特許 7537792 薄膜、バイオセンサ、及びそれらの製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-08-13

(45)【発行日】2024-08-21

(54)【発明の名称】薄膜、バイオセンサ、及びそれらの製造方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 27/414 20060101AFI20240814BHJP

   G01N 27/416 20060101ALI20240814BHJP

【ＦＩ】

G01N27/414 301V

G01N27/414 301P

G01N27/416 341G

【請求項の数】 10

(21)【出願番号】P 2022575672

(86)(22)【出願日】2022-01-18

(86)【国際出願番号】 JP2022001655

(87)【国際公開番号】W WO2022154129

(87)【国際公開日】2022-07-21

【審査請求日】2023-07-14

(31)【優先権主張番号】P 2021006049

(32)【優先日】2021-01-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(31)【優先権主張番号】P 2021014676

(32)【優先日】2021-02-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）令和２年度、国立研究開発法人日本医療研究開発機構、医療分野研究成果展開事業／先端計測分析技術・機器開発プログラム「モチベーション換気型血糖コントロール指標測定デバイスの研究開発」委託研究開発、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願

(73)【特許権者】

【識別番号】504137912

【氏名又は名称】国立大学法人 東京大学

(74)【代理人】

【識別番号】100160543

【弁理士】

【氏名又は名称】河野上 正晴

(74)【代理人】

【識別番号】100170874

【弁理士】

【氏名又は名称】塩川 和哉

(72)【発明者】

【氏名】坂田 利弥

(72)【発明者】

【氏名】白鳥 玲子

(72)【発明者】

【氏名】西谷 象一

【審査官】黒田 浩一

(56)【参考文献】

【文献】特開２０１９－０４５４１７（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１５－０３４７３０（ＪＰ，Ａ）

【文献】HIMORI, Shogo et al.，Control of Potential Response to Small Biomolecules with Electrochemically Grafted Aryl-Based Monola， LANGMUIR，2019年，Vol.35，pp.3701-3709

【文献】CAO, Chaomin et al.，Advances on Aryldiazonium Salt Chemistry Based Interfacial Fabrication for Sensing Applications，ACS APPLIED MATERIALS & INTERFACES，2017年，Vol.9，pp.5031-5049

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ ２７／４１４

Ｈ０１Ｌ ２９／７８６

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下の工程（ａ）～（ｅ）をこの順に含む、薄膜の製造方法：
（ａ）導電性基板を提供すること、
（ｂ）第１の前駆体を用いて、前記導電性基板の表面上に第１層を形成すること、
（ｃ）前記第１層から未反応の物質の少なくとも一部を除去すること、
（ｄ）前記導電性基板の表面上又は前記第１層に第２の前駆体を電気化学的に結合させることによって第２層を形成すること、及び
（ｅ）工程（ｃ）及び（ｄ）を繰り返すこと。

【請求項2】

工程（ｅ）を２回以上繰り返す、請求項１に記載の製造方法。

【請求項3】

前記工程（ｃ）が、電気化学的に行われる、請求項１又は２に記載の製造方法。

【請求項4】

前記工程（ｃ）が、超音波洗浄によって行われる、請求項１又は２に記載の製造方法。

【請求項5】

前記第１及び第２の前駆体が、同一の物質である、請求項１～４のいずれか一項に記載の製造方法。

【請求項6】

前記第１及び第２の前駆体が、それぞれジアゾ芳香族化合物から選択される、請求項１～５のいずれか一項に記載の製造方法。

【請求項7】

前記第１及び第２の前駆体の両方が、ニトロフェニルジアゾニウムであり、かつ第１層及び第２層を、電気化学的に還元処理することで、アミノフェニル基に変換する、請求項１～６のいずれか一項に記載の製造方法。

【請求項8】

前記導電性基板が、電気化学的バイオセンサの電極であり、前記薄膜が、前記電極の表面上に形成される、請求項１～７のいずれか一項に記載の製造方法。

【請求項9】

電極を含む電気化学的バイオセンサの製造方法であって、請求項８に記載の方法で前記電極の表面上に前記薄膜を形成することを含む、電気化学的バイオセンサの製造方法。

【請求項10】

前記電極を有する電界効果トランジスタ、又は前記電極に接続されたゲート電極を有する電界効果トランジスタを更に備える、請求項９に記載の電気化学的バイオセンサの製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、薄膜、バイオセンサ、及びそれらの製造方法に関する。特に、本発明は、電気化学的バイオセンサの電極の表面上の薄膜、バイオセンサ、及びそれらの製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

血液をはじめ涙・汗・唾液などの生体液には様々な生体分子が含まれている。このような生体分子をバイオマーカーとして用いて、疾患に関わるバイオマーカーを簡易に選択的かつ高感度に認識可能なバイオセンサを開発することは様々な疾患の早期発見・予防など健康維持につながり、次世代の医療の発展に大きく貢献する。

【0003】

ウェアラブルセンサによる健康管理は、現在光学系センサを用いた心拍計など、非常に身近なものになりつつある。しかしながら、種々の生体分子やイオンを含む生体液中から特定のバイオマーカーを選択的に認識するには十分な分解能が得られていないため、生体液を用いたバイオセンサによる健康管理は、未だ身近なものとはいえない。

【0004】

一方、電気化学的バイオセンサは、酸化還元反応や特定のレセプター分子との結合により選択的に電気信号から直接バイオマーカーの検出を可能にするため、実用化が期待されている。しかしながら、生体液中に多く含まれるタンパク質が電極表面に吸着することで感度や耐久性が低下するバイオファウリングにより、実用化にはさらなる技術の発展が求められている。

【0005】

近年、特許文献１に記載のような、伸長型ＡｕゲートＦＥＴバイオセンサが、様々な低分子バイオマーカーを高感度に検出可能であることが見出された。伸長型ゲートの電極を酸化還元の触媒として機能させることで、様々な生体分子が高感度で計測できることが明らかになっている。しかしながら様々な生体分子が電極と酸化還元反応を起こすため、高いＳ／Ｎ比を達成するには適切な界面修飾が必要となる。そこで、これを基軸としたセンサ／界面設計が報告されている。

【0006】

中でも、Ａｕ電極表面に夾雑物を捕捉するナノフィルターを作製し、バイオマーカーのターゲット分子のみをＡｕ電極表面に透過させる設計により、特定の生体低分子におけるＳ／Ｎ比の向上が実現されている［非特許文献１］。

【0007】

特に、ジアゾニウム塩であるニトロベンゼンジアゾニウム（ＮＢＤ）を電気化学修飾により電極表面上に薄膜化して形成したアンカー層に、夾雑物に対するレセプターとしてフェニルボロン酸（ＰＢＡ）を含む薄膜やアプタマー分子などを化学修飾することで、フィルタリング効果が達成できることも報告されている［非特許文献２］。

【0008】

また、上記のバイオファウリングに対するアンチファウリング効果を付与するため、高い親水性と双極性のホスフォリルコリン基を有するフェニルホスフォリルコリン（ＰＰＣ）を用いたＰＰＣ薄膜も提案されている［非特許文献３］。

【0009】

さらに、特許文献２では、ＦＥＴバイオセンサの電極表面上にジアゾニウム化合物を結合させてジアゾニウム化合物由来の層を得た後、原子移動ラジカル重合によってその層にポリマー鎖を形成することを開示している。このように得られたポリマー層は、高いフィルタリング効果が得られている。

【0010】

電気化学的バイオセンサは、これらのようなＦＥＴバイオセンサだけではなく、非特許文献４に記載のようなサイクリックボルタンメトリー法に基づくバイオセンサ、非特許文献５に記載のような電気化学インピーダンス分光（ＥＩＳ）法に基づくバイオセンサも知られている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0011】

【文献】特開２０１４－２１５２９２号公報

【文献】特開２０１９－４５４１７号公報

【非特許文献】

【0012】

【文献】Ｎｉｓｈｉｔａｎｉ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ＆Ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ，２０１９，１１，５５６１－５５６９

【文献】Ｈｉｍｏｒｉ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２０１９，３５，３７０１－３７０９

【文献】Ｐａｒｖｉｚ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｓｉｓ，２０１４，２６，１４７１－１４８０

【文献】Ｔｈｉａｇａｒａｊａｎ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，２００９，２４，８，２７１２－２７１５

【文献】Ｇａｒｒｏｔｅ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｓｉｓ，２０１４，２６，１４７１－１４８０

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0013】

本発明は、得られる薄膜の緻密性をコントロールすることができる薄膜の新規な製造方法及びそのような方法によって得られうる高い緻密性の薄膜を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0014】

本発明者らは、以下の態様を有する本発明により、上記課題を解決できることを見出した。
《態様１》
以下の工程（ａ）～（ｅ）をこの順に含む、薄膜の製造方法：
（ａ）導電性基板を提供すること、
（ｂ）第１の前駆体を用いて、前記導電性基板の表面上に第１層を形成すること、
（ｃ）前記第１層から未反応の物質の少なくとも一部を除去すること、
（ｄ）前記導電性基板の表面上又は前記第１層に第２の前駆体を電気化学的に結合させることによって第２層を形成すること、及び
（ｅ）工程（ｃ）及び（ｄ）を繰り返すこと。
《態様２》
工程（ｅ）を２回以上繰り返す、態様１に記載の製造方法。
《態様３》
前記工程（ｃ）が、電気化学的に行われる、態様１又は２に記載の製造方法。
《態様４》
前記工程（ｃ）が、超音波洗浄によって行われる、態様１又は２に記載の製造方法。
《態様５》
前記第１及び第２の前駆体が、同一の物質である、態様１～４のいずれかに記載の製造方法。
《態様６》
前記第１及び第２の前駆体が、それぞれジアゾ芳香族化合物から選択される、態様１～５のいずれかに記載の製造方法。
《態様７》
前記第１及び第２の前駆体の両方が、ニトロフェニルジアゾニウムであり、かつ第１層及び第２層を、電気化学的に還元処理することで、アミノフェニル基に変換する、態様１～６のいずれかに記載の製造方法。
《態様８》
前記導電性基板が、電気化学的バイオセンサの電極であり、前記薄膜が、前記電極の表面上に形成される、態様１～７のいずれかに記載の製造方法。
《態様９》
電極を含む電気化学的バイオセンサの製造方法であって、態様８に記載の方法で前記電極の表面上に前記薄膜を形成することを含む、電気化学的バイオセンサの製造方法。
《態様１０》
前記電極を有する電界効果トランジスタ、又は前記電極に接続されたゲート電極を有する電界効果トランジスタを更に備える、態様９に記載の電気化学的バイオセンサの製造方法。
《態様１１》
アミノフェニル基を有する層を含んでおり、かつ
前記アミノフェニル基の緻密性が、１０分子／ｎｍ^２以上である、薄膜。
《態様１２》
厚みが１０ｎｍ以下である、態様１１に記載の薄膜。
《態様１３》
電荷移動抵抗（Ｒ_ｃｔ）が、５０Ω・ｃｍ^２以上である、態様１１又は１２に記載の薄膜。
《態様１４》
態様１１～１３のいずれかに記載の薄膜を電極の表面上に含む、電気化学的バイオセンサ。
《態様１５》
前記電極を有する電界効果トランジスタ、又は前記電極に接続されたゲート電極を有する電界効果トランジスタを更に備える、態様１４に記載の電気化学的バイオセンサ。

【発明の効果】

【0015】

本発明の方法によれば、様々な物質に基づく様々な緻密性を有する薄膜を製造することができる。薄膜の緻密性をコントロールすることによって、例えばバイオセンサの分野において特定のターゲット分子のみを電極に透過させることが可能になり、バイオセンサの設計に非常に有利である。また、この方法によれば、従来技術では達成されなかった水準の緻密性を有する薄膜を製造できる。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】図１は、電界効果トランジスタを備えるバイオセンサの構成を例示している。

【図2】図２は、ＮＢＤ薄膜形成（修飾）時のＣＶ波形（左：連続修飾（比較例）、右：反復修飾（実施例））を示す図である。

【図3】図３は、ニトロフェニル薄膜→アミノフェニル薄膜への電気化学修飾・還元の反復プロセスを示す図である。

【図4】図４は、比較例のニトロフェニル薄膜の還元時のＣＶ波形を示す図である。

【図5】図５は、反復修飾（実施例）及び連続修飾（比較例）によって得られたアミノフェニル薄膜についてのアミノフェニル基の定量評価の結果を示す図である。

【図6】図６は、０～３回の反復修飾における交流インピーダンス測定のナイキストプロットを示す図である。

【図7】図７は、ニトロフェニル薄膜及びアミノフェニル薄膜のプローブイオン透過性を評価した結果を示す図である。

【図8】図８は、フェニルボロン酸ピナコラートの修飾の際のＣＶ波形を示す図である。

【図9】図９は、フェニルボロン酸ピナコラートの反復修飾におけるそれぞれ２回目、４回目、８回目の修飾の際のＣＶ波形を示す図である。

【図10】図１０は、反復修飾回数ごとのＰＢＡ薄膜のプローブイオン透過性を評価した結果を示す図である。

【図11】図１１は、ピナコール脱離ＰＢＡ薄膜電極とピナコール未脱離ＰＢＡ薄膜電極の交流インピーダンスのナイキストプロットを示す図である。

【図12】図１２は、ＦＥＴ応答を測定する際に用いたＦＥＴのソースフォロワー回路を示す図である。

【図13】図１３は、ＰＰＣ薄膜の作製時のＣＶ波形を示す図である。

【図14】図１４は、ＰＰＣ薄膜の作製時のＣＶ波形を示す図である。

【図15】図１５は、ＰＰＣ薄膜の接触角測定を示す図である。

【図16】図１６は、ＰＰＣ薄膜の電荷移動抵抗（Ｒ_ｃｔ）を示す図である。

【図17】図１７は、ＰＰＣ薄膜の生体分子に対するＦＥＴ応答の結果を示す図である。

【図18】図１８は、ＨＳＡ環境下におけるノルエピネフリン添加ＦＥＴ測定の結果を示す図である。

【図19】図１９は、ＰＰＣ／ＰＢＡ混合薄膜電極等の電荷移動抵抗（Ｒ_ｃｔ）を示す図である。

【図20】図２０は、ＰＰＣ／ＰＢＡ混合薄膜電極等の電荷移動抵抗（Ｒ_ｃｔ）を示す図である。

【図21】図２１は、ＰＰＣ／ＰＢＡ混合薄膜のノルエピネフリンに対するＦＥＴ応答の結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0017】

《薄膜の製造方法》
本開示の製造方法は、以下の工程（ａ）～（ｅ）をこの順に含む、薄膜の製造方法である：
（ａ）導電性基板を提供すること、
（ｂ）第１の前駆体を用いて、前記導電性基板の表面上に第１層を形成すること、
（ｃ）前記第１層から未反応の物質の少なくとも一部を除去すること、
（ｄ）前記導電性基板の表面上又は前記第１層に第２の前駆体を電気化学的に結合させることによって第２層を形成すること、及び
（ｅ）工程（ｃ）及び（ｄ）を繰り返すこと。

【0018】

従来は、上記工程（ｂ）を繰り返し行うか、工程（ｂ）及び（ｄ）を繰り返し行って積層をした後、最終的に工程（ｃ）を行って薄膜を製造していた。これに対して、本発明者らは、電気化学的に積層していく際に、未反応の物質の除去と電気化学的な反応とを１セットにして、これを反復して行うこと（以下、「反復修飾」ともいう）によって、得られる薄膜の電気的特性に大きな違いが生じることを見出した。本発明者らがさらに検討したところ、この特性の違いは、得られた薄膜の緻密性に起因していることが分かった。

【0019】

電気化学的に続けて積層し、最後に未反応物質の除去を行う場合（以下、「連続修飾」ともいう）、前駆体を反応させて積層している間に、未反応の物質が物理吸着種となって層中に留まることによって、反応が進まなくなっていたことが分かった。本発明の方法では、そのような物理吸着種等を除去してから、電気化学的な反応をさせることによって、第２層を形成しやすくなったため、得られた薄膜が緻密化されたためと考えられる。

【0020】

例えば、電気化学的バイオセンサの電極表面に形成される薄膜は、電極がターゲット分子のみを検出できるようにしていながらも、夾雑物からの影響を受けないようにする必要がある。薄膜へのこれらの要求特性は、薄膜の緻密性と大きく関連しているため、薄膜の緻密性を制御できるようになったことは、バイオセンサの設計において非常に有利である。

【0021】

本開示の方法によって得られた薄膜は、緻密でかつ高い絶縁性を与えることができる。例えば、電気化学的バイオセンサの電極の表面上に形成される薄膜の場合、電極への夾雑物からの影響を受けないようにしつつ、プローブイオンを透過させることができる。

【0022】

本開示の方法によって得られた薄膜（アンカー層）では、例えば、導電性基板である電極上の薄膜の緻密性（面密度）を制御することによって、フィルタリング効果に有効なレセプター分子を含む薄膜に、更なるフィルタリング効果が期待できる。さらに、この薄膜を構成する分子（例えば、アリール基）を機能化することで薄膜自体にフィルタリングやアンチファウリング効果を付与する設計が可能となる。

【0023】

〈工程（ａ）：導電性基板の提供〉
工程（ａ）において、導電性基板を提供する。導電性基板としては、電極を挙げることができ、この電極は、電気化学的バイオセンサの電極であってもよい。

【0024】

〈工程（ｂ）：第１層の形成〉
本開示の方法の工程（ｂ）において、第１の前駆体を用いて導電性基板の表面に第１層を形成する。第１層を形成するための第１の前駆体は、導電性基板上に直接的に結合又は付着できれば、その種類は、特に限定されない。第１層は、単分子の層であってもよく、又は第１の前駆体が複数結合した複数分子の層であってもよい。

【0025】

例えば、第１の前駆体には、ラジカルを発生させ、それにより導電性基板表面上に第１層を形成できる化合物を用いることができる。第１の前駆体にラジカルを発生させるために、導電性基板から電位を印加して、電気化学的に第１の前駆体にラジカルを発生させてもよく、加熱又は光照射によってラジカルが発生するような物質を第１の前駆体に用いてもよい。

【0026】

第１の前駆体としては、例えば、チオール化合物、ジスルフィド化合物、ビニル化合物、ジアゾニウム化合物、過酸化物等を挙げることができる。これらは、単独で又は複数種を組み合わせて用いることができる。導電性基板が電極であり、電極がＡｕ、Ａｇ、Ｃｕ等の金属電極、又はカーボン（ＧＣ）電極である場合、第１の前駆体として、ジアゾニウム化合物（塩）を用いることができる。ジアゾニウム化合物を用いて第１層を形成することで、－Ｃ－結合により、Ａｕ等の表面と強固な共有結合により固定化することができる。

【0027】

ジアゾニウム化合物としては、ジアゾ基を脱離させてラジカルを発生させ、それにより導電性基板表面上に第１層を形成できれば特に限定されないが、ジアゾ芳香族化合物、ジアゾ脂環式化合物、ジアゾ複素環式化合物等のジアゾ基を有する環式化合物を挙げることができる。ジアゾ芳香族化合物として、特にアリールジアゾニウム塩を挙げることができる。なお、これらの化合物は、そのまま用いてもよく、例えばアミン化合物（例えば、芳香族アミン）等をその場でジアゾ化してジアゾニウム化合物として用いてもよい。

【0028】

第２層を形成するための第２の前駆体との反応性等の観点から、第１の前駆体は、置換基（環式化合物の場合、特にｐ－置換基）を有していてもよく、そのような置換基としては、酸性基、塩基性基又は両性官能基を挙げることができる。酸性基としては、スルホン酸基、カルボキシル基、ヒドロキシ基、ニトロ基、ボロン酸基等のホウ素含有基、ホスホン酸基等のリン含有基、又はこれらを含む基を挙げることができる。塩基性基としては、アミノ基、アンモニウム基又はこれらを含む基を挙げることができる。両性官能基としては、ホスフォリルコリン基等を挙げることができる。これらの官能基を導入することによって、薄膜上にさらなる層を形成できるようにしてもよく、また低分子の夾雑物を薄膜内に補足するレセプターとして機能させるようにしてもよい。薄膜は、種々のプローブイオン（プローブ分子）等の化学固定が可能なように官能基（アミノ基、カルボキシ基、ボロン酸基など）を有し、親水性や疎水性など表面改質する官能基（ホスフォリルコリン基、水酸基など）を有することができる。

【0029】

ジアゾニウム化合物は、反応性の炭素ラジカルを経て導電性基板表面に結合させることができる。炭素ラジカルの生成は、電気化学的に行うことができ、水系溶媒又は有機溶媒中で電位を印加することにより、導電性基板表面と結合させることができる。アリールジアゾニウム塩を第１の前駆体として用いる場合には、還元電位を印加することができ、固定電位を一定時間印加することによって、又はＣＶ法のような電位サイクルを数サイクル走査することによって、アリールラジカルを発生させて、これを導電性基板表面に結合させてもよい。

【0030】

アリールジアゾニウム塩を第１の前駆体として用いる場合、その反応は、以下に模式的に示すことができる。

【0031】

【化1】

【0032】

このようなジアゾニウム化合物、特にアリールジアゾニウム塩を用いる電気化学的な表面修飾の利点としては、簡便で迅速な修飾方法であること；炭素、金属、半導体などの様々な基板表面に適用できること；ジアゾニウム化合物の置換基（特に、ｐ－置換基）を設計することによって任意の官能基を柔軟に導入できること；及び、アリールと導電性基板表面との間に強い共有結合が生じることを挙げることができる。

【0033】

第１の前駆体のラジカル反応を制御して第１層の厚みを調整するために、ラジカル捕捉剤又は連鎖移動剤を第１層の形成時に用いてもよい。例えば、非特許文献２に記載のようなラジカル捕捉剤を用いることで、第１層を単分子層化又は低分子層化することができる。ラジカル捕捉剤としては、特に種類は限定されないが、２，２－ジフェニル－１－ピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）、ヒドロキノン、４－メトキシフェノール、アミン－Ｎ－オキシド等の周知のラジカル捕捉剤を挙げられる。

【0034】

例えば、第１層の緻密化の程度を変更するために、以下に模式的に示すように、第１の前駆体としてジアゾニウム化合物と共にチオール化合物を併用して第１層を形成し、その後、チオール化合物部分のみを紫外線照射によって破壊することもできる。

【化2】

【0035】

この場合には、上述のようなジアゾニウム化合物塩由来の層形成に加えて、チオール基に由来する－Ｓ－結合による層も形成される。－Ｓ－結合は、紫外線（ＵＶ）照射によって分解できるため、－Ｓ－結合に由来する層部分を除去し、ジアゾニウム化合物塩由来の層部分のみを残存させることができる。したがって、ジアゾニウム化合物塩とチオール基含有化合物との比率等を調整することで、第１層の密度を制御することが可能となる。

【0036】

〈工程（ｃ）：未反応物質の除去〉
本開示の方法の工程（ｃ）において、第１の前駆体（及び２回目以降の工程（ｃ）では第２の前駆体）の未反応の物質を除去する。この工程（ｃ）においては、未反応の物質だけではなく、第１の前駆体（及び／又は第２の前駆体）が、例えばラジカル体になって他の物質と反応して生じた副生成物も除去される。

【0037】

未反応の物質の除去の方法は、特に限定されないが、例えば電位を印加して電気化学的に未反応の物質を第１の層（及び／又は第２の層）から放出させてもよく、また超音波洗浄等の洗浄によって未反応の物質を除去してもよい。

【0038】

電気化学的に未反応の物質を除去するには、工程（ｂ）（及び／又は工程（ｄ））で電気化学的に層を形成する際に印加した電位とは異なる範囲の電位を印加して行うことができる。例えば、層を形成する際に正の電位を印加したり、０Ｖから１．０Ｖの範囲でＣＶ法によって電位走査を行ったりした場合には、負の電位を印加することによって、未反応の物質を第１の層（及び／又は第２の層）から放出させることができる。このような、方法によって、未反応物質の除去を行った場合には、例えばジアゾニウム化合物のジアゾ基が残ったまま層が形成された場合に、ジアゾ基を除去できる場合があり、さらなる薄膜のさらなる緻密化が可能である。

【0039】

洗浄によって未反応の物質を除去するには、その洗浄方法は特に限定はされない。水系溶媒又は有機溶媒で単にすすぐだけであってもよいが、これらの溶媒中で超音波洗浄をすることができる。

【0040】

〈工程（ｄ）：第２層の形成〉
本開示の方法の工程（ｃ）において、未反応物質の除去をした後に、導電性基板の表面上又は第１層に第２の前駆体を電気化学的に結合させることによって第２層を形成する。第２層は、単分子の層であってもよく、又は第２の前駆体が複数結合した複数分子の層であってもよい。

【0041】

従来技術においては、ＣＶ法のような電位サイクルを数サイクル走査することによって、第１層及び第２層を電気化学的反応から形成し、最後に超音波洗浄を行って、未反応物質の除去をしていたが、本開示の方法では、未反応物質の除去の後に、さらに工程（ｄ）の積層工程を行うことに特徴を有しているため、本工程は、本開示の方法の本質的な特徴である。

【0042】

工程（ｃ）で用いられる第２の前駆体は、第１層を形成するための第１の前駆体とは異なる物質であってもよく、又は第１の前駆体と同じ物質でもよい。第２の前駆体は、電気化学的に第１層に結合させてもよく、導電性基板の表面に結合させてもよい。第２の前駆体は、第１の前駆体で使用できるとした物質と同じ物質から選択することができる。

【0043】

また、電気化学的な反応についても同様であり、第１層を形成するための電気化学的反応と同様の方法によって、第２層を形成することができる。

【0044】

〈工程（ｅ）：工程（ｃ）及び（ｄ）の繰り返し〉
本開示の方法は、工程（ｃ）及び（ｄ）を反復して行うことによって、薄膜の緻密化を行う。この繰り返しは、少なくとも１回行うことができ、１回～２０回、２回～１０回、又は３回～８回の範囲で行うことができる。この繰り返しの回数は、例えば、ＣＶ法のような電位サイクルによって電気化学的に層を形成する場合には、電流の波形が大きく変わらなくなるまで行うことができる。また、固定電位によって電気化学的に層を形成する場合には、電流が一定になるまで行うことができる。

【0045】

例えば、この方法では、反復修飾を１０回程度行って、３ｎｍ～１０ｎｍの薄さ、より具体的には６～８ｎｍの薄さで飽和する場合があり、かつ緻密化及び絶縁性も、反復修飾１０回程度で飽和する場合がある。

【0046】

この繰り返しの工程では、初回の工程（ｃ）及び（ｄ）と、次の工程（ｃ）及び（ｄ）とで、完全に同一の工程である必要はなく、例えば工程（ｃ）において用いる第２の前駆体は、初回の工程（ｃ）と次の工程（ｃ）において変更してもよい。

【0047】

２回目以降の工程（ｃ）において、それ以前の工程（ｃ）の第２の前駆体とは、異なる第２の前駆体を用いることによって、異なる物質に基づく混合薄膜を形成してもよい。実施例の実験４でも開示されているように、２種以上の異なる前駆体を用いることによって、それぞれの層で異なる機能を与えることによって、薄膜を高機能化させることができる。

【0048】

〈他の工程〉
本開示の方法は、さらに上記のようにして得られた薄膜上に、さらに他の機能を付与するための層を形成することができる。例えば、特許文献２に記載のようにボロン酸基を有するポリマーを結合させて、フィルタリング効果を与えることができる。また、薄膜上に、ターゲット分子と結合するアプタマー層を形成したり、ポリエチレングリコール等の親水性ポリマー層を形成してアンチファウリング効果を与えたりしてもよい。

【0049】

《薄膜》
本開示の薄膜は、上記の本開示の製造方法によって得られるような緻密性の高い薄膜であり、本開示の薄膜の各構成については、本開示の製造方法に関して説明した各構成を参照することができる。また、本開示の薄膜の製造方法に関する各構成についても、以下の本開示の薄膜に関して説明した各構成を参照することができる。

【0050】

本開示の薄膜は、導電性基板の表面に形成される。この薄膜は、導電性基板上に直接的に結合又は付着する第１層、及び第１層の分子に結合して厚み方向又は横方向に形成される第２層を含む。第１層及び第２層は、幾何学的に重なっていてもよい。第１層及び第２層は、同じ種類の分子から形成されていてもよく、それぞれ異なる種類の分子から形成されていてもよい。

【0051】

第１層及び第２層を構成する分子は、それぞれ上記の第１及び第２の前駆体に由来する分子から構成することができ、特にジアゾ芳香族化合物から由来する芳香族化合物であることができる。この芳香族化合物は、置換基を有していてもよく、そのような置換基としては、酸性基、塩基性基又は両性官能基を挙げることができる。酸性基としては、スルホン酸基、カルボキシル基、ヒドロキシ基、ニトロ基、ボロン酸基等のホウ素含有基、ホスホン酸基等のリン含有基、又はこれらを含む基を挙げることができる。塩基性基としては、アミノ基、アンモニウム基又はこれらを含む基を挙げることができる。両性官能基としては、ホスフォリルコリン基等を挙げることができる。

【0052】

特に、本開示の薄膜は、第１及び／又は第２の前駆体としてニトロフェニルジアゾニウムが用いられた後に、電気化学的に還元処理されて得ることができる、アミノフェニル基を有する層を含むことができる。

【0053】

本開示の薄膜の厚さは、例えば２０ｎｍ以下、１９ｎｍ以下、１８ｎｍ以下、１７ｎｍ以下、１６ｎｍ以下、１５ｎｍ以下、１４ｎｍ以下、１３ｎｍ以下、１２ｎｍ以下、１１ｎｍ以下、１０ｎｍ以下、１０ｎｍ未満、９ｎｍ以下、又は８ｎｍ以下であってもよく、３ｎｍ以上、４ｎｍ以上、５ｎｍ以上、６ｎｍ以上、７ｎｍ以上、８ｎｍ以上、９ｎｍ以上、１０ｎｍ以上、１１ｎｍ以上、１２ｎｍ以上、１３ｎｍ以上、１４ｎｍ以上、又は１５ｎｍ以上であってもよい。本開示の薄膜の厚さは、３ｎｍ以上２０ｎｍ以下、又は５ｎｍ以上１０ｎｍ以下の範囲であってもよい。薄膜の厚さは、原子間力顕微鏡によって測定することができる。

【0054】

本開示の薄膜は、緻密性が高い結果、絶縁性を高くすることができ、実施例に記載の方法によって測定した場合、電荷移動抵抗（Ｒ_ｃｔ）は、５０Ω・ｃｍ^２以上、１００Ω・ｃｍ^２以上、３００Ω・ｃｍ^２以上、５００Ω・ｃｍ^２以上、１０００Ω・ｃｍ^２以上、又は１５００Ω・ｃｍ^２以上とすることができる。

【0055】

このようにして得られたアミノフェニル基を有する層を含む薄膜は、実施例に記載の方法によって、アミノ基の数から薄膜の緻密度を定量化することができる。本開示の薄膜は、アミノフェニル基の緻密性が、１０分子／ｎｍ^２以上、１５分子／ｎｍ^２以上、又は２０分子／ｎｍ^２以上であってもよく、４０分子／ｎｍ^２以下、３０分子／ｎｍ^２以下、又は２０分子／ｎｍ^２以下であってもよい。例えば、本開示の薄膜のアミノフェニル基の緻密性は、１０分子／ｎｍ^２以上４０分子／ｎｍ^２以下の範囲である。分子／ｎｍ^２の単位は、１つのアミノフェニル基を１分子とみなした単位であり、１つのアミノフェニル基を１官能基とみなして官能基／ｎｍ^２に代えてもよい。

【0056】

本開示の薄膜は、上記のような層に加えて、さらに他の機能を付与するための層を含むことができる。例えば、特許文献２に記載のようにボロン酸基を有するポリマーを結合させて、フィルタリング効果を与えることができる。また、上記のような層の上に、ターゲット分子と結合するアプタマー層を形成したり、ポリエチレングリコール等の親水性ポリマー層を形成してアンチファウリング効果を与えたりしてもよい。

【0057】

《バイオセンサ及びその製造方法》
本開示の薄膜は、バイオセンサ、化学センサ等に用いることができる。バイオセンサは、導電性基板として電極を含む電気化学的バイオセンサであることができる。電極を含む電気化学的バイオセンサは、電極の表面に上記の薄膜を含むこと以外は、公知のバイオセンサの構成を採用することができる。バイオセンサはまた、導電性基板を含む表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ：Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）を利用したバイオセンサ、または、導電性基板を含む水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ：Ｑｕａｒｔｚ Ｃｒｙｓｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂａｌａｎｃｅ）を利用したバイオセンサであることができる。また、バイオセンサの製造方法は、電極を含む電気化学的バイオセンサの製造方法であって、上記の薄膜の製造方法によって電極の表面上に前記薄膜を形成することを含むこと以外は、公知のバイオセンサの製造方法の構成を採用することができる。

【0058】

電気化学的バイオセンサとしては、非特許文献４に記載のようなＣＶ法の電流波形に基づいて検出対象物質の存在及び濃度を検出するバイオセンサ、非特許文献５に記載のような電気化学インピーダンス分光（ＥＩＳ）法のインピーダンス計測に基づいて検出対象物質の存在及び濃度を検出するバイオセンサ、及び電界効果トランジスタのゲート電極の電位計測に基づいて検出対象物質の存在及び濃度を検出するバイオセンサ等を挙げることができる。

【0059】

バイオセンサの試料は、血液であってもよいが、非侵襲的に採取した試料、例えば、汗、涙、唾液を挙げることができる。

【0060】

バイオセンサによる検出対象物質としては、低分子のバイオマーカーであってもよい。低分子のバイオマーカーとしては、典型的には、システインやチロシン等のアミノ酸、糖尿病と関わりの深いグルコース、神経伝達物質であるドーパやドーパミン、アレルギー応答に関わりのあるヒスタミンなどの生体化合物を挙げることができる。ただし、これらに限定されるものではなく乳酸、尿酸、シアル酸、シアリルラクトース、フルクトース、パロモマイシン（ｐａｒｏｍｏｍｙｃｉｎ）、カナマイシン（Ｋａｎａｍｙｃｉｎ）、Ｌ－エピネフリン等を対象とすることもできる。

【0061】

また、バイオセンサによる検出対象物質としては、上述のようなプローブイオンであってもよく、プローブイオンを用いてバイオマーカーを間接的に検出してもよい。

【0062】

検出対象物質は、電極の検出領域内に近づくことで検出され、その検出領域は、薄膜の厚さの数ナノメートル以内であり、例えばデバイ長以内であり、典型的には５ｎｍ以内である。ここで、デバイ長とは、電極近傍で化合物の存在による電位変化が観測され得る領域のことである。当該デバイ長は、測定に用いるセンシング部内の溶液濃度等にも依存するものであり、場合によって、１、２、３、又は４ｎｍであることもあり、或いは、５～１０ｎｍの範囲となることもある。

【0063】

本開示のバイオセンサの１つの実施形態である、電界効果トランジスタを備えるバイオセンサの構成を図１に例示する。

【0064】

バイオセンサ１０は、検出対象物質の存在を識別するセンシング部１１と、検出部としての電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）１２とを備える。バイオセンサ１０は、センシング部１１において試料中に含まれる検出対象物質を識別し、識別された情報をＦＥＴ１２において電気的な信号に変換することにより、試料中の検出対象物質の存在及び濃度を検出する。

【0065】

なお、図１では、代表的な例示として、ゲート電極２１が金属線３６を介して金属電極３２と電気的に接続された構成を有する、いわゆる伸長ゲート型のＦＥＴを使用した場合を例に挙げて説明するが、バイオセンサは、このような例に限定されるものではない。

【0066】

センシング部１１は、ゲート電極（伸長ゲート電極）２１と、ゲート電極２１上に設けられた薄層２２とを備える。当該薄層は、上述のとおり、ターゲットとなる検出対象物質の応答を検出する際に、ノイズシグナルを生じさせる夾雑物を選択的に捕捉又は排除する機能を有し、これにより検出対象物質のみをゲート電極２１の界面付近に透過させるためのものである。

【0067】

図１に示す実施態様では、センシング部１１は、ゲート電極２１の一側表面上に円筒状の壁部を設けて容器２３が形成されており、当該容器２３内に識別物質を含む試料を添加される。ゲート電極２１は、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ等の金属電極、又はカーボン（ＧＣ）電極で形成することができるが、例えばＡｕである。容器２３の容量については特に制限されるものではないが、例えばバイオセンサの測定に必要な試料の量（例えば、０．１μＬ～１μＬ程度）以上の微量の体液を収容できる容量である。

【0068】

ＦＥＴ１２は、上述したセンシング部１１と電気的に接続可能であり、上記の対象物質とセンシング部１１との相互作用の結果生じる変化を検出する素子である。図１に示すように、ＦＥＴ１２は、半導体基板３１の表面に形成されたソース電極３４及びドレイン電極３５と、これらの上に形成されたゲート絶縁膜３３とを備える。ＦＥＴ１２としては、ｎチャネル型ＭＯＳＦＥＴ（ｎ－ＭＯＳ）が好適であるが、ｐチャネル型ＭＯＳＦＥＴ（ｐ－ＭＯＳ）、ｎチャネル接合型ＦＥＴ、ｐチャネル接合型ＦＥＴ等を用いることもできる。ゲート絶縁膜３３上には、金属電極３２が形成されている。金属電極３２は、配線３６を介して、センシング部側のゲート電極２１と電気的に接続されている。金属電極３２は、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ等の金属電極、又はカーボン（ＧＣ）電極で形成することができる。

【0069】

半導体基板３１の素材としては、特に制限されるものではないが、Ｓｉ、ＧａＡｓ、透明酸化物半導体（例えば、ＩＴＯ、ＩＧＺＯ、ＩＺＯ）、有機半導体、炭素半導体（例えば、カーボンナノチューブ、グラフェン半導体、ダイヤモンド半導体等）等、公知の半導体を適宜選択して用いることができる。炭素半導体を用いる場合には、Ｓｉを使用した場合よりもセンサの測定感度をより高くすることができる。

【0070】

ゲート絶縁膜３３は、半導体基板３１におけるソース電極３４とドレイン電極３５とに挟まれた部分（すなわち、図１のＦＥＴにおけるｐ型半導体部分）の表面に設けられており、ＳｉＯ_２、Ｓｉ_３Ｎ_４（ＳｉＮ_ｘ）、Ｔａ_２Ｏ_５、Ａｌ_２Ｏ_３等の酸化物又は窒化物等で形成することができる。

【0071】

ソース電極３４とドレイン電極３５は、電源３７及び電流計３８が電気的に接続されており、ソース電極３４からドレイン電極３５へ流れるドレイン電流を計測するように形成されている。ゲート絶縁膜３３上の電荷密度が変化すると、ドレイン電流の大きさが変化する。すなわちドレイン電流を一定に保つためには、ゲート絶縁膜３３上の電荷密度の変
化に伴いゲート電圧を変化させる必要がある。ＦＥＴ１２は、このゲート電圧の変化を計測することにより、ゲート絶縁膜３３上の電荷密度の変化を電気的に計測する。

【0072】

この際、必要に応じて、図１に示すように参照電極２４を設けてもよい。参照電極２４は、センシング部１１と電気的に接続され、ソース電極３４及びドレイン電極３５とともに閉回路を形成し、ＦＥＴにおける電圧測定の基準電位となる電極であり、アースされることもある。実用上は、ＦＥＴにおける電圧測定の際に必要となるが、他の方法により対象物質の測定が可能であれば参照電極２４を設けることは必ずしも必須ではない。

【0073】

なお、ＦＥＴバイオセンサにおける一般的な検出原理については、例えば、特許文献１等において説明されており、当該文献を参照することができる。

【0074】

本発明を以下の実施例でさらに具体的に説明をするが、本発明はこれによって限定されるものではない。

【実施例】

【0075】

実験１：アミノフェニル薄膜に関する実験
《製造例》
〈１－１．試薬及び実験器具〉
４－ニトロベンゼンテトラフルオロボレート（以下「ＮＢＤ」，９８％）は、東京化成工業株式会社から購入した。アセトニトリル（９８％）、アセトン、メタノール、エタノール、ヘキサフルオロリン酸テトラブチルアンモニウム（９５％）、ヘキサシアノ鉄（III）酸カリウム（以下、Ｋ_３［Ｆｅ（ＣＮ）_６］、９９％）、ＮａＨ_２ＰＯ_４、Ｎａ_２ＨＰＯ_４、ＮａＯＨ（１．０Ｎ）、ＨＣｌ（１．０Ｎ）、ＨＮＯ_３（６９％）、ＫＣｌ、Ａｇａｒ（ｐｏｗｄｅｒ）は、富士フイルム和光純薬株式会社から購入した。純水は超純水製造装置（うるぴゅあ、小松電子株式会社）で調製されたものを利用した。Ａｇ線（０．６ｍｍ）及びＰｔ線（０．７ｍｍ）はＮｉｌａｃｏ社から購入した。ロッド型のＡｕ電極（ＯＤ ６ｍｍ；ＩＤ １．６ｍｍ）やその研磨剤として用いたアルミナスラリー（０．０５μｍ）はＢＡＳから購入し電気化学的特性を観察するために使用した。またガラス基板に Ａｕ／Ｃｒを１００ｎｍ／１０ｎｍの膜厚でスパッタリングされた平板電極（０．２×１．２ｍｍ、Ｋｙｏｗａ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）は膜厚などの物理特性を観察するために用いられた。

【0076】

本実験で使用した１００ｍＭのリン酸緩衝液は、ＮａＨ_２ＰＯ_４とＮａ_２ＨＰＯ_４をそれぞれ２０ｍＭ、８０ｍＭになる量を添加し、ＮａＯＨでｐＨ７．４に調整した。

【0077】

Ａｇ／ＡｇＣｌ電極は、Ａｇ線を４ｃｍ程度の長さに切断したものをアセトンに２０分、メタノールに２０分浸漬し、水で充分洗い流したのちに硝酸に３０分以上浸漬させて均一な銀表面を得た。０．１Ｍに希釈したＨＣｌ中で電気化学アナライザー（ＡＬＳ ６１８Ｅ、ＢＡＳ）を用いて電気分解を行った。

【0078】

ＫＣｌ塩橋は、純水５０ｍＬに１０ｍｇのＫＣｌ及び１．７ｍｇのＡｇａｒを溶かした。ＫＣｌ及びＡｇａｒが全て溶けて溶液が透明になるまで１００℃で攪拌しながら温めた後、マイクロピペットのチップに詰めた。

【0079】

〈１－２．製造方法〉
（１－２．１ 電極等の前処理）
ＮＢＤによる薄膜形成及びその前処理には、電気化学アナライザーを用いた。参照電極にＡｇ／ＡｇＣｌ電極、対極にＰｔ線、作用電極にはＡｕ電極を使用した。薄膜形成の前処理として、ロッド型のＡｕ電極をアルミナスラリーで研磨し、その後、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中にて、ＣＶ法によって、金固有の酸化還元カーブが観測されるまで０．２Ｖ～１．２Ｖの電位範囲を５周、スキャン速度１００ｍＶ／ｓで走査した。

【0080】

平板電極上に薄膜形成をする際の前処理を、アセトンとメタノールを用いて行った。アセトンで３分間超音波洗浄を行い、その後、２０分アセトンに浸漬させた。その後、同様の処理をメタノール下で行った（３分間超音波洗浄、２０分浸漬）。

【0081】

Ａｕ電極のリン酸緩衝溶液中での酸化還元のＣＶ波形から、Ａｕ電極の表面粗さＲａが１．３６８±０．１０６であり、再現性の高いＡｕ電極表面が得られていることが確認できた。

【0082】

（１－２．２ ニトロベンゼンジアゾニウム塩による電極上への薄膜形成）
ＮＢＤによる薄膜形成に、アセトニトリルを溶媒に用いた。支持電解質として、ヘキサフルオロリン酸テトラブチルアンモニウムの濃度が１００ｍＭになるように溶液を調製した。この溶液中にて、ＣＶ法でＮＢＤ修飾前のブランク波形を取った後に、１．０ｍＭのＮＢＤ溶液になるよう調整した。

【0083】

ＮＢＤ溶液中で０．７Ｖ～０．０Ｖの電位範囲を走査し、ＮＢＤをＡｕ電極上に修飾しニトロフェニル薄膜を得た。

【0084】

（１－２．３ ニトロフェニル薄膜のアミノフェニル薄膜への還元及び未反応物質の除去）
ニトロフェニル薄膜をアミノフェニル薄膜へと還元する処理を電気化学的に行った。ＫＣｌを０．１Ｍ含有する水－エタノール溶媒（９：１の体積比）中で－０．９Ｖを９０秒印加して、ニトロフェニル薄膜を還元した。参照電極にＡｇ／ＡｇＣｌ電極、対極にＰｔ線、作用電極には前節で得たニトロフェニル薄膜形成後のＡｕ電極を用いた。

【0085】

また、膜の密度を計算するために、前節で得られたニトロフェニル膜をメタノールで３０分間攪拌し、その後上記のＫＣｌ含有水－エタノール溶液下でＣＶ法を用い０．０Ｖ～ ０．９Ｖの電位範囲で５周行う還元も行った。この際、ＫＣｌ含有水－エタノール溶液は窒素ガスでバブリングを３０分以上行い十分に脱気したものを用い、還元中もバブリングを続けた。

【0086】

アミノフェニル膜への還元後に、メタノール中で超音波洗浄を行った。

【0087】

上記の還元処理及び超音波洗浄によって、薄膜中の物理吸着種、副反応によって生じたジアゾ基を有する、未反応の物質等を除去した。

【0088】

（１－２．４ 連続修飾による薄膜形成（比較例））
上記１－２．２のＣＶ法による電位走査を１０サイクル連続で行って、最後に上記１－２．３の処理を行った。

【0089】

その際のＣＶ波形を図２右図に示す。２サイクル以降で還元電流が大幅に抑制されていたが、これは薄膜による電極の被覆率が上昇し、ＮＢＤをラジカル化させることができなくなったためと考えられる。１０サイクル付近では、還元電流はほとんど流れなかった。

【0090】

（１－２．５ 反復修飾による薄膜形成（実施例））
上記１－２．２及び１－２．３の処理を、３回反復して行った。この際には、同じＮＢＤ溶液中で処理を繰り返し行い、この間にＮＢＤの追加は行わなかった。

【0091】

その際のＣＶ波形を図２左図に示す。２回目の修飾においても非常に大きな還元電流が流れて、より多くのＮＢＤがＡｕ電極からラジカルを受け取り反応したことがわかる。これにより電位走査がＡｕ電極上の物理吸着種の脱離処理として機能していること、さらなる修飾が行われていることがわかる。この一連のニトロフェニル薄膜→アミノフェニル薄膜への電気化学修飾・還元プロセスを繰り返すことにより（反復修飾）アミノフェニル薄膜の密度制御を試みた。図３にこれを模式的に示す。

【0092】

〈１－３．評価方法〉
（１－３．１ アミノフェニル基の定量評価）
ニトロフェニル膜をアミノフェニル膜への還元時の流れた電荷からアミノフェニル膜のアミノ基の数を算出し、その密度を計算した。

【0093】

電極上のニトロフェニル膜からアミノフェニル膜への還元反応は以下の式で表せる：

【0094】

【化3】

【0095】

比較例についてのニトロフェニル膜の還元時のＣＶ波形を図４に示す。１サイクル目において－０．８Ｖ付近に非常に大きな還元ピークを持ち、その後、サイクルを重ねるごとに電流は小さくなり、４サイクルから５サイクルでほとんど変わらないほどまで減衰する。この電流の変化より、上記（１）と（２）の２式が－０．８Ｖの還元に寄与する還元電流とわかる。

【0096】

また、－０．２Ｖ付近の酸化ピークは１サイクル目においては大きいが、それ以降は非常に減衰している。直後の２サイクル目の－０．２５Ｖ付近のピークは１サイクル目には見られないもので、またそれ以降のサイクルにおいても明確なピークは見られない。これは １サイクル目にできた Ａｕ－Ａｒ－ＮＨＯＨがＡｕ－Ａｒ－ＮＯに酸化され、２サイクル目で、これらのことから－０．２５Ｖの還元ピークと－０．２Ｖの酸化ピーク合わせて（３）の酸化還元反応を示すピークと判断できる。

【0097】

これらの反応から還元に用いられた電荷を計算する。４サイクルと５サイクルで変化が非常に乏しかったので、５サイクルで修飾したニトロフェニルがすべてアミノフェニルに還元されたと仮定し、５サイクルのＣＶをブランクとして扱い、その差分の流れた電流について考える。

【0098】

Ａｕ電極付近の未還元のジアゾニウムによるジアゾ結合により修飾されている分子もそのジアゾ結合の還元により膜から脱離してしまうが、今回の計算においては考慮しないで上記（３）式の６電子反応のみが起きていると仮定して、ｉサイクル目(ｉ=１～４)におけるアミノ基へ還元された官能基の面密度Γ_ｉを算出した。算出式は以下の式に記載のとおりである：

【0099】

【数1】

【0100】

ここで、Ｑｉはｉサイクル目に流れた電荷総量、Ｆ はファラデー定数(９．６５＊１０^４Ｃ／ｍｏｌ)、Ａは電極面積（＝０．０２０１ｃｍ^２）をそれぞれ表す。

【0101】

（１－３．２ 薄膜の絶縁性の評価：交流インピーダンス測定）
交流インピーダンスの測定を、非特許文献２等に記載の方法と同様にして行って電荷移動抵抗（Ｒ_ｃｔ）を算出した。

【0102】

すなわち、得られたアミノフェニル膜について、Ｆｅプローブを用いてサイクリックボルタンメトリーと交流インピーダンス測定を行った。１０ｍＭのＫ_３［Ｆｅ（ＣＮ）_６］含有の１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で測定を行った。

【0103】

ＣＶでは１０秒間０．５Ｖ印加してから０．５Ｖ～－０．３Ｖの範囲を１００ｍＶのスキャン速度で波形が安定するまで５周ほど走査した。

【0104】

交流インピーダンス測定において初期電位は未修飾金における［Ｆｅ（ＣＮ）_６］^４－／［Ｆｅ（ＣＮ）_６］^３－プローブの酸化還元電位をＣＶから読み取り、０．２１５Ｖとした。変調電位の振幅を１０ｍＶ，測定周波数の範囲は１０^５～１Ｈｚで行った。

【0105】

（１－３．３ プローブイオン透過性の評価）
プローブイオン（［Ｆｅ（ＣＮ）_６］^３－）を用いたＣＶを行い、各状態での膜の分子透過性を確認した。作製直後のニトロフェニル膜電極、作製したニトロフェニル（ＮＰ）膜をメタノール中で３０分攪拌洗浄した電極、さらに還元後のアミノフェニル（ＡＰ）膜の３つを比較した。

【0106】

〈１－４．結果〉
（１－４．１ アミノフェニル基の定量評価）
比較例及び実施例についてのアミノフェニル基の定量評価の結果を、以下の表１に示す。また、これらの結果を、図５にも示す。なお、表中の単位は、分子／ｎｍ^２である。

【0107】

【表1】

【0108】

比較例１の連続修飾では、１サイクル目でほとんどのニトロ基がアミノ基に還元された。連続修飾をしたことでアミノ基の数は増加しているが、その増加は回数を重ねるごとに減少する傾向がみられた。物理吸着種等の分子による阻害があるため、電極上の薄膜形成に限界があったと考えられる。

【0109】

実施例１の反復修飾では、１回目の反復修飾と２回目の反復修飾の合計Γｉ（＝１４．０１分子／ｎｍ^２）が、比較例１の連続修飾１０サイクルの分子数Γｉ（＝８．９６分子／ｎｍ^２）よりも大きく、より緻密なアミノフェニル膜を作製することができた。

【0110】

実施例１の反復修飾における１回目修飾と２回目修飾の修飾量の差について注目すると、本来Ａｕ電極上において同じ濃度の溶液で修飾した場合、後の修飾回では前に修飾された分子によって電極への修飾を阻害されるため修飾量は減っていくと考えられるが、今回の結果では１回目の修飾よりも２回目、３回目の修飾のほうが、修飾量が大きい。これは、アミノ基の電子供与性が関係していると考えられる。同一ジアゾニウム塩の還元修飾において、電子求核性が高い分子ほどラジカルとの反応性が低く薄い膜ができ、電子供与性が高いほどラジカルとの反応性が高く、比較的厚い膜ができる。今回のアミノフェニル膜に置き換えて考えるとアミノ基の電子供与性によりベンゼン環のオルト位の炭素がプラスに分極している。そのため、ジアゾニウム塩が還元されてできたラジカルを持つＮＢＤが、Ａｕ電極よりも、アミノフェニル膜に優先して結合している可能性があるが考えられる。

【0111】

（１－４．２ 薄膜の絶縁性の評価：交流インピーダンス測定）
０～３回の反復修飾における交流インピーダンス測定のナイキストプロットを図６に示す。また、算出した電荷移動抵抗（Ｒ_ｃｔ）を表２に示す。

【0112】

【表2】

【0113】

この結果から明らかなように、反復回数を指数関数的に電荷移動抵抗が上昇する結果となった。

【0114】

より高密度な膜を作製すると、溶液／電極界面における分子の透過性が失われるため、設計するセンサの目的に沿って、薄膜の製造における反復回数等を変更し、検出対象物質を透過するだけの空隙を薄膜にもたせることが可能になる。

【0115】

（１－４．３ プローブイオン透過性の評価）
プローブイオン透過性を評価した結果を、図７に示す。作製直後のニトロフェニル（ＮＰ）膜は、非常に絶縁的であるが、３０分メタノール中で攪拌した電極においては、その絶縁性が失われ、［Ｆｅ（ＣＮ）_６］^{３－／４－}の酸化還元ピークが検出された。

【0116】

これは還元後のアミノフェニル（ＡＰ）膜のＣＶ波形に類似しており、メタノールで十分に洗浄すればニトロフェニル膜及びアミノフェニル膜の［Ｆｅ（ＣＮ）_６］^３－の透過性は、大きく変わらないということが明らかになった。このことからニトロフェニル膜の作製後の界面、また作製中の界面において、メタノール攪拌で容易に脱離するＮＢＤの物理吸着が起きていると考えられる。

【0117】

比較例１の連続修飾時の修飾分子による阻害は、Ａｕ電極に化学的に結合した分子による阻害と、電極表面上における物理吸着分子による阻害の２種類の阻害が考えられるが、後者による阻害が、１０サイクルも修飾した後であっても非常に大きいことが分かった。実施例１の方法によって製造した場合には、この２つ目の阻害の影響を低下できたことでより密なアミノフェニル膜の作製が可能であったといえる。

【0118】

実験２：フェニルボロン酸（ＰＢＡ）薄膜に関する実験
〈２－１．試薬及び実験器具〉
４－アミノフェニルボロン酸ピナコラートは Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ から購入した。亜硝酸ナトリウム、過ヨウ化酸ナトリウムとテトラヒドロフランは富士フイルム和光純薬株式会社から購入したものを使用し、そのほかの試薬、緩衝液は、実験１と同じものを使用した。

【0119】

〈２－２．製造方法〉
（２－２．１ 電極等の前処理）
４－アミノフェニルボロン酸ピナコラートの修飾及びその前処理には電気化学アナライザーを用いた。参照電極にＡｇ／ＡｇＣｌ電極、対極にＰｔ線、作用電極にはＡｕ電極を使用した。

【0120】

修飾の前処理としてロッド型のＡｕ電極はアルミナスラリーを用いて研磨した。その後、金界面に吸着した分子を脱離するため、０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液中にて、ＣＶ法で－１．６Ｖ～０．７Ｖの電位範囲を１０周、スキャン速度１００ｍＶ／ｓで走査した。その後、エタノール中に３０分以上攪拌洗浄させた後、０．５Ｍの硫酸水溶液にて金固有の酸化還元電位図が見られるまで、０．２Ｖ～１．５Ｖの範囲にて８周程度ＣＶを行った。洗浄後、修飾の際に使用する０．５Ｍの塩酸に浸漬した。また、平板電極上に修飾する際の前処理は、実験１のＮＢＤ修飾前処理と同様に、アセトン、メタノールを用いた。

【0121】

（２－２．２ アミノフェニルボロン酸のジアゾ化）
薄膜の形成前に、まず、冷却０．５Ｍ塩酸溶液中で１．０ｍＭの４－アミノフェニルボロン酸ピナコラートと２．０ｍＭの亜硝酸ナトリウムとを添加し、溶液の色が十分黄色に変化するまで、１０分間攪拌しアミノ基をジアゾ化させた。

【0122】

アミノ基のジアゾ化反応は以下の（４）の式を経て合成される。

【化4】

【0123】

（２－２．３ ＰＢＡ薄膜の形成）
ジアゾニウム塩の還元にはＣＶ法を用い、０．６Ｖ～－０．２Ｖの範囲でスキャン速度５０ｍＶ／ｓで行った。より緻密に薄膜形成するために、５周修飾した後に、実験１と同じＫＣｌ含有水－エタノール溶液下でＣＶ法を０．０Ｖ～０．９Ｖの電位範囲で５周行い、電極表面の物理吸着種の脱離処理を行い、その後に修飾を再度５周行う操作を繰り返した。

【0124】

（２－２．４ ピナコールエステルの脱離）
本実験ではボロン酸同士の反応による環状三量体無水物の形成を防ぐため、薄膜形成時に４－アミノフェニルボロン酸ピナコラートを用いてＰＢＡ薄膜を作製した。そのためボロン酸をジオールレセプターとして機能させるために、２．３の膜作製後にピナコールの脱離処理を行った。

【0125】

ピナコール脱離処理は過ヨウ化酸ナトリウムを５０ｍＭ含有したテトラヒドロフラン－水溶媒（１：４体積比）中で１８時間以上攪拌して行った。ピナコール未脱離の比較としてテトラヒドロフラン－水溶媒にて、過ヨウ化酸ナトリウムを含まずに１８時間以上攪拌を行ったものを対照として用いた。

【0126】

〈２－３．結果〉
（２－３．１ ＰＢＡ薄膜の緻密化）
フェニルボロン酸ピナコラートの修飾ＣＶ波形図を図８に示す。上段の最初の１回目の修飾の１サイクル目で、０．２６Ｖと－０．０１Ｖの付近にブランクには存在しない大きな還元ピークが存在し、このピークが、フェニルボロン酸の還元ピークとわかる。この還元ピークはサイクルを重ねるごとに減衰した。

【0127】

反復修飾におけるそれぞれ２回目、４回目、８回目の修飾波形図を図９に示す。この反復修飾において、その反復回数ｎ回目の１サイクル目の還元電流が、その前の反復回数ｎ－１回目の修飾の５サイクルの還元電流よりも大きい。このことからフェニルボロン酸膜作製においても物理吸着種の脱離に電位走査が有効であることが明らかとなった。

【0128】

（２－３．２ ＰＢＡ薄膜の電気化学特性）
この薄膜の絶縁性を、［Ｆｅ（ＣＮ）_６］^{３－／４－}プローブを用いてＣＶで確認した結果を図１０に示す。

【0129】

反復回数に応じて［Ｆｅ（ＣＮ）_６］^{３－／４－}プローブの酸化還元電流が減少している。これは、薄膜形成（修飾）と物理吸着種の脱離の反復によって、薄膜の緻密性が上昇したことにより絶縁性が上昇したことを意味している。このことからフェニルボロン酸ピナコラートの緻密性制御も、アミノフェニル膜と同様に可能であることが明らかとなった。

【0130】

（２－３．３ ＰＢＡ薄膜のピナコール脱離による特性の変化）
ピナコール脱離処理による膜の導電性の変化を確認した。フェニルボロン酸ピナコラートを連続２サイクル修飾した膜のうち、ピナコール脱離ＰＢＡ薄膜電極とピナコール未脱離ＰＢＡ薄膜電極の交流インピーダンスのナイキストプロットを図１１に比較した。

【0131】

ピナコールエステルを脱離することで電荷移動抵抗が大幅に減少した。このことから膜の密度が大幅に低下したことによって、［Ｆｅ（ＣＮ）_６］^{３－／４－}プローブの透過性が大きく上昇したことが推測できる。このことからフェニルボロン酸ピナコラート膜の［Ｆｅ（ＣＮ）_６］^{３－／４－}プローブの透過性は、ピナコールによる立体障害の効果が大きいということが分かった。このことから、フェニルボロン酸の修飾において、ピナコールの脱離が大きな影響を与えうることも示唆された。

【0132】

実験３：フェニルホスフォリルコリン（ＰＰＣ）薄膜に関する実験
〈３－１．試薬及び実験器具〉
４－アミノフェニルホスフォリルコリン（ＰＰＣ）はコスモ・バイオ株式会社から、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は富士フイルム和光純薬株式会社から購入した。そのほかの試薬、緩衝液は、実験１と同じものを使用した。

【0133】

〈３－２．製造方法〉
（３－２．１ 電極前処理、及び４－アミノフェニルホスフォリルコリンのジアゾ化）
実験２と同様の電極前処理等を行った。薄膜を形成する前に、冷却０．５Ｍ塩酸溶液中で１．０ｍＭのＰＰＣと２．０ｍＭの亜硝酸ナトリウムを添加し、１０分間攪拌して、４－アミノフェニルホスフォリルコリンのアミノ基をジアゾ化した。

【0134】

（３－２．２ ＰＰＣ薄膜の形成）
電極上での薄膜形成及び物理吸着種脱離による影響を観察するために、ＣＶ反復修飾を行った。１０サイクル修飾した後に、実験２と同じくＫＣｌ含有水－エタノール溶液下でのＣＶ法を用い、表面物理吸着種の脱離処理を行った。その後、修飾を繰り返す手法を用いた。

【0135】

また、薄膜の特性の調査には、より緻密に作製したものを用いるために、後述するＰＰＣジアゾニウム塩の還元電位（＝－０．３５Ｖ）で電位を３分間固定し還元して修飾を行った。

【0136】

表面物理吸着種の脱離にはメタノールで３分間、純水で１分間超音波洗浄を行った。平板電極上に修飾する際の前処理は実験１及び２と同じくアセトン、メタノールを用いた。

【0137】

〈３－３．評価方法〉
（３－３．１ ＰＰＣ薄膜の接触角測定）
Ａｕ電極表面にＰＰＣ薄膜が形成したことを確認するために、接触角を測定した。溶媒には純水を、測定には接触角測定器（ＤＳＡ ２５，ＫＲＵｅＳＳ ＧｍｂＨ）を用いた。この測定には、ＰＰＣはＣＶでのジアゾニウム塩還元修飾時の還元ピークである－０．３５Ｖでの３分間の修飾、及び超音波洗浄による表面物理吸着種の脱離を繰り返す反復修飾を５回行った平板電極を用いた。

【0138】

（３－３．２ ＰＰＣ薄膜のＨＳＡ浸漬時の交流インピーダンス測定）
反復修飾によって作製した膜をＨＳＡ溶液に浸漬し、［Ｆｅ（ＣＮ）_６］^{３－／４－}プローブを用いて交流インピーダンス測定を行いＰＣ基によるアンチファウリング効果を調査した。測定は、実験１と同じ条件で行った。

【0139】

試験に使用した電極は、未修飾のＡｕ電極、アミノフェニル（ＡＰ）薄膜を備えたＡｕ電極、及びＰＰＣ薄膜を備えたＡｕ電極であり、これらの修飾量を制御して比較した。具体的には、ＡＰ薄膜を備えたＡｕ電極は、実験１での反復修飾を１回行ったものと２回行ったものを用いた。ＰＰＣを備えたＡｕ電極については、ＣＶでのジアゾニウム塩還元修飾時の還元ピークである－０．３５Ｖでの３分間の修飾、及び超音波洗浄を繰り返す反復修飾を１回だけ行ったものと、５回行ったものと、連続で３０分間修飾しただけのものとを比較した。

【0140】

測定後に、０．１ｍｇ／ｍＬ、１．０ｍｇ／ｍＬ、及び１０ｍｇ／ｍＬのＨＳＡ含有の１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に１０分間浸漬後、純水中で軽く洗浄して、その後ＣＶ・交流インピーダンス測定で用いる溶液に１０分間浸漬させた後に測定を行った。

【0141】

（３－３．３ ＰＰＣ薄膜の生体分子に対するＦＥＴ応答）
体液を用いて生体分子をセンシングする際には、体液中のタンパク質による電極への付着の影響や電気信号を抑える必要がある。そのため、作製したＰＰＣ膜に対してＨＳＡを添加して、Ａｕ電極のＦＥＴ応答を確認した。

【0142】

未修飾の金、及び２種類のＰＰＣ薄膜（３分間の連続修飾ＰＰＣ薄膜（比較例）、３分間修飾と超音波洗浄を５回反復修飾した反復修飾ＰＰＣ薄膜（実施例））に対して行った。

【0143】

具体的には、ｎ－ｃｈａｎｎｅｌ ｊｕｎｃｔｉｏｎ－ｔｙｐｅＦＥＴ（Ｋ２４６－Ｙ９Ａ，Ｔｏｓｈｉｂａ）のゲート電極を、修飾Ａｕ電極と接続し、ゲート電圧はＡｇ／ＡｇＣｌ電極でＫＣｌ塩橋を通して印加した。

【0144】

ゲート電位は、ＦＥＴ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（ＰＲＯＶＩＧＡＴＥ Ｉｎｃ．）を使用してターゲットの添加とともにリアルタイムで記録した。

【0145】

ゲート電位は、ソースフォロワー回路（図１２）を用いて、ソース電位の変化とゲート電位の変化を等しくすることで測定した。ゲート電位ＶＧ＝２．５Ｖ、ドレイン電圧ＶＤ＝４．９５Ｖを測定中印加した。

【0146】

ガラスセル中の２３ｍＬの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に修飾Ａｕ電極を浸漬し、攪拌環境下でゲート電位を測定した。界面の状態を安定させるためにゲート電位をかけた後２時間程静置し、表面電位が安定したところで測定を開始した。

【0147】

添加したＨＳＡ濃度は、１μｇ／ｍＬ～１００ｍｇ／ｍＬで、それぞれ添加後に電極を浸漬している溶液が１０ｎｇ／ｍＬ～１ｍｇ／ｍＬになるように添加量を調整した。

【0148】

また、タンパク質の電極表面への吸着を抑制する効果によるＦＥＴ応答への影響を確認すべく、ＨＳＡ環境下におけるノルエピネフリン添加ＦＥＴ測定を行った。ＨＳＡ１．０ｍｇ／ｍＬ含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を用いてノルエピネフリンを添加してＦＥＴ測定を行った。

【0149】

〈３－４．結果〉
（３－４．１ ＰＰＣ薄膜形成時のＣＶ波形）
ＰＰＣ薄膜の作製時のＣＶ波形を、図１３及び図１４に示す。０．０５Ｖ付近と－０．３６Ｖ付近にブランクにはない２つの還元ピークが見られた。電位を固定して修飾する際の電位はこの２つ目のピークである－０．３５Ｖで行った。

【0150】

図１３は、２０サイクル連続修飾したＣＶ波形である。ＮＢＤやフェニルボロン酸ピナコラートの修飾と比較して２サイクル目での修飾量が大きく抑制されていないことや、他のジアゾニウム塩の還元電位（ＮＢＤ：０．４８Ｖ、０．２５Ｖ、フェニルボロン酸ピナコラート：０．２６Ｖ、－０．０１Ｖ）に比べて、フェニルホスフォリルコリン由来のジアゾニウム塩の還元電位が低いことから、ＰＰＣ薄膜の前駆体は、他のジアゾニウム塩に比べて反応性が低いことがわかる。

【0151】

修飾後に表面物理吸着種の脱離処理を行った修飾波形の変遷を、図１４に示す。１０サイクル修飾をして、５サイクル表面物理吸着種の脱離ＣＶを行うプロセス行い、それぞれ左から２回目、５回目、１０回目の修飾波形を描画した。フェニルホスフォリルコリンの修飾においてもＮＢＤやフェニルボロン酸ピナコラートと同様に、物理吸着種の脱離によりＡｕ電極への修飾量を制御できることが確認された。

【0152】

（３－４．２ ＰＰＣ薄膜の接触角測定）
接触角測定結果を図１５に示す。Ａｕ電極上は、疎水性が高いにもかかわらず、ＰＰＣ薄膜を有する電極は、非常に低い接触角を示し、非常に高い親水性を示した。これは、ＰＰＣのもつＰＣ基による非常に高い親水性によるもので、ＰＰＣが電極上に修飾できたことをこの物理特性からも示している。

【0153】

（３－４．３ ＰＰＣ薄膜のＨＳＡ浸漬時の交流インピーダンス測定）
交流インピーダンス測定の結果から計算した電荷移動抵抗（Ｒ_ｃｔ）を図１６に示す。ＰＰＣ膜のＨＳＡ溶液浸漬前において、３分間修飾した電極は、５０．４±１５．５Ω・ｃｍ^２であり、３０分間修飾した電極は、３５．９Ω・ｃｍ^２と、それほど差はないが、３分の修飾を５回繰り返した膜のＲ_ｃｔは、２１２±９７．７Ω・ｃｍ^２と前述のＰＰＣ膜に比べると非常に大きい値になった。

【0154】

これにより、ＰＰＣのような反応性の低い分子においても、他のジアゾニウム塩を還元修飾した膜と同じく、膜の修飾量を密に制御する際には修飾時間ではなく、表面の物理吸着種の脱離が重要であることが明らかになった。

【0155】

ＨＳＡの添加によって、未修飾のＡｕ電極及びＡＰ薄膜電極は、Ｒ_ｃｔが増加した。これは各電極表面にＨＳＡが非特異吸着し、溶液／電極界面での分子（［Ｆｅ（ＣＮ）_６］^{３－／４－}）の透過性が著しく低下したことが原因であると考えられる。

【0156】

ＡＰ膜のほうがＲ_ｃｔの上昇が大きい理由として、表面の電荷があげられる。ｐＨ７．４においてＨＳＡはマイナスに、アミノ基はプラスに帯電していると考えられるため、界面でタンパク質とアミノフェニル基が、静電的な相互作用でタンパク質が吸着したと考えられる。

【0157】

一方、ＰＰＣ薄膜電極ではＨＳＡ濃度に関わらず、他の電極と比較してＲ_ｃｔの増加が抑制された。特に、反復修飾を５回行った密度のより高いＰＰＣ薄膜は、その抑制効果が非常に大きかった。

【0158】

５回反復修飾を行ったＰＰＣ膜の、１ｍｇ／ｍＬのＨＳＡ溶液浸漬後のＲ_{ｃｔ，ＨＳＡ１．０}とＨＳＡ溶液浸漬前のＲ_{ｃｔ，ＨＳＡ０．０}を比較したｒ（＝Ｒ_{ｃｔ，ＨＳＡ１．０}／Ｒ_{ｃｔ，ＨＳＡ０．０}）は１．１であり、Ａｕ電極の２６３．６、２回反復修飾を行ったＡＰ膜の４４．４と比較して非常に低い値であった。ＰＰＣの修飾によってタンパク質による電極への影響、つまり表面への非特異吸着による他分子による膜の透過性への影響を大きく抑制することができた。

【0159】

また、Ａｕ電極上におけるこの値は、非特許文献３におけるチオールを利用したＳＡＭの絶縁性の高い膜と並ぶほどの値でありながら、ジアゾニウム塩の還元でできた多層膜であるがゆえに分子の透過性も兼ね備えている。このことからＰＰＣは、ナノフィルター界面におけるアンチファウリング効果を期待できる分子として用いられることが期待できることが分かった。

【0160】

（３－４．４ ＰＰＣ薄膜の生体分子に対するＦＥＴ応答）
ＰＰＣ薄膜の生体分子に対するＦＥＴ応答の結果を図１７に示す。

【0161】

ＰＰＣ薄膜については、未修飾の金よりもＨＳＡによる応答が小さくなっている。比較例の連続修飾ＰＰＣ薄膜は、約０．６倍の抑制であったが、実施例の反復修飾ＰＰＣ薄膜では、約０．３倍に抑制することができた。また、緻密な膜であればあるほど、ＨＳＡの電極表面への非特異吸着を抑制できることが分かった。

【0162】

ＨＳＡそのものによる電気信号は、ＰＰＣの修飾によって抑制されても、その程度は膜の疎密と相関はなかった。これらのことから、ＰＰＣ薄膜を緻密に形成することで［Ｆｅ（ＣＮ）_６］^{３－／４－}プローブへの影響をより少なくできるが、ＨＳＡそのものによる信号は抑制されないことが示唆された。

【0163】

タンパク質の電極表面への吸着を抑制する効果によるＦＥＴ応答への影響を確認するために行った、ＨＳＡ環境下におけるノルエピネフリン添加ＦＥＴ測定の結果を図１８に示す。

【0164】

まず未修飾のＡｕ電極において、ＨＳＡ非存在下では非常に大きな応答が出たのに対して、ＨＳＡ環境下では同じ濃度のノルエピネフリンによる応答でも、その半分以下しか応答しなかった。これは、ＨＳＡが電極表面に非特異吸着を起こし、ノルエピネフリンの電極表面への移動が抑制されている結果であると考えられる。

【0165】

ＰＰＣの応答を確認すると、同じくＨＳＡ環境下でのノルエピネフリンの測定であるのにも関わらず、ＨＳＡ非存在下未修飾のＡｕ電極の応答よりは小さいがＨＳＡ存在下未修飾のＡｕ電極のノルエピネフリン応答に比べると大きな応答である。これはＡｕ電極上に修飾したＰＰＣにより、電極表面のＨＳＡの吸着を抑制した結果といえ、［Ｆｅ（ＣＮ）_６］^{３－／４－}プローブを用いた交流インピーダンス測定の結果と一致する。

【0166】

これらの結果からＰＰＣの修飾によるアンチファウリング効果と、実際に生体分子のセンシングの成功例を示せた。

【0167】

実験４：ＰＢＡ／ＰＰＣ混合薄膜に関する実験
〈４－１．試薬及び実験器具〉
実験１～３に記載の試薬及び実験器具を用いた。

【0168】

〈４－２．製造方法〉
ＰＰＣ／ＰＢＡ混合薄膜を作成した。まず、実験２と同じように、フェニルボロン酸ピナコラートをＣＶで２サイクル修飾し、その後ピナコール脱離処理を行い、ボロン酸の保護を脱離した。そのようにして作製したＰＢＡ薄膜に、実験３と同様に、３分間電位を－０．３５Ｖ（ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ）固定してＰＰＣを修飾した後、メタノール及び／又は水による洗浄を行う操作を５回反復してＰＰＣ／ＰＢＡ混合薄膜を作製した。

【0169】

〈４－３．評価方法〉
（４－３．１ 交流インピーダンス測定）
上記実験と同様のＦｅ［（ＣＮ）_６］^{３－／４－}プローブを用いて、ＣＶと交流インピーダンス測定を用いた。測定は、前述の条件と同じ条件で行った。また、アンチファウリング効果を確認するために実験３で行ったＨＳＡ浸漬によるインピーダンスの変化測定を、ＰＰＣ修飾前のＰＢＡ薄膜と、ＰＰＣ修飾後のＰＰＣ／ＰＢＡ混合薄膜に行った。これらの結果から、電荷移動抵抗Ｒ_ｃｔを得た。

【0170】

（４－３．２ ノルエピネフリンＦＥＴ応答）
ノルエピネフリンを、実験３と同じ条件で添加し、ＰＰＣ／ＰＢＡ混合薄膜等のＦＥＴ応答を測定した。測定には１００ｎＭ～３１６ｍＭのノルエピネフリンを５分ごとに添加し、電極と反応する溶液の濃度が１ｎＭ～３．１６ｍＭと５分ごとに１０^１／２倍に調製した。

【0171】

〈４－４．結果〉
（４－４．１ 交流インピーダンス測定）
交流インピーダンス測定から得られた電荷移動抵抗Ｒ_ｃｔの結果を図１９に示す。

【0172】

ＰＰＣ修飾前のＰＢＡ薄膜とＰＰＣ／ＰＢＡ混合薄膜のＨＳＡ非存在下のＲ_ｃｔについて比較すると、ＰＰＣ／ＰＢＡ混合薄膜のほうがＰＢＡ薄膜に比べてＲ_ｃｔが大きい。この結果からＰＢＡに比べてＰＰＣ／ＰＢＡ混合薄膜のほうがＦｅ［（ＣＮ）_６］^{３－／４－}プローブの透過性が減少した、つまりＰＢＡの単体薄膜に比べてさらに物理的に薄膜が修飾されていることが示された。

【0173】

そのうえでＨＳＡ浸漬時のＲ_ｃｔの変化に注目すると、ＰＢＡ薄膜はＨＳＡの浸漬によってＲ_ｃｔが大きく変化しているのに対し、ＰＰＣ／ＰＢＡ混合薄膜においては、ほとんどＨＳＡの濃度に関係なく、Ｒ_ｃｔは変化していないという結果になった。これらのことから、実験３で説明したＰＰＣによるアンチファウリング効果は、混合薄膜においても発揮されることが明らかとなった。

【0174】

ジアゾニウム塩の前駆体を順に層形成（修飾）することによる薄膜の多機能化の従来技術においては、薄膜の構成分子の密度制御の観点からラジカル生成時のジアゾニウム塩還元電位の高低から修飾の順番を決めて修飾を行っていた。そのため ＰＰＣを先に修飾した後に他の前駆体を修飾するという手法を用いて、薄膜の構成物質の制御を達成していた。

【0175】

しかしながら、ナノフィルター界面の設計を考えるのであれば、ＰＰＣのアンチファウリング効果を最大限発揮するには、ＰＰＣは、薄膜の最表面に存在すべきであり、ＰＰＣの修飾（層形成）は最後に行われるべきである。未反応物質等の表面物理吸着種の脱離処理を行う反復修飾によって、この還元電位の差による修飾順の制限を克服することができたことは、非常に有利である。

【0176】

図２０に、図１６と図１９の結果を並べて示す。

【0177】

ＨＳＡを含まない溶液に浸漬した場合（非特異吸着の影響は考えない）、同じＰＰＣ薄膜においても３０ｍｉｎの連続修飾した薄膜と電気化学修飾を３ｍｉｎとした反復修飾を５回行なった薄膜とを比較すると、後者の薄膜のほうがＲ_ｃｔが大きく、より高密度のＰＰＣ薄膜が形成されていることがわかる。これは非特許文献３により報告されたＰＰＣ薄膜のＲ_ｃｔより大きく、本修飾法にてＰＰＣ薄膜の密度制御の幅が広がったといえる。

【0178】

さらに、ＨＳＡの添加により、未修飾のＡｕ電極、ＡＰ薄膜電極、ＰＢＡ薄膜電極のように各電極表面にＨＳＡが非特異吸着し、溶液／電極界面での分子の透過性が著しく低下、すなわちＦｅ［（ＣＮ）_６］^{３－／４－}の移動抵抗が増加したものと考えられる。

【0179】

一方、ＰＰＣ薄膜電極ではＨＳＡ濃度に関わらず、他の電極と比較してもＲ_ｃｔの増加が抑制されていることがわかる。特に、より密度の高いＰＰＣ薄膜ほどその抑制効果は大きい結果となった（ＰＰＣ ３ｍｉｎ＊５：ＰＰＣを５回反復修飾する際の１回あたりのＰＰＣ修飾に３ｍｉｎ要した）。さらに、ＰＰＣ／ＰＢＡ混合薄膜においてもＰＢＡ薄膜では得られなかったアンチファウリング効果が明らかとなった（ＰＰＣの効果）。

【0180】

（４－４．２ ノルエピネフリンＦＥＴ応答）
ＰＰＣ／ＰＢＡ混合薄膜のノルエピネフリンに対するＦＥＴ応答の結果を、図２１に示す。ＰＰＣを修飾してもなおノルエピネフリンの透過性を持ち、未修飾の金と同様な生体分子のセンシングが可能であることが明らかとなった。

【0181】

反応性の低いＰＰＣを、他のジアゾニウム薄膜（ＰＢＡ薄膜）上に修飾したとしても、ノルエピネフリンの透過性を保つことができ、ＦＥＴによる測定が可能であった。

【0182】

以上、本開示の幾つかの実施形態及び実施例について説明したが、これらの実施形態及び実施例は、本開示を例示的に説明するものである。例えば、上記各実施形態は本開示を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必要に応じて寸法、構成、材質、回路を追加変更してもよい。なお、上記に挙げた本開示の一または複数の特徴を任意に組み合わせた実施形態も本開示の範囲に含まれる。特許請求の範囲は、本開示の技術的思想から逸脱することのない範囲で、実施形態に対する多数の変形形態を包括するものである。したがって、本明細書に開示された実施形態及び実施例は、例示のために示されたものであり、本開示の範囲を限定するものと考えるべきではない。

【符号の説明】

【0183】

１０ バイオセンサ
１１ センシング部
１２ 電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）
２１ ゲート電極
２２ 薄層
２３ 容器
２４ 参照電極
３２ 金属電極
３３ ゲート絶縁膜
３４ ソース電極
３５ ドレイン電極
３６ 金属線（配線）
３７ 電源
３８ 電流計

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】