミド

工程１：４－ブロモ－３，６－ジクロロ－２－フルオロベンズアルデヒド

テトラヒドロフラン（７０ｍｌ）中の１－ブロモ－２，５－ジクロロ－３－フルオロベンゼン（９．４１ｇ、３８．６ｍｍｏｌ）の溶液を、ドライアイス／アセトン浴中で冷却した。ＴＨＦ中、２ｍｏｌ／ｌのＬＤＡ（２１．２ｍｌ、４２．５ｍｍｏｌ、１．１当量）を加え、混合物を－７５℃で２０分間攪拌した。Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（２．８２ｇ、３．０ｍｌ、３８．６ｍｍｏｌ、１当量）を滴下して加え、１時間攪拌した。エーテル中の酢酸溶液（１：１、１０ｍｌ）を加えた。混合物を一晩室温まで温めた。水を加えた後、混合物を酢酸エチルで抽出した。有機層を水で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ_４）、フィルタにかけ、減圧濃縮し、未精製の標題化合物（定量収率）を淡黄色固体として得た。化合物は、さらに精製せずに次の工程で使用した。

【0053】

工程２：６－ブロモ－４，７－ジクロロ－１Ｈ－インダゾール

ジオキサン（５０ｍｌ）中の４－ブロモ－３，６－ジクロロ－２－フルオロベンズアルデヒド（実施例１、工程１）（１０．５ｇ、３８．６ｍｍｏｌ）の溶液に、ヒドラジン水和物（３．８６ｇ、３．７８ｍｌ、７７．２ｍｍｏｌ、２．０当量）を加えた。混合物を室温で３日間撹拌した。ヒドラジン水和物（３８６ｍｇ、０．３８ｍｌ、７．７２ｍｍｏｌ、０．２当量）を加え、混合物を７０℃で７時間暖めた。室温まで冷却した後、水を加え、沈殿した固体をろ過により収集した。固体に少量のアセトニトリルを加え、２時間攪拌した。ろ過により固体を収集し、少量のアセトニトリルで洗浄し、乾燥し、標題の化合物（７．８ｇ、収率７６％）を灰色がかった白色固体として得た。ｍ／ｚ２６７．０／２６９．０、［Ｍ＋Ｈ］^＋、ＥＳＩ ｐｏｓ、Ｂｒ同位体。

【0054】

工程３：エチル２－（６－ブロモ－４，７－ジクロロ－インダゾール－２－イル）アセテート

Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（１１．５ｍＬ）中の６－ブロモ－４，７－ジクロロ－１Ｈ－インダゾール（実施例１、工程２）（７．８４ｇ、２９．５ｍｍｏｌ、１当量）の溶液に、エチル２－ブロモアセテート（９．８５ｇ、６．５３ｍｌ、５９ｍｍｏｌ、２．０当量）を加えた。反応混合物を１００℃で１６時間撹拌した。氷を加え、沈殿した固体をろ過により収集し、水で洗浄した。化合物を沸騰エタノールから結晶化した。固体をろ過により収集し、少量のエタノールで洗浄し、乾燥し、標題の化合物を白色固体として得た（７．５ｇ、収率７０％）。ｍ／ｚ３５３．０，３５５．０，［Ｍ＋Ｈ］^＋，ＥＳＩ ｐｏｓ，Ｂｒ同位体。

【0055】

工程４：ｔｅｒｔ－ブチル（２Ｓ，４Ｒ）－２－［２－（６－ブロモ－４，７－ジクロロ－インダゾール－２－イル）－３－エトキシ－３－オキソ－プロパノイル］－４－フルオロ－ピロリジン－１－カルボキシレート

テトラヒドロフラン（１１ｍｌ）中の（２Ｓ，４Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－４－フルオロピロリジン－２－カルボン酸（２．３４ｇ、１０ｍｍｏｌ、１．５５当量）の溶液を氷浴中で冷却した。カルボニルジイミダゾール（１．６３ｇ、１０ｍｍｏｌ、１．５５当量）を加えた。冷却浴を取除き、混合物を３時間攪拌し、溶液Ａを得た。テトラヒドロフラン（１１ｍｌ）中のエチル２－（６－ブロモ－４，７－ジクロロ－インダゾール－２－イル）アセテート（Ｅｘａｍｐｌｅ１、工程３）（２．２８ｇ、６．５ｍｍｏｌ）の溶液を－７０℃まで冷却した。テトラヒドロフラン中２ｍｏｌ／ｌのＬＤＡ（５．０ｍｌ、１０ｍｍｏｌ、１．５５当量）を５分以内に滴下して加えた。混合物を－７０℃で３０分間撹拌した。溶液Ａを５分以内に滴下して加えた。混合物を冷却浴中で一晩室温まで温めた。飽和ＮＨ_４Ｃｌ水溶液を添加した後、混合物を酢酸エチルで２回抽出した。有機層を水で洗浄し、混合し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮乾固し、未精製の標記化合物（定量的収率）を得、これをさらに精製することなく次の工程に使用した。ｍ／ｚ５６６．１／５６８．１，［Ｍ＋Ｈ］^＋，ＥＳＩ ｐｏｓ、Ｂｒ同位体。

【0056】

工程５：エチル２－（６－ブロモ－４，７－ジクロロ－インダゾール－２－イル）－２－［（６Ｒ）－６－フルオロ－３－チオキソ－２，５，６，７－テトラヒドロピロロ［１，２－ｃ］イミダゾール－１－イル］アセテート

ジオキサン（１１ｍｌ）中の４Ｍ ＨＣｌ中のｔｅｒｔ－ブチル（２Ｓ，４Ｒ）－２－［２－（６－ブロモ－４，７－ジクロロ－インダゾール－２－イル）－３－エトキシ－３－オキソ－プロパノイル］－４－フルオロ－ピロリジン－１－カルボキシレート（実施例１、工程４）（４．２３ｇ、６．４１ｍｍｏｌ）の溶液を室温で１時間撹拌した。混合物を濃縮乾固した。残渣をエタノール（３７ｍｌ）に溶解し、チオシアン酸カリウム（８２９ｍｇ、８．５３ｍｍｏｌ、１．３３量）およびエタノール中１Ｍ ＨＣｌ（１２．８ｍｌ）を添加し、室温で４０時間撹拌した。水を加えた後、混合物を酢酸エチルで抽出した。有機層を水で洗浄し、ＭｇＳＯ_４上で乾燥させ、フィルタにかけ、濃縮乾固し、未精製の標題化合物（２．５ｇ、収率７６％）を得、これをさらに精製することなく次の工程に使用した。ｍ／ｚ５０９．０／５１１．０，［Ｍ＋Ｈ］^＋，ＥＳＩ ｐｏｓ、Ｂｒ同位体

【0057】

工程６：エチル２－（６－ブロモ－４，７－ジクロロ－インダゾール－２－イル）－２－［（６Ｒ）－６－フルオロ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－ピロロ［１，２－ｃ］イミダゾール－１－イル］アセテート

酢酸（１０ｍｌ）中のエチル２－（６－ブロモ－４，７－ジクロロ－インダゾール－２－イル）－２－［（６Ｒ）－６－フルオロ－３－チオキソ－２，５，６，７－テトラヒドロピロロ［１，２－ｃ］イミダゾール－１－イル］アセテート（実施例１、工程５）（１．４６ｇ、２．８８ｍｍｏｌ）を１０℃まで冷却した。過酸化水素、３５％（１．１２ｇ、１．０１ｍｌ、１１．５ｍｍｏｌ、４当量）を滴下して加えた。反応混合物を室温で１時間撹拌した。飽和亜硫酸ナトリウム溶液を添加して、過剰の過酸化水素を分解した。若干量の水（すべての塩を溶解するのに十分な量）および酢酸エチルを添加した後、混合物に固体炭酸ナトリウムを慎重に添加することによってｐＨ９にした。混合物を酢酸エチルで抽出した。有機層を水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、濃縮した。生成物をクロマトグラフィ（ＳｉＯ_２、ヘプタン中０～１００％酢酸エチル）によって精製し、標題化合物（０．８１ｇ、収率５８％）を淡褐色固体として得た。ｍ／ｚ４７５．０／４７７．０，［Ｍ＋Ｈ］^＋、ＥＳＩ ｐｏｓ、Ｂｒ同位体。

【0058】

工程７：エチル２－［４，７－ジクロロ－６－（４－モルホリノフェニル）インダゾール－２－イル］－２－［（６Ｒ）－６－フルオロ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－ピロロ［１，２－ｃ］イミダゾール－１－イル］アセテート

エチル２－（６－ブロモ－４，７－ジクロロ－インダゾール－２－イル）－２－［（６Ｒ）－６－フルオロ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－ピロロ［１，２－ｃ］イミダゾール－１－イル］アセテート（実施例１、工程６）（１００ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）、（４－モルホリノフェニル）ボロン酸（１３０ｍｇ、０．６３ｍｍｏｌ、３当量）および炭酸セシウム（２０５ｍｇ、０．６３ｍｍｏｌ、３当量）をトルエン（３．０ｍｌ）と混合し、超音波処理下で混合物にアルゴンを通気することによって脱気した。［１，１’－ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］ジクロロパラジウム（ＩＩ）（１５ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ、０．１当量）を加え、混合物を、封管中、１１０℃で３０分間攪拌した。混合物を室温まで冷却し、酢酸エチルで希釈し、半濃縮炭酸ナトリウム溶液で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮した。未精製の材料をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ_２、酢酸エチル中０～４０％メタノール）によって精製し、標題化合物（８２ｍｇ、収率６９％）を淡褐色非晶体として得た。ｍ／ｚ５５８．４，［Ｍ＋Ｈ］^＋、ＥＳＩ ｐｏｓ、Ｂｒ同位体。

【0059】

工程８：２－［４，７－ジクロロ－６－（４－モルホリノフェニル）インダゾール－２－イル］－２－［（６Ｒ）－６－フルオロ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－ピロロ［１，２－ｃ］イミダゾール－１－イル］－Ｎ－チアゾール－２－イル－アセトアミド

テトラヒドロフラン（１．１ｍｌ）中のエチル２－［４，７－ジクロロ－６－（４－モルホリノフェニル）インダゾール－２－イル］－２－［（６Ｒ）－６－フルオロ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－ピロロ［１，２－ｃ］イミダゾール－１－イル］アセテート（実施例１、工程７）（４０ｍｇ、０．０７１ｍｍｏｌ）の溶液に、１ＭのＬｉＯＨ（１０１μｌ、０．１０ｍｍｏｌ、１．５当量）および水（４００μｌ）を添加した。混合物を室温で３０分間撹拌した。混合物を濃縮し、乾燥させた。残渣をＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１．１ｍｌ）に溶解した。チアゾール－２－アミン（９ｍｇ、０．０８６ｍｍｏｌ、１．２当量）、ＨＡＴＵ（３３ｍｇ、０．０８６ｍｍｏｌ、１．２当量）およびヒューニッヒ塩基（２８ｍｇ、０．０３７ｍｌ、０．２１ｍｍｏｌ、３当量）を添加した後、混合物を室温で１時間攪拌した。水を加えた後、混合物を酢酸エチルで抽出した。有機層を合わせ、硫酸ナトリウム上で乾燥し、フィルタにかけ、濃縮した。未精製の材料をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ_２、酢酸エチル中０％～４０％メタノール）によって精製し、標題化合物（２２ｍｇ、収率５０％）を淡褐色固体として得た。ｍ／ｚ６１２．４，［Ｍ＋Ｈ］^＋，ＥＳＩ ｐｏｓ。