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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-08-14
(45)【発行日】2024-08-22
(54)【発明の名称】培養液を用いたヒト多能性幹細胞の品質管理技術
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/04 20060101AFI20240815BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20240815BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20240815BHJP
C12N 5/10 20060101ALN20240815BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/04
C12N15/12
G01N33/53 V
C12N5/10
【請求項の数】
22
(21)【出願番号】P 2022529759
(86)(22)【出願日】2021-06-11
(86)【国際出願番号】 JP2021023128
(87)【国際公開番号】W WO2021251507
(87)【国際公開日】2021-12-16
【審査請求日】2023-01-12
(31)【優先権主張番号】P 2020102063
(32)【優先日】2020-06-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 ウェブサイトの掲載日： 令和２年７月１５日 ウェブサイトのアドレス： ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｓｃｉｅｎｃｅｄｉｒｅｃｔ．ｃｏｍ／ｓｃｉｅｎｃｅ／ａｒｔｉｃｌｅ／ａｂｓ／ｐｉｉ／Ｓ０００６２９１Ｘ２０３１２９１２ 公開者名： 渡邊 朋子、齊藤 佐代子、比江森 恵子、清井 佳代、回渕 修治、原本 悦和、舘野 浩章 ウェブサイトの掲載日： 令和３年３月２５日 ウェブサイトのアドレス： ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｓｃｉｅｎｃｅｄｉｒｅｃｔ．ｃｏｍ／ｓｃｉｅｎｃｅ／ａｒｔｉｃｌｅ／ａｂｓ／ｐｉｉ／Ｓ０００６２９１Ｘ２１００４６９１？ｖｉａ％３Ｄｉｈｕｂ 公開者名： 渡邊 朋子、舘野 浩章
(73)【特許権者】
【識別番号】301021533
【氏名又は名称】国立研究開発法人産業技術総合研究所
(74)【代理人】
【識別番号】230104019
【弁護士】
【氏名又は名称】大野 聖二
(74)【代理人】
【識別番号】100119183
【弁理士】
【氏名又は名称】松任谷 優子
(74)【代理人】
【識別番号】100149076
【弁理士】
【氏名又は名称】梅田 慎介
(74)【代理人】
【識別番号】100144794
【弁理士】
【氏名又は名称】大木 信人
(72)【発明者】
【氏名】渡邊 朋子
(72)【発明者】
【氏名】舘野 浩章
(72)【発明者】
【氏名】回渕 修治
(72)【発明者】
【氏名】原本 悦和
【審査官】大久保 智之
(56)【参考文献】
【文献】Stem Cells，2013年06月14日，Vol.31，pp.2084-2094
【文献】Biochemical and Biophysical Research Communications，2020年07月15日，Vol.529，pp.575-581
【文献】Biochemical and Biophysical Research Communications，2021年03月25日，Vol.554，pp.13-18
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｑ １／０４
Ｃ１２Ｎ １５／１２
Ｇ０１Ｎ ３３／５３
Ｃ１２Ｎ ５／１０
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒト多能性幹細胞の未分化性を判定又は評価する方法であって、ヒト多能性幹細胞の培養液中のＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチンを検出、又は測定する工程を含み、ただし、前記ヒト多能性幹細胞は、ヒト受精卵及びヒト胚を含まない、方法。
【請求項2】
前記ヒト多能性幹細胞の培養液中のＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチンを検出、又は測定する工程を、ＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチンを認識する一又は複数のプローブを用いて行う、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記プローブが、（ａ）ＳＳＥＡ－１をエピトープとして認識するプローブ、及び（ｂ）フィブロネクチンを認識するプローブを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記プローブが、抗体又はそのフラグメントである、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項5】
前記ヒト多能性幹細胞の培養液中のＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチンを検出、又は測定する工程を、サンドイッチアッセイ法により行う、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
ヒト多能性幹細胞の未分化性を判定又は評価する方法において使用するためのキットであって、ＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチンを認識する一又は複数のプローブを含む、キット。
【請求項7】
前記プローブが、（ａ）ＳＳＥＡ－１をエピトープとして認識するプローブ、及び（ｂ）フィブロネクチンを認識するプローブを含む、請求項６に記載のキット。
【請求項8】
前記プローブが、抗体又はそのフラグメントである、請求項６又は７に記載のキット。
【請求項9】
基板に固定化されている前記プローブ、及び標識化されている前記プローブを含み、基板に固定化されている前記プローブと標識化されている前記プローブとは異なる、請求項６～８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項10】
ヒト多能性幹細胞の品質を管理する方法であって、ヒト多能性幹細胞の培養液中のＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチンを検出、又は測定する工程を含み、ただし、前記ヒト多能性幹細胞は、ヒト受精卵及びヒト胚を含まない、方法。
【請求項11】
前記ヒト多能性幹細胞の培養液中のＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチンを検出、又は測定する工程を、ＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチンを認識する一又は複数のプローブを用いて行う、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記プローブが、（ａ）ＳＳＥＡ－１をエピトープとして認識するプローブ、及び（ｂ）フィブロネクチンを認識するプローブを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記プローブが、抗体又はそのフラグメントである、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項14】
前記ヒト多能性幹細胞の培養液中のＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチンを検出、又は測定する工程を、前記プローブを用いたサンドイッチアッセイ法により行う、請求項１０～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
さらに、培養液中にＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチンが検出された培養物より、ＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチン陽性細胞を除去する工程を含む、請求項１０～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
前記ＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチン陽性細胞を除去する工程が、前記細胞とＩＲ７００で標識されたＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチンを認識する一又は複数のプローブとを結合させた後、近赤外線（Ｎｅａｒ－Ｉｎｆｒａｒｅｄ：ＮＩＲ）照射を行うことを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
ヒト多能性幹細胞の品質を管理する方法において使用するためのキットであって、ＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチンを認識する一又は複数のプローブを含む、キット。
【請求項18】
前記プローブが、（ａ）ＳＳＥＡ－１をエピトープとして認識するプローブ、及び（ｂ）フィブロネクチンを認識するプローブを含む、請求項１７に記載のキット。
【請求項19】
基板に固定化されている前記プローブ、及び標識化されている前記プローブを含み、基板に固定化されている前記プローブと標識化されている前記プローブとは異なる、請求項１７又は１８に記載のキット。
【請求項20】
さらに、ＩＲ７００で標識されたＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチンを認識する一又は複数のプローブを含む、請求項１７～１９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項21】
前記プローブが、ＩＲ７００で標識されたＳＳＥＡ－１をエピトープとして認識するプローブ、及びＩＲ７００で標識されたフィブロネクチンを認識するプローブを含む、請求項２０に記載のキット。
【請求項22】
前記プローブが、抗体又はそのフラグメントである、請求項１７～２１のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は培養液を用いて、ヒト多能性幹細胞の未分化性を判定又は評価する方法、及び、ヒト多能性幹細胞の品質を管理する方法、ならびに、それらの方法に用いられるキットに関する。
【背景技術】
【0002】
再生医療とは、機能が損なわれた組織、臓器に対し、自己あるいは他人から採取した多能性幹細胞、又はそれら細胞から分化させた細胞を移植して補い、組織の再構築や臓器の再生を行う医療である。近年、薬物治療等の対症療法しかない疾病に対しても根本的な修復と再生が可能な医療として、大きな期待が寄せられている。
【0003】
胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や人工の多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等の多能性幹細胞は、未分化性を保持し、様々な細胞（例えば、肝細胞や心筋細胞等）へと分化誘導することができるため、再生医療における移植用細胞の供給源として期待されている。ただし医療で実際に使用されるためには、ヒト多能性幹細胞から同じ品質の移植用細胞が再現性よく作製できることが必須である。そのためには、細胞源であるヒト多能性幹細胞の品質が安定していること（言い換えれば、未分化性が維持されていること）が重要となる。しかしながら、ヒト多能性幹細胞は継代や操作によりその性質はたやすく変化してしまうため、未分化性を維持することは容易ではない。このため、ヒト多能性幹細胞の未分化性を判定又は評価することはその品質を管理する上で極めて重要といえる。
【0004】
従来、ヒト多能性幹細胞の未分化性の判定又は評価は、顕微鏡下で観察した細胞中に、形態の変化した分化の進んだ細胞を見出すことにより行われていた。しかしこの場合、分化の進んだ細胞を見出すことは容易ではなく、またどの程度そのような細胞が混入しているのか定量的に評価することは困難であった。
【0005】
また、ヒト多能性幹細胞の未分化性を示すマーカー（例えば、Ｏｃｔ３／４、ｒＢＣ２－ＬＣＮ、ＳＳＥＡ－４、Ｎａｎｏｇ、ＳＯＸ２、ｃ－Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、Ｌｉｎ２８、ＴＲＡ－１－６０、ＴＲＡ－１－８１等）、ならびに分化の進んだ細胞において発現が認められるマーカー（例えば、ＳＳＥＡ－１等）が知られており（非特許文献１，２）、これらマーカー発現の有無をフローサイトメーターや免疫染色等を用いて確認し、ヒト多能性幹細胞の未分化性を評価することができる。しかしこの場合、ヒト多能性幹細胞において発現しているマーカーを検出するために、細胞を回収する煩雑な工程が必須であるばかりでなく、本来移植治療に用いるための貴重なヒト多能性幹細胞を検査で使用してしまうという問題点があった。
【0006】
そのため当該分野においては、ヒト多能性幹細胞の未分化性を簡便かつ効率的に、かつ非侵襲的に評価することを可能とする新たな手法の確立が切望されていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0007】
【文献】Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２００９ Ｊｕｌ；３（１）：３－１１
【文献】Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２００４；２２（５）：６５９－６８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明は、従来行なわれていたヒト多能性幹細胞の未分化性を判定又は評価する方法における上記課題を解決し、簡便かつ効率的に、かつ非侵襲的にヒト多能性幹細胞の未分化性を判定又は評価することを可能とする新たな方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、未分化性が低下した細胞を含むヒト多能性幹細胞の培養液中にはフィブロネクチン、又はＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチンが含まれ、また、未分化性が低下した細胞の割合と培養液中のフィブロネクチン、又はＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチンの量は相関していることを見出した。そして、ヒト多能性幹細胞の培養液中に含まれるフィブロネクチン、又はＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチンを検出、又は測定することにより、ヒト多能性幹細胞の未分化性を判定又は評価できること、さらに、当該判定又は評価の結果に基づいて、ヒト多能性幹細胞の品質を管理できることを見出した。そして、フィブロネクチン陽性細胞を標的として除去することによって、未分化性が低下した細胞を選択的に除去することが可能であり、ヒト多能性幹細胞の品質を管理できることを見出した。
【0010】
本発明はこれらの知見に基づくものであり、以下の発明を包含する。
［１］ ヒト多能性幹細胞の未分化性を判定又は評価する方法であって、
ヒト多能性幹細胞の培養液中のフィブロネクチンを検出、又は測定する工程を含む、方法。
［２］ 前記ヒト多能性幹細胞の培養液中のフィブロネクチンを検出、又は測定する工程を、フィブロネクチンを認識する一又は複数のプローブを用いて行う、［１］の方法。
［３］ 前記ヒト多能性幹細胞の培養液中のフィブロネクチンが、ＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチンであり、
前記プローブが、（ａ）ＳＳＥＡ－１をエピトープとして認識するプローブ、及び（ｂ）フィブロネクチンを認識するプローブを含む、［２］の方法。
［４］ 前記プローブが、抗体又はそのフラグメントである、［２］又は［３］の方法。
［５］ 前記ヒト多能性幹細胞の培養液中のフィブロネクチンを検出、又は測定する工程を、サンドイッチアッセイ法により行う、［１］～［４］のいずれかの方法。
［１］ ヒト多能性幹細胞の未分化性を判定又は評価する方法であって、
ヒト多能性幹細胞の培養液中のフィブロネクチンを検出、又は測定する工程を含む、方法。
［２］ 前記ヒト多能性幹細胞の培養液中のフィブロネクチンを検出、又は測定する工程を、フィブロネクチンを認識する一又は複数のプローブを用いて行う、［１］の方法。
［３］ 前記ヒト多能性幹細胞の培養液中のフィブロネクチンが、ＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチンであり、
前記プローブが、（ａ）ＳＳＥＡ－１をエピトープとして認識するプローブ、及び（ｂ）フィブロネクチンを認識するプローブを含む、［２］の方法。
［４］ 前記プローブが、抗体又はそのフラグメントである、［２］又は［３］の方法。
［５］ 前記ヒト多能性幹細胞の培養液中のフィブロネクチンを検出、又は測定する工程を、サンドイッチアッセイ法により行う、［１］～［４］のいずれかの方法。
【0011】
［６］ ヒト多能性幹細胞の未分化性を判定又は評価する方法において使用するためキットであって、フィブロネクチンを認識する一又は複数のプローブを含む、キット。
［７］ 前記フィブロネクチンが、ＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチンであり、
前記プローブが、（ａ）ＳＳＥＡ－１をエピトープとして認識するプローブ、及び（ｂ）フィブロネクチンを認識するプローブを含む、［６］のキット。
［８］ 前記プローブが、抗体又はそのフラグメントである、［６］又は［７］のキット。
［９］ 基板に固定化されている前記プローブ、及び標識化されている前記プローブを含み、基板に固定化されている前記プローブと標識化されている前記プローブとは異なる、［６］～［８］のいずれかのキット。
［７］ 前記フィブロネクチンが、ＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチンであり、
前記プローブが、（ａ）ＳＳＥＡ－１をエピトープとして認識するプローブ、及び（ｂ）フィブロネクチンを認識するプローブを含む、［６］のキット。
［８］ 前記プローブが、抗体又はそのフラグメントである、［６］又は［７］のキット。
［９］ 基板に固定化されている前記プローブ、及び標識化されている前記プローブを含み、基板に固定化されている前記プローブと標識化されている前記プローブとは異なる、［６］～［８］のいずれかのキット。
【0012】
［１０］ ヒト多能性幹細胞の品質を管理する方法であって、
ヒト多能性幹細胞の培養液中のフィブロネクチンを検出、又は測定する工程を含む、方法。
［１１］ 前記ヒト多能性幹細胞の培養液中のフィブロネクチンを検出、又は測定する工程を、フィブロネクチンを認識する一又は複数のプローブを用いて行う、［１０］の方法。
［１２］ 前記ヒト多能性幹細胞の培養液中のフィブロネクチンが、ＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチンであり、
前記プローブが、（ａ）ＳＳＥＡ－１をエピトープとして認識するプローブ、及び（ｂ）フィブロネクチンを認識するプローブを含む、［１１］の方法。
［１３］ 前記プローブが、抗体又はそのフラグメントである、［１１］又は［１２］の方法。
［１４］ 前記ヒト多能性幹細胞の培養液中のフィブロネクチンを検出、又は測定する工程を、前記プローブを用いたサンドイッチアッセイ法により行う、［１０］～［１３］のいずれかの方法。
［１５］ さらに、培養液中にフィブロネクチンが検出された培養物より、フィブロネクチン陽性細胞を除去する工程を含む、［１０］～［１４］のいずれかの方法。
［１６］ 前記フィブロネクチン陽性細胞を除去する工程が、前記細胞とＩＲ７００で標識されたフィブロネクチンを認識する一又は複数のプローブとを結合させた後、近赤外線（Ｎｅａｒ－Ｉｎｆｒａｒｅｄ：ＮＩＲ）照射を行うことを含む、［１５］の方法。
ヒト多能性幹細胞の培養液中のフィブロネクチンを検出、又は測定する工程を含む、方法。
［１１］ 前記ヒト多能性幹細胞の培養液中のフィブロネクチンを検出、又は測定する工程を、フィブロネクチンを認識する一又は複数のプローブを用いて行う、［１０］の方法。
［１２］ 前記ヒト多能性幹細胞の培養液中のフィブロネクチンが、ＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチンであり、
前記プローブが、（ａ）ＳＳＥＡ－１をエピトープとして認識するプローブ、及び（ｂ）フィブロネクチンを認識するプローブを含む、［１１］の方法。
［１３］ 前記プローブが、抗体又はそのフラグメントである、［１１］又は［１２］の方法。
［１４］ 前記ヒト多能性幹細胞の培養液中のフィブロネクチンを検出、又は測定する工程を、前記プローブを用いたサンドイッチアッセイ法により行う、［１０］～［１３］のいずれかの方法。
［１５］ さらに、培養液中にフィブロネクチンが検出された培養物より、フィブロネクチン陽性細胞を除去する工程を含む、［１０］～［１４］のいずれかの方法。
［１６］ 前記フィブロネクチン陽性細胞を除去する工程が、前記細胞とＩＲ７００で標識されたフィブロネクチンを認識する一又は複数のプローブとを結合させた後、近赤外線（Ｎｅａｒ－Ｉｎｆｒａｒｅｄ：ＮＩＲ）照射を行うことを含む、［１５］の方法。
【0013】
［１７］ ヒト多能性幹細胞の品質を管理する方法において使用するためのキットであって、フィブロネクチンを認識する一又は複数のプローブを含む、キット。
［１８］ 前記フィブロネクチンが、ＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチンであり、
前記プローブが、（ａ）ＳＳＥＡ－１をエピトープとして認識するプローブ、及び（ｂ）フィブロネクチンを認識するプローブを含む、［１７］のキット。
［１９］ 基板に固定化されている前記プローブ、及び標識化されている前記プローブを含み、基板に固定化されている前記プローブと標識化されている前記プローブとは異なる、［１７］又は［１８］のキット。
［２０］ さらに、ＩＲ７００で標識されたフィブロネクチンを認識する一又は複数のプローブを含む、［１７］～［１９］のいずれかのキット。
［２１］ 前記プローブが、ＩＲ７００で標識されたＳＳＥＡ－１をエピトープとして認識するプローブ、及びＩＲ７００で標識されたフィブロネクチンを認識するプローブを含む、［２０］のキット。
［２２］ 前記プローブが、抗体又はそのフラグメントである、［１７］～［２１］のいずれかのキット。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２０２０－１０２０６３号の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとりいれるものとする。
［１８］ 前記フィブロネクチンが、ＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチンであり、
前記プローブが、（ａ）ＳＳＥＡ－１をエピトープとして認識するプローブ、及び（ｂ）フィブロネクチンを認識するプローブを含む、［１７］のキット。
［１９］ 基板に固定化されている前記プローブ、及び標識化されている前記プローブを含み、基板に固定化されている前記プローブと標識化されている前記プローブとは異なる、［１７］又は［１８］のキット。
［２０］ さらに、ＩＲ７００で標識されたフィブロネクチンを認識する一又は複数のプローブを含む、［１７］～［１９］のいずれかのキット。
［２１］ 前記プローブが、ＩＲ７００で標識されたＳＳＥＡ－１をエピトープとして認識するプローブ、及びＩＲ７００で標識されたフィブロネクチンを認識するプローブを含む、［２０］のキット。
［２２］ 前記プローブが、抗体又はそのフラグメントである、［１７］～［２１］のいずれかのキット。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２０２０－１０２０６３号の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとりいれるものとする。
【発明の効果】
【0014】
本発明によれば、簡便かつ効率的に、かつ非侵襲的にヒト多能性幹細胞の未分化性を判定又は評価することを可能とする新たな方法を提供することができる。
より詳細には、本発明においては、ヒト多能性幹細胞の培養液を被験試料とし、それに含まれるフィブロネクチン、又はＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチンを検出又は測定し、フィブロネクチン、又はＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチンの検出結果又は測定結果に基づいて、ヒト多能性幹細胞の未分化性を判定又は評価するものであり、貴重なヒト多能性幹細胞を減らすことなく、かつ簡便にその未分化性を判定又は評価すること、さらには未分化性が低下した細胞を選択的に除去することができ、ヒト多能性幹細胞の品質を管理することができる。
より詳細には、本発明においては、ヒト多能性幹細胞の培養液を被験試料とし、それに含まれるフィブロネクチン、又はＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチンを検出又は測定し、フィブロネクチン、又はＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチンの検出結果又は測定結果に基づいて、ヒト多能性幹細胞の未分化性を判定又は評価するものであり、貴重なヒト多能性幹細胞を減らすことなく、かつ簡便にその未分化性を判定又は評価すること、さらには未分化性が低下した細胞を選択的に除去することができ、ヒト多能性幹細胞の品質を管理することができる。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1】図１は、未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞の作製過程（０日目～１０日目）における顕微鏡像を示す写真図である。Ａは、未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞の作製過程（０日目，２日目，５日目，１０日目）における位相差顕微鏡像を示す。Ｂは、ヒトｉＰＳ細胞及び未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞における、ＤＡＰＩ（青）及びＯｃｔ３／４、ｒＢＣ２－ＬＣＮ、ＳＳＥＡ－４、ＳＳＥＡ－１（緑）についての各免疫染色像（蛍光顕微鏡像）を示す。
【図2】図２は、未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞の培養上清におけるＳＳＥＡ－１陽性糖タンパク質の解析結果を示す。Ａは、ヒトｉＰＳ細胞及び未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞の各培養上清を、ｒＡＢＡレクチンを用いて免疫沈降した後、抗ＳＳＥＡ－１モノクローナル抗体を利用したウェスタンブロッティングに供した結果を示す写真図である。未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞の培養上清に由来するサンプルにおいて矢印で示された領域は＞２５０ｋＤａのバンドを示す。Ｂは、ヒトｉＰＳ細胞及び未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞の各培養上清を、ｒＡＢＡレクチンを用いて免疫沈降した後、銀染色に供した結果を示す写真図である。未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞の培養上清に由来するサンプルにおいて矢印で示された領域は＞２５０ｋＤａのバンドを示す。Ｃは、Ｂに示す銀染色後にＳＤＳゲルから切り出した＞２５０ｋＤａのバンド領域に含まれるタンパク質の解析結果を示す。
【図3】図３は、未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞の培養上清におけるＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチンの解析結果を示す。Ａは、ヒトｉＰＳ細胞及び未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞の各培養上清を、抗フィブロネクチンポリクローナル抗体を用いて免疫沈降した後、抗ＳＳＥＡ－１モノクローナル抗体又は抗フィブロネクチンポリクローナル抗体を利用したウェスタンブロッティングに供した結果を示す写真図である。Ｂは、ヒトｉＰＳ細胞及び未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞の各培養上清を、抗フィブロネクチンモノクローナル抗体を用いて免疫沈降した後、抗ＳＳＥＡ－１モノクローナル抗体又は抗フィブロネクチンモノクローナル抗体を利用したウェスタンブロッティングに供した結果を示す写真図である。Ｃは、ヒトｉＰＳ細胞（左）及び未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞（右）の、ＤＡＰＩ（青）及びフィブロネクチン（赤）についての免疫染色像（蛍光顕微鏡像）を示す写真図である。各図において、四角で囲まれた領域の拡大図を右に示す。
【図4】図４は、フィブロネクチン抗体とＳＳＥＡ－１抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイの結果を示すグラフ図である。Ａは、ヒトｉＰＳ細胞（白三角）及び未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞（黒丸）をそれぞれ２４時間培養した培養上清を段階希釈し、作成された検量線を示す。Ｂは、未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞を２５０００細胞／ｍＬ、１２５００細胞／ｍＬ、６２５０細胞／ｍＬ、０細胞／ｍＬの密度でそれぞれ播種した際の培養上清を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡの結果を示すグラフ図である。黒は実際の細胞数、灰色は未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞を単独で培養した際の見かけの細胞数、白色はヒトｉＰＳ細胞と共培養した際の見かけの細胞数を示す。
【図5】図５は、フィブロネクチンモノクローナル抗体とフィブロネクチンポリクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイの結果を示すグラフ図である。ヒトｉＰＳ細胞（白三角）及び未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞（黒丸）をそれぞれ２４時間培養した培養上清を段階希釈し、作成された検量線を示す。
【図6】図６は、ヒトｉＰＳ細胞と未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞を、ＩＲ７００標識フィブロネクチン抗体で染色した免疫染色像（蛍光顕微鏡像）を示す写真図である。Ａは、未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞（左）とヒトｉＰＳ細胞（対照：右）を、ＩＲ７００標識フィブロネクチン抗体（赤色）及びヘキスト３３３４２（青色）で染色した免疫染色像であり、四角で囲まれた領域の拡大図を右下枠内に示す。Ｂは、未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞を、ＩＲ７００標識フィブロネクチン抗体（赤色）で１時間（左）及び６時間（右）処理して得られた免疫染色像を示す。各図において、スケールバーは１００μｍを示す。
【図7】図７は、ヒトｉＰＳ細胞と未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞に対するＩＲ７００標識フィブロネクチン抗体処理とそれに続く近赤外線（Ｎｅａｒ－Ｉｎｆｒａｒｅｄ：ＮＩＲ）照射処理後の、各細胞の生存率を分析した結果（蛍光顕微鏡像）を示す写真図である。Ａは、未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞を、無処理、ＩＲ７００標識フィブロネクチン抗体処理、ＮＩＲ照射処理、ならびに、ＩＲ７００標識フィブロネクチン抗体処理とそれに続くＮＩＲ照射処理にそれぞれ付した後、生細胞染色（カルセイン－アセトキシメチル（ＡＭ）：上段（緑色））及び死細胞染色（ＥｔｈＤ－１：下段（赤色））により細胞生存率を分析した結果を示す。Ｂは、ヒトｉＰＳ細胞について同様に細胞生存率を分析した結果を示す。各図において、スケールバーは１００μｍを示す。
【図8】図８は、ヒトｉＰＳ細胞と未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞の生存率に対する、ＩＲ７００標識フィブロネクチン抗体処理とそれに続くＮＩＲ照射処理の定量的効果の分析結果を示すグラフ図である。Ａは、所定濃度（０～１０ｎｇ／ｍＬ）のＩＲ７００標識フィブロネクチン抗体で処理した後、ＮＩＲ照射処理に付したヒトｉＰＳ細胞（白丸）と未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞（黒丸）の細胞生存率（％）を示すグラフ図である。細胞生存率（％）は、ＮＩＲ照射後ＣＣＫ－８溶液を培地に添加し、４５０ｎｍでの吸光度を測定した後、未処理の細胞を１００％とする相対値にて示し、３回の測定の平均±標準偏差として示される。Ｂは、ＩＲ７００標識フィブロネクチン抗体で処理した後、所定時間（０～１０分）のＮＩＲ照射処理に付したヒトｉＰＳ細胞（白丸）と未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞（黒丸）の細胞生存率（％）を示すグラフ図である。細胞生存率（％）は、ＮＩＲ照射後ＣＣＫ－８溶液を培地に添加し、４５０ｎｍでの吸光度をＩＲ７００標識フィブロネクチン抗体のみで処理した細胞を１００％とする相対値にて示し、３回の測定の平均±標準偏差として示される。
【図9】図９は、ヒトｉＰＳ細胞の共存下における、ＩＲ７００標識フィブロネクチン抗体処理とそれに続くＮＩＲ照射処理を用いた未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞の選択的除去の実験結果を示す。Ａは、未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞とヒトｉＰＳ細胞の共培養物を、無処理、ＩＲ７００標識フィブロネクチン抗体処理、ＮＩＲ照射処理、ならびに、ＩＲ７００標識フィブロネクチン抗体処理とそれに続くＮＩＲ照射処理にそれぞれ付した後、生細胞染色（カルセイン－アセトキシメチル（ＡＭ）：上段（緑色））及び死細胞染色（ＥｔｈＤ－１：下段（赤色））により各細胞の生存率を分析した結果（蛍光顕微鏡像）を示す写真図である。スケールバーは１００μｍを示す。Ｂは、ヒトｉＰＳ細胞とＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒＧｒｅｅｎ－５－クロロメチルフルオレセインジアセテートで染色した未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞の共培養物を、無処理、ＩＲ７００標識フィブロネクチン抗体処理、ＮＩＲ照射処理、ならびに、ＩＲ７００標識フィブロネクチン抗体処理とそれに続くＮＩＲ照射処理にそれぞれ付した後に回収し、フローサイトメーターにより各細胞の割合を測定した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0016】
１．ヒト多能性幹細胞の未分化性について
本発明において「多能性」とは、３胚葉（内胚葉、中胚葉、外胚葉）のどの系統の細胞にも分化し得る能力（ただし、胚盤胞には分化できない）、すなわちｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙを意味する。
本発明において「多能性」とは、３胚葉（内胚葉、中胚葉、外胚葉）のどの系統の細胞にも分化し得る能力（ただし、胚盤胞には分化できない）、すなわちｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙを意味する。
【0017】
「ヒト多能性幹細胞」とは、多能性を有し、３胚葉（内胚葉、中胚葉、外胚葉）にわたる生体の様々な組織に分化し得る能力を潜在的に有するヒト細胞を意味する。このような細胞としては、ヒト胚性幹細胞（ＥＳ細胞）やヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、ならびにそれらと同等の多能性を有する細胞が挙げられる。好ましくは本発明において「ヒト多能性幹細胞」とは、ヒトＥＳ細胞又はヒトｉＰＳ細胞であり、より好ましくはヒトｉＰＳ細胞である。
【0018】
「ヒトＥＳ細胞」とは、ヒトの初期胚（胚盤胞）より内部細胞塊を取り出し、フィーダー細胞上で培養することによって製造することができる多能性幹細胞を意味する（Ｔｈｏｍｓｏｎ ＪＡ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９８ Ｎｏｖ ６；２８２（５３９１）：１１４５－７．）。
【0019】
本発明において「ヒトＥＳ細胞」は、従来公知の手段に従ってヒトの初期胚（胚盤胞）より製造されたものであってもよいし、あるいは、既に樹立されたヒトＥＳ細胞株（例えば、ＫｈＥＳ－１～ＫｈＥＳ－５株、ＨＥＳ１～ＨＥＳ６株、ＣＨＢ－１～ＣＨＢ－１２株、ＲＵＥＳ１株、ＲＵＥＳ２株、ＨＵＥＳ１～ＨＵＥＳ２８株、ＷＡ０１（Ｈ１）株、ＷＡ０７（Ｈ７）株、ＷＡ０９（Ｈ９）株、ＷＡ１３（Ｈ１３）株、ＷＡ１４（Ｈ１４）株、ＳＡ００２株、ＳＡ１８１株、ＳＡ６１１株等（これらに限定はされない））であってもよい。
【0020】
「ヒトｉＰＳ細胞」とは、ヒトの体細胞又は未分化幹細胞に、核初期化因子と知られる特定の因子（例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｌ－Ｍｙｃ、ｈＴＥＲＴ、ＳＶ４０ ｌａｒｇｅ Ｔ等）を導入してリプログラミング（初期化）することによって製造することができる人工の多能性幹細胞を意味する（Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ（２００７）１３１，８６１－８７２；Ｏｋｉｔａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２００７）４４８，３１３－３１７；Ｎａｋａｇａｗａ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（２００８）２６，１０１－１０６；Ｙｕ Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００７）３１８，１９１７－１９２０；Ｐａｒｋ ＩＨ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２００７）４５１，１４１－１４６等）。
【0021】
本発明において「ヒトｉＰＳ細胞」は、従来公知の手段に従ってヒトの体細胞又は未分化幹細胞より製造されたものであってもよいし、あるいは、既に樹立されたヒトｉＰＳ細胞株（例えば、２０１Ｂ７株、２５３Ｇ１株、４０９Ｂ２株、４５４Ｅ２株、６０６Ａ１株、６１０Ｂ１株、６４８Ａ１株、Ｆｆ－ＷＪ－１８株、Ｆｆ－Ｉ０１ｓ０１株、Ｆｆ－Ｉ０１ｓ０２株、Ｆｆ－Ｉ０１ｓ０４株、Ｆｆ－Ｉ０１ｓ０６株、Ｆｆ－Ｉ１４ｓ０３株、Ｆｆ－Ｉ１４ｓ０４株、ＱＨＪＩ０１ｓ０１株、ＱＨＪＩ０１ｓ０４株、ＱＨＪＩ１４ｓ０３株、ＱＨＪＩ１４ｓ０４株、２５３Ｇ１株、ＨｉＰＳ－ＲＩＫＥＮ－１Ａ株、ＨｉＰＳ－ＲＩＫＥＮ－２Ａ株、ＨｉＰＳ－ＲＩＫＥＮ－１２Ａ株、Ｎｉｐｓ－Ｂ２株等（これらに限定はされない））であってもよい。
【0022】
本明細書において、ヒト多能性幹細胞の「未分化性」とは、ヒト多能性幹細胞が多能性を保持し、分化（「逸脱」とも称される）を生じていない状態を意味する。一方、ヒト多能性幹細胞に分化（逸脱）が生じると多能性が低下もしくは消失し、これに伴い「未分化性」は低下もしくは消失する。未分化性を保持しているヒト多能性幹細胞では通常、Ｏｃｔ３／４、ｒＢＣ２－ＬＣＮ、ＳＳＥＡ－４、Ｎａｎｏｇ、ＳＯＸ２、ｃ－Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、Ｌｉｎ２８、ＴＲＡ－１－６０、ＴＲＡ－１－８１等からなる群から選択される一又は複数の未分化マーカーの遺伝子及び／又はタンパク質の発現が認められる。一方、未分化性が低下もしくは消失した細胞では、未分化性を保持しているヒト多能性幹細胞と比べて上記未分化マーカーの遺伝子及び／又はタンパク質の発現が低下又は消失し、代わりに、ＳＳＥＡ－１、ビメンチン、Ｎ－カドヘリン、Ｔｗｉｓｔ、Ｚｅｂ１／２、Ｓｎａｉｌ、Ｓｌｕｇ等の分化マーカーやフィブロネクチンの遺伝子及び／又はタンパク質の発現が認められる。
【0023】
本明細書において、「未分化性が低下したヒト多能性幹細胞（もしくはヒトｉＰＳ細胞）」、「未分化性を低下させたヒト多能性幹細胞（もしくはヒトｉＰＳ細胞）」又は「ヒト多能性幹細胞（もしくはヒトｉＰＳ細胞）の未分化性は低下している」という場合、上記未分化性が低下もしくは消失した細胞を含むヒト多能性幹細胞（もしくはヒトｉＰＳ細胞）集団を意味する。すなわち、「未分化性が低下したヒト多能性幹細胞（もしくはヒトｉＰＳ細胞）」、「未分化性を低下させたヒト多能性幹細胞（もしくはヒトｉＰＳ細胞）」又は「ヒト多能性幹細胞（もしくはヒトｉＰＳ細胞）の未分化性は低下している」という場合には、未分化性を保持しているヒト多能性幹細胞（もしくはヒトｉＰＳ細胞）と未分化性が低下もしくは消失した細胞とが共存する態様が含まれ得る。
【0024】
２．ヒト多能性幹細胞の未分化性の判定又は評価
（２－１）フィブロネクチン
「フィブロネクチン」は、細胞接着分子として知られる分泌性の巨大な糖タンパク質であり、様々な細胞において合成され、細胞外に分泌されることが知られている（ＮＣＢＩデータベースにおけるＧｅｎｅ ＩＤ：２３３５）。フィブロネクチンは、細胞外マトリックスへの接着、結合組織の形成・保持、創傷治癒、胚発生での組織や器官の形態・区画の形成・維持等、脊椎機能の正常な生命機能を支える多くの機能を有することが公知となっている。フィブロネクチン（単量体）は、分子量２１０～２５０ｋＤａ（２，１４６～２，３２５アミノ酸残基）の可溶性糖タンパク質であって、７つのＮ型糖鎖及び１つのＯ型糖鎖を有することが知られている。本発明において「フィブロネクチン」には、下記の「ＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチン」が含まれてもよい。
（２－１）フィブロネクチン
「フィブロネクチン」は、細胞接着分子として知られる分泌性の巨大な糖タンパク質であり、様々な細胞において合成され、細胞外に分泌されることが知られている（ＮＣＢＩデータベースにおけるＧｅｎｅ ＩＤ：２３３５）。フィブロネクチンは、細胞外マトリックスへの接着、結合組織の形成・保持、創傷治癒、胚発生での組織や器官の形態・区画の形成・維持等、脊椎機能の正常な生命機能を支える多くの機能を有することが公知となっている。フィブロネクチン（単量体）は、分子量２１０～２５０ｋＤａ（２，１４６～２，３２５アミノ酸残基）の可溶性糖タンパク質であって、７つのＮ型糖鎖及び１つのＯ型糖鎖を有することが知られている。本発明において「フィブロネクチン」には、下記の「ＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチン」が含まれてもよい。
【0025】
（２－２）ＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチン
本発明において「ＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチン」とは、ＳＳＥＡ－１が結合した分泌性のフィブロネクチンをコアタンパク質とする糖タンパク質を意味する。
本発明において「ＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチン」とは、ＳＳＥＡ－１が結合した分泌性のフィブロネクチンをコアタンパク質とする糖タンパク質を意味する。
【0026】
「ＳＳＥＡ－１（Ｓｔａｇｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ－１）」は、Ｌｅｗｉｓ Ｘ、すなわちＧａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）ＧｌｃＮＡｃを糖鎖抗原（エピトープ）として有する糖鎖マーカーである。ＳＳＥＡ－１は、未分化性を保持しているヒト多能性幹細胞では発現しておらず、分化に伴い細胞膜上での発現が増大することが報告されている（Ｔｈｏｍｓｏｎ ＪＡ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９８ Ｎｏｖ ６；２８２（５３９１）：１１４５－７．）。ＳＳＥＡ－１は、フィブロネクチンの７つのＮ型糖鎖及び１つのＯ型糖鎖の１つ又は複数の糖鎖の非還元末端に結合していると考えられる。
【0027】
（２－３）培養液
本発明において、フィブロネクチン、又はＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチンの検出、又は測定は、ヒト多能性幹細胞のインビトロ培養物の培養液を被験試料として用いて行う。培養液を利用することにより、本来移植治療に用いるための貴重なヒト多能性幹細胞を用いることなく、非侵襲的にその未分化性を判定又は評価することができる。培養工程においては一般に一定期間毎に新鮮な培養液と交換する。このため、フィブロネクチン、又はＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチンの検出又は測定は、交換後の培養液中にフィブロネクチン、又はＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチンが検出可能な量分泌された後に行う。培養液交換後、培養液中に検出可能な量のフィブロネクチン、又はＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチンが分泌されるまでに要する時間は、細胞の種類や量、培養条件によって異なり得る。したがって、培養液交換後、フィブロネクチン、又はＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチンの検出又は測定に用いる培養液を採取するまでの時間は、細胞の種類や培養条件によって適宜設定され得るが、例えば１８～７２時間程度とされる。通常は１～３日程度毎に培地交換を行うので、培地交換の際に廃棄する培養液を利用することが好ましい。培養液は、従来公知の固液分離法（例えば、遠心分離、ろ過等）を用いて回収された培養上清を利用することが好ましい。
本発明において、フィブロネクチン、又はＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチンの検出、又は測定は、ヒト多能性幹細胞のインビトロ培養物の培養液を被験試料として用いて行う。培養液を利用することにより、本来移植治療に用いるための貴重なヒト多能性幹細胞を用いることなく、非侵襲的にその未分化性を判定又は評価することができる。培養工程においては一般に一定期間毎に新鮮な培養液と交換する。このため、フィブロネクチン、又はＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチンの検出又は測定は、交換後の培養液中にフィブロネクチン、又はＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチンが検出可能な量分泌された後に行う。培養液交換後、培養液中に検出可能な量のフィブロネクチン、又はＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチンが分泌されるまでに要する時間は、細胞の種類や量、培養条件によって異なり得る。したがって、培養液交換後、フィブロネクチン、又はＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチンの検出又は測定に用いる培養液を採取するまでの時間は、細胞の種類や培養条件によって適宜設定され得るが、例えば１８～７２時間程度とされる。通常は１～３日程度毎に培地交換を行うので、培地交換の際に廃棄する培養液を利用することが好ましい。培養液は、従来公知の固液分離法（例えば、遠心分離、ろ過等）を用いて回収された培養上清を利用することが好ましい。
【0028】
（２－４）プローブ
（２－４－１）フィブロネクチンを認識するプローブ
本発明において、「フィブロネクチンを認識するプローブ」としては、フィブロネクチンを認識して結合することができるタンパク質やポリペプチド、ならびに化合物を利用することができ、好ましくはフィブロネクチンを抗原（エピトープ）として認識する抗フィブロネクチン抗体又はそのフラグメントを利用することができる。抗フィブロネクチン抗体は従来慣用の手法により調製することができ、例えば、フィブロネクチンもしくはその断片をそのまま、又はアルブミンやＫＬＨ等のキャリアタンパク質に結合させて動物に免疫することで得ることができる。あるいは、抗フィブロネクチン抗体は、フィブロネクチンをエピトープとして認識して結合する、好ましくは特異的に結合する能力を有するものであればよく、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体等、特に限定されることなく用いることができる。また、本発明においては、フィブロネクチンをエピトープとして認識して結合する、好ましくは特異的に結合する能力を有する限り、抗フィブロネクチン抗体のフラグメントも利用することができる。このような抗体のフラグメントとしては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ジアボディー、ｓｃ（Ｆｖ）２等が挙げられ、これらフラグメントの多量体（例えば、ダイマー、トリマー、テトラマー、ポリマー）も本発明において利用することができる。また、既知の又は市販の抗フィブロネクチン抗体も、本発明において利用することができる。
（２－４－１）フィブロネクチンを認識するプローブ
本発明において、「フィブロネクチンを認識するプローブ」としては、フィブロネクチンを認識して結合することができるタンパク質やポリペプチド、ならびに化合物を利用することができ、好ましくはフィブロネクチンを抗原（エピトープ）として認識する抗フィブロネクチン抗体又はそのフラグメントを利用することができる。抗フィブロネクチン抗体は従来慣用の手法により調製することができ、例えば、フィブロネクチンもしくはその断片をそのまま、又はアルブミンやＫＬＨ等のキャリアタンパク質に結合させて動物に免疫することで得ることができる。あるいは、抗フィブロネクチン抗体は、フィブロネクチンをエピトープとして認識して結合する、好ましくは特異的に結合する能力を有するものであればよく、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体等、特に限定されることなく用いることができる。また、本発明においては、フィブロネクチンをエピトープとして認識して結合する、好ましくは特異的に結合する能力を有する限り、抗フィブロネクチン抗体のフラグメントも利用することができる。このような抗体のフラグメントとしては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ジアボディー、ｓｃ（Ｆｖ）２等が挙げられ、これらフラグメントの多量体（例えば、ダイマー、トリマー、テトラマー、ポリマー）も本発明において利用することができる。また、既知の又は市販の抗フィブロネクチン抗体も、本発明において利用することができる。
【0029】
フィブロネクチンを認識するプローブは１種のプローブを単独で用いてもよいし、２種又はそれ以上の複数種のプローブを組み合わせて用いてもよい。
【0030】
（２－４－２）ＳＳＥＡ－１をエピトープとして認識するプローブ
培養液中のＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチンの検出又は測定は、（ａ）ＳＳＥＡ－１をエピトープとして認識するプローブと、（ｂ）上述のフィブロネクチンを認識するプローブとを利用して行うことができる。これら２種類のプローブを用いることで、目的タンパク質を特異性高く、かつ高感度に検出することができ、好ましい。
培養液中のＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチンの検出又は測定は、（ａ）ＳＳＥＡ－１をエピトープとして認識するプローブと、（ｂ）上述のフィブロネクチンを認識するプローブとを利用して行うことができる。これら２種類のプローブを用いることで、目的タンパク質を特異性高く、かつ高感度に検出することができ、好ましい。
【0031】
本発明において、（ａ）「ＳＳＥＡ－１をエピトープとして認識するプローブ」としては、ＳＳＥＡ－１の糖鎖構造を認識して結合するＳＳＥＡ－１結合性レクチン（例えば、ミヤコグザ凝集素（Ｌｏｔｕｓ Ｔｅｔｒａｇｏｌｏｎｏｂｕｓレクチン、ＬＴＬ）、ＤＣ－ＳＩＧＮ、緑膿菌由来レクチン（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａレクチン、ＰＡ－ＩＩＬ）等（これらに限定されない））、ペプチド、アプタマーや、ＳＳＥＡ－１を糖鎖抗原（エピトープ）として認識する抗ＳＳＥＡ－１抗体又はそのフラグメントを利用することができる。好ましくは、本発明において「ＳＳＥＡ－１をエピトープとして認識するプローブ」は、抗ＳＳＥＡ－１抗体又はそのフラグメントである。抗ＳＳＥＡ－１抗体は従来慣用の手法により調製することができ、例えば、ＳＳＥＡ－１をそのまま、又はアルブミンやキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）等のキャリアタンパク質に結合させて動物に免疫することで得ることができる。あるいは、既知の又は市販の抗ＳＳＥＡ－１抗体も、本発明において利用することができる。抗ＳＳＥＡ－１抗体は、ＳＳＥＡ－１をエピトープとして認識して結合する、好ましくは特異的に結合する能力を有するものであればよく、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体等、特に限定されることなく用いることができる。また、本発明においては、ＳＳＥＡ－１をエピトープとして認識して結合する、好ましくは特異的に結合する能力を有する限り、抗ＳＳＥＡ－１抗体のフラグメントも利用することができる。このような抗体のフラグメントとしては、上記定義のものを利用することができる。
【0032】
ＳＳＥＡ－１をエピトープとして認識するプローブは１種のプローブを単独で用いてもよいし、２種又はそれ以上の複数種のプローブを組み合わせて用いてもよい。
【0033】
（２－５）フィブロネクチン、又はＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチンの検出又は測定
培養液中のフィブロネクチン、又はＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチンの検出又は測定は、上述の各プローブの使用と組み合わせた、タンパク質の検出又は定量に一般的に用いられる手法、例えば、酵素結合免疫吸着（ＥＬＩＳＡ）法、サンドイッチアッセイ法、競合法、ウェスタンブロット法、クロマトグラフィー法、免疫沈降等の一又は複数を用いて行うことができる。好ましくは、培養液中のフィブロネクチンの検出又は測定は、２種又はそれ以上のフィブロネクチンを認識するプローブを用いたサンドイッチアッセイ法により行い、より好ましくは、培養液中のＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチンの検出又は測定は、前記（ａ）及び（ｂ）のプローブを用いたサンドイッチアッセイ法により行う。
培養液中のフィブロネクチン、又はＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチンの検出又は測定は、上述の各プローブの使用と組み合わせた、タンパク質の検出又は定量に一般的に用いられる手法、例えば、酵素結合免疫吸着（ＥＬＩＳＡ）法、サンドイッチアッセイ法、競合法、ウェスタンブロット法、クロマトグラフィー法、免疫沈降等の一又は複数を用いて行うことができる。好ましくは、培養液中のフィブロネクチンの検出又は測定は、２種又はそれ以上のフィブロネクチンを認識するプローブを用いたサンドイッチアッセイ法により行い、より好ましくは、培養液中のＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチンの検出又は測定は、前記（ａ）及び（ｂ）のプローブを用いたサンドイッチアッセイ法により行う。
【0034】
サンドイッチアッセイ法においては、用いるプローブのうちのいずれか（以下、「第一のプローブ」と記載する）を基板に固定化する。第一のプローブを固定化する基板としては、プレート（例えば、マイクロウェルプレート等）、マイクロアレイ基板（例えば、マイクロアレイ用スライドガラス等）、チューブ、ビーズ（例えば、プラスチックビーズ、磁気ビーズ等）、クロマトグラフィー用担体（例えば、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）等）、メンブレン（例えば、ニトロセルロースメンブレン、ＰＶＤＦ膜等）、ゲル（例えば、ポリアクリルアミドゲル等）等が例示される。その中でもプレート、ビーズ及びメンブレンが好ましく用いられ、取り扱いの簡便性からプレートが最も好ましく用いられる。
【0035】
第一のプローブの基板への固定化は、ビオチン－アビジン結合による固定化により行うことができる。すなわち、あらかじめ固定化する第一のプローブをビオチン化しておき、ビオチン化した当該プローブをストレプトアビジンコートした基板（ウェル）上に固定化した形態で調製することができる。この場合、検出感度が向上し、バックグラウンドを大幅に減少させることができる。
【0036】
他の固定化法としては、物理的吸着法や化学的結合法が挙げられる。物理的吸着法を使用する場合はγ線処理、電子線処理、ＵＶ処理、プラズマ処理、コロナ処理等による表面を活性化する方法が挙げられ、化学的結合法を使用する場合はｐ－ニトロフェニル基等である置換又は無置換のフェノール活性エステル基；及び、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド基、Ｎ－ヒドロキシフタルイミド基、Ｎ－ヒドロキシ－５－ノルボルネン－２，３－ジカルボキシイミド、等であるＮ－ヒドロキシイミド活性エステル基、カルボキシル基、カルボニル基、アルデヒド基、エポキシ基、アミノ基、チオール基、マレイミド基等を基板表面に有することが好ましい。
【0037】
被験試料である培養液は、緩衝液で希釈し、又は希釈せずに第一プローブを固定化したウェル内に添加して相互作用させた後、非特異的結合をしている夾雑物を、緩衝液を用いて洗浄する。
【0038】
次いで、間接的又は直接的に標識化された、第一のプローブとは異なるプローブ（以下、「第二のプローブ」と記載する）を含有させた緩衝液を添加して反応させる。第二のプローブの標識には例えば、蛍光物質（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、Ｃｙ３、Ｃｙ５等）、放射性物質（例えば、１３Ｃ、３Ｈ等）、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ（西洋ワサビペルオキシダーゼ等）、グルコースオキシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ等）等の標識物質が挙げられるが、これらに限定はされない。また、第二のプローブをビオチン標識し、（ストレプト）アビジンを上記標識物質で標識して、ビオチンと（ストレプト）アビジンとの結合を利用してもよい。
【0039】
また、本明細書において、「間接的又は直接的に標識化された、第一のプローブとは異なるプローブ」又は「標識化された第二のプローブ」等という場合、当該プローブ自体を直接標識化せずに、当該プローブをそれと結合する標識化された二次抗体で間接的に標識して検出する場合も含まれる。
【0040】
標識物質として酵素を用いる場合、使用する酵素に応じた適切な基質を用いて検出を行なう。例えば、酵素としてペルオキシダーゼを使用する場合、基質としてはｏ－フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、２，２’－アジノビス［３－エチルベンゾチアゾリン－６－スルホン酸］（ＡＢＴＳ）、３，３’－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、Ａｍｐｌｅｘ（登録商標）Ｒｅｄ、３－（ｐ－ヒドロキシフェニル）プロピオン（ＨＰＰＡ）、ルミノール等が使用され、アルカリホスファターゼを使用する場合には、ｐ－ニトロフェニルホスフェート（ＰＮＰＰ）、４－メチルウンベリフェリルリン酸、５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）／ニトロブルーテトラゾリウムクロライド（ＮＢＴ）、ＡｔｔｏＰｈｏｓ（登録商標）、リン酸４－メチルウンベリフェリル（４－ＭＵＰ）、ＥＣＦ、ＤＤＡＯ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ジオキセタン、ＣＤＰ－ＳｔａｒＴＭ、ＡＭＰＰＤ（登録商標）、ＣＳＰＤ（登録商標）等が使用される。酵素反応停止液、基質溶解液についても、選択した酵素に応じて、従来公知のものを適宜選択して使用することができる。
【0041】
サンドイッチアッセイ法では、培養液中のフィブロネクチン、又はＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチンは前記基板上に固定化された第一のプローブと結合し、かつ前記標識化された第二のプローブとも結合して複合体を形成する。そして、この複合体における標識化された第二プローブより生じたシグナルを検出、又は測定することにより、試料中のフィブロネクチン、又はＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチンを検出、又は測定することができる。シグナルの検出又は測定は、使用した標識物質に応じて適切な検出又は測定装置を用いて行なうことができる。
【0042】
前記シグナルの検出または測定の方法としては、ＥＬＩＳＡ、イムノクロマトグラフィー、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ法）、化学発光イムノアッセイ、エバネッセント波分析法等を利用することができる。これらの方法は当業者に公知であり、いずれの方法を選択してもよい。また、これらの方法は通常の手順に従って実施すればよく、実際の反応条件の設定等は、当業者が通常行い得る技術範囲内のものである。本発明において好ましくは、西洋ワサビペルオキシダーゼ等の酵素で標識化された第二プローブより生じたシグナルを検出、又は測定するサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイ法により行う。
【0043】
培養液中のフィブロネクチン、又はＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチンの定量的な測定のために、例えばヒト細胞発現のリコンビナントフィブロネクチン、あるいは、フィブロネクチン、又はＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチンを発現する細胞の培養液から精製されたフィブロネクチン、又はＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチンを標準物質として用いて、上記サンドイッチアッセイ法により、標準物質量に応じた標識シグナル量を検出・ブロットして検量線を作成することができる。これにより標識シグナル量を、フィブロネクチン、又はＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチンの量として換算することができ、培養液中のフィブロネクチン、又はＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチンを定量的に測定することができる。また、未分化性が低下したヒト多能性幹細胞の培養液や、フィブロネクチンをコードする遺伝子を導入した遺伝子組換え細胞の培養液、Ｌｅｗｉｓ Ｘ合成を行うＦｕｔ９をコードする遺伝子とフィブロネクチンをコードする遺伝子を導入した遺伝子組換え細胞の培養液、フィブロネクチン発現細胞の培養液、もしくはＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチン発現細胞の培養液、またはそれらの培養液から精製したフィブロネクチン、又はＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチンを標準物質として用いて、上記サンドイッチアッセイ法により、所定の細胞数に応じた標識シグナル量を検出・ブロットして検量線を作成することができる。これにより標識シグナル量を、フィブロネクチン、又はＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチンを発現する細胞数として換算することができ、培養中のフィブロネクチン、又はＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチンを発現する細胞を定量的に測定することができる。
【0044】
（２－６）未分化性の判定又は評価
本発明において、ヒト多能性幹細胞の未分化性の判定又は評価は、上述のヒト多能性幹細胞の培養液中のフィブロネクチン、又はＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチンの検出又は測定結果に従って行うことができる。ヒト多能性幹細胞の培養液中のフィブロネクチン、又はＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチンの検出又は測定結果は、ヒト多能性幹細胞の未分化性と相関し、培養液中にフィブロネクチン、又はＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチンが検出される場合には当該多能性幹細胞の未分化性は低下している、すなわち未分化性が低下もしくは消失した細胞が含まれると判定、評価することができる。また培養液中のフィブロネクチン、又はＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチンの量が多いほど、ヒト多能性幹細胞の未分化性がより低下している、すなわち未分化性が低下もしくは消失した細胞がより多く含まれると判定、評価することができる。
本発明において、ヒト多能性幹細胞の未分化性の判定又は評価は、上述のヒト多能性幹細胞の培養液中のフィブロネクチン、又はＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチンの検出又は測定結果に従って行うことができる。ヒト多能性幹細胞の培養液中のフィブロネクチン、又はＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチンの検出又は測定結果は、ヒト多能性幹細胞の未分化性と相関し、培養液中にフィブロネクチン、又はＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチンが検出される場合には当該多能性幹細胞の未分化性は低下している、すなわち未分化性が低下もしくは消失した細胞が含まれると判定、評価することができる。また培養液中のフィブロネクチン、又はＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチンの量が多いほど、ヒト多能性幹細胞の未分化性がより低下している、すなわち未分化性が低下もしくは消失した細胞がより多く含まれると判定、評価することができる。
【0045】
３．ヒト多能性幹細胞の品質の管理
本発明において「ヒト多能性幹細胞の品質を管理する」とは、ヒト多能性幹細胞の未分化性を管理することを意味し、これは上述のヒト多能性幹細胞の未分化性の判定又は評価結果にしたがって行うことができる。例えば、上述のヒト多能性幹細胞の未分化性の判定又は評価方法において、培養液中にフィブロネクチン、又はＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチンが検出される場合、又は所定量のフィブロネクチン、又はＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチンが検出される場合、当該培養におけるヒト多能性幹細胞は未分化性が低下したヒト多能性幹細胞であると判定し、当該培養を廃棄処分、当該培養よりヒト多能性幹細胞を回収、もしくは当該培養より未分化性が低下した細胞を除去等することができる。すなわち、ヒト多能性幹細胞の未分化性の判定又は評価結果にしたがって、未分化性が低下したヒト多能性幹細胞（もしくは未分化性を有するヒト多能性幹細胞）をスクリーニングすることができ、安定した品質のヒト多能性幹細胞の供給を可能とする。例えば、「未分化性が低下したヒト多能性幹細胞（もしくはヒトｉＰＳ細胞）」、「未分化性を低下させたヒト多能性幹細胞（もしくはヒトｉＰＳ細胞）」又は「ヒト多能性幹細胞（もしくはヒトｉＰＳ細胞）の未分化性は低下している」とは、全細胞数のうち未分化性が低下もしくは消失した細胞が１０％以上の割合で含まれるとする基準を設けることができる。そして、この基準に基づいて、全細胞数のうち未分化性が低下もしくは消失した細胞の割合が１０％未満である場合に、安定した品質のヒト多能性幹細胞として供給することができる。ただし、当該基準は任意で定めることができ、上述の値に限定されるものではない。
本発明において「ヒト多能性幹細胞の品質を管理する」とは、ヒト多能性幹細胞の未分化性を管理することを意味し、これは上述のヒト多能性幹細胞の未分化性の判定又は評価結果にしたがって行うことができる。例えば、上述のヒト多能性幹細胞の未分化性の判定又は評価方法において、培養液中にフィブロネクチン、又はＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチンが検出される場合、又は所定量のフィブロネクチン、又はＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチンが検出される場合、当該培養におけるヒト多能性幹細胞は未分化性が低下したヒト多能性幹細胞であると判定し、当該培養を廃棄処分、当該培養よりヒト多能性幹細胞を回収、もしくは当該培養より未分化性が低下した細胞を除去等することができる。すなわち、ヒト多能性幹細胞の未分化性の判定又は評価結果にしたがって、未分化性が低下したヒト多能性幹細胞（もしくは未分化性を有するヒト多能性幹細胞）をスクリーニングすることができ、安定した品質のヒト多能性幹細胞の供給を可能とする。例えば、「未分化性が低下したヒト多能性幹細胞（もしくはヒトｉＰＳ細胞）」、「未分化性を低下させたヒト多能性幹細胞（もしくはヒトｉＰＳ細胞）」又は「ヒト多能性幹細胞（もしくはヒトｉＰＳ細胞）の未分化性は低下している」とは、全細胞数のうち未分化性が低下もしくは消失した細胞が１０％以上の割合で含まれるとする基準を設けることができる。そして、この基準に基づいて、全細胞数のうち未分化性が低下もしくは消失した細胞の割合が１０％未満である場合に、安定した品質のヒト多能性幹細胞として供給することができる。ただし、当該基準は任意で定めることができ、上述の値に限定されるものではない。
【0046】
当該培養より未分化性が低下した細胞の除去は、当該培養よりフィブロネクチンを発現する細胞（「フィブロネクチン陽性細胞」と記載する）、又はＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチンを発現する細胞（「ＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチン陽性細胞」と記載する）を単離、又は死滅させることにより行うことができる。本発明において「フィブロネクチン陽性細胞」には、「ＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチン陽性細胞」が含まれてもよい。
【0047】
フィブロネクチン陽性細胞、又はＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチン陽性細胞の単離は、上記プローブの使用と組み合わせた、細胞の単離、又は精製に一般的に用いられる手法、例えば、クロマトグラフィー、磁気分離、遠心分離、フローサイトメーター、セルソーター（蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）等）等の一又は複数を用いて行うことができる。
【0048】
フィブロネクチン陽性細胞、又はＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチン陽性細胞の死滅は、これら細胞を選択的に、好ましくは特異的に、死滅させることが可能な任意の手段を用いて行うことができる。例えば、所定の光感受性物質で標識された上記プローブの使用と、近赤外線（波長７００－２５００ｎｍ）、紫外線（波長１０－４００ｎｍ）、又は熱中性子線への暴露を組み合わせた、所謂、光免疫療法、中性子捕捉療法等の手法を用いて行うことができる。光感受性物質としては、例えば、近赤外線照射によって活性化される光吸収性フタロシアニン色素ＩＲＤｙｅ７００Ｄｘ（ＩＲ７００）、ホウ素１０（１０Ｂ）、セレン化カドミウム（ＣｄＳｅ）等が挙げられる。本発明の一態様においては、ＩＲ７００で標識した上記プローブを標的であるフィブロネクチン陽性細胞、又はＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチン陽性細胞に結合させ、近赤外線に暴露することによって；１０Ｂで標識した上記プローブを標的であるフィブロネクチン陽性細胞、又はＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチン陽性細胞に結合させ、熱中性子線に暴露することによって；あるいは、ＣｄＳｅで標識した上記プローブを標的であるフィブロネクチン陽性細胞、又はＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチン陽性細胞に結合させ、紫外線に暴露することによって、当該プローブが結合したフィブロネクチン陽性細胞、又はＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチン陽性細胞を選択的に、好ましくは特異的に、死滅させることができる。あるいは、細胞の所定因子の阻害剤やアポトーシスを促す薬剤（例えば、抗がん剤や分子標的薬等）を結合させた上記プローブを用いたドラッグデリバリーシステムを用いることができる。所定の阻害剤や薬剤を結合させた上記プローブを標的であるフィブロネクチン陽性細胞、又はＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチン陽性細胞に結合させ、当該細胞に阻害剤や薬剤を送達・作用させることによって当該細胞を選択的に、好ましくは特異的に、死滅させることができる。
【0049】
４．キット
本発明においてキットとは、上述のヒト多能性幹細胞の未分化性を判定又は評価する方法において使用するためのキット、又は上述のヒト多能性幹細胞の品質を管理する方法において使用するためのキットであり、培養液中のフィブロネクチンを検出、又は測定するために用いられる、フィブロネクチンを認識する一又は複数のプローブを含む。
本発明においてキットとは、上述のヒト多能性幹細胞の未分化性を判定又は評価する方法において使用するためのキット、又は上述のヒト多能性幹細胞の品質を管理する方法において使用するためのキットであり、培養液中のフィブロネクチンを検出、又は測定するために用いられる、フィブロネクチンを認識する一又は複数のプローブを含む。
【0050】
ここで「フィブロネクチン」が、ＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチンである場合、前記プローブには、（ａ）ＳＳＥＡ－１をエピトープとして認識するプローブ、及び（ｂ）フィブロネクチンを認識するプローブが含まれる。
【0051】
本発明のキットに含まれる前記プローブはいずれも、上記定義のとおりである。
【0052】
一態様において、本発明のキットに含まれる前記プローブは、上述の基板上に固定化された第一のプローブと、標識化された第二のプローブを含む。例えば、本発明のキットには、当該第一のプローブとして、基板に固定化されている抗フィブロネクチンモノクローナル抗体又はそのフラグメント、ならびに、当該第二のプローブとして、標識化されている抗フィブロネクチンポリクローナル抗体又はそのフラグメントが含まれ、あるいは、基板に固定化されている抗フィブロネクチンポリクローナル抗体又はそのフラグメント、ならびに標識化されている抗フィブロネクチンモノクローナル抗体又はそのフラグメントが含まれる。また、例えば、本発明のキットには、当該第一のプローブとして、基板に固定化されている（ａ）ＳＳＥＡ－１をエピトープとして認識するプローブ、ならびに、当該第二のプローブとして、標識化されている（ｂ）フィブロネクチンを認識するプローブが含まれ、あるいは、標識化されている（ａ）ＳＳＥＡ－１をエピトープとして認識するプローブ、ならびに基板に固定化されている（ｂ）フィブロネクチンを認識するプローブが含まれる。
【0053】
また、本発明のキットには、標準物質として利用可能な、ヒト細胞発現のリコンビナントフィブロネクチンや、未分化性が低下したヒト多能性幹細胞、フィブロネクチンをコードする遺伝子を導入した遺伝子組換え細胞、Ｌｅｗｉｓ Ｘ合成を行うＦｕｔ９をコードする遺伝子とフィブロネクチンをコードする遺伝子を導入した遺伝子組換え細胞、フィブロネクチン発現細胞の培養液、ＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチン発現細胞の培養液や、当該培養液より精製したフィブロネクチン又はＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチン等を含めることもでき、フィブロネクチン、又はＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチンやその発現細胞の定量的な測定のための検量線を作成するために利用することができる。
【0054】
また、本発明のキットが、ヒト多能性幹細胞の品質を管理する方法において使用するためのキットである場合にはさらに、当該培養より未分化性が低下した細胞を除去するための手段を含むことができる。未分化性が低下した細胞を除去するための手段には、例えば、フィブロネクチンを認識する一又は複数のプローブが任意の担体に結合されて充填されたクロマトグラフィー用カラム、前記プローブが磁性体ビーズに結合されてなる磁気分離用ビーズ、ＩＲ７００、１０Ｂ、ＣｄＳｅ等の光感受性物質により標識された前記プローブ等が挙げられるがこれらに限定はされない。「フィブロネクチン」がＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチンである場合には、前記プローブには（ａ）ＳＳＥＡ－１をエピトープとして認識するプローブ、ならびに（ｂ）フィブロネクチンを認識するプローブが含まれる。
【0055】
さらに、本発明のキットには、試薬用の容器、パッケージ、取扱説明書等の他、測定装置、近赤外光線、紫外線、熱中性子線を照射するための光源等を含めてもよい。
以下、本発明を実施例により、更に詳しく説明する。
以下、本発明を実施例により、更に詳しく説明する。
【実施例】
【0056】
実施例１：未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞の作製
ヒトｉＰＳ細胞、２０１Ｂ７（ＨＰＳ００６３）は、理化学研究所バイオリソースセンターから入手した。ヒトｉＰＳ細胞は、ｍＴｅＳＲ１培地（カタログ番号ＳＴ－０５８５０；Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてマトリゲル（カタログ番号３５４２３０；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上でフィーダーフリーの条件で培養した。培地交換は毎日行った。
ヒトｉＰＳ細胞、２０１Ｂ７（ＨＰＳ００６３）は、理化学研究所バイオリソースセンターから入手した。ヒトｉＰＳ細胞は、ｍＴｅＳＲ１培地（カタログ番号ＳＴ－０５８５０；Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてマトリゲル（カタログ番号３５４２３０；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上でフィーダーフリーの条件で培養した。培地交換は毎日行った。
【0057】
未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞は、以下の方法で作製した。ヒトｉＰＳ細胞を低密度（１：１５～１：２０）で継代し、サプリメントを５６℃で３０分間インキュベートして不活性化し、それをｍＴｅＳＲ１培地に添加して、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。培地交換は３～４日ごとに行い、約２週間培養した。培養８日目に細胞密度が８０％に達した際に、ｒＢＣ２ＬＣＮ－ＰＥ３８（Ｔａｔｅｎｏ ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２０１５）を１００ｎｇ／ｍＬの濃度で添加した。なお、実施例中、細胞の培養はいずれの場合も、３７℃、５％ＣＯ２の環境下で行った。
【0058】
未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞の作製過程における位相差顕微鏡像を、図１Ａに示す。培養過程で徐々に細胞コロニーの形態が変化し、細胞間接着が緩んでいく様子が観察され、培養２日目にはコロニーの輪郭にトゲ状の部位が生じ、培養５日目には細胞間の接着が緩み、隙間が生じている様子が観察された。培養１０日目には大きく扁平な細胞集団が観察された。この結果より、ｒＢＣ２ＬＣＮ－ＰＥ３８処理に付されたヒトｉＰＳ細胞は、未分化性が低下した細胞であると判断された。
【0059】
ヒトｉＰＳ細胞（対照）及び未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞をそれぞれ、４％パラホルムアルデヒド（カタログ番号１６３－２０１４５；和光）で１５分間、室温で固定し、ＰＢＳですすいだ。転写因子染色では、細胞サンプルを０．４％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（カタログ番号Ｔ８７８７；Ｓｉｇｍａ）を含むＰＢＳに１０分間浸した。細胞をブロッキング試薬、１％ＢＳＡおよび５％血清を含むＰＢＳで室温１時間プレハイブリダイズした後、ブロッキング試薬で希釈した一次抗体溶液にて４℃で一晩インキュベートした。一次抗体として以下の抗体を使用した。抗マウスＯｃｔ３／４抗体（ＩｇＧ；モノクローナル；１：３００希釈；カタログ番号ｓｃ－５２７９；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗マウスＳＳＥＡ－４抗体（ＩｇＧ；モノクローナル；１：３００希釈；カタログ番号ＭＡＢ４３０４；メルク）、抗マウスＳＳＥＡ－１抗体（ＩｇＭ；モノクローナル；１：２５０希釈；カタログ番号ＭＡＢ４３０１；メルク）。
【0060】
次に、各細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ブロッキング試薬で希釈した二次抗体溶液と室温で３０分間インキュベートした。二次抗体として以下の抗体を使用した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８に結合した抗マウスＩｇＧ抗体（ＩｇＧ；ポリクローナル；１：３００希釈；カタログ番号Ａ２１２０２；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および抗ウサギＡｌｅｘａ ５９４に結合したＩｇＧ抗体（ＩｇＧ；ポリクローナル；１：３００希釈；カタログ番号Ａ２１２０７；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。サンプルは、４’，６－ｄｉａｍｉｄｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ溶液（ＤＡＰＩ、１：１０００希釈；カタログ番号Ｄ５２３；同仁堂）で共染色した。画像は、ＢＺ－９０００蛍光顕微鏡（Ｋｅｙｅｎｃｅ）を使用して取得した。
【0061】
ヒトｉＰＳ細胞と未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞を、４％パラホルムアルデヒドで１５分間室温固定した。ＰＢＳでリンスした後、細胞をＰＢＳで希釈した１０μｇ／ｍＬのＦＩＴＣ結合ｒＢＣ２ＬＣＮ（カタログ番号１８０－０２９９１、和光）溶液で室温１時間インキュベートした。サンプルは、ＤＡＰＩ溶液（１：１０００希釈；カタログ番号Ｄ５２３；同仁堂）で共染色した。画像は、ＢＺ－９０００蛍光顕微鏡（Ｋｅｙｅｎｃｅ）を使用して取得した。
【0062】
ヒトｉＰＳ細胞と未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞の作製過程における免疫染色像を、図１Ｂに示す（培養３～４日目の細胞）。ヒトｉＰＳ細胞は未分化マーカーであるＯｃｔ３／４、ｒＢＣ２－ＬＣＮ、ＳＳＥＡ－４で緑色蛍光染色されたものの、分化の進んだヒトｉＰＳ細胞に反応するＳＳＥＡ－１（ルイスＸ糖鎖抗原）抗体では染色されなかった。一方、作製した未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞では、未分化マーカー（Ｏｃｔ３／４、ｒＢＣ２－ＬＣＮ、ＳＳＥＡ－４）で一部の細胞しか染色されず、ＳＳＥＡ－１抗体で染色される細胞が確認された。
【0063】
以上の結果より、未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞では、形態が変化し、かつＳＳＥＡ－１抗体で染色される細胞が含まれることがわかった。
【0064】
実施例２：ＳＳＥＡ－１陽性糖タンパク質の同定
細胞培養上清（１００μＬ）を、９μｇのｒＡＢＡレクチンを固定化した９０μＬのストレプトアビジン被覆磁気ビーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて室温で３時間インキュベートした。２００μＬのＰＢＳＴ（１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含むＰＢＳ）で５回洗浄した後、結合したサンプルを２０μＬの０．２％ ＳＤＳで９５℃、５分間溶出した。溶出したサンプルは、５～２０％ポリアクリルアミドゲル（ＤＲＣ）の還元条件下で電気泳動した。分離されたタンパク質をポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）メンブレンに転写し、１μｇ／ｍＬのＨＲＰ標識抗マウスＳＳＥＡ－１モノクローナル抗体（１：２００，カタログ番号ｓｃ－２１７０２；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）溶液でインキュベートした。最後に、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｌｉｇｈｔｉｎｇ Ｐｌｕｓ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で検出した。銀染色はＳｉｌｖｅｒ Ｓｔａｉｎｉｎｇ ＭＳ ｋｉｔ（カタログ番号２９３－７７６０１，Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．）を用いて行った。
細胞培養上清（１００μＬ）を、９μｇのｒＡＢＡレクチンを固定化した９０μＬのストレプトアビジン被覆磁気ビーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて室温で３時間インキュベートした。２００μＬのＰＢＳＴ（１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含むＰＢＳ）で５回洗浄した後、結合したサンプルを２０μＬの０．２％ ＳＤＳで９５℃、５分間溶出した。溶出したサンプルは、５～２０％ポリアクリルアミドゲル（ＤＲＣ）の還元条件下で電気泳動した。分離されたタンパク質をポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）メンブレンに転写し、１μｇ／ｍＬのＨＲＰ標識抗マウスＳＳＥＡ－１モノクローナル抗体（１：２００，カタログ番号ｓｃ－２１７０２；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）溶液でインキュベートした。最後に、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｌｉｇｈｔｉｎｇ Ｐｌｕｓ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で検出した。銀染色はＳｉｌｖｅｒ Ｓｔａｉｎｉｎｇ ＭＳ ｋｉｔ（カタログ番号２９３－７７６０１，Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．）を用いて行った。
【0065】
ヒトｉＰＳ細胞（対照）及び未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞の各培養上清を用いた免疫沈降及びウェスタンブロッティングの結果を、図２Ａに示す。ムチン様糖タンパク質に反応するｒＡＢＡレクチンを用いて、各培養上清からムチン様糖タンパク質を濃縮し、ＳＳＥＡ－１抗体で染色したところ、未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞の培養上清において＞２５０ｋＤａのバンド（矢印で示される）が見られた。一方、ヒトｉＰＳ細胞の培養上清においては、＞２５０ｋＤａのバンドは見られなかった。
【0066】
未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞及びヒトｉＰＳ細胞の培養上清を用いた免疫沈降サンプルにおいて銀染色を行った結果を、図２Ｂに示す。未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞の培養上清における＞２５０ｋＤａのバンド（矢印で示される）をＬＣ－ＭＳ／ＭＳの分析に用いた。
【0067】
ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析では、未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞の培養上清の分析領域（矢印で示される）を銀染色後にＳＤＳゲルから切り出した。対照として、ヒトｉＰＳ細胞の培養上清における対応領域も同様に、ＳＤＳゲルから切り出した。ゲル内での消化は、従来公知の手法に準じて実施した（Ｓｈｅｖｃｈｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１９９６）。すなわち、ゲル片を水とアセトニトリルで洗浄し、次にサンプルをジチオスレイトール（ＤＴＴ）とヨードアセトアミドでアルキル化した。その後、トリプシンを添加し、３７℃で１６時間保持して加水分解反応を行った。反応後、２５ｍＭ炭酸水素アンモニウム、５％ギ酸、およびアセトニトリルを使用して、ゲル片からペプチドを抽出した。最後に、抽出溶液を減圧下で乾燥させた。
【0068】
次いで、乾燥させたペプチドサンプルを水、アセトニトリル、トリフルオロ酢酸（体積比９８：２：０．１）からなる溶媒に溶解し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析に供した。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析は、パラダイムＭＳ４液体クロマトグラフ（Ｍｉｃｈｒｏｍ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ）とＬＴＱ ＯｒｂｉＴｒａｐ ＸＬ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して行った。
【0069】
ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析で取得したＭＳ／ＭＳデータを配列データベース検索に供した。検索ソフトウェアとしてＭａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ社のＭａｓｃｏｔ（ｖｅｒ．２．５）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍａｔｒｉｘｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ／）を用いた。検索用配列データセットは、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／）２０１７＿０８版から出力したヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）由来のタンパク質エントリー（計２０，１９２件）にブタ（Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ）トリプシンのアミノ酸配列を加えて構築した。検索結果を閲覧ソフトウェアＳｃａｆｆｏｌｄ（Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社）に入力した。Ｉｄｅｎｔｉｔｙｔｈｒｅｓｈｏｌｄ以上のＭａｓｃｏｔイオンスコアを示すユニークペプチドが２件以上帰属したタンパク質同定を有意とみなした。同定されたタンパク質の一覧を図２Ｃに示す。その結果、未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞の培養上清の分析領域（矢印で示される）において最も多く検出されたペプチドは、フィブロネクチンであることがわかった。一方、ヒトｉＰＳ細胞の培養上清の対応領域においては、フィブロネクチンは検出されなかった。
【0070】
実施例３：未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞の培養上清におけるＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチンの検出
１．免疫沈降及びウェスタンブロッティング
細胞培養上清（９５μＬ）を、４μｇのビオチン標識フィブロネクチンポリクローナル抗体（カタログ番号ＡＦ１９１８；Ｒ＆Ｄ）を固定化した４０μＬのストレプトアビジン被覆磁気ビーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて室温で３時間インキュベートした。２００μＬのＰＢＳＴ（１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含むＰＢＳ）で５回洗浄した後、結合したサンプルを２０μＬの０．２％ ＳＤＳで９５℃、５分間溶出した。溶出したサンプルは、５～２０％ポリアクリルアミドゲル（ＤＲＣ）の還元条件下で電気泳動した。分離されたタンパク質をポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）メンブレンに転写し、１μｇ／ｍＬのＨＲＰ標識抗マウスＳＳＥＡ－１モノクローナル抗体（１：２００，カタログ番号ｓｃ－２１７０２；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）溶液あるいはフィブロネクチンポリクローナル抗体（カタログ番号ＡＦ１９１８；Ｒ＆Ｄ）でインキュベートした。フィブロネクチンポリクローナル抗体においては、二次抗体反応にＨＲＰ標識抗ヒツジＩｇＧ抗体（カタログ番号３１３－０３５－００３；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を用いた。最後にＷｅｓｔｅｒｎ Ｌｉｇｈｔｉｎｇ Ｐｌｕｓ－ＥＣＬ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で検出した。
１．免疫沈降及びウェスタンブロッティング
細胞培養上清（９５μＬ）を、４μｇのビオチン標識フィブロネクチンポリクローナル抗体（カタログ番号ＡＦ１９１８；Ｒ＆Ｄ）を固定化した４０μＬのストレプトアビジン被覆磁気ビーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて室温で３時間インキュベートした。２００μＬのＰＢＳＴ（１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含むＰＢＳ）で５回洗浄した後、結合したサンプルを２０μＬの０．２％ ＳＤＳで９５℃、５分間溶出した。溶出したサンプルは、５～２０％ポリアクリルアミドゲル（ＤＲＣ）の還元条件下で電気泳動した。分離されたタンパク質をポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）メンブレンに転写し、１μｇ／ｍＬのＨＲＰ標識抗マウスＳＳＥＡ－１モノクローナル抗体（１：２００，カタログ番号ｓｃ－２１７０２；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）溶液あるいはフィブロネクチンポリクローナル抗体（カタログ番号ＡＦ１９１８；Ｒ＆Ｄ）でインキュベートした。フィブロネクチンポリクローナル抗体においては、二次抗体反応にＨＲＰ標識抗ヒツジＩｇＧ抗体（カタログ番号３１３－０３５－００３；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を用いた。最後にＷｅｓｔｅｒｎ Ｌｉｇｈｔｉｎｇ Ｐｌｕｓ－ＥＣＬ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で検出した。
【0071】
また、細胞培養上清（９５μＬ）を、４μｇのビオチン標識フィブロネクチンモノクローナル抗体（カタログ番号ＭＡＢ１９１８；Ｒ＆Ｄ）を固定化した４０μＬのストレプトアビジン被覆磁気ビーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて室温で３時間インキュベートした。２００μＬのＰＢＳＴ（１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含むＰＢＳ）で５回洗浄した後、結合したサンプルを２０μＬの０．２％ ＳＤＳで９５℃、５分間溶出した。溶出したサンプルは、５～２０％ポリアクリルアミドゲル（ＤＲＣ）の還元条件下で電気泳動した。分離されたタンパク質をポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）メンブレンに転写し、１μｇ／ｍＬのＨＲＰ標識抗マウスＳＳＥＡ－１モノクローナル抗体（１：２００，カタログ番号ｓｃ－２１７０２；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）溶液あるいはフィブロネクチンモノクローナル抗体（カタログ番号ＭＡＢ１９１８；Ｒ＆Ｄ）でインキュベートした。フィブロネクチンポリクローナル抗体においては、二次抗体反応にＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（カタログ番号１１５－０３５－００３；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を用いた。最後にＷｅｓｔｅｒｎ Ｌｉｇｈｔｉｎｇ Ｐｌｕｓ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で検出した。
【0072】
２．免疫染色
ヒトｉＰＳ細胞（対照）及び未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞をそれぞれ、４％パラホルムアルデヒド（カタログ番号１６３－２０１４５；和光）で１５分間、室温で固定し、ＰＢＳですすいだ。細胞をブロッキング試薬、１％ＢＳＡおよび５％血清を含むＰＢＳで室温１時間プレハイブリダイズした後、ブロッキング試薬で希釈した抗体溶液にて４℃で一晩インキュベートした。以下の抗体を使用した。ビオチン標識フィブロネクチンモノクローナル抗体（１：１５０；カタログ番号ＭＡＢ１９１８；Ｒ＆Ｄ）。
ヒトｉＰＳ細胞（対照）及び未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞をそれぞれ、４％パラホルムアルデヒド（カタログ番号１６３－２０１４５；和光）で１５分間、室温で固定し、ＰＢＳですすいだ。細胞をブロッキング試薬、１％ＢＳＡおよび５％血清を含むＰＢＳで室温１時間プレハイブリダイズした後、ブロッキング試薬で希釈した抗体溶液にて４℃で一晩インキュベートした。以下の抗体を使用した。ビオチン標識フィブロネクチンモノクローナル抗体（１：１５０；カタログ番号ＭＡＢ１９１８；Ｒ＆Ｄ）。
【0073】
次に、各細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ブロッキング試薬で希釈したＰＥ標識アビジン（１：１００希釈；カタログ番号０１６－１１０－０８４；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）で室温３０分間インキュベートした。サンプルは、ＤＡＰＩ溶液（１：１０００希釈；カタログ番号Ｄ５２３；同仁堂）で共染色した。画像は、ＢＺ－９０００蛍光顕微鏡（Ｋｅｙｅｎｃｅ）を使用して取得した。
【0074】
ヒトｉＰＳ細胞（対照）及び未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞の各培養上清を用いた免疫沈降およびウェスタンブロッティングの結果を、図３Ａと図３Ｂに示す。未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞の培養上清では＞２５０ｋＤａのバンドが検出された（矢印で示される）。一方で、ヒトｉＰＳ細胞の培養上清では＞２５０ｋＤａのバンドは検出されなかった。そのため、ＳＳＥＡ－１抗体陽性の＞２５０Ｄａの糖タンパク質はフィブロネクチンであり、未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞では、培養上清中に分泌されていることがわかった。
【0075】
ヒトｉＰＳ細胞と未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞の免疫染色像を、図３Ｃに示す。ヒトｉＰＳ細胞はフィブロネクチンについて染色されなかったものの、未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞ではフィブロネクチンについて染色された。
【0076】
実施例４：フィブロネクチン抗体とＳＳＥＡ－１抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイ
ビオチン標識ヒトフィブロネクチンモノクローナル抗体（カタログ番号ＦＮ ３０－８、タカラバイオ）をアビジンコートマイクロプレートウェル（カタログ番号ＢＳ－Ｘ７６０３、住友ベークライト）の表面に固定化した。ヒトｉＰＳ細胞（対照）及び未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞の各培養上清を所定の濃度に希釈して室温で１時間反応させた。続いて、ＨＲＰ標識ＳＳＥＡ－１モノクローナル抗体（カタログ番号ｓｃ－２１７０２；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を反応させた。０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０を含む１×ＰＢＳで洗浄した後、サンプルをＴＭＢ溶液（カタログ番号２０８－１７３７１、和光）で室温３０分間インキュベートした。１Ｎ ＨＣｌを加えることで酵素反応を停止し、ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒを使用して、マイクロプレート上の酵素活性を主波長４５０／副波長６２０ｎｍ（ＯＤ４５０／６２０）で測定した。
ビオチン標識ヒトフィブロネクチンモノクローナル抗体（カタログ番号ＦＮ ３０－８、タカラバイオ）をアビジンコートマイクロプレートウェル（カタログ番号ＢＳ－Ｘ７６０３、住友ベークライト）の表面に固定化した。ヒトｉＰＳ細胞（対照）及び未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞の各培養上清を所定の濃度に希釈して室温で１時間反応させた。続いて、ＨＲＰ標識ＳＳＥＡ－１モノクローナル抗体（カタログ番号ｓｃ－２１７０２；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を反応させた。０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０を含む１×ＰＢＳで洗浄した後、サンプルをＴＭＢ溶液（カタログ番号２０８－１７３７１、和光）で室温３０分間インキュベートした。１Ｎ ＨＣｌを加えることで酵素反応を停止し、ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒを使用して、マイクロプレート上の酵素活性を主波長４５０／副波長６２０ｎｍ（ＯＤ４５０／６２０）で測定した。
【0077】
フィブロネクチン抗体とＳＳＥＡ－１抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡを構築し、ヒトｉＰＳ細胞及び未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞の各培養上清の各希釈段階の解析を行った結果を、図４Ａに示す。その結果、未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞の培養上清（黒丸）に高い反応性を示すものの、ヒトｉＰＳ細胞の培養上清（白三角）には反応しないことが分かった。未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞の下限検出値は１００細胞／ｍＬであり、少ない細胞数の未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞を検出できることがわかった。そのため、培養上清を用いてＳＳＥＡ－１陽性フィブロネクチンを検出することで、未分化性が低下もしくは消失したヒトｉＰＳ細胞を非侵襲的、かつ高感度に検出できることがわかった。
【0078】
図４Ｂは、未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞を２５０００細胞／ｍＬ、１２５００細胞／ｍＬ、６２５０細胞／ｍＬ、０細胞／ｍＬでそれぞれ播種した際の培養上清を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡの結果を示すグラフ図である。黒は実際の細胞数、灰色は未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞を単独で培養した際の見かけの細胞数、白色はヒトｉＰＳ細胞と共培養した際の見かけの細胞数を示している。サンドイッチＥＬＩＳＡ法で算出された細胞数は播種した細胞数依存的に反応性を示し、実際の細胞数とほぼ一致することがわかった。さらに、ヒトｉＰＳ細胞共存下でも逸脱細胞を検出できることがわかった。ヒトｉＰＳ細胞共存下で若干高い値が確認されたのは、播種したヒトｉＰＳ細胞中に逸脱細胞が混在していたためであると想定された。
【0079】
実施例５：フィブロネクチンモノクローナル抗体とフィブロネクチンポリクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイ
ビオチン標識ヒトフィブロネクチンモノクローナル抗体（カタログ番号ＦＮ ３０－８、タカラバイオ）をアビジンコートマイクロプレートウェル（カタログ番号ＢＳ－Ｘ７６０３、住友ベークライト）の表面に固定化した。ヒトｉＰＳ細胞（対照）及び未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞の各培養上清を所定の濃度に希釈して室温で１時間反応させた。続いて、ＨＲＰ標識フィブロネクチンポリクローナル抗体（カタログ番号ＡＦ１９１８；Ｒ＆Ｄ）を反応させた。０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０を含む１×ＰＢＳで洗浄した後、サンプルをＴＭＢ溶液（カタログ番号２０８－１７３７１、和光）で室温３０分間インキュベートした。１Ｎ ＨＣｌを加えることで酵素反応を停止し、ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒを使用して、マイクロプレート上の酵素活性を主波長４５０／副波長６２０ｎｍ（ＯＤ４５０／６２０）で測定した。
ビオチン標識ヒトフィブロネクチンモノクローナル抗体（カタログ番号ＦＮ ３０－８、タカラバイオ）をアビジンコートマイクロプレートウェル（カタログ番号ＢＳ－Ｘ７６０３、住友ベークライト）の表面に固定化した。ヒトｉＰＳ細胞（対照）及び未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞の各培養上清を所定の濃度に希釈して室温で１時間反応させた。続いて、ＨＲＰ標識フィブロネクチンポリクローナル抗体（カタログ番号ＡＦ１９１８；Ｒ＆Ｄ）を反応させた。０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０を含む１×ＰＢＳで洗浄した後、サンプルをＴＭＢ溶液（カタログ番号２０８－１７３７１、和光）で室温３０分間インキュベートした。１Ｎ ＨＣｌを加えることで酵素反応を停止し、ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒを使用して、マイクロプレート上の酵素活性を主波長４５０／副波長６２０ｎｍ（ＯＤ４５０／６２０）で測定した。
【0080】
フィブロネクチンモノクローナル抗体とフィブロネクチンポリクローナル抗体を用いた以外は上記実施例４と同様にして、サンドイッチＥＬＩＳＡを構築した。これを用いて、ヒトｉＰＳ細胞及び未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞の各培養上清の各希釈段階の解析を行った結果を、図５に示す。その結果、未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞の培養上清（黒丸）に高い反応性を示すものの、ヒトｉＰＳ細胞の培養上清（白三角）には反応しないことが分かった。未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞の下限検出値は１００細胞／ｍＬであり、少ない細胞数の未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞を検出できることがわかった。そのため、培養上清を用いてフィブロネクチンを検出することで、未分化性が低下もしくは消失したヒトｉＰＳ細胞を非侵襲的、かつ高感度に検出できることがわかった。
【0081】
実施例６：ＩＲ７００標識フィブロネクチン抗体によるヒトｉＰＳ細胞（対照）及び未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞の生細胞イメージング
ＩＲ７００標識は、ＩＲＤｙｅ７００ＤＸタンパク質標識キット（ＬＩ－ＣＯＲ Ｉｎｃ）を用いて行われた。フィブロネクチン抗体（カタログ番号ＡＦ１９１８；Ｒ＆Ｄ）またはヒツジ免疫グロブリンＧ（カタログ番号５－００１－Ａ；Ｒ＆Ｄ）に対するポリクローナル抗体をＩＲ７００とともに室温で２時間インキュベートした。タンパク質のモル比および濃度は、ＵＶ－１９００分光光度計（島津製作所）を使用して、それぞれ２８０ｎｍ（タンパク質）および６８９ｎｍ（ＩＲ７００）での吸光度を測定することによって決定された。
ＩＲ７００標識は、ＩＲＤｙｅ７００ＤＸタンパク質標識キット（ＬＩ－ＣＯＲ Ｉｎｃ）を用いて行われた。フィブロネクチン抗体（カタログ番号ＡＦ１９１８；Ｒ＆Ｄ）またはヒツジ免疫グロブリンＧ（カタログ番号５－００１－Ａ；Ｒ＆Ｄ）に対するポリクローナル抗体をＩＲ７００とともに室温で２時間インキュベートした。タンパク質のモル比および濃度は、ＵＶ－１９００分光光度計（島津製作所）を使用して、それぞれ２８０ｎｍ（タンパク質）および６８９ｎｍ（ＩＲ７００）での吸光度を測定することによって決定された。
【0082】
細胞を、５％ＣＯ２、３７℃で１時間または６時間、ＩＲ７００標識フィブロネクチン抗体とともにインキュベートした。核染色のために、細胞をさらにヘキスト３３３４２溶液（１：１０００希釈、Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ）で５から１０分間インキュベートした。画像は、共焦点顕微鏡（オリンパス株式会社）またはＢＺ－９０００蛍光顕微鏡（株式会社キーエンス）で取得した。
【0083】
図６Ａに、生きたヒトｉＰＳ細胞（対照）及び生きた未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞をＩＲ７００標識フィブロネクチン抗体（赤色）を用いて室温で１時間染色した免疫染色像を示す。核はヘキスト３３３４２（青色）で染色した。スケールバーは１００μｍを示す。また、図６Ｂに、生きた未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞を、３７℃で１時間（左パネル）または６時間（右パネル）ＩＲ７００標識フィブロネクチン抗体（赤色）を用いて染色した免疫染色像を示す。スケールバーは１００μｍを示す。
【0084】
未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞には、ＩＲ７００標識フィブロネクチン抗体の結合が確認されたが、ヒトｉＰＳ細胞ではその結合は確認されなかった。未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞とＩＲ７００標識フィブロネクチン抗体との結合量は、共インキュベーションの時間が６時間の場合も１時間の場合と差が見られない（６時間後も十分に結合が維持されている）ことが確認された。
【0085】
実施例７：ヒトｉＰＳ細胞（対照）及び未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞の生存率に対するＩＲ７００標識フィブロネクチン抗体と近赤外線（Ｎｅａｒ－Ｉｎｆｒａｒｅｄ：ＮＩＲ）照射の影響の検証
ＮＩＲ照射の前日、細胞を９６ウェルあるいは１２ウェルプレートに播種し、２４時間インキュベートした。培地を交換した後、細胞をＩＲ７００標識フィブロネクチン抗体またはＩＲ７００標識ヒツジ免疫グロブリンＧと１時間または６時間インキュベートし、次に１０ｍＷ／ｃｍ２の電力密度でＮＩＲ発光ダイオードを照射した（エビス電子株式会社）。画像は、ＢＺ－９０００蛍光顕微鏡（株式会社キーエンス）を使用して取得した。
ＮＩＲ照射の前日、細胞を９６ウェルあるいは１２ウェルプレートに播種し、２４時間インキュベートした。培地を交換した後、細胞をＩＲ７００標識フィブロネクチン抗体またはＩＲ７００標識ヒツジ免疫グロブリンＧと１時間または６時間インキュベートし、次に１０ｍＷ／ｃｍ２の電力密度でＮＩＲ発光ダイオードを照射した（エビス電子株式会社）。画像は、ＢＺ－９０００蛍光顕微鏡（株式会社キーエンス）を使用して取得した。
【0086】
哺乳類細胞用ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ／Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、細胞生存率を分析した。生細胞は２μＭのカルセイン－アセトキシメチル（ＡＭ）で染色され、死細胞は４μＭのエチジウムホモダイマー１（ＥｔｈＤ－１）で３７℃で４０分間染色された。画像はＢＺ－９０００蛍光顕微鏡（株式会社キーエンス）で取得した。
【0087】
図７Ａに、無処理、ＩＲ７００標識フィブロネクチン抗体処理、ＮＩＲ照射処理、ならびに、ＩＲ７００標識フィブロネクチン抗体処理とそれに続くＮＩＲ照射処理にそれぞれ付した、未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞の生存率を生細胞染色（カルセイン－ＡＭ：緑色）および死細胞染色（ＥｔｈＤ－１：赤色）によって分析した結果を示す。無処理、ＩＲ７００標識フィブロネクチン抗体処理、およびＮＩＲ照射処理に付した細胞では死細胞はほとんど認められなかったが、ＩＲ７００標識フィブロネクチン抗体処理とそれに続くＮＩＲ照射処理に付した細胞においては、死細胞の増大と生細胞の減少が確認された。
【0088】
図７Ｂに、無処理、ＩＲ７００標識フィブロネクチン抗体処理、ＮＩＲ処理、ならびに、ＩＲ７００標識フィブロネクチン抗体とそれに続くＮＩＲ照射処理にそれぞれ付した、ヒトｉＰＳ細胞（対照）の生存率を生細胞染色（カルセイン－ＡＭ：緑色）および死細胞染色（ＥｔｈＤ－１：赤色））によって分析した結果を示す。上述の未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞の場合と異なり、ＩＲ７００標識フィブロネクチン抗体処理とそれに続くＮＩＲ照射処理に付した細胞においても、死細胞はほとんど認められなかった。
【0089】
実施例８：ヒトｉＰＳ細胞（対照）及び未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞の生存率に対するＩＲ７００標識フィブロネクチン抗体とＮＩＲ照射の定量的効果
Ｃｅｌｌ－Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８（Ｄｏｊｉｎｄｏ ＭｏｌｅｃｕｌａｒＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ）を使用して、細胞生存率を定量化した。１０μＬのＣｅｌｌ－Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８溶液を９６ウェルプレートの各ウェルの細胞に添加し、３７℃で２時間インキュベートした。その後、マイクロタイタープレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ３、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して４５０ｎｍでの吸光度を測定した。細胞生存率を計算するために、３７℃で２時間インキュベートした未処理培地をネガティブコントロールとして使用した。
Ｃｅｌｌ－Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８（Ｄｏｊｉｎｄｏ ＭｏｌｅｃｕｌａｒＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ）を使用して、細胞生存率を定量化した。１０μＬのＣｅｌｌ－Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８溶液を９６ウェルプレートの各ウェルの細胞に添加し、３７℃で２時間インキュベートした。その後、マイクロタイタープレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ３、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して４５０ｎｍでの吸光度を測定した。細胞生存率を計算するために、３７℃で２時間インキュベートした未処理培地をネガティブコントロールとして使用した。
【0090】
ヒトｉＰＳ細胞（対照）及び未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞をさまざまな濃度のＩＲ７００標識フィブロネクチン抗体（０～１０ｎｇ／ｍＬ）とそれぞれ１時間インキュベートした後、ＮＩＲ照射に１０分間曝露した。２４時間後、１０μＬのＣＣＫ－８溶液を培地に添加し、さらに２時間インキュベートした後、４５０ｎｍでの吸光度を測定した。図８Ａに、ヒトｉＰＳ細胞（対照）（白丸）及び未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞（黒丸）の各細胞生存率（％）を示す。細胞生存率（％）は、ＩＲ７００標識フィブロネクチン抗体処理とそれに続くＮＩＲ照射処理に付した細胞の４５０ｎｍでの吸光度を、未処理の細胞のそれと比較して計算した。データは、３回の測定の平均±標準偏差として示されている。この結果、ＩＲ７００標識フィブロネクチン抗体処理とそれに続くＮＩＲ照射処理により、未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞の生存率を顕著に低下できることが確認された。また、その効果は、１ｎｇ／ｍＬ程度のわずかな量のＩＲ７００標識フィブロネクチン抗体を用いることによって得ることができ、１０ｎｇ／ｍＬ程度の量で用いた場合には、当該細胞をほぼ死滅させることができた。
【0091】
また、ヒトｉＰＳ細胞（対照）及び未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞をそれぞれ、１０ｎｇ／ｍＬのＩＲ７００標識フィブロネクチン抗体と１時間インキュベートし、さらにさまざまな時間（０～１０分）ＮＩＲ照射に曝露した。２４時間後、１０μＬのＣＣＫ－８溶液を培地に添加し、さらに２時間インキュベートした後、４５０ｎｍでの吸光度を測定した。図８Ｂに、ヒトｉＰＳ細胞（対照）（白丸）及び未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞（黒丸）の各細胞生存率（％）を示す。細胞生存率（％）は、ＩＲ７００標識フィブロネクチン抗体のみで処理された細胞と比較したＩＲ７００標識フィブロネクチン抗体処理とそれに続くＮＩＲ照射処理に付した細胞の４５０ｎｍでの吸光度を、ＩＲ７００標識フィブロネクチン抗体のみで処理された細胞のそれと比較して計算した。データは、３回の測定の平均±標準偏差として示されている。この結果、およそ３分程度の短いＮＩＲ照射処理により、ＩＲ７００標識フィブロネクチン抗体処理した未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞の生存率を顕著に低下できることが確認され、５分程度の照射によれば当該細胞を完全に死滅させることができた。
【0092】
実施例９：ＩＲ７００標識フィブロネクチン抗体処理とＮＩＲ照射処理によるヒトｉＰＳ細胞（対照）培養での未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞の選択的除去
図９Ａに、無処理、ＩＲ７００標識フィブロネクチン抗体処理、ＮＩＲ照射処理、ならびに、ＩＲ７００標識フィブロネクチン抗体処理とそれに続くＮＩＲ照射処理にそれぞれ付した、ヒトｉＰＳ細胞（対照）（コロニー形成細胞）及び未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞（長く伸びた、大きく平らな形状）の共培養物を生細胞染色（カルセイン－ＡＭ：緑色）および死細胞染色（ＥｔｈＤ－１：赤色）によって分析した結果を示す。この結果、ＩＲ７００標識フィブロネクチン抗体処理とそれに続くＮＩＲ照射処理に付した未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞において、死細胞の増大と生細胞の減少が確認された。
図９Ａに、無処理、ＩＲ７００標識フィブロネクチン抗体処理、ＮＩＲ照射処理、ならびに、ＩＲ７００標識フィブロネクチン抗体処理とそれに続くＮＩＲ照射処理にそれぞれ付した、ヒトｉＰＳ細胞（対照）（コロニー形成細胞）及び未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞（長く伸びた、大きく平らな形状）の共培養物を生細胞染色（カルセイン－ＡＭ：緑色）および死細胞染色（ＥｔｈＤ－１：赤色）によって分析した結果を示す。この結果、ＩＲ７００標識フィブロネクチン抗体処理とそれに続くＮＩＲ照射処理に付した未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞において、死細胞の増大と生細胞の減少が確認された。
【0093】
また、付着した未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞を２０μＭのＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒＧｒｅｅｎ－５－クロロメチルフルオレセインジアセテート（ＣＭＦＤＡ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で染色し、１２ウェルプレートのウェルでヒトｉＰＳ細胞（対照）と共培養した。これを無処理、ＩＲ７００標識フィブロネクチン抗体処理、ＮＩＲ照射処理、ならびに、ＩＲ７００標識フィブロネクチン抗体処理とそれに続くＮＩＲ照射処理にそれぞれ付した後、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ組換え酵素溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、ヒトｉＰＳ細胞（対照）及び未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞を含む単一細胞懸濁液を調製し、１％ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁した。得られた細胞懸濁液を、ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｎｃ．）、及びＦｌｏｗＪｏｖ１０ソフトウェア（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してデータ分析し、各細胞の存在量を確認した。分析結果を図９Ｂに示す。この結果、ＩＲ７００標識フィブロネクチン抗体処理とそれに続くＮＩＲ照射処理により、共培養物の中から未分化性を低下させたヒトｉＰＳ細胞を選択的に除去できることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【0094】
本発明によれば、細胞を減らすことなく非侵襲的に、簡便かつ効率的にヒトｉＰＳ細胞の未分化性を判定又は評価することができ、さらに、未分化性が低下した細胞のみを選択的に除去することができる。このため、本発明はヒトｉＰＳ細胞の品質管理への貢献が期待される極めて有用な技術であるといえる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
