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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-08-01
(45)【発行日】2024-08-09
(54)【発明の名称】タンパク質の製造方法及び無細胞タンパク質合成系キット
(51)【国際特許分類】
C12P 21/00 20060101AFI20240802BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20240802BHJP
C12N 15/31 20060101ALN20240802BHJP
C07K 14/245 20060101ALN20240802BHJP
C07K 14/32 20060101ALN20240802BHJP
C07K 14/195 20060101ALN20240802BHJP
【ＦＩ】
C12P21/00 C
C12P21/02 C
C12N15/31
C07K14/245
C07K14/32
C07K14/195
【請求項の数】
11
(21)【出願番号】P 2021533988
(86)(22)【出願日】2020-07-16
(86)【国際出願番号】 JP2020027679
(87)【国際公開番号】W WO2021015095
(87)【国際公開日】2021-01-28
【審査請求日】2023-03-22
(31)【優先権主張番号】P 2019134081
(32)【優先日】2019-07-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】320011650
【氏名又は名称】大陽日酸株式会社
(73)【特許権者】
【識別番号】503359821
【氏名又は名称】国立研究開発法人理化学研究所
(74)【代理人】
【識別番号】110001634
【氏名又は名称】弁理士法人志賀国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】矢吹 孝
(72)【発明者】
【氏名】木川 隆則
(72)【発明者】
【氏名】樋口 佳恵
【審査官】小林 薫
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２０１１／０２６２９４６（ＵＳ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１３／０３１６３９７（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特開２００５－００６６４６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００７－２５９８５２（ＪＰ，Ａ）
【文献】FEBS Journal，2005年，Vol.272, No.18，pp.4691-4702
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ１２Ｐ １／００－４１／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ （ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
コールドショックタンパク質、及びコールドショックタンパク質のアミノ酸配列をコードするコード領域を含む核酸のいずれか一方又は両方を含む無細胞タンパク質合成系の反応液でタンパク質を製造する方法であり、
下記条件Ｘを満たすことにより、前記反応液中に合成される前記タンパク質の量を、下記条件Ｘを満たさない場合よりも増加させる、タンパク質の製造方法。
［条件Ｘ］前記反応液中の前記コールドショックタンパク質の含有量を０．５μｇ／μＬ～１．５μｇ／μＬとし、かつ、前記反応液の反応温度を４～２３℃として、前記反応液中で前記タンパク質を合成する。
【請求項2】
前記コールドショックタンパク質が、大腸菌由来のＣｓｐＡ、ＣｓｐＢ、ＣｓｐＣ、ＣｓｐＥ、ＣｓｐＧ、又はＣｓｐＩである、請求項１に記載のタンパク質の製造方法。
【請求項3】
前記コールドショックタンパク質が、大腸菌由来のＣｓｐＡである、請求項２に記載のタンパク質の製造方法。
【請求項4】
前記コールドショックタンパク質が、シュワネラ属のShewanella livingstonensis由来のＳｌｉＣｓｐＣである、請求項１に記載のタンパク質の製造方法。
【請求項5】
前記コールドショックタンパク質が、Bacillus属のBacillus subtilis由来のＢｓｕＣｓｐＢである、請求項１に記載のタンパク質の製造方法。
【請求項6】
前記反応温度を１２～１６℃とする、請求項１～５のいずれか一項に記載のタンパク質の製造方法。
【請求項7】
前記反応液中の前記コールドショックタンパク質の含有量が０．８μｇ／μＬ～１．５μｇ／μＬである、請求項１～６のいずれか一項に記載のタンパク質の製造方法。
【請求項8】
前記反応液が、細胞抽出液を含む溶液である、請求項１～７のいずれか一項に記載のタンパク質の製造方法。
【請求項9】
前記細胞抽出液が、大腸菌由来の細胞抽出液である、請求項８に記載のタンパク質の製造方法。
【請求項10】
前記反応液が、Ｌ－アミノ酸、緩衝液、塩、エネルギー源、及びエネルギー再生系を含む、請求項９に記載のタンパク質の製造方法。
【請求項11】
請求項１～１０のいずれか一項に記載のタンパク質の製造方法に使用されるキットであり、コールドショックタンパク質、及びコールドショックタンパク質のアミノ酸配列をコードするコード領域を含む核酸のいずれか一方又は両方と、無細胞タンパク質合成系の反応液と、を備える、無細胞タンパク質合成系キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、タンパク質の製造方法及び無細胞タンパク質合成系キットに関する。
本願は、２０１９年 ７月１９日に、日本に出願された特願２０１９－１３４０８１号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
本願は、２０１９年 ７月１９日に、日本に出願された特願２０１９－１３４０８１号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【0002】
タンパク質の製造方法としては、無細胞タンパク質合成系を用いる方法が知られている。無細胞タンパク質合成系は、タンパク質合成に必要な因子を含む細胞抽出液に、基質となるアミノ酸、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）等のエネルギー源、エネルギー再生系、マグネシウムイオン等の塩、及び目的タンパク質の遺伝子を加え、試験管内でタンパク質を合成する技術である。細胞抽出液としては、大腸菌、昆虫細胞、コムギ胚芽、タバコ細胞及び動物細胞由来の細胞抽出液が知られており、キット化されたものが市販されている。
【0003】
無細胞タンパク質合成系は、基礎的な研究だけでなく、分子診断や、ハイスループットな医薬品ターゲットの発見等の応用分野でも利用されている。タンパク質合成量を飛躍的に増大させる技術（特許文献１、２）が開発されたことから、Ｘ線結晶解析やＮＭＲ等による立体構造解析用のタンパク質試料の大量合成にも利用されるようになっている。
【0004】
無細胞タンパク質合成系は、生物を用いた細胞発現系に比べ、以下の利点がある。
（１）反応条件を自由に設定できる。
（２）発現ベクターとして、目的遺伝子をクローニングした環状ＤＮＡだけでなく、ＰＣＲ産物等の直鎖状ＤＮＡも利用できる。
（３）様々な標識タンパク質を容易に合成できる。
（４）細胞毒性を有するタンパク質を容易に合成できる。
（５）自動化が可能である。
（１）反応条件を自由に設定できる。
（２）発現ベクターとして、目的遺伝子をクローニングした環状ＤＮＡだけでなく、ＰＣＲ産物等の直鎖状ＤＮＡも利用できる。
（３）様々な標識タンパク質を容易に合成できる。
（４）細胞毒性を有するタンパク質を容易に合成できる。
（５）自動化が可能である。
【0005】
大腸菌由来の細胞抽出液を用いた無細胞タンパク質合成系では、反応温度を３０～３７℃とすることでタンパク質の合成量が高くなる。しかし、タンパク質によっては、３０～３７℃で合成すると、タンパク質の高次構造が適切に形成されずに沈殿が生じたり、不活性型のタンパク質が合成されたりする場合がある。
【0006】
大腸菌を宿主としたタンパク質発現系では、大腸菌の培養温度を低くすることで、活性型のタンパク質の発現量が増加することが知られている（非特許文献１、２）。これは、翻訳速度が遅くなって目的タンパク質が正しく折り畳まれるための時間的余裕が生まれることや、低温環境下でタンパク質分解酵素の働きが鈍くなることで発現されたタンパク質の安定性が増すためと推測される。
【0007】
無細胞タンパク質合成系においても、反応温度を２０℃程度に下げることで、沈殿を抑制できる場合があるものの、反応温度が低いとタンパク質の合成量が著しく低下する傾向がある。できるだけ少量の反応液で可溶性かつ活性型のタンパク質を効率良く得ることは経済的にも重要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
【文献】特公平７－１１０２３６号公報
【文献】特開平４－２００３９０号公報
【非特許文献】
【0009】
【文献】Mujacic, M., Cooper, K. W. and Baneyx, F. (1999) Gene 238, 325-332.
【文献】Qing, G., Ma, L. C., Khorchid, A., Swapna, G. V., Mal, T. K., Takayama, M. M., Xia, B., Phadtare, S., Ke, H., Acton, T., Montelione, G. T., Ikura, M. and Inouye, M. (2004) Nat. Biotechnol. 22, 877-882.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
本発明は、低温でも活性型のタンパク質を高効率に製造できるタンパク質の製造方法、及び無細胞タンパク質合成系キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0011】
上記課題に鑑みて、本発明者らは低温環境下への適応に関する種々のコールドショックタンパク質が無細胞タンパク質合成系での合成活性に与える影響と、合成されるタンパク質の可溶性について調べた。その結果、コールドショックタンパク質を用いることで、無細胞タンパク質合成系によるタンパク質の合成において、３０℃未満の低温でも高いタンパク質合成活性が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【0012】
本発明は、以下の構成を有する。
［１］コールドショックタンパク質、及びコールドショックタンパク質のアミノ酸配列をコードするコード領域を含む核酸のいずれか一方又は両方を含む無細胞タンパク質合成系の反応液でタンパク質を製造する、タンパク質の製造方法。
［２］前記コールドショックタンパク質が、大腸菌由来のＣｓｐＡ、ＣｓｐＢ、ＣｓｐＣ、ＣｓｐＥ、ＣｓｐＧ、又はＣｓｐＩである、［１］に記載のタンパク質の製造方法。
［３］前記コールドショックタンパク質が、大腸菌由来のＣｓｐＡである、［２］に記載のタンパク質の製造方法。
［４］前記コールドショックタンパク質が、シュワネラ属のShewanella livingstonensis由来のＳｌｉＣｓｐＣである、［１］に記載のタンパク質の製造方法。
［５］前記コールドショックタンパク質が、Bacillus属のBacillus subtilis由来のＢｓｕＣｓｐＢである、［１］に記載のタンパク質の製造方法。
［６］反応温度を４～３０℃とする、［１］～［５］のいずれかに記載のタンパク質の製造方法。
［７］反応液中の前記コールドショックタンパク質の含有量が０．５～１．５μｇ／μＬである、［１］～［６］のいずれかに記載のタンパク質の製造方法。
［８］前記反応液が、細胞抽出液を含む溶液である、［１］～［７］のいずれかに記載のタンパク質の製造方法。
［９］前記細胞抽出液が、大腸菌由来の細胞抽出液である、［８］に記載のタンパク質の製造方法。
［１０］前記反応液が、Ｌ－アミノ酸、緩衝液、塩、エネルギー源、及びエネルギー再生系を含む、［９］に記載のタンパク質の製造方法。
［１１］コールドショックタンパク質、及びコールドショックタンパク質のアミノ酸配列をコードするコード領域を含む核酸のいずれか一方又は両方と、無細胞タンパク質合成系の反応液と、を備える、無細胞タンパク質合成系キット。
［１］コールドショックタンパク質、及びコールドショックタンパク質のアミノ酸配列をコードするコード領域を含む核酸のいずれか一方又は両方を含む無細胞タンパク質合成系の反応液でタンパク質を製造する、タンパク質の製造方法。
［２］前記コールドショックタンパク質が、大腸菌由来のＣｓｐＡ、ＣｓｐＢ、ＣｓｐＣ、ＣｓｐＥ、ＣｓｐＧ、又はＣｓｐＩである、［１］に記載のタンパク質の製造方法。
［３］前記コールドショックタンパク質が、大腸菌由来のＣｓｐＡである、［２］に記載のタンパク質の製造方法。
［４］前記コールドショックタンパク質が、シュワネラ属のShewanella livingstonensis由来のＳｌｉＣｓｐＣである、［１］に記載のタンパク質の製造方法。
［５］前記コールドショックタンパク質が、Bacillus属のBacillus subtilis由来のＢｓｕＣｓｐＢである、［１］に記載のタンパク質の製造方法。
［６］反応温度を４～３０℃とする、［１］～［５］のいずれかに記載のタンパク質の製造方法。
［７］反応液中の前記コールドショックタンパク質の含有量が０．５～１．５μｇ／μＬである、［１］～［６］のいずれかに記載のタンパク質の製造方法。
［８］前記反応液が、細胞抽出液を含む溶液である、［１］～［７］のいずれかに記載のタンパク質の製造方法。
［９］前記細胞抽出液が、大腸菌由来の細胞抽出液である、［８］に記載のタンパク質の製造方法。
［１０］前記反応液が、Ｌ－アミノ酸、緩衝液、塩、エネルギー源、及びエネルギー再生系を含む、［９］に記載のタンパク質の製造方法。
［１１］コールドショックタンパク質、及びコールドショックタンパク質のアミノ酸配列をコードするコード領域を含む核酸のいずれか一方又は両方と、無細胞タンパク質合成系の反応液と、を備える、無細胞タンパク質合成系キット。
【発明の効果】
【0013】
本発明によれば、低温でも活性型のタンパク質を高効率に製造できるタンパク質の製造方法、及び無細胞タンパク質合成系キットを提供できる。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】例１におけるＧＦＰＳ１の合成の電気泳動結果である。
【図2】例１におけるＧＦＰＳ１の合成量（蛍光値）を示した図である。
【図3】例１におけるＧＦＰＳ１の合成量のＣｓｐＡ濃度依存性を示した図である。
【図4】例２における各タンパク質の合成反応後の全画分（Ｔ）及び可溶性画分（Ｓ）の電気泳動結果である。
【図5】例３におけるｈＡＫ１の合成反応後の全画分（Ｔ）及び可溶性画分（Ｓ）の電気泳動結果である。
【図6】例４におけるＧＦＰＳ１の合成量のＣｓｐ（ＣＳＤ）濃度依存性を示した図である。
【図7】例５におけるＧＦＰＳ１とＣＡＴの合成量の反応温度依存性を示した図である。
【図8】例６におけるＧＦＰＳ１とＣＡＴの合成量の反応温度依存性を示した図である。
【図9】例７における各反応温度でのＧＦＰＳ１の合成量の経時変化を示した図である。
【図10】例８におけるＧＦＰＳ１の合成量（蛍光値）を示した図である。
【図11】例８におけるＧＦＰＳ１の合成量のＣｓｐＡ鋳型ＤＮＡ濃度依存性を示した図である。
【図12】例９における各タンパク質の合成反応後の全画分（Ｔ）及び可溶性画分（Ｓ）の電気泳動結果である。
【図13】例１０における各低分子化抗体（一本鎖抗体）の合成反応後の全画分（Ｔ）及び可溶性画分（Ｓ）の電気泳動結果である。
【図14】例１０における各低分子化抗体（Ｆａｂ）の合成反応後の全画分（Ｔ）及び可溶性画分（Ｓ）の電気泳動結果である。
【図15】例１１におけるＧＦＰＳ１の合成量のＣｓｐ濃度依存性を示した図である。
【図16】例１１におけるＧＦＰＳ１の合成量のＣｓｐ相補性を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【0015】
本明細書及び特許請求の範囲における以下の用語は、以下の意味を示す。
「無細胞タンパク質合成系」とは、タンパク質の翻訳に必要なタンパク質因子を細胞抽出液として取り出し、細胞内の反応系を試験管内で再構成することで目的とするタンパク質を合成する系である。無細胞タンパク質合成系には、ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡを合成する無細胞転写系、及びｍＲＮＡの情報を読み取ってリボソーム上でタンパク質を合成する無細胞翻訳系を含む無細胞転写翻訳系と、無細胞翻訳系との両方が包含される。
「コールドショックタンパク質」とは、Ｐｆａｍデータベース（バージョン３２．０）のＣＳＤファミリー（ＰＦ００３１３）に対してスコア値１００以上で適合するアミノ酸配列を有するタンパク質ないしはタンパク質ドメインである。
「～」で表される数値範囲は、～の前後の数値を下限値及び上限値として含む数値範囲を意味する。
「無細胞タンパク質合成系」とは、タンパク質の翻訳に必要なタンパク質因子を細胞抽出液として取り出し、細胞内の反応系を試験管内で再構成することで目的とするタンパク質を合成する系である。無細胞タンパク質合成系には、ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡを合成する無細胞転写系、及びｍＲＮＡの情報を読み取ってリボソーム上でタンパク質を合成する無細胞翻訳系を含む無細胞転写翻訳系と、無細胞翻訳系との両方が包含される。
「コールドショックタンパク質」とは、Ｐｆａｍデータベース（バージョン３２．０）のＣＳＤファミリー（ＰＦ００３１３）に対してスコア値１００以上で適合するアミノ酸配列を有するタンパク質ないしはタンパク質ドメインである。
「～」で表される数値範囲は、～の前後の数値を下限値及び上限値として含む数値範囲を意味する。
【0016】
［タンパク質の製造方法］
本発明のタンパク質の製造方法は、コールドショックタンパク質（以下、「Ｃｓｐ」とも記す。）、及びＣｓｐのアミノ酸配列をコードするコード領域を含む核酸（以下、「Ｃｓｐ鋳型核酸」とも記す。）のいずれか一方又は両方を含む無細胞タンパク質合成系の反応液で目的タンパク質を製造する方法である。目的タンパク質のアミノ酸配列をコードするコード領域を含む、鋳型となる核酸（ＤＮＡ、ｍＲＮＡ）を反応液に添加することで、目的タンパク質を製造できる。
本発明のタンパク質の製造方法は、コールドショックタンパク質（以下、「Ｃｓｐ」とも記す。）、及びＣｓｐのアミノ酸配列をコードするコード領域を含む核酸（以下、「Ｃｓｐ鋳型核酸」とも記す。）のいずれか一方又は両方を含む無細胞タンパク質合成系の反応液で目的タンパク質を製造する方法である。目的タンパク質のアミノ酸配列をコードするコード領域を含む、鋳型となる核酸（ＤＮＡ、ｍＲＮＡ）を反応液に添加することで、目的タンパク質を製造できる。
【0017】
無細胞タンパク質合成系には、無細胞タンパク質合成系に必要な成分を含む細胞から抽出した細胞抽出液、あるいはタンパク質合成に必要な因子を個別に精製して混合した再構成型無細胞タンパク質合成法に用いられる溶液を用いることができる。タンパク質合成に必要な因子としては、リボソーム、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素、ｔＲＮＡ、翻訳終結因子等が挙げられる。
反応液としては、細胞抽出液を含む溶液が好ましい。
反応液としては、細胞抽出液を含む溶液が好ましい。
【0018】
細胞抽出液としては、例えば、リボソーム、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素、ｔＲＮＡ等のタンパク質合成に関与する翻訳系に必要な成分、又は、転写系及び翻訳系に必要な成分を含む植物細胞、動物細胞、真菌細胞、細菌細胞から抽出した細胞抽出液が挙げられる。具体的には、例えば、大腸菌、小麦胚芽、タバコ細胞、ウサギ網赤血球、マウスＬ－細胞、エールリッヒ腹水癌細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞、出芽酵母等からの細胞抽出液が挙げられる。
【0019】
細胞抽出液としては、抽出液調製の安定性とスケーラビリティの点から、大腸菌由来の細胞抽出液が好ましい。大腸菌由来の細胞抽出液としては、例えば、大腸菌（ＢＬ２１等）細胞からのＳ３０抽出液（以下、「大腸菌Ｓ３０抽出液」とも記す。）、Ｓ１２抽出液等が挙げられる。大腸菌Ｓ３０抽出液は、転写及び翻訳に必要な大腸菌の全ての酵素と因子を含んでいる。
【0020】
細胞抽出液の調製方法は、特に限定されず、公知の方法を採用できる。例えば、大腸菌Ｓ３０抽出液は、Zubay G., Ann Rev Genet, (1973) 7, 267-287、Seki, E., Matsuda, N., Yokoyama, S., and Kigawa, T. (2008), Anal. Biochem.等に記載の方法で調製できる。
細胞抽出液の調製方法としては、具体的には、まず大腸菌を培養し、菌体を遠心分離等により回収する。回収された菌体を洗浄した後、緩衝液に再懸濁し、フレンチプレスやガラスビーズ、ワーリングブレンダー等を用いて破砕する。破砕された大腸菌の不溶物質を遠心分離で除去し、プレインキュベーション混合液と混合してインキュベーションする。この操作によって内在性の核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）は分解されるが、さらにカルシウム塩やマイクロコッカスのヌクレアーゼ等を添加して内在性の核酸を分解させてもよい。続いて、透析により内在性のアミノ酸、核酸、ヌクレオシド等を除き、適量ずつ分注して、液体窒素中、又は－８０℃にて保存する。
なお、細胞抽出液は、市販品を使用してもよい。
細胞抽出液の調製方法としては、具体的には、まず大腸菌を培養し、菌体を遠心分離等により回収する。回収された菌体を洗浄した後、緩衝液に再懸濁し、フレンチプレスやガラスビーズ、ワーリングブレンダー等を用いて破砕する。破砕された大腸菌の不溶物質を遠心分離で除去し、プレインキュベーション混合液と混合してインキュベーションする。この操作によって内在性の核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）は分解されるが、さらにカルシウム塩やマイクロコッカスのヌクレアーゼ等を添加して内在性の核酸を分解させてもよい。続いて、透析により内在性のアミノ酸、核酸、ヌクレオシド等を除き、適量ずつ分注して、液体窒素中、又は－８０℃にて保存する。
なお、細胞抽出液は、市販品を使用してもよい。
【0021】
反応液中の細胞抽出液の含有量は、反応液中の終濃度（細胞抽出液の２６０ｎｍの吸光度Ａ２６０換算量）として４０～２００であることが好ましく、５０～１５０がより好ましい。細胞抽出液の含有量が前記範囲内であれば、目的タンパク質を高効率に合成しやすい。
【0022】
細胞抽出液には、転写及び翻訳に必要な全ての酵素と因子が含まれているが、タンパク質合成の反応液に用いる際に、さらに補充的な成分を添加してもよい。
補充的な成分としては、例えば、基質となるＬ－アミノ酸、エネルギー源、塩、各種イオン、緩衝液、エネルギー再生系、核酸分解酵素阻害剤、還元剤、抗菌剤が挙げられる。
補充的な成分としては、例えば、基質となるＬ－アミノ酸、エネルギー源、塩、各種イオン、緩衝液、エネルギー再生系、核酸分解酵素阻害剤、還元剤、抗菌剤が挙げられる。
【0023】
Ｌ－アミノ酸としては、例えば、天然の２０種類のアミノ酸、又はそれらの誘導体が挙げられる。目的タンパク質として、同位体標識された標識タンパク質を製造する場合は、安定同位元素もしくは、放射性同位元素で標識された標識アミノ酸を用いる。
エネルギー源としては、例えば、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）（以下、この４つを総称してＮＴＰと呼ぶ。）、クレアチンホスフェート（ＣＰ）、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）、グルコースが挙げられる。また、ＮＴＰの代わりにアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、及びウリジン一リン酸（ＵＭＰ）（以下、この４つを総称してＮＭＰと呼ぶ。）を反応液に添加し、代謝酵素を利用することによってＮＴＰを系内で合成させてもよい（Calhoun KA and Swartz JR, Biotechnol. Prog., 2005, 21, 1146-1153）。
塩としては、例えば、酢酸アンモニウム、酢酸カリウム、グルタミン酸カリウム、酢酸マグネシウム、塩化マグネシウム、酢酸カリウム、塩化カルシウムが挙げられる。
緩衝液としては、例えば、Ｔｒｉｓ－酢酸、ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨが挙げられる。
エネルギー源としては、例えば、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）（以下、この４つを総称してＮＴＰと呼ぶ。）、クレアチンホスフェート（ＣＰ）、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）、グルコースが挙げられる。また、ＮＴＰの代わりにアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、及びウリジン一リン酸（ＵＭＰ）（以下、この４つを総称してＮＭＰと呼ぶ。）を反応液に添加し、代謝酵素を利用することによってＮＴＰを系内で合成させてもよい（Calhoun KA and Swartz JR, Biotechnol. Prog., 2005, 21, 1146-1153）。
塩としては、例えば、酢酸アンモニウム、酢酸カリウム、グルタミン酸カリウム、酢酸マグネシウム、塩化マグネシウム、酢酸カリウム、塩化カルシウムが挙げられる。
緩衝液としては、例えば、Ｔｒｉｓ－酢酸、ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨが挙げられる。
【0024】
エネルギー再生系としては、ＡＴＰ再生系が好ましい。ＡＴＰ再生系としては、例えば、１０～１００ｍＭのＣＰと０．０２～５μｇ／μＬのクレアチンキナーゼ（ＣＫ）との組み合わせや、１～２０ｍＭのＰＥＰと０．０１～１μｇ／μＬのピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）との組み合わせ等が挙げられる。ＰＫ及びＣＫは、いずれもＡＤＰをＡＴＰに再生する酵素であり、それぞれＰＥＰ及びＣＰを基質として必要とする。
【0025】
核酸分解酵素阻害剤としては、例えば、ＲＮａｓｅインヒビターが挙げられる。
還元剤としては、例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）が挙げられる。
抗菌剤としては、例えば、アジ化ナトリウム、アンピシリンが挙げられる。
還元剤としては、例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）が挙げられる。
抗菌剤としては、例えば、アジ化ナトリウム、アンピシリンが挙げられる。
【0026】
タンパク質合成活性を増強させる目的で、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、葉酸、ｃＡＭＰ、ｔＲＮＡ等を反応液に添加してもよい。また、目的タンパク質の鋳型としてＤＮＡを用いる場合には、ＲＮＡ合成の基質であるＮＴＰかその前駆体、ＲＮＡポリメラーゼ等を反応液に添加することができる。ＮＴＰの前駆体としては、例えば、ＮＭＰ、ヌクレオシド等が挙げられる。ＲＮＡポリメラーゼとしては、例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ等が挙げられる。タンパク質が三次元構造を形成するのを助ける働きを持つシャペロンタンパク質類や、ジスルフィド結合異性化酵素を反応液に添加してもよい。シャペロンタンパク質類としては、例えば、ＤｎａＪ、ＤｎａＫ、ＧｒｏＥ、ＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳ、ＨＳＰ７０等が挙げられる。ジスルフィド結合異性化酵素としては、例えば、ＤｓｂＣ等が挙げられる。
補充的な成分は、１種でもよく、２種以上でもよい。
補充的な成分は、１種でもよく、２種以上でもよい。
【0027】
大腸菌Ｓ３０抽出液を用いる場合、反応液は、大腸菌Ｓ３０抽出液、Ｌ－アミノ酸、緩衝液、塩、ＮＴＰ、及びエネルギー源を含むことが好ましい。例えば、大腸菌Ｓ３０抽出液、ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ、ＤＴＴ、ＮＴＰ（ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ）、ＣＰ、ＣＫ、少なくとも１種のアミノ酸（天然の２０種類のアミノ酸、又はそれらの誘導体）を含む反応液が挙げられる。
【0028】
補充的な成分は、細胞抽出液とは別に保存しておき、使用直前に混合することが好ましい。補充的な成分を細胞抽出液に予め混合して凍結融解を行い、ＲＮＡ分解酵素複合体を除去することもできる（国際公開第２０００／１８３８０５号）。
【0029】
本発明では、無細胞タンパク質合成系の反応液に、Ｃｓｐ及びＣｓｐ鋳型核酸のいずれか一方、又は両方が含まれる。本発明では、Ｃｓｐを用いることが好ましい。
Ｃｓｐは、低温環境下への適応に関与すると考えられており、細菌から高等動植物に至るまで多く見出されている。Ｃｓｐとしては、例えば、大腸菌由来のＣｓｐＡ、ＣｓｐＢ、ＣｓｐＣ、ＣｓｐＥ、ＣｓｐＧ及びＣｓｐＩ、シュワネラ属のShewanella livingstonensis由来のＳｌｉＣｓｐＣ、Bacillus属のBacillus subtilis由来のＢｓｕＣｓｐＢが挙げられる。大腸菌由来のＣｓｐＡは、低温環境下で最も顕著に発現されるＣｓｐである。Ｃｓｐとしては、野生型のＣｓｐＡ、野生型のＳｌｉＣｓｐＣが好ましい。反応液に含まれるＣｓｐは、１種でもよく、２種以上でもよい。
Ｃｓｐは、低温環境下への適応に関与すると考えられており、細菌から高等動植物に至るまで多く見出されている。Ｃｓｐとしては、例えば、大腸菌由来のＣｓｐＡ、ＣｓｐＢ、ＣｓｐＣ、ＣｓｐＥ、ＣｓｐＧ及びＣｓｐＩ、シュワネラ属のShewanella livingstonensis由来のＳｌｉＣｓｐＣ、Bacillus属のBacillus subtilis由来のＢｓｕＣｓｐＢが挙げられる。大腸菌由来のＣｓｐＡは、低温環境下で最も顕著に発現されるＣｓｐである。Ｃｓｐとしては、野生型のＣｓｐＡ、野生型のＳｌｉＣｓｐＣが好ましい。反応液に含まれるＣｓｐは、１種でもよく、２種以上でもよい。
【0030】
Ｐｆａｍデータベース（バージョン３２．０）のＣＳＤファミリー（ＰＦ００３１３）に対する、各タンパク質又はタンパク質ドメインのスコア値（ＳＰ値）を表１に示す。用いるＣｓＰのＳＰ値は、１００以上であればよく、高ければ高いほど、低温でも活性型のタンパク質を高効率に製造できる効果が得られやすい。ＣｓＰのＳＰ値の上限は、特に限定されないが、入手性の点では、例えば、１１５とすることができる。
【0031】
【表1】
【0032】
Ｃｓｐを用いる場合、反応液中のＣｓｐの含有量は、０．５～１．５μｇ／μＬが好ましく、反応温度が１６～２３℃の場合には０．８～１．２μｇ／μＬ、１６℃よりも低温の場合には１．２～１．５μｇ／μＬがより好ましい。Ｃｓｐの含有量が前記範囲内であれば、目的タンパク質を高効率に合成しやすい。
【0033】
反応液中のＣｓｐ含有量を調節する方法は、特に限定されない。例えば、細胞抽出液にＣｓｐを反応液に添加してＣｓｐ含有量を前記範囲に調節することができる。また、細胞抽出液調製用の細胞として、Ｃｓｐを発現できる細胞を用い、培養中に低温ショックをかける等によって得たＣｓｐを含む細胞抽出液を用いて反応液中のＣｓｐ含有量を前記範囲に調節してもよい。また、細胞抽出液調製用の細胞に、Ｃｓｐ発現用のプラスミド鋳型ＤＮＡを形質転換しておき、それを培養して得たＣｓｐを含む細胞抽出液を用いて反応液中のＣｓｐ含有量を前記範囲に調節してもよい。
【0034】
Ｃｓｐ鋳型核酸は、無細胞タンパク質合成系において、Ｃｓｐを合成するための鋳型となる核酸である。無細胞タンパク質合成系の反応液中にＣｓｐ鋳型核酸が含まれることで、反応中にＣｓｐが合成されて、Ｃｓｐを含む反応液となる。Ｃｓｐは低温環境においても速やかに合成されるため、Ｃｓｐ鋳型核酸を用いる場合でもＣｓｐの存在下で目的タンパク質が合成される。反応液に含まれるＣｓｐ鋳型核酸は、１種でもよく、２種以上でもよい。
【0035】
Ｃｓｐ鋳型核酸を用いる場合、反応液中のＣｓｐ鋳型核酸の含有量は、０．１～１．０ｎｇ／μＬが好ましく、０．２～０．８ｎｇ／μＬがより好ましく、０．２～０．４ｎｇ／μＬがさらに好ましい。Ｃｓｐ鋳型核酸の含有量が前記範囲内であれば、目的タンパク質を高効率に合成しやすい。
【0036】
本発明では、目的タンパク質のアミノ酸配列をコードする鋳型ＤＮＡを無細胞転写翻訳系に加えて目的タンパク質を合成してもよく、目的タンパク質のアミノ酸配列をコードする鋳型ＲＮＡを無細胞翻訳系に加えて目的タンパク質を合成してもよい。
目的タンパク質の鋳型ＤＮＡとしては、組み換えＤＮＡ技術により作製されたプラスミドＤＮＡ等の環状二本鎖ＤＮＡ、あるいはＰＣＲによって調製した直鎖状ＤＮＡのいずれでもよい。本発明では、直鎖状鋳型ＤＮＡを用いても安定かつ高効率に目的タンパク質を合成できる。
目的タンパク質の鋳型ＤＮＡとしては、組み換えＤＮＡ技術により作製されたプラスミドＤＮＡ等の環状二本鎖ＤＮＡ、あるいはＰＣＲによって調製した直鎖状ＤＮＡのいずれでもよい。本発明では、直鎖状鋳型ＤＮＡを用いても安定かつ高効率に目的タンパク質を合成できる。
【0037】
反応液中の鋳型ＤＮＡ又は鋳型ＲＮＡの含有量は、細胞抽出液のタンパク質合成活性、目的タンパク質の種類等によって適宜設定でき、例えば、０．５～１０μｇ／ｍＬ程度とすることができる。
【0038】
本発明におけるタンパク質の合成方法としては、透析法、バッチ法、及び重層法（Sawasaki, T., Hasegawa, Y., Tsuchimochi, M., Kamura, N., Ogasawara, T., Kuroita, T. and Endo, Y. (2002) FEBS Lett. 514, 102-105）を適用でき、透析法が好ましい。
透析法は、反応液である内液と反応基質を含む外液とを透析膜（限外ろ過膜）によって隔離し、振盪又は撹拌可能な閉鎖系で合成する方法である。透析法では、透析膜を介して、合成に必要な基質が外液から反応液に供給されるとともに、反応液中の余計な副産物を外液中に拡散させることで、より長時間反応を持続させることができる。そのため、より高いタンパク質合成量を得ることが可能となる。
透析法は、反応液である内液と反応基質を含む外液とを透析膜（限外ろ過膜）によって隔離し、振盪又は撹拌可能な閉鎖系で合成する方法である。透析法では、透析膜を介して、合成に必要な基質が外液から反応液に供給されるとともに、反応液中の余計な副産物を外液中に拡散させることで、より長時間反応を持続させることができる。そのため、より高いタンパク質合成量を得ることが可能となる。
【0039】
反応温度は、４～３０℃が好ましく、１６～２３℃がより好ましい。
反応時間は、バッチ法の場合、２～６時間が好ましく、１６℃以下の反応においては４～６時間がより好ましい。透析法の場合、１～４０時間が好ましく、５～４０時間がより好ましい。
反応時間は、バッチ法の場合、２～６時間が好ましく、１６℃以下の反応においては４～６時間がより好ましい。透析法の場合、１～４０時間が好ましく、５～４０時間がより好ましい。
【0040】
透析内液と透析外液を隔てる透析膜の分画分子量は、３，５００～１００，０００が好ましく、１０，０００～５０，０００がより好ましい。
振盪速度又は撹拌速度は、例えば、１００～３００ｒｐｍとすることができる。
振盪速度又は撹拌速度は、例えば、１００～３００ｒｐｍとすることができる。
【0041】
目的タンパク質を合成した後は、目的タンパク質を精製することが好ましい。目的タンパク質の精製方法としては、公知のタンパク質の精製方法を採用でき、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、アセトン沈殿、酸抽出、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイト、等電点クロマトグラフィー、クロマトフォーカシング等が挙げられる。これらの精製方法は、単独で行ってもよく、２つ以上を組み合わせて行ってもよい。また、合成時に目的タンパク質にタグを付加し、前記タグを特異的に認識した吸着材を利用するアフィニティー精製法を使用してもよい。タグとしては、例えば、ヒスチジンタグ、ＧＳＴタグ、マルトース結合性タグ等が挙げられる。
目的タンパク質の同定及び定量は、活性測定、免疫学的測定、分光学的測定、アミノ酸分析等により、必要に応じて標準サンプルと比較しながら行うことができる。
目的タンパク質の同定及び定量は、活性測定、免疫学的測定、分光学的測定、アミノ酸分析等により、必要に応じて標準サンプルと比較しながら行うことができる。
【0042】
本発明のタンパク質の製造方法で製造したタンパク質の用途は、特に限定されない。例えば、Ｘ線結晶解析やＮＭＲ測定による立体構造の解析、酵素活性測定等に用いることができる。本発明では、低温で沈殿や不活性化を抑制しつつ目的タンパク質を高効率に製造できるため、多量のタンパク質が必要な立体構造の解析や酵素活性測定に好適である。
【0043】
［無細胞タンパク質合成系キット］
本発明の無細胞タンパク質合成系キットは、Ｃｓｐ及びＣｓｐ鋳型核酸のいずれか一方又は両方と、無細胞タンパク質合成系の反応液と、を備える。
本発明の無細胞タンパク質合成系キットにおいては、Ｃｓｐ及びＣｓｐ鋳型核酸が予め混合されていてもよく、細胞抽出液とは別にされていてもよい。また、反応液に使用する補充的な成分が細胞抽出液とは別にされて、使用直前に混合するようになってもよい。細胞抽出液に代えて、前記した再構成型無細胞タンパク質合成法に用いられる溶液を備えてもよい。
本発明の無細胞タンパク質合成系キットは、Ｃｓｐ及びＣｓｐ鋳型核酸のいずれか一方又は両方と、無細胞タンパク質合成系の反応液と、を備える。
本発明の無細胞タンパク質合成系キットにおいては、Ｃｓｐ及びＣｓｐ鋳型核酸が予め混合されていてもよく、細胞抽出液とは別にされていてもよい。また、反応液に使用する補充的な成分が細胞抽出液とは別にされて、使用直前に混合するようになってもよい。細胞抽出液に代えて、前記した再構成型無細胞タンパク質合成法に用いられる溶液を備えてもよい。
【0044】
無細胞タンパク質合成系キットにおいては、各成分を使用し易いように一定量ごと分注する。各成分は凍結又は乾燥状態で保存することができ、保存及び輸送に適した容器に収容してキットとする。キットには取扱説明書や陽性コントロールＤＮＡ、ベクターＤＮＡ等を添付することができる。
【0045】
以上説明したように、本発明では、Ｃｓｐ及びＣｓｐ鋳型核酸のいずれか一方又は両方を含む無細胞タンパク質合成系の反応液で目的タンパク質を製造する。無細胞タンパク質合成系の反応液中にＣｓｐが存在することで、低温でも活性型の目的タンパク質を高効率に製造することができる。このような効果が得られる要因は必ずしも明らかではないが、反応液中のｍＲＮＡの分解が抑制される、ｍＲＮＡが高次構造を形成することが抑制される、といったことが要因として考えられる。
【0046】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の記載によっては限定されない。
［例１］ＧＦＰタンパク質合成のＣｓｐＡ濃度依存性
大腸菌Ｓ３０抽出液としては、大腸菌BL21 codon plus株から調製された安定同位体標識セルフリー合成用酵素液（大陽日酸）を使用した。酵素やアミノ酸等を除くタンパク質合成用試薬として、ＬＭＣＰ（Ｄ－Ｇｌｕ）－ｔＲＮＡ（大陽日酸）を使用した。
ＧＦＰタンパク質の鋳型ＤＮＡとしては、プラスミドＤＮＡであるpCR2.1-N11-GFPS1を用いた。このプラスミドは、Ｔ７プロモーター、リボソーム結合配列、アフィニティー精製用Ｈｉｓタグ配列、ＧＦＰタンパク質の改変体（ＧＦＰＳ１）遺伝子、及びＴ７ターミネーターから構成されている（Seki, E., Matsuda, N., Yokoyama, S., and Kigawa, T. (2008), Anal. Biochem. 377, 156-161, [Anal. Biochem. 517, (2017), 22]）。
［例１］ＧＦＰタンパク質合成のＣｓｐＡ濃度依存性
大腸菌Ｓ３０抽出液としては、大腸菌BL21 codon plus株から調製された安定同位体標識セルフリー合成用酵素液（大陽日酸）を使用した。酵素やアミノ酸等を除くタンパク質合成用試薬として、ＬＭＣＰ（Ｄ－Ｇｌｕ）－ｔＲＮＡ（大陽日酸）を使用した。
ＧＦＰタンパク質の鋳型ＤＮＡとしては、プラスミドＤＮＡであるpCR2.1-N11-GFPS1を用いた。このプラスミドは、Ｔ７プロモーター、リボソーム結合配列、アフィニティー精製用Ｈｉｓタグ配列、ＧＦＰタンパク質の改変体（ＧＦＰＳ１）遺伝子、及びＴ７ターミネーターから構成されている（Seki, E., Matsuda, N., Yokoyama, S., and Kigawa, T. (2008), Anal. Biochem. 377, 156-161, [Anal. Biochem. 517, (2017), 22]）。
【0047】
タンパク質合成反応は下記の表２に示した組成の反応液を、表３に示した組成の透析外液に対して透析し、４℃、８℃、１２℃、１６℃、２０℃、２３℃、３０℃で１８時間行った。反応スケールとしては、内液（反応液）を３０μＬ、透析外液５００μＬとした。大腸菌由来の精製ＣｓｐＡ（ＳＰ値：１１１．９）を、０～１．５μｇ／μＬの範囲で種々の濃度となるように反応液に添加して反応を行った。なお、精製ＣｓｐＡは、無細胞タンパク質合成系で合成した。
また、表２及び表３中の「ＬＭＣＰ（Ｄ－Ｇｌｕ）－ｔＲＮＡ」とは、緩衝液としてＨｅｐｅｓＫＯＨ（ｐＨ７．５）、塩としてＤ－グルタミン酸カリウム及び酢酸アンモニウム、エネルギー源としてＡＴＰ、転写用基質としてＧＴＰ、ＣＴＰ及びＵＴＰ、その他の試薬としてｃｙｃｌｉｃＡＭＰ、フォリン酸、ＤＴＴ及びポリエチレングリコールを含む混合物である。
また、表２及び表３中の「ＬＭＣＰ（Ｄ－Ｇｌｕ）－ｔＲＮＡ」とは、緩衝液としてＨｅｐｅｓＫＯＨ（ｐＨ７．５）、塩としてＤ－グルタミン酸カリウム及び酢酸アンモニウム、エネルギー源としてＡＴＰ、転写用基質としてＧＴＰ、ＣＴＰ及びＵＴＰ、その他の試薬としてｃｙｃｌｉｃＡＭＰ、フォリン酸、ＤＴＴ及びポリエチレングリコールを含む混合物である。
【0048】
【表2】
【0049】
【表3】
【0050】
反応後の全画分を、トリシンを１５％含むＳＤＳ（Sodium dodecyl sulfate）－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（１５％Ｔｒｉｃｉｎｅ－ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）に供した後、ＣＢＢ染色した。結果を図１に示す。
また、合成されたＧＦＰＳ１の合成量は、ＧＦＰＳ１の蛍光値で示した。反応液を緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、３００ｍＭ ＮａＣｌ）で希釈後、マルチモードマイクロプレートリーダーSpectraMax i3（Molecular Devices）を用いて励起４８５ｎｍ、蛍光５３５ｎｍでＧＦＰＳ１の蛍光値を測定した。結果を図２に示す。
また、ＣｓｐＡ非存在下のＧＦＰＳ１の合成量を基準とする、ＧＦＰＳ１の合成量の相対値で表したＣｓｐＡ濃度依存性を図３に示す。
また、合成されたＧＦＰＳ１の合成量は、ＧＦＰＳ１の蛍光値で示した。反応液を緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、３００ｍＭ ＮａＣｌ）で希釈後、マルチモードマイクロプレートリーダーSpectraMax i3（Molecular Devices）を用いて励起４８５ｎｍ、蛍光５３５ｎｍでＧＦＰＳ１の蛍光値を測定した。結果を図２に示す。
また、ＣｓｐＡ非存在下のＧＦＰＳ１の合成量を基準とする、ＧＦＰＳ１の合成量の相対値で表したＣｓｐＡ濃度依存性を図３に示す。
【0051】
図１～３に示すように、４℃～２３℃での反応において、ＣｓｐＡの濃度が高くなるにつれてＧＦＰＳ１の合成量が増加し、３０℃での反応に比べて合成量の増加率が高かった。反応温度が２３℃、ＣｓｐＡの添加量（含有量）が０．７５～１．２５μｇ／μＬの範囲と、反応温度が２０℃、ＣｓｐＡの添加量が１．０～１．２５μｇ／μＬの範囲の場合では、反応温度が３０℃の場合と同等以上の高い合成量が得られた。反応温度が１６℃、ＣｓｐＡの添加量が１．０～１．２５μｇ／μＬの範囲と、反応温度が１２℃、ＣｓｐＡの添加量が１．２５μｇ／μＬ以上の場合では、ＣｓｐＡ非存在下に比べてＧＦＰＳ１の合成量が６倍以上高かった。
【0052】
［例２］ＣｓｐＡ存在下におけるタンパク質合成
鋳型ＤＮＡを変更し、反応温度を２０℃として、例１と同様の方法により、ＣｓｐＡ存在下（１．０μｇ／μＬ）と非存在下で、タンパク質としてＣＡＴ（鋳型ＤＮＡ：pUC-CAT）、ｈＡＫ１（鋳型ＤＮＡ：pCR2.1-NHis-hAK1）、ｈＰＧＫ（鋳型ＤＮＡ：pCR2.1-N11-hPGK）、ＧＦＰＳ１（鋳型ＤＮＡ：pCR2.1-N11-GFPS1）を合成した。
反応後の反応液の全画分（Ｔ）及び可溶性画分（Ｓ）を１５％Ｔｒｉｃｉｎｅ－ＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した後、ＣＢＢ染色した。結果を図４に示す。
鋳型ＤＮＡを変更し、反応温度を２０℃として、例１と同様の方法により、ＣｓｐＡ存在下（１．０μｇ／μＬ）と非存在下で、タンパク質としてＣＡＴ（鋳型ＤＮＡ：pUC-CAT）、ｈＡＫ１（鋳型ＤＮＡ：pCR2.1-NHis-hAK1）、ｈＰＧＫ（鋳型ＤＮＡ：pCR2.1-N11-hPGK）、ＧＦＰＳ１（鋳型ＤＮＡ：pCR2.1-N11-GFPS1）を合成した。
反応後の反応液の全画分（Ｔ）及び可溶性画分（Ｓ）を１５％Ｔｒｉｃｉｎｅ－ＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した後、ＣＢＢ染色した。結果を図４に示す。
【0053】
図４に示すように、ＧＦＰＳ１だけでなく、他のタンパク質合成においても、ＣｓｐＡ非存在下に比べて、ＣｓｐＡ存在下ではタンパク質の合成量が増加した。
【0054】
［例３］沈殿傾向タンパク質の可溶性発現
反応温度を２０℃又は３０℃として、例２と同様の方法でｈＡＫ１の合成を行った。反応後の反応液の全画分（Ｔ）及び可溶性画分（Ｓ）を１５％Ｔｒｉｃｉｎｅ－ＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した後、ＣＢＢ染色した。結果を図５に示す。
反応温度を２０℃又は３０℃として、例２と同様の方法でｈＡＫ１の合成を行った。反応後の反応液の全画分（Ｔ）及び可溶性画分（Ｓ）を１５％Ｔｒｉｃｉｎｅ－ＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した後、ＣＢＢ染色した。結果を図５に示す。
【0055】
図５に示すように、反応温度３０℃で合成すると沈殿する傾向が高いｈＡＫ１でも、２０℃の反応では沈殿が抑制された。また、ＣｓｐＡ存在下では、高い可溶性を維持しつつ、タンパク質の合成量が増加した。
【0056】
［例４］ＣｓｐＡ以外のＣｓｐ（ＣＳＤ）を用いたタンパク質合成
ＣｓｐＡとアミノ酸配列上の同一性が高いタンパク質は多く知られている。ＣｓｐＡは核酸との結合能を有するが、核酸と結合しないＣｓｐＡホモログも存在する。これらのＣｓｐＡホモログを用いて、実施例１と同様の方法でＧＦＰＳ１の合成を行った。具体的には、大腸菌由来のＣｓｐＡ、ＣｓｐＢ（ＳＰ値：１０７．８）、ＣｓｐＣ（ＳＰ値：１１３．４）、ＣｓｐＤ（ＳＰ値：９９．５）、ＣｓｐＥ（ＳＰ値：１１４．４）、ＣｓｐＧ（ＳＰ値：１１３．４）、ＣｓｐＨ（ＳＰ値：７９．４）、ＣｓｐＩ（ＳＰ値：１０７．０）、ヒト由来のｈＣＳＤＥ１－ＣＳＤ１（ＳＰ値：６１．７）、Shewanella livingstonensis由来のＳｌｉＣｓｐＣ（ＳＰ値：１０２．０）、シロイヌナズナ由来のＡｔＣＳＰ３－ＣＳＤ（ＳＰ値：８３．７）、Bacillus subtilis由来のＢｓｕＣｓｐＢ（ＳＰ値：１０３．３）を用い、例１と同様の方法により、２３℃でＧＦＰＳ１を合成した。
例１と同様にしてＧＦＰＳ１の蛍光値を測定した。ＧＦＰＳ１の合成量のＣｓｐ濃度依存性を図６に示す。
ＣｓｐＡとアミノ酸配列上の同一性が高いタンパク質は多く知られている。ＣｓｐＡは核酸との結合能を有するが、核酸と結合しないＣｓｐＡホモログも存在する。これらのＣｓｐＡホモログを用いて、実施例１と同様の方法でＧＦＰＳ１の合成を行った。具体的には、大腸菌由来のＣｓｐＡ、ＣｓｐＢ（ＳＰ値：１０７．８）、ＣｓｐＣ（ＳＰ値：１１３．４）、ＣｓｐＤ（ＳＰ値：９９．５）、ＣｓｐＥ（ＳＰ値：１１４．４）、ＣｓｐＧ（ＳＰ値：１１３．４）、ＣｓｐＨ（ＳＰ値：７９．４）、ＣｓｐＩ（ＳＰ値：１０７．０）、ヒト由来のｈＣＳＤＥ１－ＣＳＤ１（ＳＰ値：６１．７）、Shewanella livingstonensis由来のＳｌｉＣｓｐＣ（ＳＰ値：１０２．０）、シロイヌナズナ由来のＡｔＣＳＰ３－ＣＳＤ（ＳＰ値：８３．７）、Bacillus subtilis由来のＢｓｕＣｓｐＢ（ＳＰ値：１０３．３）を用い、例１と同様の方法により、２３℃でＧＦＰＳ１を合成した。
例１と同様にしてＧＦＰＳ１の蛍光値を測定した。ＧＦＰＳ１の合成量のＣｓｐ濃度依存性を図６に示す。
【0057】
図６に示すように、大腸菌由来のＣｓｐＢ、ＣｓｐＣ、ＣｓｐＥ、ＣｓｐＧ、ＣｓｐＩと、Shewanella livingstonensis由来のＳｌｉＣｓｐＣ、Bacillus subtilis由来のＢｓｕＣｓｐＢは、大腸菌由来のＣｓｐＡと同様の作用を持つことが分かった。
【0058】
［例５］各反応温度におけるタンパク質合成
例１と同様の方法により、反応温度を１６℃、２３℃、３０℃、３７℃として、ＣｓｐＡ存在下（添加量：１．０μｇ／μＬ）と非存在下でＧＦＰＳ１とＣＡＴを合成した。
ＣＡＴの鋳型ＤＮＡとしては、pk7-CAT（KimDM, Kigawa T, Choi CY, Yokoyama S (1996) EurJ Biochem 239:881-886）を用いた。ＣＡＴタンパク質の合成量は、Kigawaらの方法（Kigawa T, YabukiT, Matsuda N, Matsuda T, Nakajima R, Tanaka A, Yokoyama S. (2004) J Struct Funct Genomics 5, 63-68）に従って換算した。
ＣｓｐＡ存在下（ＣｓｐＡ＋）と非存在下（ＣｓｐＡ－）におけるＧＦＰＳ１とＣＡＴの合成量の反応温度依存性を図７に示す。
例１と同様の方法により、反応温度を１６℃、２３℃、３０℃、３７℃として、ＣｓｐＡ存在下（添加量：１．０μｇ／μＬ）と非存在下でＧＦＰＳ１とＣＡＴを合成した。
ＣＡＴの鋳型ＤＮＡとしては、pk7-CAT（KimDM, Kigawa T, Choi CY, Yokoyama S (1996) EurJ Biochem 239:881-886）を用いた。ＣＡＴタンパク質の合成量は、Kigawaらの方法（Kigawa T, YabukiT, Matsuda N, Matsuda T, Nakajima R, Tanaka A, Yokoyama S. (2004) J Struct Funct Genomics 5, 63-68）に従って換算した。
ＣｓｐＡ存在下（ＣｓｐＡ＋）と非存在下（ＣｓｐＡ－）におけるＧＦＰＳ１とＣＡＴの合成量の反応温度依存性を図７に示す。
【0059】
図７に示すように、ＧＦＰＳ１とＣＡＴのいずれのタンパク質の場合も、反応温度が低いほど、ＣｓｐＡ存在下ではＣｓｐＡ非存在下と比べてタンパク質の合成量が大きく増加した。図７における相対値は、ＣｓｐＡ非存在下（ＣｓｐＡ－）の合成量を基準とするＣｓｐＡ存在下（ＣｓｐＡ＋）の合成量の比率である。
【0060】
［例６］各反応温度におけるタンパク質合成
下記の表４に示した組成の溶液を反応液とし、合成方法を透析法からバッチ法に変更し、反応時間を４時間、反応温度を１６℃、２３℃、３０℃、３７℃として、ＣｓｐＡ存在下（添加量：１．０μｇ／μＬ）と非存在下でＧＦＰＳ１とＣＡＴを合成した。ＣＡＴの鋳型ＤＮＡとしては、例５と同じものを使用した。
ＣｓｐＡ存在下（ＣｓｐＡ＋）と非存在下（ＣｓｐＡ－）におけるＧＦＰＳ１とＣＡＴの合成量の反応温度依存性を図８に示す。図８における相対値は、ＣｓｐＡ非存在下（ＣｓｐＡ－）の合成量を基準とするＣｓｐＡ存在下（ＣｓｐＡ＋）の合成量の比率である。
下記の表４に示した組成の溶液を反応液とし、合成方法を透析法からバッチ法に変更し、反応時間を４時間、反応温度を１６℃、２３℃、３０℃、３７℃として、ＣｓｐＡ存在下（添加量：１．０μｇ／μＬ）と非存在下でＧＦＰＳ１とＣＡＴを合成した。ＣＡＴの鋳型ＤＮＡとしては、例５と同じものを使用した。
ＣｓｐＡ存在下（ＣｓｐＡ＋）と非存在下（ＣｓｐＡ－）におけるＧＦＰＳ１とＣＡＴの合成量の反応温度依存性を図８に示す。図８における相対値は、ＣｓｐＡ非存在下（ＣｓｐＡ－）の合成量を基準とするＣｓｐＡ存在下（ＣｓｐＡ＋）の合成量の比率である。
【0061】
【表4】
【0062】
図８に示すように、バッチ法においても、ＧＦＰＳ１とＣＡＴのいずれのタンパク質の場合も、反応温度が低いほど、ＣｓｐＡ存在下ではＣｓｐＡ非存在下と比べてタンパク質の合成量が大きく増加した。
【0063】
［例７］各反応温度でのＧＦＰＳ１タンパク質合成の経時変化
例１と同様の方法により、反応温度を１６℃、２３℃、３０℃とし、反応時間を０～４０時間としてＣｓｐＡ存在下（添加量：１．０μｇ／μＬ）と非存在下でＧＦＰＳ１を合成した。
例１と同様にしてＧＦＰＳ１の蛍光値を測定した。ＣｓｐＡ存在下（ＣｓｐＡ＋）と非存在下（ＣｓｐＡ－）における各反応温度でのＧＦＰＳ１の合成量の経時変化を図９に示す。
例１と同様の方法により、反応温度を１６℃、２３℃、３０℃とし、反応時間を０～４０時間としてＣｓｐＡ存在下（添加量：１．０μｇ／μＬ）と非存在下でＧＦＰＳ１を合成した。
例１と同様にしてＧＦＰＳ１の蛍光値を測定した。ＣｓｐＡ存在下（ＣｓｐＡ＋）と非存在下（ＣｓｐＡ－）における各反応温度でのＧＦＰＳ１の合成量の経時変化を図９に示す。
【0064】
図９に示すように、ＣｓｐＡ存在下におけるタンパク質の合成は、ＣｓｐＡ非存在下と比べて、より長時間継続した。また、３０℃での合成反応は１６時間で停止しているのに対し、ＣｓｐＡ存在下の２３℃での合成反応は４０時間まで継続したため、最終的なタンパク質の合成量は３０℃での合成反応による合成量を大きく上回った。
【0065】
［例８］ＣｓｐＡ鋳型ＤＮＡを用いたＧＦＰＳ１タンパク質合成
例１と同様の方法により、酢酸マグネシウムを１０ｍＭ、反応温度を２３℃、反応時間を１８時間としてＧＦＰＳ１を合成した。ＣｓｐＡ鋳型ＤＮＡを、０～０．８ｎｇ／μＬの範囲で種々の濃度となるように反応液に添加して反応を行った。ＣｓｐＡ鋳型ＤＮＡとしては、Ｔ７プロモーター、リボソーム結合配列、アフィニティー精製用Ｈｉｓタグ配列、ＣｓｐＡタンパク質遺伝子（大腸菌由来のＣｓｐＡ（ＳＰ値：１１１．９）のアミノ酸配列をコードするコード領域を含む遺伝子）、及びＴ７ターミネーターから構成された直鎖状Ｎ１１－ＣｓｐＡを用いた。
例１と同様にしてＧＦＰＳ１の蛍光値を測定した。結果を図１０に示す。また、ＣｓｐＡ非存在下のＧＦＰＳ１の合成量を基準とする、ＧＦＰＳ１の合成量の相対値で表したＣｓｐＡ鋳型ＤＮＡ濃度依存性を図１１に示す。
例１と同様の方法により、酢酸マグネシウムを１０ｍＭ、反応温度を２３℃、反応時間を１８時間としてＧＦＰＳ１を合成した。ＣｓｐＡ鋳型ＤＮＡを、０～０．８ｎｇ／μＬの範囲で種々の濃度となるように反応液に添加して反応を行った。ＣｓｐＡ鋳型ＤＮＡとしては、Ｔ７プロモーター、リボソーム結合配列、アフィニティー精製用Ｈｉｓタグ配列、ＣｓｐＡタンパク質遺伝子（大腸菌由来のＣｓｐＡ（ＳＰ値：１１１．９）のアミノ酸配列をコードするコード領域を含む遺伝子）、及びＴ７ターミネーターから構成された直鎖状Ｎ１１－ＣｓｐＡを用いた。
例１と同様にしてＧＦＰＳ１の蛍光値を測定した。結果を図１０に示す。また、ＣｓｐＡ非存在下のＧＦＰＳ１の合成量を基準とする、ＧＦＰＳ１の合成量の相対値で表したＣｓｐＡ鋳型ＤＮＡ濃度依存性を図１１に示す。
【0066】
図１０～１１に示すように、２３℃での反応において、ＣｓｐＡ鋳型ＤＮＡの濃度が高くなるにつれてＧＦＰＳ１の合成量が増加し、添加量が０．４ｎｇ／μＬを超えると徐々に減少した。ＣｓｐＡ鋳型ＤＮＡの添加量が０．２～０．４ｎｇ／μＬの範囲では、ＣｓｐＡ非存在下に比べてＧＦＰＳ１の合成量が約１．５倍高かった。
【0067】
［例９］ヒト由来タンパク質の可溶性発現
例５と同様の方法により、反応温度を１６℃又は３０℃として、Human Universal QUICK-CloneTM cDNA II（Clontech）からクローニングしたヒト由来タンパク質の遺伝子ＴＲＩＢ２（鋳型ＤＮＡ：pCR2.1-N11-TRIB2）、ＣＡＳＰ７（鋳型ＤＮＡ：直鎖状N11-CASP7）、ＭＡＰ２Ｋ６（鋳型ＤＮＡ：直鎖状N11-MAP2K6）、ＡＵＲＫＢ（鋳型ＤＮＡ：直鎖状N11-AURKB）の合成を行った。
例５と同様の方法により、反応温度を１６℃又は３０℃として、Human Universal QUICK-CloneTM cDNA II（Clontech）からクローニングしたヒト由来タンパク質の遺伝子ＴＲＩＢ２（鋳型ＤＮＡ：pCR2.1-N11-TRIB2）、ＣＡＳＰ７（鋳型ＤＮＡ：直鎖状N11-CASP7）、ＭＡＰ２Ｋ６（鋳型ＤＮＡ：直鎖状N11-MAP2K6）、ＡＵＲＫＢ（鋳型ＤＮＡ：直鎖状N11-AURKB）の合成を行った。
【0068】
反応後の反応液の全画分（Ｔ）及び可溶性画分（Ｓ）を１５％Ｔｒｉｃｉｎｅ－ＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した後、ＣＢＢ染色した。結果を図１２に示す。
【0069】
図１２に示すように、反応温度３０℃で合成すると沈殿する傾向が高いヒトｃＤＮＡ由来タンパク質の合成においても、１６℃の反応では沈殿が抑制された。また、ＣｓｐＡ存在下では、高い可溶性を維持しつつ、タンパク質の合成量が増加した。３０℃において低発現のＣＡＳＰ７は、１６℃におけるＣｓｐＡ存在下で高い可溶性を維持しつつ、タンパク質の合成量が増加した。
【0070】
［例１０］低分子化抗体の可溶性発現
大腸菌Ｓ３０抽出液としては、大腸菌BL21 codon plus株から調製された安定同位体標識セルフリー合成用酵素液（大陽日酸）を透析によってＤＴＴを含まない溶媒に交換して使用した。酵素やアミノ酸等を除くタンパク質合成用試薬として、ＬＭＣＰ（Ｄ－Ｇｌｕ）－ｔＲＮＡ－ＤＴＴ（大陽日酸）を使用した。
低分子化抗体である一本鎖抗体（single chain Fv: ｓｃＦｖ）の鋳型ＤＮＡとして、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ ｓｃＦｖ（pCR2.1-N11-Cetu-VLVH-SBP）、Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ ｓｃＦｖ（pCR2.1-N11-Inf-VLVH-SBP）、Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ ｓｃＦｖ（pCR2.1-N11-Beva-VLVH-SBP）、Ｔｏｃｉｌｉｚｕｍａｂ ｓｃＦｖ（pCR2.1-N11-Toci-VLVH-SBP）を用い、各々のｓｃＦｖの合成を行った。これらのプラスミドは、Ｔ７プロモーター、リボソーム結合配列、アフィニティー精製用Ｈｉｓタグ配列、可溶化SUMOタグ配列、各抗体の抗原結合部位（ＶＬ及びＶＨ）遺伝子、ＶＬとＶＨを連結させるリンカー配列、アフィニティ精製用ＳＢＰタグ配列、及びＴ７ターミネーターから構成されている。また、低分子化抗体のうちＦａｂの鋳型ＤＮＡとして、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ Ｆａｂ（Ｈ鎖：pCR2.1-N11-Cetu-VHCH1-SBP、Ｌ鎖：pCR2.1-N11-Cetu-VLCL）、Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ Ｆａｂ（Ｈ鎖：pCR2.1-N11-Inf-VHCH1-SBP、Ｌ鎖：pCR2.1-N11-Cetu-VLCL）、Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ Ｆａｂ（Ｈ鎖：pCR2.1-N11-Beva-VHCH1-SBP、Ｌ鎖：pCR2.1-N11-Beva-VLCL）、Ｔｏｃｉｌｉｚｕｍａｂ Ｆａｂ（Ｈ鎖：pCR2.1-N11-Toci-VHCH1-SBP、Ｌ鎖：pCR2.1-Toci -VLCL）を用いて、Ｈ鎖とＬ鎖を共発現させることで各々のＦａｂの合成を行った。Ｈ鎖用プラスミドは、Ｔ７プロモーター、リボソーム結合配列、アフィニティー精製用Ｈｉｓタグ配列、可溶化SUMOタグ配列、各抗体のＨ鎖（ＶＨ、ＣＨ１）遺伝子、アフィニティ精製用ＳＢＰタグ配列、及びＴ７ターミネーターから構成されている。Ｌ鎖用プラスミドは、Ｔ７プロモーター、リボソーム結合配列、アフィニティー精製用Ｈｉｓタグ配列、各抗体のＬ鎖（ＶＬ、ＣＬ）遺伝子、及びＴ７ターミネーターから構成されている。
大腸菌Ｓ３０抽出液としては、大腸菌BL21 codon plus株から調製された安定同位体標識セルフリー合成用酵素液（大陽日酸）を透析によってＤＴＴを含まない溶媒に交換して使用した。酵素やアミノ酸等を除くタンパク質合成用試薬として、ＬＭＣＰ（Ｄ－Ｇｌｕ）－ｔＲＮＡ－ＤＴＴ（大陽日酸）を使用した。
低分子化抗体である一本鎖抗体（single chain Fv: ｓｃＦｖ）の鋳型ＤＮＡとして、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ ｓｃＦｖ（pCR2.1-N11-Cetu-VLVH-SBP）、Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ ｓｃＦｖ（pCR2.1-N11-Inf-VLVH-SBP）、Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ ｓｃＦｖ（pCR2.1-N11-Beva-VLVH-SBP）、Ｔｏｃｉｌｉｚｕｍａｂ ｓｃＦｖ（pCR2.1-N11-Toci-VLVH-SBP）を用い、各々のｓｃＦｖの合成を行った。これらのプラスミドは、Ｔ７プロモーター、リボソーム結合配列、アフィニティー精製用Ｈｉｓタグ配列、可溶化SUMOタグ配列、各抗体の抗原結合部位（ＶＬ及びＶＨ）遺伝子、ＶＬとＶＨを連結させるリンカー配列、アフィニティ精製用ＳＢＰタグ配列、及びＴ７ターミネーターから構成されている。また、低分子化抗体のうちＦａｂの鋳型ＤＮＡとして、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ Ｆａｂ（Ｈ鎖：pCR2.1-N11-Cetu-VHCH1-SBP、Ｌ鎖：pCR2.1-N11-Cetu-VLCL）、Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ Ｆａｂ（Ｈ鎖：pCR2.1-N11-Inf-VHCH1-SBP、Ｌ鎖：pCR2.1-N11-Cetu-VLCL）、Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ Ｆａｂ（Ｈ鎖：pCR2.1-N11-Beva-VHCH1-SBP、Ｌ鎖：pCR2.1-N11-Beva-VLCL）、Ｔｏｃｉｌｉｚｕｍａｂ Ｆａｂ（Ｈ鎖：pCR2.1-N11-Toci-VHCH1-SBP、Ｌ鎖：pCR2.1-Toci -VLCL）を用いて、Ｈ鎖とＬ鎖を共発現させることで各々のＦａｂの合成を行った。Ｈ鎖用プラスミドは、Ｔ７プロモーター、リボソーム結合配列、アフィニティー精製用Ｈｉｓタグ配列、可溶化SUMOタグ配列、各抗体のＨ鎖（ＶＨ、ＣＨ１）遺伝子、アフィニティ精製用ＳＢＰタグ配列、及びＴ７ターミネーターから構成されている。Ｌ鎖用プラスミドは、Ｔ７プロモーター、リボソーム結合配列、アフィニティー精製用Ｈｉｓタグ配列、各抗体のＬ鎖（ＶＬ、ＣＬ）遺伝子、及びＴ７ターミネーターから構成されている。
【0071】
タンパク質反応は下記の表５に示した組成の反応液を、表６に示した組成の透析外液に対して透析し、反応温度を１６℃、２３℃として、ＣｓｐＡ存在下（添加量（１６℃）：１．０μｇ／μＬ、添加量（２３℃）：０．６７μｇ／μＬ）と非存在下で２０時間合成した。また、反応温度３０℃のＣｓｐＡ非存在下でも同様に合成を行った。
【0072】
【表5】
【0073】
【表6】
【0074】
【0075】
図１３、図１４に示すように、反応温度３０℃又は２３℃で合成すると沈殿する傾向が高いｓｃＦｖやＦａｂのＨ鎖でも、１６℃の反応では沈殿が抑制された。また、ＣｓｐＡ存在下では、高い可溶性を維持しつつ、タンパク質の合成量が増加した。
【0076】
［例１１］複数種のＣｓｐｓを用いたタンパク質合成
例６と同様の方法により、反応時間を６時間、反応温度を１６℃として、大腸菌由来のＣｓｐＡ、ＣｓｐＢ、ＣｓｐＣ、ＣｓｐＤ、ＣｓｐＥ、ＣｓｐＧ、ＣｓｐＨ、ＣｓｐＩ、Shewanella livingstonensis由来のＳｌｉＣｓｐＣ、Bacillus subtilis由来のＢｓｕＣｓｐＢを用いて、ＧＦＰＳ１を合成した。
例１と同様にしてＧＦＰＳ１の蛍光値を測定した。ＧＦＰＳ１の合成量のＣｓｐ濃度依存性（ＣＳＰ添加量：０．２、０．５、１．０、１．４μｇ／μＬ）を図１５に、相補性を図１６に示す。図１６における「Ａ／Ｂ、０．５ｅａｃｈ」は、ＣｓｐＡとＣｓｐＢの添加量が０．５μｇ／μＬずつであることを意味し、他の表記も同様である。
例６と同様の方法により、反応時間を６時間、反応温度を１６℃として、大腸菌由来のＣｓｐＡ、ＣｓｐＢ、ＣｓｐＣ、ＣｓｐＤ、ＣｓｐＥ、ＣｓｐＧ、ＣｓｐＨ、ＣｓｐＩ、Shewanella livingstonensis由来のＳｌｉＣｓｐＣ、Bacillus subtilis由来のＢｓｕＣｓｐＢを用いて、ＧＦＰＳ１を合成した。
例１と同様にしてＧＦＰＳ１の蛍光値を測定した。ＧＦＰＳ１の合成量のＣｓｐ濃度依存性（ＣＳＰ添加量：０．２、０．５、１．０、１．４μｇ／μＬ）を図１５に、相補性を図１６に示す。図１６における「Ａ／Ｂ、０．５ｅａｃｈ」は、ＣｓｐＡとＣｓｐＢの添加量が０．５μｇ／μＬずつであることを意味し、他の表記も同様である。
【0077】
図１５に示すように、大腸菌由来のＣｓｐＡ、ＣｓｐＢ、ＣｓｐＣ、ＣｓｐＥ、ＣｓｐＧ、ＣｓｐＩと、Shewanella livingstonensis由来のＳｌｉＣｓｐＣ、Bacillus subtilis由来のＢｓｕＣｓｐＢは、バッチ法においてもＧＦＰＳ１の合成量を増加させた。また、図１６に示すように、合成量を増加させるＣｓｐは互いに相補的な効果を示した。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】