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7534768アセトンを生成する組換え好熱性細菌及びそれを用いたアセトンの製造方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-08-06
(45)【発行日】2024-08-15
(54)【発明の名称】アセトンを生成する組換え好熱性細菌及びそれを用いたアセトンの製造方法
(51)【国際特許分類】
C12N 1/21 20060101AFI20240807BHJP
C12P 7/28 20060101ALI20240807BHJP
C12N 15/54 20060101ALN20240807BHJP
C12N 15/55 20060101ALN20240807BHJP
C12N 15/60 20060101ALN20240807BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20240807BHJP
【ＦＩ】
C12N1/21 ZNA
C12P7/28
C12N15/54
C12N15/55
C12N15/60
C12N15/09 Z
【請求項の数】
9
(21)【出願番号】P 2020096417
(22)【出願日】2020-06-02
(65)【公開番号】P2021185862
(43)【公開日】2021-12-13
【審査請求日】2023-03-14
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成３０年度国立研究開発法人科学技術振興機構、未来社会創造事業「再生可能エネルギーを活用した有用物質高生産微生物デザイン」委託研究開発、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
【微生物の受託番号】NPMD NITE P-03217
(73)【特許権者】
【識別番号】504136568
【氏名又は名称】国立大学法人広島大学
(74)【代理人】
【識別番号】100121728
【弁理士】
【氏名又は名称】井関 勝守
(74)【代理人】
【識別番号】100165803
【弁理士】
【氏名又は名称】金子 修平
(72)【発明者】
【氏名】中島田 豊
(72)【発明者】
【氏名】加藤 淳也
(72)【発明者】
【氏名】加藤 節
(72)【発明者】
【氏名】竹村 海生
【審査官】阪▲崎▼ 裕美
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１９／０６８０１１（ＷＯ，Ａ１）
【文献】Biotechnology for Biofuels，2017年，10:150
【文献】Biotechnology and Bioengineering，2018年，115，2951-2961
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １／２１
Ｃ１２Ｐ ７／２８－７／３６
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
炭素源から中間体としてのアセチル‐ＣｏＡを経て酢酸を生成する代謝経路を有する好熱性ホモ酢酸菌であるモーレラ（Moorella）属細菌由来の組換え細菌であって、遺伝子工学的手法によりホスホアセチルトランスフェラーゼであるＰｄｕＬ１又はＰｄｕＬ２の一方が欠損され、
２分子のアセチル‐ＣｏＡからアセトアセチル‐ＣｏＡを生成する縮合反応を触媒する外来の耐熱性酵素、アセトアセチル‐ＣｏＡと酢酸とからアセト酢酸を生成する反応を触媒する外来の耐熱性酵素、及びアセト酢酸からアセトンを生成する脱炭酸反応を触媒する外来の耐熱性酵素を発現し、
前記耐熱性酵素はいずれも至適温度が５５℃～６５℃の範囲内にあることを特徴とするアセトンを生成する組換え好熱性細菌。
【請求項2】
前記アセチル‐ＣｏＡを基質としてアセトアセチル‐ＣｏＡを生成する外来の耐熱性酵素は、Caldanaerobacter subterraneus subsp. tengcongensis由来のチオラーゼであることを特徴とする請求項１に記載の組換え好熱性細菌。
【請求項3】
前記アセトアセチル‐ＣｏＡを基質としてアセト酢酸を生成する外来の耐熱性酵素は、Thermosipho melanesiensis由来のＣｏＡトランスフェラーゼであることを特徴とする請求項１又は２に記載の組換え好熱性細菌。
【請求項4】
前記アセト酢酸を基質としてアセトンを生成する外来の耐熱性酵素は、Clostridium acetobutylicum由来のアセト酢酸デカルボキシラーゼであることを特徴とする請求項１～３のいずれか１項に記載の組換え好熱性細菌。
【請求項5】
受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０３２１７として寄託された請求項１～４のいずれか１項に記載の組換え好熱性細菌。
【請求項6】
糖、一酸化炭素又は二酸化炭素の存在下で請求項１～５のいずれか１項に記載の組換え好熱性細菌を培養してアセトンを生成させるステップを備えていることを特徴とするアセトンの製造方法。
【請求項7】
生成されたアセトンを回収するステップをさらに備えていることを特徴とする請求項６に記載のアセトンの製造方法。
【請求項8】
前記アセトンを生成させるステップにおいて、糖、一酸化炭素又は二酸化炭素に加えてさらに水素及びメタノールの少なくとも一方が存在する条件下で前記組換え好熱性細菌を培養することを特徴とする請求項６又は７に記載のアセトンの製造方法。
【請求項9】
前記アセトンを生成させるステップにおいて、前記組換え好熱性細菌を５５℃～６５℃で培養することを特徴とする請求項６～８のいずれか１項に記載のアセトンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、アセトンを生成する組換え好熱性細菌及びそれを用いたアセトンの製造方法に関し、特に遺伝子工学的手法により代謝経路が改変された好熱性ホモ酢酸菌及びそれを用いたアセトンの製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
これまで人類は石炭や石油等の化石燃料の消費によって産業を発達させてきた一方で、二酸化炭素（ＣＯ２）の排出による環境問題を引き起こしてきた。また、これら化石燃料は限りある資源であるため枯渇が懸念されており、代替エネルギーや材料の開発は急務である。ＣＯ２を固定し再利用することがＣＯ２削減の有効な手段の１つであるが、さらに固定したＣＯ２をエネルギーや材料として利用することが望ましい。
【0003】
近年、廃棄物を合成ガス（水素（Ｈ２）、一酸化炭素（ＣＯ）を主成分としＣＯ２等も含まれるガス）化した上で利用する技術が発展してきており、再生可能エネルギーとしてＨ２の利用も進展してきている。その中でも、これらのガスを炭素源又はエネルギー源として用いた微生物発酵により有用物質を生成する種々の技術が開発されている。例えば、特許文献１及び２には、遺伝子組換え微生物を利用して、合成ガスから有用物質としてアセトンを生成する技術が提示されている。アセトンは有機溶媒として用いられ、またイソブチレン、プロピレン、ジェット燃料などの合成前駆物質として用いられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【文献】特表２０１６－５３８８６９号公報
【文献】特許６１９９７４７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
しかしながら、従来の特許文献１及び２に開示された微生物を用いた方法ではアセトン以外にも多種の副生物が生成し、アセトンの生成効率が高いとは言えない。このため、未だ更に生成効率が高い方法と共に、その方法を可能とするための微生物が求められている。
【0006】
本発明は、前記問題に鑑みてなされたものであり、その目的は、微生物発酵によって、糖や二酸化炭素又は一酸化炭素といった炭素源を基質としてアセトンを高効率で得られるようにすることにある。
【課題を解決するための手段】
【0007】
前記の目的を達成するために、本発明者らは、鋭意研究の結果、好熱性ホモ酢酸菌に対して、遺伝子組み換え技術により内在性の酢酸生成の代謝経路の一部を破壊すると共に、アセチル－ＣｏＡからアセトンを生合成するための耐熱性酵素の発現遺伝子を導入することで、アセトンを高効率で生成できることを見出して本発明を完成した。
【0008】
具体的に、本発明に係るアセトンを生成する組換え好熱性細菌は、炭素源から中間体としてのアセチル‐ＣｏＡを経て酢酸を生成する代謝経路を有する好熱性ホモ酢酸菌由来の組換え細菌であって、遺伝子工学的手法によりアセチル‐ＣｏＡから酢酸を生成するまでの代謝経路に関わる酵素の一部が欠損され、２分子のアセチル‐ＣｏＡからアセトアセチル‐ＣｏＡを生成する縮合反応を触媒する外来の耐熱性酵素、アセトアセチル‐ＣｏＡと酢酸とからアセト酢酸を生成する反応を触媒する外来の耐熱性酵素、及びアセト酢酸からアセトンを生成する脱炭酸反応を触媒する外来の耐熱性酵素を発現することを特徴とする。
【0009】
本発明に係る組換え好熱性細菌は、炭素源から中間体としてのアセチル‐ＣｏＡを経て酢酸を生成する好熱性ホモ酢酸菌に由来する細菌であるが、アセチル‐ＣｏＡから順にアセトアセチル‐ＣｏＡ、アセト酢酸、アセトンを生成する代謝経路を確立する３種の外来酵素を発現するように組換えがなされたものである。このため、当該組換え細菌は、糖、ＣＯ２及びＣＯといった炭素源からアセチル‐ＣｏＡを中間体として、アセトンを生成することができる。さらに、本発明に係る組換え好熱性細菌は、アセチル‐ＣｏＡから酢酸を生成するまでの内在性の代謝経路に関わる酵素の一部が欠損されているため、アセチル‐ＣｏＡからの酢酸の生成が抑制され、代わりに多くのアセチル‐ＣｏＡをアセトンの生成のために利用可能となる。また、本発明に係る組換え好熱性細菌において、アセト酢酸を生成する際にアセトアセチル‐ＣｏＡと酢酸とを反応させるが、酢酸の生成は上記の通り一部の酵素の欠損により抑制されているものの、その代謝が完全に阻害されてはおらず生成はなされるため、生成された酢酸はアセト酢酸の生成のために利用され得る。これらによって、本発明に係る組換え好熱性細菌では、炭素源から、副生物の酢酸を利用しながらアセトンを高効率で生成することができる。さらに、本発明に係る細菌は、好熱性細菌であるため、中温菌等と比較して代謝反応速度が大きく、アセトン生成に有利であり、また、多くの汚染微生物の生育温度より高い温度が至適生育温度であるため安全性も高い。さらに、ガス発酵及び生成物精製における冷却、加熱のコストが節約できるといった利点もあり、また、アセトンの沸点である５６℃前後又はそれ以上の温度で培養を行うことで細菌の増殖阻害を起こすことなくアセトンの蒸留精製が可能となり、アセトンの回収を容易にすることもできる。特に、本発明に係る組換え好熱性細菌の副生物は酢酸のみであり、酢酸の沸点が１１８℃であるため、アセトンの分離は容易である。
【0010】
本発明に係る組換え好熱性細菌において、前記好熱性ホモ酢酸菌は、モーレラ（Moorella）属細菌であることが好ましい。
【0011】
モーレラ属細菌は、ＷＬＰ（Wood-Ljungdahl pathway, 別名還元的アセチル‐ＣｏＡ経路）を用いることで糖代謝により生ずるＣＯ２、又はガスとして添加するＣＯやＣＯ２を固定して唯一の最終代謝産物として酢酸を生産するが、代謝経路の改変により酢酸に代えて様々な物質生産株の構築が可能な細菌である。従って、糖はもちろんのこと、廃ガスやガス化した廃棄物やバイオマスからの有用物質生産を可能であり、上記のように本発明に係る組換え好熱性細菌の親株としてモーレラ属細菌を用いることは好ましい。
【0012】
本発明に係る組換え好熱性細菌において、アセチル‐ＣｏＡを基質としてアセチルリン酸を生成する酵素の一部が欠損されていることが好ましい。
【0013】
このように、アセチル‐ＣｏＡから酢酸を生成するまでの代謝経路に関わる酵素のうちアセチル‐ＣｏＡを基質としてアセチルリン酸を生成する酵素の一部が欠損されることにより、上述の通り、酢酸の生成を抑制できる。このため、細菌中のアセチル‐ＣｏＡの多くをアセトンの生成に利用できると共に、アセト酢酸の生成のために利用される酢酸の生成も維持される。その結果、アセトンの生成効率を向上することができる。
【0014】
その場合、アセチル‐ＣｏＡを基質としてアセチルリン酸を生成する酵素として、ホスホアセチルトランスフェラーゼであるＰｄｕＬ１又はＰｄｕＬ２が欠損されていることが好ましい。
【0015】
本発明に係る組換え好熱性細菌において、前記アセチル‐ＣｏＡを基質としてアセトアセチル‐ＣｏＡを生成する外来の耐熱性酵素は、Caldanaerobacter subterraneus subsp. tengcongensis由来のチオラーゼとすることができる。
【0016】
本発明に係る組換え好熱性細菌において、前記アセトアセチル‐ＣｏＡを基質としてアセト酢酸を生成する外来の耐熱性酵素は、Thermosipho melanesiensis由来のＣｏＡトランスフェラーゼとすることができる。
【0017】
本発明に係る組換え好熱性細菌において、前記アセト酢酸を基質としてアセトンを生成する外来の耐熱性酵素は、Clostridium acetobutylicum由来のアセト酢酸デカルボキシラーゼとすることができる。
【0018】
本発明に係る組換え好熱性細菌は、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）に受託日２０２０年５月１５日、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０３２１７として寄託された細菌であることが好ましい。
【0019】
本発明に係るアセトンの製造方法は、糖、一酸化炭素又は二酸化炭素の存在下で上記本発明に係る組換え好熱性細菌を培養してアセトンを生成させるステップを備えていることを特徴とする。
【0020】
本発明に係るアセトンの製造方法によると、上記本発明に係る組換え好熱性細菌を炭素源存在下で培養するため、上述の通り、当該組換え細菌の代謝によって高効率でアセトンを得ることができる。
【0021】
本発明に係るアセトンの製造方法は、生成されたアセトンを回収するステップをさらに備えていてもよい。
【0022】
本発明に係るアセトンの製造方法は、前記アセトンを生成させるステップにおいて、糖、一酸化炭素又は二酸化炭素に加えてさらに水素やメタノールといったエネルギー源として用いられ得る電子供与体が存在する条件下で前記組換え好熱性細菌を培養することが好ましい。
【0023】
このようにすると、水素等の電子供与体によりアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の合成を促進できるため、細菌増殖を促進できてアセトン生成に有利となり、また、ＡＴＰ不足に起因するＣＯ２の代謝が例えばギ酸で停止する等してアセトン生成量が低減することを防止できる。
【0024】
本発明に係るアセトンの製造方法は、前記アセトンを生成させるステップにおいて、前記組換え好熱性細菌を５５℃～６５℃で培養することが好ましい。
【0025】
好熱性細菌として特にモーレラ属細菌を用いた場合、上記温度範囲で特に優れた代謝速度を示し、アセトンの生成に有利であり、また、上述した通りアセトンの回収にも有利である。
【発明の効果】
【0026】
本発明に係るアセトンを生成する組換え好熱性細菌及びそれを用いたアセトンの製造方法によると、微生物発酵によって、糖、ＣＯ又はＣＯ２といった炭素源を基質としてアセトンを高効率で得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【0027】
【図1】（ａ）はアセトン生合成遺伝子群の導入プラスミド及びそれを用いた相同組換えによる遺伝子導入方法を説明するための図であり、（ｂ）は本実施例において行われたモーレラ・サーモアセチカ細菌への遺伝子導入の成否の確認のための電気泳動の結果を示す写真である。
【図2】本実施例におけるｐｄｕＬ２：：ａｃｅｔｏｎｅ株のアセトン生成能を評価したＨＰＬＣの結果を示す図である。
【図3】本実施例におけるｐｄｕＬ２：：ａｃｅｔｏｎｅ株のアセトン生成能を評価したＧＣ－ＭＳの結果を示す図である。
【図4】（ａ）は本実施例におけるｐｄｕＬ２：：ａｃｅｔｏｎｅ株のフルクトースを炭素源として加えた場合の菌体増殖の評価結果を示すグラフであり、（ｂ）は本実施例におけるｐｄｕＬ２：：ａｃｅｔｏｎｅ株のフルクトースを炭素源として加えた場合の代謝産物量の測定結果を示すグラフである。
【図5】（ａ）は本実施例におけるｐｄｕＬ２：：ａｃｅｔｏｎｅ株をＣＯ、ＣＯ２及びＨ２の存在下で培養した場合の菌体増殖の評価結果を示すグラフであり、（ｂ）はその場合の代謝産物量の測定結果を示すグラフである。（ｃ）は本実施例におけるｐｄｕＬ２：：ａｃｅｔｏｎｅ株をＣＯ及びＣＯ２の存在下で培養した場合の菌体増殖の評価結果を示すグラフであり、（ｄ）はその場合の代謝産物量の測定結果を示すグラフである。（ｅ）は本実施例におけるｐｄｕＬ２：：ａｃｅｔｏｎｅ株をＣＯ２及びＨ２の存在下で培養した場合の菌体増殖の評価結果を示すグラフであり、（ｆ）はその場合の代謝産物量の測定結果を示すグラフである。
【図6】（ａ）は本実施例におけるｐｄｕＬ２：：ａｃｅｔｏｎｅ株をフルクトース並びにＣＯ２及びＨ２の存在下で培養した場合の菌体増殖の評価結果を示すグラフであり、（ｂ）はその場合の代謝産物量の測定結果を示すグラフである。（ｃ）は本実施例におけるｐｄｕＬ２：：ａｃｅｔｏｎｅ株をフルクトースの存在下で培養した場合の菌体増殖の評価結果を示すグラフであり、（ｄ）はその場合の代謝産物量の測定結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0028】
以下、本発明を実施するための形態を図面に基づいて説明する。以下の好ましい実施形態の説明は、本質的に例示に過ぎず、本発明、その適用方法或いはその用途を制限することを意図するものではない。
【0029】
本発明の一実施形態は、炭素源から中間体としてのアセチル‐ＣｏＡを経て酢酸を生成する代謝経路を有する好熱性ホモ酢酸菌由来の組換え細菌である。特に、本実施形態の細菌は、遺伝子工学的手法によりアセチル‐ＣｏＡから酢酸を生成するまでの代謝経路に関わる酵素の一部が欠損され、２分子のアセチル‐ＣｏＡからアセトアセチル‐ＣｏＡを生成する縮合反応を触媒する外来の耐熱性酵素、アセトアセチル‐ＣｏＡと酢酸とからアセト酢酸を生成する反応を触媒する外来の耐熱性酵素、及びアセト酢酸からアセトンを生成する脱炭酸反応を触媒する外来の耐熱性酵素を発現する。
【0030】
好熱性ホモ酢酸菌とは、至適生育温度が４５℃以上であり、糖などの有機物に加えて、一酸化炭素、又は二酸化炭素と水素といったガス基質を利用して酢酸を生成する細菌である。好熱性ホモ酢酸菌は、水素等の電子供与体をエネルギー源として利用できるが、水素以外にもメタノールを利用することもできる（Arch Microbiol (2003) 179, p315-320を参照）。本実施形態の組換え細菌の親細菌としての好熱性ホモ酢酸菌は、炭素源から中間体としてのアセチル‐ＣｏＡを経て酢酸を生成する代謝経路を有するものであれば、特に限定はされない。古細菌が含まれてもよい。本実施形態においては、モーレラ属細菌であることが好ましく、そのような細菌として例えばモーレラ・サーモアセチカ（Moorella thermoacetica）又はモーレラ・サーモオートトロフィカ（Moorella thermoautotrophica）を用いることができる。モーレラ属細菌以外の例としては、サーモアナエロバクター・キウビ（Thermoanaerobacter kiuvi）が挙げられ、古細菌の例としてはアルカエオグロブス・フルギダス（Archaeoglobus fulgidus）が挙げられる。
【0031】
本実施形態に係る組換え細菌は、アセチル‐ＣｏＡから酢酸を生成するまでの代謝経路に関わる酵素の一部が欠損されているが、そのために、種々の遺伝子工学的手法を用いることができる。その手法は、細菌のゲノム上の当該酵素の発現遺伝子を除去する又は変異させる等により、当該酵素を安定的に発現させないことができるものであれば特に限定されない。当該遺伝子工学的手法としては、例えば相同組換えを利用した遺伝子ノックアウト法等を用いることができる。
【0032】
欠損させるアセチル‐ＣｏＡから酢酸を生成するまでの代謝経路に関わる酵素は、当該代謝経路に関わる酵素であれば特に限定されない。好熱性ホモ酢酸菌の場合、炭素源から種々の酵素の作用によりアセチル‐ＣｏＡを生成した後に、所定の酵素の作用によりアセチル‐ＣｏＡからＣｏＡを脱離させ、リン酸を付加させてアセチルリン酸を生成し、その後、他の酵素によってリン酸を脱離させて酢酸を生成する。このため、これらの過程に関わる酵素の一部の発現を欠損させることが好ましいが、当該欠損により、酢酸が全く生成できなくなるのではなく、酢酸の生成量が低減するような酵素が選択されることが好ましい。欠損させる酵素としては、例えばアセチル‐ＣｏＡからアセチルリン酸を生成するホスホアセチルトランスフェラーゼであることが好ましい。モーレラ属の場合、例えば２つのホスホアセチルトランスフェラーゼのうちの１つの酵素を欠損させることが好ましい。
【0033】
本実施形態に係る組換え細菌は、上記３種の外来の耐熱性酵素を発現でき、すなわち、アセチル‐ＣｏＡからアセトンを生成する代謝経路が導入されている。具体的に、下記式に係る代謝経路が導入されている。
【化1】
【0034】
本実施形態において、上記３種の外来の耐熱性酵素は、上記式のようにアセチル‐ＣｏＡからアセトンを生成させることができるものであって、例えばそれぞれチオラーゼ、ＣｏＡトランスフェラーゼ、アセト酢酸デカルボキシラーゼであるが、当該細菌の至適生育温度で作用することができるものであれば特に限定されない。従って、好熱性細菌由来の酵素を用いることが好ましい。アセチル‐ＣｏＡを基質としてアセトアセチル‐ＣｏＡを生成する外来の耐熱性酵素としては、Caldanaerobacter subterraneus subsp. tengcongensis由来のチオラーゼ（ｔｈｌ、遺伝子番号ＴＴＥ０５４９）を用いることができる。アセトアセチル‐ＣｏＡを基質としてアセト酢酸を生成する外来の耐熱性酵素としては、Thermosipho melanesiensis由来のＣｏＡトランスフェラーゼ（ｃｔｆＡ及びｃｔｆＢにコードされる２つのタンパク質による複合体ｃｔｆＡＢ、遺伝子番号Ｔｍｅｌ＿１１３５及びＴｍｅｌ＿１１３６）を用いることができる。アセト酢酸を基質としてアセトンを生成する外来の耐熱性酵素としては、Clostridium acetobutylicum由来のアセト酢酸デカルボキシラーゼ（ａｄｃ、遺伝子番号ＣＡ＿Ｐ０１６５）を用いることができる。
【0035】
本実施形態において、上記３種の外来の耐熱性酵素の発現遺伝子は、種々の遺伝子工学的手法を用いることによって細菌内に導入される。当該手法は、それらの酵素を安定的に発現できるように細菌のゲノム内に導入させることができものであれば特に限定されない。本実施形態において、当該遺伝子工学的手法としては、例えば相同組換えを利用した遺伝子ノックイン法等を用いることができる。特に、上記アセチル‐ＣｏＡから酢酸を生成するまでの代謝経路に関わる酵素の一部を欠損させるのと同時に上記３種の外来の耐熱性酵素の発現遺伝子を導入することが好ましい。すなわち、細菌のゲノム上における欠損させるためのアセチル‐ＣｏＡから酢酸を生成するための酵素の遺伝子座と上記３種の外来の耐熱性酵素の発現遺伝子群とを相同組換えすることにより、アセチル‐ＣｏＡから酢酸を生成するまでの代謝経路に関わる酵素の一部を欠損させるのと同時に上記３種の外来の耐熱性酵素の発現遺伝子を導入することが好ましい。これにより、１度の工程で上記内在酵素の発現遺伝子の欠損と外来酵素の発現遺伝子の導入とを同時にできる。
【0036】
本実施形態に係る組換え細菌としては、例えば受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０３２１７の細菌を用いることができる。当該細菌は、モーレラ・サーモアセチカ（Moorella thermoacetica）を親株として、内在のホスホアセチルトランスフェラーゼのうちの１つであるＰｄｕＬ２の発現遺伝子が欠損され、且つCaldanaerobacter subterraneus subsp. tengcongensis由来のチオラーゼ、Thermosipho melanesiensis由来のＣｏＡトランスフェラーゼ、及びClostridium acetobutylicum由来のアセト酢酸デカルボキシラーゼの発現遺伝子が導入されたものである。
【0037】
本発明に係る他の実施形態は、上記組換え細菌を用いたアセトンの製造方法である。本実施形態の方法は、上記組換え細菌を培養してアセトンを生成させるステップを備えている。組換え細菌の培養は、炭素源からアセトンを生成できるように糖、一酸化炭素又は二酸化炭素の存在下で行われる。本実施形態では、組換え細菌は、上記の炭素源に加えて水素の存在下で培養されることが好ましい。特に、上記炭素源として二酸化炭素が選択される場合、アセトン生成の代謝を促進させるためにエネルギー源として利用される電子供与体である水素を加えることが好ましい。また、水素以外に上述の通りエネルギー源として利用され得るメタノールを加えて培養してもよい。
【0038】
また、組換え細菌の培養は、可能な限り高い効率でアセトンを生成させるために、当該細菌の至適生育温度で行われることが好ましく、モーレラ属細菌を用いる場合、５５℃～６５℃で培養することが好ましい。
【0039】
本実施形態に係る方法において、上記細菌の培養によってアセトンを生成させた後に、当該アセトンを回収するステップをさらに備えていることが好ましい。アセトンを回収する方法は、他の成分からアセトンを分離して、純度高いアセトンのみを得ることができる方法であれば特に限定されない。そのような方法として、例えば細菌の培養液の蒸留によってアセトンを分離精製する方法を用いることができる。本実施形態において、上記組換え細菌は、アセトンと酢酸とを生成するが、アセトンの沸点は５６℃であり、酢酸は１１８℃であり、蒸留によりそれらの分離は容易にでき、また、５６℃前後で細菌を培養することで、アセトンの蒸留精製と細菌培養とを同時にすることができて好ましい。
【実施例】
【0040】
以下に、本発明に係るアセトンを生成する組換え好熱性細菌及びそれを用いたアセトンの製造方法について詳細に説明するための実施例を示す。
【0041】
［使用菌株、プラスミド及びプライマー］
本実施例で使用した菌株、プラスミド及びＰＣＲプライマーをそれぞれ下記表１～表３に示す。
本実施例で使用した菌株、プラスミド及びＰＣＲプライマーをそれぞれ下記表１～表３に示す。
【0042】
【表1】
【0043】
【表2】
【0044】
【表3】
【0045】
［基本培地及び基本溶液の調製］
（モーレラ細菌用基本培地の調製）
本実施例では、C. ljungdahliiの培養に用いられるＡＴＣＣ １７５４ ＰＥＴＣ培地を改変したものを基本培地として用いた。改変として、塩酸システイン・一水和物の最終濃度を１．２ｇ／Ｌに減らし、Ｎａ２Ｓ・９Ｈ２Ｏを除いた。培地の作製において、還元剤（システイン及びＴｉ（ＩＩＩ）クエン酸）及び基質（フルクトース等）は別に調製した。嫌気的に培地を調製する方法として、Ｈｕｎｇａｔｅの方法（Hungate, R. E., 1969, Methods Microbiol., 3B: 117-132）を改変したＭｉｌｌｅｒらの方法（Miller, T. L. et al., 1974, Appl. Microbiol., 27: 985-987）を用いた。各成分の組成は以下の通りである。１．０ｇのＮＨ４Ｃｌ、０．１ｇのＫＣｌ、０．２ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．８ｇのＮａＣｌ、０．１ｇのＫＨ２ＰＯ４、０．０２ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１．０ｇの酵母エキス（酵母エキス無添加の場合は０．０１ｇのウラシル）、２．０ｇのＮａＨＣＯ３、１０ｍｌの微量元素溶液、１０ｍｌのビタミン溶液、１０００ｍｌのイオン交換水、（必要に応じて２０ｇのアガー）、（必要に応じて２．０ｇのフルクトース）。調製手順は以下の通りである。まず、上記各成分を混合し、５ＮＨＣｌでｐＨ６．９に調整後、イオン交換水で９００ｍＬにメスアップし、培地を湯浴でボイル（２０分間）した。その後、Ｎ２／ＣＯ２（８０：２０）を注入しながら氷中で冷却（２０分間）し、予めＮ２／ＣＯ２を注入しておいた１２５ｍＬバイアル瓶に４５ｍＬずつ分注し、さらに、Ｎ２／ＣＯ２を３分間注入した後、ブチルゴム栓及びアルミシールで密閉した。その後、当該バイアル瓶をオートクレーブ（１２１℃、１５分）した。
（モーレラ細菌用基本培地の調製）
本実施例では、C. ljungdahliiの培養に用いられるＡＴＣＣ １７５４ ＰＥＴＣ培地を改変したものを基本培地として用いた。改変として、塩酸システイン・一水和物の最終濃度を１．２ｇ／Ｌに減らし、Ｎａ２Ｓ・９Ｈ２Ｏを除いた。培地の作製において、還元剤（システイン及びＴｉ（ＩＩＩ）クエン酸）及び基質（フルクトース等）は別に調製した。嫌気的に培地を調製する方法として、Ｈｕｎｇａｔｅの方法（Hungate, R. E., 1969, Methods Microbiol., 3B: 117-132）を改変したＭｉｌｌｅｒらの方法（Miller, T. L. et al., 1974, Appl. Microbiol., 27: 985-987）を用いた。各成分の組成は以下の通りである。１．０ｇのＮＨ４Ｃｌ、０．１ｇのＫＣｌ、０．２ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．８ｇのＮａＣｌ、０．１ｇのＫＨ２ＰＯ４、０．０２ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１．０ｇの酵母エキス（酵母エキス無添加の場合は０．０１ｇのウラシル）、２．０ｇのＮａＨＣＯ３、１０ｍｌの微量元素溶液、１０ｍｌのビタミン溶液、１０００ｍｌのイオン交換水、（必要に応じて２０ｇのアガー）、（必要に応じて２．０ｇのフルクトース）。調製手順は以下の通りである。まず、上記各成分を混合し、５ＮＨＣｌでｐＨ６．９に調整後、イオン交換水で９００ｍＬにメスアップし、培地を湯浴でボイル（２０分間）した。その後、Ｎ２／ＣＯ２（８０：２０）を注入しながら氷中で冷却（２０分間）し、予めＮ２／ＣＯ２を注入しておいた１２５ｍＬバイアル瓶に４５ｍＬずつ分注し、さらに、Ｎ２／ＣＯ２を３分間注入した後、ブチルゴム栓及びアルミシールで密閉した。その後、当該バイアル瓶をオートクレーブ（１２１℃、１５分）した。
【0046】
（微量元素溶液の調製）
イオン交換水に以下の成分を溶解後、１Ｌにフィルアップした。２．０ｇのニトリロトリ酢酸（ニトリロトリ酢酸を溶解させた後、ＫＯＨでｐＨ６．０に調整）、１．０ｇのＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、０．８ｇのＦｅ（ＳＯ４）２（ＮＨ４）２・６Ｈ２Ｏ、０．２ｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．２ｍｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２０．０ｍｇのＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、２０．０ｍｇのＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、２０．０ｍｇのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、２０．０ｍｇのＮａ２ＳｅＯ４、２０．０ｍｇのＮａ２ＷＯ４。溶液は遮光し４℃で保存した。
イオン交換水に以下の成分を溶解後、１Ｌにフィルアップした。２．０ｇのニトリロトリ酢酸（ニトリロトリ酢酸を溶解させた後、ＫＯＨでｐＨ６．０に調整）、１．０ｇのＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、０．８ｇのＦｅ（ＳＯ４）２（ＮＨ４）２・６Ｈ２Ｏ、０．２ｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．２ｍｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２０．０ｍｇのＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、２０．０ｍｇのＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、２０．０ｍｇのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、２０．０ｍｇのＮａ２ＳｅＯ４、２０．０ｍｇのＮａ２ＷＯ４。溶液は遮光し４℃で保存した。
【0047】
（ビタミン溶液の調製）
イオン交換水に以下の成分を溶解後、１Ｌにフィルアップした。２．０ｍｇのビオチン、２．０ｍｇの葉酸、１０．０ｍｇのピリドキシン塩酸塩、５．０ｍｇのチアミン・ＨＣｌ、５．０ｍｇのリボフラビン、５．０ｍｇのニコチン酸、５．０ｍｇのカルシウム Ｄ－（＋）－パントテン酸、０．１ｍｇのビタミンＢ１２、５．０ｍｇのｐ－アミノ安息香酸、５．０ｍｇのチオクト酸。溶液は遮光し４℃で保存した。
イオン交換水に以下の成分を溶解後、１Ｌにフィルアップした。２．０ｍｇのビオチン、２．０ｍｇの葉酸、１０．０ｍｇのピリドキシン塩酸塩、５．０ｍｇのチアミン・ＨＣｌ、５．０ｍｇのリボフラビン、５．０ｍｇのニコチン酸、５．０ｍｇのカルシウム Ｄ－（＋）－パントテン酸、０．１ｍｇのビタミンＢ１２、５．０ｍｇのｐ－アミノ安息香酸、５．０ｍｇのチオクト酸。溶液は遮光し４℃で保存した。
【0048】
（フルクトース溶液（２００ｇ／Ｌ）の調製）
フルクトースをイオン交換水と混合して２００ｇ／Ｌの濃度で調製し、バイアル瓶に分注した後、２０分間ボイルした。その後、Ｎ２ガスを注入しながら氷冷し２０分間冷却後、ブチルゴム栓及びアルミキャップで密閉した。その後、オートクレーブ（１２１℃、１５分）を行った後、室温保存した。
フルクトースをイオン交換水と混合して２００ｇ／Ｌの濃度で調製し、バイアル瓶に分注した後、２０分間ボイルした。その後、Ｎ２ガスを注入しながら氷冷し２０分間冷却後、ブチルゴム栓及びアルミキャップで密閉した。その後、オートクレーブ（１２１℃、１５分）を行った後、室温保存した。
【0049】
（還元剤システイン（６０ｇ／Ｌ）の調製）
Ｌ－システイン・ＨＣｌ・Ｈ２Ｏをイオン交換水と混合して６０ｇ／Ｌの濃度で調製し、バイアル瓶に分注した後、２０分間ボイルした。その後、Ｎ２ガスを注入しながら氷冷し２０分間冷却後、ブチルゴム栓及びアルミキャップで密閉した。その後、オートクレーブ（１２１℃、１５分）を行った後、遮光し室温保存した。培地使用前に１／５０量を添加した。
Ｌ－システイン・ＨＣｌ・Ｈ２Ｏをイオン交換水と混合して６０ｇ／Ｌの濃度で調製し、バイアル瓶に分注した後、２０分間ボイルした。その後、Ｎ２ガスを注入しながら氷冷し２０分間冷却後、ブチルゴム栓及びアルミキャップで密閉した。その後、オートクレーブ（１２１℃、１５分）を行った後、遮光し室温保存した。培地使用前に１／５０量を添加した。
【0050】
（還元剤Ｔｉ（ＩＩＩ）クエン酸溶液の調製）
イオン交換水にクエン酸ナトリウム二水和物（１１．７６ｇ）を加えて、２００ｍＬにメスアップした。２０分間ボイルして脱気後、Ｎ２を注入しつつ氷中で２０分間冷却した。その後、２０％塩化チタン（ＩＩＩ）水溶液（ナカライテスク）（１０．６ｍＬ）を混合し、湯煎で沈殿を溶解させた飽和炭酸ナトリウム水溶液でｐＨ６．０に調整後、予めＮ２を注入しておいた１２５ｍＬバイアル瓶に８０ｍＬずつ分注した。さらにＮ２を３分間注入した後、ブチルゴム栓及びアルミキャップで密閉した。オートクレーブ（１２１℃、１５分）後に遮光し室温保存した。これを培地に対して１、２滴添加した。
イオン交換水にクエン酸ナトリウム二水和物（１１．７６ｇ）を加えて、２００ｍＬにメスアップした。２０分間ボイルして脱気後、Ｎ２を注入しつつ氷中で２０分間冷却した。その後、２０％塩化チタン（ＩＩＩ）水溶液（ナカライテスク）（１０．６ｍＬ）を混合し、湯煎で沈殿を溶解させた飽和炭酸ナトリウム水溶液でｐＨ６．０に調整後、予めＮ２を注入しておいた１２５ｍＬバイアル瓶に８０ｍＬずつ分注した。さらにＮ２を３分間注入した後、ブチルゴム栓及びアルミキャップで密閉した。オートクレーブ（１２１℃、１５分）後に遮光し室温保存した。これを培地に対して１、２滴添加した。
【0051】
（ウラシル溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）の調製）
ウラシル（３００ｍｇ）をジメチルスルホオキシド（ＤＭＳＯ）（３０ｍＬ）に溶解した。バイアル瓶に移し、ブチルゴム栓及びアルミキャップで密閉、遮光し室温保存した。
ウラシル溶液は、ウラシル要求性変異株（ΔｐｙｒＦ株）培養時のみ培地に対して１／１０００量を添加した。
ウラシル（３００ｍｇ）をジメチルスルホオキシド（ＤＭＳＯ）（３０ｍＬ）に溶解した。バイアル瓶に移し、ブチルゴム栓及びアルミキャップで密閉、遮光し室温保存した。
ウラシル溶液は、ウラシル要求性変異株（ΔｐｙｒＦ株）培養時のみ培地に対して１／１０００量を添加した。
【0052】
（モーレラ属細菌用エレクトロポレーション・バッファー（２７２ｍＭスクロース溶液）の調製）
スクロースをミリＱ水に溶解し、２７２ｍＭ溶液を調製した。２０分間ボイルして脱気後、Ｎ２を注入しつつ氷中で２０分間冷却した。ブチルゴム栓及びアルミキャップで密閉し、オートクレーブ（１２１℃、１５分）後に室温保存した。
スクロースをミリＱ水に溶解し、２７２ｍＭ溶液を調製した。２０分間ボイルして脱気後、Ｎ２を注入しつつ氷中で２０分間冷却した。ブチルゴム栓及びアルミキャップで密閉し、オートクレーブ（１２１℃、１５分）後に室温保存した。
【0053】
（ＬＢ培地の作製）
１０ｇのトリプトン（ナカライテスク）、５ｇの酵母エキス（ナカライテスク）、１０ｇのＮａＣｌを１０００ｍＬのイオン交換水に溶かしてオートクレーブした。プレート作成時には寒天末を１．５％添加した。
１０ｇのトリプトン（ナカライテスク）、５ｇの酵母エキス（ナカライテスク）、１０ｇのＮａＣｌを１０００ｍＬのイオン交換水に溶かしてオートクレーブした。プレート作成時には寒天末を１．５％添加した。
【0054】
（２×ＹＴ培地の作製）
１６ｇのトリプトン（ナカライテスク）、１０ｇの酵母エキス（ナカライテスク）、５ｇのＮａＣｌを１０００ｍＬのイオン交換水に溶かしてオートクレーブした。プレート作成時には寒天末を１％添加した。
１６ｇのトリプトン（ナカライテスク）、１０ｇの酵母エキス（ナカライテスク）、５ｇのＮａＣｌを１０００ｍＬのイオン交換水に溶かしてオートクレーブした。プレート作成時には寒天末を１％添加した。
【0055】
（ＳＯＢ培地の作製）
９５０ｍＬのイオン交換水に対して、２０ｇのトリプトン（ナカライテスク）、 ５ｇの酵母エキス（ナカライテスク）、 ０．５ｇのＮａＣｌ、及び１０ｍＬの２５０ｍＭ ＫＣｌを溶解後、ｐＨを７．０に調整し、イオン交換水で１０００ｍＬにメスアップした。オートクレーブ後、使用直前にオートクレーブ滅菌した２ＭＭｇＣｌ２（５ｍＬ）を添加した。
９５０ｍＬのイオン交換水に対して、２０ｇのトリプトン（ナカライテスク）、 ５ｇの酵母エキス（ナカライテスク）、 ０．５ｇのＮａＣｌ、及び１０ｍＬの２５０ｍＭ ＫＣｌを溶解後、ｐＨを７．０に調整し、イオン交換水で１０００ｍＬにメスアップした。オートクレーブ後、使用直前にオートクレーブ滅菌した２ＭＭｇＣｌ２（５ｍＬ）を添加した。
【0056】
（Ｉｎｏｕｅトランスフォーメーションバッファーの調製）
まず以下の手順で、０．５ＭＰＩＰＥＳ（ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ－１，２－ｂｉｓ［２－ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ］）を準備した。ＰＩＰＥＳ（１５．１ｇ）をミリＱ水（８０ｍＬ）に溶解し、５ＮＫＯＨを用いてｐＨを６．７に調整後、ミリＱ水で１００ｍＬにメスアップした。その後、０．４５μｍフィルターで濾過滅菌し、－２０℃で保存した。次に、以下の試薬をミリＱ水（８００ｍＬ）に溶解して、Ｉｎｏｕｅトランスフォーメーションバッファーを調製した。１０．８８ｇのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、２．２０ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１８．６５ｇのＫＣｌを溶解後、０．５ＭＰＩＰＥＳ（２０ｍＬ）を添加し、ミリＱ水で１０００ｍＬにメスアップした。その後、０．４５μｍフィルターで濾過滅菌し、－２０℃で保存した。
まず以下の手順で、０．５ＭＰＩＰＥＳ（ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ－１，２－ｂｉｓ［２－ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ］）を準備した。ＰＩＰＥＳ（１５．１ｇ）をミリＱ水（８０ｍＬ）に溶解し、５ＮＫＯＨを用いてｐＨを６．７に調整後、ミリＱ水で１００ｍＬにメスアップした。その後、０．４５μｍフィルターで濾過滅菌し、－２０℃で保存した。次に、以下の試薬をミリＱ水（８００ｍＬ）に溶解して、Ｉｎｏｕｅトランスフォーメーションバッファーを調製した。１０．８８ｇのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、２．２０ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１８．６５ｇのＫＣｌを溶解後、０．５ＭＰＩＰＥＳ（２０ｍＬ）を添加し、ミリＱ水で１０００ｍＬにメスアップした。その後、０．４５μｍフィルターで濾過滅菌し、－２０℃で保存した。
【0057】
［使用機器］
本実施形態において使用した機器は以下の通りである。
インキュベーター
ＢＲ－４３ＦＨ（タイテック）：振とう培養（５５℃、１８０ｒｐｍ）
ＴＶＡ６６０ＤＡ（アドバンテック）：静置培養（５５℃）
ＩＳ－６１（ヤマト科学）：静置培養（３７℃）
遠心分離機 ＭＸ３００（トミー精工） Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ５４１０（エッペンドルフ）
吸光光度計 Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ ３３００ｐｒｏ（アマシャムバイオサイエンス）：菌体濃度測定
ＤＮＡ、ＲＮＡ濃度測定 ＵＶ－１６００（島津製作所）：酵素活性測定
ｐＨメーター Ｆ－２１（堀場製作所）：電極はＣＭ０５７－ＢＮＣ（ＣＥＭＣＯ）を使用
ＰＣＲ装置 ＰＣ８０８（アステック） ＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ２４００（パーキンエルマー）
ブロックインキュベーター ＢＩ－５２５Ａ （アステック）
超音波破砕機 Ｄｉｇｉｔａｌ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ（ブランソン）
ｑＲＴ－ＰＣＲ Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ １．５（ロシュ・ダイアグノスティックス）
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）装置（詳細は後に説明する。）
ガスクロマトグラフィー（ＧＣ－ＭＳ）装置（詳細は後に説明する。）。
本実施形態において使用した機器は以下の通りである。
インキュベーター
ＢＲ－４３ＦＨ（タイテック）：振とう培養（５５℃、１８０ｒｐｍ）
ＴＶＡ６６０ＤＡ（アドバンテック）：静置培養（５５℃）
ＩＳ－６１（ヤマト科学）：静置培養（３７℃）
遠心分離機 ＭＸ３００（トミー精工） Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ５４１０（エッペンドルフ）
吸光光度計 Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ ３３００ｐｒｏ（アマシャムバイオサイエンス）：菌体濃度測定
ＤＮＡ、ＲＮＡ濃度測定 ＵＶ－１６００（島津製作所）：酵素活性測定
ｐＨメーター Ｆ－２１（堀場製作所）：電極はＣＭ０５７－ＢＮＣ（ＣＥＭＣＯ）を使用
ＰＣＲ装置 ＰＣ８０８（アステック） ＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ２４００（パーキンエルマー）
ブロックインキュベーター ＢＩ－５２５Ａ （アステック）
超音波破砕機 Ｄｉｇｉｔａｌ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ（ブランソン）
ｑＲＴ－ＰＣＲ Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ １．５（ロシュ・ダイアグノスティックス）
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）装置（詳細は後に説明する。）
ガスクロマトグラフィー（ＧＣ－ＭＳ）装置（詳細は後に説明する。）。
【0058】
ＨＰＬＣのシステムは、以下の通りである。
ＰＵ－２０８０ Ｐｌｕｓ（ＨＰＬＣポンプ）、ＲＩ－２０３１ Ｐｌｕｓ（ＲＩディテクター）、ＣＯ－２０６５ Ｐｌｕｓ（カラムオーブン）、ＡＳ－２０５７ Ｐｌｕｓ（オートサンプラー）を用いた（いずれもＪＡＳＣＯ）。移動相は０．１％（ｖ／ｖ）Ｈ３ＰＯ４を用い、０．７ｍＬ／分の流速で流した。分離カラムには、ＲＳｐａｋＫＣ－８１１（Ｓｈｏｄｅｘ）を用いた。また、ガードカラムとして、ＲＳｐａｋ ＫＣ－Ｇ（Ｓｈｏｄｅｘ）を分離カラムの前に設置した。カラムオーブンの温度は、６０℃に設定した。測定時にはサンプルの上清に、内部標準として１００ｍＭのクロトン酸を含む０．２％（ｖ／ｖ）Ｈ３ＰＯ４を１：１で混合し、酢酸セルロース親水性フィルター０．２０μｍ（Ｄｉｓｍｉｃ（登録商標）－１３ＣＰ）で濾過してから測定を行った。オートサンプラーのインジェクションボリュームは１０μＬとした。
ＰＵ－２０８０ Ｐｌｕｓ（ＨＰＬＣポンプ）、ＲＩ－２０３１ Ｐｌｕｓ（ＲＩディテクター）、ＣＯ－２０６５ Ｐｌｕｓ（カラムオーブン）、ＡＳ－２０５７ Ｐｌｕｓ（オートサンプラー）を用いた（いずれもＪＡＳＣＯ）。移動相は０．１％（ｖ／ｖ）Ｈ３ＰＯ４を用い、０．７ｍＬ／分の流速で流した。分離カラムには、ＲＳｐａｋＫＣ－８１１（Ｓｈｏｄｅｘ）を用いた。また、ガードカラムとして、ＲＳｐａｋ ＫＣ－Ｇ（Ｓｈｏｄｅｘ）を分離カラムの前に設置した。カラムオーブンの温度は、６０℃に設定した。測定時にはサンプルの上清に、内部標準として１００ｍＭのクロトン酸を含む０．２％（ｖ／ｖ）Ｈ３ＰＯ４を１：１で混合し、酢酸セルロース親水性フィルター０．２０μｍ（Ｄｉｓｍｉｃ（登録商標）－１３ＣＰ）で濾過してから測定を行った。オートサンプラーのインジェクションボリュームは１０μＬとした。
【0059】
ＧＣ－ＭＳのシステムは、Ａｇｉｌｅｎｔ ７０００ ＧＣ／ＭＳ Ｔｒｉｐｌｅ Ｑｕａｄ（Ａｇｉｌｅｎｔ社）を用いた。移動相はヘリウムを用い、０．７ｍｌ／ｍｉｎの流速で流した。分離カラムには、Ｊ＆Ｗ ＧＣ ｃｏｌｕｍｎｓ ＤＢ－ＷＡＸ （Ａｇｉｌｅｎｔ社）を用いた。分析は４０℃で４分間保持した後、５℃／ｍｉｎで１００℃まで加熱、さらに１０℃／ｍｉｎで２００℃まで加熱後、１０分間保持することにより行った。注入口温度は２５０℃とした。
【0060】
［組換え細菌（モーレラ・サーモアセチカ）の作製］
（大腸菌の培養）
大腸菌をＬＢ培地、２×ＹＴ培地及びＳＯＢ培地を使用し、３７℃で培養した。カナマイシン耐性株のスクリーニングはカナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含むプレートを、クロラムフェニコール耐性株のスクリーニングにはクロラムフェニコール（１０μｇ／ｍＬ）を含むプレートを使用した。
（大腸菌の培養）
大腸菌をＬＢ培地、２×ＹＴ培地及びＳＯＢ培地を使用し、３７℃で培養した。カナマイシン耐性株のスクリーニングはカナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含むプレートを、クロラムフェニコール耐性株のスクリーニングにはクロラムフェニコール（１０μｇ／ｍＬ）を含むプレートを使用した。
【0061】
（大腸菌コンピテントセルの作製）
ヒートショックによる形質転換に用いるコンピテントセルの作製は、井上法（Inoue et al., 1990, Gene 96: 23-28）を参考に、以下の手順で行った。まず、大腸菌を寒天入りＬＢ培地に塗布し、３７℃で１晩培養した。得られたシングルコロニーを２×ＹＴ（５ｍＬ）に植菌し、６～８時間振とう培養（３７℃、２８０ｒｐｍ）した。さらに、得られた培養液（２ｍＬ）をＳＯＢ培地（１００ｍＬ）に植菌し、ＯＤ６００＝０．５５程度になるまで振とう培養（１８℃、１２０ｒｐｍ）した。得られた培養液を５０ｍｌずつ分注し、１０分間氷上静置した。１０分後、遠心分離（２５００×ｇ、４℃）し、上清を取り除いた後、氷冷した Ｉｎｏｕｅトランスフォーメーションバッファー（１６ｍＬ）で菌体ペレットをタッピングにより静かに懸濁した。懸濁後、氷上で１０分間静置し、遠心分離（２５００×ｇ、４℃）した。遠心分離後、上清を取り除き、氷冷したＩｎｏｕｅトランスフォーメーションバッファー（４ｍＬ）で菌体ペレットをタッピングにより静かに懸濁した。ＤＭＳＯ（ジメチルスルホオキシド）（３００μＬ）を添加し、混合した後、適当量分注し、液体窒素により急速冷凍した。作製したコンピテントセルは－８０℃で保存した。エレクトロポレーションによる形質転換に用いるコンピテントセルの作製は、上記と同様に培養した菌体を滅菌水にて２回洗浄後、菌体量と同量の１０％グリセロールに懸濁し行った。作製したコンピテントセルは－８０℃で保存した。
ヒートショックによる形質転換に用いるコンピテントセルの作製は、井上法（Inoue et al., 1990, Gene 96: 23-28）を参考に、以下の手順で行った。まず、大腸菌を寒天入りＬＢ培地に塗布し、３７℃で１晩培養した。得られたシングルコロニーを２×ＹＴ（５ｍＬ）に植菌し、６～８時間振とう培養（３７℃、２８０ｒｐｍ）した。さらに、得られた培養液（２ｍＬ）をＳＯＢ培地（１００ｍＬ）に植菌し、ＯＤ６００＝０．５５程度になるまで振とう培養（１８℃、１２０ｒｐｍ）した。得られた培養液を５０ｍｌずつ分注し、１０分間氷上静置した。１０分後、遠心分離（２５００×ｇ、４℃）し、上清を取り除いた後、氷冷した Ｉｎｏｕｅトランスフォーメーションバッファー（１６ｍＬ）で菌体ペレットをタッピングにより静かに懸濁した。懸濁後、氷上で１０分間静置し、遠心分離（２５００×ｇ、４℃）した。遠心分離後、上清を取り除き、氷冷したＩｎｏｕｅトランスフォーメーションバッファー（４ｍＬ）で菌体ペレットをタッピングにより静かに懸濁した。ＤＭＳＯ（ジメチルスルホオキシド）（３００μＬ）を添加し、混合した後、適当量分注し、液体窒素により急速冷凍した。作製したコンピテントセルは－８０℃で保存した。エレクトロポレーションによる形質転換に用いるコンピテントセルの作製は、上記と同様に培養した菌体を滅菌水にて２回洗浄後、菌体量と同量の１０％グリセロールに懸濁し行った。作製したコンピテントセルは－８０℃で保存した。
【0062】
（プラスミドの構築）
モーレラ・サーモアセチカ細菌の内在性ホスホアセチルトランスフェラーゼ発現遺伝子（ＰｄｕＬ２）の破壊、及び外来のアセトン合成遺伝子（チオラーゼ、ＣｏＡトランスフェラーゼ、及びアセト酢酸デカルボキシラーゼの発現遺伝子）導入用のプラスミドｐＫ１８－ΔｐｄｕＬ２：：ａｃｅｔｏｎｅは以下の手順で構築した。プライマーセットＪＫ５０、ＪＫ５１を用いてＧ３ＰＤプロモーターとそれに続く４つのアセトン合成遺伝子群をＫＯＤ ｐｌｕｓ ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）を用いてＰＣＲ法により増幅した。ここで、４つのアセトン合成遺伝子群としては、Caldanaerobacter subterraneus subsp. tengcongensis由来のチオラーゼ（ｔｈｌ、遺伝子番号ＴＴＥ０５４９：配列番号７）、Thermosipho melanesiensis由来のＣｏＡトランスフェラーゼ（ｃｔｆＡ及びｃｔｆＢにコードされる２つのタンパク質による複合体ｃｔｆＡＢ、遺伝子番号Ｔｍｅｌ＿１１３５：配列番号８及びＴｍｅｌ＿１１３６：配列番号９）、Clostridium acetobutylicum由来のアセト酢酸デカルボキシラーゼ（ａｄｃ、遺伝子番号ＣＡ＿Ｐ０１６５：配列番号１０）を用いた。プロトコルは添付のマニュアルに従った。鋳型となるＤＮＡは人工遺伝子合成（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）により用意し、それぞれの遺伝子の配列はモーレラ・サーモアセチカ細菌での発現に最適となるようコドン最適化を行ったものを用いた（ｔｈｌ：配列番号１１、ｃｔｆＡ：配列番号１２、ｃｔｆＢ：配列番号１３、ａｄｃ：配列番号１４）。同様に、プライマーセットＪＫ５２、ＪＫ５３を用いてｐｄｕＬ２の上流と下流それぞれ約１ｋｂｐ、及びウラシル選択制のマーカーであるｐｙｒＦマーカーがｐＫ１８ｍｏｂベクターにつながれた配列を同様にＰＣＲ法により増幅した。鋳型としてはｐＫ１８－ΔｐｄｕＬ２：：ｌｄｈ（Iwasaki et al.,2017, Appl.Environ. Microbiol. 83(8) e00247-17）を用いた。これら２つのＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いてつなげ、大腸菌ＨＳＴ０８株を形質転換することでクローニングした。得られたＤＮＡコンストラクト（図１（ａ）のｐｄｕＬ２：：ａｃｅｔｏｎｅ導入用プラスミドを参照）はサンガーシーケンスによりＰＣＲエラーなどがないことを確認した。参考として、得られたプラスミドにおけるｐｄｕＬ２上流からｐｄｕＬ２下流までの配列は、配列表に配列番号１５として示す。
モーレラ・サーモアセチカ細菌の内在性ホスホアセチルトランスフェラーゼ発現遺伝子（ＰｄｕＬ２）の破壊、及び外来のアセトン合成遺伝子（チオラーゼ、ＣｏＡトランスフェラーゼ、及びアセト酢酸デカルボキシラーゼの発現遺伝子）導入用のプラスミドｐＫ１８－ΔｐｄｕＬ２：：ａｃｅｔｏｎｅは以下の手順で構築した。プライマーセットＪＫ５０、ＪＫ５１を用いてＧ３ＰＤプロモーターとそれに続く４つのアセトン合成遺伝子群をＫＯＤ ｐｌｕｓ ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）を用いてＰＣＲ法により増幅した。ここで、４つのアセトン合成遺伝子群としては、Caldanaerobacter subterraneus subsp. tengcongensis由来のチオラーゼ（ｔｈｌ、遺伝子番号ＴＴＥ０５４９：配列番号７）、Thermosipho melanesiensis由来のＣｏＡトランスフェラーゼ（ｃｔｆＡ及びｃｔｆＢにコードされる２つのタンパク質による複合体ｃｔｆＡＢ、遺伝子番号Ｔｍｅｌ＿１１３５：配列番号８及びＴｍｅｌ＿１１３６：配列番号９）、Clostridium acetobutylicum由来のアセト酢酸デカルボキシラーゼ（ａｄｃ、遺伝子番号ＣＡ＿Ｐ０１６５：配列番号１０）を用いた。プロトコルは添付のマニュアルに従った。鋳型となるＤＮＡは人工遺伝子合成（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）により用意し、それぞれの遺伝子の配列はモーレラ・サーモアセチカ細菌での発現に最適となるようコドン最適化を行ったものを用いた（ｔｈｌ：配列番号１１、ｃｔｆＡ：配列番号１２、ｃｔｆＢ：配列番号１３、ａｄｃ：配列番号１４）。同様に、プライマーセットＪＫ５２、ＪＫ５３を用いてｐｄｕＬ２の上流と下流それぞれ約１ｋｂｐ、及びウラシル選択制のマーカーであるｐｙｒＦマーカーがｐＫ１８ｍｏｂベクターにつながれた配列を同様にＰＣＲ法により増幅した。鋳型としてはｐＫ１８－ΔｐｄｕＬ２：：ｌｄｈ（Iwasaki et al.,2017, Appl.Environ. Microbiol. 83(8) e00247-17）を用いた。これら２つのＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いてつなげ、大腸菌ＨＳＴ０８株を形質転換することでクローニングした。得られたＤＮＡコンストラクト（図１（ａ）のｐｄｕＬ２：：ａｃｅｔｏｎｅ導入用プラスミドを参照）はサンガーシーケンスによりＰＣＲエラーなどがないことを確認した。参考として、得られたプラスミドにおけるｐｄｕＬ２上流からｐｄｕＬ２下流までの配列は、配列表に配列番号１５として示す。
【0063】
（モーレラ・サーモアセチカへのアセトン合成遺伝子群導入）
Kita et al.,2013, J. Biosci.Bioeng. 115(4):347-352にて確立された方法に従いモーレラサーモアセチカ（ＡＴＣ３９０７３株）の形質転換を行った。構築したプラスミドｐＫ１８－ΔｐｄｕＬ２：：ａｃｅｔｏｎｅは、モーレラサーモアセチカ（ＡＴＣ３９０７３株）のＤＮＡメチラーゼ遺伝子を導入したプラスミドｐＢＡＤ１２８１とともに大腸菌Ｔｏｐ１０株にエレクトロポレーション法により導入した。この大腸菌よりＤＮＡを調整することでモーレラ・サーモアセチカ（ＡＴＣ３９０７３株）型にメチル化されたＤＮＡを取得した。モーレラサーモアセチカ（ＡＴＣ３９０７３株）の形質転換法は、以下の点を改変した。ウラシル要求性をマーカーとして用いるため、菌株はΔｐｙｒＦ株を用いた。菌体は、上述の基本培地に糖源として終濃度１１ｍＭフルクトースを添加し、４７℃～５５℃で培養、吸光度ＯＤ６００の値が０．３～１．１程度となった培養から用意した。添加したＤＮＡ量は１０～３０μｇとした。形質転換により得られたクローンはＰＣＲ法によってｐｄｕＬ２領域のＤＮＡを増幅し、遺伝子導入により相当の大きさにサイズが変化したことにより確認した（図１（ａ）及び（ｂ）を参照）。図１（ｂ）に示すように、野生型（ここではΔｐｙｒＦ株）では増幅サイズが９６０ｂｐだが、遺伝子群の導入により４８５４ｂｐにサイズが増大することが示された。
Kita et al.,2013, J. Biosci.Bioeng. 115(4):347-352にて確立された方法に従いモーレラサーモアセチカ（ＡＴＣ３９０７３株）の形質転換を行った。構築したプラスミドｐＫ１８－ΔｐｄｕＬ２：：ａｃｅｔｏｎｅは、モーレラサーモアセチカ（ＡＴＣ３９０７３株）のＤＮＡメチラーゼ遺伝子を導入したプラスミドｐＢＡＤ１２８１とともに大腸菌Ｔｏｐ１０株にエレクトロポレーション法により導入した。この大腸菌よりＤＮＡを調整することでモーレラ・サーモアセチカ（ＡＴＣ３９０７３株）型にメチル化されたＤＮＡを取得した。モーレラサーモアセチカ（ＡＴＣ３９０７３株）の形質転換法は、以下の点を改変した。ウラシル要求性をマーカーとして用いるため、菌株はΔｐｙｒＦ株を用いた。菌体は、上述の基本培地に糖源として終濃度１１ｍＭフルクトースを添加し、４７℃～５５℃で培養、吸光度ＯＤ６００の値が０．３～１．１程度となった培養から用意した。添加したＤＮＡ量は１０～３０μｇとした。形質転換により得られたクローンはＰＣＲ法によってｐｄｕＬ２領域のＤＮＡを増幅し、遺伝子導入により相当の大きさにサイズが変化したことにより確認した（図１（ａ）及び（ｂ）を参照）。図１（ｂ）に示すように、野生型（ここではΔｐｙｒＦ株）では増幅サイズが９６０ｂｐだが、遺伝子群の導入により４８５４ｂｐにサイズが増大することが示された。
【0064】
以上のようにして、モーレラ・サーモアセチカを親株とし、内在性ＰｄｕＬ２が欠損し、ｔｈｌ、ｃｔｆＡＢ及びａｄｃを発現する組換え株（ｐｄｕＬ２：：ａｃｅｔｏｎｅ）を得た。なお、この株は受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０３２１７として寄託されている。
【0065】
［組換え株のアセトン生成能の評価］
上記のようにして得られた組換え株（ｐｄｕＬ２：：ａｃｅｔｏｎｅ）のアセトン生成能を以下の通りに評価した。
上記のようにして得られた組換え株（ｐｄｕＬ２：：ａｃｅｔｏｎｅ）のアセトン生成能を以下の通りに評価した。
【0066】
まず、モーレラ属が資化する糖の１種であるフルクトースを基質として、組換え株（ｐｄｕＬ２：：ａｃｅｔｏｎｅ）と、コントロールとして内在性ＰｄｕＬ２の遺伝子座に、相同組換えにより外来のアセトン合成遺伝子の代わりに乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子ｌｄｈが導入されたｐｄｕＬ２：：ｌｄｈ株とを培養した。用いた培地は上述の基本培地であり、フルクトース濃度は２．０ｇ／Ｌとし、培養温度は５５℃とした。７２時間の培養後にその培養上清を回収し、それぞれ培養上清及び市販のアセトン標品をＨＰＬＣにより解析し、それらの結果を比較した。図２に示すように、ｐｄｕＬ２：：ａｃｅｔｏｎｅ株の培養上清において、標品のアセトンと同じ保持時間に検出されるピークを確認した。このピークはｐｄｕＬ２：：ｌｄｈ株では検出されないため、ｐｄｕＬ２：：ａｃｅｔｏｎｅ株に特異的なピークであり、ｐｄｕＬ２：：ａｃｅｔｏｎｅ株のアセトン生成を示すものである。
【0067】
さらに、これらの培養上清について、ＧＣ－ＭＳによる解析も行った。その結果、図３に示すように、アセトンを示す質量電荷比５８のピークが、アセトン標品とｐｄｕＬ２：：ａｃｅｔｏｎｅ株の培養上清で同じ保持時間に検出された。なお、ｐｄｕＬ２：：ｌｄｈ株ではピークは検出されなかった。これらのピークについてＭＳ／ＭＳ解析を行うとアセトンに特徴的な質量電荷比５８、４３のピークが検出された。これらの結果から本発明で構築したｐｄｕＬ２：：ａｃｅｔｏｎｅ株はアセトンを生成しているといえる。
【0068】
次に、ｐｄｕＬ２：：ａｃｅｔｏｎｅ株について、炭素源としてフルクトースを加えた培養の菌体増殖、及び生産物の生成量の測定を経時的に行った。培養条件は上記ＨＰＬＣ及びＧＣ－ＭＳ試験での培養条件と同様の条件とした。菌体増殖は吸光光度計による菌体濁度ＯＤ６００をもとに菌体重量を算出して評価した。具体的に、ＯＤ６００と乾燥菌体重量（ｄｒｙ ｃｅｌｌ ｗｅｉｇｈｔ）は正比例の関係にあり、ＯＤ６００＝１．０のとき０．３８３ｇ／Ｌである（Iwasaki et al.,2017, Appl.Environ. Microbiol. 83(8) e00247-17）ため、関係式に基づき、測定したＯＤより乾燥菌体重量を算出した。一方、生産物の測定はＨＰＬＣにより糖及び生産物濃度を経時的に測定した。その結果、図４（ａ）に示すように、ｐｄｕＬ２：：ａｃｅｔｏｎｅ株の菌体重量は２４時間まで増加を続け、その後、緩やかに低減した。これは、基質であるフルクトースを全て消費したためと考えられる。また、図４（ｂ）に示すように、培養開始から約２０時間後にｐｄｕＬ２：：ａｃｅｔｏｎｅ株は１３．３ｍＭのフルクトースを完全に消費し、アセトン１９．６ｍＭを生産した。副生物の酢酸は４．７ｍＭ生産された。以上の結果から、ｐｄｕＬ２：：ａｃｅｔｏｎｅ株は、糖を基質としてアセトンを生成でき、また、副生物として酢酸を生成することが示された。
【0069】
次に、ｐｄｕＬ２：：ａｃｅｔｏｎｅ株について、ＣＯ、Ｈ２、ＣＯ２から構成される合成ガスの存在下での菌体増殖、並びにアセトン、酢酸及びギ酸の生成量を経時的に測定した。測定方法は、上記試験と同様に、菌体増殖は菌体濁度ＯＤ６００をもとに菌体重量を算出して評価し、生産物の測定はＨＰＬＣにより生産物濃度を経時的に測定した。まず、ヘッドスペースに注入したＨ２とＣＯとの比が１：１（それぞれ０．４気圧）、ＣＯ２が培地中の炭酸水素ナトリウム（２．０ｇ／Ｌ）から供給される系で培養すると、ｐｄｕＬ２：：ａｃｅｔｏｎｅ株は、図５（ａ）に示すように、菌体重量は６０時間まで増加を続け、その後、緩やかに低減した。また、この系においてｐｄｕＬ２：：ａｃｅｔｏｎｅ株は、図５（ｂ）に示すように、５．２ｍＭのアセトンを生産し、７．０ｍＭの酢酸を生産した。エネルギー源となるＨ２を添加しない条件でも同様に測定を行ったところ、図５（ｃ）に示すように、水素添加時と同様に菌は増殖したが、図５（ｄ）に示すように物質生産は低下し、最終生産量はアセトン１．８ｍＭ、副生物の酢酸は４．２ｍＭであった。また、ＣＯを添加しない条件でも測定を行い、ヘッドスペースにＣＯ２＋Ｈ２ガスを比１：４で合計２気圧注入し測定を行った。図５（ｅ）に示すように、この場合の菌体増殖はわずかであり、図５（ｆ）に示すように、アセトンの生産は１．８ｍＭ、酢酸は３．３ｍＭ生産した。この場合、ギ酸（ｆｏｒｍａｔｅ）も生産物として蓄積したことから、ＡＴＰが不足したために固定したＣＯ２の代謝が途中からギ酸で停止したこと、及びＡＴＰ不足が増殖が少なかった原因であることが考えられた。
【0070】
そこで、次に、ＣＯ２＋Ｈ２に加えて少量のフルクトースを添加し、ＡＴＰ生成を補い経時的に生産物を定量した。比較はＣＯ２＋Ｈ２培養にフルクトース４ｍＭを添加した場合と、フルクトース４ｍＭのみの場合で行った。ＣＯ２＋Ｈ２培養にフルクトース４ｍＭを添加した場合では、図６（ａ）に示すように、菌体重量は２４時間まで増加を続け、その後、緩やかに低減した。また、この系においてｐｄｕＬ２：：ａｃｅｔｏｎｅ株は、図６（ｂ）に示すように、フルクトースを完全に消費し、アセトンの最終濃度は５．８ｍＭ、酢酸は５．３ｍＭであった。一方、フルクトースのみで培養を行った場合、図６（ｃ）に示すように、菌体増殖はＣＯ２＋Ｈ２培養にフルクトース４ｍＭを添加した場合と同様の結果であったが、図６（ｄ）に示すように、アセトン４．０ｍＭ、酢酸４．５ｍＭであった。この場合も、フルクトースは完全に消費した。最終生産物量を比較するとＣＯ２＋Ｈ２を添加した場合は明らかに酢酸およびアセトンの生産量が増加していた。この生産物量増加はＣＯ２を資化して酢酸およびアセトンを合成したものに由来し、ＡＴＰ生成が担保されれば副生物は酢酸のみでギ酸の蓄積はおこらないことが示された。
【0071】
以上から、本発明に係る組換え細菌によると、糖やＣＯ等の炭素源からアセトンを高い効率で生成できることが示された。また、糖やＨ２の存在下ではＡＴＰ生成が担保されて、より高い効率でアセトンを生成できて好ましいといえる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【配列表】