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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-08-19
(45)【発行日】2024-08-27
(54)【発明の名称】温度応答性液状培地組成物
(51)【国際特許分類】
C12N 5/07 20100101AFI20240820BHJP
C12N 5/09 20100101ALI20240820BHJP
【ＦＩ】
C12N5/07
C12N5/09
【請求項の数】
7
(21)【出願番号】P 2021509631
(86)(22)【出願日】2020-03-27
(86)【国際出願番号】 JP2020013981
(87)【国際公開番号】W WO2020196827
(87)【国際公開日】2020-10-01
【審査請求日】2023-03-23
(31)【優先権主張番号】P 2019065075
(32)【優先日】2019-03-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】000003986
【氏名又は名称】日産化学株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100080791
【弁理士】
【氏名又は名称】高島 一
(74)【代理人】
【識別番号】100136629
【弁理士】
【氏名又は名称】鎌田 光宜
(74)【代理人】
【識別番号】100125070
【弁理士】
【氏名又は名称】土井 京子
(74)【代理人】
【識別番号】100121212
【弁理士】
【氏名又は名称】田村 弥栄子
(74)【代理人】
【識別番号】100174296
【弁理士】
【氏名又は名称】當麻 博文
(74)【代理人】
【識別番号】100137729
【弁理士】
【氏名又は名称】赤井 厚子
(74)【代理人】
【識別番号】100151301
【弁理士】
【氏名又は名称】戸崎 富哉
(72)【発明者】
【氏名】畑中 大輔
【審査官】斉藤 貴子
(56)【参考文献】
【文献】欧州特許出願公開第０２６９８４２９（ＥＰ，Ａ１）
【文献】特開平０７－０３１４９１（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開平０８－２８３３０５（ＪＰ，Ａ）
【文献】矢追 克郎，キシログルカンとそのオリゴ糖，応用糖質科学，2012年，Vol.2, No.3，P.185-190
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ガラクトキシログルカンのガラクトース部分分解物を含む、温度応答性液状培地組成物であって、ガラクトキシログルカンのガラクトース部分分解物におけるグルコース及びガラクトースの含有比率（ｍｏｌ）が、グルコース：ガラクトース＝１：０．１５０～０．２５０であり、細胞又は組織の浮遊培養用である液状培地組成物。
【請求項2】
液状培地組成物におけるガラクトキシログルカンのガラクトース部分分解物の終濃度が、０．０５～４．０重量％である、請求項１記載の液状培地組成物。
【請求項3】
浮遊培養が静置浮遊培養である、請求項１又は２記載の液状培地組成物。
【請求項4】
以下の工程を含む、細胞又は組織の培養方法：（１）ガラクトキシログルカンのガラクトース部分分解物を含む温度応答性液状培地組成物中で細胞又は組織を浮遊培養する工程であって、該液状培地組成物のゾル－ゲル転移温度を超える温度下で細胞又は組織を培養する、工程（ここでガラクトキシログルカンのガラクトース部分分解物におけるグルコース及びガラクトースの含有比率（ｍｏｌ）が、グルコース：ガラクトース＝１：０．１５０～０．２５０である）。
【請求項5】
液状培地組成物におけるガラクトキシログルカンのガラクトース部分分解物の終濃度が、０．０５～４．０重量％である、請求項４記載の方法。
【請求項6】
浮遊培養が静置浮遊培養である、請求項４又は５記載の方法。
【請求項7】
さらに以下の工程を含む、請求項４～６のいずれか一項記載の方法：（２）（１）の工程後、液状培地組成物を冷却し、該液状培地組成物の粘度を低下させる工程、及び
（３）該液状培地組成物から細胞又は組織を分離する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、温度応答性の液状培地組成物及びそれを用いた細胞の培養方法等に関する。
【背景技術】
【0002】
細胞を用いた再生医療技術は、これまでに治療することが困難であった様々な疾病や損傷を治療し得る手段の一つとして、近年、非常に注目されている。再生医療には大量の細胞を必要とするため、細胞を効率良く培養する方法の開発が意欲的に進められている。
【0003】
再生医療の発展には、細胞の効率的な培養法の開発が重要な課題であることは論を待たないが、該課題と並行して、培養した細胞を効率良く回収する方法の開発もまた、非常に重要な課題として認識されている。
【0004】
細胞を効率良く回収するための方法の一態様として、温度応答性を有する培養基材の使用が提案されている。例えば、特許文献１には、温度応答性（下限臨界溶解温度（Ｌｏｗｅｒ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（ＬＣＳＴ））：約３２℃）を有するポリ－Ｎ－イソプロピルアクリルアミド（ＰＮＩＰＡＭ）を培養容器表面に固定化することで、タンパク質分解酵素（ペプシン、トリプシン、ペプチダーゼ等）やキレート剤（ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸））等を用いずに、接着性細胞の培養容器表面からの剥離及び回収が可能となることが報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【文献】特開平２－２１１８６５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
特許文献１に開示される方法を含め、従来の温度応答性を有する細胞培養基材を用いての細胞培養方法及び細胞回収方法は、その使用が２次元培養に限定されるものが多数であり、より生体内に近い、好ましい培養方法である３次元培養（例、浮遊培養）に適用できるようなものは報告がない。そこで、本発明は、細胞を浮遊状態で培養することができ、さらに細胞にダメージを与えることなく簡便に回収できる新規手段の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者らは、上記課題に対して鋭意検討した結果、特定の割合でガラクトースを部分的に除去したガラクトキシログルカンを特定の濃度で含有する液状の培地組成物が、（１）ゾル－ゲル転移温度を超える温度下において細胞を好ましく浮遊培養させることができ、更に当該状態では細胞が非常に効率的に増殖すること、（２）該培地組成物をゾル－ゲル転移温度を下回る温度下におくことで、培地組成物の粘性が低下する結果、極めて効率よく細胞と培地組成物を分離できること等を見出し、かかる知見に基づいてさらに研究を進めることによって本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
すなわち、本発明は以下の通りである。
【0008】
［１］ガラクトキシログルカンのガラクトース部分分解物を含む、温度応答性液状培地組成物。
［２］ガラクトキシログルカンのガラクトース部分分解物におけるグルコース及びガラクトースの含有比率（ｍｏｌ）が、グルコース：ガラクトース＝１：０．１５０～０．２５０である、［１］記載の液状培地組成物。
［３］液状培地組成物におけるガラクトキシログルカンのガラクトース部分分解物の終濃度が、０．０５～４．０重量％である、［１］又は［２］記載の液状培地組成物。
［４］細胞又は組織の浮遊培養用である、［１］～［３］のいずれか記載の液状培地組成物。
［５］以下の工程を含む、細胞又は組織の培養方法：
（１）ガラクトキシログルカンのガラクトース部分分解物を含む温度応答性液状培地組成物中で細胞又は組織を浮遊培養する工程であって、該液状培地組成物のゾル－ゲル転移温度を超える温度下で細胞又は組織を培養する、工程。
［６］ガラクトキシログルカンのガラクトース部分分解物におけるグルコース及びガラクトースの含有比率（ｍｏｌ）が、グルコース：ガラクトース＝１：０．１５０～０．２５０である、［５］記載の方法。
［７］液状培地組成物におけるガラクトキシログルカンのガラクトース部分分解物の終濃度が、０．０５～４．０重量％である、［５］又は［６］記載の方法。
［８］さらに以下の工程を含む、［５］～［７］のいずれか記載の方法：
（２）（１）の工程後、液状培地組成物を冷却し、該液状培地組成物の粘度を低下させる工程、及び
（３）該液状培地組成物から細胞又は組織を分離する工程。
［２］ガラクトキシログルカンのガラクトース部分分解物におけるグルコース及びガラクトースの含有比率（ｍｏｌ）が、グルコース：ガラクトース＝１：０．１５０～０．２５０である、［１］記載の液状培地組成物。
［３］液状培地組成物におけるガラクトキシログルカンのガラクトース部分分解物の終濃度が、０．０５～４．０重量％である、［１］又は［２］記載の液状培地組成物。
［４］細胞又は組織の浮遊培養用である、［１］～［３］のいずれか記載の液状培地組成物。
［５］以下の工程を含む、細胞又は組織の培養方法：
（１）ガラクトキシログルカンのガラクトース部分分解物を含む温度応答性液状培地組成物中で細胞又は組織を浮遊培養する工程であって、該液状培地組成物のゾル－ゲル転移温度を超える温度下で細胞又は組織を培養する、工程。
［６］ガラクトキシログルカンのガラクトース部分分解物におけるグルコース及びガラクトースの含有比率（ｍｏｌ）が、グルコース：ガラクトース＝１：０．１５０～０．２５０である、［５］記載の方法。
［７］液状培地組成物におけるガラクトキシログルカンのガラクトース部分分解物の終濃度が、０．０５～４．０重量％である、［５］又は［６］記載の方法。
［８］さらに以下の工程を含む、［５］～［７］のいずれか記載の方法：
（２）（１）の工程後、液状培地組成物を冷却し、該液状培地組成物の粘度を低下させる工程、及び
（３）該液状培地組成物から細胞又は組織を分離する工程。
【発明の効果】
【0009】
本発明によれば、効率よく細胞を拡大培養することができる。また、培養した細胞は、温度変化と遠心分離等の簡単な分離操作のみにより、極めて効率良く回収することができる。また、細胞の回収時に、細胞を強制的に剥離する工程（例、酵素及び／又はキレート剤による剥離処理や物理的な剥離処理）を含まないため、回収時に細胞に与えるダメージを大きく低減させることができる。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1】図１は、室温、３７℃（１０分間）、又は３７℃（３０分間）の温度条件下で静置したときの、調製例２で調製したＰＤ－ＧＸＧ水溶液の外観を示す写真図である（試験例２）。該水溶液は室温では低粘性の液体である。３７℃に１０分間静置後、該水溶液の粘性は高まりつつある状態である。３７℃に３０分間静置後、該水溶液は高粘性の液体となる。
【発明を実施するための形態】
【0011】
以下、本発明を詳細に説明する。尚、本明細書において「室温」とは、１５℃～２５℃を意味するものとする。
【0012】
１．温度応答性液状培地組成物
本発明は、ガラクトキシログルカンのガラクトース部分分解物を含む、温度応答性液状培地組成物（本明細書において「本発明の培地組成物」と称することがある）を提供する。
本発明は、ガラクトキシログルカンのガラクトース部分分解物を含む、温度応答性液状培地組成物（本明細書において「本発明の培地組成物」と称することがある）を提供する。
【0013】
本発明の培地組成物は、ガラクトキシログルカンのガラクトース部分分解物を含有する。
【0014】
本明細書における「ガラクトキシログルカン（以下、「ＧＸＧ」と称することがある）」とは、グルコース、キシロース及びガラクトースを構成糖とし、その主鎖は、β－１，４結合したグルコースであり、側鎖は、キシロースと、そのキシロースに結合したガラクトースとを有している。ガラクトキシログルカンは、双子葉植物及び単子葉植物等の高等植物の細胞壁に存在する天然の多糖であり、タマリンドをはじめ、大豆、緑豆、インゲンマメ、イネ、オオムギ、リンゴ等から抽出される。入手し易く、含有量も多いことから、タマリンド由来のガラクトキシログルカンが好ましい。かかるガラクトキシログルカンとしては、市販されているタマリンド種子ガム（「グリロイド」、大日本住友製薬）が挙げられるが、これに限定されない。
【0015】
【化1】
【0016】
また、本明細書における「ガラクトキシログルカンのガラクトース部分分解物（以下、「ＰＤ－ＧＸＧ」と称することがある）」とは、ガラクトキシログルカンの側鎖に存在するガラクトースを部分的に分解、除去した物質を意味する。
【0017】
【化2】
【0018】
本発明の培地組成物に用いられるＰＤ－ＧＸＧは、自体公知の方法により製造することができる。一例としては、特開平８－２８３３０５号公報に記載の方法を例示することができる。簡潔には、ガラクトキシログルカンを用いて、その側鎖ガラクトースを酵素的に若しくは化学的に、好ましくは酵素的に部分分解することにより製造することができる。反応時間は基質濃度、酵素濃度、ｐＨ等に依存するので、当業者であれば、かかるパラメーターを調節することで反応時間を適宜設定ことができる。
【0019】
本発明の培地組成物に用いられるＰＤ－ＧＸＧの構成糖の含有比率（モル比率）、具体的にはグルコース及びガラクトースの含有比率（モル比率）としては、通常、グルコース：ガラクトース＝１：０．１５０～０．２５０、好ましくは、グルコース：ガラクトース＝１：０．１６０～０．２４０、より好ましくは、グルコース：ガラクトース＝１：０．１７０～０．２３０、さらに好ましくは、グルコース：ガラクトース＝１：０．１８０～０．２３０、特に好ましくは、グルコース：ガラクトース＝１：０．１９１～０．２２６であり得る。
【0020】
尚、ＰＤ－ＧＸＧの構成糖の含有比率は自体公知の方法により決定することができる。一例としては、後述する実施例に記載されている方法を用いることができるが、これに限定されない。
【0021】
本発明の培地組成物中に含まれるＰＤ－ＧＸＧの濃度は、培養する細胞種若しくは組織又は培養条件を考慮して適宜調整して使用すれば良いが、培地組成物に対して、通常、終濃度０．０５～４．０重量％、より好ましくは、終濃度０．１０～３．０重量％、さらに好ましくは、終濃度０．１５～２．０重量％、特に好ましくは、終濃度０．２～１．０重量％であり得る。
【0022】
以下の実施例において詳述される通り、ＰＤ－ＧＸＧは温度変化に応じてゾル又はゲルの形態となり得る。従って、ＰＤ－ＧＸＧを含有する本発明の培地組成物は温度に応答してその粘弾性が大きく変化し得る（ただし、本発明の培地組成物は細胞の培養時の温度（例、３７℃）であってもゲル（即ち、固体）とはならず、ＰＤ－ＧＸＧの自己組織化により生じた３次元構造体の生成に起因する高い粘弾性を有する流動性の液体の状態（即ち、貯蔵弾性率が損失弾性率よりも高い値を示す状態）で存在する）。本発明の培地組成物におけるゾル－ゲル転移温度は、ＰＤ－ＧＸＧの構成糖の比率及び培地中のＰＤ－ＧＸＧの濃度等によっても影響を受け得るが、通常は、１５～３５℃であり得る。
【0023】
本発明の培地組成物において、ＰＤ－ＧＸＧが配合され得る培地は、特に限定されず、培養する細胞種又は組織に応じて適宜選択すればよい。本発明の培地組成物に使用され得る培地としては、以下の培地が含まれ得るが、これらに限定されない：ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ；ＤＭＥＭ）、ハムＦ１２培地（Ｈａｍ’ｓ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ１２）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、マッコイ５Ａ培地（ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ Ｍｅｄｉｕｍ）、イーグルＭＥＭ培地（Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ；ＥＭＥＭ）、αＭＥＭ培地（ａｌｐｈａ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ；αＭＥＭ）、ＭＥＭ培地（Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ；ＩＭＤＭ）、ＭＣＤＢ１３１培地、ウィリアム培地Ｅ、ＩＰＬ４１培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、ＳｔｅｍＰｒｏ３４（インビトロジェン社製）、Ｘ－ＶＩＶＯ １０（ケンブレックス社製）、Ｘ－ＶＩＶＯ １５（ケンブレックス社製）、ＨＰＧＭ（ケンブレックス社製）、ＳｔｅｍＳｐａｎ Ｈ３０００（ステムセルテクノロジー社製）、ＳｔｅｍＳｐａｎＳＦＥＭ（ステムセルテクノロジー社製）、ＳｔｅｍｌｉｎｅＩＩ（シグマアルドリッチ社製）、ＱＢＳＦ－６０（クオリティバイオロジカル社製）、ＳｔｅｍＰｒｏｈＥＳＣＳＦＭ（インビトロジェン社製）、ｍＴｅＳＲ１或いは２培地（ステムセルテクノロジー社製）、Ｓｆ－９００ＩＩ（インビトロジェン社製）、Ｏｐｔｉ－Ｐｒｏ（インビトロジェン社製）、ムラシゲ・スクーグ（ＭＳ）培地、リンズマイヤー・スクーグ（ＬＳ）培地、ホワイト培地、ガンボーグＢ５培地、ニッチェ培地、ヘラー培地、モーレル培地等の基本培地、或いは、これら培地成分を至適濃度に修正した修正培地（例えば、アンモニア態窒素濃度を半分にする等）に、オーキシン類及び必要に応じてサイトカイニン類等の植物生長調節物質（植物ホルモン）を適当な濃度で添加した培地。
【0024】
上記の培地には、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、リン、塩素、各種アミノ酸、各種ビタミン、抗生物質、血清、脂肪酸、糖などを当業者は目的に応じて自由に添加してもよい。動物由来の細胞及び／又は組織培養の際には、当業者は目的に応じてその他の化学成分あるいは生体成分を一種類以上組み合わせて添加することもできる。動物由来の細胞及び／又は組織の培地に添加される成分としては、ウシ胎児血清、ヒト血清、ウマ血清、インシュリン、トランスフェリン、ラクトフェリン、コレステロール、エタノールアミン、亜セレン酸ナトリウム、モノチオグリセロール、２－メルカプトエタノール、ウシ血清アルブミン、ピルビン酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、各種ビタミン、各種アミノ酸、寒天、アガロース、コラーゲン、メチルセルロース、各種サイトカイン、各種ホルモン、各種増殖因子、各種細胞外マトリックスや各種細胞接着分子などが挙げられる。培地に添加されるサイトカインとしては、例えばインターロイキン－１（ＩＬ－１）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インターロイキン－３（ＩＬ－３）、インターロイキン－４（ＩＬ－４）、インターロイキン－５（ＩＬ－５）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、インターロイキン－７（ＩＬ－７）、インターロイキン－８（ＩＬ－８）、インターロイキン－９（ＩＬ－９）、インターロイキン－１０（ＩＬ－１０）、インターロイキン－１１（ＩＬ－１１）、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン－１３（ＩＬ－１３）、インターロイキン－１４（ＩＬ－１４）、インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）、インターロイキン－１８（ＩＬ－１８）、インターロイキン－２１（ＩＬ－２１）、インターフェロン－α（ＩＦＮ－α）、インターフェロン－β（ＩＦＮ－β）、インターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、単球コロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ｆｌｋ２／ｆｌｔ３リガンド（ＦＬ）、白血病細胞阻害因子（ＬＩＦ）、オンコスタチンＭ（ＯＭ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）などが挙げられるが、これらに限られるわけではない。
【0025】
培地に添加されるホルモンとしては、メラトニン、セロトニン、チロキシン、トリヨードチロニン、エピネフリン、ノルエピネフリン、ドーパミン、抗ミュラー管ホルモン、アディポネクチン、副腎皮質刺激ホルモン、アンギオテンシノゲン及びアンギオテンシン、抗利尿ホルモン、心房ナトリウム利尿性ペプチド、カルシトニン、コレシストキニン、コルチコトロピン放出ホルモン、エリスロポイエチン、卵胞刺激ホルモン、ガストリン、グレリン、グルカゴン、ゴナドトロピン放出ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、ヒト胎盤性ラクトーゲン、成長ホルモン、インヒビン、インスリン、インスリン様成長因子、レプチン、黄体形成ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン、オキシトシン、副甲状腺ホルモン、プロラクチン、セクレチン、ソマトスタチン、トロンボポイエチン、甲状腺刺激ホルモン、チロトロピン放出ホルモン、コルチゾール、アルドステロン、テストステロン、デヒドロエピアンドロステロン、アンドロステンジオン、ジヒドロテストステロン、エストラジオール、エストロン、エストリオール、プロゲステロン、カルシトリオール、カルシジオール、プロスタグランジン、ロイコトリエン、プロスタサイクリン、トロンボキサン、プロラクチン放出ホルモン、リポトロピン、脳ナトリウム利尿ペプチド、神経ペプチドＹ、ヒスタミン、エンドセリン、膵臓ポリペプチド、レニン、及びエンケファリンが挙げられるが、これらに限られるわけではない。
【0026】
培地に添加される増殖因子としては、トランスフォーミング成長因子－α（ＴＧＦ－α）、トランスフォーミング成長因子－β（ＴＧＦ－β）、マクロファージ炎症蛋白質－１α（ＭＩＰ－１α）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子－１、２、３、４、５、６、７、８、又は９（ＦＧＦ－１、２、３、４、５、６、７、８、９）、神経細胞増殖因子（ＮＧＦ）肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、白血病阻止因子（ＬＩＦ）、プロテアーゼネキシンＩ、プロテアーゼネキシンＩＩ、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、コリン作動性分化因子（ＣＤＦ）、ケモカイン、Ｎｏｔｃｈリガンド（Ｄｅｌｔａ１など）、Ｗｎｔ蛋白質、アンジオポエチン様蛋白質２、３、５又は７（Ａｎｇｐｔ２、３、５、７）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、インスリン様成長因子結合蛋白質（ＩＧＦＢＰ）、プレイオトロフィン（Ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｈｉｎ）などが挙げられるが、これらに限られるわけではない。
【0027】
また、遺伝子組換え技術によりこれらのサイトカインや増殖因子のアミノ酸配列を人為的に改変させたものも添加させることもできる。その例としては、ＩＬ－６／可溶性ＩＬ－６受容体複合体あるいはＨｙｐｅｒ ＩＬ－６（ＩＬ－６と可溶性ＩＬ－６受容体との融合タンパク質）などが挙げられる。
【0028】
各種細胞外マトリックスや各種細胞接着分子の例としては、コラーゲンＩ乃至ＸＩＸ、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン－１乃至１２、ニトジェン、テネイシン、トロンボスポンジン、フォンビルブランド（ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ）因子、オステオポンチン、フィブリノーゲン、各種エラスチン、各種プロテオグリカン、各種カドヘリン、デスモコリン、デスモグレイン、各種インテグリン、Ｅ－セレクチン、Ｐ－セレクチン、Ｌ－セレクチン、免疫グロブリンスーパーファミリー、マトリゲル、ポリ－Ｄ－リジン、ポリ－Ｌ－リジン、キチン、キトサン、セファロース、ヒアルロン酸、アルギン酸ゲル、各種ハイドロゲル、さらにこれらの切断断片などが挙げられる。
【0029】
培地に添加される抗生物質の例としては、サルファ製剤、ペニシリン、フェネチシリン、メチシリン、オキサシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、ナフシリン、アンピシリン、ペニシリン、アモキシシリン、シクラシリン、カルベニシリン、チカルシリン、ピペラシリン、アズロシリン、メクズロシリン、メシリナム、アンジノシリン、セファロスポリン及びその誘導体、オキソリン酸、アミフロキサシン、テマフロキサシン、ナリジクス酸、ピロミド酸、シプロフロキサン、シノキサシン、ノルフロキサシン、パーフロキサシン、ロザキサシン、オフロキサシン、エノキサシン、ピペミド酸、スルバクタム、クラブリン酸、β－ブロモペニシラン酸、β－クロロペニシラン酸、６－アセチルメチレン－ペニシラン酸、セフォキサゾール、スルタンピシリン、アディノシリン及びスルバクタムのホルムアルデヒド・フードラートエステル、タゾバクタム、アズトレオナム、スルファゼチン、イソスルファゼチン、ノカルディシン、フェニルアセトアミドホスホン酸メチル、クロルテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、テトラサイクリン、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、メタサイクリン、並びにミノサイクリンが挙げられる。
【0030】
本発明の培地組成物を用いて培養され得る細胞種は、本発明の所望の効果を得られる細胞種であれば特に限定されず、動物及び植物由来の細胞のいずれを用いることもできる。本発明における動物由来の細胞には、精子や卵子などの生殖細胞、生体を構成する体細胞、幹細胞（多能性幹細胞等）、前駆細胞、生体から分離された癌細胞、生体から分離され不死化能を獲得して体外で安定して維持される細胞（細胞株）、生体から分離され人為的に遺伝子改変が成された細胞、生体から分離され人為的に核が交換された細胞等が含まれる。生体を構成する体細胞の例としては、以下に限定されるものではないが、線維芽細胞、骨髄細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、好中球、赤血球、血小板、マクロファージ、単球、骨細胞、骨髄細胞、周皮細胞、樹状細胞、ケラチノサイト、脂肪細胞、間葉細胞、上皮細胞、表皮細胞、内皮細胞、血管内皮細胞、肝実質細胞、軟骨細胞、卵丘細胞、神経系細胞、グリア細胞、ニューロン、オリゴデンドロサイト、マイクログリア、星状膠細胞、心臓細胞、食道細胞、筋肉細胞（たとえば、平滑筋細胞又は骨格筋細胞）、膵臓ベータ細胞、メラニン細胞、造血前駆細胞（例えば、臍帯血由来のＣＤ３４陽性細胞）、及び単核細胞等が含まれる。当該体細胞は、例えば皮膚、腎臓、脾臓、副腎、肝臓、肺、卵巣、膵臓、子宮、胃、結腸、小腸、大腸、膀胱、前立腺、精巣、胸腺、筋肉、結合組織、骨、軟骨、血管組織、血液（臍帯血を含む）、骨髄、心臓、眼、脳又は神経組織などの任意の組織から採取される細胞が含まれる。幹細胞とは、自分自身を複製する能力と他の複数系統の細胞に分化する能力を兼ね備えた細胞であり、その例としては、以下に限定されるものではないが、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性腫瘍細胞、胚性生殖幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、筋幹細胞、生殖幹細胞、腸幹細胞、癌幹細胞、毛包幹細胞などが含まれる。細胞株とは、生体外での人為的な操作により無限の増殖能を獲得した細胞である。細胞株とは、生体外での人為的な操作により無限の増殖能を獲得した細胞であり、その例としては、以下に限定されるものではないが、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞株）、ＨＣＴ１１６、Ｈｕｈ７、ＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎細胞）、ＨｅＬａ（ヒト子宮癌細胞株）、ＨｅｐＧ２（ヒト肝癌細胞株）、ＵＴ７／ＴＰＯ（ヒト白血病細胞株）、ＭＤＣＫ、ＭＤＢＫ、ＢＨＫ、Ｃ－３３Ａ、ＨＴ－２９、ＡＥ－１、３Ｄ９、Ｎｓ０／１、Ｊｕｒｋａｔ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＣ１２、Ｓ２、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ（登録商標）、Ｖｅｒｏ等が含まれる。
【0031】
本発明における植物由来の細胞には、植物体の各組織から分離した細胞が含まれ、当該細胞から細胞壁を人為的に除いたプロトプラストも含まれる。
【0032】
本発明における組織とは、何種類かの異なった性質や機能を有する細胞が一定の様式で集合した構造の単位であり、動物の組織の例としては、上皮組織、結合組織、筋組織、神経組織等が含まれる。植物の組織の例としては、分裂組織、表皮組織、同化組織、葉肉組織、通道組織、機械組織、柔組織、脱分化した細胞塊（カルス）等が含まれる。
【0033】
細胞及び／又は組織を培養するに際し、培養する細胞及び／又は組織は、前記に記載した細胞及び／又は組織から任意に選択して培養することができる。細胞及び／又は組織は、動物或いは植物体より直接採取することができる。細胞及び／又は組織は、特定の処理を施すことにより動物或いは植物体から誘導させたり、成長させたり、又は形質転換させた後に採取してもよい。この際、当該処理は生体内であっても生体外であってもよい。動物としては、例えば魚類、両生類、爬虫類、鳥類、汎甲殻類、六脚類、哺乳類等が挙げられる。哺乳動物の例としては、限定されるものではないが、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、リス、ハムスター、ハタネズミ、カモノハシ、イルカ、クジラ、イヌ、ネコ、ヤギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ゾウ、コモンマーモセット、リスザル、アカゲザル、チンパンジー及びヒトが挙げられる。植物としては、採取した細胞及び／又は組織が液体培養可能なものであれば、特に限定はない。例えば、生薬類（例えば、サポニン、アルカロイド類、ベルベリン、スコポリン、植物ステロール等）を生産する植物（例えば、薬用人参、ニチニチソウ、ヒヨス、オウレン、ベラドンナ等）や、化粧品・食品原料となる色素や多糖体（例えば、アントシアニン、ベニバナ色素、アカネ色素、サフラン色素、フラボン類等）を生産する植物（例えば、ブルーベリー、紅花、セイヨウアカネ、サフラン等）、或いは医薬品原体を生産する植物などがあげられるが、それらに限定されない。
【0034】
細胞を培養するに際し、培養する細胞は、前記に記載した細胞から任意に選択して培養することができる。細胞は、動物或いは植物体より直接採取することができる。細胞は、特定の処理を施すことにより動物或いは植物体から誘導させたり、成長させたり、又は形質転換させた後に採取してもよい。この際、当該処理は生体内であっても生体外であってもよい。動物としては、例えば魚類、両生類、爬虫類、鳥類、汎甲殻類、六脚類、哺乳類等が挙げられる。哺乳動物の例としては、限定されるものではないが、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、リス、ハムスター、ハタネズミ、カモノハシ、イルカ、クジラ、イヌ、ネコ、ヤギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ゾウ、コモンマーモセット、リスザル、アカゲザル、チンパンジー及びヒトが挙げられる。植物としては、採取した細胞が液体培養可能なものであれば、特に限定はない。例えば、生薬類（例えば、サポニン、アルカロイド類、ベルベリン、スコポリン、植物ステロール等）を生産する植物（例えば、薬用人参、ニチニチソウ、ヒヨス、オウレン、ベラドンナ等）や、化粧品・食品原料となる色素や多糖体（例えば、アントシアニン、ベニバナ色素、アカネ色素、サフラン色素、フラボン類等）を生産する植物（例えば、ブルーベリー、紅花、セイヨウアカネ、サフラン等）、或いは医薬品原体を生産する植物などがあげられるが、それらに限定されない。
【0035】
本発明の培地組成物に含有されるＰＤ－ＧＸＧは、ゾル－ゲル転移温度を超える温度条件下において３次元的な構造体を形成する。かかる培地組成物中に懸濁された細胞又は組織は、ＰＤ－ＧＸＧが形成する当該３次元的な構造体にトラップされ得る。その結果、ゾル－ゲル転移温度を超える温度条件下において本発明の培地組成物を用いて細胞培養を行うことにより、細胞又は組織を浮遊状態で分散させたまま培養することができる。
【0036】
本明細書において、細胞の浮遊とは、培養容器に対して細胞が接着しない状態（非接着）であることをいう。さらに、本発明の培地組成物において、細胞を増殖、分化或いは維持させる際、液状培地組成物に対する外部からの圧力や振動或いは当該組成物中での振とう、回転操作等を伴わずに細胞が当該液状培地組成物中で均一に分散し尚且つ浮遊状態にある状態を「浮遊静置」といい、当該状態で細胞を培養することを「浮遊静置培養」という。浮遊静置培養において細胞又は組織を浮遊させる期間としては、５分以上（例、少なくとも５～６０分）、１時間以上（例、１時間～２４時間）、２４時間以上（例、１日～２１日）、４８時間以上、７日以上等が含まれるが、浮遊状態を保つ限りこれらの期間に限定されない。
【0037】
本発明の培地組成物中で細胞又は組織を培養する際には、本発明の培養組成物に対して別途調製した細胞又は組織を添加し、均一に分散される様に混合すればよい。その際の混合方法は特に制限はなく、例えばピペッティング等の手動での混合、スターラー、ボルテックスミキサー、マイクロプレートミキサー、振とう機等の機器を用いた混合が挙げられる。混合後は培養液を静置状態にしてもよいし、必要に応じて培養液を回転、振とう或いは撹拌してもよい。その回転数と頻度は、当業者の目的に合わせて適宜設定すればよい。
【0038】
細胞又は組織を培養する際の温度は、動物細胞であれば通常３０℃～３９℃、好ましくは３３℃～３９℃である。ＣＯ２濃度は、通常、培養の雰囲気中、４～１０体積％であり、４～６体積％が好ましい。培養期間は通常３～３５日間であるが、培養の目的に合わせて自由に設定すればよい。植物細胞の培養温度は、通常２０～３０℃であり、光が必要であれば照度２０００～８０００ルクスの照度条件下にて培養すればよい。培養期間は通常３～７０日間であるが、培養の目的に合わせて自由に設定すればよい。
【0039】
培養器材としては、細胞や組織の培養に一般的に用いられるシャーレ、フラスコ、プラスチックバック、テフロン（登録商標）バック、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレート、チャンバースライド、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトル等の培養器材を用いることが可能である。
【0040】
本発明の培地組成物の一態様において、本発明の培地組成物は、細胞又は組織を含んでいてもよい。換言すれば、本発明の培地組成物は、本発明の培地組成物と、これにより培養した細胞又は組織を含有する培養調製物をも含む。本明細書において、培養調製物とは、細胞又は組織を培養することにより得られる結果物をいい、細胞又は組織、培地（培地組成物）、細胞分泌性成分等が含まれていてもよい。
【0041】
２．培養方法
本発明はまた、以下の工程を含む、細胞又は組織の培養方法（以下、「本発明の方法」と称することがある）を提供する：（１）ガラクトキシログルカンのガラクトース部分分解物を含む温度応答性液状培地組成物中で細胞又は組織を浮遊培養する工程であって、該液状培地組成物のゾル－ゲル転移温度を超える温度下で細胞又は組織を培養する、工程。
本発明はまた、以下の工程を含む、細胞又は組織の培養方法（以下、「本発明の方法」と称することがある）を提供する：（１）ガラクトキシログルカンのガラクトース部分分解物を含む温度応答性液状培地組成物中で細胞又は組織を浮遊培養する工程であって、該液状培地組成物のゾル－ゲル転移温度を超える温度下で細胞又は組織を培養する、工程。
【0042】
本発明の方法に用いられる、ＰＤ－ＧＸＧ、細胞又は組織、培地、培養条件等は上述した通りである。尚、工程（１）は、上述した本発明の培地組成物を用いて行うことができる。
【0043】
一態様において、本発明の方法は、培養した細胞又は組織を回収する工程を含み得る。具体的には、上述した工程（１）に加えて、工程（２）（１）の工程後、液状培地組成物を冷却し、該液状培地組成物の粘度を低下させる工程、及び工程（３）液状培地組成物から細胞又は組織を分離する工程を含み得る。
【0044】
工程（２）における培地組成物の冷却は、培地組成物中のＰＤ－ＧＸＧがゾル－ゲル転移温度付近又はそれ以下の温度まで冷却されることにより、ＰＤ－ＧＸＧが形成する構造体が消失し、その結果培地組成物の粘性を低下させ得ることができる限り、どのような方法で冷却してもよい。一態様として、本発明の培地組成物を室温（例、１５～２５℃程度）または冷蔵環境（例、４℃程度）に静置することにより、本発明の培地組成物を冷却することができる。本工程を経ることにより、本発明の培地組成物の粘性は大きく低下する。
【0045】
次に、本発明の培地組成物と細胞又は組織とを工程（３）において分離する。低粘性となった本発明の培地組成物は、上述したＰＤ－ＧＸＧによる３次元構造体が解消するため、もはや細胞又は組織を浮遊させることができない。従って、本発明の培地組成物と細胞又は組織とは、例えば、遠心分離を用いて容易に分離できる。遠心分離を行う際の重力加速度は、本発明の培地組成物と細胞又は組織とが分離できる限り特に限定されないが、通常１０～４００Ｇであり得る。また、遠心分離処理の代わりに、ろ過処理による分離を行なってもよい。ろ過処理に用いるフィルターの細孔のサイズは、分離する細胞又は組織のサイズを考慮して適宜設定すればよいが、例えば、１０μｍ～１００μｍのサイズを有するフィルターを使用することができる。
【0046】
また、工程（３）が行われる温度条件としては、本発明の培地組成物の粘性が高まり、培地組成物と細胞又は組織の分離が不可能となる温度でなければ特に限定されない。一態様において、ゾル－ゲル転移温度以下であれば本発明の培地組成物の粘性は高まらないため好ましいが、これに限定されない。
【0047】
以下の実施例において本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの例によってなんら限定されるものではない。
【実施例】
【0048】
［調製例１］ＰＤ－ＧＸＧの調製
ガラス容器に８０質量部の２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）及び２質量部のＧＸＧ（グリロイド３Ｃ又は６Ｓ、ＤＳＰ五協フード＆ケミカル社製）を加えて撹拌し溶解した後、１７．８質量部の２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に０．２質量部のβ－ガラクトシダーゼ（β－Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ｆｒｏｍ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を溶解したものを加え、３０℃で１５時間撹拌し酵素反応によるＧＸＧからのガラクトースの部分除去を行った。１００℃で２０分間加熱することで酵素を失活させ反応を停止した。得られた溶液を４℃に冷却後、等体積量のエタノール（和光純薬工業社製）に加えることで生成した析出物を吸引ろ過により回収し、減圧乾燥又は凍結乾燥によりＰＤ－ＧＸＧの乾燥生成物を作製した。
ガラス容器に８０質量部の２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）及び２質量部のＧＸＧ（グリロイド３Ｃ又は６Ｓ、ＤＳＰ五協フード＆ケミカル社製）を加えて撹拌し溶解した後、１７．８質量部の２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に０．２質量部のβ－ガラクトシダーゼ（β－Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ｆｒｏｍ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を溶解したものを加え、３０℃で１５時間撹拌し酵素反応によるＧＸＧからのガラクトースの部分除去を行った。１００℃で２０分間加熱することで酵素を失活させ反応を停止した。得られた溶液を４℃に冷却後、等体積量のエタノール（和光純薬工業社製）に加えることで生成した析出物を吸引ろ過により回収し、減圧乾燥又は凍結乾燥によりＰＤ－ＧＸＧの乾燥生成物を作製した。
【0049】
［調製例２］多糖水溶液の調製
ガラス製培地ビンに９８質量部の精製水及び調製例１で作製したＰＤ－ＧＸＧを２質量部加え、４℃に冷却しながら撹拌することで溶解した。得られた水溶液をオートクレーブ滅菌処理（１２１℃、２０分）した後再度４℃に冷却することにより、２質量％濃度のＰＤ－ＧＸＧ水溶液を作製した。同様にして２質量％濃度のメチルセルロース（ＭＥＴＯＬＯＳＥ ＳＭ－１５００、信越化学工業株式会社製、以下、ＭＣと称することがある）水溶液を作製した。また、ガラス製培地ビンに９８質量部の精製水及びＧＸＧを２質量部加え、オートクレーブ滅菌処理（１２１℃、２０分）を行うことにより、２質量％濃度のＧＸＧ水溶液を作製した。また、ガラス製培地ビンに９９．２質量部の精製水及び脱アシル化ジェランガム（三晶社製、以下、ＤＡＧと称することがある）を０．８質量部加え、オートクレーブ滅菌処理（１２１℃、２０分）を行うことにより、０．８質量％濃度のＤＡＧ水溶液を作製した。
ガラス製培地ビンに９８質量部の精製水及び調製例１で作製したＰＤ－ＧＸＧを２質量部加え、４℃に冷却しながら撹拌することで溶解した。得られた水溶液をオートクレーブ滅菌処理（１２１℃、２０分）した後再度４℃に冷却することにより、２質量％濃度のＰＤ－ＧＸＧ水溶液を作製した。同様にして２質量％濃度のメチルセルロース（ＭＥＴＯＬＯＳＥ ＳＭ－１５００、信越化学工業株式会社製、以下、ＭＣと称することがある）水溶液を作製した。また、ガラス製培地ビンに９８質量部の精製水及びＧＸＧを２質量部加え、オートクレーブ滅菌処理（１２１℃、２０分）を行うことにより、２質量％濃度のＧＸＧ水溶液を作製した。また、ガラス製培地ビンに９９．２質量部の精製水及び脱アシル化ジェランガム（三晶社製、以下、ＤＡＧと称することがある）を０．８質量部加え、オートクレーブ滅菌処理（１２１℃、２０分）を行うことにより、０．８質量％濃度のＤＡＧ水溶液を作製した。
【0050】
［調製例３］培地組成物の調製
各種粉末培地及びＦＢＳ（ウシ胎児血清）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）より作製した１倍又は２倍濃縮の液体培地と、調製例２で作製した多糖水溶液又はそれらを希釈した多糖水溶液を混合することで培地に多糖を均一に添加して培地組成物を作製した。培地と多糖水溶液の混合には培地作製キット（日産化学社製 ＦＣｅＭ（登録商標）－ｓｅｒｉｅｓ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を使用し、以下の手順で行った。コニカルチューブ（住友ベークライト社製 ５０ｍＬ遠沈管）に所定量の各種培地を分注し、キットの構成品であるアダプターキャップを装着した。つぎに、所定量の多糖水溶液を充填したディスポーザブルシリンジの先端部をアダプターキャップの円筒部に嵌め込んで接続し、シリンジのプランジャーを人力で押圧し、勢い良くシリンジ内の多糖水溶液を容器内へと射出して培地と混合させて培地組成物を作製した。作製した培地組成物を表１に示す。目視及び顕微鏡観察において、すべての培地組成物が均一かつ透明であることを確認した。
各種粉末培地及びＦＢＳ（ウシ胎児血清）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）より作製した１倍又は２倍濃縮の液体培地と、調製例２で作製した多糖水溶液又はそれらを希釈した多糖水溶液を混合することで培地に多糖を均一に添加して培地組成物を作製した。培地と多糖水溶液の混合には培地作製キット（日産化学社製 ＦＣｅＭ（登録商標）－ｓｅｒｉｅｓ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を使用し、以下の手順で行った。コニカルチューブ（住友ベークライト社製 ５０ｍＬ遠沈管）に所定量の各種培地を分注し、キットの構成品であるアダプターキャップを装着した。つぎに、所定量の多糖水溶液を充填したディスポーザブルシリンジの先端部をアダプターキャップの円筒部に嵌め込んで接続し、シリンジのプランジャーを人力で押圧し、勢い良くシリンジ内の多糖水溶液を容器内へと射出して培地と混合させて培地組成物を作製した。作製した培地組成物を表１に示す。目視及び顕微鏡観察において、すべての培地組成物が均一かつ透明であることを確認した。
【0051】
【表1】
【0052】
［試験例１］ＰＤ－ＧＸＧのガラクトース除去率の算出
調製例１で作製したＰＤ－ＧＸＧのガラクトース除去率を、ＧｌｙＳｃｏｐｅ ＡＢＥＥ標識化キット（Ｊ－ケミカル社製）を用いて、以下の方法で算出した。
調製例１で作製したＰＤ－ＧＸＧのガラクトース除去率を、ＧｌｙＳｃｏｐｅ ＡＢＥＥ標識化キット（Ｊ－ケミカル社製）を用いて、以下の方法で算出した。
【0053】
まず、原料のＧＸＧ又は調製例１で作製したＰＤ－ＧＸＧの乾燥生成物をそれぞれ冷水に加え撹拌し、３０ｍｇ／ｍＬの各水溶液を調製した。これらを上記キットのプロトコールに従い、トリフルオロ酢酸により酸加水分解後、遊離した各糖の還元末端にＡＢＥＥ（４－アミノ安息香酸エチルエステル）を還元アミノ化反応で標識化を行った。標識後、下記の条件※でＨＰＬＣ測定を行い、グルコース画分、キシロース画分及びガラクトース画分の溶出面積をＵＶ検出器にて検出した。なお、各単糖の検量線は、市販のＤ（＋）－グルコース、Ｄ（＋）－キシロース、Ｄ（＋）－ガラクトース（和光純薬工業社製）を標準物質として用い、上記キットにて調製した各標準試料のＨＰＬＣ測定での溶出面積より作成を行った。各溶出面積値から検量線を用いて重量比に換算し、ＧＸＧ及びＰＤ－ＧＸＧのグルコース／キシロース／ガラクトース構成比を算出した。その結果、グルコースを基準としたときの構成比は、ＧＸＧが「１／０．８５８／０．３４８」、ＰＤ－ＧＸＧが「１／０．８９１／０．２０７」であった。したがって、ＰＤ－ＧＸＧのガラクトース除去率は、（１－０．２０７／０．３４８）×１００＝４０．５％ と算出された。
【0054】
※[ＨＰＬＣ条件]
カラム：糖分析用カラム Ｈｏｎｅｎｐａｋ Ｃ１８（４．６×７５ｍｍ）
温度 ：３０℃
検出 ：ＵＶ３０５ｎｍ
流速 ：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
注入量：４０μＬ
溶離液：０．２Ｍホウ酸カリウム緩衝液／アセトニトリル＝９３／７（ｖ／ｖ）
カラム：糖分析用カラム Ｈｏｎｅｎｐａｋ Ｃ１８（４．６×７５ｍｍ）
温度 ：３０℃
検出 ：ＵＶ３０５ｎｍ
流速 ：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
注入量：４０μＬ
溶離液：０．２Ｍホウ酸カリウム緩衝液／アセトニトリル＝９３／７（ｖ／ｖ）
【0055】
［試験例２］ＰＤ－ＧＸＧ水溶液の物性評価
調製例２で作製した２質量％濃度のＰＤ－ＧＸＧ水溶液について各種物性を測定し評価を行った。
調製例２で作製した２質量％濃度のＰＤ－ＧＸＧ水溶液について各種物性を測定し評価を行った。
【0056】
（１）相転移挙動の確認：温度変化によるゾル－ゲル転移挙動の確認
調製例２で作製した２質量％濃度のＰＤ－ＧＸＧ水溶液を３７℃の恒温機に静置保管し、１０分後及び３０分後の様子を観察した。外観の観察結果を図１に示す。これらの結果より、調製例２で作製したＰＤ－ＧＸＧの水溶液は３７℃に昇温することでゾル－ゲル転移することを確認した。
調製例２で作製した２質量％濃度のＰＤ－ＧＸＧ水溶液を３７℃の恒温機に静置保管し、１０分後及び３０分後の様子を観察した。外観の観察結果を図１に示す。これらの結果より、調製例２で作製したＰＤ－ＧＸＧの水溶液は３７℃に昇温することでゾル－ゲル転移することを確認した。
【0057】
（２）相転移温度の測定：ＤＳＣ測定
調製例２で作製したＰＤ－ＧＸＧ水溶液をアルミパンに封入し、４℃から３７℃の範囲にて、昇温－降温サイクル時の示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を行った。得られたＤＳＣ曲線を図２に示す。図２より、昇温過程では２９℃付近に、降温過程では２５℃付近に吸発熱ピークが観測されたことから、ＰＤ－ＧＸＧ水溶液は前述の温度にて相転移挙動が確認され、温度応答性組成物であることを確認した。
調製例２で作製したＰＤ－ＧＸＧ水溶液をアルミパンに封入し、４℃から３７℃の範囲にて、昇温－降温サイクル時の示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を行った。得られたＤＳＣ曲線を図２に示す。図２より、昇温過程では２９℃付近に、降温過程では２５℃付近に吸発熱ピークが観測されたことから、ＰＤ－ＧＸＧ水溶液は前述の温度にて相転移挙動が確認され、温度応答性組成物であることを確認した。
【0058】
［試験例３］培地組成物の物性評価
調製例３で作製した培地組成物について各種物性を測定し評価を行った。
（１）培地組成物の透明性評価
ＰＤ－ＧＸＧ配合培地組成物の透明性を、加温前後での透過率により評価を行った。比較例１、ＤＨｄ４０５、ＤＨｄ４０６を９６穴平底透明プレートにそれぞれ２００μＬずつ分注し、プレートリーダー（テカン社製、ｉｎｆｉｎｉｔｅＭ２００ＰＲＯ）を用いて、室温時と３７℃加温時における可視光領域（波長６６０ｎｍ）の吸光度測定を行った。得られた吸光度から透過率の式（１００／１０＾吸光度）より透過率を導出した。その結果を表２に示す。培地組成物の透過率は無添加の比較例１と比較して、２５℃で３～９％の低下となり、目視及び顕微鏡観察に影響しない範囲であることを確認した。５０ｍＬのコニカルチューブに分注し、３７℃に恒温したＤＨｄ４０５及びＤＨｄ４０６の外観を図３に示す。反対側の目盛り線が視認できることからも、透明性は良好であることを確認した。
調製例３で作製した培地組成物について各種物性を測定し評価を行った。
（１）培地組成物の透明性評価
ＰＤ－ＧＸＧ配合培地組成物の透明性を、加温前後での透過率により評価を行った。比較例１、ＤＨｄ４０５、ＤＨｄ４０６を９６穴平底透明プレートにそれぞれ２００μＬずつ分注し、プレートリーダー（テカン社製、ｉｎｆｉｎｉｔｅＭ２００ＰＲＯ）を用いて、室温時と３７℃加温時における可視光領域（波長６６０ｎｍ）の吸光度測定を行った。得られた吸光度から透過率の式（１００／１０＾吸光度）より透過率を導出した。その結果を表２に示す。培地組成物の透過率は無添加の比較例１と比較して、２５℃で３～９％の低下となり、目視及び顕微鏡観察に影響しない範囲であることを確認した。５０ｍＬのコニカルチューブに分注し、３７℃に恒温したＤＨｄ４０５及びＤＨｄ４０６の外観を図３に示す。反対側の目盛り線が視認できることからも、透明性は良好であることを確認した。
【0059】
【表2】
【0060】
（２）温度変化によるビーズの浮遊・沈降制御の評価
調製例３で作製した培地組成物ＤＨｄ４０５中に、浮遊する細胞を模擬的に再現するためのポリスチレンビーズ（直径５００～６００μｍ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．製）を添加して混合し、静置保管して１０分間、１時間、及び２４時間経過後に、液中のビーズの分散状態を目視にて確認した。その結果、いずれの静置時間でもビーズは分散状態を維持したまま静止していた。２４時間経過後のビーズ入りＤＨｄ４０５を室温に戻し、遠心分離（３００ｘｇ、３分間）を行ったところ、ビーズは沈降した。さらに、これを３７℃に加温して反転混合したところ、再びビーズは浮遊し分散状態を維持したまま静止した。このことから、温度差によるビーズの浮遊及び沈降の制御が可能であることを確認した。これらの外観を図４に示す。
調製例３で作製した培地組成物ＤＨｄ４０５中に、浮遊する細胞を模擬的に再現するためのポリスチレンビーズ（直径５００～６００μｍ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．製）を添加して混合し、静置保管して１０分間、１時間、及び２４時間経過後に、液中のビーズの分散状態を目視にて確認した。その結果、いずれの静置時間でもビーズは分散状態を維持したまま静止していた。２４時間経過後のビーズ入りＤＨｄ４０５を室温に戻し、遠心分離（３００ｘｇ、３分間）を行ったところ、ビーズは沈降した。さらに、これを３７℃に加温して反転混合したところ、再びビーズは浮遊し分散状態を維持したまま静止した。このことから、温度差によるビーズの浮遊及び沈降の制御が可能であることを確認した。これらの外観を図４に示す。
【0061】
（３）温度変化による細胞の浮遊・沈降制御の評価
対数増殖期にあるヒト肺胞基底上皮腺癌細胞（Ａ５４９、ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製）を１５×１０４細胞準備し、１．５ｍＬ丸底マイクロチューブ（深江化成社製）３本に各５×１０４細胞ずつ分注した。遠心分離（３００ｘｇ，３分間）を行い上清除去した後、３７℃に加温したＰＤ－ＧＸＧを種々の濃度で含む培地組成物（ＤＨｄ４０５乃至ＤＨｄ４０６）、及びＰＤ－ＧＸＧを含まない培地組成物（比較例１）をそれぞれ１本ずつに０．５ｍＬ加えて緩やかに撹拌し細胞懸濁液を作製した（１０×１０４細胞／ｍＬ）。インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２、Ｐａｎａｓｏｎｉｃ社製）内で４日間静置した後、細胞が浮遊しているか目視にて観察した。その結果、ＰＤ－ＧＸＧを含まない培地組成物（表１の比較例１）に懸濁した細胞は容器底部に沈降していたのに対し、ＰＤ－ＧＸＧ配合培地組成物（ＤＨｄ４０５乃至ＤＨｄ４０６）に懸濁した細胞は、液全体に分散したまま静止状態で浮遊していることを確認した。外観を図５に示す。
対数増殖期にあるヒト肺胞基底上皮腺癌細胞（Ａ５４９、ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製）を１５×１０４細胞準備し、１．５ｍＬ丸底マイクロチューブ（深江化成社製）３本に各５×１０４細胞ずつ分注した。遠心分離（３００ｘｇ，３分間）を行い上清除去した後、３７℃に加温したＰＤ－ＧＸＧを種々の濃度で含む培地組成物（ＤＨｄ４０５乃至ＤＨｄ４０６）、及びＰＤ－ＧＸＧを含まない培地組成物（比較例１）をそれぞれ１本ずつに０．５ｍＬ加えて緩やかに撹拌し細胞懸濁液を作製した（１０×１０４細胞／ｍＬ）。インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２、Ｐａｎａｓｏｎｉｃ社製）内で４日間静置した後、細胞が浮遊しているか目視にて観察した。その結果、ＰＤ－ＧＸＧを含まない培地組成物（表１の比較例１）に懸濁した細胞は容器底部に沈降していたのに対し、ＰＤ－ＧＸＧ配合培地組成物（ＤＨｄ４０５乃至ＤＨｄ４０６）に懸濁した細胞は、液全体に分散したまま静止状態で浮遊していることを確認した。外観を図５に示す。
【0062】
（４）培地組成物のＳＥＭ観察
培地中でのＰＤ－ＧＸＧの構造体を観察するため、培地組成物より調製した乾燥生成物のＳＥＭ観察を行った。ＳＥＭ観察用サンプルは、以下の方法で調整した。ガラスプレートに調製例３で作製した培地組成物ＤＨｄ４０５をキャストし、５０℃に加温したホットプレート上で乾燥後、５０℃の温水で洗浄し、再度５０℃のホットプレート上で乾燥した。また、ガラスプレートに調製例３で作製した培地組成物ＤＨｄ４０５をキャストし、室温で自然乾燥後、５０℃の温水で洗浄し、再度室温で自然乾燥した。５０℃又は室温で調製したＰＤ－ＧＸＧ乾燥生成物のＳＥＭ観察像を図６に示す。図６より、５０℃で乾燥したものはコロイドが数珠状に連なったような構造体が観察された。一方で、室温で乾燥したものでは上述のような数珠状の構造体は見られず、球状のコロイド様粒子が点在したもののみが観察された。これらの結果から、昇温することでＰＤ－ＧＸＧのハイドロコロイドがコロイド表面の疎水的な相互作用により会合し、図７の模式図に示すようなネットワークを形成することで細胞の浮遊性が発現するものと考えられる。さらに、室温に戻した際は疎水性相互作用が弱まり、ネットワークが解けて浮遊性を失うため、温度変化によって可逆的な浮遊挙動の制御が可能であると考えられる。
培地中でのＰＤ－ＧＸＧの構造体を観察するため、培地組成物より調製した乾燥生成物のＳＥＭ観察を行った。ＳＥＭ観察用サンプルは、以下の方法で調整した。ガラスプレートに調製例３で作製した培地組成物ＤＨｄ４０５をキャストし、５０℃に加温したホットプレート上で乾燥後、５０℃の温水で洗浄し、再度５０℃のホットプレート上で乾燥した。また、ガラスプレートに調製例３で作製した培地組成物ＤＨｄ４０５をキャストし、室温で自然乾燥後、５０℃の温水で洗浄し、再度室温で自然乾燥した。５０℃又は室温で調製したＰＤ－ＧＸＧ乾燥生成物のＳＥＭ観察像を図６に示す。図６より、５０℃で乾燥したものはコロイドが数珠状に連なったような構造体が観察された。一方で、室温で乾燥したものでは上述のような数珠状の構造体は見られず、球状のコロイド様粒子が点在したもののみが観察された。これらの結果から、昇温することでＰＤ－ＧＸＧのハイドロコロイドがコロイド表面の疎水的な相互作用により会合し、図７の模式図に示すようなネットワークを形成することで細胞の浮遊性が発現するものと考えられる。さらに、室温に戻した際は疎水性相互作用が弱まり、ネットワークが解けて浮遊性を失うため、温度変化によって可逆的な浮遊挙動の制御が可能であると考えられる。
【0063】
（５）相転移温度の測定：粘弾性測定
調製例３で作製した培地組成物ＤＨｄ４０５を２０℃に恒温し、２０℃から１℃ずつ２分刻みで３７℃まで上昇させながら各温度での貯蔵弾性率及び損失弾性率を測定した。その結果を図８に示す。図８より、２９℃で貯蔵弾性率が損失弾性率よりも大きくなり、逆転したことから、昇温過程で構造体形成が進み、２９℃以降でネットワーク様の構造体が形成されたことが示唆された。
調製例３で作製した培地組成物ＤＨｄ４０５を２０℃に恒温し、２０℃から１℃ずつ２分刻みで３７℃まで上昇させながら各温度での貯蔵弾性率及び損失弾性率を測定した。その結果を図８に示す。図８より、２９℃で貯蔵弾性率が損失弾性率よりも大きくなり、逆転したことから、昇温過程で構造体形成が進み、２９℃以降でネットワーク様の構造体が形成されたことが示唆された。
【0064】
［試験例４］培養実験：Ａ５４９細胞の増殖評価
対数増殖期にあるヒト肺胞基底上皮腺癌細胞（Ａ５４９、ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製）を１２５×１０４細胞準備し、１５ｍＬコニカルチューブ（住友ベークライト社製）５本に各２５×１０４細胞ずつ分注した。遠心分離（３００ｘｇ，３分間）を行い上清除去した後、３７℃に加温したＰＤ－ＧＸＧを含む培地組成物（ＤＨｄ４０６）、種々の多糖を含む培地組成物（比較例２～４）及び多糖を含まない培地組成物（比較例１）をそれぞれ１本ずつに２．５ｍＬ加えて緩やかに撹拌し細胞懸濁液を作製した（１０×１０４細胞／ｍＬ）。調製したそれぞれの細胞懸濁液を９６穴平底超低接着プレート（＃３４７４、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）へ１ウェルあたり１×１０４細胞分の０．１ｍＬずつ各４ウェルに加え、３７℃、５％炭酸ガス条件下において４日間培養を行った。１日毎に細胞中に含まれるＡＴＰ量をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ―Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、Ｇ７５７１）を用いてプレートリーダー（ｉｎｆｉｎｉｔｅＭ２００ＰＲＯ、テカン社製）により定量し、細胞増殖性を評価した。以上の試験は全て４回実施し、その平均値を表３及び図９に記した。また、培養４日後に細胞の状態及び浮遊性について顕微鏡観察を行った。図１０にそれぞれを観察した顕微鏡写真を示す。図１０より、培地組成物ＤＨｄ４０６及び比較例２のみが浮遊状態で培養することができることを確認した。さらに、ＤＨｄ４０６を用いた培養では、細胞の凝集が顕著に抑制されており、細胞同士の凝集抑制効果があることがわかった。また、表３の結果より、比較例１、３、４は細胞同士の過凝集に起因する細胞死によるものと考えられる生細胞数の減少がみられた一方で、本発明の培地組成物であるＤＨｄ４０６を用いた３次元静置浮遊培養においては、比較例２を用いた培養と同等の良好な細胞増殖性が確認された。
対数増殖期にあるヒト肺胞基底上皮腺癌細胞（Ａ５４９、ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製）を１２５×１０４細胞準備し、１５ｍＬコニカルチューブ（住友ベークライト社製）５本に各２５×１０４細胞ずつ分注した。遠心分離（３００ｘｇ，３分間）を行い上清除去した後、３７℃に加温したＰＤ－ＧＸＧを含む培地組成物（ＤＨｄ４０６）、種々の多糖を含む培地組成物（比較例２～４）及び多糖を含まない培地組成物（比較例１）をそれぞれ１本ずつに２．５ｍＬ加えて緩やかに撹拌し細胞懸濁液を作製した（１０×１０４細胞／ｍＬ）。調製したそれぞれの細胞懸濁液を９６穴平底超低接着プレート（＃３４７４、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）へ１ウェルあたり１×１０４細胞分の０．１ｍＬずつ各４ウェルに加え、３７℃、５％炭酸ガス条件下において４日間培養を行った。１日毎に細胞中に含まれるＡＴＰ量をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ―Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、Ｇ７５７１）を用いてプレートリーダー（ｉｎｆｉｎｉｔｅＭ２００ＰＲＯ、テカン社製）により定量し、細胞増殖性を評価した。以上の試験は全て４回実施し、その平均値を表３及び図９に記した。また、培養４日後に細胞の状態及び浮遊性について顕微鏡観察を行った。図１０にそれぞれを観察した顕微鏡写真を示す。図１０より、培地組成物ＤＨｄ４０６及び比較例２のみが浮遊状態で培養することができることを確認した。さらに、ＤＨｄ４０６を用いた培養では、細胞の凝集が顕著に抑制されており、細胞同士の凝集抑制効果があることがわかった。また、表３の結果より、比較例１、３、４は細胞同士の過凝集に起因する細胞死によるものと考えられる生細胞数の減少がみられた一方で、本発明の培地組成物であるＤＨｄ４０６を用いた３次元静置浮遊培養においては、比較例２を用いた培養と同等の良好な細胞増殖性が確認された。
【0065】
【表3】
【0066】
［試験例５］培養実験：ＨｅｐＧ２細胞の増殖評価
対数増殖期にあるヒト肝癌由来細胞（ＨｅｐＧ２、ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製）を１２５×１０４細胞準備し、１５ｍＬコニカルチューブ（住友ベークライト社製）５本に各２５×１０４細胞ずつ分注した。遠心分離（３００ｘｇ，３分間）を行い上清除去した後、３７℃に加温したＰＤ－ＧＸＧを含む培地組成物（ＤＨｄ４１１）、種々の多糖を含む培地組成物（比較例６～８）及び多糖を含まない培地組成物（比較例５）をそれぞれ１本ずつに２．５ｍＬ加えて緩やかに撹拌し細胞懸濁液を作製した（１０×１０４細胞／ｍＬ）。調製したそれぞれの細胞懸濁液を９６穴平底超低接着プレート（＃３４７４、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）へ１ウェルあたり１×１０４細胞分の０．１ｍＬずつ各４ウェルに加え、３７℃、５％炭酸ガス条件下において４日間培養を行った。１日毎に細胞中に含まれるＡＴＰ量をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ―Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、Ｇ７５７１）を用いてプレートリーダー（ｉｎｆｉｎｉｔｅＭ２００ＰＲＯ、テカン社製）により定量し、細胞増殖性を評価した。以上の試験は全て４回実施し、その平均値を表４及び図１１に記した。また、培養４日後に細胞の状態及び浮遊性について顕微鏡観察を行った。試験例４と同様に、培地組成物ＤＨｄ４１１及び比較例６のみが浮遊状態で培養することができることを確認した。さらに、ＤＨｄ４１１を用いた培養では、ＨｅｐＧ２細胞の培養においても細胞の凝集が顕著に抑制されており、細胞同士の凝集抑制効果があることがわかった。また、表４の結果より、比較例５、７、８は細胞同士の過凝集に起因する細胞死によるものと考えられる生細胞数の減少がみられた一方で、本発明の培地組成物であるＤＨｄ４１１を用いた３次元静置浮遊培養において、比較例６と同等の良好な細胞増殖性が確認された。
対数増殖期にあるヒト肝癌由来細胞（ＨｅｐＧ２、ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製）を１２５×１０４細胞準備し、１５ｍＬコニカルチューブ（住友ベークライト社製）５本に各２５×１０４細胞ずつ分注した。遠心分離（３００ｘｇ，３分間）を行い上清除去した後、３７℃に加温したＰＤ－ＧＸＧを含む培地組成物（ＤＨｄ４１１）、種々の多糖を含む培地組成物（比較例６～８）及び多糖を含まない培地組成物（比較例５）をそれぞれ１本ずつに２．５ｍＬ加えて緩やかに撹拌し細胞懸濁液を作製した（１０×１０４細胞／ｍＬ）。調製したそれぞれの細胞懸濁液を９６穴平底超低接着プレート（＃３４７４、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）へ１ウェルあたり１×１０４細胞分の０．１ｍＬずつ各４ウェルに加え、３７℃、５％炭酸ガス条件下において４日間培養を行った。１日毎に細胞中に含まれるＡＴＰ量をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ―Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、Ｇ７５７１）を用いてプレートリーダー（ｉｎｆｉｎｉｔｅＭ２００ＰＲＯ、テカン社製）により定量し、細胞増殖性を評価した。以上の試験は全て４回実施し、その平均値を表４及び図１１に記した。また、培養４日後に細胞の状態及び浮遊性について顕微鏡観察を行った。試験例４と同様に、培地組成物ＤＨｄ４１１及び比較例６のみが浮遊状態で培養することができることを確認した。さらに、ＤＨｄ４１１を用いた培養では、ＨｅｐＧ２細胞の培養においても細胞の凝集が顕著に抑制されており、細胞同士の凝集抑制効果があることがわかった。また、表４の結果より、比較例５、７、８は細胞同士の過凝集に起因する細胞死によるものと考えられる生細胞数の減少がみられた一方で、本発明の培地組成物であるＤＨｄ４１１を用いた３次元静置浮遊培養において、比較例６と同等の良好な細胞増殖性が確認された。
【0067】
【表4】
【0068】
［試験例６］培養後の細胞回収実験：Ａ５４９細胞の回収性評価
対数増殖期にあるヒト肺胞基底上皮腺癌細胞（Ａ５４９、ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製）を３０×１０４細胞準備し、１５ｍＬコニカルチューブ（住友ベークライト社製）２本に各１５×１０４細胞ずつ分注した。遠心分離（３００ｘｇ，３分間）を行い上清除去した後、３７℃に加温したＰＤ－ＧＸＧを含む培地組成物（ＤＨｄ４０６）又はＤＡＧを含む培地組成物（比較例２）をそれぞれ１本ずつに１．５ｍＬ加えて緩やかに撹拌し細胞懸濁液を作製した（１０×１０４細胞／ｍＬ）。調製したそれぞれの細胞懸濁液を２４穴平底超低接着プレート（＃３４７３、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）へ各１ウェルに１３×１０４細胞分の１．３ｍＬずつ加え、３７℃、５％炭酸ガス条件下において４日間培養を行った。培養後、ウェル内の培養液全量を１．５ｍＬ丸底マイクロチューブ（深江化成社製）に移し、１００μＬ中の細胞中に含まれるＡＴＰ量をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ―Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、Ｇ７５７１）を用いてプレートリーダー（ｉｎｆｉｎｉｔｅＭ２００ＰＲＯ、テカン社製）により定量し、これを基準値とした。つぎに、１．５ｍＬ丸底マイクロチューブ内の残りの培養液１．０ｍＬが２０～２５℃になるまで静置後、遠心分離（３００ｘｇ，３分間）を行った。遠心分離後、上清を０．８ｍＬ除去し、残りの０．２ｍＬに培地を０．８ｍＬ加え、ピペッティングにより再懸濁した。再懸濁液１００μＬ中の細胞中に含まれるＡＴＰ量をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ―Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、Ｇ７５７１）を用いてプレートリーダー（ｉｎｆｉｎｉｔｅＭ２００ＰＲＯ、テカン社製）により定量し、遠心分離前後でのＲＬＵ値を比較することで細胞の回収率を算出した。以上の試験は全て３回実施し、その平均値より算出した回収率を表５に示す。表５より、比較例２の培養液より回収した細胞が１６．６％であったのに対し、ＤＨｄ４０６の培養液より回収した細胞は９０．２％であり、ほとんどの細胞を回収できたことを確認した。また、遠心分離後の外観を図１２に示す。遠心分離前はいずれの培養液においても細胞は浮遊していたが、遠心分離後は図１２のようにＤＨｄ４０６の培養液のみが細胞が沈降し、良好なペレットを形成したことを確認した。一方、比較例２の培養液は、ほとんど細胞が沈降せず、培養液中に浮遊したままであった。上述の表５及び図１２の結果から、本発明の培地組成物ＤＨｄ４０６は、液状の培地中での細胞の浮遊と沈降を温度変化により制御可能であることを実証した。
対数増殖期にあるヒト肺胞基底上皮腺癌細胞（Ａ５４９、ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製）を３０×１０４細胞準備し、１５ｍＬコニカルチューブ（住友ベークライト社製）２本に各１５×１０４細胞ずつ分注した。遠心分離（３００ｘｇ，３分間）を行い上清除去した後、３７℃に加温したＰＤ－ＧＸＧを含む培地組成物（ＤＨｄ４０６）又はＤＡＧを含む培地組成物（比較例２）をそれぞれ１本ずつに１．５ｍＬ加えて緩やかに撹拌し細胞懸濁液を作製した（１０×１０４細胞／ｍＬ）。調製したそれぞれの細胞懸濁液を２４穴平底超低接着プレート（＃３４７３、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）へ各１ウェルに１３×１０４細胞分の１．３ｍＬずつ加え、３７℃、５％炭酸ガス条件下において４日間培養を行った。培養後、ウェル内の培養液全量を１．５ｍＬ丸底マイクロチューブ（深江化成社製）に移し、１００μＬ中の細胞中に含まれるＡＴＰ量をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ―Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、Ｇ７５７１）を用いてプレートリーダー（ｉｎｆｉｎｉｔｅＭ２００ＰＲＯ、テカン社製）により定量し、これを基準値とした。つぎに、１．５ｍＬ丸底マイクロチューブ内の残りの培養液１．０ｍＬが２０～２５℃になるまで静置後、遠心分離（３００ｘｇ，３分間）を行った。遠心分離後、上清を０．８ｍＬ除去し、残りの０．２ｍＬに培地を０．８ｍＬ加え、ピペッティングにより再懸濁した。再懸濁液１００μＬ中の細胞中に含まれるＡＴＰ量をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ―Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、Ｇ７５７１）を用いてプレートリーダー（ｉｎｆｉｎｉｔｅＭ２００ＰＲＯ、テカン社製）により定量し、遠心分離前後でのＲＬＵ値を比較することで細胞の回収率を算出した。以上の試験は全て３回実施し、その平均値より算出した回収率を表５に示す。表５より、比較例２の培養液より回収した細胞が１６．６％であったのに対し、ＤＨｄ４０６の培養液より回収した細胞は９０．２％であり、ほとんどの細胞を回収できたことを確認した。また、遠心分離後の外観を図１２に示す。遠心分離前はいずれの培養液においても細胞は浮遊していたが、遠心分離後は図１２のようにＤＨｄ４０６の培養液のみが細胞が沈降し、良好なペレットを形成したことを確認した。一方、比較例２の培養液は、ほとんど細胞が沈降せず、培養液中に浮遊したままであった。上述の表５及び図１２の結果から、本発明の培地組成物ＤＨｄ４０６は、液状の培地中での細胞の浮遊と沈降を温度変化により制御可能であることを実証した。
【0069】
【表5】
【産業上の利用可能性】
【0070】
本発明によれば、効率よく細胞を拡大培養することができる。また、培養した細胞を、細胞を傷つけずに効率良く回収することができる。従って、本発明は、例えば、再生医療分野において極めて有用である。
【0071】
本出願は日本で出願された特願２０１９－０６５０７５（出願日：２０１９年３月２８日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
