特許 7535265 微生物分解細菌、微生物製剤、微生物の分解方法及び分解装置

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-08-07

(45)【発行日】2024-08-16

(54)【発明の名称】微生物分解細菌、微生物製剤、微生物の分解方法及び分解装置

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/20 20060101AFI20240808BHJP

   C02F 11/02 20060101ALI20240808BHJP

   C12N 15/11 20060101ALN20240808BHJP

【ＦＩ】

C12N1/20 A ZNA

C02F11/02

C12N1/20 D

C12N1/20 F

C12N15/11 Z

【請求項の数】 3

(21)【出願番号】P 2020549508

(86)(22)【出願日】2019-09-27

(86)【国際出願番号】 JP2019038437

(87)【国際公開番号】W WO2020067555

(87)【国際公開日】2020-04-02

【審査請求日】2022-09-06

(31)【優先権主張番号】P 2018185192

(32)【優先日】2018-09-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

【微生物の受託番号】NPMD  NITE BP-02779

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】000002093

【氏名又は名称】住友化学株式会社

(73)【特許権者】

【識別番号】518347532

【氏名又は名称】株式会社片岡バイオ研究所

(74)【代理人】

【識別番号】110001195

【氏名又は名称】弁理士法人深見特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】満井 智和

【審査官】長谷川 強

(56)【参考文献】

【文献】特開２００３－０６２５９９（ＪＰ，Ａ）

【文献】韓国公開特許第１０－２０１３－００５６５８５（ＫＲ，Ａ）

【文献】Database GenBank [online], Accession No. KF441681, 2014-07-17 uploaded, [retrieved on 2023-07-10], <https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/542215135?sat=4&satkey=116434385>,Tumebacillus sp. 7B-408 16S ribosomal RNA gene, partial sequence.

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １／２０

Ｃ０２Ｆ １１／０２

Ｃ１２Ｎ １５／１１

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２７７９として寄託された細菌。

【請求項2】

細菌（ａ１）を含む、余剰汚泥を分解するための微生物製剤であって、
前記細菌（ａ１）は、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２７７９として寄託された細菌である、余剰汚泥を分解するための微生物製剤。

【請求項3】

請求項１に記載の細菌又は請求項２に記載の余剰汚泥を分解するための微生物製剤を、余剰汚泥に作用させる工程を含む、余剰汚泥の分解方法であって、
前記余剰汚泥は、活性汚泥法によって生じた汚泥であり、
前記余剰汚泥は、グラム陰性菌又はグラム陽性菌を含む、余剰汚泥の分解方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、微生物分解能を有する細菌に関する。

【背景技術】

【0002】

活性汚泥法により汚水浄化を行うと、除去した有機物が微生物を含んだフロックとなり、余剰汚泥と呼ばれる汚泥が発生する。廃水処理設備から排出される余剰汚泥は産業廃棄物の中で２０％もの割合を占めるため、産業廃棄物を減容化するには、この余剰汚泥の減容化が効果的と考えられる。一般的に余剰汚泥は、脱水、乾燥後、焼却処理される（非特許文献１：平成２７年度事業、産業廃棄物排出・処理状況調査報告書、平成２５年度実績（概要版）、非特許文献２：山本昌幸、「下水の燃焼技術について」、日本燃料学会誌、一般社団法人日本燃焼学会、２０１１、第５３巻、１６４号、ｐ９１－９６）。

【0003】

しかしながら、余剰汚泥を焼却処理すると温室効果ガスが発生するため、必ずしも環境に与える影響が少ない処理方法ではなかった。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0004】

【文献】「平成２７年度事業、産業廃棄物排出・処理状況調査報告書、平成２５年度実績（概要版）」［online］、平成２８年３月、環境省大臣官房廃棄物・リサイクル対策部、[平成３０年８月３１日検索]、インターネット＜URL:https://www.e-stat.go.jp/stat-search/file-download?statInfId=000031403476&fileKind=2＞

【文献】山本昌幸、「下水の燃焼技術について」、日本燃料学会誌、一般社団法人日本燃焼学会、２０１１、第５３巻、１６４号、ｐ９１－９６

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

近年、地球環境に対する意識が社会全体で高まってきており、環境に与える影響がより少ない余剰汚泥の減容化方法、即ち、余剰汚泥を構成する微生物の分解方法が求められていた。

【0006】

本発明は、微生物を分解しうる細菌、微生物製剤、微生物の分解方法及び分解装置を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0007】

すなわち、本発明は、以下に例示する［１］～［１７］に関する。
［１］配列番号１に記載の塩基配列と９８．２％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有し、且つ、標的微生物分解能を有する細菌（以下、「本発明に係る細菌」と記すことがある）。
［２］配列番号１に記載の塩基配列と９８．５％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有する、［１］に記載の細菌。
［３］配列番号１に記載の塩基配列と９９．０％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有する、［１］に記載の細菌。
［４］配列番号１に記載の塩基配列と９９．５％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有する、［１］に記載の細菌。
［５］配列番号１に記載の塩基配列を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有する、［１］に記載の細菌。
［６］標的微生物が標的細菌である、［１］～［５］のいずれかに記載の細菌。
［７］標的微生物が標的死細菌である、［１］～［６］のいずれかに記載の細菌。
［８］受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２７７９として寄託された細菌。
［９］細菌（ａ１）を含む、標的微生物分解用微生物製剤（以下、「本発明に係る微生物製剤」と記すことがある。）。
（ａ１）：配列番号１に記載の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有し、且つ、標的微生物分解能を有する細菌
［１０］細菌（ａ１）は、配列番号１に記載の塩基配列と９２％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有する、［９］に記載の標的微生物分解用微生物製剤。
［１１］細菌（ａ１）は、配列番号１に記載の塩基配列と９５％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有する、［９］に記載の標的微生物分解用微生物製剤。
［１２］細菌（ａ１）は、配列番号１に記載の塩基配列を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有する、［９］に記載の標的微生物分解用微生物製剤。
［１３］細菌（ａ１）は、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２７７９として寄託された細菌である、［９］に記載の標的微生物分解用微生物製剤。
［１４］細菌（ａ２）をさらに含み、細菌（ａ１）及び細菌（ａ２）の総数に対する細菌（ａ１）数は０．１％以上１００％以下である、［９］～［１３］のいずれかに記載の標的微生物分解用微生物製剤。
細菌（ａ２）：細菌（ａ１）と異なる細菌
［１５］細菌（ａ１）の培養物を含む、標的微生物分解用微生物製剤。
（ａ１）：配列番号１に記載の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有し、且つ、標的微生物分解能を有する細菌
［１６］［１］～［８］のいずれかに記載の細菌又は［９］～［１５］のいずれかに記載の標的微生物分解用微生物製剤を標的微生物に作用させる工程を含む、標的微生物の分解方法（以下、「本発明に係る分解方法」と記すことがある。）。
［１７］［１］～［８］のいずれかに記載の細菌又は［９］～［１５］のいずれかに記載の標的微生物分解用微生物製剤を用いた、標的微生物の分解装置（以下、「本発明に係る分解装置」と記すことがある。）。

【発明の効果】

【0008】

本発明によれば、微生物を分解しうる細菌、微生物製剤、微生物の分解方法及び分解装置を提供可能となる。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】実験７においてＴｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．（ＮＩＴＥ ＢＰ－０２７７９）添加後の余剰汚泥の乾燥重量を示した図である。

【発明を実施するための形態】

【0010】

以下、本発明を実施するための形態（以下、「本実施形態」という。）について詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施形態に限定されるものではない。

【0011】

（共通する用語の説明）
本明細書において、「微生物」とは肉眼では構造が判別できないような微小な生物であり、大型多細胞生物を除く生物である。「標的微生物」とは、本発明に係る細菌又は微生物製剤により分解される微生物である。このような微生物としては細菌、真菌等が挙げられ、中でも細菌が好ましく、余剰汚泥を構成する細菌がより好ましい。標的微生物は、生菌であっても死菌であってもよい。

【0012】

「標的細菌」とは、標的微生物となる細菌を指し、生菌であってもよく、死菌であってもよく、生菌及び死菌を含んでもよい。生菌とは生きている細菌、例えば代謝が行われている細菌を指す。「標的死細菌」とは、標的細菌のうち死んでいる細菌、例えば代謝が行われていない細菌を指す。生菌と死菌とは、例えばｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）等の色素を用いて判別することができる。標的細菌は、細菌による分解効率の観点からは死菌であることが好ましい。余剰汚泥中の微生物の約５０％は死細菌である。標的死細菌は、例えば標的細菌に対して加熱、高圧蒸気滅菌、紫外線照射、ホルマリン処理、酸処理などを行うことにより得ることもできる。また、標的死細菌は粉砕されたものでもよい。

【0013】

標的微生物として、例えばミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、バチラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、パエニバチラス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、ラクトバチラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌などのグラム陽性菌、エスケリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属細菌などのグラム陰性菌が挙げられる。

【0014】

本明細書において、「標的微生物分解能」とは、標的微生物を代謝して、標的微生物を構成する生体分子の一部又は全部を、異なる分子に変換する能力を指す。生体分子としては、例えば糖、タンパク質、核酸、脂質等が挙げられる。

【0015】

（本発明に係る細菌）
本発明に係る細菌は、配列番号１に記載の塩基配列と９８．２％以上の同一性又は相同性を有する塩基配列を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有し、且つ、標的微生物分解能を有する。本発明において、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子は、細菌が本来有している内在性の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子であることが好ましい。人工的に変異が誘発された１６Ｓ ｒＲＮＡであってもよい。配列番号１に記載の塩基配列と９８．２％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有する細菌として、チューメバチルス（Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌が挙げられる。

【0016】

本発明に係る細菌の一実施形態としては、配列番号１に記載の塩基配列を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有し、且つ、標的微生物分解能を有する細菌が挙げられる。

【0017】

配列番号１に記載の塩基配列を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有する細菌の代表的な菌株としては、Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．（受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２７７９、原寄託日：２０１８年９月１１日）として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ、住所：〒２９２－０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ １２２号室）にブダペスト条約に基づいて寄託されている菌株を挙げることができる。該菌株の菌学的性質については、後述する表１～４に示す。

【0018】

本発明に係る細菌は、配列番号１に記載の塩基配列と比較し、同一性又は相同性が９８．５％以上の塩基配列を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有していてもよく、９８．８％以上の塩基配列を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有していてもよく、９９．０％以上の塩基配列を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有していてもよく、９９．３％以上の塩基配列を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有していてもよく、９９．５％以上の塩基配列を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有していてもよく、９９．８％以上の塩基配列を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有していてもよい。本発明に係る細菌は、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２７７９として寄託された細菌であってもよい。

【0019】

また、本発明に係る細菌は、配列番号１に記載の塩基配列と比較し、１塩基又は数塩基の置換、欠失又は付加が起こった塩基配列を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有していてもよい。１塩基又は数塩基とは、例えば１～２５塩基、好ましくは１～１０塩基、より好ましくは１～５塩基とすることができる。上記の変異は、１６Ｓ ｒＲＮＡの発現及び機能が失われない変異である。

【0020】

本発明に係る細菌は、配列番号１に記載の塩基配列に含まれる、約１５塩基以上、好ましくは約１８～約５００塩基、より好ましくは約１８～約２００塩基、さらに好ましくは約１８～約５０塩基の連続した配列又はその相補配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有していてもよい。ストリンジェントな条件とは、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、例えば６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、好ましくは６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ中で１回以上洗浄する条件等が挙げられる。

【0021】

本発明に係る細菌の標的微生物分解能は、反応条件（標的微生物の種類及び濃度、反応液の組成、温度、ｐＨ、細菌数等）によって変化する。

【0022】

例えば、本発明に係る細菌の代表的菌株Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．（ＮＩＴＥ ＢＰ－０２７７９）とミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌死菌とをそれぞれ濁度（ＯＤ６６０）０．２に調製し、体積比１：１００で混合後、２０～３５℃の温度条件下で、６．５～８．０のｐＨ条件下で反応させることにより、１日後の濁度を５０％程度低下させ、ミクロコッカス属細菌を分解することができる。

【0023】

本発明に係る細菌は、対象微生物の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の解析、及び標的微生物の分解能の測定により、特定することができる。具体的には、対象微生物が、配列番号１に記載の塩基配列と相同性９８．２％以上の塩基配列を有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有し、且つ、標的微生物分解能を有していれば、その対象微生物は本発明に係る細菌であると特定できる。

【0024】

１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の解析は、例えば以下の方法で行うことができる。まず、公知の方法を用いて、対象微生物からゲノムＤＮＡを抽出し、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を増幅させる。１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を増幅させる方法としては、特に制限されるものではなく、当業者が通常用いるユニバーサルプライマーを用いたＰＣＲ法等が挙げられる。ＰＣＲ法により得られた増幅産物を、必要に応じて精製し、ＤＮＡシークエンサー等に供して、塩基配列を決定することができる。得られた塩基配列と配列番号１に記載の配列との比較を行う。

【0025】

標的微生物分解能を有するかどうかを調べる方法としては、例えば、対象微生物と標的微生物とを適切な培地又は緩衝液中で一定時間反応させた後、培地又は緩衝液中における標的微生物の分解を調べる方法が挙げられる。分解を調べる方法は、特に限定されないが、例えば標的微生物の濁度を測定する方法、ＳＬＰ試薬により標的微生物を検出する方法、ＰＣＲにより標的微生物のＤＮＡを検出する方法、標的微生物の乾燥菌体重量を測定する方法、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）；質量分析法（ＭＳ）；薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）；核磁気共鳴（ＮＭＲ）；ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）等を用いて標的微生物由来の分解物を検出する方法等が挙げられる。

【0026】

濁度により標的微生物の分解を調べる場合、標的微生物分解能を有するとは、反応後の濁度が反応前の濁度よりも有意に低下しており、例えば反応後の濁度は、反応前の濁度の８０％以下であり、好ましくは５０％以下であり、より好ましくは３０％以下である。乾燥菌体重量により標的微生物の分解を調べる場合、標的微生物分解能を有するとは、例えば反応後の乾燥菌体重量が反応前よりも有意に低下しており、例えば反応後の乾燥菌体重量は、反応前の９５％以下であり、好ましくは９０％以下である。

【0027】

これらの塩基配列解析及び標的微生物分解能の測定の結果に基づき、対象微生物が本発明に係る細菌であるかを判断できる。

【0028】

（本発明に係る微生物製剤）
本発明に係る微生物製剤は、以下の細菌（ａ１）を含む。
＜細菌（ａ１）＞
細菌（ａ１）は配列番号１に記載の塩基配列と比較し、９０％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有し、且つ、標的微生物分解能を有する細菌である。このような細菌としてチューメバチルス（Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌が挙げられる。

【0029】

細菌（ａ１）は、配列番号１に記載の塩基配列と比較し、同一性又は相同性が９２％以上の塩基配列を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有していてもよく、９５％以上の塩基配列を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有していてもよく、９８％以上の塩基配列を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有していてもよく、９９％以上の塩基配列を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有していてもよく、９９．５％以上の塩基配列を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有していてもよく、９９.９％以上の塩基配列を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有していてもよい。細菌（ａ１）は、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２７７９として寄託された細菌であってもよい。

【0030】

また、細菌（ａ１）は、配列番号１に記載の塩基配列と比較し、１塩基又は数塩基の置換、欠失又は付加が起こった塩基配列を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有していてもよい。１塩基又は数塩基とは、例えば１～１３５塩基、好ましくは１～１００塩基、より好ましくは１～５０塩基、さらに好ましくは１～２５塩基、特に好ましくは１～５塩基とすることができる。上記の変異は、１６Ｓ ＲＮＡの発現及び機能が失われない変異である。

【0031】

細菌（ａ１）は、配列番号１に記載の塩基配列に含まれる、約１５塩基以上、好ましくは約１８～約５００塩基、より好ましくは約１８～約２００塩基、さらに好ましくは約１８～約５０塩基の連続した配列又はその相補配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有していてもよい。

【0032】

細菌（ａ１）の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の解析、及び標的微生物分解能の測定は、上述の本発明に係る細菌と同様にして行うことができる。

【0033】

細菌（ａ１）としては、標的微生物分解能が良好であることから、本発明に係る細菌、又は以下Ａ群より選ばれるいずれかの細菌であることが好ましく、本発明に係る細菌であることがより好ましい。細菌（ａ１）は、単一の細菌であってもよいし、複数種の細菌であってもよい。
Ａ群：チューメバチルス アルギファエシス（Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｇｉｆａｅｃｉｓ）、チューメバチルス アビウム（Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓ ａｖｉｕｍ）、チューメバチルス フラゲラテス（Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｇｅｌｌａｔｅｓ）、チューメバチルス ギンセンギソリ（Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓ ｇｉｎｓｅｎｇｉｓｏｌｉ）、チューメバチルス リポリティカス（Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃｕｓ）、チューメバチルス ルテオラス（Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｕｔｅｏｌｕｓ）、チューメバチルス パーマメンティフリゴリス（Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｅｒｍａｎｅｎｔｉｆｒｉｇｏｒｉｓ）、チューメバチルス ソリ（Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｏｌｉ）

【0034】

微生物製剤は、細菌（ａ１）の培養物を含んでいてもよい。細菌（ａ１）の培養物は、例えば細菌（ａ１）の分泌物、代謝物等を含む液体培地を指す。具体的には、培養物は、制御された条件下で所定の液体培地中、又は炭素源及び窒素源を含む液体培地中で増殖させた細菌（ａ１）の培養物が含まれる。標的細菌（ａ１）の培養物を含む標的微生物分解用製剤には、細菌（ａ１）の生菌が含まれていてもよい。細菌（ａ１）の培養物は、細菌（ａ１）を培養した培養上清であってもよい。培養上清は、例えば細菌（ａ１）を培養した液体培地から細菌（ａ１）を遠心分離、濾過操作等で除いて得ることができる。また、培養物は、細菌（ａ１）の断片を含んでいてもよい。細菌（ａ１）の断片は、例えば細菌（ａ１）を超音波破砕、ビーズ摩砕、化学的溶解処理により得ることもできる。

【0035】

微生物製剤は、細菌（ａ１）の他に、必要に応じて、細菌（ａ２）、添加剤（ｂ）及び担体（ｃ）を含むことができる。微生物製剤の具体例としては、細菌（ａ１）、細菌（ａ２）、添加剤（ｂ）及び担体（ｃ）を含む微生物製剤を挙げることができる。

【0036】

＜細菌（ａ２）＞
細菌（ａ２）は、細菌（ａ１）と異なる細菌である。細菌（ａ２）は、細菌（ａ１）の標的微生物分解能を失わせるような細菌でなければ特に制限されるものではなく、単一の細菌であってもよいし、複数種の細菌であってもよい。

【0037】

細菌（ａ２）は対象微生物の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の解析、及び標的微生物の分解能の測定により、特定することができる。具体的には、対象微生物が、配列番号１に記載の塩基配列と比較し、同一性が９０％未満である塩基配列を含む１６Ｓ ｒＲＮＡを有していれば、又は微生物分解能を有していなければ、その対象微生物は、細菌（ａ２）であると特定できる。

【0038】

対象微生物の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の解析、及び標的微生物の分解能の測定は、上述の本発明に係る細菌と同様にして行うことができる。

【0039】

細菌（ａ１）及び細菌（ａ２）の総数に対する細菌（ａ１）数は、０．１％以上１００％以下でもよく、１％以上１００％以下であってもよく、１０％以上１００％以下であってもよく、５０％以上１００％以下であってもよく、７５％以上１００％以下であってもよく、９０％以上１００％以下であってもよく、９５％以上１００％以下であってもよく、１００％未満であってもよい。このような割合にすることにより、標的微生物を効率よく分解することができる。

【0040】

細菌（ａ１）及び細菌（ａ２）の総数に対する細菌（ａ１）数とは、微生物製剤に含まれる全細菌に対する細菌（ａ１）の割合である。細菌（ａ１）及び細菌（ａ２）の総数に対する細菌（ａ１）数を算出する方法としては、クローンライブラリー法、次世代シーケンサー解析、定量ＰＣＲにより算出する方法等が挙げられる。

【0041】

クローンライブラリー法及び次世代シーケンサー解析により細菌の存在割合を算出する方法として、具体的には、微生物製剤に含まれる細菌（ａ１）及び細菌（ａ２）からゲノムＤＮＡを抽出して１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を複数取得し（以下、取得した複数の塩基配列数をリード数と記す）、取得した塩基配列が細菌（ａ１）又は細菌（ａ２）のいずれに由来する塩基配列であるかをそれぞれ決定する。次に、リード数に対する細菌（ａ１）に由来する塩基配列数を算出し、細菌（ａ１）及び細菌（ａ２）の総数に対する細菌（ａ１）数とすることができる。

【0042】

次世代シーケンサー解析で用いる次世代シーケンサーとしては、ＤＮＡ断片をテンプレートとし、１塩基ずつ再合成する時の蛍光強度を検出し、塩基配列を決定できれば特に制限されるものではない。次世代シーケンサーとしては、例えば、ＭｉＳｅｑ、ＨｉＳｅｑ ２５００（イルミナ社製）、５５００ｘｌ ＳＯＬｉＤＴＭ、Ｉｏｎ ＰｒｏｔｏｎＴＭ、Ｉｏｎ ＰＧＭＴＭ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、ＧＳ ＦＬＸ＋（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製）等が挙げられる。

【0043】

定量ＰＣＲにより細菌の存在割合を算出する方法として、具体的には、対象微生物製剤に含まれる細菌（ａ１）の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子コピー数と、細菌（ａ１）及び細菌（ａ２）の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子コピー数をそれぞれ算出する。次に細菌（ａ１）及び細菌（ａ２）の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子コピー数に対する細菌（ａ１）の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子コピー数を算出し、細菌（ａ１）及び細菌（ａ２）の総数に対する細菌（ａ１）数とすることができる。このような方法により、対象微生物製剤が、本発明に係る微生物製剤であると特定できる。

【0044】

定量ＰＣＲで用いるリアルタイムＰＣＲ装置としては、ＤＮＡをＰＣＲにより増幅することができるサーマルサイクラーと、増幅産物を検出するための分光蛍光光度計と、を備えていれば、特に制限されるものではない。リアルタイムＰＣＲ装置としては、例えば、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）、Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ（タカラバイオ株式会社製）、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ９６ Ｓｙｓｔｅｍ（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製）等が挙げられる。

【0045】

定量ＰＣＲに用いるマスターミックスとしてはＦａｓｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔeｒ Ｍｉｘ、ＳＹＢＲ Ｓｅｌｅｃｔ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、ＰｏｗｅｒＵｐ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）等が挙げられる。

【0046】

＜添加剤（ｂ）＞
添加剤（ｂ）としては、例えば、界面活性剤、分散剤、補助剤、保護剤等が挙げられる。添加剤（ｂ）の種類及び濃度は、細菌（ａ１）が死滅しない、又は当該細菌が有する標的微生物分解能が失われない条件で適宜決定することができる。

【0047】

＜担体（ｃ）＞
担体（ｃ）としては、例えば、無機微粒子担体が挙げられる。無機微粒子担体としては、金属及びその無機塩類又は酸化物であってもよく、炭素を含有するものであっても化学的に無機物に分類されるものであってもよい。また、有機態炭素の含有量が１％程度未満の純物質又は混合物であってもよい。

【0048】

無機微粒子担体の中心粒子径は、好ましくは１μｍ～１００μｍであり、より好ましくは４μｍ～７５μｍであり、さらに好ましくは１３μｍ～２５μｍである。中心粒子径がこのような範囲にある場合、細菌（ａ１）が無機微粒子担体に担持されやすくなる傾向にある。ここで、中心粒子径とは、レーザー回折・光散乱法に基づく体積基準の粒度分布におけるメジアン径（Ｄ５０）を指す。

【0049】

無機微粒子担体の比重は、特に制限されないが、１．２～３．５であることが好ましい。

【0050】

無機微粒子担体は、培養初期の歩留まりを向上させることを目的として、必要に応じて、各種凝集剤を用いて凝集させてもよい。凝集剤としては、例えば、ノニオン性、カチオン性、アニオン性の高分子凝集剤等が挙げられる。

【0051】

微生物製剤の製造方法としては、例えば、細菌（ａ１）と無機微粒子担体とを混合し、無機微粒子担体上に細菌（ａ１）を担持させ、これを培養して得られる微生物製剤を回収する方法が挙げられる。

【0052】

培養方法としては、回分、半回分、流加、連続のいずれの方式を用いてもよい。培養方法としては、例えば、増殖が遅く菌体収率の低い微生物を効率的に調製するという観点から、特開平９－１８７２７２号公報に記載されるように、微生物を培養する容器（以下、反応槽という）へ供給する対象化合物の濃度を培養時間の経過に伴い、対数増加させる連続培養方式を用いてもよい。

【0053】

本発明において、微生物の製剤化手段は、細菌（ａ１）の標的微生物分解能が失われない限り特に限定されず、公知の製剤化手段を利用することができる。微生物製剤の形態としては、液体又は固体（カプセル封入体、寒天状、粉末状等を含む）であってもよく、それらの凍結体、凍結乾燥体等であってもよい。微生物製剤が液体である場合は、培地、緩衝液、生理的食塩水等に懸濁された菌懸濁液としてもよい。微生物製剤が固体又は凍結乾燥体である場合は、例えば培養された細菌を濃縮した後、適当な乾燥又は凍結乾燥を行い、固体又は凍結乾燥体としてもよい。その際、賦形剤などを添加してもよい。

【0054】

（本発明に係る分解方法）
本発明に係る分解方法は、本発明に係る細菌又は本発明に係る微生物製剤を標的微生物に作用させる工程を含む。

【0055】

本発明に係る細菌又は本発明に係る微生物製剤を標的微生物に作用させるとは、例えば本発明に係る細菌もしくは本発明に係る微生物製剤又はこれらを懸濁した溶液と、標的微生物とを接触させることをいう。本発明に係る細菌又は本発明に係る微生物製剤を標的微生物に作用させることによって、標的微生物が分解される。

【0056】

本発明に係る細菌又は本発明に係る微生物製剤を標的微生物に作用させる工程は、本発明に係る細菌又は細菌（ａ１）が死滅しない、又は当該細菌が有する標的微生物分解能が失われない条件であれば、特に制限されるものではない。当該工程は、例えば、温度が２０～３５℃の条件下であってもよく、２５～３０℃の条件下であってもよい。また、ｐＨは６．５～８．０の条件下であってもよく、７．０～７．５の条件下であってもよい。

【0057】

本発明に係る分解方法において用いる細菌としては、例えば、Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．（受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２７７９）が挙げられる。

【0058】

標的微生物に作用させる際の本発明に係る細菌又は本発明に係る微生物製剤の量は、標的微生物の濃度、反応系の容積等を考慮し、適宜設定することができる。

【0059】

本発明に係る分解方法において、標的微生物が分解されていることの確認方法は、特に制限されるものではなく、当業者が通常用いることができる方法により行われる。このような確認方法としては、例えば、上述の標的微生物分解能の測定方法が挙げられる。

【0060】

以上のように、本発明に係る細菌及び本発明に係る微生物製剤は、標的微生物分解能を有することから、標的微生物を含む余剰汚泥の処理に有用である。また、標的微生物に本発明に係る細菌又は微生物製剤を作用させることにより標的微生物が分解されるため、本発明に係る分解方法は標的微生物を含む余剰汚泥処理に有用である。

【0061】

（本発明に係る分解装置）
装置としては、本発明に係る細菌又は本発明に係る微生物製剤を用いて余剰汚泥を削減できる装置であれば特に限定されないが、例えば余剰汚泥が発生する汚泥処理装置、排水処理装置等を分解装置として用いることができる。また、例えば余剰汚泥が存在する既存の汚泥処理装置、排水処理装置等に本発明に係る細菌又は本発明に係る微生物製剤を添加して、標的微生物の分解装置とすることもできる。

【実施例】

【0062】

［実験１．標的微生物分解能を有する微生物の探索］
（方法）
ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌を炭素源とした培地を用いて、環境（水）中に存在する微生物群を培養することにより、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌を分解する微生物を集積培養した。次に、集積培養された微生物群から、増殖が良好であった数菌株を単離した。

【0063】

（結果）
単離した菌株ごとにミクロコッカス属細菌分解能を調べたところ、１つの菌株にミクロコッカス属細菌分解能が認められた。以下、ミクロコッカス属細菌分解能が認められた菌株を「菌株Ａ」と記すことがある。

【0064】

［実験２．ミクロコッカス属細菌分解能を有する菌株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列解析］
（材料）
・Ｒ２Ａ培地：１０００ｍＬの超純水に対し、Ｒ２Ａ Ｂｒｏｔｈ, ＤＡＩＧＯ (日本製薬株式会社製) を３.２ｇの割合で溶解し，高圧蒸気滅菌をした培地
・クローニング用フォワードプライマー（２７ｆ：配列番号２）
・クローニング用リバースプライマー（１４９２ｒ：配列番号３）
・シークエンス解析用プライマー（３３９Ｆ：配列番号４、５３６Ｒ：配列番号５、９０７Ｆ：配列番号６）

【0065】

（方法）
菌株Ａからイージー・エクストラクト ｆｏｒ ＤＮＡ（エーエムアール株式会社製）を用いてＤＮＡを抽出し、ＰＣＲにより１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を増幅させるための鋳型ＤＮＡとして用いた。

【0066】

ＰＣＲは以下の条件で行った。２５．０μＬの２×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ ｆｏｒ ＫＯＤ ＦＸ（東洋紡株式会社製）、１０．０μＬのｄＮＴＰ ｍｉｘ（２ｍＭ）、１．５μＬのクローニング用フォワードプライマー及びクローニング用リバースプライマー（それぞれ１０ｐｍｏｌ／μＬ）、０．５８μＬの鋳型ＤＮＡ、１０．４μＬの滅菌水、１．０μＬのＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ ＦＸ、１Ｕ／μＬ、東洋紡株式会社製）を、マイクロチューブに加え、混合した。マイクロチューブをＰＣＲ装置に供し、鋳型ＤＮＡの増幅反応を行った。反応は、（１）９４℃、２分間、（２）９８℃、１０秒間、（３）５０℃、３０秒間、（４）６８℃、１．５分間で行い、（２）～（４）の工程は３５サイクル繰り返し行った。ＰＣＲ後の増幅産物を精製した。

【0067】

精製したＰＣＲ後の増幅産物１５０ｎｇ相当量と、シークエンス解析用プライマー（１０μＭ）０．３２μＬと、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）８．０μＬとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を２０．０μＬとした反応液を調製した。この反応液をＰＣＲ装置に供し、増幅反応を行った。反応は、（１）９６℃、１分間、（２）９６℃、１０秒間、（３）５０℃、５秒間、（４）６０℃、４分間で行い、（２）～（４）の工程は２５サイクル繰り返し行った。得られた反応液を精製し、精製液をＤＮＡシーケンス解析（３７３０ｘｌ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ）に供して、菌株Ａから抽出した鋳型ＤＮＡの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を決定した。

【0068】

（結果）
得られた塩基配列を国際塩基配列データベース（ＤＤＢＪ／ＥＮＡ（ＥＭＢＬ）／ＧｅｎＢａｎｋ）に対してホモロジー解析を行った。基準株の中では、Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｅｒｍａｎｅｎｔｉｆｒｉｇｏｒｉｓ Ｅｕｒｌ＿９．５の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に対し、同一性９８．１％を示した。しかし、得られた塩基配列と完全に一致する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を持つ微生物は存在しなかった。

【0069】

得られた１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を配列番号１に示す。このことから、配列番号１に記載の塩基配列を有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有する細菌は、微生物分解能を持つことが示唆された。

【0070】

［実験３．配列番号１に記載の塩基配列を有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するチューメバチルス（Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌の形態観察及び生理・生化学的性状試験］
（方法）
菌株Ａについて、形態観察及び生理・生化学的性状試験を行った。これらの試験は、光学顕微鏡による形態観察、ＢＡＲＲＯＷらの方法（Ｃｏｗａｎ ａｎｄ Ｓｔｅｅｌ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂａｃｔｅｒｉａ ３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ １９９３、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ．）及びＡＰＩ５０ＣＨＢ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ社製、Ｌｙｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）によって行った。試験結果を表１～表４に示す。

【0071】

（結果）
菌株Ａは、１０℃で生育しなかったが、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の相同性が最も高いＴｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｅｒｍａｎｅｎｔｉｆｒｉｇｏｒｉｓ Ｅｕｒｌ＿９．５にはこのような特徴がみられなかった。そのため、菌株Ａは、従来のＴｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓとは異なる、新種であることが示唆された。菌株ＡをＴｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＮＩＴＥ ＢＰ－０２７７９として寄託した。

【0072】

【表1】

【0073】

【表2】

【0074】

【表3】

【0075】

【表4】

【0076】

［実験４．Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＮＩＴＥ ＢＰ－０２７７９の標的細菌（死菌）に対する分解能評価］
（材料）
・Ｒ２Ａ培地：１０００ｍＬの超純水に対し、Ｒ２Ａ Ｂｒｏｔｈ, ＤＡＩＧＯ（日本製薬株式会社製）を３.２gの割合で溶解し，高圧蒸気滅菌をした培地
・ＬＢ液体培地：５００ｍＬの超純水に対し、ＬＢ Ｂｒｏｔｈ，１．１Ｇ ＰＥＲ ＴＡＢＬＥＴ（ＳＩＧＭＡ社製）を１０個の割合で溶解し、高圧蒸気滅菌をした培地
・８０２培地：１０ｇ ポリペプトン、２ｇ 酵母エキス、１ｇ 硫酸マグネシウム七水和物を超純水に溶解し、ｐＨを７．０に調節した後、１０００ｍＬに調製し、高圧蒸気滅菌した培地
・細菌用培地：２０ｇ グルコース、５ｇ ポリペプトン、３ｇ 酵母エキス、３ｇ 肉エキス、２ｇ 硫酸アンモニウム、１ｇ リン酸二水素一カリウム、０．５ｇ 硫酸マグネシウム七水和物を超純水に溶解し、ｐＨを７．０に調節した後、１０００ｍＬに調製し、高圧蒸気滅菌した培地

【0077】

・標的細菌（死菌）含有無機培地：９８６ｍＬ 基質溶液、３．０ｍＬ Ａ液、３．０ｍＬ Ｂ液、３．０ｍＬ Ｃ液、３．０ｍＬ Ｄ液、及び１．８ｍＬ １％リン酸を混合した培地
なお、上記の基質溶液及びＡ液～Ｄ液としては、以下のものを用いた。
基質溶液:表５記載の標的細菌を同表記載の条件で培養し、集菌及び洗浄後、超純水９８６ｍＬに対し、濁度（ＯＤ６６０）０．２となるように混合し、高圧蒸気滅菌を行った溶液
Ａ液:４．３５ｇ リン酸水素二カリウム、１．７０ｇ リン酸二水素一カリウム、８．９２ｇ リン酸水素二ナトリウム１２水和物、０．３４ｇ 塩化アンモニウムを超純水に溶解後、２００ｍＬに調製し、高圧蒸気滅菌を行った溶液
Ｂ液:４．５０ｇ 硫酸マグネシウム７水和物を超純水に溶解後、２００ｍＬに調製し、高圧蒸気滅菌を行った溶液
Ｃ液:５．５０ｇ 塩化カルシウム無水物を超純水に溶解後、２００ｍＬに調製し、高圧蒸気滅菌を行った溶液
Ｄ液:０．０５ｇ 塩化鉄６水和物を超純水に溶解後、２００ｍＬに調製し、０．２μｍのシリンジフィルターで濾過滅菌を行った溶液

【0078】

【表5】

【0079】

（方法）
Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＮＩＴＥ ＢＰ－０２７７９をＲ２Ａ培地に播種し、２５℃で２４時間～４８時間培養した。

【0080】

培養終了後、Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＮＩＴＥ ＢＰ－０２７７９培養液５０μＬと標的細菌（死菌）含有無機培地５．０ｍＬとを試験管に添加して、２５℃、２００ｒｐｍにて反応させ、経時的に試験管の濁度（ＯＤ６６０）を簡易濁度計（簡易ＯＤモニター ｍｉｎｉｐｈｏｔｏ ５１８Ｒ、ＴＡＩＴＥＣ社製）で測定した。標的細菌（死菌）含有無機培地の濁度（ＯＤ６６０）が、陰性対照の濁度（ＯＤ６６０）の５０％を示す経過日数を算出し、以下の基準で分解能の有無を判定した。
Ａ：０日以上２．０日未満
Ｂ：２．０日以上５．０日未満
Ｃ：５．０日以上
なお、陰性対照はＴｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＮＩＴＥ ＢＰ－０２７７９無添加の標的細菌（死菌）含有無機培地の濁度（ＯＤ６６０）を用いた。

【0081】

（結果）
結果を表６に示す。Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＮＩＴＥ ＢＰ－０２７７９を添加することにより、標的細菌（死菌）含有無機培地の濁度の低下が認められた。従って、Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＮＩＴＥ ＢＰ－０２７７９は標的微生物（標的死細菌）を分解可能であった。

【0082】

【表6】

【0083】

［実験５．Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＮＩＴＥ ＢＰ－０２７７９の標的細菌（生菌）に対する分解能評価］
（材料）
・標的細菌（生菌）含有無機培地：９８６ｍＬ 滅菌水、３．０ｍＬ Ａ液、３．０ｍＬ Ｂ液、３．０ｍＬ Ｃ液、３．０ｍＬ Ｄ液、１．８ｍＬ １％リン酸、及び標的細菌（生菌）を混合した溶液
なお、Ａ液～Ｄ液としては実験４と同じものを用いた。また、標的細菌（生菌）含有無機培地の濁度（ＯＤ６６０）は０．２となるように標的細菌（生菌）を混合した。

【0084】

（方法）
標的細菌（生菌）含有無機培地を用いたこと以外は、実験４と同様の方法でＴｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＮＩＴＥ ＢＰ－０２７７９の標的細菌（生菌）に対する分解能を評価した。

【0085】

（結果）
結果を表７に示す。Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＮＩＴＥ ＢＰ－０２７７９を添加することにより、標的細菌（生菌）含有無機培地の濁度の低下が認められた。従って、Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＮＩＴＥ ＢＰ－０２７７９は標的細菌（生菌）を分解可能であった。

【0086】

【表7】

【0087】

［実験６．Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＮＩＴＥ ＢＰ－０２７７９の余剰汚泥（死菌）に対する分解能評価（１）］
・余剰汚泥（死菌）含有無機培地：９８６ｍＬ 基質溶液、３．０ｍＬ Ａ液、３．０ｍＬ Ｂ液、３．０ｍＬ Ｃ液、３．０ｍＬ Ｄ液、及び１．８ｍＬ １％リン酸を混合した培地
基質溶液:余剰汚泥を洗浄後、超純水９８６ｍＬに対し、濁度（ＯＤ６６０）０．２となるように混合し、高圧蒸気滅菌を行った溶液
基質溶液として上記のものを用いたこと以外は、実験４と同じものを用いた。

【0088】

（方法）
余剰汚泥（死菌）含有無機培地を用いたこと以外は、実験４と同様の方法でＴｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＮＩＴＥ ＢＰ－０２７７９の余剰汚泥（死菌）に対する分解能を評価した。

【0089】

（結果）
結果を表８に示す。Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＮＩＴＥ ＢＰ－０２７７９を添加することにより、余剰汚泥（死菌）の濁度の低下が認められた。従って、Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＮＩＴＥ ＢＰ－０２７７９は余剰汚泥（死菌）を分解可能であった。

【0090】

【表8】

【0091】

［実験７．Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＮＩＴＥ ＢＰ－０２７７９の余剰汚泥（死菌）に対する分解能評価（２）］
（材料）
実験６と同じものを用いた。

【0092】

（方法）
実験４と同じ方法で反応を行った。反応は５連で行い、反応開始後４日目に試験管中に残存する余剰汚泥を全量回収した。回収した余剰汚泥を乾燥後、余剰汚泥の乾燥重量を測定し、陰性対照群とＴｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＮＩＴＥ ＢＰ－０２７７９添加群とで有意差検定（ｔ検定、片側）を行った。

【0093】

（結果）
結果を図１に示す。陰性対照群と比較してＴｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＮＩＴＥ ＢＰ－０２７７９添加群では余剰汚泥の乾燥重量の有意な低下（ｐ＜０．０１）が認められた。従って、Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＮＩＴＥ ＢＰ－０２７７９を添加することにより余剰汚泥を削減可能であった。

【0094】

［実験８．標的微生物分解用微生物製剤のＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ属細菌に対する分解能評価］
（材料）
標的細菌含有無機培地として、実験４で用いたＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ属細菌を標的細菌として含む標的細菌（死菌）含有無機培地を準備した。微生物分解能の有無を評価する細菌として表９に示す細菌を準備した。

【0095】

【表9】

【0096】

（方法）
実験４と同様の方法で、標的細菌含有無機培地と評価対象となる細菌を含む培養液とを混ぜ、評価対象となる細菌の微生物分解能を評価した。標的細菌含有無機培地の濁度（ＯＤ６６０）が、陰性対照の濁度（ＯＤ６６０）の５０％を示す経過日数を算出し、以下の基準で微生物分解能の有無を判定した。
Ａ：０日以上１．０日未満
Ｂ：１．０日以上４．０日未満
Ｃ：４．０日以上
なお、陰性対照は評価対象となる細菌を含む培養液を添加しなかった標的細菌含有無機培地の濁度（ＯＤ６６０）を用いた。

【0097】

（結果）
結果を表１０に示す。また、表９に記載の評価対象の細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列とＴｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＮＩＴＥ ＢＰ－０２７７９の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列（配列番号１）との相同性検索を行い、算出された同一性割合を表１０に示す。表１０に記載の細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を、配列番号７～１６として示す。これらは独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンター（ＮＢＲＣ）オンラインカタログ<https://www.nite.go.jp/nbrc/catalogue/NBRCDispSearchServlet?lang=jp>又は国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）データベースカタログ<https://www.ncbi.nlm.nih.gov/>に収載されている配列である。

【0098】

Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＮＩＴＥ ＢＰ－０２７７９及びＴｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｇｉｆａｅｃｉｓ ＮＢＲＣ１０８７６５ｔはＡ判定であったが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌及びＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌はＢ判定又はＣ判定であった。従って、Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＮＩＴＥ ＢＰ－０２７７９及びＴｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｇｉｆａｅｃｉｓ ＮＢＲＣ１０８７６５ｔはＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌及びＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌よりも標的微生物（標的死細菌）分解能が優れていた。

【0099】

Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＮＩＴＥ ＢＰ－０２７７９の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列とＴｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｇｉｆａｅｃｉｓ ＮＢＲＣ１０８７６５ｔの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列との同一性は、９２．８％であった。一方、Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＮＩＴＥ ＢＰ－０２７７９の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列とＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌又はＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列との同一性は、９０％未満であった。このことから、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の同一性が、Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＮＩＴＥ ＢＰ－０２７７９と９０％以上である細菌は、標的微生物分解能が優れていると考えられた。Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｇｉｆａｅｃｉｓ ＮＢＲＣ１０８７６５ｔはＮＢＲＣから入手可能であり、その１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列はＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪデータベースにＡｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＪＸ１１０７１０として収載されている。

【0100】

【表10】

【0101】

［実験９．Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ.ＮＩＴＥ ＢＰ－０２７７９とＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉとを含む標的微生物分解用微生物製剤の標的微生物分解能評価]
（材料）
標的細菌含有無機培地として、実験４で用いたＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ属細菌を標的細菌として含む標的細菌（死菌）含有無機培地を準備した。また、標的微生物分解用微生物製剤としてＴｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ.ＮＩＴＥ ＢＰ－０２７７９（細菌（ａ１））とＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α（細菌（ａ２））とを含む微生物製剤を準備した。

【0102】

（方法）
まず、Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＮＩＴＥ ＢＰ－０２７７９を２５℃で２４時間、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５αを３７℃で２４時間培養した。

【0103】

培養後、Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＮＩＴＥ ＢＰ－０２７７９培養液（ＯＤ６６０＝０．２に調製）とＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α培養液（ＯＤ６６０＝０．２に調製）とを表１１に示す比率で混合し、標的微生物分解用微生物製剤を準備した。調製した微生物製剤５０μＬと標的細菌含有無機培地５．０ｍＬとを試験管に添加して、２５℃、２００ｒｐｍにて反応させ、２日後に混合液の濁度（ＯＤ６６０）を簡易濁度計（簡易ＯＤモニター、ｍｉｎｉｐｈｏｔｏ ５１８Ｒ、ＴＡＩＴＥＣ社製）で測定した。陰性対照の濁度（ＯＤ６６０）に対する、微生物製剤を添加した標的細菌含有無機培地の濁度（ＯＤ６６０）の割合を標的微生物の残存率として算出し、以下の基準で標的微生物分解能を評価した。
Ａ：０％以上５０％未満
Ｂ：５０％以上７０％未満
Ｃ：７０％以上
なお、陰性対照は標的微生物分解用微生物製剤無添加の標的細菌含有無機培地の濁度（ＯＤ６６０）を用いた。

【0104】

（結果）
結果を表１１に示す。Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ.ＮＩＴＥ ＢＰ－０２７７９とＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉとを含む標的微生物分解用微生物製剤は、良好な標的微生物分解能を示した。

【0105】

【表11】

【0106】

［実験１０．Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ.ＮＩＴＥ ＢＰ－０２７７９培養物の標的微生物分解能評価]
（材料）
標的細菌（生菌）含有リン酸緩衝液として６６ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．２４）１０ｍＬ、及びＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ属細菌乾燥菌体（ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ社製）１０ｍｇを混合した溶液を用いた。標的微生物分解用微生物製剤としてＴｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ.ＮＩＴＥ ＢＰ－０２７７９（細菌（ａ１））の培養物を含む微生物製剤を用いた。

【0107】

（方法）
まず、Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ.ＮＩＴＥ ＢＰ－０２７７９をＲ２Ａ培地で一定時間、培養した。

【0108】

培養後、培養液を遠心分離して、菌体を除いた培養上清を回収した。９６穴プレートに回収した培養上清１００μＬと標的細菌含有リン酸緩衝液１００μＬとを添加して、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ社製）を用いてＡＢＳ４５０ｎｍを経時的に測定した。Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ属細菌分解能（ＵＮＩＴＳ／ｍＬ）を算出し、以下の基準で標的微生物分解能を評価した。
Ｓ：２００（ＵＮＩＴＳ／ｍＬ）以上
Ａ：１００（ＵＮＩＴＳ／ｍＬ）以上２００（ＵＮＩＴＳ／ｍＬ）未満
Ｂ：２０（ＵＮＩＴＳ／ｍＬ）以上１００（ＵＮＩＴＳ／ｍＬ）未満
Ｃ：２０（ＵＮＩＴＳ／ｍＬ）未満
なお、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ属細菌分解能（ＵＮＩＴＳ／ｍＬ）は以下の式を用いて算出した。
Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ属細菌分解能（ＵＮＩＴＳ／ｍＬ）
＝｛ΔＡＢＳ４５０ｎｍ／分（培養上清を添加した標的細菌含有リン酸緩衝液）－ΔＡＢＳ４５０ｎｍ／分（培養上清無添加の標的細菌含有リン酸緩衝液）｝／（０．００１×０．１）

【0109】

（結果）
結果を表１２に示す。Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ.ＮＩＴＥ ＢＰ－０２７７９を一定時間培養した培養上清は、標的微生物分解能を有していることがわかった。

【0110】

【表12】

【図1】

【配列表】

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