特許 7539420 アデノ随伴ウイルスの精製方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-08-15

(45)【発行日】2024-08-23

(54)【発明の名称】アデノ随伴ウイルスの精製方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 7/02 20060101AFI20240816BHJP

   C12N 7/01 20060101ALN20240816BHJP

   C07K 14/015 20060101ALN20240816BHJP

【ＦＩ】

C12N7/02

C12N7/01 ZNA

C07K14/015

【請求項の数】 17

(21)【出願番号】P 2021577391

(86)(22)【出願日】2020-06-26

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-09-07

(86)【国際出願番号】 US2020039971

(87)【国際公開番号】W WO2020264411

(87)【国際公開日】2020-12-30

【審査請求日】2023-05-17

(31)【優先権主張番号】62/868,282

(32)【優先日】2019-06-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】000002934

【氏名又は名称】武田薬品工業株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100139723

【弁理士】

【氏名又は名称】樋口 洋

(74)【代理人】

【識別番号】100116540

【弁理士】

【氏名又は名称】河野 香

(72)【発明者】

【氏名】フィードラー，クリスティアン

(72)【発明者】

【氏名】シャインデル，マルクス

(72)【発明者】

【氏名】ハスラヒャー，マインハルト

(72)【発明者】

【氏名】コーエン，ヤドランカ

【審査官】藤澤 雅樹

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１８－５０７７０７（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００２－５０３４８４（ＪＰ，Ａ）

【文献】Molecular Therapy，2018年，Vol.26, No.5, Suppl.1，p.291, Abstract No.631

【文献】Mol. Ther. Methods Clin. Dev.，2018年，Vol.9，pp.33-46

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ ７／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を精製する方法であって、
（ａ）ＡＡＶ含有溶液を、ＡＡＶを標的とするアフィニティ樹脂に、室温で、溶液中のＡＡＶとアフィニティ樹脂との間の結合を可能にする条件下でロードするステップ；
（ｂ）室温で、少なくとも１つの、洗浄バッファーでの洗浄ステップを行うステップ；および
（ｃ）１８℃未満の温度で、アフィニティ樹脂からＡＡＶを溶出するステップ；
を含み、
前記ＡＡＶはＡＡＶ９であり、前記アフィニティ樹脂はＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶＸである、方法。

【請求項2】

ステップ（ｃ）における温度が１℃～１２℃である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

ステップ（ｃ）における温度が２℃～８℃である、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

室温で少なくとも２つの洗浄ステップが行われる、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

少なくとも１つの洗浄バッファーが、７．５～９．２のｐＨで、１０ｍＭ～２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび５０ｍＭ～５００ｍＭの塩を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

少なくとも１つの洗浄バッファーが、５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび１２５ ｍＭの塩を含み、８．５のｐＨを有する、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

少なくとも１つの洗浄バッファーが、５．０～７．４のｐＨで、１０ｍＭ～２０００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび０．００１％～１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

少なくとも１つの洗浄バッファーが、１００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含み、６．０のｐＨを有する、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

少なくとも１つの洗浄バッファーが、７．５～９．２のｐＨで、１０ｍＭ～２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび１０％～７５％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

少なくとも１つの洗浄バッファーが、６．０～８．０のｐＨで、１０ｍＭ～２００ｍＭのグリシン、１ｍＭ～１００ｍＭのヒスチジン、２０ｍＭ～５００ｍＭの塩、１％～１０％（ｗ／ｗ）のトレハロース、および０．０００５％～１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

少なくとも１つの洗浄バッファーが、６．０～８．８のｐＨで、１ｍＭ～２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、５０ｍＭ～５００ｍＭの塩、および０．００１％～１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

ステップ（ｃ）が、少なくとも１つの溶出バッファーでＡＡＶを溶出することを含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

少なくとも１つの溶出バッファーが、洗浄バッファーの少なくとも１つと同じである、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

少なくとも１つの溶出バッファーが、ステップ（ｃ）においてＡＡＶを溶出する前の最終洗浄ステップで使用される最後の洗浄バッファーと同じである、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

第１の溶出バッファーが、ステップ（ｃ）においてＡＡＶを溶出する前の最終洗浄ステップで使用される最後の洗浄バッファーと同じである、請求項１３に記載の方法。

【請求項16】

前記バッファーが、５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび１２５ｍＭのＮａＣｌを含み、８．５のｐＨを有する、請求項５または６に記載の方法。

【請求項17】

溶出ステップ（ｃ）から溶出されるＡＡＶカプシドの少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％が、完全ＡＡＶカプシドである、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【関連出願の相互参照】

【0001】

本出願は、２０１９年６月２８日に出願された米国仮特許出願第６２／８６８，２８２号の優先権を主張し、その開示内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【技術分野】

【0002】

本発明は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を精製する材料および方法に関する。

【背景技術】

【0003】

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、線状一本鎖ＤＮＡゲノムをパッケージングする小型の非エンベロープウイルスである。ＡＡＶの増殖性感染はアデノウイルスやヘルペスウイルスなどのヘルパーウイルスの存在下でのみ生じることから、ＡＡＶはパルボウイルス科ディペンドウイルス属に属する。

【0004】

ＡＡＶを臨床で安全に使用するために、ＡＡＶはそのゲノム内のいくつかの位置で遺伝子改変されている。例えば、多くのウイルスベクターにおいて、ウイルスの複製に必要なＲｅｐ遺伝子、および部位特異的組み込みに必要な要素が、ＡＡＶゲノムから除去されている。このような組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は、染色体外状態で存在し、ゲノムＤＮＡへの組み込み効率は非常に低い。そのため、ｒＡＡＶが宿主細胞においてランダム突然変異を誘発する可能性は、完全にはなくならないまでも低減される。これらの特性ならびに病原性のなさから、ｒＡＡＶは遺伝子治療用ベクターとして、前臨床および臨床適用のさまざまな場面で大きな期待が寄せられている。

【0005】

ヒトへの投与に適したＡＡＶ生成物を精製するための効率的で大規模な方法を設計するための努力はは多大なものであったが、より優れたＡＡＶ精製法が依然として必要とされている。ＡＡＶの精製中に、より効率的に除去することができる宿主細胞培養マトリックスからの他の様々なタンパク質や物質がある。したがって、最終ＡＡＶ生成物から宿主細胞物質を除去するステップを含むＡＡＶ精製法が望まれている。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0006】

細胞培養でのＡＡＶベクター製造の特徴は、破壊された細胞からの物質を含む複雑なマトリックスの形成である。特に、宿主細胞タンパク質、プロテアソーム、細胞残屑（cell debris）、および潜在的なウイルス特異的受容体が、破壊された細胞からの物質中に存在することが多い。本開示の方法は、生理学的に適用可能なｐＨでより高い純度をもたらす条件で、最終ＡＡＶ生成物から宿主細胞物質を除去するステップを含む。

【0007】

一態様において、本明細書で提供されるのは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を精製する方法であって、その方法は、
（ａ）ＡＡＶ含有溶液を、ＡＡＶ上のエピトープを標的とするアフィニティ樹脂に、溶液中のＡＡＶとアフィニティ樹脂との間の結合を可能にする条件下でロードすること、
（ｂ）室温で、少なくとも１つの洗浄ステップを行うこと、および
（ｃ）１８℃未満の温度で、アフィニティ樹脂からＡＡＶを溶出すること
を含む。

【0008】

室温は１８～２６℃の間である。室温は、１８℃、１８．５℃、１９℃、１９．５℃、２０℃、２０．５℃、２１℃、２１．５℃、２２℃、２２．５℃、２３℃、２３．５℃、２４℃、２４．５℃、２５℃、２５．５℃、または２６℃であり得る。室温は、１８℃、約１８．５℃、約１９℃、約１９．５℃、約２０℃、約２０．５℃、約２１℃、約２１．５℃、約２２℃、約２２．５℃、約２３℃、約２３．５℃、約２４℃、約２４．５℃、約２５℃、約２５．５℃、または２６℃であり得る。

【0009】

いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）の温度は、１℃～１２℃の間である。いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）の温度は、２℃～８℃の間である。いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）の温度は、１℃、１．５℃、２℃、２．５℃、３℃、３．５℃、４℃、４．５℃、５℃、５．５℃、６℃、６．５℃、７℃、７．５℃、８℃、８．５℃、９℃、９．５℃、１０℃、１０．５℃、１１℃、１１．５℃、または１２℃である。いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）の温度は、約１℃、約１．５℃、約２℃、約２．５℃、約３℃、約３．５℃、約４℃、約４．５℃、約５℃、約５．５℃、約６℃、約６．５℃、約７℃、約７．５℃、約８℃、約８．５℃、約９℃、約９．５℃、約１０℃、約１０．５℃、約１１℃、約１１．５℃、または約１２℃である。

【0010】

いくつかの実施形態では、本方法は、ＡＡＶ含有溶液をアフィニティ樹脂にロードする前に、ＡＡＶ含有溶液を陰イオン交換体と接触させること、および陰イオン交換体からＡＡＶ含有溶液を溶出させることをさらに含む。

【0011】

いくつかの実施形態では、溶出ステップから得られたＡＡＶは、≦９９．９％のＨＣ不純物レベルを有する。いくつかの実施形態では、溶出ステップから得られたＡＡＶは、≦９９．０％のＨＣ不純物レベルを有する。

【0012】

いくつかの実施形態では、ＡＡＶはＡＡＶ９である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ９は、野生型ＶＰ１を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ９は、配列番号１のＶＰ１を含む。

【0013】

いくつかの実施形態では、本方法は、ＡＡＶ含有溶液を、酸性の荷電汚染物質をＡＡＶ含有溶液から枯渇させるのに有効な正荷電基を含むフィルターと接触させることをさらに含む。

【0014】

いくつかの実施形態では、本方法は、３５ｎｍより大きいウイルスを除去するためにＡＡＶ画分をナノろ過することをさらに含む。

【0015】

いくつかの実施形態では、本方法は、陽イオン交換クロマトグラフィーを行うことを含むポリッシングステップをさらに含む。

【0016】

いくつかの実施形態では、本方法は、ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡを介してＡＡＶ画分を検査することをさらに含む。

【0017】

いくつかの実施形態では、ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡは、ＡＡＶに特異的なサンドイッチＥＬＩＳＡである。

【0018】

別の態様では、本明細書で提供されるのは、上記の方法のいずれかによって製造されたＡＡＶ生成物である。

【0019】

一態様では、本明細書で提供されるのは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を精製する方法であって、その方法は、（ａ）ＡＡＶ含有溶液を、ＡＡＶを標的とするアフィニティ樹脂に、室温で、溶液中のＡＡＶとアフィニティ樹脂との間の結合を可能にする条件下でロードすること；（ｂ）室温で、少なくとも１つの洗浄ステップを行うこと；および（ｃ）１８℃未満の温度で、アフィニティ樹脂からＡＡＶを溶出すること；を含む。

【0020】

いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）の温度は、１℃～１２℃の間である。いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）の温度は、２℃～８℃の間である。

【0021】

いくつかの実施形態では、本方法は、ＡＡＶ含有溶液をアフィニティ樹脂にロードする前に、ＡＡＶ含有溶液を陰イオン交換体と接触させること、および陰イオン交換体からＡＡＶ含有溶液を溶出させることをさらに含む。

【0022】

いくつかの実施形態では、室温で少なくとも２つの洗浄ステップが行われる。いくつかの実施形態では、室温で少なくとも３つの洗浄ステップが行われる。いくつかの実施形態では、室温で少なくとも４つの洗浄ステップが行われる。

【0023】

いくつかの実施形態では、２つの洗浄ステップが行われる。いくつかの実施形態では、３つの洗浄ステップが行われる。いくつかの実施形態では、４つの洗浄ステップが行われる。

【0024】

いくつかの実施形態では、洗浄ステップが連続して行われる。

【0025】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの洗浄バッファーは、約１０～約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約５０～約５００ｍＭの塩を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの洗浄バッファーは、約２５～約１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約７５～約２５０ｍＭの塩を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの洗浄バッファーは、約４０～約６０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１００～約１５０ｍＭの塩を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの洗浄バッファーは、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１２５ｍＭの塩を含む。いくつかの実施形態では、洗浄バッファーは、約７．５～約９．２、約８．０～約９．０、または約８．０～約８．８、または約８．５のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの洗浄バッファーは、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１２５ｍＭの塩を含み、約８．５のｐＨを有する。

【0026】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの洗浄バッファーは、約１０～約２０００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．００１～約１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの洗浄バッファーは、約５０～約２００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．００５～約０．３％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの洗浄バッファーは、約９０～約１１０ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．０５～約０．２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの洗浄バッファーは、約１００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む。いくつかの実施形態では、洗浄バッファーは、約５．０～約７．４、約５．５～約７．０、または約５．５～約６．５、または約６．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの洗浄バッファーは、約１００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含み、約６．０のｐＨを有する。

【0027】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの洗浄バッファーは、約１０ｍＭ～約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１０％～約７５％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの洗浄バッファーは、約２５ｍＭ～約１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約２５％～約７０％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの洗浄バッファーは、約４０ｍＭ～約６０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約４０％～約６０％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの洗浄バッファーは、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約５０％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含む。いくつかの実施形態では、洗浄バッファーは、約７．５～約９．２、約８．０～約９．０、または約８．０～約８．８、または約８．５のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの洗浄バッファーは、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約５０％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含み、約８．５のｐＨを有する。

【0028】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの洗浄バッファーは、約１０～約２００ｍＭのグリシン、約１～約１００ｍＭのヒスチジン、約２０～約５００ｍＭの塩、約１～約１０％（ｗ／ｗ）のトレハロース、および約０．０００５～約１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの洗浄バッファーは、約３０ｍＭ～約８０ｍＭのグリシン、約５～約２０ｍＭのヒスチジン、約５０～約２００ｍＭの塩、約３～約８％（ｗ／ｗ）のトレハロース、および約０．００１～約０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの洗浄バッファーは、約４０～約６０ｍＭのグリシン、約５～約１５ｍＭのヒスチジン、約９０～約１１０ｍＭの塩、約４～約６％（ｗ／ｗ）のトレハロース、および約０．００１～約０．０５％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの洗浄バッファーは、約５０ｍＭのグリシン、約１０ｍＭのヒスチジン、約１００ｍＭの塩、約５％（ｗ／ｗ）のトレハロース、約０．００５％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む。いくつかの実施形態では、洗浄バッファーは、約６．０～約８．０、約６．５～約７．５、または約７．０～約７．４、または約７．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの洗浄バッファーは、約５０ｍＭのグリシン、約１０ｍＭのヒスチジン、約１００ｍＭの塩、約５％（ｗ／ｗ）のトレハロース、約０．００５％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含み、約７．０のｐＨを有する。

【0029】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの洗浄バッファーは、約１～約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、約５０～約５００ｍＭの塩、および約０．００１～約１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの洗浄バッファーは、約５～約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、約７５～約２５０ｍＭの塩、および約０．００５～約０．３％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの洗浄バッファーは、約１０～約３０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、約１４０～約１６０ｍＭの塩、および約０．０５～約０．２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの洗浄バッファーは、約２０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、約１５０ｍＭの塩、および約０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む。いくつかの実施形態では、洗浄バッファーは、約６．０～約８．８、約６．５～約８．５、または約７．０～約８．０、または約７．４のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの洗浄バッファーは、約２０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、約１５０ｍＭの塩、および約０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含み、約７．４のｐＨを有する。

【0030】

いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）は、少なくとも１つの溶出バッファーでＡＡＶを溶出することを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの溶出バッファーは、少なくとも１つの洗浄バッファーと同じである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの溶出バッファーは、ステップ（ｃ）でＡＡＶを溶出する前の最終洗浄ステップで使用される最後の洗浄バッファーと同じである。いくつかの実施形態では、第１の溶出バッファーは、ステップ（ｃ）でＡＡＶを溶出する前の最終洗浄ステップで使用される最後の洗浄バッファーと同じである。

【0031】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの溶出バッファーは、約１０～約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約５０～約５００ｍＭの塩を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの溶出バッファーは、約２５～約１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約７５～約２５０ｍＭの塩を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの溶出バッファーは、約４０～約６０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１００～約１５０ｍＭの塩を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの溶出バッファーは、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１２５ｍＭの塩を含む。いくつかの実施形態では、溶出バッファーは、約７．５～約９．２、約８．０～約９．０、または約８．０～約８．８、または約８．５のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの溶出バッファーは、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１２５ｍＭの塩を含み、約８．５のｐＨを有する。

【0032】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの溶出バッファーは、約１０～約２０００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．００１～約１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの溶出バッファーは、約５０～約２００ｍＭの酢酸ナトリウム、および約０．００５～約０．３％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの溶出バッファーは、約９０～約１１０ｍＭの酢酸ナトリウム、および約０．０５～約０．２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの溶出バッファーは、約１００ｍＭの酢酸ナトリウム、および約０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む。いくつかの実施形態では、溶出バッファーは、約５．０～約７．４、約５．５～約７．０、または約５．５～約６．５、または約６．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの溶出バッファーは、約１００ｍＭの酢酸ナトリウム、および約０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含み、約６．０のｐＨを有する。

【0033】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの溶出バッファーは、約１０ｍＭ～約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、および約１０％～約７５％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの溶出バッファーは、約２５ｍＭ～約１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、および約２５％～約７０％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの溶出バッファーは、約４０ｍＭ～約６０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、および約４０％～約６０％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの溶出バッファーは、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、および約５０％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含む。いくつかの実施形態では、溶出バッファーは、約７．５～約９．２、約８．０～約９．０、または約８．０～約８．８、または約８．５のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの溶出バッファーは、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、および約５０％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含み、約８．５のｐＨを有する。

【0034】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの溶出バッファーは、約１０～約２００ｍＭのグリシン、約１～約１００ｍＭのヒスチジン、約２０～約５００ｍＭの塩、約１～約１０％（ｗ／ｗ）のトレハロース、および約０．０００５～約１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの溶出バッファーは、約３０～約８０ｍＭのグリシン、約５～約２０ｍＭのヒスチジン、約５０～約２００ｍＭの塩、約３～約８％のトレハロース、および約０．００１～約０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの溶出バッファーは、約４０～約６０ｍＭのグリシン、約５～約１５ｍＭのヒスチジン、約９０～約１１０ｍＭの塩、約４～約６％（ｗ／ｗ）のトレハロース、および約０．００１～約０．０５％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの溶出バッファーは、約５０ｍＭのグリシン、約１０ｍＭのヒスチジン、約１００ｍＭの塩、約５％（ｗ／ｗ）のトレハロース、および約０．００５％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む。いくつかの実施形態では、溶出バッファーは、約６．０～約８．０、約６．５～約７．５、または約７．０～約７．４、または約７．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの溶出バッファーは、約５０ｍＭのグリシン、約１０ｍＭのヒスチジン、約１００ｍＭの塩、約５％（ｗ／ｗ）のトレハロース、および約０．００５％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含み、約７．０のｐＨを有する。

【0035】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの溶出バッファーは、約１～約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、約５０～約５００ｍＭの塩、および約０．００１～約１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの溶出バッファーは、約５～約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、約７５～約２５０ｍＭの塩、および約０．００５～約０．３％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの溶出バッファーは、約１０～約３０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、約１４０～約１６０ｍＭの塩、および約０．０５％～約０．２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの溶出バッファーは、約２０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、約１５０ｍＭの塩、および０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む。いくつかの実施形態では、溶出バッファーは、約６．０～約８．８、約６．５～約８．５、または約７．０～約８．０、または約７．４のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの溶出バッファーは、約２０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、約１５０ｍＭの塩、および０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含み、約７．４のｐＨを有する。

【0036】

いくつかの実施形態では、第１、第２、第３、および／または第４の洗浄ステップは、約１０～約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約５０～約５００ｍＭの塩を含むバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、第１、第２、第３、および／または第４の洗浄ステップは、約２５～約１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約７５～約２５０ｍＭの塩を含むバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、第１、第２、第３、および／または第４の洗浄ステップは、約４０～約６０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１００～約１５０ｍＭの塩を含むバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、第１、第２、第３、および／または第４の洗浄ステップは、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１２５ｍＭの塩を含むバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、第１、第２、第３、および／または第４の洗浄ステップは、約７．５～約９．２、約８．０～約９．０、または約８．０～約８．８、または約８．５のｐＨを有するバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、第１、第２、第３、および／または第４の洗浄ステップは、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１２５ｍＭの塩を含みかつ約８．５のｐＨを有するバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。

【0037】

いくつかの実施形態では、第１、第２、第３、および／または第４の洗浄ステップは、約１０～約２０００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．００１～約１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、第１、第２、第３、および／または第４の洗浄ステップは、約５０～約２００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．００５～約０．３％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、第１、第２、第３、および／または第４の洗浄ステップは、約９０～約１１０ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．０５～約０．２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、第１、第２、第３、および／または第４の洗浄ステップは、約１００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、第１、第２、第３、および／または第４の洗浄ステップは、約５．０～約７．４、約５．５～約７．０、または約５．５～約６、または約６のｐＨを含む。いくつかの実施形態では、第１、第２、第３、および／または第４の洗浄ステップは、約１００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含みかつ約６．０のｐＨを有するバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。

【0038】

いくつかの実施形態では、第１の洗浄ステップは、約１０～約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約５０～約５００ｍＭの塩を含む第１のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、第１の洗浄ステップは、約２５～約１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約７５～約２５０ｍＭの塩を含む第１のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、第１の洗浄ステップは、約４０～約６０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１００～約１５０ｍＭの塩を含む第１のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、第１の洗浄ステップは、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１２５ｍＭの塩を含む第１のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、第１の洗浄ステップは、約７．５～約９．２、約８．０～約９．０、または約８．０～約８．８、または約８．５のｐＨを有する第１のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、第１の洗浄ステップは、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１２５ｍＭの塩を含みかつ約８．５のｐＨを有する第１のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。

【0039】

いくつかの実施形態では、第２の洗浄ステップは、約１０～約２０００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．００１～約１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む第２のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、第２の洗浄ステップは、約５０～約２００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．００５～約０．３％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む第２のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、第２の洗浄ステップは、約９０～約１１０ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．０５～約０．２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む第２のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、第２の洗浄ステップは、約１００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む第２のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、第２の洗浄バッファーは、約５．０～約７．４、約５．５～約７．０、または約５．５～約６、または約６のｐＨを有する第２のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、第２の洗浄ステップは、約１００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含みかつ約６．０のｐＨを有する第２のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。

【0040】

いくつかの実施形態では、第３の洗浄ステップは、約１０～約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約５０～約５００ｍＭの塩を含む第３のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、第３の洗浄ステップは、約２５～約１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約７５～約２５０ｍＭの塩を含む第３のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、第３の洗浄ステップは、約４０～約６０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１００～約１５０ｍＭの塩を含む第３のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、第３の洗浄ステップは、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１２５ｍＭの塩を含む第３のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、第３の洗浄ステップは、約７．５～約９．２、約８．０～約９．０、または約８．０～約８．８、または約８．５のｐＨを有する第３のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、第３の洗浄ステップは、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１２５ｍＭの塩を含みかつ約８．５のｐＨを有する第３のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。

【0041】

いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）は、約１０～約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約５０～約５００ｍＭの塩を含むバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）は、約２５～約１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約７５～約２５０ｍＭの塩を含むバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）は、約４０～約６０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１００～約１５０ｍＭの塩を含むバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）は、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１２５ｍＭの塩を含むバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、溶出洗浄ステップは、約７．５～約９．２、約８．０～約９．０、または約８．０～約８．８、または約８．５のｐＨを有するバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）は、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１２５ｍＭの塩を含みかつ約８．５のｐＨを有するバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。

【0042】

いくつかの実施形態では、第１の洗浄ステップは、約１０～約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約５０～約５００ｍＭの塩を含む第１のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、第１の洗浄ステップは、約２５～約１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約７５～約２５０ｍＭの塩を含む第１のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、第１の洗浄ステップは、約４０～約６０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１００～約１５０ｍＭの塩を含む第１のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、第１の洗浄ステップは、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１２５ｍＭの塩を含む第１のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、第１の洗浄ステップは、約７．５～約９．２、約８．０～約９．０、または約８．０～約８．８、または約８．５のｐＨを有する第１のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、第１の洗浄ステップは、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１２５ｍＭの塩を含みかつ約８．５のｐＨを有する第１のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。

【0043】

いくつかの実施形態では、第２の洗浄ステップは、約１０～約２０００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．００１～約１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む第２のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、第２の洗浄ステップは、約５０～約２００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．００５～約０．３％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む第２のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、第２の洗浄ステップは、約９０～約１１０ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．０５～約０．２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む第２のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、第２の洗浄ステップは、約１００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む第２のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、第２の洗浄バッファーは、約５．０～約７．４、約５．５～約７．０、または約５．５～約６、または約６のｐＨを有する第２のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、第２の洗浄ステップは、約１００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含みかつ約６．０のｐＨを有する第２のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。

【0044】

いくつかの実施形態では、第３の洗浄ステップは、約１０～約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約５０～約５００ｍＭの塩を含む第３のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、第３の洗浄ステップは、約２５～約１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約７５～約２５０ｍＭの塩を含む第３のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、第３の洗浄ステップは、約４０～約６０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１００～約１５０ｍＭの塩を含む第３のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、第３の洗浄ステップは、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１２５ｍＭの塩を含む第３のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、第３の洗浄ステップは、約７．５～約９．２、約８．０～約９．０、または約８．０～約８．８、または約８．５のｐＨを有する第３のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、第３の洗浄ステップは、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１２５ｍＭの塩を含みかつ約８．５のｐＨを有する第３のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。

【0045】

いくつかの実施形態では、第４の洗浄ステップは、約１０～約２０００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．００１～約１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む第４のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、第４の洗浄ステップは、約５０～約２００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．００５～約０．３％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む第４のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、第４の洗浄ステップは、約９０～約１１０ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．０５～約０．２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む第４のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、第４の洗浄ステップは、約１００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む第４のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、第４の洗浄バッファーは、約５．０～約７．４、約５．５～約７．０、または約５．５～約６、または約６のｐＨを有する第４のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、第４の洗浄ステップは、約１００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含みかつ約６．０のｐＨを有する第４のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。

【0046】

いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）は、約１０～約２０００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．００１～約１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）は、約５０～約２００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．００５～約０．３％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）は、約９０～約１１０ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．０５～約０．２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）は、約１００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、溶出バッファーは、約５．０～約７．４、約５．５～約７．０、または約５．５～約６、または約６のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）は、約１００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含みかつ約６．０のｐＨを有するバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。

【0047】

いくつかの実施形態では、第１の洗浄ステップは、約１０～約２０００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．００１～約１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む第１のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、第１の洗浄ステップは、約５０～約２００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．００５～約０．３％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む第１のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、第１の洗浄ステップは、約９０～約１１０ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．０５～約０．２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む第１のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、第１の洗浄ステップは、約１００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む第１のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、第１の洗浄バッファーは、約５．０～約７．４、約５．５～約７．０、または約５．５～約６、または約６のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、第１の洗浄ステップは、約１００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含みかつ約６．０のｐＨを有する第１のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。

【0048】

いくつかの実施形態では、第２の洗浄ステップは、約１０～約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約５０～約５００ｍＭの塩を含む第２のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、第２の洗浄ステップは、約２５～約１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約７５～約２５０ｍＭの塩を含む第２のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、第２の洗浄ステップは、約４０～約６０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１００～約１５０ｍＭの塩を含む第２のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、第２の洗浄ステップは、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１２５ｍＭの塩を含む第２のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、第２の洗浄ステップは、約７．５～約９．２、約８．０～約９．０、または約８．０～約８．８、または約８．５のｐＨを有する第２のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、第２の洗浄ステップは、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１２５ｍＭの塩を含みかつ約８．５のｐＨを有する第２のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。

【0049】

いくつかの実施形態では、第３の洗浄ステップは、約１０～約２０００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．００１～約１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む第３のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、第３の洗浄ステップは、約５０～約２００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．００５～約０．３％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む第３のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、第３の洗浄ステップは、約９０～約１１０ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．０５～約０．２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む第３のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、第３の洗浄ステップは、約１００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む第３のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、第３の洗浄バッファーは、約５．０～約７．４、約５．５～約７．０、または約５．５～約６、または約６のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、第３の洗浄ステップは、約１００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含みかつ約６．０のｐＨを有する第３のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。

【0050】

いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）は、約１０～約２０００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．００１～約１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）は、約５０～約２００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．００５～約０．３％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）は、約９０～約１１０ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．０５～約０．２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）は、約１００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、溶出バッファーは、約５．０～約７．４、約５．５～約７．０、または約５．５～約６、または約６のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）は、約１００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含みかつ約６．０のｐＨを有するバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。

【0051】

いくつかの実施形態では、第１の洗浄ステップは、約１０～約２０００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．００１～約１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む第１のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、第１の洗浄ステップは、約５０～約２００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．００５～約０．３％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む第１のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、第１の洗浄ステップは、約９０～約１１０ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．０５～約０．２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む第１のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、第１の洗浄ステップは、約１００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む第１のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、第１の洗浄バッファーは、約５．０～約７．４、約５．５～約７．０、または約５．５～約６、または約６のｐＨを有する。第１のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、第１の洗浄ステップは、約１００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含みかつ約６．０のｐＨを有する第１のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。

【0052】

いくつかの実施形態では、第２の洗浄ステップは、約１０～約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約５０～約５００ｍＭの塩を含む第２のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、第２の洗浄ステップは、約２５～約１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約７５～約２５０ｍＭの塩を含む第２のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、第２の洗浄ステップは、約４０～約６０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１００～約１５０ｍＭの塩を含む第２のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、第２の洗浄ステップは、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１２５ｍＭの塩を含む第２のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、第２の洗浄ステップは、約７．５～約９．２、約８．０～約９．０、または約８．０～約８．８、または約８．５のｐＨを有する第２のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、第２の洗浄ステップは、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１２５ｍＭの塩を含みかつ約８．５のｐＨを有する第２のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。

【0053】

いくつかの実施形態では、第３の洗浄ステップは、約１０～約２０００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．００１～約１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む第３のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、第３の洗浄ステップは、約５０～約２００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．００５～約０．３％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む第３のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、第３の洗浄ステップは、約９０～約１１０ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．０５～約０．２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む第３のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、第３の洗浄ステップは、約１００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む第３のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、第３のバッファーは、約５．０～約７．４、約５．５～約７．０、または約５．５～約６、または約６のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、第３の洗浄ステップは、約１００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含みかつ約６．０のｐＨを有する第３のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。

【0054】

いくつかの実施形態では、第４の洗浄ステップは、約１０～約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約５０～約５００ｍＭの塩を含む第４のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、第４の洗浄ステップは、約２５～約１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約７５～約２５０ｍＭの塩を含む第４のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、第４の洗浄ステップは、約４０～約６０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１００～約１５０ｍＭの塩を含む第４のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、第４の洗浄ステップは、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１２５ｍＭの塩を含む第４のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、第４の洗浄ステップは、約７．５～約９．２、約８．０～約９．０、または約８．０～約８．８、または約８．５のｐＨを有する第４のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、第４の洗浄ステップは、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１２５ｍＭの塩を含みかつ約８．５のｐＨを有する第４のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。

【0055】

いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）は、約１０～約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約５０～約５００ｍＭの塩を含むバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）は、約２５～約１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約７５～約２５０ｍＭの塩を含むバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）は、約４０～約６０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１００～約１５０ｍＭの塩を含むバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）は、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１２５ｍＭの塩を含むバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、溶出洗浄ステップは、約７．５～約９．２、約８．０～約９．０、または約８．０～約８．８、または約８．５のｐＨを有するバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）は、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１２５ｍＭの塩を含みかつ約８．５のｐＨを有するバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む。

【0056】

いくつかの実施形態（例えば、上記の実施形態）において、塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２、ＣａＣｌ_２、クエン酸ナトリウム、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、酢酸ナトリウム、ならびにＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２、ＣａＣｌ_２、クエン酸ナトリウム、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、および酢酸ナトリウムのうちの１つまたは複数の組み合わせから選択される。いくつかの実施形態（例えば、上記の実施形態）において、塩はＮａＣｌである。

【0057】

いくつかの実施形態では、バッファーは、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１２５ｍＭのＮａＣｌを含み、約８．５のｐＨを有する。

【0058】

いくつかの実施形態では、溶出ステップから得られたＡＡＶは、９９．９％以上の純度レベルを有する。いくつかの実施形態では、溶出ステップから得られたＡＡＶは、９９．０％以上の純度レベルを有する。

【0059】

いくつかの実施形態では、溶出ステップ（ｃ）から溶出されたＡＡＶカプシドの少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％が完全ＡＡＶカプシドである。

【0060】

いくつかの実施形態では、アフィニティ樹脂はＡＡＶｘ樹脂である。

【0061】

いくつかの実施形態では、ＡＡＶはＡＡＶ９である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ９は、配列番号１、配列番号２、および／または配列番号３の配列を含むペプチドを含む。

【0062】

いくつかの実施形態では、本方法は、ＡＡＶ含有溶液を、ＡＡＶ含有溶液から酸性の荷電汚染物質を枯渇させるのに有効な正荷電基を含むフィルターと接触させることをさらに含む。

【0063】

いくつかの実施形態では、本方法は、３５ｎｍより大きいウイルスを除去するためにＡＡＶ画分をナノろ過することをさらに含む。

【0064】

いくつかの実施形態では、本方法は、陽イオン交換クロマトグラフィーを行うことを含むポリッシングステップをさらに含む。

【0065】

いくつかの実施形態では、本方法は、ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡを介してＡＡＶ画分を検査することをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡは、ＡＡＶに特異的なサンドイッチＥＬＩＳＡである。

【0066】

別の態様では、本明細書に開示された実施形態のいずれか１つに従う方法によって製造されたＡＡＶ生成物を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0067】

【図1-1】実施例３による分離手順のクロマトグラムを示す。

【図1-2】図１－１の続き。

【図1-3】図１－２の続き。

【図2A】実施例４による分離手順のクロマトグラムを示す。ロードゾーンと洗浄－溶出ゾーンを「スプリットスクリーン」機能で分離する。青：ＵＶ２８０ｎｍ、紫：ＵＶ２５４ｎｍ、赤：導電率。

【図2B】実施例４による分離手順のクロマトグラムを示す。ロードゾーンと洗浄－溶出ゾーンを「スプリットスクリーン」機能で分離する。青：ＵＶ２８０ｎｍ、紫：ＵＶ２５４ｎｍ、赤：導電率。

【図3-1】実施例６による分離手順のクロマトグラムを示す。

【図3-2】図３－１の続き。

【図3-3】図３－２の続き。

【発明を実施するための形態】

【0068】

本明細書では、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）生成物を製造する方法、ＡＡＶを精製する方法、および空のＡＡＶカプシドと完全ＡＡＶカプシドを含む濃縮ＡＡＶ画分から完全ＡＡＶカプシドを精製する方法を提供する。

【0069】

細胞培養でのＡＡＶベクター製造の特徴は、破壊された細胞からの物質を含む複雑なマトリックスの形成である。特に、宿主細胞タンパク質、プロテアソーム、細胞残屑、潜在的なウイルス特異的受容体が、破壊された細胞からの物質中に存在することが多い。開示の方法は、生理学的に適用可能なｐＨでより高い純度をもたらす条件で、最終ＡＡＶ生成物から宿主細胞物質を除去するステップを含む。

【0070】

一態様において、本明細書で提供されるのは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を精製する方法であって、その方法は、
（ａ）ＡＡＶ含有溶液を、ＡＡＶ上のエピトープを標的とするアフィニティ樹脂に、溶液中のＡＡＶとアフィニティ樹脂との間の結合を可能にする条件下でロードすること、
（ｂ）室温で、少なくとも１つの洗浄ステップを行うこと、および
（ｃ）１８℃未満の温度で、アフィニティ樹脂からＡＡＶを溶出すること
を含む。

【0071】

特定の態様において、本方法は、バッファーの温度を室温から下げることによって、アフィニティ樹脂からＡＡＶカプシドを溶出することを含む。特定の実施形態では、１～１２℃の低くした温度で同じバッファーを用いて同じ樹脂からＡＡＶを溶出させることができる。特定の実施形態では、２～８℃の低くした温度で同じバッファーを用いて同じ樹脂からＡＡＶを溶出させることができる。室温から温度を下げることによるＡＡＶの溶出の増加は、驚くべきことであり、また予想外である。特定の理論に拘束されることなく、より低い温度が抗体と抗原の間の結合が平衡に達するまでの時間を延長することは知られているが、温度を室温より低く下げたときに、既に結合している抗原が容易に放出されることを当業者は予想しなかったため、この結果は驚くべきことであり、また予想外であった。

【0072】

温度シフト溶出プロトコルは、低温でのマイルドな溶出により、ＡＡＶ粒子の構造および／または感染性の保持に役立つという利点を有する。本明細書に記載された様々な実施形態による溶出は、低ｐＨへの暴露を防ぎ（例えば、中性に近いｐＨでの溶出）、ＡＡＶの高い効力を保持することができる。さらに、マイルドな溶出バッファーの使用は、製造環境で容易に実施することができ、溶出ステップのためにバッファーを変更する必要がないため、より効率的である。さらに、温度シフト溶出プロトコルは、完全ＡＡＶカプシドのより高い含有率をもたらす。

【0073】

特定の実施形態では、ＡＡＶ９は、約２０～２５℃の温度範囲で本明細書に記載の樹脂に結合することができ、同じバッファーシステムで約１～１２℃のより低い温度で溶出することができる。特定の実施形態では、ＡＡＶ９は、約２０～２５℃の温度範囲で本明細書に記載の樹脂に結合することができ、同じバッファーシステムで約２～８℃のより低い温度で溶出することができる。例えば、ＡＡＶ９は、ｐＨ８．５で１２５ｍＭのＮａＣｌおよび５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌを含むバッファー中にあるとき、室温でＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＡＡＶｘ樹脂に結合することができ、同じバッファーを用いて、約１～１２℃または約２～８℃のより低い温度で樹脂から溶出することができる。別の例として、ＡＡＶ９は、ｐＨ６．０で１００ｍＭの酢酸ナトリウム（ＮａＡｃｅｔａｔｅ）および０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むバッファー中にあるとき、室温でＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＡＡＶｘ樹脂に結合することができ、同じバッファーを用いて約１～１２℃または約２～８℃のより低い温度で樹脂から溶出することができる。

【0074】

本明細書に記載されている様々な実施形態および実施例に従って洗浄ステップと溶出ステップを連続して行う場合に、ＡＡＶ生成物の純度のさらなる向上が見られる。

【0075】

定義
本開示を説明する文脈（特に以下の請求項の文脈）における用語「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、および同様の参照語の使用は、本明細書で別段の指示がない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、単数形と複数形の両方をカバーするように解釈されるべきである。また、「含む」、「有する」、「包含する」、および「含有する」という用語は、特に断りのない限り、オープンエンドの用語（すなわち、「～を含むが、～に限定されない」という意味）として解釈される。

【0076】

本明細書では、「カプシド」、「カプシド粒子」、および「粒子」という用語は互換的に使用され、少なくとも１つのインタクトなＡＡＶカプシドシェルを含むＡＡＶ粒子を指す。

【0077】

本明細書で使用される場合、ＡＡＶまたはＡＡＶカプシドに関する「空（empty）」という用語は、完全な（すなわち、完全）関心遺伝子（ＧＯＩ）を欠いているものを指す。空のＡＡＶまたは空のＡＡＶカプシドまたは空のＡＡＶ粒子は、治療上の利益を提供することができない。本明細書で使用される場合、ＡＡＶまたはＡＡＶカプシドまたはＡＡＶ粒子に関する「完全（full）」という用語は、完全な（complete）ＧＯＩの大部分を含むものを指す。完全ＡＡＶカプシドは、レシピエント患者に治療上の利益を提供することができる。特定の実施形態では、「完全」には、「不完全なベクターＤＮＡ」または「切断されたベクターＤＮＡ（truncated vector DNA）」も含まれ得る。特定の実施形態では、ＡＡＶまたはＡＡＶカプシドまたはＡＡＶ粒子に関する「過搭載（overfilled）」は、潜在的に二重パッケージングされたまたはより長いゲノムまたはＧＯＩ ＤＮＡ（例えば、最大で二倍サイズ）を含むものを指す。特定の実施形態では、完全な対不完全なおよび／または切断されたおよび／または過搭載されたベクターＤＮＡは、追加の分析方法で差別化することができる。そのような方法には、キャピラリー電気泳動によるＤＮＡサイジング、ＡＵＣ（超遠心分析）、％アガロースＤＮＡ（ネイティブまたはアルカリ性）、ゲル、サザンブロット、ドットブロットハイブリダイゼーション、ＵＶ分光測光法、弱陰イオン交換クロマトグラフィー、および質量分析が含まれるが、これらに限定されない（Resolving Adeno-Associated Viral Particle Diversity with Charge Detection Mass Spectrometry Elizabeth E. Piersonet.al Anal. Chem., 2016, 88 (13), pp 6718-6725を参照；あらゆる目的のためによりその全体が本明細書に組み込まれる）。

【0078】

本明細書での値の範囲の記載は、本明細書で別段の指示がない限り、範囲内に入る各個別の値および各終点を個別に参照する略記法として機能することを意図しており、各個別の値および終点は、本明細書で個別に記載されているかのように本明細書に組み込まれる。

【0079】

本明細書に記載されているすべての方法は、本明細書に別の指示がない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実行することができる。本明細書で提供される任意のおよびすべての例、または例示的な言語（例えば、「～など」）の使用は、単に本開示をよりよく例示することを意図しており、別段の請求がない限り、本開示の範囲に限定するものではない。本明細書のいかなる言語も、請求されていない要素を本開示の実施に必須であると示すものとして解釈されるべきではない。

【0080】

本開示の好ましい実施形態は、本開示を実施するために本発明者らに知られている最良の態様を含めて、本明細書に記載されている。それらの好ましい実施形態の変形は、前述の説明を読めば当業者に明らかになるであろう。本発明者らは、当業者が適宜そのような変形を採用することを予測しており、本発明者らは、本開示が、本明細書に具体的に記載されている以外の方法で実施されることを意図している。したがって、本開示は、適用法で認められているように、添付の特許請求の範囲に記載されている主題のすべての変更および同等物を含む。さらに、本明細書に別段の記載がない限り、あるいは文脈上明らかに矛盾しない限り、上述の要素のあらゆる可能なバリエーションの組み合わせが本開示に包含される。

【0081】

洗浄および溶出ステップならびにバッファー
一態様において、本明細書は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を精製する方法を提供する。この方法は、（ａ）ＡＡＶ含有溶液を、ＡＡＶを標的とするアフィニティ樹脂に、溶液中のＡＡＶとアフィニティ樹脂との間の結合を可能にする条件下でロードするステップ、（ｂ）室温で、少なくとも１つの洗浄ステップを行うステップ、および（ｃ）１８℃未満の温度で、アフィニティ樹脂からＡＡＶを溶出するステップを含む。

【0082】

アフィニティ精製ステップは、１つまたは複数の洗浄ステップを含む。１つまたは複数の洗浄ステップの後に、１つまたは複数の溶出ステップを行うことができる。特定の実施形態では、本開示の方法は、アフィニティ精製ステップの前に行われるろ過ステップを含む。

【0083】

いくつかの実施形態では、少なくとも２つの洗浄ステップが行われ、それぞれが同じまたは異なるバッファーを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも３つの洗浄ステップが行われ、それぞれが同じまたは異なるバッファーを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも４つの洗浄ステップが行われ、それぞれが同じまたは異なるバッファーを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の洗浄ステップが行われ、それぞれが同じまたは異なるバッファーを含む。いくつかの実施形態では、２つの洗浄ステップが行われる。いくつかの実施形態では、３つの洗浄ステップが行われる。いくつかの実施形態では、４つの洗浄ステップが行われる。一部の実施形態では、洗浄バッファーは異なる。いくつかの実施形態では、洗浄ステップは連続して行われる。これらの洗浄ステップの１つまたは複数、あるいはこれらの洗浄ステップのすべてが、室温（例えば、１８～２６℃の間、あるいは１８℃、１８．５℃、１９℃、１９．５℃、２０℃、２０．５℃、２１℃、２１．５℃、２２℃、２２．５℃、２３℃、２３．５℃、２４℃、２４．５℃、２５℃、２５．５℃または２６℃）で実施される。特定の実施形態では、すべての洗浄ステップが室温で行われる。

【0084】

特定の実施形態では、少なくとも１つの洗浄バッファーが使用される。特定の実施形態では、少なくとも２つの異なる洗浄バッファーが使用され得る。特定の実施形態では、少なくとも３つの異なる洗浄バッファーが使用され得る。特定の実施形態では、少なくとも４つの異なる洗浄バッファーが使用され得る。特定の実施形態では、１つの洗浄バッファーが使用され得る。特定の実施形態では、２つの異なる洗浄バッファーが使用され得る。特定の実施形態では、３つの異なる洗浄バッファーが使用され得る。特定の実施形態では、４つの異なる洗浄バッファーが使用され得る。

【0085】

特定の実施形態では、少なくとも１つの溶出ステップが行われる。特定の実施形態では、少なくとも２つの溶出ステップが行われ、それぞれが同じまたは異なるバッファーを含む。特定の実施形態では、少なくとも３つの溶出ステップが行われ、それぞれが同じまたは異なるバッファーを含む。一部の実施形態では、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の溶出ステップが行われ、それぞれが同じまたは異なるバッファーを含む。特定の実施形態では、１つの溶出ステップが行われる。特定の実施形態では、少なくとも２つの溶出ステップが行われる。特定の実施形態では、少なくとも３つの溶出ステップが実施される。特定の実施形態では、少なくとも１つの溶出バッファーは、洗浄バッファー（複数可）のうちの少なくとも１つと同じである。特定の実施形態では、少なくとも１つの溶出バッファーは、洗浄バッファー（複数可）とは異なる。特定の実施形態では、少なくとも１つの溶出バッファーは、ＡＡＶを溶出する前の最終洗浄ステップで使用される最後の洗浄バッファーと同じである。特定の実施形態では、第１の溶出バッファーは、ＡＡＶを溶出する前の最終洗浄ステップで使用される最後の洗浄バッファーと同じである。溶出は、１℃～１２℃の間の温度（例えば、２℃～８℃の間、または１℃、１．５℃、２℃、２．５℃、３℃、３．５℃、４℃、４．５℃、５℃、５．５℃、６℃、６．５℃、７℃、７．５℃、８℃、８．５℃、９℃、９．５℃、１０℃、１０．５℃、１１℃、１１．５℃、または１２℃）で行われる。本明細書に記載された様々な実施形態による溶出は、低ｐＨへの暴露を防ぎ（例えば、中性に近いｐＨでの溶出）、ＡＡＶの高い効力を保持することができる。

【0086】

特定の実施形態では、少なくとも１つの溶出バッファーが使用される。特定の実施形態では、少なくとも２つの異なる溶出バッファーが使用され得る。特定の実施形態では、少なくとも３つの異なる溶出バッファーが使用され得る。特定の実施形態では、少なくとも４つの異なる溶出バッファーが使用され得る。特定の実施形態では、１つの溶出バッファーが使用され得る。特定の実施形態では、２つの異なる溶出バッファーが使用され得る。特定の実施形態では、３つの異なる溶出バッファーが使用され得る。特定の実施形態では、４つの異なる溶出バッファーが使用され得る。

【0087】

特定の実施形態では、室温より低い温度へのシフトは、冷却キャビネット（例えば、Ｕｎｉｃｈｒｏｍａｔ １５００）、温度ジャケット（例えば、水冷ジャケット）、および／または溶出のための冷たいバッファーの使用によって生じることができる。特定の実施形態では、バッファーは冷やす前に室温で作られる。特定の実施形態では、バッファーのｐＨは冷やす前に室温で測定される。

【0088】

例えば、約２カラム容量～約１５カラム容量、約３カラム容量～約７カラム容量、約４カラム容量～約８カラム容量、約５カラム容量～約１０カラム容量、または約７カラム容量～約１２カラム容量など、さまざまな容量が使用され得る。例えば、カラム容量が約２ｍｌ～約３ｍｌの場合、１０カラム容量が使用され得る。約５カラム容量、または５カラム容量の任意の洗浄および／または溶出バッファーが使用され得る。あるいは、約１０カラム容量、または１０カラム容量の任意の洗浄および／または溶出バッファーが使用され得る。ＡＡＶの純度を向上させるために、洗浄ステップの時間を長くすることがさらに行われ得る。

【0089】

洗浄ステップは、ＡＡＶおよび／またはアフィニティーマトリックスのベース樹脂から、強く結合した汚染物質を除去するのに有効である。同時に、洗浄ステップで使用されるバッファーは、ＡＡＶを実質的に溶出しない。

【0090】

特定の実施形態では、少なくとも１つの洗浄バッファーは、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）を含む。特定の実施形態では、洗浄バッファーは、ｐＨ範囲および宿主細胞（例えば、ＨＥＫ）－ＨＣＰの枯渇率（depletion rate）を確実にする単一アミノ酸または２つ以上のアミノ酸の任意の組み合わせ、例えば、グリシン、アルギニン、トリプトファン、アミノ酸の誘導体（例えば、タウリン（酸化システイン）、Ｎ－アセチル－トリプトファン、グリシルグリシン）を含む。

【0091】

溶出ステップは、ＡＡＶカプシドを溶出するのに有効であり得る。特定の実施形態では、溶出ステップは、空または過搭載のＡＡＶカプシドよりも完全ＡＡＶカプシドを優先的に溶出する。特定の実施形態では、溶出バッファーは、ｐＨおよびＡＡＶの溶出を確実にするために、単一アミノ酸または２つ以上のアミノ酸の任意の組み合わせ、例えば、グリシン、アルギニン、トリプトファン、アミノ酸の誘導体（例えば、タウリン（酸化システイン）、Ｎ－アセチルトリプトファン、グリシルグリシン）を含む。

【0092】

理論に縛られることなく、ＡＡＶの溶出の程度は、第３のバッファー中のエチレングリコールの量と塩の導電性の両方により影響される。バッファー中の少なくとも５５％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールの量は、５０％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールと比較して、溶出量を有意に増加させることができる。したがって、所定のエチレングリコール濃度において、ＮａＣｌ濃度を増加させると、溶出の程度および速度を増加させることができる。また、所定のエチレングリコール濃度において、ＮａＣｌを多価の塩に置き換えることでも、溶出の程度および速度を高めることができる。

【0093】

理論に縛られることなく、塩が一定（例えば、１５０ｍＭのＮａＣｌ）であれば、エチレングリコールの量を増やせば、バッファーの溶出強度を高めることができる。エチレングリコールの含有量が一定（例えば、５５％）であれば、塩の量を増やせば、バッファーの溶出強度を高めることができる。このように、１５０ｍＭのＮａＣｌ中のエチレングリコールが４０％（ｗ／ｗ）から、４５％（ｗ／ｗ）へと、５０％（ｗ／ｗ）へと、５５％（ｗ／ｗ）へと、６０％（ｗ／ｗ）へとなるにつれ溶出強度が増加する。塩含有量が一定の溶液のエチレングリコール量を増加させると、導電率を低下させることができる。エチレングリコールの量を増やすと、バッファー中の塩の溶解量（amount of solubility）を下げることができる。

【0094】

特定の実施形態では、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、スクロース、トレハロース、グリセロール（１，２，３－プロパントリオール）、またはエリスリトール（メソ－１，２，３，４－ブタンテトロール）のうちの１つまたは複数を、エチレングリコールと組み合わせて、またはエチレングリコールの代わりに使用することができる。特定の実施形態では、溶出バッファーは、約３０～約３５％、約３５～約４０％、約４０～約４５％、約４５～約５０％、約４８～約５２％、約５０～約５５％、約５５～約６０％、約６０～約６５％、約６５～約７０％、または約７０～約７５％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含むことができる。特定の実施形態では、溶出バッファーは、約５０％または５０％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含むことができる。特定の実施形態では、エチレングリコールの濃度は、少なくとも５５％（ｗ／ｗ）である。特定の実施形態では、エチレングリコールの濃度は、少なくとも５６％（ｗ／ｗ）である。特定の実施形態では、エチレングリコールの濃度は、少なくとも５７％（ｗ／ｗ）である。特定の実施形態では、エチレングリコールの濃度は、少なくとも５８％（ｗ／ｗ）である。

【0095】

例えば、洗浄および／または溶出バッファーは、ＴｒｉｓＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩、ヒスチジン、イミダゾール、リジン、アルギニン、グリシン、タウリン、クエン酸塩、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＭＥＳ－Ｎａ、ホウ酸塩、Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ、ＭＯＰＳ、ビシン、トリシン、ＴＡＰＳ、ＴＡＰＳＯ、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＴＥＳ（２－［［１，３－ジヒドロキシ－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－２－イル］アミノ］エタンスルホン酸）、バルビタールナトリウム（ベロナル）、ＡＤＡ（Ｎ－（２－アセトアミド）イミノ二酢酸）、ＡＣＥＳ（Ｎ－（２－アセトアミド）－２－アミノエタンスルホン酸）、ビス－トリスプロパン（Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ Ｐｒｏｐａｎｅ）、ＢＥＳ（Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）－２－アミノエタンスルホン酸）、ＤＩＰＳＯ（３－（Ｎ，Ｎ－ビス［２－ヒドロキシエチル］アミノ）－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸）、トリズマ（Ｔｒｉｚｍａ）、ＨＥＰＰＳＯ（４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－（２－ヒドロキシプロパンスルホン酸））、ＰＯＰＳＯ（ピペラジン－１，４－ビス（２－ヒドロキシプロパンスルホン酸）脱水物）、ＴＥＡ、ＥＰＰＳ（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンプロパンスルホン酸）、ＨＥＰＢＳ（Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－Ｎ’－（４－ブタンスルホン酸））、ＡＭＰＤ（２－アミノ－２－メチル－１，３－プロパンジオール）、ＡＭＰＳＯ（Ｎ－（１，１－ジメチル－２－ヒドロキシエチル）－３－アミノ－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸）、単一アミノ酸または２つ以上のアミノ酸の任意の組み合わせ、例えば、グリシン、アルギニン、トリプトファン、アミノ酸の誘導体、例えば、タウリン（酸化システイン）、Ｎ－アセチルトリプトファン、およびグリシルグリシンなどのうちの１つまたは複数を含むことができる。

【0096】

いくつかの実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、酢酸ナトリウム、ＴｒｉｓＨＣｌ、アルギニン－ＨＣｌ、リジン－ＨＣｌ、およびヒスチジン－ＨＣｌ、ヒスチジン、グリシン、タウリン、ＭＥＳ－Ｎａ、Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ、クエン酸塩、酢酸塩、ＭＥＳ、ＨＥＰＥＳ、リン酸塩、ＴｒｉｓＨＣｌ、Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ、ヒスチジン、イミダゾール、アルギニン－ＨＣｌ、リジン－ＨＣｌ、グリシン、グリシルグリシン、ホウ酸塩、ＭＯＰＳ、ビシン、トリシン、ＴＡＰＳ、ＴＡＰＳＯ、ＰＩＰＥＳ、Ｌ－グルタミン酸、アスパラギン酸、ＢＡＰＴＡ（１，２－ビス（ｏ－アミノフェノキシ）エタン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸）、および／またはＮ－アセチル－Ｄ，Ｌ－トリプトファンのうちの１つまたは複数を含むことができる。

【0097】

特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、塩をさらに含む。一部の実施形態では、バッファーはＴｒｉｓＨＣｌおよび塩を含む。一部の実施形態では、バッファーは、アルギニン－ＨＣｌおよび塩を含む。いくつかの実施形態では、バッファーは、ヒスチジンおよび塩を含む。

【0098】

本明細書に記載の洗浄および／または溶出バッファーの場合、塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２、ＣａＣｌ_２、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、酢酸ナトリウム（Ｃ_２Ｈ_３ＮａＯ_２）、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、ＮＨ_４Ｃｌ、Ｎａ_２ＳＯ_４、Ｋ_２ＳＯ_４、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム；ならびにＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２、ＣａＣｌ_２、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、Ｃ_２Ｈ_３ＮａＯ_２、クエン酸ナトリウム、およびクエン酸カリウムのうちの１つまたは複数の組み合わせ；から選択することができる。いくつかの実施形態では、塩濃度は、約５０～約２０００ｍＭ、約１００～約１５００ｍＭ、約１００～約２００ｍＭ、約２００ｍＭ～約１０００ｍＭ、約５００～約９００ｍＭ、約６００ｍＭ～約８００ｍＭ、約７５０ｍＭ、または７５０ｍＭである。いくつかの実施形態では、塩濃度は、約５０～約２０００ｍＭ、約１００～約１５００ｍＭ、約１００～約２００ｍＭ、約２００ｍＭ～約１０００ｍＭ、約５００～約９００ｍＭ、約６００ｍＭ～約８００ｍＭのＮａＣｌ、約７５０ｍＭのＮａＣｌ、または７５０ｍＭのＮａＣｌである。いくつかの実施形態では、ＮａＣｌの濃度勾配を使用する場合、目標濃度は２０００ｍＭである。いくつかの実施形態では、塩の濃度は５００ｍＭを超えない。いくつかの実施形態では、塩の濃度は、２００ｍＭを超えない。いくつかの実施形態では、塩はＮａＣｌである。いくつかの実施形態では、塩は１２５ｍＭのＮａＣｌである。いくつかの実施形態では、塩は１５０ｍＭのＮａＣｌである。

【0099】

特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、１つまたは複数の有機溶媒またはデタージェント（detergent）をさらに含むことができる。例えば、有機溶媒またはデタージェントは、Ｔｗｅｅｎ ８０、ポリソルベート８０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００、トリ（ｎ－ブチル）ホスフェート（ＴＮＢＰ）、エチレングリコール、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、ＤＭＳＯ、スクロース、またはトレハロースであり得るが、これらに限定されない。例えば、デタージェントは、非イオン性のポリオキシエチレン界面活性剤（例えば、Ｂｒｉｊ ３５）、４－ノニルフェニル－ポリエチレングリコール（Ａｒｋｏｐａｌ Ｎ１００）、オクチルグリコシド、ｎ－ドデシルβ－Ｄ－マルトシド、ジギトニン（Ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ）、６－シクロヘキシルヘキシルβ－Ｄ－マルトシド、またはオクチルグリコピラノシドであり得るが、これらに限定されない。例えば、エチレングリコールは、ＰＥＧであってよく、例えば、ＰＥＧ２０００、ＰＥＧ４０００、ＰＥＧ６０００（マクロゴール）などが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、有機溶媒は、グリセロール（１，２，３－プロパントリオール）、エリスリトール（メソ－１，２，３，４－ブタンテトロール）であり得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、デタージェントは、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００、ポリソルベート８０、およびトリ（ｎ－ブチル）ホスフェート（ＴＮＢＰ）のうちの１つまたは複数を含む。いくつかの実施形態では、有機溶媒またはデタージェントは、ポリソルベート８０、エチレングリコール、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、スクロース、またはトレハロースであり得る。いくつかの実施形態では、バッファーは、ＴｒｉｓＨＣｌおよびＤＭＳＯを含む。

【0100】

特定の実施形態では、有機溶媒またはデタージェントは、洗浄および／または溶出バッファー中に、約０．０００５～約２０％、約０．０００５～約１５％、約０．０００５～約１０％、約０．０００５～約５％、約０．０００５～約１％、約０．００１～約４％、約０．００１～約０．１％、約０．００１～約０．０５％、約０．００５～約３％、約０．０１～約２．５％、約０．０５～約５％、約０．０５～約２％、０．０５～約０．２％、または約０．１～約１．５％（ｗ／ｗ）で存在する。いくつかの実施形態では、有機溶媒またはデタージェントは、約０．００５％（ｗ／ｗ）で存在する。いくつかの実施形態では、有機溶媒またはデタージェントは、約０．１％（ｗ／ｗ）で存在する。

【0101】

いくつかの実施形態では、有機溶媒またはデタージェントはポリソルベート８０（例えば、Ｔｗｅｅｎ ８０またはＣｒｉｌｌｅｔ）である。いくつかの実施形態では、バッファーはポリソルベート８０を含む。いくつかの実施形態では、バッファーは、アルギニン－ＨＣｌおよびポリソルベート８０を含む。いくつかの実施形態では、バッファーは、タウリンおよびポリソルベート８０を含む。いくつかの実施形態では、バッファーは、ＴｒｉｓＨＣｌおよびポリソルベート８０を含む。いくつかの実施形態では、バッファーは、酢酸ナトリウムおよびポリソルベート８０を含む。

【0102】

特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約０．０００５～約２０％、約０．０００５～約１５％、約０．０００５～約１０％、約０．０００５～約５％、約０．０００５～約１％、約０．００１～約４％、約０．００１～約０．１％、約０．００１～約０．０５％、約０．００５～約３％、約０．０１～約２．５％、約０．０５～約５％、約０．０５～約２％、０．０５～約０．２％、または約０．１～約１．５％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む。いくつかの実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約０．００５％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む。いくつかの実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む。いくつかの実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約５％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む。いくつかの実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約１０％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む。いくつかの実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約２０％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む。

【0103】

特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約３０～約３５％、約３５～約４０％、約４０～約４５％、約４５～約５０％、約４８～約５２％、約５０～約５５％、約５５～約６０％、約６０～約６５％、約６５～約７０％、または約７０～約７５％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含むことができる。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約５０％、または５０％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含むことができる。

【0104】

有機溶媒またはデタージェントは、使用されるすべての洗浄および／または溶出バッファーに存在する必要はない。特定の実施形態では、有機溶媒またはデタージェントは、使用されるいかなる洗浄および／または溶出バッファーにも存在しない。特定の実施形態では、有機溶媒またはデタージェントは、使用される洗浄バッファーの少なくとも１つに存在する。特定の実施形態では、有機溶媒またはデタージェントは、使用される溶出バッファーの少なくとも１つに存在する。いくつかの実施形態では、洗浄バッファー、例えば、第１の洗浄バッファーは、酢酸ナトリウムおよびポリソルベート８０の両方を含む。いくつかの実施形態では、洗浄バッファー、例えば、第２の洗浄バッファーは、酢酸ナトリウムおよびポリソルベート８０の両方を含む。いくつかの実施形態では、洗浄バッファーは、Ｔｗｅｅｎ ８０、ＤＭＳＯ、およびトリ（ｎ－ブチル）ホスフェート（ＴＮＢＰ）のうちの１つまたは複数を含む。いくつかの実施形態では、洗浄バッファーは、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００、ポリソルベート８０およびＴＮＢＰのうちの１つまたは複数を含む。いくつかの実施形態では、洗浄バッファー、例えば、第３の洗浄バッファーは、トリス（Ｔｒｉｓ）およびエチレングリコールを含む。理論に拘束されることを望むものではないが、洗浄バッファー中の有機溶媒およびデタージェントは、強く結合した宿主タンパク質およびウイルス受容体を除去するのに有効であり、同時に脂質エンベロープウイルスを不活性化および／または崩壊させる。

【0105】

いくつかの実施形態では、バッファーは、エチレングリコール、スクロース、タウリン、および／またはグリセロールをさらに含む。いくつかの実施形態では、バッファーは、アルギニン－ＨＣｌと、スクロースおよびグリセロールのうちの１つとを含む。いくつかの実施形態では、バッファーは、タウリンおよびエチレングリコールを含む。いくつかの実施形態では、バッファーは、ＴｒｉｓＨＣｌおよびエチレングリコールを含む。いくつかの実施形態では、バッファーは、酢酸ナトリウムおよびエチレングリコールを含む。

【0106】

特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、塩（例えば、ＮａＣｌ）を含むＴｒｉｓベースのバッファーであり得る。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、酢酸ナトリウム（ＮａＡｃｅｔａｔｅ）ベースのバッファーであり得る。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸のナトリウム塩（ＭＥＳ－Ｎａ）と、ＥＤＴＡと、ポリソルベート８０、ＤＭＳＯ、およびトリ（ｎ－ブチル）ホスフェート（ＴＮＢＰ）を含む溶媒／デタージェント混合物とを含むことができる。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約５０～約２００ｍＭのタウリン、および０．２～１．５％のＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ６０００）を含むことができる。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓと、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００、ポリソルベート８０およびＴＮＢＰを含む溶媒／デタージェント混合物とを含むことができる。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、グリシンベースのバッファー；クエン酸ナトリウムベースのバッファー；または塩（例えば、ＮａＣｌ）を含むアルギニン－ＨＣｌベースのバッファーを含むことができる。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、エチレングリコールおよび／またはＮａＣｌを含むＴｒｉｓベースのバッファー；タウリンベースのバッファー；またはＮａＣｌを含むアルギニン－ＨＣｌベースのバッファーであり得る。あるいは、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、スクロース、またはトレハロースのうちの１つまたは複数を、エチレングリコールと組み合わせて、またはエチレングリコールの代わりに使用することができる。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、酢酸ナトリウムおよびポリソルベート８０を含むことができる。

【0107】

特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約１０～約５００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌを含む。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約１０～約４００ｍＭ、約１０～約３００ｍＭ、約１０～約２００ｍＭ、約１５～約１７５ｍＭ、約２０～約１５０ｍＭ、約２５～約１２５ｍＭ、約２５～約１００ｍＭ、約３０～約９０ｍＭ、約３５～約７５ｍＭ、または約４０～約６０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌを含む。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約１０～約１５ｍＭ；約１０～約３０ｍＭ；約１５～約２０ｍＭ；約２０～約２５ｍＭ；約２５～約３０ｍＭ；約３０～約３５ｍＭ；約３５～約４０ｍＭ；約４０～約４５ｍＭ；約４０～約５０ｍＭ；約４５～約５０ｍＭ；約５０～約５５ｍＭ；約５５～約６０ｍＭ；約６０～約６５ｍＭ；約６５～約７０ｍＭ；約７０～約７５ｍＭ；約７５～約８０ｍＭ；約８０～約９０ｍＭ；約９０～約１００ｍＭ；約１００～約１１０ｍＭ；約１１０～約１２０ｍＭ；約１２０～約１３０ｍＭ；約１３０～約１４０ｍＭ；約１４０～約１５０ｍＭ；約１５０～約１６０ｍＭ；約１６０～約１７０ｍＭ；約１７０～約１８０ｍＭ；約１８０～約１９０ｍＭ；または約１９０～約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌを含む。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約５０ｍＭまたは５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌを含むことができる。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約２０ｍＭまたは２０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌを含むことができる。

【0108】

特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約２５ｍＭ、約５０ｍＭ、約７５ｍＭ、約１００ｍＭ、約１２５ｍＭ、約１５０ｍＭ、約１７５ｍＭ、約２００ｍＭ、約２２５ｍＭ、約２５０ｍＭ、約２７５ｍＭ、約３００ｍＭ、約３２５ｍＭ、約３５０ｍＭ、約３７５ｍＭ、約４００ｍＭ、約４２５ｍＭ、約４５０ｍＭ、約４７５ｍＭ、約５００ｍＭ、約５２５ｍＭ、約５５０ｍＭ、約５７５ｍＭ、約６００ｍＭ、約６２５ｍＭ、約６５０ｍＭ、約６７５ｍＭ、約７００ｍＭ、約７２５ｍＭ、約７５０ｍＭ、約７７５ｍＭ、約８００ｍＭ、約８２５ｍＭ、約８５０ｍＭ、約８７５ｍＭ、約９００ｍＭ、約９２５ｍＭ、約９５０ｍＭ、約９７５ｍＭ、約１０００ｍＭ、約１０２５ｍＭ、約１０５０ｍＭ、約１０７５ｍＭ、約１１００ｍＭ、約１１２５ｍＭ、約１１５０ｍＭ、約１１７５ｍＭ、約１２００ｍＭ、約１２２５ｍＭ、約１２５０ｍＭ、約１２７５ｍＭ、約１３００ｍＭ、約１３２５ｍＭ、約１３５０ｍＭ、約１３７５ｍＭ、約１４００ｍＭ、約１４２５ｍＭ、約１４５０ｍＭ、約１４７５ｍＭ、約１５００ｍＭ、約１５２５ｍＭ、約１５５０ｍＭ、約１５７５ｍＭ、約１６００ｍＭ、約１６２５ｍＭ、約１６５０ｍＭ、約１６７５ｍＭ、約１７００ｍＭ、約１７２５ｍＭ、約１７５０ｍＭ、約１７７５ｍＭ、約１８００ｍＭ、約１８２５ｍＭ、約１８５０ｍＭ、約１８７５ｍＭ、約１９００ｍＭ、約１９２５ｍＭ、約１９５０ｍＭ、約１９７５ｍＭ、または約２０００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌを含むことができる。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約５０ｍＭまたは５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌを含むことができる。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約２０ｍＭまたは２０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌを含むことができる。

【0109】

特定の実施形態では、ＴｒｉｓＨＣｌ洗浄および／または溶出バッファーは、約５０～約５００ｍＭの塩をさらに含むことができる。特定の実施形態では、ＴｒｉｓＨＣｌ洗浄および／または溶出バッファーは、約５５～約４００ｍＭ、約６０～約３５０ｍＭ、約７０～約３００ｍＭ、約７５～約２５０ｍＭ、約８０～約２００ｍＭ、約９０～約１７５ｍＭ、または約１００～約１５０ｍＭの塩をさらに含むことができる。特定の実施形態では、ＴｒｉｓＨＣｌ洗浄および／または溶出バッファーは、約７５～約１００ｍＭ；約１００～約１２５ｍＭ；約１２５～約１５０ｍＭ；約１５０～約１７５ｍＭ；約１７５～約２００ｍＭ；約２００～約２２５ｍＭ；または約２２５～約２５０ｍＭの塩をさらに含むことができる。特定の実施形態では、ＴｒｉｓＨＣｌ洗浄および／または溶出バッファーは、約１５０ｍＭまたは１５０ｍＭの塩を含むことができる。特定の実施形態では、ＴｒｉｓＨＣｌ洗浄および／または溶出バッファーは、約１２５ｍＭまたは１２５ｍＭの塩を含むことができる。

【0110】

特定の実施形態では、ＴｒｉｓＨＣｌ洗浄および／または溶出バッファーは、約５０～約５００ｍＭのＮａＣｌをさらに含むことができる。特定の実施形態では、ＴｒｉｓＨＣｌ洗浄および／または溶出バッファーは、約５５～約４００ｍＭ、約６０～約３５０ｍＭ、約７０～約３００ｍＭ、約７５～約２５０ｍＭ、約８０～約２００ｍＭ、約９０～約１７５ｍＭ、または約１００～約１５０ｍＭのＮａＣｌをさらに含むことができる。特定の実施形態では、ＴｒｉｓＨＣｌ洗浄および／または溶出バッファーは、約７５～約１００ｍＭ；約１００～約１２５ｍＭ；約１２５～約１５０ｍＭ；約１５０～約１７５ｍＭ；約１７５～約２００ｍＭ；約２００～約２２５ｍＭ；または約２２５～約２５０ｍＭのＮａＣｌをさらに含むことができる。特定の実施形態では、ＴｒｉｓＨＣｌ洗浄および／または溶出バッファーは、約１５０ｍＭまたは１５０ｍＭのＮａＣｌを含むことができる。特定の実施形態では、ＴｒｉｓＨＣｌ洗浄および／または溶出バッファーは、約１２５ｍＭまたは１２５ｍＭのＮａＣｌを含むことができる。

【0111】

特定の実施形態では、ＴｒｉｓＨＣｌ洗浄および／または溶出バッファーは、約１０～約７５％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールをさらに含むことができる。特定の実施形態では、ＴｒｉｓＨＣｌ洗浄および／または溶出バッファーは、約２０～約７２％、約２５～約７０％、約３０～約６５％、または約４０～約６０％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールをさらに含むことができる。特定の実施形態では、ＴｒｉｓＨＣｌ洗浄および／または溶出バッファーは、約３０～約３５％、約３５～約４０％、約４０～約４５％、約４５～約５０％、約４８～約５２％、約５０～約５５％、約５５～約６０％、約６０～約６５％、約６５～約７０％、または約７０～約７５％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールをさらに含むことができる。特定の実施形態では、ＴｒｉｓＨＣｌ洗浄および／または溶出バッファーは、約５０％または５０％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含むことができる。

【0112】

特定の実施形態では、ＴｒｉｓＨＣｌ洗浄および／または溶出バッファーは、有機溶媒またはデタージェントをさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、有機溶媒またはデタージェントは、ポリソルベート８０（例えば、Ｔｗｅｅｎ ８０またはＣｒｉｌｌｅｔ）である。特定の実施形態では、ポリソルベート８０は、約０．０００５～約５％、約０．０００５～約１％、約０．００１～約４％、約０．００１～約０．１％、約０．００１～約０．０５％、約０．００５～約３％、約０．０１～約２．５％、約０．０５～約５％、約０．０５～約２％、０．０５～約０．２％、または約０．１～約１．５％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０であり得る。特定の実施形態では、ＴｒｉｓＨＣｌ洗浄および／または溶出バッファーは、約０．０５～約０．０８％；約０．０８～約０．１１％；約０．１１～約０．１４％；約０．１４～約０．１７％；または約０．１７～約０．２０％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができる。特定の実施形態では、ＴｒｉｓＨＣｌ洗浄および／または溶出バッファーは、約０．１％または０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができる。特定の実施形態では、ＴｒｉｓＨＣｌ洗浄および／または溶出バッファーは、約０．００５％または０．００５％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができる。特定の実施形態では、ＴｒｉｓＨＣｌ洗浄および／または溶出バッファーは、約０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができる。

【0113】

特定の実施形態では、ＴｒｉｓＨＣｌ洗浄および／または溶出バッファーのｐＨは、約７．５～約９．２、約８．０～約９．０、または約８．０～約８．８であり得る。特定の実施形態では、ＴｒｉｓＨＣｌ洗浄および／または溶出バッファーのｐＨは、約７．５～約７．７；約７．７～約７．９；約７．９～約８．１；約８．１～約８．３；約８．３～約８．５；約８．５～約８．７；約８．７～約８．９；または約８．９～約９．２であり得る。特定の実施形態では、ＴｒｉｓＨＣｌ洗浄および／または溶出バッファーは、約７．４または７．４のｐＨを有することができる。特定の実施形態では、ＴｒｉｓＨＣｌ洗浄および／または溶出バッファーのｐＨは、約８．５または８．５であり得る。

【0114】

特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約１０～約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約５０～約５００ｍＭの塩を含むことができる。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約２５～約１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約７５～約２５０ｍＭの塩を含むことができる。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約４０～約６０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１００～約１５０ｍＭの食塩を含むことができる。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１２５ｍＭの塩を含むことができる。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび１２５ｍＭの塩を含むことができる。特定の実施形態では、塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２、ＣａＣｌ_２、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、酢酸ナトリウム（Ｃ_２Ｈ_３ＮａＯ_２）、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、ＮＨ_４Ｃｌ、Ｎａ_２ＳＯ_４、Ｋ_２ＳＯ_４、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、またはそれらの組み合わせであり得る。特定の実施形態では、塩はＮａＣｌである。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約７．５～約９．２、約８．０～約９．０、または約８．０～約８．８のｐＨを有する。特定の実施形態では、バッファーは、約８．５または８．５のｐＨを有する。

【0115】

特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約１０～約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１０～約７５％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含むことができる。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約２５ｍＭ～約１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約２５％～約７０％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含むことができる。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約４０ｍＭ～約６０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約４０％～約６０％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含むことができる。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約５０％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含むことができる。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約５０％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含むことができる。約７．５～約９．２、約８．０～約９．０、または約８．０～約８．８のｐＨである。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約８．５または８．５のｐＨを有する。

【0116】

特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約１～約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、約５０～約５００ｍＭの塩、および約０．００１～約１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができる。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約５～約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、約７５～約２５０ｍＭの塩、および約０．００５～約０．３％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができる。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、１０ｍＭ～約３０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、約１４０ｍＭ～約１６０ｍＭの塩、および約０．０５～約０．２％（ｗ／ｗ）のポリソルベートを含むことができる。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約２０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、約１５０ｍＭの塩、および約０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができる。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、２０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、１５０ｍＭの塩、および０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができる。特定の実施形態では、塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２、ＣａＣｌ_２、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、酢酸ナトリウム（Ｃ_２Ｈ_３ＮａＯ_２）、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、ＮＨ_４Ｃｌ、Ｎａ_２ＳＯ_４、Ｋ_２ＳＯ_４、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、またはそれらの組み合わせであり得る。特定の実施形態では、塩はＮａＣｌである。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約６．０～約８．８、約６．５～約８．５、または約７．０～約８．０のｐＨを有することができる。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約７．４または７．４のｐＨを有する。

【0117】

特定の実施形態では、ＴｒｉｓＨＣｌバッファーは、第１の洗浄バッファーおよび溶出バッファーである。特定の実施形態では、ＴｒｉｓＨＣｌバッファーは、第１と第３の洗浄バッファーおよび溶出バッファーである。特定の実施形態では、ＴｒｉｓＨＣｌバッファーは、第２の洗浄バッファーおよび溶出バッファーである。特定の実施形態では、ＴｒｉｓＨＣｌバッファーは、第２と第４の洗浄バッファーおよび溶出バッファーである。特定の実施形態では、ＴｒｉｓＨＣｌバッファーは、第２の洗浄バッファーであるが、溶出バッファーではない。特定の実施形態では、ＴｒｉｓＨＣｌバッファーは第２と第４の洗浄バッファーであるが、溶出バッファーではない。約５カラム容量または５カラム容量の各洗浄バッファーが使用され得る。約１０カラム容量または１０カラム容量の各洗浄バッファーが使用され得る。約５カラム容量または５カラム容量の溶出バッファーが使用され得る。約１０カラム容量または１０カラム容量の溶出バッファーが使用され得る。

【0118】

特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約１０～約２０００ｍＭの酢酸ナトリウムを含む。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約２０～約１０００ｍＭ、約３０～約７５０ｍＭ、約４０～約５００ｍＭ、約５０～約２００ｍＭ、約７５～約１７５ｍＭ、約８０～約１５０ｍＭ、約８５～約１２５ｍＭ、または約９０～約１１０ｍＭの酢酸ナトリウムを含む。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約５０～約７５ｍＭ；約７５～約１００ｍＭ；約９０～約１１０ｍＭ；約１００～約１２５ｍＭ；約１２５～約１５０ｍＭ；約１５０～約１７５ｍＭ；約１７５～約２００ｍＭ；約２００～約２５０ｍＭ；約２５０～約３００ｍＭ；約３００～約３５０ｍＭ；約３５０～約４００ｍＭ；約４００～約４５０ｍＭ；約４５０～約５００ｍＭ；約５００～約５５０ｍＭ；約５５０～約６００ｍＭ；約６００～約６５０ｍＭ；約６５０～約７００ｍＭ；約７００～約７５０ｍＭ；約７５０～約８００ｍＭ；約８００～約８５０ｍＭ；約８５０～約９００ｍＭ；約９００～約９５０ｍＭ；約９５０～約１０００ｍＭ；約１０００～約１０５０ｍＭ；約１０５０～約１１００ｍＭ；約１１００～約１１５０ｍＭ；約１１５０～約１２００ｍＭ；約１２００～約１２５０ｍＭ；約１２５０～約１３００ｍＭ；約１３００～約１３５０ｍＭ；約１３５０～約１４００ｍＭ；約１４００～約１４５０ｍＭ；約１４５０～約１５００ｍＭ；約１５００～約１５５０ｍＭ；約１５５０～約１６００ｍＭ；約１６００～約１６５０ｍＭ；約１６５０～約１７００ｍＭ；約１７００～約１７５０ｍＭ；約１７５０～約１８００ｍＭ；約１８００～約１８５０ｍＭ；約１８５０～約１９００ｍＭ；約１９００～約１９５０ｍＭ；または約１９５０～約２０００ｍＭの酢酸ナトリウムを含むことができる。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約１００ｍＭまたは１００ｍＭの酢酸ナトリウムを含むことができる。

【0119】

特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約２５ｍＭ、約５０ｍＭ、約７５ｍＭ、約１００ｍＭ、約１２５ｍＭ、約１５０ｍＭ、約１７５ｍＭ、約２００ｍＭ、約２２５ｍＭ、約２５０ｍＭ、約２７５ｍＭ、約３００ｍＭ、約３２５ｍＭ、約３５０ｍＭ、約３７５ｍＭ、約４００ｍＭ、約４２５ｍＭ、約４５０ｍＭ、約４７５ｍＭ、約５００ｍＭ、約５２５ｍＭ、約５５０ｍＭ、約５７５ｍＭ、約６００ｍＭ、約６２５ｍＭ、約６５０ｍＭ、約６７５ｍＭ、約７００ｍＭ、約７２５ｍＭ、約７５０ｍＭ、約７７５ｍＭ、約８００ｍＭ、約８２５ｍＭ、約８５０ｍＭ、約８７５ｍＭ、約９００ｍＭ、約９２５ｍＭ、約９５０ｍＭ、約９７５ｍＭ、約１０００ｍＭ、約１０２５ｍＭ、約１０５０ｍＭ、約１０７５ｍＭ、約１１００ｍＭ、約１１２５ｍＭ、約１１５０ｍＭ、約１１７５ｍＭ、約１２００ｍＭ、約１２２５ｍＭ、約１２５０ｍＭ、約１２７５ｍＭ、約１３００ｍＭ、約１３２５ｍＭ、約１３５０ｍＭ、約１３７５ｍＭ、約１４００ｍＭ、約１４２５ｍＭ、約１４５０ｍＭ、約１４７５ｍＭ、約１５００ｍＭ、約１５２５ｍＭ、約１５５０ｍＭ、約１５７５ｍＭ、約１６００ｍＭ、約１６２５ｍＭ、約１６５０ｍＭ、約１６７５ｍＭ、約１７００ｍＭ、約１７２５ｍＭ、約１７５０ｍＭ、約１７７５ｍＭ、約１８００ｍＭ、約１８２５ｍＭ、約１８５０ｍＭ、約１８７５ｍＭ、約１９００ｍＭ、約１９２５ｍＭ、約１９５０ｍＭ、約１９７５ｍＭ、または約２０００ｍＭの酢酸ナトリウムを含むことができる。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約１００ｍＭまたは１００ｍＭの酢酸ナトリウムを含むことができる。

【0120】

特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約５０～約２００ｍＭの酢酸ナトリウムを含むことができる。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約５０～約８０ｍＭ；約７０～約１００ｍＭ；約８０～約１１０ｍＭ；約９０～約１２０ｍＭ；約１００～約１３０ｍＭ；約１２０～約１５０ｍＭ；約１４０～約１７０ｍＭ；約１７０～約２００ｍＭの酢酸ナトリウムを含むことができる。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約６０；約７０ｍＭ；約８０ｍＭ；約９０ｍＭ；約１００ｍＭ；約１１０ｍＭ；約１２０ｍＭ；約１３０ｍＭ；約１４０ｍＭ；約１５０ｍＭ；または約１６０ｍＭの酢酸ナトリウムを含むことができる。

【0121】

特定の実施形態では、酢酸ナトリウム洗浄および／または溶出バッファーは、有機溶媒またはデタージェントをさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、有機溶媒またはデタージェントは、ポリソルベート８０（例えば、Ｔｗｅｅｎ ８０またはＣｒｉｌｌｅｔ）である。特定の実施形態では、ポリソルベート８０は、約０．０００５～約５％、約０．０００５～約１％、約０．００１～約４％、約０．００１～約０．１％、約０．００１～約０．０５％、約０．００５～約３％、約０．０１～約２．５％、約０．０５～約５％、約０．０５～約２％、０．０５～約０．２％、または約０．１～約１．５％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０であり得る。特定の実施形態では、酢酸ナトリウムバッファーは、約０．０５～約０．０８％、約０．０８～約０．１１％、約０．１１～約０．１４％、約０．１４～約０．１７％、または約０．１７～約０．２０％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができる。特定の実施形態では、酢酸ナトリウムバッファーは、約０．１％または０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができる。特定の実施形態では、酢酸ナトリウムバッファーは、約０．００５％または０．００５％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができる。特定の実施形態では、酢酸ナトリウムバッファーは、約０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができる。

【0122】

特定の実施形態では、酢酸ナトリウム洗浄および／または溶出バッファーのｐＨは、約５．０～約７．４、約５．５～約７．０、または約５．５～約６．５であり得る。特定の実施形態では、酢酸ナトリウム洗浄および／または溶出バッファーのｐＨは、約５．２～約５．５；約５．５～約５．８；約５．８～約６．１；約６．１～約６．４；または約６．４～約６．８であり得る。特定の実施形態では、酢酸ナトリウム洗浄および／または溶出バッファーは、約６．０または６．０のｐＨを有する。

【0123】

特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約１０～約２０００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．００１～約１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができる。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約５０～約２００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．００５～約０．３％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができる。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約９０～約１１０ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．０５～約０．２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができる。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約１００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができる。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、１００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができる。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約５．０～約７．４、約５．５～約７．０、または約５．５～約６．５のｐＨを有することができる。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約６．０または６．０のｐＨを有する。

【0124】

特定の実施形態では、酢酸ナトリウムバッファーは、第１の洗浄バッファーおよび溶出バッファーである。特定の実施形態では、酢酸ナトリウムバッファーは、第１と第３の洗浄バッファーおよび溶出バッファーである。特定の実施形態では、酢酸ナトリウムバッファーは、第２の洗浄バッファーおよび溶出バッファーである。特定の実施形態では、酢酸ナトリウムバッファーは、第２と第４の洗浄バッファーおよび溶出バッファーである。特定の実施形態では、酢酸ナトリウムバッファーは、第２の洗浄バッファーであるが、溶出バッファーではない。特定の実施形態では、酢酸ナトリウムバッファーは、第２と第４の洗浄バッファーであるが、溶出バッファーではない。

【0125】

約５カラム容量または５カラム容量の各酢酸ナトリウム洗浄バッファーが使用され得る。約１０カラム容量または１０カラム容量の各酢酸ナトリウム洗浄バッファーが使用され得る。約５カラム容量または５カラム容量の酢酸ナトリウム溶出バッファーが使用され得る。約１０カラム容量または１０カラム容量の酢酸ナトリウム溶出バッファーが使用され得る。

【0126】

特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約１０～約５００ｍＭのグリシンを含む。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約１０～約４００ｍＭ、約１０～約３００ｍＭ、約１０～約２００ｍＭ、約１５～約１７５ｍＭ、約２０～約１５０ｍＭ、約２５～約１２５ｍＭ、約２５～約１００ｍＭ、約３０～約９０ｍＭ、約３５～約７５ｍＭ、または約４０～約６０ｍＭのグリシンを含む。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約３０～約３５ｍＭ、約３５～約４０ｍＭ、約４０～約４５ｍＭ、約４５～約５０ｍＭ、約５０～約５５ｍＭ、約５５～約６０ｍＭ、約６０～約６５ｍＭ、約６５～約７０ｍＭ、約７０～約７５ｍＭ、約７５～約８０ｍＭ、約８０～約９０ｍＭ；約９０～約１００ｍＭ；約１００～約１１０ｍＭ；約１１０～約１２０ｍＭ；約１２０～約１３０ｍＭ；約１３０～約１４０ｍＭ；約１４０～約１５０ｍＭ；約１５０～約１６０ｍＭ；約１６０～約１７０ｍＭ；約１７０～約１８０ｍＭ；約１８０～約１９０ｍＭ；または約１９０～約２００ｍＭのグリシンを含む。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約５０ｍＭまたは５０ｍＭのグリシンを含むことができる。

【0127】

特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約２５ｍＭ、約５０ｍＭ、約７５ｍＭ、約１００ｍＭ、約１２５ｍＭ、約１５０ｍＭ、約１７５ｍＭ、約２００ｍＭ、約２２５ｍＭ、約２５０ｍＭ、約２７５ｍＭ、約３００ｍＭ、約３２５ｍＭ、約３５０ｍＭ、約３７５ｍＭ、約４００ｍＭ、約４２５ｍＭ、約４５０ｍＭ、約４７５ｍＭ、約５００ｍＭ、約５２５ｍＭ、約５５０ｍＭ、約５７５ｍＭ、約６００ｍＭ、約６２５ｍＭ、約６５０ｍＭ、約６７５ｍＭ、約７００ｍＭ、約７２５ｍＭ、約７５０ｍＭ、約７７５ｍＭ、約８００ｍＭ、約８２５ｍＭ、約８５０ｍＭ、約８７５ｍＭ、約９００ｍＭ、約９２５ｍＭ、約９５０ｍＭ、約９７５ｍＭ、約１０００ｍＭ、約１０２５ｍＭ、約１０５０ｍＭ、約１０７５ｍＭ、約１１００ｍＭ、約１１２５ｍＭ、約１１５０ｍＭ、約１１７５ｍＭ、約１２００ｍＭ、約１２２５ｍＭ、約１２５０ｍＭ、約１２７５ｍＭ、約１３００ｍＭ、約１３２５ｍＭ、約１３５０ｍＭ、約１３７５ｍＭ、約１４００ｍＭ、約１４２５ｍＭ、約１４５０ｍＭ、約１４７５ｍＭ、約１５００ｍＭ、約１５２５ｍＭ、約１５５０ｍＭ、約１５７５ｍＭ、約１６００ｍＭ、約１６２５ｍＭ、約１６５０ｍＭ、約１６７５ｍＭ、約１７００ｍＭ、約１７２５ｍＭ、約１７５０ｍＭ、約１７７５ｍＭ、約１８００ｍＭ、約１８２５ｍＭ、約１８５０ｍＭ、約１８７５ｍＭ、約１９００ｍＭ、約１９２５ｍＭ、約１９５０ｍＭ、約１９７５ｍＭ、または約２０００ｍＭのグリシンを含むことができる。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約５０ｍＭまたは５０ｍＭのグリシンを含むことができる。

【0128】

特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約１～約３００ｍＭのヒスチジンを含む。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約１～約２５０ｍＭ、約１～約２００ｍＭ、約１～約１００ｍＭ、約１．５～約１７５ｍＭ、約２．０～約１５０ｍＭ、約２．５～約１２５ｍＭ、約２．５～約１００ｍＭ、約３．０～約９０ｍＭ、約３．５～約７５ｍＭ、または約４．０～約６０ｍＭ、約５．０～約５０ｍＭ、約６．０～約４０ｍＭ、約７．０～約３０ｍＭ、約８．０～約２０ｍＭ、約９．０～約１５ｍＭのヒスチジンを含む。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約３．０～約３．５ｍＭ；約３．５～約４．０ｍＭ；約４．０～約４．５ｍＭ；約４．５～約５．０ｍＭ；約５．０～約５．５ｍＭ；約５．５～約６．０ｍＭ；約６．０～約６．５ｍＭ；約６．５～約７．０ｍＭ；約７．０～約７．５ｍＭ；約７．５～約８．０ｍＭ；約８．０～約９．０ｍＭ；約９．０～約１０．０ｍＭ；約１０．０～約１１．０ｍＭ；約１１．０～約１２．０ｍＭ；約１２．０～約１３．０ｍＭ；約１３．０～約１４．０ｍＭ；約１４．０～約１５．０ｍＭ；約１５．０～約１６．０ｍＭ；約１６．０～約１７．０ｍＭ；約１７．０～約１８．０ｍＭ；約１８．０～約１９．０ｍＭ；または約１９．０～約２０．０ｍＭのヒスチジンを含む。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約１０ｍＭまたは１０ｍＭのヒスチジンを含むことができる。

【0129】

特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約２．５ｍＭ、約５．０ｍＭ、約７．５ｍＭ、約１０．０ｍＭ、約１２．５ｍＭ、約１５．０ｍＭ、約１７．５ｍＭ、約２０．０ｍＭ、約２２．５ｍＭ、約２５．０ｍＭ、約２７．５ｍＭ、約３０．０ｍＭ、約３２．５ｍＭ、約３５．０ｍＭ、約３７．５ｍＭ、約４０．０ｍＭ、約４２．５ｍＭ、約４５．０ｍＭ、約４７．５ｍＭ、約５０．０ｍＭ、約５２．５ｍＭ、約５５．０ｍＭ、約５７．５ｍＭ、約６０．０ｍＭ、約６２．５ｍＭ、約６５．０ｍＭ、約６７．５ｍＭ、約７０．０ｍＭ、約７２．５ｍＭ、約７５．０ｍＭ、約７７．５ｍＭ、約８０．０ｍＭ、約８２．５ｍＭ、約８５．０ｍＭ、約８７．５ｍＭ、約９０．０ｍＭ、約９２．５ｍＭ、約９５．０ｍＭ、約９７．５ｍＭ、約１００．０ｍＭ、約１０２．５ｍＭ、約１０５．０ｍＭ、約１０７．５ｍＭ、約１１０．０ｍＭ、約１１２．５ｍＭ、約１１５．０ｍＭ、約１１７．５ｍＭ、約１２０．０ｍＭ、約１２２．５ｍＭ、約１２５．０ｍＭ、約１２７．５ｍＭ、約１３０．０ｍＭ、約１３２．５ｍＭ、約１３５．０ｍＭ、約１３７．５ｍＭ、約１４０．０ｍＭ、約１４２．５ｍＭ、約１４５．０ｍＭ、約１４７．５ｍＭ、約１５０．０ｍＭ、約１５２．５ｍＭ、約１５５．０ｍＭ、約１５７．５ｍＭ、約１６０．０ｍＭ、約１６２．５ｍＭ、約１６５．０ｍＭ、約１６７．５ｍＭ、約１７０．０ｍＭ、約１７２．５ｍＭ、約１７５．０ｍＭ、約１７７．５ｍＭ、約１８０．０ｍＭ、約１８２．５ｍＭ、約１８５．０ｍＭ、約１８７．５ｍＭ、約１９０．０ｍＭ、約１９２．５ｍＭ、約１９５．０ｍＭ、約１９７．５ｍＭ、または約２００．０ｍＭのヒスチジンを含む。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約１０ｍＭまたは１０ｍＭのヒスチジンを含むことができる。

【0130】

特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約１～約７５％（ｗ／ｗ）のトレハロースをさらに含むことができる。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約２～約５０％、約２．５～約２５％、約３．０～約２０％、または約４．０～約１０％（ｗ／ｗ）のトレハロースをさらに含むことができる。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約３．０～約３．５％；３．５～約４．０％；約４．０～約４．５％；約４．５～約５．０％；約４．８～約５．２％；約５．０～約５．５％；約５．５～約６．０％；約６．０～約６．５％；約６．５～約７．０％；ｏｒ約７．０～約７．５％；約７．５～約８．０％；約８．０～約８．５％；約８．５～約９．０％；約９．０～約９．５％；約９．５～約１０％；約１０～約１５％；約１５～約２０％；約２０～約２５％；約２５～約３０％；約３０～約３５％；約３５～約４０％；約４０～約４５％；約４５～約５０％；約５０～約５５％；約５５～約６０％；約６０～約６５％；約６５～約７０％；約７０～約７５％（ｗ／ｗ）のトレハロースを含むことができる。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約５．０％または５．０％（ｗ／ｗ）のトレハロースを含むことができる。

【0131】

特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、有機溶媒またはデタージェントをさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、有機溶媒またはデタージェントは、ポリソルベート８０（例えば、Ｔｗｅｅｎ ８０またはＣｒｉｌｌｅｔ）である。特定の実施形態では、ポリソルベート８０は、約０．０００５～約５％、約０．０００５～約１％、約０．０００６～約４％、約０．０００７～約０．１％、約０．０００８～約０．０５％、約０．０００９～約３％、約０．００１～約２．５％、約０．００２～約５％、約０．００３～約２％、または０．００４～約０．２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０であり得る。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約０．０５～約０．０８％；約０．０８～約０．１１％；約０．１１～約０．１４％；約０．１４～約０．１７％；または約０．１７～約０．２０％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができる。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約０．１％または０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができる。いくつかの実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約０．００５％または０．００５％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができる。いくつかの実施形態では、ポリソルベート８０は０．００５％である。

【0132】

特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーのｐＨは、約５．０～約９．０、約５．５～約８．０、または約６．０～約７．５であり得る。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーのｐＨは、約５．２～約５．５；約５．５～約５．８；約５．８～約６．１；約６．１～約６．４；約６．４～約６．８；約６．８～約７．０；約７．０～約７．２；約７．２～約７．４；約７．４～約７．８；約７．８～約８．０；約８．０～約８．２；約８．２～約８．４；約８．４～約８．６；約８．６～約８．８；または約８．８～約９．０であり得る。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約７．０または７．０のｐＨを有する。

【0133】

特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約１０～約２００ｍＭのグリシン、約１～約１００ｍＭのヒスチジン、約２０～約５００ｍＭの塩、約１～約１０％のトレハロース、および約０．０００５～約１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができる。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約３０～約８０ｍＭのグリシン、約５～約２０ｍＭのヒスチジン、約５０～約２００ｍＭの塩、約３～約８％のトレハロース、および約０．００１～約０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができる。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約４０～約６０ｍＭのグリシン、約５～約１５ｍＭのヒスチジン、約９０～約１１０ｍＭの塩、約４～約６％のトレハロース、および約０．００１～約０．０５％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができる。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約５０ｍＭのグリシン、約１０ｍＭのヒスチジン、約１００ｍＭの塩、約５％のトレハロース、および約０．００５％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができる。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、５０ｍＭのグリシン、１０ｍＭのヒスチジン、１００ ｍＭの塩、５％のトレハロース、および０．００５％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができる。特定の実施形態では、塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２、ＣａＣｌ_２、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、酢酸ナトリウム（Ｃ_２Ｈ_３ＮａＯ_２）、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、ＮＨ_４Ｃｌ、Ｎａ_２ＳＯ_４、Ｋ_２ＳＯ_４、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、またはそれらの組み合わせであり得る。特定の実施形態では、塩はＮａＣｌである。特定の実施形態では、バッファーは、約６．０～約８．０、約６．５～約７．５、または約７．０～約７．４のｐＨを有する。特定の実施形態では、バッファーは、約７．０～約７．４のｐＨを有する。

【0134】

特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約１０～約２００ｍＭのグリシン、約１～約１００ｍＭのヒスチジン、約２０～約５００ｍＭのＮａＣｌ、約１～約１０％のトレハロース、および約０．０００５～約１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができる。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約３０～約８０ｍＭのグリシン、約５～約２０ｍＭのヒスチジン、約５０～約２００ｍＭのＮａＣｌ、約３～約８％のトレハロース、および約０．００１～約０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができる。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約４０～約６０ｍＭのグリシン、約５～約１５ｍＭのヒスチジン、約９０～約１１０ｍＭのＮａＣｌ、約４～約６％のトレハロース、および約０．００１～約０．０５％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができる。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約５０ｍＭのグリシン、約１０ｍＭのヒスチジン、約１００ｍＭのＮａＣｌ、約５％のトレハロース、および約０．００５％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができる。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、５０ｍＭのグリシン、１０ｍＭのヒスチジン、１００ｍＭのＮａＣｌ、５％のトレハロース、および０．００５％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができる。７．５、または約７．０～約７．４のｐＨである。特定の実施形態では、バッファーは、約７．０～約７．４のｐＨを有する。

【0135】

特定の実施形態では、グリシンバッファーは、第１の洗浄バッファーおよび溶出バッファーである。特定の実施形態では、グリシンバッファーは、第１と第３の洗浄バッファーおよび溶出バッファーである。特定の実施形態では、グリシンバッファーは、第２の洗浄バッファーおよび溶出バッファーである。特定の実施形態では、グリシンバッファーは、第２と第４の洗浄バッファーおよび溶出バッファーである。特定の実施形態では、グリシンバッファーは、第２の洗浄バッファーであるが、溶出バッファーではない。特定の実施形態では、グリシンバッファーは、第２および第４の洗浄であるが、溶出バッファーではない。

【0136】

約５カラム容量または５カラム容量の各グリシン洗浄バッファーが使用され得る。約１０カラム容量または１０カラム容量の各グリシン洗浄バッファーが使用され得る。約５カラム容量または５カラム容量のグリシン溶出バッファーが使用され得る。約１０カラム容量または１０カラム容量のグリシン溶出バッファーが使用され得る。

【0137】

特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約５０～約５００ｍＭの２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸のナトリウム塩（ＭＥＳ－Ｎａ）と、約３～約３０ｍＭのＥＤＴＡと、ポリソルベート８０、ＤＭＳＯ、およびトリ（ｎ－ブチル）ホスフェート（ＴＮＢＰ）を含む溶媒／デタージェント混合物とを含むことができる。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約５０～約７５ｍＭ；約７５～約１００ｍＭ；約９０～約１１０ｍＭ；約１００～約１２５ｍＭ；約１２５～約１５０ｍＭ；約１５０～約１７５ｍＭ；約１７５～約２００ｍＭ；約２００～約２５０ｍＭ；約２５０～約３００ｍＭ；約３００～約３５０ｍＭ；約３５０～約４００ｍＭ；約４００～約４５０ｍＭ；または約４５０～約５００ｍＭのＭＥＳ－Ｎａを含むことができる。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約５０ｍＭ；約７５ｍＭ；約９０ｍＭ；約１００ｍＭ；約１２５ｍＭ；約１５０ｍＭ；約１７５ｍＭ；約２００ｍＭ；約２５０ｍＭ；約３００ｍＭ；約３５０ｍＭ；約４００ｍＭ；約４５０ｍＭ；または約５００ｍＭのＭＥＳ－Ｎａを含むことができる。

【0138】

特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約５０～約２００ｍＭのタウリンを含むことができる。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約５０～約７５ｍＭ；約７５～約１００ｍＭ；約９０～約１１０ｍＭ；約１００～約１２５ｍＭ；約１２５～約１５０ｍＭ；約１５０～約１７５ｍＭ；約１７５～約２００ｍＭのタウリンを含むことができる。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約５０ｍＭ；約７５ｍＭ；約９０ｍＭ；約１００ｍＭ；約１２５ｍＭ；約１５０ｍＭ；約１７５ｍＭ；約２００ｍＭのタウリンを含むことができる。

【0139】

特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約８０～約４００ｍＭのＢｉｓ－Ｔｒｉｓを含むことができる。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約８０～約１００ｍＭ；約９０～約１１０ｍＭ；約１００～約１２５ｍＭ；約１２５～約１５０ｍＭ；約１５０～約１７５ｍＭ；約１７５～約２００ｍＭ；約２００～約２５０ｍＭ；約２５０～約３００ｍＭ；約３００～約３５０ｍＭ；約３５０～約４００ｍＭのＢｉｓ－Ｔｒｉｓを含むことができる。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約５０ｍＭ；約７５ｍＭ；約９０ｍＭ；約１００ｍＭ；約１２５ｍＭ；約１５０ｍＭ；約１７５ｍＭ；約２００ｍＭ；約２５０ｍＭ；約３００ｍＭ；約３５０ｍＭ；約４００ｍＭのＢｉｓ－Ｔｒｉｓを含むことができる。

【0140】

洗浄および／または溶出バッファーは、約３０～約３５ｍＭ、約３５～約４０ｍＭ、約４０～約４５ｍＭ、約４５～約５０ｍＭ、約５０～約５５ｍＭ、約５５～約６０ｍＭ、約６０～約６５ｍＭ、約６５～約７０ｍＭ、約７０～約７５ｍＭ、または約７５～約８０ｍＭのアルギニン－ＨＣｌを含むことができる。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約５０ｍＭまたは５０ｍＭのアルギニン－ＨＣｌを含むことができる。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約７５～約１００ｍＭ；約１００～約１２５ｍＭ；約１２５～約１５０ｍＭ；約１５０～約１７５ｍＭ；約１７５～約２００ｍＭ；約２００～約２２５ｍＭ；または約２２５～約２５０ｍＭのＮａＣｌを含むことができる。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約１５０ｍＭまたは１５０ｍＭのＮａＣｌを含むことができる。特定の実施形態では、第２のバッファーのｐＨは、約７．５～約７．７；約７．７～約７．９；約７．９～約８．１；約８．１～約８．３；約８．３～約８．５；約８．５～約８．７；約８．７～約８．９；または約８．９～約９．２であり得る。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーのｐＨは、約８．５または８．５であり得る。

【0141】

洗浄および／または溶出バッファーは、約５０～約２００ｍＭのグリシンを含むことができる。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約５０～約１００ｍＭ；約７０～約１２０ｍＭ；約１００～約１５０ｍＭ；約１２０～約１７０ｍＭ；約１５０～約２００ｍＭのグリシンを含むことができる。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーのｐＨは、約７．５～約７．７；約７．７～約７．９；約７．９～約８．１；約８．１～約８．３；約８．３～約８．５；約８．５～約８．７；約８．７～約８．９；または約８．９～約９．２であり得る。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーのｐＨは、約８．５または８．５であり得る。

【0142】

洗浄および／または溶出バッファーは、約５０～約２０ｍＭのクエン酸ナトリウムを含むことができる。特定の実施形態では、第２のバッファーは、約５～約１０ｍＭ；約７～約１２ｍＭ；約１０～約１５ｍＭ；約１２～約１７ｍＭ；約１５～約２０ｍＭのクエン酸ナトリウムを含むことができる。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーのｐＨは、約７．５～約７．７；約７．７～約７．９；約７．９～約８．１；約８．１～約８．３；約８．３～約８．５；約８．５～約８．７；約８．７～約８．９；または約８．９～約９．２であり得る。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーのｐＨは、約８．５または８．５であり得る。

【0143】

洗浄および／または溶出バッファーは、約２０～約１００ｍＭのヒスチジンおよび約７５～約２５０ｍＭのＮａＣｌを含み、ｐＨは約７．５～約８．８である。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約２０～約４０ｍＭ、約４０～約６０ｍＭ、約６０～約７５ｍＭ、または約７５～約１００ｍＭのヒスチジンを含むことができる。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約２０ｍＭまたは２０ｍＭのヒスチジンを含むことができる。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約７５～約１００ｍＭ；約１００～約１２５ｍＭ；約１２５～約１５０ｍＭ；約１５０～約１７５ｍＭ；約１７５～約２００ｍＭ；約２００～約２２５ｍＭのＮａＣｌ；または約２２５～約２５０ｍＭのＮａＣｌを含むことができる。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約１５０ｍＭまたは１５０ｍＭのＮａＣｌを含むことができる。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約７．５～約７．９；約７．８～約８．２；約８．１～約８．５；約８．４～約８．９；または約８．６～約９．０のｐＨを有することができる。特定の実施形態では、洗浄および／または溶出バッファーは、約８．０または８．０のｐＨを有することができる。

【0144】

洗浄および／または溶出バッファーは、約３０～約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約３０～約７５％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含むことができ、ｐＨは約７．５～約９．２であり得る。洗浄および／または溶出バッファーは、約２０～約８０ｍＭのアルギニン－ＨＣｌおよび約５０～約２００ｍＭの塩を含むことができ、ｐＨは約７．３～約８．８であり得る。洗浄および／または溶出バッファーは、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約５０％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含むことができ、ｐＨは約８．５であり得る。洗浄および／または溶出バッファーは、約２０～約１５０ｍＭのタウリン、約３０～約７５％（ｗ／ｗ）のエチレングリコール、および０．０５～０．２％（ｗ／ｗ）のオクチルグリコピラノシドを含むことができ、ｐＨは約７．３～約８．８であり得る。洗浄および／または溶出バッファーは、約５０～約２００ｍＭのアルギニン－ＨＣｌ、約５０～約２００ｍＭのリジン－ＨＣｌ、約５０～約２００ｍＭのヒスチジン－ＨＣｌ、および約１ｍＭ～約４ｍＭのＮ－アセチル－Ｄ，Ｌ－トリプトファン、ならびに約１０％～約４０％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができ、ｐＨは約７．３～約８．８であり得る。特定の実施形態では、塩（例えばＮａＣｌ）が洗浄および／または溶出バッファー中に存在する場合、特定の実施形態では、塩の濃度は５００ｍＭを超えず、特定の実施形態では、塩の濃度は２００ｍＭを超えない。特定の実施形態では、塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２、ＣａＣｌ_２、クエン酸ナトリウム、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、酢酸ナトリウム；あるいはＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２、ＣａＣｌ_２、クエン酸ナトリウム、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、酢酸ナトリウムのうちの１つまたは複数の組み合わせである。特定の実施形態では、塩はＮａＣｌである。特定の実施形態では、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、スクロース、またはトレハロースのうちの１つまたは複数を、エチレングリコールと組み合わせて、またはエチレングリコールの代わりに使用することができる。

【0145】

特定の実施形態では、第１の洗浄ステップは、ＴｒｉｓＨＣｌベースのバッファーであり得る第１のバッファーを使用する。特定の実施形態では、第１の洗浄ステップは、酢酸ナトリウム（ＮａＡｃｅｔａｔｅ）ベースのバッファーであり得る第１のバッファーを使用する。特定の実施形態では、第１の洗浄ステップは、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸のナトリウム塩（ＭＥＳ－Ｎａ）と、ＥＤＴＡと、ポリソルベート８０、ＤＭＳＯ、およびトリ（ｎ－ブチル）ホスフェート（ＴＮＢＰ）を含む溶媒／デタージェント混合物とを含む第１のバッファーを使用する。特定の実施形態では、第１の洗浄ステップは、約５０～約２００ｍＭのタウリン、および０．２～１．５％のＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ６０００）を含む第１のバッファーを使用する。特定の実施形態では、第１の洗浄ステップは、Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓと、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００、ポリソルベート８０およびＴＮＢＰを含む溶媒／デタージェント混合物とを含む第１のバッファーを使用する。特定の実施形態では、第１の洗浄ステップは、酢酸ナトリウムおよびポリソルベート８０を含む第１のバッファーを使用する。これらの洗浄ステップの１つまたは複数、あるいはこれらの洗浄ステップのすべてが、室温で実施される。特定の実施形態では、第１の洗浄ステップは、ＮａＣｌを含むＴｒｉｓＨＣｌベースのバッファーであり得る第１のバッファーを使用する。

【0146】

特定の実施形態では、第２の洗浄ステップは、ＴｒｉｓＨＣｌベースのバッファーであり得る第２のバッファーを使用する。特定の実施形態では、第２の洗浄ステップは、酢酸ナトリウム（ＮａＡｃｅｔａｔｅ）ベースのバッファーであり得る第２のバッファーを使用する。特定の実施形態では、第２の洗浄ステップは、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸のナトリウム塩（ＭＥＳ－Ｎａ）と、ＥＤＴＡと、ポリソルベート８０、ＤＭＳＯ、およびトリ（ｎ－ブチル）ホスフェート（ＴＮＢＰ）を含む溶媒／デタージェント混合物とを含む第２のバッファーを使用する。特定の実施形態では、第２の洗浄ステップは、約５０～約２００ｍＭのタウリン、および０．２～１．５％のＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ６０００）を含む第２のバッファーを使用する。特定の実施形態では、第２の洗浄ステップは、Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓと、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００、ポリソルベート８０およびＴＮＢＰを含む溶媒／デタージェント混合物とを含む第２のバッファーを使用する。特定の実施形態では、第２の洗浄ステップは、酢酸ナトリウムおよびポリソルベート８０を含む第２のバッファーを使用する。特定の実施形態では、第２の洗浄ステップは、ＴｒｉｓＨＣｌおよびＮａＣｌバッファーを含む第２のバッファーを使用する。

【0147】

特定の実施形態では、少なくとも１つの洗浄バッファーは、約１０～約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約５０～約５００ｍＭの塩を含むことができ、ｐＨは約７．５～約９．２であり得る。特定の実施形態では、少なくとも１つの洗浄バッファーは、約２５～約１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約７５～約２５０ｍＭの塩を含むことができ、ｐＨは約８．０～約９．０であり得る。特定の実施形態では、少なくとも１つの洗浄バッファーは、約４０～約６０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１００～約１５０ｍＭの塩を含むことができ、ｐＨは約８．０～約９．０であり得る。特定の実施形態では、少なくとも１つの洗浄バッファーは、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１２５ｍＭの塩を含むことができ、ｐＨは約８．５であり得る。特定の実施形態では、塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２、ＣａＣｌ_２、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、酢酸ナトリウム（Ｃ_２Ｈ_３ＮａＯ_２）、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、ＮＨ_４Ｃｌ、Ｎａ_２ＳＯ_４、Ｋ_２ＳＯ_４、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、またはそれらの組み合わせであり得る。特定の実施形態では、塩はＮａＣｌである。これらの洗浄ステップの１つまたは複数、あるいはこれらの洗浄ステップのすべてが、室温で実施される。特定の実施形態では、洗浄ステップは室温で行われる。

【0148】

特定の実施形態では、少なくとも１つの洗浄バッファーは、約１０～約２０００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．００１～約１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができ、ｐＨは約５．０～約７．４であり得る。特定の実施形態では、少なくとも１つの洗浄バッファーは、約５０～約２００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．００５～約０．３％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができ、ｐＨは約５．５～約７．０であり得る。特定の実施形態では、少なくとも１つの洗浄バッファーは、約５０～約２００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．０５～約０．２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができ、ｐＨは約５．５～約６．５であり得る。特定の実施形態では、少なくとも１つの洗浄バッファーは、約１００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができ、ｐＨは約６．０であり得る。これらの洗浄ステップの１つまたは複数、あるいはこれらの洗浄ステップのすべてが、室温で実施される。特定の実施形態では、洗浄ステップは室温で行われる。

【0149】

特定の実施形態では、少なくとも２つの洗浄バッファーが使用される。特定の実施形態では、少なくとも１つの洗浄バッファーは、約１０～約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約５０～約５００ｍＭの塩を含むことができ、ｐＨは約７．５～約９．２であり得る。特定の実施形態では、少なくとも１つの洗浄バッファーは、約１０～約２０００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．００１～約１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができ、ｐＨは約５．０～約７．４であり得る。特定の実施形態では、塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２、ＣａＣｌ_２、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、酢酸ナトリウム（Ｃ_２Ｈ_３ＮａＯ_２）、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、ＮＨ_４Ｃｌ、Ｎａ_２ＳＯ_４、Ｋ_２ＳＯ_４、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、またはそれらの組み合わせであり得る。これらの洗浄ステップの１つまたは複数、あるいはこれらの洗浄ステップのすべてが、室温で実施される。特定の実施形態では、塩はＮａＣｌである。特定の実施形態では、洗浄ステップは室温で行われる。

【0150】

特定の実施形態では、少なくとも２つの洗浄バッファーが使用される。特定の実施形態では、少なくとも１つの洗浄バッファーは、約２５～約１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約７５～約２５０ｍＭの塩を含むことができ、ｐＨは約８．０～約９．０であり得る。特定の実施形態では、少なくとも１つの洗浄バッファーは、約５０～約２００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．００５～約０．３％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができ、ｐＨは約５．５～約７．０であり得る。特定の実施形態では、塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２、ＣａＣｌ_２、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、酢酸ナトリウム（Ｃ_２Ｈ_３ＮａＯ_２）、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、ＮＨ_４Ｃｌ、Ｎａ_２ＳＯ_４、Ｋ_２ＳＯ_４、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、またはそれらの組み合わせであり得る。これらの洗浄ステップの１つまたは複数、あるいはこれらの洗浄ステップのすべてが、室温で実施される。特定の実施形態では、塩はＮａＣｌである。特定の実施形態では、洗浄ステップは室温で行われる。

【0151】

特定の実施形態では、少なくとも２つの洗浄バッファーが使用される。特定の実施形態では、少なくとも１つの洗浄バッファーは、約４０～約６０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１００～約１５０ｍＭの塩を含むことができ、ｐＨは約８．０～約９．０であり得る。特定の実施形態では、少なくとも１つの洗浄バッファーは、約９０～約１００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．０５～約０．２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができ、ｐＨは約５．５～約６．５であり得る。特定の実施形態では、塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２、ＣａＣｌ_２、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、酢酸ナトリウム（Ｃ_２Ｈ_３ＮａＯ_２）、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、ＮＨ_４Ｃｌ、Ｎａ_２ＳＯ_４、Ｋ_２ＳＯ_４、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、またはそれらの組み合わせであり得る。これらの洗浄ステップの１つまたは複数、あるいはこれらの洗浄ステップのすべてが、室温で実施される。特定の実施形態では、塩はＮａＣｌである。特定の実施形態では、洗浄ステップは室温で行われる。

【0152】

特定の実施形態では、少なくとも２つの洗浄バッファーが使用される。特定の実施形態では、少なくとも１つの洗浄バッファーは、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１２５ｍＭの塩を含むことができ、ｐＨは約８．５であり得る。特定の実施形態では、少なくとも１つの洗浄バッファーは、約１００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができ、ｐＨは約６．０であり得る。特定の実施形態では、塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２、ＣａＣｌ_２、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、酢酸ナトリウム（Ｃ_２Ｈ_３ＮａＯ_２）、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、ＮＨ_４Ｃｌ、Ｎａ_２ＳＯ_４、Ｋ_２ＳＯ_４、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、またはそれらの組み合わせであり得る。これらの洗浄ステップの１つまたは複数、あるいはこれらの洗浄ステップのすべてが、室温で実施される。特定の実施形態では、塩はＮａＣｌである。特定の実施形態では、洗浄ステップは室温で行われる。

【0153】

いくつかの実施形態では、少なくとも３つの洗浄ステップが行われる；少なくとも１つの洗浄バッファーは、約５０～約２０００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．０５～約０．２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含み、ｐＨは約５．２～約６．８である；少なくとも１つの洗浄バッファーは、約３０～約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約７５～約５００ｍＭの塩を含み、ｐＨは約７．５～約９．２である；および少なくとも１つの洗浄バッファーは、約３０～約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約３０～約７５％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含み、ｐＨは約７．３～約８．８である。特定の実施形態では、塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２、ＣａＣｌ_２、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、酢酸ナトリウム（Ｃ_２Ｈ_３ＮａＯ_２）、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、ＮＨ_４Ｃｌ、Ｎａ_２ＳＯ_４、Ｋ_２ＳＯ_４、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、またはそれらの組み合わせであり得る。特定の実施形態では、塩はＮａＣｌである。これらの洗浄ステップの１つまたは複数、あるいはこれらの洗浄ステップのすべてが、室温で実施される。特定の実施形態では、洗浄ステップは室温で行われる。

【0154】

いくつかの実施形態では、少なくとも３つの洗浄ステップが行われる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバッファーは、約１００ｍＭの酢酸ナトリウム、約０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含み、ｐＨは約６．０である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバッファーは、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１２５ｍＭのＮａＣｌを含み、ｐＨは約８．５である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバッファーは、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約５０％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含み、ｐＨは約８．５である。これらの洗浄ステップの１つまたは複数、あるいはこれらの洗浄ステップのすべてが、室温で実施される。特定の実施形態では、洗浄ステップは室温で行われる。

【0155】

いくつかの実施形態では、少なくとも３つの洗浄ステップが行われる；第１の洗浄ステップは、約５０～約２０００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．０５～約０．２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む第１のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含み、第１のバッファーは約５．２～約６．８のｐＨを有する；第２の洗浄ステップは、約３０～約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約７５～約５００ｍＭの塩を含む第２のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含み、第２のバッファーは約７．５～約９．２のｐＨを有する；第３の洗浄ステップは、約３０～約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約３０～約７５％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含む第３のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含み、第３のバッファーは約７．３～約８．８のｐＨを有する。特定の実施形態では、塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２、ＣａＣｌ_２、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、酢酸ナトリウム（Ｃ_２Ｈ_３ＮａＯ_２）、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、ＮＨ_４Ｃｌ、Ｎａ_２ＳＯ_４、Ｋ_２ＳＯ_４、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、またはそれらの組み合わせであり得る。特定の実施形態では、塩はＮａＣｌである。これらの洗浄ステップの１つまたは複数、あるいはこれらの洗浄ステップのすべてが、室温で実施される。特定の実施形態では、洗浄ステップは室温で行われる。

【0156】

いくつかの実施形態では、本方法は、第１の洗浄ステップの前に行われる第４の洗浄ステップをさらに含み、第４の洗浄ステップは、約１０～約３０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約７５～約２５０ｍＭのＮａＣｌを含む第４のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含み、第４のバッファーは約６．５～約８．０のｐＨを有する。

【0157】

いくつかの実施形態では、少なくとも３つの洗浄ステップが行われる；第１のバッファーは、約１００ｍＭの酢酸ナトリウム、約０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含み、第１のバッファーは約６．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、第２のバッファーは、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１２５ｍＭのＮａＣｌを含み、第２のバッファーは約８．５のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、第３のバッファーは、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約５０％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含み、第３のバッファーは約８．５のｐＨを有する。これらの洗浄ステップの１つまたは複数、あるいはこれらの洗浄ステップのすべてが、室温で実施される。特定の実施形態では、洗浄ステップは室温で行われる。

【0158】

いくつかの実施形態では、少なくとも３つの洗浄ステップが行われる；第１の洗浄ステップは、約５０～約２００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．０５～約０．２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む第１のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含み、第１のバッファーは約５．５～約６．５のｐＨを有する；第２の洗浄ステップは、約１０～約７０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約７５～約２５０ｍＭのＮａＣｌを含む第２のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含み、第２のバッファーは、約８．０～約９．０のｐＨを有する；第３の洗浄ステップは、約１０～約７０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約３０～約７５％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含む第３のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含み、第３のバッファーは約８．０～約９．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、本方法は、第１の洗浄ステップの前に行われる第４の洗浄ステップをさらに含み、第４の洗浄ステップは、約１０～約３０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約７５～約２５０ｍＭのＮａＣｌを含む第４のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含み、第４のバッファーは約６．５～約８．０のｐＨを有する。これらの洗浄ステップの１つまたは複数、あるいはこれらの洗浄ステップのすべてが、室温で実施される。特定の実施形態では、洗浄ステップは室温で行われる。

【0159】

いくつかの実施形態では、少なくとも３つの洗浄ステップが行われる；第１の洗浄ステップは、約５０～約２００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．０５～約０．２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む第１のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含み、第１のバッファーは約５．５～約６．５のｐＨを有する；第２の洗浄ステップは、約１０～約７０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約７５～約２５０ｍＭのＮａＣｌを含む第２のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含み、第２のバッファーは約８．０～約９．０のｐＨを有する；および第３の洗浄ステップは、約１０～約７０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約３０～約７５％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含む第３のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含み、第３のバッファーは約８．０～約９．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、本方法は、第１の洗浄ステップの前に行われる第４の洗浄ステップをさらに含み、第４の洗浄ステップは、約１０～約３０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約７５～約２５０ｍＭのＮａＣｌを含む第４のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含み、第４のバッファーは約６．５～約８．０のｐＨを有する。これらの洗浄ステップの１つまたは複数、あるいはこれらの洗浄ステップのすべてが、室温で実施される。特定の実施形態では、洗浄ステップは室温で行われる。

【0160】

いくつかの実施形態では、第１のバッファーは、約１００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含み、第１のバッファーのｐＨは約６．０である。いくつかの実施形態では、第２のバッファーは、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１２５ｍＭのＮａＣｌを含み、第２のバッファーは約８．５のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、第３のバッファーは、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約５０％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含み、第３のバッファーは約８．０のｐＨを有する。これらの洗浄ステップの１つまたは複数、あるいはこれらの洗浄ステップのすべてが、室温で実施される。特定の実施形態では、洗浄ステップは室温で行われる。

【0161】

さらなる実施形態では、少なくとも３つの洗浄ステップが行われる；第１の洗浄ステップは、約５０～約５００ｍＭの２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸のナトリウム塩（ＭＥＳ－Ｎａ）と、約３～約３０ｍＭのＥＤＴＡと、ポリソルベート８０、ＤＭＳＯ、およびトリ（ｎ－ブチル）ホスフェート（ＴＮＢＰ）を含む溶媒／デタージェント混合物とを含む第１のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含み、第１のバッファーは、約５．２～約６．８のｐＨを有する；第２の洗浄ステップは、約３０～約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌまたはアルギニン－ＨＣｌ、および約７５～約５００ｍＭの塩を含む第２のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含み、第２のバッファーは約７．５～約９．２のｐＨを有する；第３の洗浄ステップは、約２０～約８０ｍＭのアルギニン－ＨＣｌおよび約５０～約６０％（ｗ／ｗ）のスクロースを含む第３のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含み、第３のバッファーは約７．３～約８．８のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２、ＣａＣｌ_２、クエン酸ナトリウム、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、酢酸ナトリウム；ならびにＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２、ＣａＣｌ_２、クエン酸ナトリウム、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、および酢酸ナトリウムのうちの１つまたは複数の組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、塩はＮａＣｌである。いくつかの実施形態では、塩の濃度は５００ｍＭを超えない。いくつかの実施形態では、塩の濃度は２００ｍＭを超えない。いくつかの実施形態では、第３のバッファー中の塩の濃度は５００ｍＭを超えない。いくつかの実施形態では、第３のバッファー中の塩の濃度は２００ｍＭを超えない。いくつかの実施形態では、本方法は、第１の洗浄ステップの前に行われる第４の洗浄ステップをさらに含み、第４の洗浄ステップは、約２０～約１００ｍＭのアルギニン－ＨＣｌおよび約７５～約２５０ｍＭのＮａＣｌを含む第４のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含み、第４のバッファーは約７．５～約８．８のｐＨを有する。これらの洗浄ステップの１つまたは複数、あるいはこれらの洗浄ステップのすべてが、室温で実施される。特定の実施形態では、洗浄ステップは室温で行われる。

【0162】

いくつかの実施形態では、本方法は、第１の溶出ステップの後でかつ第２の溶出ステップの前に行われる洗浄ステップをさらに含み、その洗浄ステップは、約２０～約１００ｍＭのアルギニン－ＨＣｌおよび約７５～約２５０ｍＭのＮａＣｌを含む第５のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含み、第５のバッファーは約７．５～約８．５のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、第２の溶出ステップは、約２０～約１００ｍＭのアルギニン－ＨＣｌ、約４０～約６０％（ｗ／ｗ）のグリセロール、および約５００～１０００ｍＭの塩（例えば、ＮａＣｌ）を含む第２の溶出バッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含み、第２の溶出バッファーは約７．５～約８．５のｐＨを有する。

【0163】

追加の洗浄ステップは、第１の溶出ステップと第２の溶出ステップの間のフロンティング効果（fronting effect）を最小化するのに有効である可能性があり、例えば、第１の溶出バッファーと第２の溶出バッファーの混合物により生じ得るフロンティングではなく、第１の溶出バッファーと第２の溶出バッファーそれら自体によってのみ誘発される溶出を提供することができる。いくつかの実施形態では、本方法は、第５の洗浄ステップおよび第２の溶出ステップの後に行われる第６の洗浄ステップをさらに含み、この洗浄ステップは、約２０～約１００ｍＭのアルギニン－ＨＣｌおよび約７５～約２５０ｍＭのＮａＣｌを含む第６のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含み、第６のバッファーは約７．５～約８．５のｐＨを有する。

【0164】

いくつかの実施形態では、少なくとも３つの洗浄ステップが行われる；第１の洗浄ステップは、約８０～約４００ｍＭのＢｉｓ－Ｔｒｉｓと、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００、ポリソルベート８０およびＴＮＢＰを約１１：３：３（重量比）の割合で含む約１０～約２０グラム（ｇ）の溶媒／デタージェント混合物とを含む第１のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含み、第１のバッファーは約５．２～約６．８のｐＨを有する；第２の洗浄ステップは、約５～約２０ｍｍｏｌのクエン酸ナトリウムを含む第２のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含み、第２のバッファーは約７．５～約９．２のｐＨを有する；第３の洗浄ステップは、約５０～約２００ｍＭのアルギニン－ＨＣｌ、約５０～約２００ｍＭのリジン－ＨＣｌ、約５０～約２００ｍＭのヒスチジン－ＨＣｌ、約１ｍＭ～約４ｍＭのＮ－アセチル－Ｄ，Ｌ－トリプトファン、および約１０％～約４０％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む第３のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含み、第３のバッファーは約７．３～約８．８のｐＨを有する。

【0165】

特定の実施形態では、第１の溶出ステップは、ＴｒｉｓＨＣｌベースのバッファーであり得る第１のバッファーを使用する。特定の実施形態では、第１の溶出ステップは、酢酸ナトリウム（ＮａＡｃｅｔａｔｅ）ベースのバッファーであり得る第１のバッファーを使用する。特定の実施形態では、第１の溶出ステップは、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸のナトリウム塩（ＭＥＳ－Ｎａ）と、ＥＤＴＡと、ポリソルベート８０、ＤＭＳＯ、およびトリ（ｎ－ブチル）ホスフェート（ＴＮＢＰ）を含む溶媒／デタージェント混合物とを含む第１のバッファーを使用する。特定の実施形態では、第１の溶出ステップは、約５０～約２００ｍＭのタウリン、および０．２～１．５％のＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ６０００）を含む第１のバッファーを使用する。特定の実施形態では、第１の溶出ステップは、Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓと、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００、ポリソルベート８０およびＴＮＢＰを含む溶媒／デタージェント混合物とを含む第１のバッファーを使用する。特定の実施形態では、第１の溶出ステップは、酢酸ナトリウムおよびポリソルベート８０を含む第１のバッファーを使用する。これらの溶出ステップの１つまたは複数、あるいはこれらの溶出ステップのすべてが、室温で実施される。特定の実施形態では、第１の溶出ステップは、ＮａＣｌを含むＴｒｉｓＨＣｌベースのバッファーであり得る第１のバッファーを使用する。

【0166】

特定の実施形態では、第２の溶出ステップは、ＴｒｉｓＨＣｌベースのバッファーであり得る第２のバッファーを使用する。特定の実施形態では、第２の溶出ステップは、酢酸ナトリウム（ＮａＡｃｅｔａｔｅ）ベースのバッファーであり得る第２のバッファーを使用する。特定の実施形態では、第２の溶出ステップは、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸のナトリウム塩（ＭＥＳ－Ｎａ）と、ＥＤＴＡと、ポリソルベート８０、ＤＭＳＯ、およびトリ（ｎ－ブチル）ホスフェート（ＴＮＢＰ）を含む溶媒／デタージェント混合物とを含む第２のバッファーを使用する。特定の実施形態では、第２の溶出ステップは、約５０～約２００ｍＭのタウリン、および０．２～１．５％のＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ６０００）を含む第２のバッファーを使用する。特定の実施形態では、第２の溶出ステップは、Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓと、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００、ポリソルベート８０およびＴＮＢＰを含む溶媒／デタージェント混合物とを含む第２のバッファーを使用する。特定の実施形態では、第２の溶出ステップは、酢酸ナトリウムおよびポリソルベート８０を含む第２のバッファーを使用する。特定の実施形態では、第２の溶出ステップは、ＴｒｉｓＨＣｌおよびＮａＣｌバッファーを含む第２のバッファーを使用する。

【0167】

特定の実施形態では、少なくとも１つの溶出バッファーは、約１０～約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約５０～約５００ｍＭの塩を含むことができ、ｐＨは約７．５～約９．２であり得る。特定の実施形態では、少なくとも１つの溶出バッファーは、約２５～約１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約７５～約２５０ｍＭの塩を含むことができ、ｐＨは約８．０～約９．０であり得る。特定の実施形態では、少なくとも１つの溶出バッファーは、約４０～約６０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１００～約１５０ｍＭの塩を含むことができ、ｐＨは約８．０～約９．０であり得る。特定の実施形態では、少なくとも１つの溶出バッファーは、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１２５ｍＭの塩を含むことができ、ｐＨは約８．５であり得る。特定の実施形態では、塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２、ＣａＣｌ_２、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、酢酸ナトリウム（Ｃ_２Ｈ_３ＮａＯ_２）、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、ＮＨ_４Ｃｌ、Ｎａ_２ＳＯ_４、Ｋ_２ＳＯ_４、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、またはそれらの組み合わせであり得る。特定の実施形態では、塩はＮａＣｌである。特定の実施形態では、溶出ステップ（複数可）は、１８℃未満（例えば、上述のように、１℃～１２℃の間、または２℃～８℃の間）で行われる。

【0168】

特定の実施形態では、少なくとも１つの溶出バッファーは、約１０～約２０００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．００１～約１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができ、ｐＨは約５．０～約７．４であり得る。特定の実施形態では、少なくとも１つの溶出バッファーは、約５０～約２００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．００５～約０．３％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができ、ｐＨは約５．５～約７．０であり得る。特定の実施形態では、少なくとも１つの溶出バッファーは、約９０～約１１０ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．０５～約０．２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができ、ｐＨは約５．５～約６．５であり得る。特定の実施形態では、少なくとも１つの溶出バッファーは、約１００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができ、ｐＨは約６．０であり得る。特定の実施形態では、溶出ステップ（複数可）は、１８℃未満（例えば、上述のように１℃～１２℃の間、または２℃～８℃の間）で行われる。

【0169】

特定の実施形態では、少なくとも１つの溶出バッファーは、約１０～約２００ｍＭのグリシン、約１～約１００ｍＭのヒスチジン、約２０～約５００ｍＭの塩、約１～約１０％（ｗ／ｗ）のトレハロース、および約０．０００５～約１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができ、ｐＨは約６．０～約８．０であり得る。特定の実施形態では、少なくとも１つの溶出バッファーは、約３０ｍＭ～約８０ｍＭのグリシン、約５～約２０ｍＭのヒスチジン、約５０～約２００ｍＭの塩、約３～約８％（ｗ／ｗ）のトレハロース、および約０．００１～約０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができ、ｐＨは約６．５～約７．５で得る。特定の実施形態では、少なくとも１つの溶出バッファーは、約４０～約６０ｍＭのグリシン、約５～約１５ｍＭのヒスチジン、約９０～約１１０ｍＭの塩、約４～約６％（ｗ／ｗ）のトレハロース、および約０．００１～約０．０５％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができ、ｐＨは約７．０～約７．４であり得る。特定の実施形態では、少なくとも１つの溶出バッファーは、約５０ｍＭのグリシン、約１０ｍＭのヒスチジン、約１００ｍＭの塩、約５％（ｗ／ｗ）のトレハロース、約０．００５％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができ、ｐＨは約７．０であり得る。特定の実施形態では、塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２、ＣａＣｌ_２、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、酢酸ナトリウム（Ｃ_２Ｈ_３ＮａＯ_２）、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、ＮＨ_４Ｃｌ、Ｎａ_２ＳＯ_４、Ｋ_２ＳＯ_４、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、またはそれらの組み合わせであり得る。特定の実施形態では、塩はＮａＣｌである。特定の実施形態では、溶出ステップ（複数可）は、１８℃未満（例えば、上述のように、１℃～１２℃の間、または２℃～８℃の間）で行われる。

【0170】

特定の実施形態では、少なくとも１つの溶出バッファーは、約１～約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、約５０～約５００ｍＭの塩、および約０．００１～約１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができ、ｐＨは約６．０～約８．８であり得る。特定の実施形態では、少なくとも１つの溶出バッファーは、約５～約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、約７５～約２５０ｍＭの塩、および約０．００５～約０．３％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができ、ｐＨは約６．５～約８．５であり得る。特定の実施形態では、少なくとも１つの溶出バッファーは、約１０～約３０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、約１４０～約１６０ｍＭの塩、および約０．０５～約０．２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができ、ｐＨは約７．０～約８．０であり得る。特定の実施形態では、少なくとも１つの溶出バッファーは、約２０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、約１５０ｍＭの塩、および約０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができ、ｐＨは約７．４であり得る。特定の実施形態では、塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２、ＣａＣｌ_２、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、酢酸ナトリウム（Ｃ_２Ｈ_３ＮａＯ_２）、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、ＮＨ_４Ｃｌ、Ｎａ_２ＳＯ_４、Ｋ_２ＳＯ_４、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、またはそれらの組み合わせであり得る。特定の実施形態では、塩はＮａＣｌである。特定の実施形態では、溶出ステップ（複数可）は、１８℃未満（例えば、上述のように、１℃～１２℃の間、または２℃～８℃の間）で行われる。

【0171】

特定の実施形態では、少なくとも１つの溶出バッファーは、約１０ｍＭ～約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１０％～約７５％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含むことができ、ｐＨは約７．５～約９．２であり得る。特定の実施形態では、少なくとも１つの溶出バッファーは、約２５ｍＭ～約１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約２５％～約７０％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含むことができ、ｐＨは約８．０～約９．０であり得る。特定の実施形態では、少なくとも１つの溶出バッファーは、約４０ｍＭ～約６０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約４０％～約６０％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含むことができ、ｐＨは約８．０～約８．８であり得る。特定の実施形態では、少なくとも１つの溶出バッファーは、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約５０％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含むことができ、ｐＨは約８．５であり得る。

【0172】

特定の実施形態では、少なくとも２つの溶出バッファーが使用される。特定の実施形態では、少なくとも１つの溶出バッファーは、約１０～約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約５０～約５００ｍＭの塩を含むことができ、ｐＨは約７．５～約９．２であり得る。特定の実施形態では、少なくとも１つの溶出バッファーは、約１０～約２０００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．００１～約１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができ、ｐＨは約５．０～約７．４であり得る。特定の実施形態では、塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２、ＣａＣｌ_２、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、酢酸ナトリウム（Ｃ_２Ｈ_３ＮａＯ_２）、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、ＮＨ_４Ｃｌ、Ｎａ_２ＳＯ_４、Ｋ_２ＳＯ_４、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、またはそれらの組み合わせであり得る。特定の実施形態では、溶出ステップ（複数可）は、１８℃未満（例えば、上述のように１℃～１２℃の間、または２℃～８℃の間）で行われる。

【0173】

特定の実施形態では、少なくとも２つの溶出バッファーが使用される。特定の実施形態では、少なくとも１つの溶出バッファーは、約２５～約１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約７５～約２５０ｍＭの塩を含むことができ、ｐＨは約８．０～約９．０であり得る。特定の実施形態では、少なくとも１つの溶出バッファーは、約５０～約２００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．００５～約０．３％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができ、ｐＨは約５．５～約７．０であり得る。特定の実施形態では、塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２、ＣａＣｌ_２、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、酢酸ナトリウム（Ｃ_２Ｈ_３ＮａＯ_２）、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、ＮＨ_４Ｃｌ、Ｎａ_２ＳＯ_４、Ｋ_２ＳＯ_４、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、またはそれらの組み合わせであり得る。特定の実施形態では、溶出ステップ（複数可）は、１８℃未満（例えば、上述のように１℃～１２℃の間、または２℃～８℃の間）で行われる。

【0174】

特定の実施形態では、少なくとも２つの溶出バッファーが使用される。特定の実施形態では、少なくとも１つの溶出バッファーは、約４０～約６０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１００～約１５０ｍＭの塩を含むことができ、ｐＨは約８．０～約９．０であり得る。特定の実施形態では、少なくとも１つの溶出バッファーは、約９０～約１１０ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．０５～約０．２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができ、ｐＨは約５．５～約６．５であり得る。特定の実施形態では、塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２、ＣａＣｌ_２、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、酢酸ナトリウム（Ｃ_２Ｈ_３ＮａＯ_２）、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、ＮＨ_４Ｃｌ、Ｎａ_２ＳＯ_４、Ｋ_２ＳＯ_４、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、またはそれらの組み合わせであり得る。特定の実施形態では、溶出ステップ（複数可）は、１８℃未満（例えば、上述のように１℃～１２℃の間、または２℃～８℃の間）で行われる。

【0175】

特定の実施形態では、少なくとも２つの溶出バッファーが使用される。特定の実施形態では、少なくとも１つの溶出バッファーは、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１２５ｍＭの塩を含むことができ、ｐＨは約８．５であり得る。特定の実施形態では、少なくとも１つの溶出バッファーは、約１００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができ、ｐＨは約６．０であり得る。特定の実施形態では、塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２、ＣａＣｌ_２、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、酢酸ナトリウム（Ｃ_２Ｈ_３ＮａＯ_２）、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、ＮＨ_４Ｃｌ、Ｎａ_２ＳＯ_４、Ｋ_２ＳＯ_４、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、またはそれらの組み合わせであり得る。特定の実施形態では、溶出ステップ（複数可）は、１８℃未満（例えば、上述のように１℃～１２℃の間、または２℃～８℃の間）で行われる。

【0176】

いくつかの実施形態では、少なくとも３つの溶出ステップが行われる；少なくとも１つの溶出バッファーは、約５０～約２０００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．０５～約０．２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含み、ｐＨは約５．２～約６．８である；少なくとも１つの溶出バッファーは、約３０～約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約７５～約５００ｍＭの塩を含み、ｐＨは約７．５～約９．２である；および少なくとも１つの溶出バッファーは、約３０～約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約３０～約７５％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含み、ｐＨは約７．３～約８．８である。特定の実施形態では、塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２、ＣａＣｌ_２、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、酢酸ナトリウム（Ｃ_２Ｈ_３ＮａＯ_２）、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、ＮＨ_４Ｃｌ、Ｎａ_２ＳＯ_４、Ｋ_２ＳＯ_４、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、またはそれらの組み合わせであり得る。特定の実施形態では、塩はＮａＣｌである。特定の実施形態では、溶出ステップ（複数可）は、１８℃未満（例えば、上述のように、１℃～１２℃の間、または２℃～８℃の間）で行われる。

【0177】

いくつかの実施形態では、少なくとも３つの溶出ステップが行われる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバッファーは、約１００ｍＭの酢酸ナトリウム、約０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含み、ｐＨは約６．０のである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバッファーは、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１２５ｍＭのＮａＣｌを含み、ｐＨは約８．５である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバッファーは、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約５０％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含み、ｐＨは約８．５である。特定の実施形態では、溶出ステップ（複数可）は、１８℃未満（例えば、上述のように１℃～１２℃の間、または２℃～８℃の間）で行われる。

【0178】

いくつかの実施形態では、少なくとも３つの溶出ステップが行われる；第１の溶出ステップは、約５０～約２０００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．０５～約０．２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む第１のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含み、第１のバッファーは約５．２～約６．８のｐＨを有する；第２の溶出ステップは、約３０～約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約７５～約５００ｍＭの塩を含む第２のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含み、第２のバッファーは約７．５～約９．２のｐＨを有する；第３の溶出ステップは、約３０～約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約３０～約７５％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含む第３のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含み、第３のバッファーは約７．３～約８．８のｐＨを有する。特定の実施形態では、塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２、ＣａＣｌ_２、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、酢酸ナトリウム（Ｃ_２Ｈ_３ＮａＯ_２）、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、ＮＨ_４Ｃｌ、Ｎａ_２ＳＯ_４、Ｋ_２ＳＯ_４、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、またはそれらの組み合わせであり得る。特定の実施形態では、塩はＮａＣｌである。特定の実施形態では、溶出ステップ（複数可）は、１８℃未満（例えば、上述のように、１℃～１２℃の間、または２℃～８℃の間）で行われる。

【0179】

いくつかの実施形態では、溶出バッファーの少なくとも１つは、約５．８～約６．２のｐＨで、約９０～約１１０ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．０９～約０．１１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０／Ｔｗｅｅｎ ８０を含む。いくつかの実施形態では、溶出バッファーの少なくとも１つは、約６．５～約７．５のｐＨで、約３５～７０ｍＭのグリシン、５～１５ｍＭのヒスチジン、５０～２００ｍＭのＮａＣｌ、３～８％のトレハロース、および０．００１～０．００５％のＣｒｉｌｌｅｔ（商標）４を含む。いくつかの実施形態では、溶出バッファーの少なくとも１つは、約８．２～約８．８のｐＨで、約４５～約５５ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約９０～約１５０ｍＭのＮａＣｌを含む。特定の実施形態では、溶出ステップ（複数可）は、１８℃未満（例えば、上述のように１℃～１２℃の間、または２℃～８℃の間）で行われる。

【0180】

いくつかの実施形態では、第１の溶出バッファーは、約５．８～約６．２のｐＨで、約９０～約１１０ｍＭの酢酸ナトリウム、および約０．０９～約０．１１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０／Ｔｗｅｅｎ ８０を含む。いくつかの実施形態では、第２の溶出バッファーは、約６．５～約７．５のｐＨで、約３５～７０ｍＭのグリシン、５～１５ｍＭのヒスチジン、５０～２００ｍＭのＮａＣｌ、３～８％のトレハロース、および０．００１～０．００５％のＣｒｉｌｌｅｔ（商標）４を含む。いくつかの実施形態では、第３の溶出バッファーは、約８．２～約８．８のｐＨで、約４５～約５５ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約９０～約１５０ｍＭのＮａＣｌを含む。特定の実施形態では、溶出ステップは、１８℃未満（例えば、上述のように１℃～１２℃の間、または２℃～８℃の間）で行われる。

【0181】

いくつかの実施形態では、第１の溶出バッファーは、約５．８～約６．２のｐＨで、約９０～約１１０ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．０９～約０．１１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０／Ｔｗｅｅｎ ８０を含み、第２のバッファーは、約８．２～約８．８のｐＨで、約４５～約５５ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１１０～約１３５ｍＭのＮａＣｌを含み、第３のバッファーは、約８．２～約８．８のｐＨで、約４５～約５５ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約４５～約５５％のエチレングリコールを含む。特定の実施形態では、約７．２～約７．６のｐＨで約１５～約２５ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１３５～約１６５ｍＭのＮａＣｌを含む任意選択の第４のバッファーが存在する。特定の実施形態では、溶出バッファーは、約７．８～約８．２のｐＨで、約４５～約５５ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、約４５～約５５％のエチレングリコール、および約６５０～約８５０ｍＭのＮａＣｌを含む。特定の実施形態では、溶出ステップ（複数可）は、１８℃未満（例えば、上述したように、１℃～１２℃の間、または２℃～８℃の間）で行われる。

【0182】

いくつかの実施形態では、溶出バッファーの少なくとも１つは、約７．２～約７．６のｐＨで、約１５～約２５ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１３５～約１６５ｍＭのＮａＣｌを含む。いくつかの実施形態では、溶出バッファーの少なくとも１つは、約５．８～約６．２のｐＨで、約９０～約１１０ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．０９～約０．１１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む。いくつかの実施形態では、溶出バッファーの少なくとも１つは、約８．２～約８．８のｐＨで、約４５～約５５ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１１０～約１３５ｍＭのＮａＣｌを含む。いくつかの実施形態では、溶出バッファーの少なくとも１つは、約７．５～約８．５のｐＨで、約４５～約５５ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約４５～約５５％のエチレングリコールを含む。いくつかの実施形態では、溶出バッファーの少なくとも１つは、約７．８～約８．２のｐＨで、約４５～約５５ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、約４５～約５５％のエチレングリコール、および約６５０～約８５０ｍＭのＮａＣｌを含む。特定の実施形態では、溶出ステップ（複数可）は、１８℃未満（例えば、上述のように１℃～１２℃の間、または２℃～８℃の間）で行われる。

【0183】

いくつかの実施形態では、第１のバッファーは、約７．２～約７．６のｐＨで、約１５～約２５ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１３５～約１６５ｍＭのＮａＣｌを含み、第２のバッファーは、約５．８～約６．２のｐＨで、約９０～約１１０ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．０９～約０．１１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含み、第３のバッファーは、約８．２～約８．８のｐＨで、約４５～約５５ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１１０～約１３５ｍＭのＮａＣｌを含み、第４のバッファーは約７．５～約８．５のｐＨで、約４５～約５５ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約４５～約５５％のエチレングリコールを含み、第５の溶出バッファーは、約７．８～約８．２のｐＨで、約４５～約５５ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、約４５～約５５％のエチレングリコールおよび約６５０～約８５０ｍＭのＮａＣｌを含む。特定の実施形態では、溶出ステップ（複数可）は、１８℃未満（例えば、上述のように１℃～１２℃の間、または２℃～８℃の間）で行われる。

【0184】

特定の実施形態では、第１の洗浄バッファーは、約１０～約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約５０～約５００ｍＭの塩を含むことができ、ｐＨは約７．５～約９．２であり得る。特定の実施形態では、第１の溶出バッファーは、約１０～約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約５０～約５００ｍＭの塩を含むことができ、ｐＨは約７．５～約９．２であり得る。特定の実施形態では、塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２、ＣａＣｌ_２、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、酢酸ナトリウム（Ｃ_２Ｈ_３ＮａＯ_２）、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、ＮＨ_４Ｃｌ、Ｎａ_２ＳＯ_４、Ｋ_２ＳＯ_４、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、またはそれらの組み合わせであり得る。特定の実施形態では、塩はＮａＣｌである。特定の実施形態では、洗浄ステップは室温で行われる。特定の実施形態では、溶出ステップ（複数可）は、１８℃未満（例えば、上述のように１℃～１２℃の間、または２℃～８℃の間）で行われる。

【0185】

特定の実施形態では、第１の洗浄バッファーは、約２５～約１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約７５～約２５０ｍＭの塩を含むことができ、ｐＨは約８．０～約９．０であり得る。特定の実施形態では、第１の溶出バッファーは、約２５～約１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約７５～約２５０ｍＭの塩を含むことができ、ｐＨは約８．０～約９．０であり得る。特定の実施形態では、塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２、ＣａＣｌ_２、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、酢酸ナトリウム（Ｃ_２Ｈ_３ＮａＯ_２）、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、ＮＨ_４Ｃｌ、Ｎａ_２ＳＯ_４、Ｋ_２ＳＯ_４、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、またはそれらの組み合わせであり得る。特定の実施形態では、塩はＮａＣｌである。特定の実施形態では、洗浄ステップは室温で行われる。特定の実施形態では、溶出ステップ（複数可）は、１８℃未満（例えば、上述のように１℃～１２℃の間、または２℃～８℃の間）で行われる。

【0186】

特定の実施形態では、第１の洗浄バッファーは、約４０～約６０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１００～約１５０ｍＭの塩を含むことができ、ｐＨは約８．０～約９．０であり得る。特定の実施形態では、第１の溶出バッファーは、約２５～約１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約７５～約２５０ｍＭの塩を含むことができ、ｐＨは約８．０～約８．８であり得る。特定の実施形態では、塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２、ＣａＣｌ_２、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、酢酸ナトリウム（Ｃ_２Ｈ_３ＮａＯ_２）、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、ＮＨ_４Ｃｌ、Ｎａ_２ＳＯ_４、Ｋ_２ＳＯ_４、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、またはそれらの組み合わせであり得る。特定の実施形態では、塩はＮａＣｌである。特定の実施形態では、洗浄ステップは室温で行われる。特定の実施形態では、溶出ステップ（複数可）は、１８℃未満（例えば、上述のように１℃～１２℃の間、または２℃～８℃の間）で行われる。

【0187】

特定の実施形態では、第１の洗浄バッファーは、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１２５ｍＭの塩を含むことができ、ｐＨは約８．５であり得る。特定の実施形態では、第１の溶出バッファーは、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１２５ｍＭの塩を含むことができ、ｐＨは約８であり得る。特定の実施形態では、塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２、ＣａＣｌ_２、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、酢酸ナトリウム（Ｃ_２Ｈ_３ＮａＯ_２）、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、ＮＨ_４Ｃｌ、Ｎａ_２ＳＯ_４、Ｋ_２ＳＯ_４、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、またはそれらの組み合わせであり得る。特定の実施形態では、塩はＮａＣｌである。特定の実施形態では、洗浄ステップは、室温で行われる。特定の実施形態では、溶出ステップ（複数可）は、１８℃未満（例えば、上述のように１℃～１２℃の間、または２℃～８℃の間）で行われる。

【0188】

特定の実施形態では、第１および第３の洗浄バッファーは、約１０～約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約５０～約５００ｍＭの塩を含むことができ、ｐＨは約７．５～約９．２であり得る。特定の実施形態では、第１の溶出バッファーは、約１０～約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約５０～約５００ｍＭの塩を含むことができ、ｐＨは約７．５～約９．２であり得る。特定の実施形態では、塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２、ＣａＣｌ_２、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、酢酸ナトリウム（Ｃ_２Ｈ_３ＮａＯ_２）、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、ＮＨ_４Ｃｌ、Ｎａ_２ＳＯ_４、Ｋ_２ＳＯ_４、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、またはそれらの組み合わせであり得る。特定の実施形態では、塩はＮａＣｌである。特定の実施形態では、洗浄ステップは室温で行われる。特定の実施形態では、溶出ステップ（複数可）は、１８℃未満（例えば、上述のように１℃～１２℃の間、または２℃～８℃の間）で行われる。

【0189】

特定の実施形態では、第１および第３の洗浄バッファーは、約２５～約１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約７５～約２５０ｍＭの塩を含むことができ、ｐＨは約８．０～約９．０であり得る。特定の実施形態では、第１の溶出バッファーは、約２５～約１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約７５～約２５０ｍＭの塩を含むことができ、ｐＨは約８．０～約９．０であり得る。特定の実施形態では、塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２、ＣａＣｌ_２、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、酢酸ナトリウム（Ｃ_２Ｈ_３ＮａＯ_２）、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、ＮＨ_４Ｃｌ、Ｎａ_２ＳＯ_４、Ｋ_２ＳＯ_４、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、またはそれらの組み合わせであり得る。特定の実施形態では、塩はＮａＣｌである。特定の実施形態では、洗浄ステップは室温で行われる。特定の実施形態では、溶出ステップ（複数可）は、１８℃未満（例えば、上述のように１℃～１２℃の間、または２℃～８℃の間）で行われる。

【0190】

特定の実施形態では、第１および第３の洗浄バッファーは、約４０～約６０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１００～約１５０ｍＭの塩を含むことができ、ｐＨは約８．０～約９．０であり得る。特定の実施形態では、第１の溶出バッファーは、約２５～約１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約７５～約２５０ｍＭの塩を含むことができ、ｐＨは約８．０～約８．８であり得る。特定の実施形態では、塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２、ＣａＣｌ_２、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、酢酸ナトリウム（Ｃ_２Ｈ_３ＮａＯ_２）、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、ＮＨ_４Ｃｌ、Ｎａ_２ＳＯ_４、Ｋ_２ＳＯ_４、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、またはそれらの組み合わせであり得る。特定の実施形態では、塩はＮａＣｌである。特定の実施形態では、洗浄ステップは室温で行われる。特定の実施形態では、溶出ステップ（複数可）は、１８℃未満（例えば、上述のように１℃～１２℃の間、または２℃～８℃の間）で行われる。

【0191】

特定の実施形態では、第１および第３の洗浄バッファーは、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１２５ｍＭの塩を含むことができ、ｐＨは約８．５であり得る。特定の実施形態では、第１の溶出バッファーは、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１２５ｍＭの塩を含むことができ、ｐＨは約８であり得る。特定の実施形態では、塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２、ＣａＣｌ_２、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、酢酸ナトリウム（Ｃ_２Ｈ_３ＮａＯ_２）、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、ＮＨ_４Ｃｌ、Ｎａ_２ＳＯ_４、Ｋ_２ＳＯ_４、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、またはこれらの組み合わせであり得る。特定の実施形態では、塩はＮａＣｌである。特定の実施形態では、洗浄ステップは室温で行われる。特定の実施形態では、溶出ステップ（複数可）は、１８℃未満（例えば、上述のように１℃～１２℃の間、または２℃～８℃の間）で行われる。

【0192】

特定の実施形態では、第１および第３の洗浄バッファーは、約１０～約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約５０～約５００ｍＭの塩を含むことができ、ｐＨは約７．５～約９．２であり得る。特定の実施形態では、第２の洗浄バッファーは、約１０～約２０００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．００１～約１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができ、ｐＨは約５．０～約７．４であり得る。特定の実施形態では、第１の溶出バッファーは、約１０～約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約５０～約５００ｍＭの塩を含むことができ、ｐＨは約７．５～約９．２であり得る。特定の実施形態では、塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２、ＣａＣｌ_２、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、酢酸ナトリウム（Ｃ_２Ｈ_３ＮａＯ_２）、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、ＮＨ_４Ｃｌ、Ｎａ_２ＳＯ_４、Ｋ_２ＳＯ_４、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、またはそれらの組み合わせであり得る。特定の実施形態では、塩はＮａＣｌである。特定の実施形態では、洗浄ステップは室温で行われる。特定の実施形態では、溶出ステップ（複数可）は、１８℃未満（例えば、上述のように１℃～１２℃の間、または２℃～８℃の間）で行われる。

【0193】

特定の実施形態では、第１および第３の洗浄バッファーは、約２５～約１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約７５～約２５０ｍＭの塩を含むことができ、ｐＨは約８．０～約９．０であり得る。特定の実施形態では、第２の洗浄バッファーは、約５０～約２００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．００５～約０．３％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができ、ｐＨは約５．５～約７．０であり得る。特定の実施形態では、第１の溶出バッファーは、約２５～約１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約７５～約２５０ｍＭの塩を含むことができ、ｐＨは約８．０～約９．０であり得る。特定の実施形態では、塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２、ＣａＣｌ_２、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、酢酸ナトリウム（Ｃ_２Ｈ_３ＮａＯ_２）、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、ＮＨ_４Ｃｌ、Ｎａ_２ＳＯ_４、Ｋ_２ＳＯ_４、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、またはそれらの組み合わせであり得る。特定の実施形態では、塩はＮａＣｌである。特定の実施形態では、洗浄ステップは室温で行われる。特定の実施形態では、溶出ステップ（複数可）は、１８℃未満（例えば、上述のように１℃～１２℃の間、または２℃～８℃の間）で行われる。

【0194】

特定の実施形態では、第１および第３の洗浄バッファーは、約４０～約６０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１００～約１５０ｍＭの塩を含むことができ、ｐＨは約８．０～約９．０であり得る。特定の実施形態では、第２の洗浄バッファーは、約９０～約１１０ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．０５～約０．２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができ、ｐＨは約５．５～約６．５であり得る。特定の実施形態では、第１の溶出バッファーは、約２５～約１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約７５～約２５０ｍＭの塩を含むことができ、ｐＨは約８．０～約８．８であり得る。特定の実施形態では、塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２、ＣａＣｌ_２、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、酢酸ナトリウム（Ｃ_２Ｈ_３ＮａＯ_２）、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、ＮＨ_４Ｃｌ、Ｎａ_２ＳＯ_４、Ｋ_２ＳＯ_４、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、またはそれらの組み合わせであり得る。特定の実施形態では、塩はＮａＣｌである。特定の実施形態では、洗浄ステップは室温で行われる。特定の実施形態では、溶出ステップ（複数可）は、１８℃未満（例えば、上述のように１℃～１２℃の間、または２℃～８℃の間）で行われる。

【0195】

特定の実施形態では、第１および第３の洗浄バッファーは、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１２５ｍＭの塩を含むことができ、ｐＨは約８．５であり得る。特定の実施形態では、第２の洗浄バッファーは、約１００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができ、ｐＨは約６．０であり得る。特定の実施形態では、第１の溶出バッファーは、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１２５ｍＭの塩を含むことができ、ｐＨは約８であり得る。特定の実施形態では、塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２、ＣａＣｌ_２、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、酢酸ナトリウム（Ｃ_２Ｈ_３ＮａＯ_２）、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、ＮＨ_４Ｃｌ、Ｎａ_２ＳＯ_４、Ｋ_２ＳＯ_４、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、またはこれらの組み合わせである。特定の実施形態では、塩はＮａＣｌである。特定の実施形態では、洗浄ステップは室温で行われる。特定の実施形態では、溶出ステップ（複数可）は、１８℃未満（例えば、上述のように１℃～１２℃の間、または２℃～８℃の間）で行われる。

【0196】

特定の実施形態では、第１および第３の洗浄バッファーは、約１０～約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約５０～約５００ｍＭの塩を含むことができ、ｐＨは約７．５～約９．２であり得る。特定の実施形態では、第２および第４の洗浄バッファーは、約１０～約２０００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．００１～約１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができ、ｐＨは約５．０～約７．４であり得る。特定の実施形態では、第１の溶出バッファーは、約１０～約２０００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．００１～約１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができ、ｐＨは約５．０～約７．４であり得る。特定の実施形態では、塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２、ＣａＣｌ_２、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、酢酸ナトリウム（Ｃ_２Ｈ_３ＮａＯ_２）、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、ＮＨ_４Ｃｌ、Ｎａ_２ＳＯ_４、Ｋ_２ＳＯ_４、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、またはそれらの組み合わせであり得る。特定の実施形態では、塩はＮａＣｌである。特定の実施形態では、洗浄ステップは室温で行われる。特定の実施形態では、溶出ステップ（複数可）は、１８℃未満（例えば、上述のように１℃～１２℃の間、または２℃～８℃の間）で行われる。

【0197】

特定の実施形態では、第１および第３の洗浄バッファーは、約２５～約１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約７５～約２５０ｍＭの塩を含むことができ、ｐＨは約８．０～約９．０であり得る。特定の実施形態では、第２および第４の洗浄バッファーは、約５０～約２００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．００５～約０．３％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができ、ｐＨは約５．５～約７．０であり得る。特定の実施形態では、第１の溶出バッファーは、約５０～約２００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．００５～約０．３％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができ、ｐＨは約５．５～約７．０であり得る。特定の実施形態では、塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２、ＣａＣｌ_２、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、酢酸ナトリウム（Ｃ_２Ｈ_３ＮａＯ_２）、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、ＮＨ_４Ｃｌ、Ｎａ_２ＳＯ_４、Ｋ_２ＳＯ_４、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、またはそれらの組み合わせであり得る。特定の実施形態では、塩はＮａＣｌである。特定の実施形態では、洗浄ステップは室温で行われる。特定の実施形態では、溶出ステップ（複数可）は、１８℃未満（例えば、上述のように１℃～１２℃の間、または２℃～８℃の間）で行われる。

【0198】

特定の実施形態では、第１および第３の洗浄バッファーは、約４０～約６０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１００～約１５０ｍＭの塩を含むことができ、ｐＨは約８．０～約９．０であり得る。特定の実施形態では、第２および第４の洗浄バッファーは、約９０～約１１０ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．０５～約０．２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができ、ｐＨは約５．５～約６．５であり得る。特定の実施形態では、第１の溶出バッファーは、約９０～約１１０ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．０５～約０．２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができ、ｐＨは約５．５～約６．５であり得る。特定の実施形態では、塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２、ＣａＣｌ_２、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、酢酸ナトリウム（Ｃ_２Ｈ_３ＮａＯ_２）、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、ＮＨ_４Ｃｌ、Ｎａ_２ＳＯ_４、Ｋ_２ＳＯ_４、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、またはそれらの組み合わせであり得る。特定の実施形態では、塩はＮａＣｌである。特定の実施形態では、洗浄ステップは室温で行われる。特定の実施形態では、溶出ステップ（複数可）は、１８℃未満（例えば、上述のように１℃～１２℃の間、または２℃～８℃の間）で行われる。

【0199】

特定の実施形態では、第１および第３の洗浄バッファーは、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１２５ｍＭの塩を含むことができ、ｐＨは約８．５であり得る。特定の実施形態では、第２および第４の洗浄バッファーは、約１００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができ、ｐＨは約６．０であり得る。特定の実施形態では、第１の溶出バッファーは、約１００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができ、ｐＨは約６．０であり得る。特定の実施形態では、塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２、ＣａＣｌ_２、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、酢酸ナトリウム（Ｃ_２Ｈ_３ＮａＯ_２）、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、ＮＨ_４Ｃｌ、Ｎａ_２ＳＯ_４、Ｋ_２ＳＯ_４、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、またはそれらの組み合わせであり得る。特定の実施形態では、塩はＮａＣｌである。特定の実施形態では、洗浄ステップは室温で行われる。特定の実施形態では、溶出ステップ（複数可）は、１８℃未満（例えば、上述のように１℃～１２℃の間、または２℃～８℃の間）で行われる。

【0200】

特定の実施形態では、第１の洗浄バッファーは、約１０～約２０００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．００１～約１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができ、ｐＨは約５．０～約７．４であり得る。特定の実施形態では、第１の溶出バッファーは、約１０～約２０００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．００１～約１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができ、ｐＨは約５．０～約７．４であり得る。特定の実施形態では、溶出ステップ（複数可）は、１８℃未満（例えば、上述したように、１℃～１２℃の間、または２℃～８℃の間）で行われる。

【0201】

特定の実施形態では、第１の洗浄バッファーは、約５０～約２００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．００５～約０．３％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができ、ｐＨは約５．５～約７．０であり得る。特定の実施形態では、第１の溶出バッファーは、約５０～約２００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．００５～約０．３％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができ、ｐＨは約５．５～約７．０であり得る。特定の実施形態では、洗浄ステップは室温で行われる。特定の実施形態では、溶出ステップ（複数可）は、１８℃未満（例えば、上述のように１℃～１２℃の間、または２℃～８℃の間）で行われる。

【0202】

特定の実施形態では、第１の洗浄バッファーは、約９０～約１１０ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．０５～約０．２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができ、ｐＨは約５．５～約６．５であり得る。特定の実施形態では、第１の溶出バッファーは、約９０～約１１０ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．０５～約０．２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができ、ｐＨは約５．５～約６．５であり得る。特定の実施形態では、洗浄ステップは室温で行われる。特定の実施形態では、溶出ステップ（複数可）は、１８℃未満（例えば、上述のように１℃～１２℃の間、または２℃～８℃の間）で行われる。

【0203】

特定の実施形態では、第１の洗浄バッファーは、約１００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができ、ｐＨは約６．０であり得る。特定の実施形態では、第１の溶出バッファーは、約１００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができ、ｐＨは約６．０であり得る。特定の実施形態では、洗浄ステップは室温で行われる。特定の実施形態では、溶出ステップ（複数可）は、１８℃未満（例えば、上述のように１℃～１２℃の間、または２℃～８℃の間）で行われる。

【0204】

特定の実施形態では、第１および第３の洗浄バッファーは、約１０～約２０００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．００１～約１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができ、ｐＨは約５．０～約７．４であり得る。特定の実施形態では、第１の溶出バッファーは、約１０～約２０００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．００１～約１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができ、ｐＨは約５．０～約７．４であり得る。特定の実施形態では、洗浄ステップは室温で行われる。特定の実施形態では、溶出ステップ（複数可）は、１８℃未満（例えば、上述のように１℃～１２℃の間、または２℃～８℃の間）で行われる。

【0205】

特定の実施形態では、第１および第３の洗浄バッファーは、約５０～約２００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．００５～約０．３％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができ、ｐＨは約５．５～約７．０であり得る。特定の実施形態では、第１の溶出バッファーは、約５０～約２００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．００５～約０．３％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができ、ｐＨは約５．５～約７．０であり得る。特定の実施形態では、洗浄ステップは室温で行われる。特定の実施形態では、溶出ステップ（複数可）は、１８℃未満（例えば、上述のように１℃～１２℃の間、または２℃～８℃の間）で行われる。

【0206】

特定の実施形態では、第１および第３の洗浄バッファーは、約９０～約１１０ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．０５～約０．２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができ、ｐＨは約５．５～約６．５のｐＨであり得る。特定の実施形態では、第１の溶出バッファーは、約９０～約１１０ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．０５～約０．２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができ、ｐＨは約５．５～約６．５であり得る。特定の実施形態では、洗浄ステップは室温で行われる。特定の実施形態では、溶出ステップ（複数可）は、１８℃未満（例えば、上述のように１℃～１２℃の間、または２℃～８℃の間）で行われる。

【0207】

特定の実施形態では、第１および第３の洗浄バッファーは、約１００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができ、ｐＨは約６．０であり得る。特定の実施形態では、第１の溶出バッファーは、約１００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができ、ｐＨは約６．０であり得る。特定の実施形態では、洗浄ステップは室温で行われる。特定の実施形態では、溶出ステップは、１８℃未満（例えば、上述のように１℃～１２℃の間、または２℃～８℃の間）で行われる。

【0208】

特定の実施形態では、第１および第３の洗浄バッファーは、約１０～約２０００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．００１～約１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができ、ｐＨは約５．０～約７．４であり得る。特定の実施形態では、第２の洗浄バッファーは、約１０～約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約５０～約５００ｍＭの塩を含むことができ、ｐＨは約７．５～約９．２であり得る。特定の実施形態では、第１の溶出バッファーは、約１０～約２０００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．００１～約１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができ、ｐＨは約５．０～約７．４であり得る。特定の実施形態では、塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２、ＣａＣｌ_２、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、酢酸ナトリウム（Ｃ_２Ｈ_３ＮａＯ_２）、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、ＮＨ_４Ｃｌ、Ｎａ_２ＳＯ_４、Ｋ_２ＳＯ_４、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、またはそれらの組み合わせであり得る。特定の実施形態では、塩はＮａＣｌである。特定の実施形態では、洗浄ステップは室温で行われる。特定の実施形態では、溶出ステップ（複数可）は、１８℃未満（例えば、上述のように１℃～１２℃の間、または２℃～８℃の間）で行われる。

【0209】

特定の実施形態では、第１および第３の洗浄バッファーは、約５０～約２００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．００５～約０．３％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができ、ｐＨは約５．５～約７．０であり得る。特定の実施形態では、第２の洗浄バッファーは、約２５～約１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約７５～約２５０ｍＭの塩を含むことができ、ｐＨは約８．０～約９．０であり得る。特定の実施形態では、第１の溶出バッファーは、約５０～約２００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．００５～約０．３％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができ、ｐＨは約５．５～約７．０であり得る。特定の実施形態では、塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２、ＣａＣｌ_２、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、酢酸ナトリウム（Ｃ_２Ｈ_３ＮａＯ_２）、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、ＮＨ_４Ｃｌ、Ｎａ_２ＳＯ_４、Ｋ_２ＳＯ_４、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、またはそれらの組み合わせであり得る。特定の実施形態では、塩はＮａＣｌである。特定の実施形態では、洗浄ステップは室温で行われる。特定の実施形態では、溶出ステップ（複数可）は、１８℃未満（例えば、上述のように１℃～１２℃の間、または２℃～８℃の間）で行われる。

【0210】

特定の実施形態では、第１および第３の洗浄バッファーは、約９０～約１１０ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．０５～約０．２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができ、ｐＨは約５．５～約６．５であり得る。特定の実施形態では、第２の洗浄バッファーは、約４０～約６０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１００～約１５０ｍＭの塩を含むことができ、ｐＨは約８．０～約９．０であり得る。特定の実施形態では、第１の溶出バッファーは、約９０～約１１０ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．０５～約０．２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができ、ｐＨは約５．５～約６．５であり得る。特定の実施形態では、塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２、ＣａＣｌ_２、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、酢酸ナトリウム（Ｃ_２Ｈ_３ＮａＯ_２）、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、ＮＨ_４Ｃｌ、Ｎａ_２ＳＯ_４、Ｋ_２ＳＯ_４、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、またはそれらの組み合わせであり得る。特定の実施形態では、塩はＮａＣｌである。特定の実施形態では、洗浄ステップは室温で行われる。特定の実施形態では、溶出ステップ（複数可）は、１８℃未満（例えば、上述のように１℃～１２℃の間、または２℃～８℃の間）で行われる。

【0211】

特定の実施形態では、第１および第３の洗浄バッファーは、約１００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができ、ｐＨは約６．０であり得る。特定の実施形態では、第２の洗浄バッファーは、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１２５ｍＭの塩を含むことができ、ｐＨは約８．５であり得る。特定の実施形態では、第１の溶出バッファーは、約１００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができ、ｐＨは約６．０であり得る。特定の実施形態では、塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２、ＣａＣｌ_２、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、酢酸ナトリウム（Ｃ_２Ｈ_３ＮａＯ_２）、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、ＮＨ_４Ｃｌ、Ｎａ_２ＳＯ_４、Ｋ_２ＳＯ_４、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、またはそれらの組み合わせであり得る。特定の実施形態では、塩はＮａＣｌである。特定の実施形態では、洗浄ステップは室温で行われる。特定の実施形態では、溶出ステップ（複数可）は、１８℃未満（例えば、上述のように１℃～１２℃の間、または２℃～８℃の間）で行われる。

【0212】

特定の実施形態では、第１および第３の洗浄バッファーは、約１０～約２０００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．００１～約１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができ、ｐＨは約５．０～約７．４であり得る。特定の実施形態では、第２および第４の洗浄バッファーは、約１０～約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約５０～約５００ｍＭの塩を含むことができ、ｐＨは約７．５～約９．２であり得る。特定の実施形態では、第１の溶出バッファーは、約１０～約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約５０～約５００ｍＭの塩を含むことができ、ｐＨは約７．５～約９．２であり得る。特定の実施形態では、塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２、ＣａＣｌ_２、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、酢酸ナトリウム（Ｃ_２Ｈ_３ＮａＯ_２）、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、ＮＨ_４Ｃｌ、Ｎａ_２ＳＯ_４、Ｋ_２ＳＯ_４、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、またはそれらの組み合わせであり得る。特定の実施形態では、塩はＮａＣｌである。特定の実施形態では、洗浄ステップは室温で行われる。特定の実施形態では、溶出ステップ（複数可）は、１８℃未満（例えば、上述のように１℃～１２℃の間、または２℃～８℃の間）で行われる。

【0213】

特定の実施形態では、第１および第３の洗浄バッファーは、約５０～約２００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．００５～約０．３％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができ、ｐＨは約５．５～約７．０であり得る。特定の実施形態では、第２および第４の洗浄バッファーは、約２５～約１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約７５～約２５０ｍＭの塩を含むことができ、ｐＨは約８．０～約９．０であり得る。特定の実施形態では、第１の溶出バッファーは、約２５～約１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約７５～約２５０ｍＭの塩を含むことができ、ｐＨは約８．０～約９．０であり得る。特定の実施形態では、塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２、ＣａＣｌ_２、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、酢酸ナトリウム（Ｃ_２Ｈ_３ＮａＯ_２）、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、ＮＨ_４Ｃｌ、Ｎａ_２ＳＯ_４、Ｋ_２ＳＯ_４、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、またはそれらの組み合わせであり得る。特定の実施形態では、塩はＮａＣｌである。特定の実施形態では、洗浄ステップは室温で行われる。特定の実施形態では、溶出ステップ（複数可）は、１８℃未満（例えば、上述のように１℃～１２℃の間、または２℃～８℃の間）で行われる。

【0214】

特定の実施形態では、第１および第３の洗浄バッファーは、約９０～約１１０ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．０５～約０．２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができ、ｐＨは約５．５～約６．５であり得る。特定の実施形態では、第２および第４の洗浄バッファーは、約４０～約６０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１００～約１５０ｍＭの塩を含むことができ、ｐＨは約８．０～約９．０であり得る。特定の実施形態では、第１の溶出バッファーは、約４０～約６０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１００～約１５０ｍＭの塩を含むことができ、ｐＨは約８．０～約９．０であり得る。特定の実施形態では、塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２、ＣａＣｌ_２、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、酢酸ナトリウム（Ｃ_２Ｈ_３ＮａＯ_２）、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、ＮＨ_４Ｃｌ、Ｎａ_２ＳＯ_４、Ｋ_２ＳＯ_４、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、またはそれらの組み合わせであり得る。特定の実施形態では、塩はＮａＣｌである。特定の実施形態では、洗浄ステップは室温で行われる。特定の実施形態では、溶出ステップ（複数可）は、１８℃未満（例えば、上述のように１℃～１２℃の間、または２℃～８℃の間）で行われる。

【0215】

特定の実施形態では、第１および第３の洗浄バッファーは、約１００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができ、ｐＨは約６．０であり得る。特定の実施形態では、第２および第４の洗浄バッファーは、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１２５ｍＭの塩を含むことができ、ｐＨは約８．５であり得る。特定の実施形態では、第１の溶出バッファーは、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１２５ｍＭの塩を含むことができ、ｐＨは約８．５であり得る。特定の実施形態では、塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２、ＣａＣｌ_２、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、酢酸ナトリウム（Ｃ_２Ｈ_３ＮａＯ_２）、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、ＮＨ_４Ｃｌ、Ｎａ_２ＳＯ_４、Ｋ_２ＳＯ_４、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、またはそれらの組み合わせであり得る。特定の実施形態では、塩はＮａＣｌである。特定の実施形態では、洗浄ステップは室温で行われる。特定の実施形態では、溶出ステップ（複数可）は、１８℃未満（例えば、上述のように１℃～１２℃の間、または２℃～８℃の間）で行われる。

【0216】

洗浄および／または溶出バッファーの追加例は国際公開第２０１９１３３６７７号に記載されており、すべての意図された目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。

【0217】

樹脂
いくつかの実施形態では、アフィニティ樹脂はＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶｘである。

【0218】

いくつかの実施形態では、ＡＡＶはＡＡＶ８であり、アフィニティ樹脂はＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶ８である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶはＡＡＶ９であり、アフィニティ樹脂はＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶ９である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶはＡＡＶ９であり、アフィニティ樹脂はＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶｘである。

【0219】

いくつかの実施形態では、ＡＡＶはＡＡＶ８であり、アフィニティ樹脂はＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶ８であり、溶出バッファーは酸性でありかつエチレングリコールを含まない。いくつかの実施形態では、ＡＡＶはＡＡＶ９であり、アフィニティ樹脂はＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶ９であり、溶出バッファーは酸性でありかつエチレングリコールを含まない。いくつかの実施形態では、ＡＡＶはＡＡＶ９であり、アフィニティ樹脂はＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶｘであり、溶出バッファーは酸性でありかつエチレングリコールを含まない。

【0220】

いくつかの実施形態では、ＡＡＶはＡＡＶ８であり、アフィニティ樹脂は、クロマトグラフィーマトリックスに固定化されたＡＤＫ８またはＡＤＫ８／９のタイプからの固定化されたＡＡＶ８に対するモノクローナル抗体からなるイムノアフィニティ樹脂である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶはＡＡＶ９であり、アフィニティ樹脂は、クロマトグラフィーマトリックスに固定化されたＡＤＫ９またはＡＤＫ８／９のタイプからの固定化されたＡＡＶ９に対するモノクローナル抗体からなるイムノアフィニティ樹脂である。

【0221】

ｒＡＡＶ粒子の供給源
本開示の方法に関して、ＡＡＶは任意のＡＡＶ血清型のものであり得る。特定の実施形態では、本明細書に記載の方法によって精製されるＡＡＶは、ＡＡＶ１血清型、ＡＡＶ２血清型、ＡＡＶ３血清型、ＡＡＶ４血清型、ＡＡＶ５血清型、ＡＡＶ６血清型、ＡＡＶ７血清型、ＡＡＶ８血清型、ＡＡＶ９血清型、ＡＡＶ１０血清型、ＡＡＶ１１血清型、ＡＡＶ１２血清型、ＡＡＶ１３血清型、ＡＡＡＶ血清型、ＢＡＡＶ血清型、ＡＡＶ（ＶＲ－１９５）血清型、およびＡＡＶ（ＶＲ－３５５）血清型、またはキメラＡＡＶベクターのものである。特定の実施形態では、ＡＡＶは野生型である。

【0222】

特定の実施形態では、ＡＡＶは、ＡＡＶ５血清型である。特定の実施形態では、ＡＡＶは、ＡＡＶ９血清型である。特定の実施形態では、ＡＡＶは、遺伝子工学によって改変されており、および／または化学修飾されている。特定の実施形態では、ＡＡＶは、改変されたカプシド、例えば、遺伝子工学的に改変されたＡＡＶカプシドまたは化学修飾されたＡＡＶカプシドを含む。特定の実施形態では、ＡＡＶベクターは、配列番号１の配列を含むＶＰ１を含む。特定の実施形態では、ＡＡＶベクターは、配列番号２の配列を含むＶＰ２を含む。特定の実施形態では、ＡＡＶベクターは、配列番号３の配列を含むＶＰ３を含む。

【0223】

一部の実施形態では、ＡＡＶは、遺伝子工学的に改変されており、および／または化学修飾されている。特定の実施形態では、ＡＡＶは、遺伝子改変および／または化学修飾されている。特定の実施形態では、ＡＡＶは遺伝子改変されている。特定の実施形態では、ＡＡＶは化学修飾されている。

【0224】

特定の実施形態では、ＡＡＶは、遺伝子治療適用のために、受容体利用、抗原性、導入効率および／または組織向性（tropism）が変更されたＡＡＶベクターを作製するように遺伝子改変されている。特定の実施形態では、ＡＡＶは、ペプチドリガンド、抗体、抗体フラグメント、ＭＨＣ、および／または受容体をウイルスカプシドに挿入するように遺伝子改変されてもよい。特定の実施形態では、ＡＡＶは、ウイルスカプシドを標識するためのペプチドを挿入するように遺伝子改変されてもよい。可能な改変の非限定的な例は、Buning H., Bolyard C.M., Hallek M., Bartlett J.S. (2012) Modification and Labeling of AAV Vector Particles. In: Snyder R., Moullier P. (eds) Adeno-Associated Virus. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols), vol 807. Humana Pressに記載されており、すべての目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。

【0225】

ある実施形態では、ＡＡＶはＡＡＶベクターの組織向性を変化させるように化学修飾されている。例えば、特定のアミノ酸側鎖を標的とすることができる化学選択的反応を利用して、ＡＡＶカプシド上の受容体結合ドメイン内の電荷、極性、疎水性および水素結合ポテンシャルを変化させることができる。ＡＡＶカプシド表面上の特定の受容体メイクアップを変更するこのような能力は、組織向性が変更された合成ベクターの作製を可能にする。特定の実施形態では、化学修飾されたＡＡＶベクターは、化学修飾されたＡＡＶベクターの変更された受容体利用（receptor usage）、抗原性、導入効率および／または組織向性のを示すことができる。可能な修飾の非限定的な例は、Buning H., Bolyard C.M., Hallek M., Bartlett J.S. (2012) Modification and Labeling of AAV Vector Particles. In: Snyder R., Moullier P. (eds) Adeno-Associated Virus. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols), vol 807. Humana Pressに記載されており、すべての目的のために、その全体が本明細書に組み込まれる。

【0226】

特定の実施形態では、ＡＡＶ画分は、トランスフェクトされた宿主細胞によって産生されたＡＡＶ画分を表す。特定の実施形態では、ＡＡＶ画分は、トリプルプラスミドシステムでトランスフェクトされた宿主細胞を含む細胞培養物から収穫（ハーベスト）された上清を表し、このシステムの１つのプラスミドは目的の遺伝子またはｃＤＮＡを含み、１つのプラスミドはカプシドタンパク質ＶＰ１、カプシドタンパク質ＶＰ２および／またはカプシドタンパク質ＶＰ３をコードする。特定の実施形態では、ＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３は、ＡＡＶ８ ＶＰ１、ＡＡＶ８ ＶＰ２、および／またはＡＡＶ８ ＶＰ３である。特定の実施形態では、ＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３は、ＡＡＶ９ ＶＰ１、ＡＡＶ９ ＶＰ２、および／またはＡＡＶ９ ＶＰ３である。ｒＡＡＶ製造の目的のためのトリプルプラスミドトランスフェクションは、当技術分野で知られている。例えば、Qu et al., 2015, supra, and Mizukami et al., "A Protocol for AAV vector production and purification." PhD dissertation, Division of Genetic Therapeutics, Center for Molecular Medicine, 1998; and Kotin et al., Hum Mol Genet 20(R1): R2-R6 (2011)に記載されている。特定の実施形態では、トランスフェクションは、無機化合物（例えばリン酸カルシウム）、または有機化合物、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いて、あるいは非化学的手段、例えばエレクトロポレーションを用いて実施することができる。特定の実施形態では、宿主細胞は付着性細胞である。特定の実施形態では、宿主細胞は浮遊細胞である。特定の実施形態では、宿主細胞は、ＨＥＫ２９３細胞またはＳｆ９細胞である。特定の実施形態では、細胞培養は、血清およびタンパク質を含まない培養液を含む。特定の実施形態では、培地は、化学的に定義されており、動物由来の成分（例えば、加水分解物）を含まない。特定の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子を含む画分は、トリプルプラスミドシステムでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を含む画分を表す。特定の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子を含む画分は、米国仮出願第６２／４１７，７７５号および国際公開第２０１８１２８６８８号に記載されており、それらは、すべての意図された目的のために参照により本明細書に組み込まれる。

【0227】

宿主細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）を培養してＡＡＶ粒子（例えば、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９など）を生成し、清澄な無細胞培養上清を濃縮および／またはろ過した後、ウイルス粒子をアフィニティーマトリックスにロードする。特定の実施形態では、ウイルス粒子は、約７．４～約７．８の範囲のｐＨを有する溶液中でロードされる。特定の実施形態では、ウイルス粒子は、約８．３～約８．７の範囲のｐＨを有する溶液中でロードされる。特定の実施形態では、ウイルス粒子は、約８．５のｐＨを有する溶液中でロードされる。特定の実施形態では、ｐＨは８．３～８．７であり、溶液はＮａＣｌおよびＴｒｉｓＨＣｌを含む。特定の実施形態では、ウイルス粒子は、約２０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１５０ｍＭのＮａＣｌを含み、約８．５のｐＨを有する溶液中でロードされる。

【0228】

追加のステップおよび考慮事項
本開示の方法は、本明細書に記載されたステップの任意の組み合わせを含み、任意選択で１つまたは複数の追加のステップと組み合わせてもよい。したがって、例示的な態様では、本開示の方法は、本明細書に記載のトリプルプラスミドシステムで宿主細胞をトランスフェクションするステップをさらに含む。例示的な態様では、本開示の方法は、トリプルプラスミドシステムでトランスフェクトされた宿主細胞、例えばＨＥＫ２９３細胞を含む細胞培養物から上清を収穫することを含む。例示的な態様では、トランスフェクションおよび収穫（ハーベスト）ステップは、本明細書に記載の超遠心分離ステップの前に行われる。

【0229】

本開示の方法は、さらに他の追加のステップを含んでいてもよく、これらのステップは、ＡＡＶの純度をさらに高め、他の不要な成分を除去し、および／または画分を濃縮し、および／または後続のステップのために画分を調整することができる。

【0230】

特定の実施形態では、上記の洗浄ステップの前に、任意選択の再平衡化ステップが行われる

【0231】

特定の実施形態では、宿主細胞産生からのＡＡＶ含有溶液をアフィニティ精製する前に、複雑な酸性タンパク質構造および宿主細胞ＤＮＡの１つまたは複数を除去するために、予備精製（pre-purification）を行うことができる。予備精製は、フロースルーモードの陰イオン交換によって行われ得る。予備精製ステップは、本明細書に記載されるアフィニティ精製方法のいずれかの前に行われ得る。このようなＡＡＶ含有溶液の予備精製によって、以下の１つまたは複数が除去され得る：ヒストン（例えば、ヒストンＨ２Ａタイプ１、ヒストンＨ２Ｂタイプ１－Ｂ、ヒストンＨ４、ヒストンＨ１．４）、６０Ｓリボソームタンパク質（例えば、６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ２７、６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ６、および６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ３０）、細胞質アクチン（例えば、細胞質アクチン１）、チューブリン（例えば、チューブリンβ－２Ａ鎖）、ヘテロ核リボヌクレオタンパク質Ｃ、Ｒｅｐ６８タンパク質、ＨＥＫ２９３ラミニン受容体３７ｋＤａ形態（ＬａｍＲ ３７ｋＤａ）、ＡＴＰ依存性分子シャペロンＨＳＣ８２。

【0232】

特定の実施形態では、追加のステップは超遠心分離ステップであり得る。

【0233】

例示的な態様において、本方法は、デプスろ過（depth filtration）ステップを含む。例示的な態様において、本方法は、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞の培養上清の画分を、セルロースおよびパーライトを含みかつ約５００Ｌ／ｍ^２の最小透過率を有するフィルターを用いてデプスろ過にかけることを含む。例示的な態様では、本方法は、約０．２μｍの最小孔径を有するフィルターを使用することをさらに含む。例示的な態様では、デプスろ過に続いて、約０．２μｍの最小孔径を有するフィルターを通したろ過が行われる。例示的な態様では、デプスフィルターと最小孔径が約０．２μｍのフィルターの一方または両方を洗浄し、その洗浄液を回収する。例示的な態様では、洗浄液を一緒にプールし、デプスフィルターおよび最小孔径が約０．２μｍのフィルターでのろ過で得られたろ液と合わせる。

【0234】

いくつかの実施形態では、本方法は、ＡＡＶ含有溶液をアフィニティ樹脂にロードする前に、ＡＡＶ含有溶液を陰イオン交換体と接触させ、そして陰イオン交換体からＡＡＶ含有溶液を溶出させることをさらに含む。陰イオン交換体は、フロースルーモードで操作され得る。

【0235】

例示的な態様において、本開示の方法は、１つまたは複数のクロマトグラフィーステップを含む。例示的な態様において、本方法は、不要な成分がクロマトグラフィー樹脂に結合し、所望のＡＡＶがクロマトグラフィー樹脂に結合しない、ネガティブクロマトグラフィーステップを含む。例示的な態様では、方法は、ネガティブ陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィーステップ、または「非結合モード」でのＡＥＸクロマトグラフィーステップを含む。「非結合モード」の利点として、手順を実行するのが比較的容易であること、およびその後のアッセイを行うのが容易であることが挙げられる。

【0236】

したがって、例示的な実施形態では、ＡＡＶ粒子を精製する方法は、ＡＡＶがＡＥＸクロマトグラフィーカラムまたはメンブレン（膜）をフロースルー（通過）できる条件下で、ＡＥＸクロマトグラフィーカラムまたはメンブレンに画分をアプライし、ＡＡＶ粒子を回収することにより、ＡＡＶ粒子を含む画分に対してネガティブ陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィーを行うことを含む。例示的な態様では、画分は、約１００ｍＭ～約１５０ｍＭの塩（例えばＮａＣｌ）を含むローディングバッファーを用いて、ＡＥＸクロマトグラフィーカラムまたはメンブレンにアプライされされ、任意選択で、ローディングバッファーのｐＨは約８～約９である。例示的な態様では、ローディングバッファーは、約１１５ｍＭ～約１３０ｍＭの塩、例えばＮａＣｌを含み、任意選択で、ローディングバッファーは、約１２０ｍＭ～約１２５ｍＭの塩、例えばＮａＣｌを含む。例示的な態様では、ネガティブＡＥＸステップは、本明細書に記載されている超遠心分離ステップの前に行われる。

【0237】

例示的な態様において、本開示の方法は、限外ろ過／透析ろ過システムを用いてＡＡＶ画分を濃縮することを含む。例示的な態様において、本開示の方法は、１つまたは複数のタンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）ステップを含む。例示的な態様において、ＡＡＶ画分は、限外ろ過／透析ろ過を受ける。例示的な態様において、ＡＡＶ画分は、ネガティブＡＥＸクロマトグラフィーを行うことを含むステップの前、ネガティブＡＥＸクロマトグラフィーを行うことを含むステップの後、またはネガティブＡＥＸクロマトグラフィーを行うことを含むステップの前後に、限外ろ過／透析ろ過を用いて濃縮される。例示的な態様では、ＴＦＦステップは、本明細書に記載の超遠心分離ステップの前に行われる。

【0238】

エンベロープウイルスの不活性化は、例えば、Ｂａｃｕｌｏトランスフェクションシステムが使用される場合に、特に重要となり得る。例示的な態様において、本開示の方法は、ｒＡＡＶ粒子を含む画分をろ過して、画分中のｒＡＡＶ粒子よりも大きいサイズのウイルスを除去することを含む。

【0239】

理論に拘束されることを望まないが、エチレングリコール単独で、または別の添加剤と組み合わせて、このような脂質エンベロープウイルスを不活性化することができる。例示的な添加剤には、非イオン性デタージェント、脂肪族薬剤（例えば、ＴｎＢＰ）、およびデタージェント（例えば、ポリソルベート（例えば、Ｔｗｅｅｎ）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００、ＴｎＢＰ）が含まれる。例えば、溶媒－デタージェント混合物は、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００、０．３％のトリ－ｎ－ブチルホスフェート（またはリン酸トリブチル）、および０．３％のＴＷＥＥＮ（登録商標）８０を含むことができる。

【0240】

以下の表１にまとめたように、脂質エンベロープウイルスの「カラム上」での不活性化を、様々なアフィニティークロマトグラフィの実施で試験することができる。

【表1】

【0241】

ＤＭＳＯ含有バッファーＷａｓｈ Ｘバッファーは、中性に近いｐＨ（例えばｐＨ８．０）で、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＡＡＶ８樹脂において、ＡＡＶ９の溶出を誘発するのに有効であり得るが、ＡＡＶ８の溶出についてはそうではなく、これは意外な結果であった。ＤＭＳＯ含有バッファーＷａｓｈ Ｘバッファーは、中性に近いｐＨ（例えばｐＨ８．０）で、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＡＡＶｘ樹脂において、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＡＶ、ＢＡＡＶ、ＡＡＶ（ＶＲ－１９５）、およびＡＡＶ（ＶＲ－３５５）を含むがこれらに限定されない様々なＡＡＶの溶出を誘発するのに有効であり得、これは驚くべき結果であった。特定の実施形態では、ＡＡＶはＡＡＶ５血清型のものである。特定の実施形態では、ＡＡＶは、ＡＡＶ６血清型のものである。特定の実施形態では、ＡＡＶはＡＡＶ８血清型のものである。特定の実施形態では、ＡＡＶはＡＡＶ９血清型のものである。

【0242】

理論に縛られるつもりはないが、Ｗａｓｈ Ｘバッファーは、カラムを洗浄するおよび／または脂質エンベロープウイルスを不活性化または崩壊させる活性を有することが期待される。Ｗａｓｈ ＸバッファーがＡＡＶ９とＡＡＶ８を差別的に溶出させることは全く予測されなかった。

【0243】

例示的な態様では、本開示の方法は、１つまたは複数の品質管理ステップ、例えば、プロセスの１つまたは複数のステップの後（例えば、各ステップの後）に、得られたＡＡＶ画分の効力または比活性を測定するステップを含む。例示的な態様において、本開示の方法は、ＡＡＶに特異的なＥＬＩＳＡを含む。例示的な態様において、ＥＬＩＳＡは、サンドイッチＥＬＩＳＡである。例示的な態様において、サンドイッチＥＬＩＳＡは、ＡＡＶエピトープに特異的な抗体を含む。例示的な態様では、ＡＡＶエピトープは、会合した（assembled）ＡＡＶカプシド上に存在するコンフォメーションエピトープである。本明細書で述べたように、ＥＬＩＳＡは、ＡＡＶ画分の効力を決定する方法として、ｑＰＣＲに置き換わることができる。例示的な態様において、本開示の方法は、ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡを介してＡＡＶ画分を検査することを含み、本方法は、定量的ＰＣＲを介して効力を測定する方法を含まない。例示的な態様では、ＡＡＶ画分中のカプシドの大部分が完全カプシドであることから、ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡは、ＡＡＶ画分の効力に関する代表的な読み出しを提供するのに十分である。

【0244】

例示的な態様では、本開示の方法は、本開示のステップの１つまたは複数の後に、ＡＡＶに特異的なＥＬＩＳＡを行うことを含む。例示的な態様において、本開示の方法は、デプスろ過後に得られたＡＡＶ画分を、ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡを介して検査して、その画分中のＡＡＶの比活性（specific activity）を決定することを含む。例示的な態様において、本開示の方法は、限外ろ過／透析ろ過システムを用いてＡＡＶ画分を濃縮した後に得られたＡＡＶ画分を、ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡを介して検査し、その画分中のＡＡＶの比活性を決定することを含む。例示的な態様において、本開示の方法は、タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）ステップの後に得られたＡＡＶ画分を、ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡを介して検査して、その画分中のＡＡＶの比活性を決定することを含む。例示的な態様において、本開示の方法は、ネガティブ陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィーの後に得られたＡＡＶ画分を、ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡを介して検査して、その画分中のＡＡＶの比活性を決定することを含む。例示的な態様において、本開示の方法は、ポリッシングステップの後に得られたＡＡＶ画分を、ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡを介して検査して、その画分中のＡＡＶの比活性を決定することを含む。

【0245】

いくつかの実施形態では、本方法は、ＡＡＶ含有溶液を、ＡＡＶ含有溶液から酸性の荷電汚染物質を除去するのに有効な正荷電基を含むフィルターと接触させることをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、３５ｎｍより大きいウイルスを除去するためにＡＡＶ画分をナノろ過することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、陽イオン交換クロマトグラフィーを行うことを含むポリッシングステップをさらに含む。カチオン交換クロマトグラフィーで使用するための例示的な媒体には、Ｃａｐｔｏ（商標）Ｓ、Ｅｓｈｍｕｎｏ（登録商標）Ｓ、およびＦｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＳＯ３が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本方法は、ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡ、例えばＡＡＶ８に特異的なもの、またはＡＡＶ９に特異的なものを介して、ＡＡＶ画分を検査することをさらに含む。ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡは、ＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９に特異的なサンドイッチＥＬＩＳＡであり得る。

【0246】

ＡＡＶ生成物
別の態様では、本明細書に記載の任意の方法によって製造されたＡＡＶ生成物が提供される。

【0247】

本開示の方法によって製造されたＡＡＶ生成物が本明細書でさらに提供される。例示的な態様では、ＡＡＶ生成物は、約１０００Ｌの出発材料（例えば、細胞培養物）から製造された少なくとも約１０^１２個のウイルス粒子（ｖｐ）、または約１０００Ｌの出発材料（例えば、細胞培養物）から製造された少なくとも約１０^１３個のウイルス粒子（ｖｐ）を含む。例示的な態様では、ＡＡＶ生成物は、導入遺伝子プラスミドを含まないｒｅｐ－ｃａｐおよびＡｄヘルパープラスミドをトランスフェクトすることによって製造された空のカプシドである。精製された空のプラスミドは、患者の血液からＡＡＶ抗原に特異的な抗体を枯渇または除去するために使用することができる。

【0248】

例示的な態様では、本開示のＡＡＶ生成物は、高純度で、高効力であり、ヒトでの臨床使用に適している。例示的な態様では、ＡＡＶ生成物は、均質な集団でかつ高純度のＡＡＶ粒子を含む。例示的な態様において、ＡＡＶ生成物は完全長のベクターＤＮＡを含む。例示的な実施形態では、ＡＡＶ生成物は、不要な汚染物質を実質的に含まず、そのような汚染物質には、切断されたまたは不完全なベクターＤＮＡを含むＡＡＶ粒子、不完全なタンパク質組成およびオリゴマー化された構造を有するＡＡＶ粒子、または汚染ウイルス、例えば、非ＡＡＶウイルス、脂質エンベロープウイルスが含まれるが、これらに限定されない。例示的な実施形態では、ＡＡＶ生成物は、目的タンパク質のコードｃＤＮＡを大量に含む。例示的な態様では、本開示のＡＡＶ生成物は、ヒトへの投与に適している。例示的な態様において、ＡＡＶ生成物は無菌であり、および／またはＧＭＰ（Ｇｏｏｄ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）グレードである。例示的な態様において、ＡＡＶ製剤は、遺伝子治療用医薬品に関する米国薬局方第１０４６章または欧州薬局方に定められた要件に適合するか、または米国食品医薬品局（ＵＳＦＤＡ）もしくは欧州医薬品庁（ＥＭＡ）によって義務付けられた要件に適合する。例示的な態様では、ＡＡＶ生成物は、処理や取り扱いをほとんどまたは全くしないでヒトに直接投与するためのすぐに使用できる（ready-to-use）生成物である。

【0249】

本発明の方法に関して、ＡＡＶ画分は、例示的な態様では濃縮ＡＡＶ画分である。特定の実施形態では、ＡＡＶ画分は、１ｍＬあたり少なくとも１×１０^１０、１×１０^１１または１×１０^１２個のＡＡＶカプシドを含む。特定の実施形態では、ＡＡＶ画分は、１ｍＬあたり少なくとも１×１０^１２個のＡＡＶカプシドを含む。ＡＡＶカプシドは、空のＡＡＶカプシドおよび完全ＡＡＶカプシドを含み得る。特定の実施形態では、ＡＡＶ画分は、空のＡＡＶおよび／または過搭載のＡＡＶカプシドよりも多くの完全ＡＡＶカプシドを含む。

【0250】

特定の実施形態では、溶出ステップから溶出されるＡＡＶカプシドの少なくとも約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が完全ＡＡＶカプシドである。

【0251】

特定の実施形態では、本明細書に記載のＡＡＶの製造および精製方法は、同じ洗浄プロトコルおよび低温での溶出を行わない比較手順で得られるものよりも、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％多い完全カプシドを含む製品をもたらす。特定の実施形態では、本明細書に記載のＡＡＶの製造および精製方法は、同じ洗浄プロトコルおよび低温での溶出を行わない比較手順で得られるものよりも、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％多い完全カプシドを含む製品をもたらす。特定の実施形態では、本明細書に記載のＡＡＶの製造および精製方法は、同じ洗浄プロトコルおよび低温での溶出を行わない比較手順によって得られるものよりも、少なくとも約６％多い完全カプシドを含む製品をもたらす。特定の実施形態では、本明細書に記載のＡＡＶの製造および精製方法は、同じ洗浄プロトコルおよび低温での溶出を行わない比較手順によって得られるものよりも、少なくとも約１０％多い完全カプシドを含む製品をもたらす。特定の実施形態では、本明細書に記載のＡＡＶの製造および精製方法は、同じ洗浄プロトコルおよび低温での溶出を行わない比較手順によって得られるものよりも、少なくとも約２０％多い完全カプシドを含む製品をもたらす。特定の実施形態では、本明細書に記載のＡＡＶの製造および精製方法は、同じ洗浄プロトコルおよび低温での溶出を行わない比較手順によって得られるものよりも、約６％多い完全カプシドを含む製品をもたらす。特定の実施形態では、本明細書に記載のＡＡＶを製造および精製する方法は、同じ洗浄プロトコルおよび低温での溶出を行わない比較手順によって得られるものよりも、約１０％多い完全カプシドを含む製品をもたらす。特定の実施形態では、本明細書に記載のＡＡＶを製造および精製する方法は、同じ洗浄プロトコルおよび低温での溶出を行わない比較手順によって得られるものよりも、約１６％多い完全カプシドを含む製品をもたらす。特定の実施形態では、本明細書に記載のＡＡＶの製造および精製方法は、同じ洗浄プロトコルおよび低温での溶出を行わない比較手順によって得られるものよりも約２０％多い完全カプシドを含む製品をもたらす。

【0252】

様々な実施形態において、本明細書に記載された精製ステップの後で、重量／体積としてＩＴＲ－ｑＰＣＲアッセイによって測定されたＡＡＶ、例えばＡＡＶ９の収率は、洗浄ステップを行わない比較手順によって得られるものよりも、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％高い。

【0253】

様々な実施形態において、本明細書に記載された精製ステップの後で、重量／重量としてＩＴＲ－ｑＰＣＲアッセイによって測定されたＡＡＶ、例えばＡＡＶ９の収率は、洗浄ステップを行わない比較手順によって得られるものよりも、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％高い。

【0254】

有利には、本方法は、大量の出発材料（例えば、細胞培養物）に拡大可能である。特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、少なくともまたは約５００Ｌ、少なくともまたは約６００Ｌ、少なくともまたは約７００Ｌ、少なくともまたは約８００Ｌ、少なくともまたは約９００Ｌ、あるいは少なくともまたは約１０００Ｌの体積からＡＡＶを精製することができる大規模な方法である。特定の実施形態では、本方法は、少なくともまたは約１２５０Ｌ、少なくともまたは約１５００Ｌ、少なくともまたは約２０００Ｌ、少なくとも約２５００Ｌ、少なくとも約３０００Ｌ、少なくとも約４０００Ｌ、少なくとも約５０００Ｌ、少なくとも約６０００Ｌ、少なくとも約７０００Ｌ、少なくとも約８０００Ｌ、少なくとも約９０００Ｌ、少なくとも約１００００Ｌ、あるいはそれ以上の出発材料（例えば、細胞培養物）の最小体積まで拡大可能である。例えば、本方法は、約１０００Ｌ、または約１０，０００Ｌ、または２５，０００Ｌまたはそれ以上の、ＡＡＶを生成する細胞培養物の最小体積で実施される。

【0255】

本明細書に記載のＡＡＶの製造および精製方法は、高タイターのＡＡＶ生成物をもたらすことからも有利である。特定の実施形態では、少なくとも約１０^１０のウイルス粒子（ｖｐ）を含むＡＡＶ生成物が、約１０００Ｌの出発材料（例えば、細胞培養物）から製造される。特定の実施形態では、少なくとも約１０^１１のウイルス粒子（ｖｐ）を含むＡＡＶ生成物が、約１０００Ｌの出発材料（例えば、細胞培養物）から製造される。特定の実施形態では、少なくとも約１０^１２のウイルス粒子（ｖｐ）を含むＡＡＶ生成物が、約１０００Ｌの出発材料（例えば、細胞培養物）から製造される。特定の実施形態では、少なくとも約１０^１３のウイルス粒子（ｖｐ）を含むＡＡＶ生成物が、約１０００Ｌの出発材料（例えば、細胞培養物）から製造される。特定の実施形態では、少なくとも約１０^１４のウイルス粒子（ｖｐ）を含むＡＡＶ生成物が、約１０００Ｌの出発材料（例えば、細胞培養物）から製造される。特定の実施形態では、少なくとも約１０^１５のウイルス粒子（ｖｐ）を含むＡＡＶ生成物が、約１０００Ｌの出発材料（例えば、細胞培養物）から製造される。特定の実施形態では、少なくとも約１０^１６のウイルス粒子（ｖｐ）を含むＡＡＶ生成物が、約１０００Ｌの出発材料（例えば、細胞培養物）から製造される。特定の実施形態では、少なくとも約１０^１７のウイルス粒子（ｖｐ）を含むＡＡＶ生成物が、約１０００Ｌの出発材料（例えば、細胞培養物）から製造される。特定の実施形態では、少なくとも約２×１０^１６のウイルス粒子（ｖｐ）を含むＡＡＶ生成物が、約１０００Ｌの出発材料（例えば、細胞培養物）から製造される。特定の実施形態では、少なくとも約５×１０^１７のウイルス粒子（ｖｐ）を含むＡＡＶ生成物が、約１０００Ｌの出発材料（例えば、細胞培養物）から製造される。

【0256】

本明細書に記載の方法の別の利点は、その方法によって高純度のＡＡＶ生成物が得られることである。特定の実施形態では、本開示の方法によって製造されるＡＡＶ生成物は、以下の１つまたは複数の汚染物質を実質的に含まない：宿主細胞タンパク質、宿主細胞核酸（例えば、遊離の宿主細胞ＤＮＡおよび遊離のプラスミドＤＮＡ）、プラスミドＤＮＡ、空のウイルスカプシド、熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、プロテアソーム、汚染非ＡＡＶウイルス（例えば、脂質エンベロープウイルス）、宿主細胞培養成分（例えば、抗生物質）、マイコプラズマ、パイロジェン、細菌性エンドトキシン、細胞破片（例えば、膜脂質、タンパク質および他の生物学的高分子から構成される破片）、ならびに外来性汚染物質（adventitious agent）。ＡＡＶが本明細書に記載のＡＡＶを製造および精製する方法に従って精製される際に、以下の不純物の１つまたは複数あるいは全てが検出不可能であり得る：ヒストンＨ２Ａタイプ１、ヒストンＨ２Ｂタイプ１－Ｂ、ヒストンＨ４、熱ショック７０ｋＤａタンパク質１Ａ、ピルビン酸キナーゼＰＫＭ、伸長因子２、ＡＴＰ－クエン酸シンターゼ、ヒストンＨ１．４、免疫グロブリン重鎖定常ガンマ１（酸性溶出方法からの固定化リガンド）、６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ２７、フルクトース－ビスホスフェートアルドラーゼＡ、熱ショック同族７１ｋＤａタンパク質、細胞質アクチン１、Ｓ－ホルミルグルタチオンヒドロラーゼ、アスパラギンシンテターゼ（グルタミン加水分解）、Ｌ－乳酸デヒドロゲナーゼＢ鎖、チューブリンベータ－２Ａ鎖、Ｘ染色体ＲＮＡ結合モチーフタンパク質、６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ６、細胞質スレオニンｔＲＮＡリガーゼ、免疫グロブリンカッパ定常、６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ３０、ＷＤリピート含有タンパク質１、アデノシルホモシステイナーゼ、ヘテロ核リボヌクレオタンパク質Ｃ、タンパク質Ｒｅｐ６８、チメット（ｔｈｉｍｅｔ）オリゴペプチダーゼ、Ｄ－３－ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ、ＡＴＰ依存性分子シャペロンＨＳＣ８２。また、本明細書に記載の陰イオンＡＡＶを製造および精製する方法にしたがい、洗浄ステップの前に陰イオン交換ステップを加えることで、以下のものを検出できなくすることができる：ヒストンＨ１．４、６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ２７、細胞質アクチン１、チューブリンβ－２Ａ鎖、６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ６、６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ３０、ヘテロ核リボヌクレオタンパク質Ｃ、タンパク質Ｒｅｐ６８、およびＡＴＰ依存性分子シャペロンＨＳＣ８２。

【0257】

例示的な実施形態では、本開示の方法は、出発材料（例えば、細胞培養物）に見られる汚染物質の少なくともまたは約５０％が除去された精製ＡＡＶ生成物を提供する。例示的な実施形態では、本開示の方法は、出発材料（例えば、細胞培養物）中に見られる汚染物質の少なくともまたは約６０％が除去された精製ＡＡＶ生成物を提供する。例示的な実施形態では、本開示の方法は、出発材料（例えば、細胞培養物）中に見られる汚染物質の少なくともまたは約７０％が除去された精製ＡＡＶ生成物を提供する。例示的な実施形態では、本開示の方法は、出発材料（例えば、細胞培養物）中に見られる汚染物質の少なくともまたは約８０％が除去された精製ＡＡＶ生成物を提供する。例示的な実施形態では、本開示の方法は、出発材料（例えば、細胞培養物）中に見られる汚染物質の少なくともまたは約９０％が除去された精製ＡＡＶ生成物を提供する。

【0258】

特定の実施形態において、本明細書に記載のＡＡＶの製造および精製方法は、同じ洗浄プロトコルを使用しない比較手順で得られるものよりも、約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６．０％、９６．１％、９６．２％、９６．３％、９６．４％、９６．５％、９６．６％、９６．７％、９６．８％、９６．９％、９７．０％、９７．１％、９７．２％、９７．３％、９７．４％、９７．５％、９７．６％、９７．７％、９７．８％、９７．９％、９８．０％、９８．１％、９８．２％、９８．３％、９８．４％、９８．５％、９８．６％、９８．７％、９８．８％、９８．９％、９９％、９９．１％、９９．２％多く、タンパク質不純物（例えば、宿主細胞（ＨＣ）不純物）を含む不純物の数を減少させる。いくつかの実施形態では、溶出ステップから得られたＡＡＶは、≦９９．９％の不純物レベルを有する。いくつかの実施形態では、溶出ステップから得られたＡＡＶは、≦９９．０％の不純物レベルを有する。

【0259】

特定の実施形態では、本明細書に記載のＡＡＶの製造および精製方法は、少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６．０％、９６．１％、９６．２％、９６．３％、９６．４％、９６．５％、９６．６％、９６．７％、９６．８％、９６．９％、９７．０％、９７．１％、９７．２％、９７．３％、９７．４％、９７．５％、９７．６％、９７．７％、９７．８％、９７．９％、９８．０％、９８．１％、９８．２％、９８．３％、９８．４％、９８．５％、９８．６％、９８．７％、９８．８％、９８．９％、９９％、９９．１％、９９．２％の純度の製品をもたらす。いくつかの実施形態では、溶出ステップから得られたＡＡＶは、９９．９％以上の純度レベルを有する。いくつかの実施形態では、溶出ステップから得られたＡＡＶは、９９．０％以上の純度レベルを有する。

【0260】

特定の実施形態では、本明細書に記載のＡＡＶの製造および精製方法は、同じ洗浄プロトコルおよび低温での溶出を行わない比較手順で得られるものよりも、少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６．０％、９６．１％、９６．２％、９６．３％、９６．４％、９６．５％、９６．６％、９６．７％、９６．８％、９６．９％、９７．０％、９７．１％、９７．２％、９７．３％、９７．４％、９７．５％、９７．６％、９７．７％、９７．８％、９７．９％、９８．０％、９８．１％、９８．２％、９８．３％、９８．４％、９８．５％、９８．６％、９８．７％、９８．８％、９８．９％、９９％、９９．１％、９９．２％純度が高い。いくつかの実施形態では、溶出ステップから得られたＡＡＶは、同じ洗浄プロトコルおよび低温での溶出を行わない比較手順によって得られるものよりも、９９．９％以上高い純度レベルを有する。いくつかの実施形態では、溶出ステップから得られたＡＡＶは、同じ洗浄プロトコルおよび低温での溶出を行わない比較手順によって得られたものよりも、９９．０％以上高い純度レベルを有する。

【0261】

特定の実施形態では、本開示の方法により製造されたＡＡＶ生成物は、ヒトへの投与に適している。特定の実施形態では、ＡＡＶは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）である。特定の実施形態では、本開示の方法により製造されたＡＡＶ生成物は、無菌および／またはＧＭＰ（Ｇｏｏｄ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）グレードのものである。特定の実施形態では、本開示の方法により製造されたＡＡＶ生成物は、遺伝子治療用医薬品に関する米国薬局方第１０４６章もしくは欧州薬局方に定められた要件、または米国食品医薬品局（ＵＳＦＤＡ）もしくは欧州医薬品庁（ＥＭＡ）によって義務付けられた要件に適合する。

【0262】

さらに、本明細書に記載の方法から製造されたＡＡＶ生成物は、高い効力を有する。ＡＡＶ生成物、例えば、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９生成物の効力は、（１）マウス血漿１ｍＬ当たりの単位（ＦＩＸまたはＦＶＩＩＩ）として与えられるｉｎ ｖｉｖｏ生物効力（biopotency）（例えば、マウスにおける活性タンパク質の産生）、または（２）ｉｎ ｖｉｔｒｏ生物効力によって記載することができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏ生物効力試験は、ＡＡＶベクターが細胞（例えばＨｅｐＧ２細胞）に感染する能力を測定し、細胞は目的タンパク質を発現して培地中に分泌し、その量をＥＬＩＳＡ技術および／または酵素活性によって決定する。ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏ生物効力を測定する適切な方法は、当技術分野で知られており、本明細書にも記載されている。

【0263】

さらなる実施形態において、本明細書に記載の方法から製造されたＡＡＶ生成物は、優れた比活性を示す。ＡＡＶの「比活性」は、ｑＰＣＲ／μｇ ＡＡＶ８の比で表される。例示的な実施形態では、本明細書に記載の方法から製造されたＡＡＶ生成物は、優れたＧＯＩ／μｇ ＡＡＶの比を示し、ＡＡＶ生成物が大量の「完全」ウイルス粒子を有することを実証する。特定の実施形態では、本開示の方法は、ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡを介してＡＡＶ画分を検査することを含む。特定の実施形態では、ＡＡＶ画分中のカプシドの大部分が完全カプシドであることから、ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡは、ＡＡＶ画分の効力に関する代表的な読み出しを提供するのに十分である。

【0264】

非限定的な実施形態：
１．アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を精製する方法であって、
（ａ）ＡＡＶ含有溶液を、ＡＡＶを標的とするアフィニティ樹脂に、室温で、溶液中のＡＡＶとアフィニティ樹脂との間の結合を可能にする条件下でロードするステップ；
（ｂ）室温で、少なくとも１つの洗浄ステップを行うステップ；および
（ｃ）１８℃未満の温度で、アフィニティ樹脂からＡＡＶを溶出するステップ；
を含む、方法。

【0265】

２．ステップ（ｃ）の温度が１℃～１２℃の間である、実施形態１の方法。

【0266】

３．ステップ（ｃ）の温度が２℃～８℃の間である、実施形態１の方法。

【0267】

４．ＡＡＶ含有溶液をアフィニティ樹脂にロードする前に、ＡＡＶ含有溶液を陰イオン交換体と接触させること、および陰イオン交換体からＡＡＶ含有溶液を溶出させることをさらに含む、実施形態１～３のいずれか１つに記載の方法。

【0268】

５．洗浄ステップの少なくとも１つが、有機溶媒および／またはデタージェントを含むバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む、実施形態１～４のいずれか１つに記載の方法。

【0269】

６．バッファーが酢酸ナトリウムを含む、実施形態５に記載の方法。

【0270】

７．バッファーが、ＴｒｉｓＨＣｌおよび塩を含む、実施形態５に記載の方法。

【0271】

８．バッファーが、ヒスチジン、ヒスチジン－ＨＣｌ、アルギニン－ＨＣｌ、リジン－ＨＣｌ、グリシン、タウリン、ＭＥＳ－Ｎａ、Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ、およびＮ－アセチル－Ｄ，Ｌ－トリプトファンのうちの１つまたは複数を含む、実施形態５に記載の方法0。

【0272】

９．塩がＮａＣｌである、実施形態７または８に記載の方法。

【0273】

１０．バッファーが塩化マグネシウムを含む、実施形態５に記載の方法0。

【0274】

１１．バッファーが、ＴｒｉｓＨＣｌおよびエチレングリコールを含む、実施形態５に記載の方法。

【0275】

１２．バッファーが、アルギニン－ＨＣｌと、スクロースおよびグリセロールのうちの１つを含む、実施形態５に記載の方法

【0276】

１３．バッファーが、タウリンおよびエチレングリコールを含む、実施形態５に記載の方法。

【0277】

１４．バッファーが、アルギニン－ＨＣｌ、リジン－ＨＣｌ、およびヒスチジン－ＨＣｌを含む、実施形態５に記載の方法。

【0278】

１５．バッファーが、ＴｒｉｓＨＣｌおよびＤＭＳＯを含む、実施形態５に記載の方法。

【0279】

１６．有機溶媒またはデタージェントが、ポリソルベート８０、エチレングリコール、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、ＤＭＳＯ、スクロース、またはトレハロースである、実施形態５に記載の方法0。

【0280】

１７．デタージェントが、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００、ポリソルベート８０、およびトリ（ｎ－ブチル）ホスフェート（ＴＮＢＰ）のうちの１つまたは複数を含む、実施形態５に記載の方法0。

【0281】

１８．デタージェントがポリソルベート８０を含む、実施形態１７に記載の方法0。

【0282】

１９．バッファーが、約０．０５％～約３０％（ｗ／ｗ）の有機溶媒またはデタージェントを含む、実施形態５～１８のいずれか１つに記載の方法。

【0283】

２０．バッファーが、約０．０５％～約０．２％（ｗ／ｗ）の有機溶媒またはデタージェントを含む、実施形態５に記載の方法。

【0284】

２１．室温で少なくとも２つの洗浄ステップが行われる、実施形態１～２０のいずれか１つに記載の方法。

【0285】

２２．室温で少なくとも３つの洗浄ステップが行われる、実施形態１～２１のいずれか１つに記載の方法。

【0286】

２３．室温で少なくとも４つの洗浄ステップが行われる、実施形態１～２２のいずれか１つに記載の方法。

【0287】

２４．２つの洗浄ステップが行われる、実施形態２１に記載の方法。

【0288】

２５．３つの洗浄ステップが行われる、実施形態２２に記載の方法。

【0289】

２６．４つの洗浄ステップが行われる、実施形態２３に記載の方法。

【0290】

２７．洗浄ステップが連続して行われる、実施形態１～２６のいずれか１つに記載の方法。

【0291】

２８．少なくとも１つの洗浄バッファーが、約１０～約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約５０～約５００ｍＭの塩を含む、実施形態１～２７のいずれか１つに記載の方法。

【0292】

２９．少なくとも１つの洗浄バッファーが、約２５～約１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約７５～約２５０ｍＭの塩を含む、実施形態２８に記載の方法。

【0293】

３０．少なくとも１つの洗浄バッファーが、約４０～約６０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１００～約１５０ｍＭの塩を含む、実施形態２９に記載の方法。

【0294】

３１．洗浄バッファーが、約７．５～約９．２、約８．０～約９．０、または約８．０～約８．８のｐＨを有する、実施形態２８～３０のいずれか１つに記載の方法。

【0295】

３２．少なくとも１つの洗浄バッファーが、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１２５ｍＭの塩を含み、約８．５のｐＨを有する、実施形態３１に記載の方法。

【0296】

３３．少なくとも１つの洗浄バッファーが、約１０～約２０００ｍＭの酢酸ナトリウム、および約０．００１～約１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む、実施形態１～３２のいずれか１つに記載の方法。

【0297】

３４．少なくとも１つの洗浄バッファーが、約５０～約２００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．００５～約０．３％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む、実施形態３３に記載の方法。

【0298】

３５．少なくとも１つの洗浄バッファーが、約９０～約１１０ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．０５～約０．２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む、実施形態３４に記載の方法。

【0299】

３６．洗浄バッファーが、約５．０～約７．４、約５．５～約７．０、または約５．５～約６．５のｐＨを有する、実施形態３３～３５のいずれか１つに記載の方法。

【0300】

３７．少なくとも１つの洗浄バッファーが、約１００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含み、約６．０のｐＨを有する、実施形態３６に記載の方法。

【0301】

３８．少なくとも１つの洗浄バッファーが、約１０～約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１０～約７５％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含む、実施形態１～３７のいずれか１つに記載の方法。

【0302】

３９．少なくとも１つの洗浄バッファーが、約２５ｍＭ～約１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約２５％～約７０％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含む、実施形態３８に記載の方法。

【0303】

４０．少なくとも１つの洗浄バッファーが、約４０ｍＭ～約６０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約４０％～約６０％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含む、実施形態３９に記載の方法。

【0304】

４１．洗浄バッファーが、約７．５～約９．２、約８．０～約９．０、または約８．０～約８．８のｐＨを有する、実施形態の３８～４０のいずれか１つに記載の方法。

【0305】

４２．少なくとも１つの洗浄バッファーが、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約５０％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含み、約８．５のｐＨを有する、実施形態４１に記載の方法。

【0306】

４３．少なくとも１つの洗浄バッファーが、約１０～約２００ｍＭのグリシン、約１～約１００ｍＭのヒスチジン、約２０～約５００ｍＭの塩、約１～約１０％（ｗ／ｗ）のトレハロース、および約０．０００５～約１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む、実施形態１～４２のいずれか１つに記載の方法。

【0307】

４４．少なくとも１つの洗浄バッファーが、約３０ｍＭ～約８０ｍＭのグリシン、約５～約２０ｍＭのヒスチジン、約５０～約２００ｍＭの塩、約３～約８％（ｗ／ｗ）のトレハロース、および約０．００１～約０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む、実施形態４３に記載の方法。

【0308】

４５．少なくとも１つの洗浄バッファーが、約４０～約６０ｍＭのグリシン、約５～約１５ｍＭのヒスチジン、約９０～約１１０ｍＭの塩、約４～約６％（ｗ／ｗ）のトレハロース、および約０．００１～約０．０５％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む、実施形態４４に記載の方法。

【0309】

４６．洗浄バッファーが、約６．０～約８．０、約６．５～約７．５、または約７．０～約７．４のｐＨを有する、実施形態４３～４５のいずれか１つに記載の方法。

【0310】

４７．少なくとも１つの洗浄バッファーが、約５０ｍＭのグリシン、約１０ｍＭのヒスチジン、約１００ ｍＭの塩、約５％（ｗ／ｗ）トレハロース、約０．００５％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含み、約７．０のｐＨを有する、実施形態４６に記載の方法。

【0311】

４８．少なくとも１つの洗浄バッファーが、約１～約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、約５０～約５００ｍＭの塩、および約０．００１～約１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む、実施形態１～４７のいずれか１つに記載の方法。

【0312】

４９．少なくとも１つの洗浄バッファーが、約５～約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、約７５～約２５０ｍＭの塩、および約０．００５～約０．３％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む、実施形態４８に記載の方法。

【0313】

５０．少なくとも１つの洗浄バッファーが、約１０～約３０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、約１４０～約１６０ｍＭの塩、および約０．０５～約０．２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む、実施形態４９に記載の方法。

【0314】

５１．洗浄バッファーが、約６．０～約８．８、約６．５～約８．５、または約７．０～約８．０のｐＨを有する、実施形態４８～５０のいずれか１つに記載の方法。

【0315】

５２．少なくとも１つの洗浄バッファーが、約２０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１５０ｍＭの塩、ならびに約０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含み、約７．４のｐＨを有する、実施形態５１に記載の方法。

【0316】

５３．ステップ（ｃ）が、少なくとも１つの溶出バッファーでＡＡＶを溶出することを含む、実施形態１～５２のいずれか１つに記載の方法。

【0317】

５４．少なくとも１つの溶出バッファーが、少なくとも１つの洗浄バッファーと同じである、実施形態５３に記載の方法。

【0318】

５５．少なくとも１つの溶出バッファーが、ステップ（ｃ）でＡＡＶを溶出する前の最終洗浄ステップで使用される最後の洗浄バッファーと同じである、実施形態５４に記載の方法。

【0319】

５６．第１の溶出バッファーが、ステップ（ｃ）でＡＡＶを溶出する前の最終洗浄ステップで使用される最後の洗浄バッファーと同じである、実施形態５４に記載の方法。

【0320】

５７．少なくとも１つの溶出バッファーが、約１０～約２００ｍＭのグリシン、約１～約１００ｍＭのヒスチジン、約２０～約５００ｍＭの塩、約１～約１０％（ｗ／ｗ）のトレハロース、および約０．０００５～約１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む、実施形態５３～５６のいずれか１つに記載の方法。

【0321】

５８．少なくとも１つの溶出バッファーが、約３０～約８０ｍＭのグリシン、約５～約２０ｍＭのヒスチジン、約５０～約２００ｍＭの塩、約３～約８％のトレハロース、および約０．００１～約０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む、実施形態５７に記載の方法。

【0322】

５９．少なくとも１つの溶出バッファーが、約４０～約６０ｍＭのグリシン、約５～約１５ｍＭのヒスチジン、約９０～約１１０ｍＭの塩、約４～約６％（ｗ／ｗ）のトレハロース、および約０．００１～約０．０５％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む、実施形態５８に記載の方法。

【0323】

６０．洗浄バッファーが、約６．０～約８．０、約６．５～約７．５、または約７．０～約７．４のｐＨを有する、実施形態５７～５９のいずれか１つに記載の方法。

【0324】

６１．少なくとも１つの溶出バッファーが、約５０ｍＭのグリシン、約１０ｍＭのヒスチジン、約１００ ｍＭの塩、約５％（ｗ／ｗ）トレハロース、および約０．００５％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含み、約７．０のｐＨを有する、実施形態６０に記載の方法。

【0325】

６２．少なくとも１つの洗浄バッファーが、約１～約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、約５０～約５００ｍＭの塩、および約０．００１～約１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む、実施形態５３～６１のいずれか１つに記載の方法。

【0326】

６３．少なくとも１つの洗浄バッファーが、約５～約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、約７５～約２５０ｍＭの塩、および約０．００５～約０．３％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む、実施形態６２に記載の方法。

【0327】

６４．少なくとも１つの洗浄バッファーが、約１０～約３０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、約１４０～約１６０ｍＭの塩、および約０．０５％～約０．２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む、実施形態６３に記載の方法。

【0328】

６５．洗浄バッファーが、約６．０～約８．８、約６．５～約８．５、または約７．０～約８．０のｐＨを有する、実施形態６２～６４のいずれか１つに記載の方法。

【0329】

６６．少なくとも１つの洗浄バッファーが、約２０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、約１５０ｍＭの塩、および約０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含み、約７．４のｐＨを有する、実施形態６５に記載の方法。

【0330】

６７．第１および第３の洗浄ステップが、約１０～約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約５０～約５００ｍＭの塩を含みかつ約７．５～約９．２のｐＨを有するバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含み、
第２の洗浄ステップが、約１０～約２０００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．００１～約１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含みかつ約５．０～約７．４のｐＨを有するバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む、実施形態１～６６のいずれか１つに記載の方法。

【0331】

６８．第１および第３の洗浄ステップが、約１０～約２０００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．００１～約１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含みかつ約５．０～約７．４のｐＨを有するバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含み、
第２の洗浄ステップが、約１０～約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約５０～約５００ｍＭの塩を含みかつ約７．５～約９．２のｐＨを有するバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む、実施形態１～６６のいずれか１つに記載の方法。

【0332】

６９．第１および第３の洗浄ステップが、約１０～約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約５０～約５００ｍＭの塩を含みかつ約７．５～約９．２のｐＨを有するバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含み、
第２および第４の洗浄ステップが、約１０～約２０００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．００１～約１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含みかつ約５．０～約７．４のｐＨを有するバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む、実施形態１～６６のいずれか１つに記載の方法。

【0333】

７０．第１および第３の洗浄ステップが、約１０～約２０００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．００１～約１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含みかつ約５．０～約７．４のｐＨを有するバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含み、
第２および第４の洗浄ステップが、約１０～約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約５０～約５００ｍＭの塩を含みかつ約７．５～約９．２のｐＨを有するバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む、実施形態１～６６のいずれか１つに記載の方法。

【0334】

７１．第１および第３のバッファーが、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１２５ｍＭの塩を含み、約８．５のｐＨを有する、実施形態６７または６９に記載の方法。

【0335】

７２．第１および第３のバッファーが、約１００ｍＭの酢酸ナトリウム、約０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含み、約６．０のｐＨを有する、実施形態６８または７０に記載の方法。

【0336】

７３．第２のバッファーが、約１００ｍＭの酢酸ナトリウム、約０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含み、約６．０のｐＨを有する、実施形態６７または６９に記載の方法。

【0337】

７４．第２のバッファーが、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１２５ｍＭの塩を含み、約８．５のｐＨを有する、実施形態６８または７０に記載の方法。

【0338】

７５．第４のバッファーが、約１００ｍＭの酢酸ナトリウム、約０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含み、約６．０のｐＨを有する、実施形態６９に記載の方法。

【0339】

７６．第４のバッファーが、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１２５ｍＭの塩を含み、約８．５のｐＨを有する、実施形態７０に記載の方法。

【0340】

７７．ステップ（ｃ）が、約１０～約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約５０～約５００ｍＭの塩を含みかつ約７．５～約９．２のｐＨを有するバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む、実施形態６７または７０に記載の方法。

【0341】

７８．ステップ（ｃ）が、約１０～約２０００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．００１～約１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含みかつ約５．０～約７．４のｐＨを有するバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む、実施形態６８または６９に記載の方法。

【0342】

７９．バッファーが、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１２５ｍＭの塩を含み、約８．５のｐＨを有する、実施形態７７に記載の方法。

【0343】

８０．バッファーが、約１００ｍＭの酢酸ナトリウム、約０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含み、約６．０のｐＨを有する、実施形態７８に記載の方法。

【0344】

８１．少なくとも１つの洗浄および／または溶出バッファーが、約５０～約５００ｍＭの２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸のナトリウム塩（ＭＥＳ－Ｎａ）と、約３～約３０ｍＭのＥＤＴＡと、ポリソルベート８０、ＤＭＳＯ、およびトリ（ｎ－ブチル）ホスフェート（ＴＮＢＰ）を含む溶媒／デタージェント混合物とを含み、約５．２～約６．８のｐＨを有する、実施形態１～８０のいずれか１つに記載の方法。

【0345】

８２．少なくとも１つの洗浄および／または溶出バッファーが、約３０～約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌまたはアルギニン－ＨＣｌ、および約７５～約５００ｍＭの塩を含み、約７．５～約９．２のｐＨを有する、実施形態１～８１のいずれか１つに記載の方法。

【0346】

８３．少なくとも１つの洗浄および／または溶出バッファーが、約２０～約８０ｍＭのアルギニン－ＨＣｌおよび約５０～約２００ｍＭの塩を含み、約７．３～約８．８のｐＨを有する、実施形態１～８２のいずれか１つに記載の方法。

【0347】

８４．少なくとも１つの洗浄および／または溶出バッファーが、約５０～約２００ｍＭのタウリン、および０．２～１．５％（ｗ／ｗ）のＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ６０００）を含み、約５．２～約６．８のｐＨを有する、実施形態１～８３のいずれか１つに記載の方法。

【0348】

８５．少なくとも１つの洗浄および／または溶出バッファーが、約３０～約３００ｍＭのグリシンを含み、約７．５～約９．２のｐＨを有する、実施形態１～８４のいずれか１つに記載の方法。

【0349】

８６．少なくとも１つの洗浄および／または溶出バッファーが、約２０～約１５０ｍＭのタウリン、約３０～約７５％（ｗ／ｗ）のエチレングリコール、および０．０５～０．２％のオクチルグリコピラノシドを含み、約７．３～約８．８のｐＨを有する、実施形態１～８５のいずれか１つに記載の方法。

【0350】

８７．少なくとも１つの洗浄および／または溶出バッファーが、約８０～約４００ｍＭのＢｉｓ－Ｔｒｉｓと、約１０～約２０グラムの、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００、ポリソルベート８０およびＴＮＢＰを約１１：３：３（重量比）の比率で含む溶媒／デタージェント混合物とを含み、約５．２～約６．８のｐＨを有する、実施形態１～８６のいずれか１つに記載の方法。

【0351】

８８．少なくとも１つの洗浄および／または溶出バッファーが、約５～約２０ｍｍｏｌのクエン酸ナトリウムを含み、約７．５～約９．２のｐＨを有する、実施形態１～８７のいずれか１つに記載の方法。

【0352】

８９．少なくとも１つの洗浄および／または溶出バッファーが、約５０ｍＭ～約２００ｍＭのアルギニン－ＨＣｌ、約５０ｍＭ～約２００ｍＭのリジン－ＨＣｌ、約５０ｍＭ～約２００ｍＭのヒスチジン－ＨＣｌ、および約１ｍＭ～約４ｍＭのＮ－アセチル－Ｄ，Ｌ－トリプトファン、および約１０％～約４０％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含み、約７．３～約８．８のｐＨを有する、実施形態１～８８のいずれか１つに記載の方法。

【0353】

９０．第１の洗浄ステップが、約５０～約２０００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．０５～約０．２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む第１のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含み、第１のバッファーは約５．２～約６．８のｐＨを有する；
第２の洗浄ステップが、約３０～約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約７５～約５００ｍＭの塩を含む第２のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含み、第２のバッファーは約７．５～約９．２のｐＨを有する；および
第３の洗浄ステップが、約３０～約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約３０～約７５％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含む第３のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含み、第３のバッファーは約７．３～約８．８のｐＨを有する、実施形態１～６６のいずれか１つに記載の方法。

【0354】

９１．第１の洗浄ステップが、約５０～約５００ｍＭの２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸のナトリウム塩（ＭＥＳ－Ｎａ）と、約３～約３０ｍＭのＥＤＴＡと、ポリソルベート８０、ＤＭＳＯ、およびトリ（ｎ－ブチル）ホスフェート（ＴＮＢＰ）を含む溶媒／デタージェント混合物とを含む第１のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含み、第１のバッファーは約５．２～約６．８のｐＨを有する；
第２の洗浄ステップが、約３０～約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌまたはアルギニン－ＨＣｌ、および約７５～約５００ｍＭの塩を含む第２のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含み、第２のバッファーは約７．５～約９．２のｐＨを有する；および
第３の洗浄ステップが、約２０～約８０ｍＭのアルギニン－ＨＣｌおよび約５０～約２００ｍＭの塩を含む第３のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含み、第３のバッファーは約７．３～約８．８のｐＨを有する、実施形態１～６６のいずれか１つに記載の方法。

【0355】

９２．第１の洗浄ステップが、約５０～約２００ｍＭのタウリン、および０．２～１．５％（ｗ／ｗ）のＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ６０００）を含む第１のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含み、第１のバッファーは約５．２～約６．８のｐＨを有する；
第２の洗浄ステップが、約３０～約３００ｍＭのグリシンを含む第２のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含み、第２のバッファーは約７．５～約９．２のｐＨを有する；および
第３の洗浄ステップが、約２０～約１５０ｍＭのタウリン、約３０～約７５％（ｗ／ｗ）のエチレングリコール、および０．０５～０．２％（ｗ／ｗ）のオクチルグリコピラノシドを含む第３のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含み、第３のバッファーは約７．３～約８．８のｐＨを有する、実施形態１～６６のいずれか１つに記載の方法。

【0356】

９３．第１の洗浄ステップが、約８０～約４００ｍＭのＢｉｓ－Ｔｒｉｓと、約１０～約２０ｇの、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００、ポリソルベート８０およびＴＮＢＰを約１１：３：３（重量比）の比率で含む溶媒／デタージェント混合物とを含む第１のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含み、第１のバッファーは約５．２～約６．８のｐＨを有する；
第２の洗浄ステップが、約５～約２０ｍｍｏｌのクエン酸ナトリウムを含む第２のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含み、第２のバッファーは約７．５～約９．２のｐＨを有する；および
第３の洗浄ステップが、約５０～約２００ｍＭのアルギニン－ＨＣｌ、約５０～約２００ｍＭのリジン－ＨＣｌ、約５０～約２００ｍＭのヒスチジン－ＨＣｌ、および約１ｍＭ～約４ｍＭのＮ－アセチル－Ｄ，Ｌ－トリプトファン、ならびに約１０％～約４０％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む第３のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含み、第３のバッファーは約７．３～約８．８のｐＨを有する、実施形態１～６６のいずれか１つに記載の方法。

【0357】

９４．第１の洗浄ステップが、約５０ｎＭ～約２００ｍＭの酢酸ナトリウム（ＮａＡｃｅｔａｔｅ）および約０．０５～約０．２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む第１のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含み、第１のバッファーは約５．２～約６．８のｐＨを有する；
第２の洗浄ステップが、約２０ｎＭ～約１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約５０ｎＭ～約２００ｎＭの塩を含む第２のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含み、第２のバッファーは約７．５～約８．８のｐＨを有する；および
第３の洗浄ステップが、約２０ｍＭ～１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、約４０％～約６０％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含む第３のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含み、第３のバッファーは約７．５～約８．８のｐＨを有する、実施形態１～６６のいずれか１つに記載の方法。

【0358】

９５．第１の洗浄ステップが、約５０ｎＭ～約２００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．０５～約０．２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む第１のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含み、第１のバッファーは約５．２～約６．８のｐＨを有する；
第２の洗浄ステップが、約２０ｎＭ～約１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約５０ｎＭ～約２００ｎＭの塩を含む第２のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含み、第２のバッファーは約７．５～約８．８のｐＨを有する；および
第３の洗浄ステップが、約２０ｍＭ～１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、約４０％～約６０％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含む第３のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含み、第３のバッファーは約７．５～約８．８のｐＨを有する、実施形態１～６６のいずれか１つに記載の方法。

【0359】

９６．塩が、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２、ＣａＣｌ_２、クエン酸ナトリウム、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、酢酸ナトリウム、ならびにＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２、ＣａＣｌ_２、クエン酸ナトリウム、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌおよび酢酸ナトリウムのうちの１つまたは複数の組み合わせから選択される、実施形態７、または２９～９５のいずれか１つに記載の方法。

【0360】

９７．塩がＮａＣｌである、実施形態９６に記載の方法。

【0361】

９８．塩の濃度が５００ｍＭを超えない、実施形態７、または２９～９７のいずれか１つに記載の方法。

【0362】

９９．塩の濃度が２００ｍＭを超えない、実施形態７、または２９～９７のいずれか１つに記載の方法。

【0363】

１００．バッファーが、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１２５ｍＭのＮａＣｌを含み、約８．５のｐＨを有する、実施形態２８～３２または６７～９５のいずれか１つに記載の方法。

【0364】

１０１．第１の洗浄ステップが、約５０～約２００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．０５～約０．２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む第１のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含み、第１のバッファーは約５．５～約６．５のｐＨを有する；
第２の洗浄ステップが、約１０～約７０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約７５～約２５０ｍＭのＮａＣｌを含む第２のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含み、第２のバッファーは約８．０～約９．０のｐＨを有する；および
第３の洗浄ステップが、約１０～約７０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約３０～約７５％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含む第３のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含み、第３のバッファーは約８．０～約９．０のｐＨを有する、実施形態１～６６のいずれか１つに記載の方法。

【0365】

１０２．第１の洗浄ステップの前に行われる第４の洗浄ステップをさらに含み、第４の洗浄ステップが、約１０～約３０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約７５～約２５０ｍＭのＮａＣｌを含む第４のバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含み、第４のバッファーは約６．５～約８．０のｐＨを有する、実施形態１０１に記載の方法。

【0366】

１０３．第１のバッファーが、約１００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含み、第１のバッファーが約６．０のｐＨを有する、実施形態１００または１０２に記載の方法。

【0367】

１０４．第２のバッファーが、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１２５ｍＭのＮａＣｌを含み、第２のバッファーが約８．５のｐＨを有する、実施形態１００～１０３のいずれか１つに記載の方法。

【0368】

１０５．第３のバッファーが、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約５０％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含み、さらに第３のバッファーが約８．０のｐＨを有する、実施形態１００～１０４のいずれか１つに記載の方法。

【0369】

１０６．酸性成分が除去される、実施形態１～１０５のいずれか１つに記載の方法。

【0370】

１０７．酸性成分が、ＨＥＫ２９３ ＤＮＡなどの宿主細胞ＤＮＡであり、酸性成分が、ｑＰＣＲによって測定して、ＡＡＶ抗原１μｇあたり２５０ｐｇ未満の値に低減される、実施形態１０６に記載の方法。

【0371】

１０８．酸性成分が、ＨＥＫ２９３ ＤＮＡなどの宿主細胞ＤＮＡであり、酸性成分が、ＥＬＩＳＡで測定して、ＡＡＶ抗原１μｇあたり２５０ｐｇ未満の値に低減される、実施形態１０６に記載の方法。

【0372】

１０９．溶出が、グラジエント溶出によって溶出バッファーの導電率を連続的に直線的に増加させることを含む、実施形態１～１０８のいずれか１つに記載の方法。

【0373】

１１０．溶出が、グラジエント溶出によって有機溶媒の濃度を連続的に直線的に増加させることを含む、実施形態１～１０９のいずれか１つに記載の方法。

【0374】

１１１．溶出が、アフィニティ樹脂を、酢酸ナトリウム、グリシン、ヒスチジン、ＮａＣｌ、および／またはポリソルベート８０を含む溶出バッファーと接触させることを含む、実施形態１～１１０のいずれか１つに記載の方法

【0375】

１１２．塩濃度が約５０～２００ｍＭである、実施形態１１１に記載の方法。

【0376】

１１３．ｐＨが５．５～９．０である、実施形態１１１または１１２に記載の方法。

【0377】

１１４．溶出が、アフィニティ樹脂を、５０～２００ｍＭのＮａＣｌおよび３０～８０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌを含む溶出バッファーと接触させることを含む、実施形態１１１～１１３のいずれか１つに記載の方法。

【0378】

１１５．溶出バッファーがｐＨ８．０～９．０である、実施形態１１４に記載の方法。

【0379】

１１６．溶出バッファーが、少なくとも約５５％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含む、実施形態１１４に記載の方法。

【0380】

１１７．溶出が、アフィニティ樹脂を、約５０～２００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび０．０５％～０．２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む溶出バッファーと接触させることを含み、溶出バッファーは約５．５～６．５のｐＨである、実施形態１～１１６のいずれか１つに記載の方法。

【0381】

１１８．溶出が、アフィニティ樹脂を、３０～８０ｍＭのグリシン、５～２０ｍＭのヒスチジン、５０～２００ｍＭのＮａＣｌ、３～８％（ｗ／ｗ）トレハロース、および０．００１～０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む溶出バッファーと接触させることを含み、溶出バッファーは６．５～７．５のｐＨである、実施形態１～１１７のいずれか１つに記載の方法。

【0382】

１１９．溶出が、
（ａ）アフィニティ樹脂を、５０～２００ｍＭの酢酸ナトリウム、０．０５％～０．２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含み、約５．５～６．５のｐＨを有する第１の溶出バッファーと接触させること；
（ｂ）アフィニティ樹脂を、３０～８０ｍＭのグリシン、５～２０ｍＭのヒスチジン、５０～２００ｍＭのＮａＣｌ、３～８％（ｗ／ｗ）のトレハロース、および０．００１～０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含み、６．５～７．５のｐＨを有する第２の溶出バッファーと接触させること；および
（ｃ）アフィニティ樹脂を、５０～２００ｍＭのＮａＣｌおよび３０～８０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌを含み、８．０～９．０のｐＨを有する第３の溶出バッファーと接触させること；
をさらに含む、実施形態１１８に記載の方法。

【0383】

１２０．ステップが連続して行われる、実施形態１～１１９のいずれか１つに記載の方法。

【0384】

１２１．溶出が、アフィニティ樹脂を、約２ｍＭの塩化マグネシウム、約５０ｍＭのアルギニン－ＨＣｌ、約７５０ｍＭ～約１０００ｍＭのＮａＣｌ、および少なくとも約５０％（ｗ／ｗ）のグリセロールを含む溶出バッファーと、少なくとも約８．０のｐＨで接触させることを含む、実施形態１～１２０のいずれか１つに記載の方法。

【0385】

１２２．溶出が、アフィニティ樹脂を、約２ｍＭの塩化マグネシウム、約５０ｍＭのタウリン、約６００ｍＭ～約１０００ｍＭのＮａＣｌ、約０．０５～約０．２％（ｗ／ｗ）のオクチルグリコピラノシド、および約６０％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含む溶出バッファーと、少なくとも約７．８のｐＨで接触させることを含む、実施形態１～１２１のいずれか１つに記載の方法。

【0386】

１２３．溶出が、
（ａ）アフィニティ樹脂を、約２０～約１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌおよび約７５～約２５０ｍＭのＮａＣｌを含み、約８．０～約８．８のｐＨを有する、第５のバッファーと接触させること；および
（ｂ）アフィニティ樹脂を、約１Ｍの硫酸アンモニウム、約５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、および約５０％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含む第２の溶出バッファーと、少なくとも約６．８のｐＨで接触させること；
をさらに含む、実施形態１２２に記載の方法。

【0387】

１２４．ステップが連続して行われる、実施形態１２３に記載の方法。

【0388】

１２５．溶出が、アフィニティ樹脂を、約１Ｍの硫酸アンモニウム、約５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、および約５０％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含む溶出バッファーと、少なくとも約６．８のｐＨで接触させることを含む、実施形態１～１２４のいずれか１つに記載の方法。

【0389】

１２６．溶出が、アフィニティ樹脂を、約２０％（ｗ／ｗ）のスクロースと、約１０％（ｗ／ｗ）のソルビトールと、約５％（ｗ／ｗ）のマンニトールまたは約５％（ｗ／ｗ）のスクロースと、約１５％（ｗ／ｗ）のグリセロールと、約５０ｍＭのヒスチジンと、約７５０～約１０００ｍＭのＮａＣｌとを含む溶出バッファーに、少なくとも約７．８のｐＨで接触させることを含む、実施形態１～１２５のいずれか１つに記載の方法。

【0390】

１２７．溶出が、
（ａ）アフィニティ樹脂を、約２０～約１００ｍＭのヒスチジン、約８０～約１２０ｍＭのＮａＣｌを含み、約８．０～約８．８のｐＨを有する第５のバッファーと接触させること；および
（ｂ）アフィニティ樹脂を、約２０～約１００ｍＭのヒスチジン、約６００～約９００ｍＭのＮａＣｌ、および約５～６０％（ｗ／ｗ）のＤＭＳＯを含み、約６．５～約８．５のｐＨを有する第２の溶出バッファーと接触させること；
をさらに含む、実施形態１２６に記載の方法。

【0391】

１２８．ステップが連続して行われる、実施形態１２７に記載の方法。

【0392】

１２９．溶出が、アフィニティ樹脂を、約１００ｍＭのグリシン－ＨＣｌ、約２００ｍＭのＮａＣｌを含む溶出バッファーと、約２．５のｐＨで接触させることを含む、実施形態１～１２８のいずれか１つに記載の方法。

【0393】

１３０．溶出バッファーがｐＨ約８．０である、実施形態１０９～１２９のいずれか１つに記載の方法。

【0394】

１３１．溶出バッファーがｐＨ８．０である、実施形態１０９～１２９のいずれか１つに記載の方法。

【0395】

１３２．溶出が、対イオンの濃度を段階的に増加させることを含む、実施形態１０９～１３１のいずれか１つに記載の方法。

【0396】

１３３．溶出が、有機溶媒の濃度を段階的に増加させることを含む、実施形態１０９～１３２のいずれか１つに記載の方法。

【0397】

１３４．溶出バッファー中の塩が、塩化物、酢酸塩、硫酸塩、およびクエン酸塩などの一価、二価、または多価の陰イオンから選択される、実施形態１～１３３のいずれか１つに記載の方法。

【0398】

１３５．０から１００％（ｗ／ｗ）の２０～５０ ｍＭの塩酸／０．５～２．０ ｍＭの塩酸中の８００～１２００ｍＭのＮａＣｌのグラジエントを適用することにより溶出することをさらに含む、実施形態１～１３４のいずれか１つに記載の方法。

【0399】

１３６．溶出ステップから得られるＡＡＶが、≦９９．９％のＨＣ不純物レベルを有する、実施形態１～１３５のいずれか１つに記載の方法。

【0400】

１３７．溶出ステップから得られるＡＡＶが、≦９９．０％のＨＣ不純物レベルを有する、実施形態１～１３６のいずれか１つに記載の方法。

【0401】

１３８．溶出ステップから得られるＡＡＶが、９９．０％以上の純度レベルを有する、実施形態１～１３７のいずれか１項に記載の方法。

【0402】

１３９．溶出ステップから得られるＡＡＶが９９．９％以上の純度を有する、実施形態１～１３８のいずれか１つに記載の方法。

【0403】

１４０．溶出ステップ（ｃ）から溶出されるＡＡＶカプシドの少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％が完全ＡＡＶカプシドである、実施形態１～１３９のいずれか１つに記載の方法。

【0404】

１４１．アフィニティ樹脂がＡＡＶｘ樹脂である、実施形態１～１４０のいずれか１つに記載の方法。

【0405】

１４２．ＡＡＶがＡＡＶ９である、実施形態１～１４１のいずれか１つに記載の方法。

【0406】

１４３．ＡＡＶ９が、配列番号１、配列番号２、および／または配列番号３の配列を含むペプチドを含む、実施形態１４２に記載の方法。

【0407】

１４４．ＡＡＶ含有溶液を、該ＡＡＶ含有溶液から酸性の荷電汚染物質を枯渇させるのに有効な正荷電基を含むフィルターと接触させることをさらに含む、実施形態１～１４３のいずれか１つに記載の方法。

【0408】

１４５．ＡＡＶ画分をナノろ過して３５ｎｍより大きいウイルスを除去することをさらに含む、実施形態１～１４４のいずれか１つに記載の方法。

【0409】

１４６．カチオン交換クロマトグラフィーを行うことを含むポリッシングステップをさらに含む、実施形態１～１４５のいずれか１つに記載の方法。

【0410】

１４７．ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡを介してＡＡＶ画分を検査することをさらに含む、実施形態１～１４６のいずれか１つに記載の方法。

【0411】

１４８．ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡが、ＡＡＶに特異的なサンドイッチＥＬＩＳＡである、実施形態１４７に記載の方法。

【0412】

１４９．実施形態１～１４８のいずれか１つに記載の方法により製造されたＡＡＶ生成物。

【0413】

以下の実施例は、単に本発明を説明するために与えられたものであり、決してその範囲を限定するものではない。

【実施例1】

【0414】

以下の実施例は、ＨＥＫ２９３細胞株をトリプルプラスミドシステムでトランスフェクションして、目的タンパク質をコードする核酸を含むｒＡＡＶ粒子を製造する例示的な方法を説明する。

【0415】

付着性のＨＥＫ２９３細胞を、例えば、すべての意図された目的のために参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１８１２８６８８号の段落［００１４６］～［００１５０］に記載されているように、化学的に定義され、動物由来の成分、タンパク質および血清を含まない市販の培養液中において、懸濁状態で培養した。細胞を以下の３つのプラスミドでトランスフェクトした：（１）増殖性のＡＡＶ感染に不可欠なヘルパーウイルス機能を提供するヘルパープラスミド、（２）ウイルスのカプシド生成、複製、およびパッケージングに関するすべての情報を運ぶｒｅｐｃａｐプラスミド、（３）得られるｒＡＡＶ粒子にパッケージングされる目的の遺伝子（ＧＯＩ）を含むプラスミド。ＧＯＩのサイズは２．６～３．０ｋＢであった。目的の遺伝子を担持するｒＡＡＶ粒子は、トランスフェクション後３～５日の期間にわたりＨＥＫ２９３細胞株中にある。

【0416】

トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞培養物の上清を、例えば、すべての意図された目的のために参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１８１２８６８８号の段落［００１５１］～［００１５５］、表１および表２に記載されているように収穫した。収穫した上清を、例えば、すべての意図された目的のために参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１８１２８６８８号の段落［００１５６］～［００１６０］、表３および表４に記載されているように、濃縮およびコンディショニング（透析ろ過）した。全ての意図された目的のために参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１８１２８６８８号の段落［００１６１］～［００１６５］および表５に記載されているように、例えば透析ろ過処理された濃縮物に対してネガティブクロマトグラフィーを行った。

【実施例2】

【0417】

ＡＡＶ９の製造は、目的タンパク質のｃＤＮＡとＡＡＶ９のＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３とをコードすることを含むトリプルプラスミドシステムでトランスフェクションした後、ＨＥＫ２９３細胞株で展開される。ＡＡＶ９は、約２．６～３．０ｋＢのベクターＤＮＡを含む。清澄な無細胞培養上清を濃縮し、Ｐａｌｌ Ｏｍｅｇａ Ｔ－Ｓｅｒｉｅｓ Ｃａｓｓｅｔｔｅ １００ｋＤａで透析ろ過する。ウイルス粒子は、非結合状態、すなわち１２５ｍＭのＮａＣｌおよび５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌを含むｐＨ８．５の溶液中で、膜吸着器（membrane absorber）（ＭｕｓｔａｎｇＱ；Ｐａｌｌ Ｐａｒｔ Ｎｕｍｂｅｒ ＸＴ１４０ＭＳＴＧＱＰ０５）にロードされる。ＡＡＶ９を含むフロースルーを２５％ＨＣｌで７．４～７．８の間のｐＨ範囲に調整することにより、ｐＨ調整済みＬＯＡＤが得られる。

【0418】

以下の手順が行われる。まず、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶＸアフィニティ樹脂（カタログ番号３６７４２；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を含む、ＩＤ １６ｍｍ、ベッド高さ５０±０．５ｍｍ、面積２．０１ｃｍ^２、および容量約１０ｍｌのカラムを、５カラム容量の、１００ｍＭのグリシン、２００ｍＭのＮａＣｌを含むｐＨ２．０のバッファーで活性化する。その後、少なくとも５カラム容量の、５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび１２５ｍＭのＮａＣｌを含むｐＨ８．５のバッファーでカラムを平衡化する。ｐＨ調整済みＬＯＡＤを、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶＸアフィニティ樹脂を含むカラムにアプライする。

【0419】

次に、５カラム容量のＷａｓｈ １（Ｗ１）：５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび１２５ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．５で、室温（１８～２６℃）でカラムを洗浄する。次に、５カラム容量のＷａｓｈ ２（Ｗ２）：１００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび０．１％のＴｗｅｅｎ ８０（すなわち、ポリソルベート８０）、ｐＨ６．０で、室温（１８～２６℃）でカラムを洗浄する。次に、５カラム容量のＷＡＳＨ １（Ｗ１）：５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび１２５ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．５で、室温（１８～２６℃）でカラムを洗浄する。次に、５カラム容量のＷａｓｈ ２（Ｗ２）：１００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび０．１％のＴｗｅｅｎ ８０、ｐＨ６．０で、室温（１８～２６℃）でカラムを洗浄する。これらすべての洗浄ステップにおいて、線流速（linear flow rate）は６０ｃｍ／時である。

【0420】

溶出は、５カラム容量の上記のＷ２をアプライすることにより行われるが、＋２～＋８℃の間のより低い温度で行われる。次いで、５カラム容量の以下の二次溶出バッファー（ＥＬＴ－バッファー）：５０ｍＭのグリシン、１０ｍＭのヒスチジン、１００ｍＭのＮａＣｌ、５％のトレハロース、０．００３％のＣｒｉｌｌｅｔ（商標）４ＨＰ（すなわち、ポリソルベート８０）、ｐＨ７．０を、＋２～＋８℃の温度でカラムにアプライする。次いで、５カラム容量の以下の溶出バッファー：５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび１２５ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．５を、＋２～＋８℃の温度でカラムにアプライする。これらの溶出ステップの線流速は５ｃｍ／時である。その後、５カラム容量の精製水を、やはり＋２～＋８℃の温度でカラムにアプライする。その後、グラジエント溶出を行う。精製水中の１ｍＭから２０ｍＭのＨＣｌへの１５カラム容量のグラジエントを、１５ｃｍ／時の線流速で、＋２から＋２６℃の温度でアプライし、カラムを清浄化する。

【0421】

表２に上記の手順を詳細に記載しており、「ＣＶ」は、そのステップで添加された溶液のカラム容量数を示す。

【0422】

【表2】

【0423】

カラムを室温～約＋２～８℃に冷却する方法は、
－冷却キャビネットＵｎｉｃｈｒｏｍａｔ １５００内のクロマトグラフィースキッドＡＫＴＡ ｐｕｒｅ １５０；
－温度ジャケット付きクロマトグラフィーカラム（水冷式）；
－溶出に使用される冷バッファー；または
－上記の組み合わせ；
を含む。

【0424】

採取したサンプルを、ＩＴＲ ｑＰＣＲ、ＡＡＶ抗原に対するＥＬＩＳＡ、ＨＥＫ２９３ ＨＣＰに対するＥＬＩＳＡのそれぞれによってアッセイし、収率、ならびにステップでロスが発生していないかを評価する。

【0425】

ＥＬＩＳＡは、ＡＡＶ９抗原の量を測定するために使用される。ＥＬＩＳＡは、ＴＥＣＡＮ Ｒｏｂｏｔｅｒシステムで、ＡＡＶ－９滴定ＥＬＩＳＡキット（品番：ＰＲＡＡＶ９；Ｐｒｏｇｅｎ社（ハイデルベルグ、ドイツ））を用いて行う。簡単に説明すると、ＡＡＶ９カプシドに特異的なモノクローナル抗体（ＡＡＶ８／９抗体（「ＡＤＫ８／９抗体」、カタログ番号：０３－６５１１６１、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．，ウォルサム、マサチューセッツ州））をマイクロタイターストリップにコーティングし、ＡＡＶ画分からＡＡＶ９粒子を捕捉するために使用する。捕捉されたＡＡＶ９粒子は２つのステップにより検出される。最初のステップでは、ＡＤＫ８／９抗体に特異的なビオチン結合モノクローナル抗体を、（ＡＤＫ８／９とＡＤＫ８／９抗体の）免疫複合体に結合させる。ビオチン結合モノクローナル抗体に結合した免疫複合体に、ストレプトアビジンペルオキシダーゼコンジュゲートを添加すると、ストレプトアビジンペルオキシダーゼコンジュゲートがビオチンと反応する。ペルオキシダーゼ基質溶液を添加すると、結合したＡＡＶ粒子の量に比例した呈色反応が生じる。発色反応を４５０ｎｍで測光法により測定する。

【0426】

ＩＴＲ－ｑＰＣＲアッセイを用いて、目的の遺伝子（例えば、ヒト第ＶＩＩＩ因子またはヒト第ＩＸ因子）をコードするベクターに見られる逆方向タンデム反復（inverted tandem repeat）を定量化することにより、ゲノムコピータイターを測定する。ＨＥＫ－ＨＣＰは、ＥＬＩＳＡによる残留宿主細胞タンパク質の測量である。ＬＤＨは、比色活性測定法により決定される。

【0427】

Ｉｎ－ｖｉｔｒｏ生物効力アッセイでは、ウイルスベクターＡＡＶ９は肝標的細胞株に感染し、その後、その細胞は機能的で測定可能なコードされたタンパク質を培地中に分泌する。最初のステップでは、ＨｅｐＧ２標的細胞にＡＡＶ９を感染させて形質導入する。インキュベーション時間中に、コードされたタンパク質が細胞上清に放出される。第２のステップでは、細胞培養上清中のコードされたタンパク質の活性を活性アッセイにより直接測定する。ＡＡＶ９サンプルの測定値は、参照物質に対する割合（％）として示される。この方法は、ＡＡＶ９遺伝子治療ベクターの生物学的機能の定量的評価を可能にする。

【0428】

ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を行い、比較手順の代わりに洗浄ステップを含む試験手順を用いた場合に、熱ショックタンパク質７０ｋＤａ（ＨＳＰ７０）の減少があったかどうかを判定する。ウェスタンブロットは、一次抗体として抗Ｈｓｐ７０抗体（アブカム（Ａｂｃａｍ）、カタログ番号ａｂ７９８５２）を１：２０００希釈で２時間用い、二次抗体としてヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＡＰコンジュゲート（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ８０２５）を１：１０００希釈で１時間用いて行う。

【0429】

ＳＤＳ－ＰＡＧＥ銀染色アッセイを実施し、存在する不純物の全体レベルを決定する。超遠心分析（ＡＵＣ）を実施して、存在するＡＡＶ９の量を定量し、完全カプシド、空のカプシド、および完全カプシドと比較して追加のＤＮＡを有するもの、すなわち過搭載のものの相対的な量を決定する。

【0430】

試験手順および比較手順に従って精製した後に回収されたＡＡＶ９のレベルおよび純度を決定するために、１２％抗ＡＡＶ抗体を用いたウェスタンブロットを行う。ウェスタンブロットは、ＡＡＶ９のＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３に対するモノクローナル抗体を一次抗体として用い、ヤギ抗マウスＡＬＰ抗体（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ４６５６）を二次抗体として用いて行う。

【0431】

これらのアッセイを以下の表３にまとめた。

【0432】

【表3】

【実施例3】

【0433】

ＡＡＶ９の製造は、目的タンパク質のｃＤＮＡとＡＡＶ９のＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３とをコードすることを含むトリプルプラスミドシステムでトランスフェクションした後、ＨＥＫ２９３細胞株で展開された。ＡＡＶ９は、約２．６～３．０ｋＢのベクターＤＮＡを含む。清澄な無細胞培養上清を濃縮し、Ｐａｌｌ Ｏｍｅｇａ Ｔ－Ｓｅｒｉｅｓ Ｃａｓｓｅｔｔｅ １００ｋＤａで透析ろ過した。ウイルス粒子を、非結合状態、すなわち、１２５ｍＭのＮａＣｌおよび５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌを含むｐＨ８．５の溶液中で、膜吸着器（ＭｕｓｔａｎｇＱ；Ｐａｌｌ Ｐａｒｔ Ｎｕｍｂｅｒ ＸＴ１４０ＭＳＴＧＱＰ０５）にロードした。ＡＡＶ９を含むフロースルーを２５％ＨＣｌで８．２～８．７の間のｐＨ範囲に調整することにより、ｐＨ調整済みＬＯＡＤを得た。

【0434】

次の手順を行った。なお、この実施例に記載される全てのバッファーは室温で作製し、全てのバッファーのｐＨを室温で測定した。まず、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶＸアフィニティ樹脂（カタログ番号３６７４２；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）ＩＤ １６ｍｍ、ベッド高さ５０±０．５ｍｍ、面積２．０１ｃｍ^２、容量約１０ｍｌのカラムを、５カラム容量の、１００ｍＭのグリシン、２００ｍＭのＮａＣｌを含むｐＨ２．０のバッファーで活性化した。その後、少なくとも１０カラム容量の、５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、１２５ｍＭのＮａＣｌを含みｐＨ８．５のバッファーでカラムを平衡化した。ｐＨ調整済みＬＯＡＤを、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶＸアフィニティ樹脂を含むカラムにアプライした。

【0435】

その後、５カラム容量のＷａｓｈ １（Ｗ１）：５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび１２５ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．５で、室温（１８～２６℃）でカラムを洗浄した。次に、５カラム容量のＷａｓｈ ２（Ｗ２）：１００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび０．１％のＴｗｅｅｎ ８０、ｐＨ６．０で、室温（１８～２６℃）でカラムを洗浄した。次に、５カラム容量のＷａｓｈ １（Ｗ１）：５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび１２５ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．５で、室温（１８～２６℃）でカラムを洗浄した。これらすべての洗浄ステップにおいて、線流速は６０ｃｍ／時であった。

【0436】

溶出は、１０カラム容量の上記のＷ１をアプライすることにより行われたが、＋２～＋８℃のより低い温度で行われた。溶出（すなわち、下記の表４のステップ７）のために、クロマトグラフィースキッド、カラム、およびバッファーをすべて冷却キャビネット（Ｕｎｉｃｈｒｏｍａｔ １５００）に入れて、それらを＋８℃未満の温度に下げた。溶出のための線流速は５ｃｍ／時であった。その後、５カラム容量の１００ｍＭのグリシン、２００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ２．０のバッファーでカラムをストリップした。

【0437】

表４に上記の手順を詳細に記載しており、「ＣＶ」は、そのステップで添加された溶液のカラム容量数を示す。

【0438】

【表4】

【0439】

上記の手順からのクロマトグラムを図１に示す。また、表４のプロトコルによる結果を以下の表５に示す。Ｅ１プール「低温溶出液」の値は、上記表４のステップ７の後の量を反映する。「ストリップ（strip）」の値は、上記の表４のステップ９の後の量を反映する。表５は、ＡＡＶ９の有意な溶出をもたらさなかったＷ１およびＷ３が、同じバッファー（すなわち、１２５ｍＭのＮａＣｌおよび５０ｍＭ、ｐＨ８．５）を用いて室温（すなわち、＋１８～２５℃）で行われたことから、溶出が、＋２～＋８℃の温度への温度のシフトによって引き起こされることを明確に示す。

【0440】

【表5】

【0441】

さらに、表４に記載されたプロセスについて測定された不純物含有量を以下の表６に示す。不純物のサンプルは、最初のサンプルとステップ７の後に再び採取した。

【0442】

【表6】

【0443】

表７は、粒子径に基づいて決定された完全カプシドの割合（％）および過搭載カプシドの割合（％）を調べたものである。本明細書では、粒子径は、粒子の沈降速度に基づくＳｖｅｄｂｅｒｇｓの範囲で示される。

【0444】

【表7】

【0445】

本明細書では、「ｑＰＣＲ収率」という用語は、ＬＯＡＤにおけるｑＰＣＲの初期量と比較した、存在するｑＰＣＲの割合（％）を意味する。本明細書では、「抗原収率」という用語は、ＬＯＡＤにおけるＡＡＶ９の初期量と比較した、存在するＡＡＶ９の割合（％）を意味する。ｑＰＣＲによって測定された７５．８％の収率（表５）および８７．５％の完全カプシドを有するＡＡＶ９（表７）は、本実施例に記載された低温溶出プロトコルがＡＡＶ９完全カプシドの実質的な濃縮（enrichment）を提供することを示す。

【0446】

上記の手順から得られたクロマトグラムデータを、標準的な溶出手順（表８に示すように、１００ｍＭのグリシンおよび２００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ２．７）と比較し、その結果を以下の表９に示す。出発物質は両方の実施で同じものを使用した。

【0447】

【表8】

【0448】

【表9】

【0449】

表１０および表１１は、表８の標準的な溶出手順からの追加データを提供する。

【0450】

【表10】

【0451】

【表11】

【0452】

表５に示されているように、ＡＡＶ９はＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶｘ樹脂に室温（すなわち約２０～２８℃）で結合し、驚くべきことにまた予想外に、その後、結合したＡＡＶ９が、同じバッファーシステムにおいて＋１８℃超から＋８℃未満への温度シフトで溶出され得ることが見いだされた。このように、温度シフトプロトコルは、低温でマイルドな溶出を行うことで、ＡＡＶ粒子の構造および感染性を維持することができるという利点がある。同様に、マイルドな溶出バッファーの使用は、製造環境で容易に実施でき、さらに溶出ステップのためにバッファーを変更する必要がないため、より効率的である。さらに、有利なこととして、完全ＡＡＶ９カプシドは温度を下げることにより溶出するが、一方、空のＡＡＶ９ベクターおよび非特異的なＡＡＶ９ベクターは、ステップストリップ－酸性溶出で溶出されるまで結合したままであることが見いだされた（表７参照）。

【実施例4】

【0453】

実施例３は、１２５ｍＭのＮａＣｌおよび５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ８．５のバッファーを用いて、＋１８℃超から＋８℃未満への温度シフトでのＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶｘからのＡＡＶ９の溶出を実証した。この実施例は、＋１８℃超から＋８℃未満への温度シフトでのＡＡＶｘからのＡＡＶ９の溶出のための代替バッファーシステムの可能性を検討するために行った。ＡＡＶ９をＡＡＶｘ樹脂にロードした後、バッファーをまず洗浄バッファーとしてより高い温度範囲でアプライし、その後、溶出バッファーとしてより低い温度でアプライした。

【0454】

ＡＡＶ９の製造は、目的タンパク質のｃＤＮＡとＡＡＶ９のＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３とをコードすることを含むトリプルプラスミドシステムでトランスフェクションした後、ＨＥＫ２９３細胞株で展開された。ＡＡＶ９は、約２．６～３．０ｋＢのベクターＤＮＡを含む。清澄な無細胞培養上清を濃縮し、Ｐａｌｌ Ｏｍｅｇａ Ｔ－Ｓｅｒｉｅｓ Ｃａｓｓｅｔｔｅ １００ｋＤａで透析ろ過した。ウイルス粒子を、非結合状態、すなわち、１２５ｍＭのＮａＣｌおよび５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌを含むｐＨ８．５の溶液中で、膜吸着器（ＭｕｓｔａｎｇＱ；Ｐａｌｌ Ｐａｒｔ Ｎｕｍｂｅｒ ＸＴ１４０ＭＳＴＧＱＰ０５）にロードした。ＡＡＶ９を含むフロースルーを２５％ＨＣｌで８．２～８．７の間のｐＨ範囲に調整することにより、ｐＨ調整済みＬＯＡＤを得た。

【0455】

次の手順を行った。なお、この実施例に記載される全てのバッファーは室温で作製し、全てのバッファーのｐＨを室温で測定した。

【0456】

ＡＡＶ９がまだリガンドに結合していることを確かにするために、最初に、ｐＨおよび導電率を上げた３種類のバッファーを高温（＋１８～＋２８℃）でアプライした。その後、冷却キャビネット（Ｕｎｉｃｈｒｏｍａｔ １５００）にクロマトグラフィースキッド、カラム、およびバッファーをすべて入れて、それらを＋２～＋８℃に冷却した後、同じバッファーをアプライして溶出特性を調べた。まず、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶＸアフィニティ樹脂（カタログ番号：３６７４２；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を含む、ＩＤ １１ｍｍ、ベッド高さ５７ｍｍ、面積０．９５ｃｍ^２、容量約５．４ｍｌのカラムを、５カラム容量の、１００ｍＭのグリシン、２００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ２．０のバッファーで活性化した。その後、少なくとも５カラム容量の、５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、１２５ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．５のバッファーでカラムを平衡化した。ｐＨ調整済みＬＯＡＤを、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶＸアフィニティ樹脂を含むカラムにアプライした。

【0457】

その後、５カラム容量のＷａｓｈ １（Ｗ１）：５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび１２５ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．５で、室温（１８～２６℃）でカラムを洗浄した。次に、５カラム容量のＷａｓｈ ２（Ｗ２）：１００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび０．１％のＴｗｅｅｎ ８０、ｐＨ６．０で、室温（１８～２６℃）でカラムを洗浄した。次に、５カラム容量のＷａｓｈ １（Ｗ１）：５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび１２５ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．５で、室温（１８～２６℃）でカラムを洗浄した。次に、５カラム容量の洗浄液２（Ｗ２）：１００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび０．１％のＴｗｅｅｎ ８０、ｐＨ６．０で、室温（１８～２６℃）でカラムを洗浄した。これらすべての洗浄ステップにおいて、線流速は６０ｃｍ／時であった。

【0458】

溶出はまず、５カラム容量の上記のＷ２をアプライすることによって行われたが、＋２～＋８℃のより低い温度で、５ｃｍ／時の線流速で行われた。次いで、５カラム容量の以下の二次溶出バッファー：５０ｍＭのグリシン、１０ｍＭのヒスチジン、１００ｍＭのＮａＣｌ、５％のトレハロース、０．００５％のＣｒｉｌｌｅｔ ４ ＨＰ、ｐＨ７．０（ＥＬＴ－バッファー）を、＋２～＋８℃の温度でカラムにアプライした。次いで、５カラム容量の以下の溶出バッファー：５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび１２５ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．５を、＋２～＋８℃の温度でカラムにアプライした。これらの溶出ステップの線流速は３０ｃｍ／時であった。その後、５カラム容量の精製水を、やはり＋２～＋８℃の温度でカラムにアプライした。その後、グラジエント溶出を行った。精製水中の１ｍＭから２０ｍＭのＨＣｌ、２００ｍＭのＮａＣｌへの１５カラム容量のグラジエントを、２０ｃｍ／時の線流速、および＋２～＋８℃の温度で適用した。

【0459】

カラムクリーニングは、５カラム容量の以下の再生バッファー：精製水中の２０ｍＭのＨＣｌ、２００ｍＭのＮａＣｌをアプライした後、５カラム容量の５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、１２５ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．５のバッファーを６０ｃｍ／時でアプライし、続いて、５カラム容量の１Ｍ Ｌ－アルギニン塩酸塩＋２００ｍＭ ＮａＣｌを３０ｃｍ／時の線流速および＋２～＋８℃の温度でアプライすることにより行った。

【0460】

表１２に上記の手順を詳細に記載しており、「ＣＶ」は、そのステップで添加した溶液のカラム容量数を示す。

【0461】

【表12】

【0462】

上記の手順からの結果、特にカラムから溶出したＡＡＶ９の収率（％）を以下の表１３に示す。また、上記の手順からのクロマトグラムを図２Ａ～２Ｂに示す。

【0463】

【表13】

【0464】

示されているように、１２５ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ８．５以外のバッファーでも、低い温度範囲での溶出が確認される。さらに、表１２に記載のプロセスについて測定された不純物含有量を以下の表１４に示す。不純物のサンプルは、各溶出ステップ（ステップ８ａ、８ｂ、９、１０、および１２）の後に採取した。

【0465】

【表14】

【0466】

実施例３のバッファーと実施例４のバッファーの低温溶出の比較を以下の表１５に示す。

【0467】

【表15】

【0468】

【表16】

【0469】

溶出は、１００ｍＭの酢酸ナトリウム（ＮａＡｃｅａｔａ）、０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート、ｐＨ６．０を用いて、＋２～＋８℃で確認されたが、室温では確認されなかった（表１６を参照）。注目すべきは、通常はｐＨ６からｐＨ８．５へとｐＨが上昇すると溶出効率が上昇することから、低温での１００ｍＭの酢酸ナトリウムは、１２５ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ８．５とｐＨおよび導電性が逆であることである。このように、実施例４は、温度が溶出の駆動力であり、ｐＨおよび導電性は温度に比べて溶出への影響が小さいことを実証する。また、この温度シフトを利用したアフィニティ法は、完全ＡＡＶカプシドのより高い含有率をもたらすことも確認された。

【0470】

このように、実施例３および４は、ＡＡＶｘからＡＡＶ９を溶出させるための作用モードが、バッファーシステムとは無関係に、主に温度を下げることに依存することを実証する。

【実施例5】

【0471】

ＡＡＶ９のバッチ吸着を以下に記載する手順で行った。上記の２種類の樹脂を用いた２セットを、ＡＡＶ９含有溶液と室温でインキュベートして、まずＡＡＶ９を結合させ、続いて低温で溶出させた。以下の表１７にこの手順を概説する。この実施例に記載のすべてのバッファーを室温で作製し、すべてのバッファーのｐＨを室温で測定したことに留意されたい。

【0472】

実施例５のステップは以下の通りである：平衡化：０．２ｇの樹脂を１５ｍｌのファルコンチューブに挿入し、１０ｍｌの１２５ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ８．５±０．２のバッファーで洗浄した。懸濁液を５５００ＲＰＭで１０分間遠心分離（ＨＥＲＡＥＵＳ ＭＥＧＡＦＵＧＥ １６Ｒ、ＴＨＥＲＭＯ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）し、上澄みを捨てた。洗浄／平衡化した樹脂に、９．６ｇのＬＯＡＤを添加し、室温で１５時間（ｈ）～１６時間（ｈ）インキュベートした。懸濁液を５５００ＲＰＭで１０分間遠心分離した。上澄み液の一部を採取し、ＡＡＶ９抗原の検査を行った。ペレットを、１ｍｌの１２５ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ８．５±０．２（＋２℃～＋８℃）のバッファーに再懸濁させ、３０分間インキュベートした。この懸濁液を５５００ＲＰＭで１０分間遠心分離した。上澄み液の一部を採取し、ＡＡＶ９抗原の検査を行った。ＡＡＶ９は約２．６～３．０ｋＢのベクターＤＮＡを含む。溶出には、冷バッファーを使用し、実験は冷蔵室で行った。

【0473】

【表17】

【0474】

上記の手順で得られた結果、特にカラムから溶出したＡＡＶ９の収率（％）を以下の表１８に示す。

【0475】

【表18】

【0476】

さらに、第２のセットは、２種類の樹脂を用いて低温でインキュベートし、この条件での結合特性を調べた。以下の表１９にこの手順をまとめた。

【0477】

【表19】

【0478】

上記の手順で得られた結果、特にカラムから溶出したＡＡＶ９の収率を以下の表２０に示す。

【0479】

【表20】

【0480】

ＡＡＶ９はどの温度範囲でもＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶ９に結合するが、低い温度で溶出は引き起こされない。したがって、この実施例は、低温での溶出がＡＡＶ９とＡＡＶｘアフィニティ樹脂の相互作用の特徴であることを示す。

【0481】

また、ＡＡＶ８およびＡＡＶ６は、温度を＋１８℃超から＋８℃未満にシフトさせても、ＡＡＶｘ樹脂から溶出しないことが確認された。ＡＡＶ８およびＡＡＶ６がＡＡＶｘアフィニティ樹脂から溶出するためには、より過酷な条件（例えば、下記の実施例６を参照）が必要であった。

【実施例6】

【0482】

ＡＡＶ８の製造は、目的タンパク質のｃＤＮＡとＡＡＶ８のＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３とをコードすることを含むトリプルプラスミドシステムでトランスフェクションした後、ＨＥＫ２９３細胞株で展開された。清澄な無細胞培養上清を濃縮し、Ｐａｌｌ Ｏｍｅｇａ Ｔ－Ｓｅｒｉｅｓ Ｃａｓｓｅｔｔｅ １００ｋＤａで透析ろ過した。ウイルス粒子を、非結合状態、すなわち、１２５ｍＭのＮａＣｌおよび５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌを含むｐＨ８．５の溶液中で、膜吸着器（ＭｕｓｔａｎｇＱ；Ｐａｌｌ Ｐａｒｔ Ｎｕｍｂｅｒ ＸＴ１４０ＭＳＴＧＱＰ０５）にロードした。ＡＡＶ８を含むフロースルーを２５％ＨＣｌで８．３～８．７の間のｐＨ範囲に調整することにより、ｐＨ調整済みＬＯＡＤを得た。

【0483】

以下の試験手順を実施した。なお、本実施例に記載の全てのバッファーを室温で作製し、全てのバッファーのｐＨを室温で測定した。まず、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶＸアフィニティ樹脂（カタログ番号：３６７４２；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）を含む、ＩＤ １６ｍｍ、ベッド高さ５２ｍｍ、面積２．０１ｃｍ^２、容量約１０．５ｍｌのカラムを、５カラム容量の１００ｍＭのグリシン、２００ｍＭのＮａＣｌを含みｐＨ２．０のバッファーで活性化した。その後、少なくとも５カラム容量の５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、１２５ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．５のバッファーでカラムを平衡化した。ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶＸアフィニティ樹脂を含むカラムにｐＨ調整済みＬＯＡＤをアプライした。

【0484】

その後、５カラム容量のＷａｓｈ １（Ｗ１）：５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび１２５ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．５で、室温（１８～２６℃）でカラムを洗浄した。次に、５カラム容量のＷａｓｈ ２（Ｗ２）：１００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび０．１％のＴｗｅｅｎ ８０、ｐＨ６．０で、室温（１８～２６℃）でカラムを洗浄した。次に、５カラム容量のＷａｓｈ １（Ｗ１）：５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび１２５ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．５で、室温（１８～２６℃）でカラムを洗浄した。次に、５カラム容量の洗浄液２（Ｗ２）：１００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび０．１％のＴｗｅｅｎ ８０、ｐＨ６．０で、室温（１８～２６℃）でカラムを洗浄した。これらすべての洗浄ステップにおいて、線流速は６０ｃｍ／時であった。

【0485】

溶出のために、クロマトグラフィースキッド、カラム、バッファーをすべて冷却キャビネット（Ｕｎｉｃｈｒｏｍａｔ １５００）に入れて、＋８℃未満に下げた。溶出はまず、５カラム容量の上記のＷ２であるが、＋２～＋８℃の低い温度で、５ｃｍ／時の線流速でアプライして行った。次いで、５カラム容量の以下の二次溶出バッファー：５０ｍＭのグリシン、１０ｍＭのヒスチジン、１００ｍＭのＮａＣｌ、５％のトレハロース、０．００５％のＣｒｉｌｌｅｔ ４ ＨＰ、ｐＨ７．０（ＥＬＴ－バッファー）を、＋２～＋８℃の温度でカラムにアプライした。次いで、５カラム容量の以下の溶出バッファー：５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび１２５ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．５を、＋２～＋８℃の温度でカラムにアプライした。これらの溶出ステップの線流速は３０ｃｍ／時であった。その後、５カラム容量の精製水を、やはり＋２～＋８℃の温度でカラムにアプライした。その後、グラジエント溶出を行った。精製水中の１ｍＭから２０ｍＭのＨＣｌ、２００ｍＭのＮａＣｌへの１５カラム容量のグラジエントを、２０ｃｍ／時の線流速で、＋２から＋８℃の温度でアプライした。

【0486】

表２１に上記の手順を詳細に記載しており、「ＣＶ」は、そのステップで添加された溶液のカラム容量数を示す。

【0487】

【表21】

【0488】

上記の手順で得られた結果、特にカラムから溶出したＡＡＶ８の収率（％）を、以下の表２２および図３に示す。

【0489】

【表22】

【0490】

示されているように、＋２～＋８℃に温度シフトさせてもＡＡＶｘからＡＡＶ８は溶出されない。

【実施例7】

【0491】

以下の手順は、シングルウォッシュプロトコルの一例である。まず、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶＸアフィニティ樹脂（カタログ番号：３６７４２；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を含む、ＩＤ １６ｍｍ、ベッド高さ５０±０．５ｍｍ、面積２．０１ｃｍ^２、容量約１０ｍｌのカラムを、ｐＨ２．０で１００ｍＭのグリシン、２００ｍＭのＮａＣｌを含む５カラム容量のバッファーで活性化する。その後、ｐＨ８．５で５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび１２５ｍＭのＮａＣｌを含む１０カラム容量のバッファーでカラムを平衡化する。ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶＸアフィニティ樹脂を含むカラムに、ｐＨ調整済みＬＯＡＤをアプライする。

【0492】

次に、５カラム容量のＷａｓｈ １（Ｗ１）：５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび１２５ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．５で、室温（１８～２６℃）でカラムを洗浄する。溶出は、５～１０カラム容量の上記のＷ１であるが、＋２～＋８℃の低い温度でアプライして行う。その後、カラムをストリップする。

【0493】

表２３に上記の手順を詳細に記載しており、「ＣＶ」は、そのステップで添加される溶液のカラム容量数を示す。

【0494】

【表23】

【実施例8】

【0495】

以下の配列は、本開示のいくつかの実施形態によるＡＡＶ９ ＶＰ１配列の例を示す（配列番号１）。

【0496】

以下の配列は、本開示のいくつかの実施形態によるＡＡＶ９ ＶＰ２配列の例を示し、ＡＡＶ９ ＶＰ２配列は、配列番号２の配列を含む。

【0497】

以下の配列は、本開示のいくつかの実施形態によるＡＡＶ９ ＶＰ２配列の例を示し、ＡＡＶ９ ＶＰ３配列は、配列番号３の配列を含む。

【0498】

本明細書で引用されている出版物、特許出願、および特許を含むすべての参考文献は、各参考文献が個別にかつ具体的に参考文献として示され、その全体が本書に記載されている場合と同程度に、ここに参考文献として組み込まれる。
最後に、本発明の好ましい実施態様を項分け記載する。
［実施態様１］
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を精製する方法であって、
（ａ）ＡＡＶ含有溶液を、ＡＡＶを標的とするアフィニティ樹脂に、室温で、溶液中のＡＡＶとアフィニティ樹脂との間の結合を可能にする条件下でロードするステップ；
（ｂ）室温で、少なくとも１つの洗浄ステップを行うステップ；および
（ｃ）１８℃未満の温度で、アフィニティ樹脂からＡＡＶを溶出するステップ；
を含む、方法。
［実施態様２］
ステップ（ｃ）における温度が１℃～１２℃である、実施態様１に記載の方法。
［実施態様３］
ステップ（ｃ）における温度が２℃～８℃である、実施態様１に記載の方法。
［実施態様４］
ＡＡＶ含有溶液をアフィニティ樹脂にロードする前に、ＡＡＶ含有溶液を陰イオン交換体と接触させること、および陰イオン交換体からＡＡＶ含有溶液を溶出させることをさらに含む、実施態様１～３のいずれかに記載の方法。
［実施態様５］
室温で少なくとも２つの洗浄ステップが行われる、実施態様１～４のいずれかに記載の方法。
［実施態様６］
室温で少なくとも３つの洗浄ステップが行われる、実施態様１～５のいずれかに記載の方法。
［実施態様７］
室温で少なくとも４つの洗浄ステップ行われる、実施態様１～６のいずれかに記載の方法。
［実施態様８］
２つの洗浄ステップが行われる、実施態様５に記載の方法。
［実施態様９］
３つの洗浄ステップが行われる、実施態様６に記載の方法。
［実施態様１０］
４つの洗浄ステップが行われる、実施態様７に記載の方法。
［実施態様１１］
前記洗浄ステップが連続して行われる、実施態様５～１０のいずれかに記載の方法。
［実施態様１２］
少なくとも１つの洗浄バッファーが、約１０ｍＭ～約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約５０ｍＭ～約５００ｍＭの塩を含む、実施態様１～１１のいずれかに記載の方法。
［実施態様１３］
少なくとも１つの洗浄バッファーが、約２５ｍＭ～約１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約７５ｍＭ～約２５０ｍＭの塩を含む、実施態様１２に記載の方法。
［実施態様１４］
少なくとも１つの洗浄バッファーが、約４０ｍＭ～約６０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１００ｍＭ～約１５０ｍＭの塩を含む、実施態様１３に記載の方法。
［実施態様１５］
少なくとも１つの洗浄バッファーが、約７．５～約９．２、約８．０～約９．０、または約８．０～約８．８のｐＨを有する、実施態様１２～１４のいずれかに記載の方法。
［実施態様１６］
少なくとも１つの洗浄バッファーが、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１２５ ｍＭの塩を含み、約８．５のｐＨを有する、実施態様１５に記載の方法。
［実施態様１７］
少なくとも１つの洗浄バッファーが、約１０ｍＭ～約２０００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．００１％～約１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む、実施態様１～１６のいずれかに記載の方法。
［実施態様１８］
少なくとも１つの洗浄バッファーが、約５０ｍＭ～約２００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．００５％～約０．３％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む、実施態様１７に記載の方法。
［実施態様１９］
少なくとも１つの洗浄バッファーが、約９０ｍＭ～約１１０ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．０５％～約０．２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む、実施態様１８に記載の方法。
［実施態様２０］
少なくとも１つの洗浄バッファーが、約５．０～約７．４、約５．５～約７．０、または約５．５～約６．５のｐＨを有する、実施態様１７～１９のいずれかに記載の方法。
［実施態様２１］
少なくとも１つの洗浄バッファーが、約１００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含み、約６．０のｐＨを有する、実施態様２０に記載の方法。
［実施態様２２］
少なくとも１つの洗浄バッファーが、約１０ｍＭ～約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１０％～約７５％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含む、実施態様１～２１のいずれかに記載の方法。
［実施態様２３］
少なくとも１つの洗浄バッファーが、約２５ｍＭ～約１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約２５％～約７０％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含む、実施態様２２に記載の方法。
［実施態様２４］
少なくとも１つの洗浄バッファーが、約４０ｍＭ～約６０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約４０％～約６０％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含む、実施態様２３に記載の方法。
［実施態様２５］
少なくとも１つの洗浄バッファーが、約７．５～約９．２、約８．０～約９．０、または約８．０～約８．８のｐＨを有する、実施態様２２～２４のいずれかに記載の方法。
［実施態様２６］
少なくとも１つの洗浄バッファーが、約５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌおよび約５０％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含み、約８．５のｐＨを有する、実施態様２５に記載の方法。
［実施態様２７］
少なくとも１つの洗浄バッファーが、約１０ｍＭ～約２００ｍＭのグリシン、約１ｍＭ～約１００ｍＭのヒスチジン、約２０ｍＭ～約５００ｍＭの塩、約１％～約１０％（ｗ／ｗ）のトレハロース、および約０．０００５％～約１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む、実施態様１～２６のいずれかに記載の方法。
［実施態様２８］
少なくとも１つの洗浄バッファーが、約３０ｍＭ～約８０ｍＭのグリシン、約５ｍＭ～約２０ｍＭのヒスチジン、約５０ｍＭ～約２００ｍＭの塩、約３％～約８％（ｗ／ｗ）のトレハロース、および約０．００１％～約０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む、実施態様２７に記載の方法。
［実施態様２９］
少なくとも１つの洗浄バッファーが、約４０ｍＭ～約６０ｍＭのグリシン、約５ｍＭ～約１５ｍＭのヒスチジン、約９０ｍＭ～約１１０ｍＭの塩、約４％～約６％（ｗ／ｗ）のトレハロース、および約０．００１％～約０．０５％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む、実施態様２８に記載の方法。
［実施態様３０］
少なくとも１つの洗浄バッファーが、約６．０～約８．０、約６．５～約７．５、または約７．０～約７．４のｐＨを有する、実施態様２７～２９のいずれかに記載の方法。
［実施態様３１］
少なくとも１つの洗浄バッファーが、約５０ｍＭのグリシン、約１０ｍＭのヒスチジン、約１００ｍＭの塩、約５％（ｗ／ｗ）のトレハロース、約０．００５％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含み、約７．０のｐＨを有する、実施態様３０に記載の方法。
［実施態様３２］
少なくとも１つの洗浄バッファーが、約１ｍＭ～約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、約５０ｍＭ～約５００ｍＭの塩、および約０．００１％～約１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む、実施態様１～３１のいずれかに記載の方法。
［実施態様３３］
少なくとも１つの洗浄バッファーが、約５ｍＭ～約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、約７５ｍＭ～約２５０ｍＭの塩、および約０．００５％～約０．３％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む、実施態様３２に記載の方法。
［実施態様３４］
少なくとも１つの洗浄バッファーが、約１０ｍＭ～約３０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、約１４０ｍＭ～約１６０ｍＭの塩、および約０．０５％～約０．２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む、実施態様３３に記載の方法。
［実施態様３５］
少なくとも１つの洗浄バッファーが、約６．０～約８．８、約６．５～約８．５、または約７．０～約８．０のｐＨを有する、実施態様３２～３４のいずれかに記載の方法。
［実施態様３６］
少なくとも１つの洗浄バッファーが、約２０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、約１５０ｍＭの塩、および約０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含み、約７．４のｐＨを有する、実施態様３５に記載の方法。
［実施態様３７］
ステップ（ｃ）が、少なくとも１つの溶出バッファーでＡＡＶを溶出することを含む、実施態様１～３６のいずれかに記載の方法。
［実施態様３８］
少なくとも１つの溶出バッファーが、洗浄バッファーの少なくとも１つと同じである、実施態様３７に記載の方法。
［実施態様３９］
少なくとも１つの溶出バッファーが、ステップ（ｃ）においてＡＡＶを溶出する前の最終洗浄ステップで使用される最後の洗浄バッファーと同じである、実施態様３８に記載の方法。
［実施態様４０］
第１の溶出バッファーが、ステップ（ｃ）においてＡＡＶを溶出する前の最終洗浄ステップで使用される最後の洗浄バッファーと同じである、実施態様３８に記載の方法。
［実施態様４１］
少なくとも１つの溶出バッファーが、約１０ｍＭ～約２００ｍＭのグリシン、約１ｍＭ～約１００ｍＭのヒスチジン、約２０ｍＭ～約５００ｍＭの塩、約１％～約１０％（ｗ／ｗ）のトレハロース、および約０．０００５％～約１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む、実施態様３７～４０のいずれかに記載の方法。
［実施態様４２］
少なくとも１つの溶出バッファーが、約３０ｍＭ～約８０ｍＭのグリシン、約５ｍＭ～約２０ｍＭのヒスチジン、約５０ｍＭ～約２００ｍＭの塩、約３％～約８％のトレハロース、および約０．００１％～約０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む、実施態様４１に記載の方法。
［実施態様４３］
少なくとも１つの溶出バッファーが、約４０ｍＭ～約６０ｍＭのグリシン、約５ｍＭ～約１５ｍＭのヒスチジン、約９０ｍＭ～約１１０ｍＭの塩、約４％～約６％（ｗ／ｗ）のトレハロース、および約０．００１％～約０．０５％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む、実施態様４２に記載の方法。
［実施態様４４］
少なくとも１つの溶出バッファーが、約６．０～約８．０、約６．５～約７．５、または約７．０～約７．４のｐＨを有する、実施態様４１～４３のいずれかに記載の方法。
［実施態様４５］
少なくとも１つの溶出バッファーが、約５０ｍＭのグリシン、約１０ｍＭのヒスチジン、約１００ｍＭの塩、約５％（ｗ／ｗ）のトレハロース、および約０．００５％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含み、約７．０のｐＨを有する、実施態様４４に記載の方法。
［実施態様４６］
少なくとも１つの溶出バッファーが、約１ｍＭ～約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、約５０ｍＭ～約５００ｍＭの塩、および約０．００１％～約１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む、実施態様３７～４５のいずれかに記載の方法。
［実施態様４７］
少なくとも１つの溶出バッファーが、約５ｍＭ～約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、約７５ｍＭ～約２５０ｍＭの塩、および約０．００５％～約０．３％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む、実施態様４６に記載の方法。
［実施態様４８］
少なくとも１つの溶出バッファーが、約１０ｍＭ～約３０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、約１４０ｍＭ～約１６０ｍＭの塩、および約０．０５％～約０．２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む、実施態様４７に記載の方法。
［実施態様４９］
少なくとも１つの溶出バッファーが、約６．０～約８．８、約６．５～約８．５、または約７．０～約８．０のｐＨを有する、実施態様４６～４８のいずれかに記載の方法。
［実施態様５０］
少なくとも１つの溶出バッファーが、約２０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ、約１５０ ｍＭの塩、および約０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含み、約７．４のｐＨを有する、実施態様４９に記載の方法。
［実施態様５１］
第１および第３の洗浄ステップが、約１０ｍＭ～約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約５０ｍＭ～約５００ｍＭの塩を含みかつ約７．５～約９．２のｐＨを有するバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含み、
第２の洗浄ステップが、約１０ｍＭ～約２０００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．００１％～約１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含みかつ約５．０～約７．４のｐＨを有するバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む、実施態様１～５０のいずれかに記載の方法。
［実施態様５２］
第１および第３の洗浄ステップが、約１０ｍＭ～約２０００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．００％１～約１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含みかつ約５．０～約７．４のｐＨを有するバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含み、
第２の洗浄ステップが、約１０ｍＭ～約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約５０ｍＭ～約５００ｍＭの塩を含みかつ約７．５～約９．２のｐＨを有するバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む、実施態様１～５０のいずれかに記載の方法。
［実施態様５３］
第１および第３の洗浄ステップが、約１０ｍＭ～約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約５０ｍＭ～約５００ｍＭの塩を含みかつ約７．５～約９．２のｐＨを有するバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含み、
第２および第４の洗浄ステップが、約１０ｍＭ～約２０００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．００１％～約１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含みかつ約５．０～約７．４のｐＨを有するバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む、実施態様１～５０のいずれかに記載の方法。
［実施態様５４］
第１および第３の洗浄ステップが、約１０ｍＭ～約２０００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．００１％～約１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含みかつ約５．０～約７．４のｐＨを有するバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含み、
第２および第４の洗浄ステップが、約１０ｍＭ～約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約５０ｍＭ～約５００ｍＭの塩を含みかつ約７．５～約９．２のｐＨを有するバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む、実施態様１～５０のいずれかに記載の方法。
［実施態様５５］
第１および第３の洗浄ステップでそれぞれ使用される第１および第３のバッファーが、それぞれ、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１２５ｍＭの塩を含み、約８．５のｐＨを有する、実施態様５１または実施態様５３に記載の方法。
［実施態様５６］
第１および第３の洗浄ステップでそれぞれ使用される第１および第３のバッファーが、それぞれ、約１００ｍＭの酢酸ナトリウム、約０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含み、約６．０のｐＨを有する、実施態様５２または５４に記載の方法。
［実施態様５７］
第２の洗浄ステップで使用される第２のバッファーが、約１００ｍＭの酢酸ナトリウム、約０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含み、約６．０のｐＨを有する、実施態様５１または５３に記載の方法。
［実施態様５８］
第２の洗浄ステップで使用される第２のバッファーが、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１２５ｍＭの塩を含み、約８．５のｐＨを有する、実施態様５２または５４に記載の方法。
［実施態様５９］
第４の洗浄ステップで使用される第４のバッファーが、約１００ｍＭの酢酸ナトリウム、約０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含み、約６．０のｐＨを有する、実施態様５３に記載の方法。
［実施態様６０］
第４の洗浄ステップで使用される第４のバッファーが、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１２５ｍＭの塩を含み、約８．５のｐＨを有する、実施態様５４に記載の方法。
［実施態様６１］
ステップ（ｃ）が、約１０ｍＭ～約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約５０ｍＭ～約５００ｍＭの塩を含みかつ約７．５～約９．２のｐＨを有するバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む、実施態様５１または５４に記載の方法。
［実施態様６２］
ステップ（ｃ）が、約１０ｍＭ～約２０００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約０．００１％～約１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含みかつ約５．０～約７．４のｐＨを有するバッファーをアフィニティ樹脂にアプライすることを含む、実施態様５２または５３に記載の方法。
［実施態様６３］
前記バッファーが、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１２５ ｍＭの塩を含み、約８．５のｐＨを有する、実施態様６１に記載の方法。
［実施態様６４］
前記バッファーが、約１００ｍＭの酢酸ナトリウム、約０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含み、約６．０のｐＨを有する、実施態様６２に記載の方法。
［実施態様６５］
前記塩が、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ _２ 、ＣａＣｌ _２ 、クエン酸ナトリウム、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、酢酸ナトリウム、ならびにＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ _２ 、ＣａＣｌ _２ 、クエン酸ナトリウム、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、および酢酸ナトリウムのうちの１つまたは複数の組み合わせから選択される、実施態様１２～６４のいずれかに記載の方法。
［実施態様６６］
前記塩がＮａＣｌである、実施態様６５に記載の方法。
［実施態様６７］
前記バッファーが、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび約１２５ｍＭのＮａＣｌを含み、約８．５のｐＨを有する、実施態様１２～１６、５１～５５、５８、６０、または６１のいずれかに記載の方法。
［実施態様６８］
溶出ステップから得られるＡＡＶが、９９．０％以上の純度レベルを有する、実施態様１～６７のいずれかに記載の方法。
［実施態様６９］
溶出ステップから得られるＡＡＶが、９９．９％以上の純度レベルを有する、実施態様１～６８のいずれかに記載の方法。
［実施態様７０］
溶出ステップ（ｃ）から溶出されるＡＡＶカプシドの少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％が、完全ＡＡＶカプシドである、実施態様１～６９のいずれかに記載の方法。
［実施態様７１］
前記アフィニティ樹脂がＡＡＶｘ樹脂である、実施態様１～７０のいずれかに記載の方法。
［実施態様７２］
ＡＡＶがＡＡＶ９である、実施態様１～７１のいずれかに記載の方法。
［実施態様７３］
ＡＡＶ９が、配列番号１、配列番号２および／または配列番号３の配列を含むペプチドを含む、実施態様７２に記載の方法。
［実施態様７４］
実施態様１～７３のいずれかに記載の方法により製造されたＡＡＶ生成物。

【図1-1】

【図1-2】

【図1-3】

【図2A】

【図2B】

【図3-1】

【図3-2】

【図3-3】

【配列表】

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