(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-08-19
(45)【発行日】2024-08-27
(54)【発明の名称】粒子収集装置及び粒子径分布測定方法
(51)【国際特許分類】
G01N 1/04 20060101AFI20240820BHJP
G01N 37/00 20060101ALI20240820BHJP
C12M 1/00 20060101ALI20240820BHJP
G01N 15/02 20240101ALI20240820BHJP
【ＦＩ】
G01N1/04 M
G01N37/00 101
C12M1/00 A
G01N15/02 F
【請求項の数】
9
(21)【出願番号】P 2020083270
(22)【出願日】2020-05-11
(65)【公開番号】P2021179320
(43)【公開日】2021-11-18
【審査請求日】2023-02-20
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成３０年度、国立研究開発法人科学技術振興機構、戦略的創造研究推進事業（さきがけ）、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(73)【特許権者】
【識別番号】519135633
【氏名又は名称】公立大学法人大阪
(74)【代理人】
【識別番号】100103034
【弁理士】
【氏名又は名称】野河 信久
(74)【代理人】
【識別番号】100065248
【弁理士】
【氏名又は名称】野河 信太郎
(74)【代理人】
【識別番号】100159385
【弁理士】
【氏名又は名称】甲斐 伸二
(74)【代理人】
【識別番号】100163407
【弁理士】
【氏名又は名称】金子 裕輔
(74)【代理人】
【識別番号】100166936
【弁理士】
【氏名又は名称】稲本 潔
(74)【代理人】
【識別番号】100174883
【弁理士】
【氏名又は名称】冨田 雅己
(72)【発明者】
【氏名】許 岩
【審査官】永田 浩司
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２０１７／０１０７５０７（ＵＳ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１８／２１２３０９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２０１５－１０９８２１（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１７－１５３４２２（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ １／０２ － １／２６
Ｇ０１Ｎ ３７／００
Ｃ１２Ｍ １／００ － １／４２
Ｇ０１Ｎ １５／０２ － １／０２２７
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
導入流路と、前記導入流路を流れる液体が流入するように設けられた第１流路と、第２流路と、第１流路と第２流路とを連通するように設けられた複数の第１連通流路と、第２流路の下流側において第２流路に接続した第１収集チャンバと、第３流路と、第１収集チャンバと第３流路とを連通するように設けられた第２連通流路とを備え、第１流路は、様々な粒径の粒子を含む液体が流れるように設けられ、
第１連通流路の幅は、第１流路を流れる液体に含まれる様々な粒径の粒子から第１粒径以下の粒子を分離するように設定され、
第２流路は、第１連通流路により分離された第１粒径以下の粒子を含む液体が第２流路を流れ第１収集チャンバに流入するように設けられ、
第２連通流路の幅は、第１収集チャンバ内の液体に含まれる粒子から第２粒径以下の粒子を分離するように設定され、
第２連通流路は、分離された第２粒径以下の粒子を含む液体が第３流路に流入するように設けられ、
第１流路の終端は第３流路に接続し、第１流路と第３流路はネック構造で連通し、
第１収集チャンバには第２粒径より大きく第１粒径以下の範囲の粒子が収集されることを特徴とする粒子収集装置。
【請求項2】
導入流路と、前記導入流路を流れる液体が流入するように設けられた第１流路と、第２流路と、第１流路と第２流路とを連通するように設けられた複数の第１連通流路と、第２流路の下流側において第２流路に接続した第１収集チャンバと、第３流路と、第１収集チャンバと第３流路とを連通するように設けられた第２連通流路と、粒子抽出用開口とを備え、第１流路は、様々な粒径の粒子を含む液体が流れるように設けられ、
第１連通流路の幅は、第１流路を流れる液体に含まれる様々な粒径の粒子から第１粒径以下の粒子を分離するように設定され、
第２流路は、第１連通流路により分離された第１粒径以下の粒子を含む液体が第２流路を流れ第１収集チャンバに流入するように設けられ、
第２連通流路の幅は、第１収集チャンバ内の液体に含まれる粒子から第２粒径以下の粒子を分離するように設定され、
第２連通流路は、分離された第２粒径以下の粒子を含む液体が第３流路に流入するように設けられ、
前記粒子抽出用開口は、第１収集チャンバの底面又天井面と粒子収集装置の外面とを連通するように設けられ、
第１収集チャンバには第２粒径より大きく第１粒径以下の範囲の粒子が収集されることを特徴とする粒子収集装置。
【請求項3】
第１基板と第２基板とを備え、第１、第２又は第３流路或いは第１又は第２連通流路は、第１基板に設けられた溝が第２基板で覆われた構造を有する請求項１又は２に記載の粒子収集装置。
【請求項4】
第１連通流路は、ネック流路と、前記ネック流路の第１流路側に設けられた進入流路とを有し、前記進入流路の幅は、前記ネック流路の幅よりも大きい請求項１～３のいずれか１つに記載の粒子収集装置。
【請求項5】
第１連通流路の深さは、前記ネック流路の幅の１．０倍以上である請求項４に記載の粒子収集装置。
【請求項6】
第２収集チャンバと、第４流路と、第２収集チャンバと第４流路とを連通するように設けられた第３連通流路とをさらに備え、第２収集チャンバは、第３流路を流れた液体が第２収集チャンバに流入するように設けられ、
第３連通流路の幅は、第２収集チャンバ内の液体に含まれる粒子から第３粒径以下の粒子を分離するように設定され、
第３連通流路は、分離された第３粒径以下の粒子を含む液体が第４流路に流入するように設けられた請求項１～５のいずれか１つに記載の粒子収集装置。
【請求項7】
圧力調整部をさらに備え、前記圧力調整部は、第１流路の圧力が第２流路の圧力よりも大きくなるように上流側と下流側との圧力差を調整するように設けられた請求項１～６のいずれか１つに記載の粒子収集装置。
【請求項8】
第１流路構造、第２流路構造、第３流路構造、第４流路構造及び第５流路構造を備え、第１～第５流路構造のそれぞれは、第１流路と、第２流路と、複数の第１連通流路と、第１収集チャンバと、第２連通流路とを備え、
第１～第５流路構造の第１連通流路は、それぞれ異なる幅を有する請求項１～７のいずれか１つに記載の粒子収集装置。
【請求項9】
請求項８に記載の粒子収集装置の各第１流路に様々な粒径の粒子を含む液体を流すステップと、各第１流路に前記液体を流した後各第１収集チャンバに収集された粒子の第１粒子量を計測するステップと、
第１粒子量を計測した後第１流路の圧力が第２流路の圧力よりも大きくなるように圧力を調整するステップと、
圧力を調整した後各第１収集チャンバに収集された粒子の第２粒子量を計測するステップと、
第１粒子量と第２粒子量との差を算出するステップとを含む粒子径分布測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、粒子収集装置及び粒子径分布測定方法に関する。
【背景技術】
【0002】
ナノ粒子は、マテリアル、分析化学、触媒化学、生化学、光デバイス、エネルギー、バイオ、医療などの分野で幅広く利用されている。このようなナノ粒子を利用する分野において、ナノ粒子のサイズ分画及び微量サンプルからのナノ粒子の収集・回収が課題となっている。特に、医療診断、創薬、基礎生物学などのバイオ分野では、細胞外小胞顆粒（例えば、サイズが30nm～200nm程度といわれているエクソソーム）やウィルス（サイズ：20nm～300nm程度）などの生体ナノ粒子を微量な検体から生の状態でサイズ分画、収集、回収することが求められている。
【0003】
エクソソーム、リポソーム、ウィルスなどのナノ粒子を分離・回収する方法として超遠心分離法（100000G以上）が主に用いられている（例えば、特許文献１参照）。超遠心分離法は、サンプル中の微粒子の比重の差を利用して微粒子を分離精製・回収する方法である。このため、この分離法は、ナノサイズレベルの分離能がなく、エクソソームと不純物とを分離することが困難であり、さらに、エクソソームをサイズ分画することもできない。また、超遠心分離を行うとエクソソームの構造を破壊している恐れがあるという報告もある。さらに、超遠心分離法は、多量のサンプル量（数十mL）が必要となること、専門家による煩雑で時間を要する操作（３ｈ～２４ｈ）が必要なことなどの問題がある。
また、ダメージレスのナノ粒子を短時間で捕捉することができる流体チップが知られている（例えば、特許文献２）。
また、ダメージレスのナノ粒子を短時間で捕捉することができる流体チップが知られている（例えば、特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【文献】特表２０１９－５２８０８５号公報
【文献】WO 2018/212309 A1
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
しかし、従来の流体チップでは、ナノ粒子をサイズ分画し収集することができない。
本発明は、このような事情に鑑みてなされたものであり、サイズ分画した所望の粒径範囲の粒子を収集チャンバに短時間で収集することができる粒子収集装置を提供する。
本発明は、このような事情に鑑みてなされたものであり、サイズ分画した所望の粒径範囲の粒子を収集チャンバに短時間で収集することができる粒子収集装置を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明は、導入流路と、前記導入流路を流れる液体が流入するように設けられた第１流路と、第２流路と、第１流路と第２流路とを連通するように設けられた複数の第１連通流路と、第２流路の下流側において第２流路に接続した第１収集チャンバと、第３流路と、第１収集チャンバと第３流路とを連通するように設けられた第２連通流路とを備え、第１流路は、様々な粒径の粒子を含む液体が流れるように設けられ、第１連通流路の幅は、第１流路を流れる液体に含まれる様々な粒径の粒子から第１粒径以下の粒子を分離するように設定され、第２流路は、第１連通流路により分離された第１粒径以下の粒子を含む液体が第２流路を流れ第１収集チャンバに流入するように設けられ、第２連通流路の幅は、第１収集チャンバ内の液体に含まれる粒子から第２粒径以下の粒子を分離するように設定され、第２連通流路は、分離された第２粒径以下の粒子を含む液体が第３流路に流入するように設けられたことを特徴とする粒子収集装置を提供する。また、第３流路は排出側流路であってもよい。
【発明の効果】
【0007】
本発明の粒子収集装置の第１流路に様々な粒径の粒子を含む第１液体を流すことにより、第２粒径以上第１粒径以下の粒子を第１収集チャンバに収集することができる。従って、第１液体に含まれる粒子をサイズ分画した所望の粒径範囲の粒子を第１収集チャンバに短時間で収集することができる。
【図面の簡単な説明】
【0008】
【図1】本発明の一実施形態の粒子収集装置の概略平面図である。
【図3】（ａ）～（ｄ）はそれぞれ粒子収集装置の部分断面図である。
【図4】本発明の一実施形態の粒子収集装置の部分拡大図である。
【図5】本発明の一実施形態の粒子収集装置の部分拡大図である。
【図6】本発明の一実施形態の粒子収集装置の部分拡大図である。
【図7】（ａ）は作製した粒子収集装置の写真であり、（ｂ）は作製した粒子収集装置のＳＥＭ画像である。
【図8】ＨＴ－２９細胞由来のエクソソームサンプルに含まれるエクソソームの粒径分布である。
【図9】収集チャンバに収集したエクソソームの計測結果を示すグラフである。
【図10】ＨＫＴ－２９３Ｔ細胞由来のエクソソームサンプルに含まれるエクソソームの粒径分布である。
【図11】収集チャンバに収集したエクソソームの計測結果を示すグラフである。
【図12】粒子抽出口を形成した石英ガラス基板の写真である。
【発明を実施するための形態】
【0009】
本発明の粒子収集装置は、導入流路と、前記導入流路を流れる液体が流入するように設けられた第１流路と、第２流路と、第１流路と第２流路とを連通するように設けられた複数の第１連通流路と、第２流路の下流側において第２流路に接続した第１収集チャンバと、第３流路と、第１収集チャンバと第３流路とを連通するように設けられた第２連通流路とを備え、第１流路は、様々な粒径の粒子を含む液体が流れるように設けられ、第１連通流路の幅は、第１流路を流れる液体に含まれる様々な粒径の粒子から第１粒径以下の粒子を分離するように設定され、第２流路は、第１連通流路により分離された第１粒径以下の粒子を含む液体が第２流路を流れ第１収集チャンバに流入するように設けられ、第２連通流路の幅は、第１収集チャンバ内の液体に含まれる粒子から第２粒径以下の粒子を分離するように設定され、第２連通流路は、分離された第２粒径以下の粒子を含む液体が第３流路に流入するように設けられたことを特徴とする。第３流路は、排出側流路であってもよい。
【0010】
本発明の粒子収集装置は第１基板と第２基板とを備えることが好ましく、第１、第２又は第３流路或いは第１又は第２連通流路は、第１基板に設けられた溝が第２基板で覆われた構造を有することが好ましい。
第１連通流路は、ネック流路と、前記ネック流路の第１流路側に設けられた進入流路とを有することが好ましく、前記進入流路の幅は、前記ネック流路の幅よりも大きいことが好ましい。進入流路を設けることにより、第１流路を流れる粒子が第１連通流路に入りやすくなり、第１収集チャンバに収集できる粒子量を多くすることができる。
第１連通流路は、ネック流路と、前記ネック流路の第１流路側に設けられた進入流路とを有することが好ましく、前記進入流路の幅は、前記ネック流路の幅よりも大きいことが好ましい。進入流路を設けることにより、第１流路を流れる粒子が第１連通流路に入りやすくなり、第１収集チャンバに収集できる粒子量を多くすることができる。
【0011】
第１連通流路の深さは、ネック流路の幅の１．０倍以上であることが好ましい。
本発明の粒子収集装置は、第２収集チャンバと、第４流路と、第２収集チャンバと第４流路とを連通するように設けられた第３連通流路とをさらに備えることが好ましい。第２収集チャンバは、第３流路を流れた液体が第２収集チャンバに流入するように設けられることが好ましい。第３連通流路の幅は、第２収集チャンバ内の液体に含まれる粒子から第３粒径以下の粒子を分離するように設定されることが好ましい。第３連通流路は、分離された第３粒径以下の粒子を含む液体が第４流路に流入するように設けられることが好ましい。このことにより、第１収集チャンバ及び第２収集チャンバのそれぞれにサイズ分画された粒子を収集することができる。
本発明の粒子収集装置は、第２収集チャンバと、第４流路と、第２収集チャンバと第４流路とを連通するように設けられた第３連通流路とをさらに備えることが好ましい。第２収集チャンバは、第３流路を流れた液体が第２収集チャンバに流入するように設けられることが好ましい。第３連通流路の幅は、第２収集チャンバ内の液体に含まれる粒子から第３粒径以下の粒子を分離するように設定されることが好ましい。第３連通流路は、分離された第３粒径以下の粒子を含む液体が第４流路に流入するように設けられることが好ましい。このことにより、第１収集チャンバ及び第２収集チャンバのそれぞれにサイズ分画された粒子を収集することができる。
【0012】
本発明の粒子収集装置は圧力調整部を備えることが好ましく、前記圧力調整部は、第１流路の圧力が第２流路の圧力よりも大きくなるように上流側と下流側との圧力差を調整するように設けられることが好ましい。このことにより、第１連通流路を通過する粒子の量を増やすことができ、第１収集チャンバに収集する粒子の量を増やすことができる。
本発明の粒子収集装置は粒子抽出用開口を備えることが好ましく、前記粒子抽出用開口は、第１収集チャンバの底面又天井面と前記粒子収集装置の外面とを連通するように設けられることが好ましい。このことにより、第１収集チャンバに収集した粒子を装置外に抽出することができ、収集した粒子を様々な方法で分析することができる。
本発明の粒子収集装置は粒子抽出用開口を備えることが好ましく、前記粒子抽出用開口は、第１収集チャンバの底面又天井面と前記粒子収集装置の外面とを連通するように設けられることが好ましい。このことにより、第１収集チャンバに収集した粒子を装置外に抽出することができ、収集した粒子を様々な方法で分析することができる。
【0013】
本発明の粒子収集装置は第１流路構造、第２流路構造、第３流路構造、第４流路構造及び第５流路構造を備えることが好ましく、第１～第５流路構造のそれぞれは、第１流路と、第２流路と、複数の第１連通流路と、第１収集チャンバと、第２連通流路とを備えることが好ましい。また、第１～第５流路構造の第１連通流路は、それぞれ異なる幅を有することが好ましい。このような粒子収集装置を利用して粒径分布測定を行うことが可能になる。
本発明は、本発明の粒子収集装置の各第１流路に様々な粒径の粒子を含む液体を流すステップと、各第１流路に前記液体を流した後各第１収集チャンバに収集された粒子の第１粒子量を計測するステップと、第１粒子量を計測した後第１流路の圧力が第２流路の圧力よりも大きくなるように圧力を調整するステップと、圧力を調整した後各第１収集チャンバに収集された粒子の第２粒子量を計測するステップと、第１粒子量と第２粒子量との差を算出するステップとを含む粒子径分布測定方法も提供する。
本発明は、本発明の粒子収集装置の各第１流路に様々な粒径の粒子を含む液体を流すステップと、各第１流路に前記液体を流した後各第１収集チャンバに収集された粒子の第１粒子量を計測するステップと、第１粒子量を計測した後第１流路の圧力が第２流路の圧力よりも大きくなるように圧力を調整するステップと、圧力を調整した後各第１収集チャンバに収集された粒子の第２粒子量を計測するステップと、第１粒子量と第２粒子量との差を算出するステップとを含む粒子径分布測定方法も提供する。
【0014】
以下、複数の実施形態を参照して本発明をより詳細に説明する。図面や以下の記述中で示す構成は、例示であって、本発明の範囲は、図面や以下の記述中で示すものに限定されない。
【0015】
第１実施形態
図１は本実施形態の粒子収集装置の概略平面図であり、図２は図１の破線で囲んだ範囲Ａにおける粒子収集装置の部分拡大図である。図３（ａ）は図２の破線Ｂ－Ｂにおける粒子収集装置の部分断面図であり、図３（ｂ）は図２の破線Ｃ－Ｃにおける粒子収集装置の部分断面図であり、図３（ｃ）は図２の破線Ｄ－Ｄにおける粒子収集装置の部分断面図であり、図３（ｄ）は図２の破線Ｅ－Ｅにおける粒子収集装置の部分断面図である。
図１は本実施形態の粒子収集装置の概略平面図であり、図２は図１の破線で囲んだ範囲Ａにおける粒子収集装置の部分拡大図である。図３（ａ）は図２の破線Ｂ－Ｂにおける粒子収集装置の部分断面図であり、図３（ｂ）は図２の破線Ｃ－Ｃにおける粒子収集装置の部分断面図であり、図３（ｃ）は図２の破線Ｄ－Ｄにおける粒子収集装置の部分断面図であり、図３（ｄ）は図２の破線Ｅ－Ｅにおける粒子収集装置の部分断面図である。
【0016】
本実施形態の粒子収集装置５０は、導入流路１０と、導入流路１０を流れる液体が流入するように設けられた第１流路４（４ａ～４ｃ）と、第２流路５（５ａ～５ｃ）と、第１流路４と第２流路５とを連通するように設けられた複数の第１連通流路６と、第２流路５の下流側において第２流路５に接続した第１収集チャンバ８（８ａ～８ｃ）と、第３流路（排出側流路１４）と、第１収集チャンバ８と第３流路（排出側流路１４）とを連通するように設けられた第２連通流路９とを備え、第１流路４は、様々な粒径の粒子を含む第１液体が流れるように設けられ、第１連通流路６の流路幅Ｗａは、第１液体に含まれる様々な粒径の粒子から第１粒径以下の粒子を分離するように設定され、第２流路５は、第１連通流路６により分離された第１粒径以下の粒子を含む第２液体が第２流路５を流れ第１収集チャンバ８に流入するように設けられ、第２連通流路９の流路幅Ｗｃは、第２液体に含まれる粒子から第２粒径以下の粒子を分離するように設定され、第２連通流路９は、分離された第２粒径以下の粒子を含む第３液体が第３流路（排出側流路１４）に流入するように設けられたことを特徴とする。本実施形態では第３流路は排出側流路１４であるが、他の実施形態では、第３流路は他の流路であってもよい。
また、本実施形態の粒子収集装置５０は、導入流路１０と第１流路４との間に扁平流路１２を有することができる。また、粒子収集装置５０は、第２連通流路９と排出側流路１４の間に扁平流路を有することもできる。また、第１流路４、第２流路５、第１連通流路６、第１収集チャンバ８、第２連通流路９などは、流路構造３５（３５ａ～３５ｃ）を構成する。
また、本実施形態の粒子収集装置５０は、導入流路１０と第１流路４との間に扁平流路１２を有することができる。また、粒子収集装置５０は、第２連通流路９と排出側流路１４の間に扁平流路を有することもできる。また、第１流路４、第２流路５、第１連通流路６、第１収集チャンバ８、第２連通流路９などは、流路構造３５（３５ａ～３５ｃ）を構成する。
【0017】
粒子収集装置５０は、ターゲット粒子を収集するための装置である。また、粒子収集装置５０は、粒子分画装置であってもよい。また、粒子収集装置５０は、小胞収集装置（又は小胞分画装置）、ウィルス収集装置（又はウィルス分画装置）であってもよい。
ターゲット粒子は、例えば、小胞、細胞小器官、細胞外小胞（エクソソーム、マイクロベジクルなど）、ウィルス、リポソーム、金属粒子、合金粒子、有機粒子、無機粒子、半導体粒子（量子ドット）、大気汚染微粒子（浮遊粒子状物質、ＰＭ２．５など）、花粉などである。粒子収集装置５０は、このようなターゲット粒子を含む液体を流路に流すことにより、ターゲット粒子を分画し収集チャンバに収集する。
ターゲット粒子は、例えば、小胞、細胞小器官、細胞外小胞（エクソソーム、マイクロベジクルなど）、ウィルス、リポソーム、金属粒子、合金粒子、有機粒子、無機粒子、半導体粒子（量子ドット）、大気汚染微粒子（浮遊粒子状物質、ＰＭ２．５など）、花粉などである。粒子収集装置５０は、このようなターゲット粒子を含む液体を流路に流すことにより、ターゲット粒子を分画し収集チャンバに収集する。
【0018】
ターゲット粒子が細胞外小胞である場合、例えば、血清、血漿、尿、培養上清、唾液、羊水、悪性腹水、脳脊髄液（ＣＳＦ）、胃腸液（ＧＩ）、炎症性液、リンパ液、肺胞洗浄液などを粒子収集装置５０の流路に流す。
ターゲット粒子の平均粒径は、例えば、１ｎｍ以上１００μｍ以下であり、好ましくは５ｎｍ以上１μｍ以下であり、より好ましくは２０ｎｍ以上３００ｎｍ以下である。
ターゲット粒子の平均粒径は、例えば、１ｎｍ以上１００μｍ以下であり、好ましくは５ｎｍ以上１μｍ以下であり、より好ましくは２０ｎｍ以上３００ｎｍ以下である。
【0019】
粒子収集装置５０は、第１流路４、第２流路５、第１連通流路６、第２連通流路９、第１収集チャンバ８などを設けることができれば、その構造は限定されないが、例えば、第１基板２と第２基板３とを重ねた構造を有することができる。この場合、第１流路４、第２流路５、第１連通流路６、第２連通流路９、第１収集チャンバ８などとなる溝を第１基板２に形成し、第１基板２の溝を形成した表面上に第２基板３を接着することができる。このことにより、第１基板２と第２基板３との間に、第１流路４、第２流路５、第１連通流路６、第２連通流路９、第１収集チャンバ８などを形成することができる。
複数の流路構造３５は、第１基板２と第２基板３との間に形成されてもよい。また、粒子収集装置５０が積層された３つ以上の基板を有し、隣接する２つの基板の間のそれぞれに流路構造３５が設けられてもよい。この場合、粒子収集装置５０は、三次元的に配置された複数の流路構造３５を有する。
複数の流路構造３５は、第１基板２と第２基板３との間に形成されてもよい。また、粒子収集装置５０が積層された３つ以上の基板を有し、隣接する２つの基板の間のそれぞれに流路構造３５が設けられてもよい。この場合、粒子収集装置５０は、三次元的に配置された複数の流路構造３５を有する。
【0020】
第１基板２の材料および第２基板３の材料は、無機材料であってもよく、有機材料であってもよい。第１基板２の材料および第２基板３の材料は、透光性を有することが好ましい。このことにより、粒子収集装置５０により収集した粒子を光学的に観察、解析することが可能になる。
第１基板２または第２基板３は、例えば、ガラス基板（石英ガラス基板など）、シリコーン系材料基板（ポリジメチルシロキサン（PDMS）など）、ポリマー・樹脂基板（ポリメタクリル酸メチル（PMMA）樹脂、ポリカーボネート（PC）樹脂など)、半導体基板（シリコン基板など）、セラミックス基板などである。特に第１基板２および第２基板３にガラス基板を用いることが好ましい。ガラスの表面には通常水酸基（－ＯＨ）が存在するため、第１流路４、第２流路５、第１連通流路６などの内表面を親水性にすることができる。このため、ターゲット粒子を含む水溶液を毛管現象により第１流路４などに流すことができる。また、ガラス基板は透光性を有するため、第１収集チャンバ８に収集したターゲット粒子を光学的に観察することができる。また、ターゲット粒子に光学的処理を施すことも可能である。
第１基板２または第２基板３は、例えば、ガラス基板（石英ガラス基板など）、シリコーン系材料基板（ポリジメチルシロキサン（PDMS）など）、ポリマー・樹脂基板（ポリメタクリル酸メチル（PMMA）樹脂、ポリカーボネート（PC）樹脂など)、半導体基板（シリコン基板など）、セラミックス基板などである。特に第１基板２および第２基板３にガラス基板を用いることが好ましい。ガラスの表面には通常水酸基（－ＯＨ）が存在するため、第１流路４、第２流路５、第１連通流路６などの内表面を親水性にすることができる。このため、ターゲット粒子を含む水溶液を毛管現象により第１流路４などに流すことができる。また、ガラス基板は透光性を有するため、第１収集チャンバ８に収集したターゲット粒子を光学的に観察することができる。また、ターゲット粒子に光学的処理を施すことも可能である。
【0021】
第１流路４、第２流路５、第１連通流路６などとなる溝は、第１基板２をエッチング処理することにより形成することができる。例えば、第１基板２の表面上にレジストを塗布した後、電子ビームによりレジストの一部を除去しレジストにパターンを形成する。この後、レジストをマスクとしてエッチングを行い第１基板２の一部を除去し溝を形成する。このようなエッチング処理により、第１流路４、第２流路５、第１連通流路６などが形成されるような溝を第１基板２に形成することができる。また、導入流路１０又は排出側流路１４となる溝は、フォトリソグラフィとエッチング技術により第１基板２又は第２基板３に形成することができる。この後、第１基板２と第２基板３とを接着して所望の流路が形成された粒子収集装置５０を製造することができる。
第１基板２と第２基板３とは、熱接合により接着されてもよく、融着されてもよい。また、第１基板２と第２基板３とにプラズマ処理を施し、第１基板２のプラズマ処理された表面と第２基板３のプラズマ処理された表面とを接触させることにより第１基板２と第２基板３とを接着してもよい。
なお、第１基板２と第２基板３の両方に溝を形成して第１基板２と第２基板３との間に第１流路４、第２流路５、第１連通流路６などを形成してもよい。
第１基板２と第２基板３とは、熱接合により接着されてもよく、融着されてもよい。また、第１基板２と第２基板３とにプラズマ処理を施し、第１基板２のプラズマ処理された表面と第２基板３のプラズマ処理された表面とを接触させることにより第１基板２と第２基板３とを接着してもよい。
なお、第１基板２と第２基板３の両方に溝を形成して第１基板２と第２基板３との間に第１流路４、第２流路５、第１連通流路６などを形成してもよい。
【0022】
粒子収集装置５０は、導入流路１０を有することができる。導入流路１０は、ターゲット粒子を含む液体を第１流路４（流路構造３５）に供給するための流路である。導入流路１０は、第１流路４の流路断面又は扁平流路１２の流路断面よりも広い流路断面を有する。導入流路１０を流れる液体は、ターゲット粒子の他、様々な粒径の粒子を含むことができる。
導入流路１０は、注入口２８ａから流入した液体が導入流路１０を流れ排出口２９ａから排出されるように設けることができる。また、導入流路１０は、導入流路１０を流れる液体の一部が扁平流路１２に流入するように設けることができる。このように導入流路１０を設けることにより、液体中の粒子のうち扁平流路１２の厚さよりも大きい粒径の粒子は、扁平流路１２に流入せずに排出口２９ａに向かって流れ、扁平流路１２の厚さよりも小さい粒径の粒子は、扁平流路１２に流入することができる。従って、扁平流路１２の流入口において液体と共に扁平流路１２に流入する粒子をフィルタリングすることができる。
導入流路１０は、注入口２８ａから流入した液体が導入流路１０を流れ排出口２９ａから排出されるように設けることができる。また、導入流路１０は、導入流路１０を流れる液体の一部が扁平流路１２に流入するように設けることができる。このように導入流路１０を設けることにより、液体中の粒子のうち扁平流路１２の厚さよりも大きい粒径の粒子は、扁平流路１２に流入せずに排出口２９ａに向かって流れ、扁平流路１２の厚さよりも小さい粒径の粒子は、扁平流路１２に流入することができる。従って、扁平流路１２の流入口において液体と共に扁平流路１２に流入する粒子をフィルタリングすることができる。
【0023】
導入流路１０は、注入口２８ａに供給されたターゲット粒子を含む液体が毛管現象により導入流路１０を流れるように設けることができる。このことにより、送液ポンプ２５などを省略することができ、装置を簡素化することができる。例えば、ターゲット粒子を含む液体を注入口２８ａに滴下することにより、導入流路１０に液体を流すことができる。
導入流路１０は、送液ポンプ２５を利用してターゲット粒子を含む液体が導入流路１０を流れるように設けられてもよい。このことのより、第１流路４と第２流路５との間に圧力差を形成することができ、第１収集チャンバ８に収集される粒子の量を増やすこととができる。送液ポンプ２５は、例えばシリンジポンプである。また、送液ポンプ２５は、圧力調整部として機能する。また、圧力調整部は、第２流路５側を減圧することにより第１流路４と第２流路５との間に圧力差を形成する部分であってもよい。
導入流路１０は、送液ポンプ２５を利用してターゲット粒子を含む液体が導入流路１０を流れるように設けられてもよい。このことのより、第１流路４と第２流路５との間に圧力差を形成することができ、第１収集チャンバ８に収集される粒子の量を増やすこととができる。送液ポンプ２５は、例えばシリンジポンプである。また、送液ポンプ２５は、圧力調整部として機能する。また、圧力調整部は、第２流路５側を減圧することにより第１流路４と第２流路５との間に圧力差を形成する部分であってもよい。
【0024】
注入口２８ａに注入する液体は、注入する前にフィルタリング処理を施されたものであってもよい。このことにより、導入流路１０に詰まるような大きな粒子を液体から除去することができ、導入流路１０が詰まることを抑制することができる。例えば、０．２２μｍフィルター、０．４５μｍフィルターなどのフィルターのろ液を注入口２８ａから導入流路１０に注入することができる。また、遠心分離処理により得られた上清を注入口２８ａから導入流路１０に注入することもできる。
【0025】
粒子収集装置５０は、第１流路４（流路構造３５）と導入流路１０との間に設けられた扁平流路１２を有することができる。扁平流路１２は、導入流路１０を流れた液体が扁平流路１２に流入し、扁平流路１２を流れた液体が流路構造３５の第１流路４に流入するように設けることができる。扁平流路１２は、扁平な流路断面を有し、厚さが小さく、横幅の広い流路である。
液体が導入流路１０から扁平流路１２に流入する流入口は、扁平流路１２の流路断面と同様の形状を有することができる。このことにより、導入流路１０を流れてきた粒子の１つが扁平流路１２に詰まったとしても、扁平流路１２が閉塞されることはない。従って、扁平流路１２を設けることにより、導入流路１０から第１流路４（流路構造３５）に向かう液体の流れが遮断されることを抑制することができる。
液体が導入流路１０から扁平流路１２に流入する流入口は、扁平流路１２の流路断面と同様の形状を有することができる。このことにより、導入流路１０を流れてきた粒子の１つが扁平流路１２に詰まったとしても、扁平流路１２が閉塞されることはない。従って、扁平流路１２を設けることにより、導入流路１０から第１流路４（流路構造３５）に向かう液体の流れが遮断されることを抑制することができる。
【0026】
粒子収集装置５０は、流路構造３５（３５ａ～３５ｃ）を有する。流路構造３５は、液体に含まれる様々な粒径の粒子を所望の粒径範囲にサイズ分画し、サイズ分画された粒子を第１収集チャンバ８に収集する流路構造である。
流路構造３５は、第１流路４（４ａ～４ｃ）と、第２流路５（５ａ～５ｃ）と、第１流路４と第２流路５とを連通するように設けられた複数の第１連通流路６と、第２流路５の下流側において第２流路５に接続した第１収集チャンバ８（８ａ～８ｃ）と、第２連通流路９とを備える。
粒子収集装置５０は、複数の流路構造３５を備えることができる。例えば、図１～３に示した粒子収集装置５０は、３つの流路構造３５ａ～３５ｃを備えている。各流路構造３５は基本的には同じ構造を有するが、第１連通流路６の流路幅Ｗａ、第２連通流路９の流路幅Ｗｃなどは流路構造３５によって異なってもよい。
流路構造３５は、第１流路４（４ａ～４ｃ）と、第２流路５（５ａ～５ｃ）と、第１流路４と第２流路５とを連通するように設けられた複数の第１連通流路６と、第２流路５の下流側において第２流路５に接続した第１収集チャンバ８（８ａ～８ｃ）と、第２連通流路９とを備える。
粒子収集装置５０は、複数の流路構造３５を備えることができる。例えば、図１～３に示した粒子収集装置５０は、３つの流路構造３５ａ～３５ｃを備えている。各流路構造３５は基本的には同じ構造を有するが、第１連通流路６の流路幅Ｗａ、第２連通流路９の流路幅Ｗｃなどは流路構造３５によって異なってもよい。
【0027】
第１流路４は、様々な粒径の粒子を含む液体を扁平流路１２から流路構造３５に引き込む流路である。第１流路４の流路断面は特に限定されないが、例えば矩形の流路断面を有することができる。第１流路４は、第１連通流路６の流路幅Ｗａの１．２倍以上２０倍以下の流路幅及び深さを有することができる。
複数の第１連通流路６が第１流路４から第２流路５に向かって伸びる。このため、第１流路４を流れる液体がターゲット粒子と共に第２流路５に流入することができる。例えば、図１～３に示した粒子収集装置５０では、１３本の第１連通流路６が第１流路４と第２流路５とを連通している。１本の第１流路４から第２流路５に向かって伸びる第１連通流路６の数は、特に限定されないが、例えば、５本以上１００００本以下とすることができ、好ましくは１０本以上１００００本以下とすることができる。
複数の第１連通流路６が第１流路４から第２流路５に向かって伸びる。このため、第１流路４を流れる液体がターゲット粒子と共に第２流路５に流入することができる。例えば、図１～３に示した粒子収集装置５０では、１３本の第１連通流路６が第１流路４と第２流路５とを連通している。１本の第１流路４から第２流路５に向かって伸びる第１連通流路６の数は、特に限定されないが、例えば、５本以上１００００本以下とすることができ、好ましくは１０本以上１００００本以下とすることができる。
【0028】
第１流路４の終端は、排出側流路１４に接続することができる。このことにより、第１流路４を流れる液体に含まれる様々な粒径の粒子のうち、第１連通流路６に流れる以外の粒子（第１連通流路６の流路幅よりも大きい粒子を含む）が液体と共に排出側流路１４に流れることができ、第１連通流路６に流れる以外の粒子が第１流路４に溜まることを抑制することができる。
また、第１流路４は、複数の第１連通流路６のうち排出側流路１４側の端の第１連通流路６と排出側流路１４との間にネック構造１８を有することができる。また、第１流路４と排出側流路１４は、このネック構造１８で連通する。この連通構造において、第１流路４を流れてきた溶液に含まれる一部の粒子がネック構造１８に溜まることにより、このネック構造１８がバルブ（semi-open）となり、液体は排出側流路１４へ流れるが、粒子の排出側流路１４への流出を抑制できる選択的なバルブ機能をする。このようなセミオープンバルブ機能により、サンプルに含まれる粒子の流失を抑制することができ、より多くの粒子を第１連通流路６に流すことができる。また、このネック構造１８を利用して溶液のチップ内への導入もできるため、後の粒子分析などの多様な操作に対応することが可能になる。
また、第１流路４は、複数の第１連通流路６のうち排出側流路１４側の端の第１連通流路６と排出側流路１４との間にネック構造１８を有することができる。また、第１流路４と排出側流路１４は、このネック構造１８で連通する。この連通構造において、第１流路４を流れてきた溶液に含まれる一部の粒子がネック構造１８に溜まることにより、このネック構造１８がバルブ（semi-open）となり、液体は排出側流路１４へ流れるが、粒子の排出側流路１４への流出を抑制できる選択的なバルブ機能をする。このようなセミオープンバルブ機能により、サンプルに含まれる粒子の流失を抑制することができ、より多くの粒子を第１連通流路６に流すことができる。また、このネック構造１８を利用して溶液のチップ内への導入もできるため、後の粒子分析などの多様な操作に対応することが可能になる。
【0029】
第１連通流路６の流路幅Ｗａは、第１流路４を流れる液体に含まれる様々な粒径の粒子から第１粒径以下の粒子を分離するように設定される。第１連通流路６により分離された第１粒径以下の粒子は、液体と共に第２流路５へと流れ、その他の粒子は液体と共に第１流路４を流れていく。従って、第１連通流路６により、第１粒径以下の粒子と第１粒径よりも大きい粒子とを分離することができる。また、圧力調整部を用いて第１流路４の圧力を第２流路５の圧力よりも大きくすることができる。このことにより、第１粒径以下の粒子が第２流路５へ流れやすくなり、第１収集チャンバ８に収集するターゲット粒子の量を増やすことができる。
【0030】
流路幅Ｗａと第１粒径との関係は、粒子の柔らかさや形により変わる。例えば、第１流路４を流れる液体に含まれる粒子が硬く球状である場合、流路幅Ｗａと第１粒径は同じになる。この場合、Ｗａ以下の粒径を有する粒子が第１連通流路６で分離され第２流路５に液体と共に流入する。Ｗａより大きい粒径を有する粒子は、第１流路４を流れ排出側流路１４に流入する。例えば、ターゲット粒子の粒径範囲が１１０ｎｍ以上１４０ｎｍ以下である場合、流路幅Ｗａは１４０ｎｍとすることができる。
【0031】
例えば、第１流路４を流れる液体に含まれる粒子が柔らかい場合、粒子が変形して第１連通流路６を通過するため、第１粒径は、流路幅Ｗａよりも大きくなる。この場合、粒子の柔らかさに応じて、流路幅Ｗａをターゲット粒子の粒径範囲の上限値よりも小さい幅に設定することができる。また、圧力調整部を用いて第１流路４の圧力を第２流路５の圧力よりも大きくすることにより、第１粒径は大きくなる。
１本の第１流路４から第２流路５に向かって伸びる複数の第１連通流路６の流路幅Ｗａは、すべて実質的に同じにすることができる。このことにより、多くの第１連通流路６を用いて第１粒径以下の粒子を分離することができ、第１収集チャンバ８に収集されるターゲット粒子の量を多くすることができる。
１本の第１流路４から第２流路５に向かって伸びる複数の第１連通流路６の流路幅Ｗａは、すべて実質的に同じにすることができる。このことにより、多くの第１連通流路６を用いて第１粒径以下の粒子を分離することができ、第１収集チャンバ８に収集されるターゲット粒子の量を多くすることができる。
【0032】
第１連通流路６の深さは、流路幅Ｗａの１．０倍以上２０倍以下とすることができる。また、第１連通流路６の深さは、流路幅Ｗａの５倍以上２０倍以下とすることができる。このことにより、粒子が第１連通流路６に詰った場合でも第１連通流路６が閉塞することを抑制することができる。
【0033】
第１連通流路６は、流路幅Ｗａを有するネック流路１５を有することができる。このネック流路１５を利用して粒子を分離することができる。また、第１連通流路６は、ネック流路１５の第１流路側に設けられた進入流路１６を有することができる。進入流路１６の流路幅Ｗｂは、流路幅Ｗａよりも大きい。流路幅Ｗｂは、例えば流路幅Ｗａの２倍以上１０倍以下とすることができる。このような進入流路１６を設けることにより、第１流路４を流れる液体に含まれる粒子が第１連通流路６に進入しやすくなる。なお、進入流路１６は省略することができる。
【0034】
第２流路５は、第１連通流路６により分離された第１粒径以下の粒子を含む液体が第２流路５を流れ第１収集チャンバ８に流入するように設けられる。第２流路５は、第１流路４と実質的に平行に伸びる流路とすることができる。このことにより、第１流路４と第２流路５との間に比較的短い第１連通流路６を多数配置することができる。
第２流路５の流路断面は特に限定されないが、例えば矩形の流路断面を有することができる。第２流路５は、第１連通流路６の流路幅Ｗａの１．２倍以上２０倍以下の流路幅及び深さを有することができる。
第１収集チャンバ８は、ターゲット粒子を収集するチャンバである。第２流路５から流入する液体に含まれるターゲット粒子が第１収集チャンバ８に溜まる。
第２流路５の流路断面は特に限定されないが、例えば矩形の流路断面を有することができる。第２流路５は、第１連通流路６の流路幅Ｗａの１．２倍以上２０倍以下の流路幅及び深さを有することができる。
第１収集チャンバ８は、ターゲット粒子を収集するチャンバである。第２流路５から流入する液体に含まれるターゲット粒子が第１収集チャンバ８に溜まる。
【0035】
第２連通流路９は、第１収集チャンバ８と第３流路（排出側流路１４）とを連通するように設けられる。また、第１収集チャンバ８と第３流路（排出側流路１４）との間に複数の第２連通流路９を設けることができる。第２連通流路９の流路幅Ｗｃは、第１収集チャンバ８内の液体に含まれる粒子から第２粒径以下の粒子を分離するように設定される。また、第２連通流路９は、分離された第２粒径以下の粒子を含む液体が第３流路（排出側流路１４）に流入するように設けられる。第２粒径は第１粒径よりも小さく、流路幅Ｗｃは流路幅Ｗａよりも小さい。このことにより、第２粒径よりも小さい粒子を第３流路（排出側流路１４）に流出させることができ、第２粒径よりも大きい粒子を第１収集チャンバ８内に留めることができる。従って、サイズ分画を行うことができ第１粒径よりも小さく第２粒径よりも大きい粒子を第１収集チャンバ８に収集することができる。本実施形態では、第３流路を排出側流路１４としているが、第３流路は、排出側流路１４とは別の流路であってもよい。この場合、第３流路は、下流側において排出側流路１４と接続することができる。
【0036】
流路幅Ｗｃと第２粒径との関係は、粒子の柔らかさや形により変わる。例えば、第１収集チャンバ８内の液体に含まれる粒子が硬く球状である場合、流路幅Ｗｃと第２粒径は同じになる。この場合、Ｗｃ以下の粒径を有する粒子が第２連通流路９で分離され第３流路（排出側流路１４）へ液体と共に流出する。Ｗｃより大きい粒径を有する粒子は、第１収集チャンバ８内に残る。例えば、ターゲット粒子の粒径範囲が１１０ｎｍ以上１４０ｎｍ以下である場合、流路幅Ｗｃは１１０ｎｍとすることができる。
【0037】
例えば、第１収集チャンバ８内の液体に含まれる粒子が柔らかい場合、粒子が変形して第２連通流路９を通過するため、第２粒径は、流路幅Ｗｃよりも大きくなる。この場合、粒子の柔らかさに応じて、流路幅Ｗｃをターゲット粒子の粒径範囲の下限値よりも小さい幅に設定することができる。また、圧力調整部を用いて第１収集チャンバ８の圧力を第３流路（排出側流路１４）の圧力よりも大きくすることにより、第２粒径は大きくなる。
第１収集チャンバ８と第３流路（排出側流路１４）との間の複数の第２連通流路９の流路幅Ｗｃは、すべて実質的に同じにすることができる。このことにより、第２粒径以下の粒子が第３流路（排出側流路１４）に排出されやすくなり、サイズ分画精度を向上させることができる。
第１収集チャンバ８と第３流路（排出側流路１４）との間の複数の第２連通流路９の流路幅Ｗｃは、すべて実質的に同じにすることができる。このことにより、第２粒径以下の粒子が第３流路（排出側流路１４）に排出されやすくなり、サイズ分画精度を向上させることができる。
【0038】
第２連通流路９の深さは、流路幅Ｗａの１．０倍以上２０倍以下とすることができる。また、第２連通流路９の深さは、流路幅Ｗａの５倍以上２０倍以下とすることができる。このことにより、粒子が第２連通流路９に詰った場合でも第２連通流路９が閉塞することを抑制することができる。
【0039】
粒子収集装置５０は、粒子抽出用開口３０を備えることができる。粒子抽出用開口３０は、第１収集チャンバ８の底面又天井面と粒子収集装置５０の外面とを連通するように設けられる。この粒子抽出用開口３０を用いて第１収集チャンバ８に収集したターゲット粒子を粒子収集装置５０の外部に取り出すことができる。ターゲット粒子を第１収集チャンバ８に収集しているとき、粒子抽出用開口３０は、栓３１で塞がれている。ターゲット粒子を第１収集チャンバ８に収集した後、栓３１を取り外し、ナノピペットや吸引により粒子抽出用開口３０を介してターゲット粒子を第１収集チャンバ８から取り出すことができる。ターゲット粒子が小胞である場合、第１収集チャンバ８から取り出した小胞からタンパク質や核酸を抽出して分析することや取り出した小胞を質量分析することなどが可能である。また、ターゲット粒子がウィルスである場合、第１収容チャンバ８から取り出したウィルスを電子顕微鏡で観察することやＰＣＲ法で分析することができる。
粒子抽出用開口３０は、例えば、レーザー加工、ドリリング、ドライエッチング、ウェットエッチングなどにより形成することができる。
粒子抽出用開口３０は、例えば、レーザー加工、ドリリング、ドライエッチング、ウェットエッチングなどにより形成することができる。
【0040】
第２実施形態
図４は、第２実施形態の粒子収集装置の部分拡大図である。第２実施形態の粒子収集装置５０の流路構造３５は、２つの第１流路４ａ、４ｂを有し、第１流路４ａと第２流路５との間に複数の第１連通流路６が設けられ、第１流路４ｂと第２流路５との間に複数の第１連通流路６が設けられている。このことにより、第１流路４ａ、４ｂの両方からターゲット粒子を第２流路５に液体と共に流入させることができ、第１収集チャンバ８に収集するターゲット粒子の量を多くすることができる。
また、粒子収集装置５０が三次元的に積層した流路構造を有する場合、第２流路５の上層に配置された第１流路４から第１連通流路６を介してターゲット粒子を第２流路５に流入させてもよく、第２流路５の下層に配置された第１流路４から第１連通流路６を介してターゲット粒子を第２流路５に流入させてもよい。また、独立の流路構造３５を三次元で複数配置してもよい。
その他の構成は第１実施形態と同様である。また、第１実施形態についての記載は矛盾がない限り第２実施形態についても当てはまる。
図４は、第２実施形態の粒子収集装置の部分拡大図である。第２実施形態の粒子収集装置５０の流路構造３５は、２つの第１流路４ａ、４ｂを有し、第１流路４ａと第２流路５との間に複数の第１連通流路６が設けられ、第１流路４ｂと第２流路５との間に複数の第１連通流路６が設けられている。このことにより、第１流路４ａ、４ｂの両方からターゲット粒子を第２流路５に液体と共に流入させることができ、第１収集チャンバ８に収集するターゲット粒子の量を多くすることができる。
また、粒子収集装置５０が三次元的に積層した流路構造を有する場合、第２流路５の上層に配置された第１流路４から第１連通流路６を介してターゲット粒子を第２流路５に流入させてもよく、第２流路５の下層に配置された第１流路４から第１連通流路６を介してターゲット粒子を第２流路５に流入させてもよい。また、独立の流路構造３５を三次元で複数配置してもよい。
その他の構成は第１実施形態と同様である。また、第１実施形態についての記載は矛盾がない限り第２実施形態についても当てはまる。
【0041】
第３実施形態
図５は、第３実施形態の粒子収集装置の部分拡大図である。
第３実施形態の粒子収集装置５０の流路構造３５は、第１流路４、第１連通流路６、第２流路５、第１収集チャンバ８及び第２連通流路９に加え、第３流路２３、第３連通流路２４及び第２収集チャンバ２１を有する。第１及び第２実施形態では、排出側流路１４が第３流路であったが、第３実施形態では、排出側流路１４は第４流路となる。この流路構造３５では、第１収集チャンバ８に収集する第１ターゲット粒子と、第２収集チャンバ２１に収集する第２ターゲット粒子とが設定される。例えば、第１ターゲット粒子を１１０ｎｍ以上１４０ｎｍ以下の粒径範囲の粒子とすることができ、第２ターゲット粒子を８０ｎｍ以上１１０ｎｍ以下の粒径範囲の粒子とすることができる。
図５は、第３実施形態の粒子収集装置の部分拡大図である。
第３実施形態の粒子収集装置５０の流路構造３５は、第１流路４、第１連通流路６、第２流路５、第１収集チャンバ８及び第２連通流路９に加え、第３流路２３、第３連通流路２４及び第２収集チャンバ２１を有する。第１及び第２実施形態では、排出側流路１４が第３流路であったが、第３実施形態では、排出側流路１４は第４流路となる。この流路構造３５では、第１収集チャンバ８に収集する第１ターゲット粒子と、第２収集チャンバ２１に収集する第２ターゲット粒子とが設定される。例えば、第１ターゲット粒子を１１０ｎｍ以上１４０ｎｍ以下の粒径範囲の粒子とすることができ、第２ターゲット粒子を８０ｎｍ以上１１０ｎｍ以下の粒径範囲の粒子とすることができる。
【0042】
第１流路４、第１連通流路６、第２流路５及び第１収集チャンバ８については第１実施形態で説明したためここでは省略するが、第１収集チャンバ８には、第１ターゲット粒子が収集される。
第３実施形態では、流路構造３５は複数の第２連通流路９を有する。第２連通流路９のうち一部は第１収集チャンバ８と第３流路２３とを連通するように設けられ、第２連通流路９の一部は、第２流路５と第３流路２３とを連通するように設けられる。
第３実施形態では、流路構造３５は複数の第２連通流路９を有する。第２連通流路９のうち一部は第１収集チャンバ８と第３流路２３とを連通するように設けられ、第２連通流路９の一部は、第２流路５と第３流路２３とを連通するように設けられる。
【0043】
第２連通流路９の流路幅Ｗｃは、第１収集チャンバ８内の液体に含まれる粒子から第２粒径以下の粒子を分離するように設定される。また、流路幅Ｗｃは、第２流路５を流れる液体に含まれる粒子から第２粒径以下の粒子を分離するように設定される。また、第２連通流路９は、分離された第２粒径以下の粒子を含む液体が第３流路２３に流入するように設けられる。第２粒径は第１粒径よりも小さく、流路幅Ｗｃは流路幅Ｗａよりも小さい。このことにより、第２粒径よりも小さい粒子を第３流路２３に流出させることができ、第２粒径よりも大きい粒子を第１収集チャンバ８内に留めることができる。流路幅Ｗｃと第２粒径との関係は、粒子の柔らかさや形、第２流路５と第３流路２３との圧力差などにより変わる。詳細は第１実施形態と同様である。第１収集チャンバ８と第３流路２３との間の複数の第２連通流路９の流路幅Ｗｃ及び第２流路５と第３流路２３との間の複数の第２連通流路９の流路幅Ｗｃは、すべて実質的に同じにすることができる。また、第２連通流路９の深さは、流路幅Ｗａの１．０倍以上２０倍以下とすることができる。
【0044】
第２流路５と第３流路２３とを連通するように設けられた第２連通流路９は、流路幅Ｗｃを有するネック流路１５を有することができる。このネック流路１５を利用して粒子を分離することができる。また、第２連通流路９は、ネック流路１５の第２流路側に設けられた進入流路１６を有することができる。進入流路１６の流路幅は、流路幅Ｗｃよりも大きい。このような進入流路１６を設けることにより、第２流路５を流れる液体に含まれる粒子が第２連通流路９に進入しやすくなる。なお、進入流路１６は省略することができる。
【0045】
第３流路２３は、第２連通流路９により分離された第２粒径以下の粒子を含む液体が第３流路２３を流れ第２収集チャンバ２１に流入するように設けられる。第２収集チャンバ２１は、第２ターゲット粒子を収集するチャンバである。第３流路２３から流入する液体に含まれる第２ターゲット粒子が第２収集チャンバ２１に溜まる。
【0046】
第３連通流路２４は、第２収集チャンバ２１と第４流路（排出側流路１４）とを連通するように設けられる。また、第２収集チャンバ２１と第４流路（排出側流路１４）との間に複数の第３連通流路２４を設けることができる。第３連通流路２４の流路幅Ｗｄは、第２収集チャンバ２１内の液体に含まれる粒子から第３粒径以下の粒子を分離するように設定される。また、第３連通流路２４は、分離された第３粒径以下の粒子を含む液体が第４流路（排出側流路１４）に流入するように設けられる。第３粒径は第２粒径よりも小さく、流路幅Ｗｄは流路幅Ｗｃよりも小さい。このことにより、第３粒径よりも小さい粒子を第４流路（排出側流路１４）に流出させることができ、第３粒径よりも大きい粒子を第２収集チャンバ２１内に留めることができる。従って、サイズ分画を行うことができ第２粒径よりも小さく第３粒径よりも大きい粒子を第２収集チャンバ２１に収集することができる。流路幅Ｗｄと第３粒径との関係は、粒子の柔らかさや形、第２収集チャンバ２１と第４流路（排出側流路１４）との圧力差などにより変わる。詳細は第１実施形態と同様である。第２収集チャンバ２１と第４流路（排出側流路１４）との間の複数の第３連通流路２４の流路幅Ｗｄは、すべて実質的に同じにすることができる。また、第３連通流路２４の深さは、流路幅Ｗａの１．０倍以上２０倍以下とすることができる。
このように、第３実施形態の粒子収集装置１０では、第２粒径以上第１粒径以下の第１ターゲット粒子を第１収集チャンバ８に収集することができ、第３粒径以上第２粒径以下の第２ターゲット粒子を第２収集チャンバ２１に収集することができる。
本実施形態では、第４流路を排出側流路１４としているが、第４流路は、排出側流路１４とは別の流路であってもよい。この場合、第４流路は、下流側において排出側流路１４と接続することができる。
このように、第３実施形態の粒子収集装置１０では、第２粒径以上第１粒径以下の第１ターゲット粒子を第１収集チャンバ８に収集することができ、第３粒径以上第２粒径以下の第２ターゲット粒子を第２収集チャンバ２１に収集することができる。
本実施形態では、第４流路を排出側流路１４としているが、第４流路は、排出側流路１４とは別の流路であってもよい。この場合、第４流路は、下流側において排出側流路１４と接続することができる。
【0047】
粒子収集装置５０は、第１収集チャンバ８及び第２収集チャンバ２１のそれぞれに粒子抽出用開口３０を備えることができる。粒子抽出用開口３０については第１実施形態で説明したためここでは省略する。
その他の構成は第１又は第２実施形態と同様である。また、第１又は第２実施形態についての記載は矛盾がない限り第３実施形態についても当てはまる。
その他の構成は第１又は第２実施形態と同様である。また、第１又は第２実施形態についての記載は矛盾がない限り第３実施形態についても当てはまる。
【0048】
第４実施形態
図６は、第４実施形態の粒子収集装置５０の部分拡大図である。第４実施形態の粒子収集装置５０は、複数の流路構造３５ａ～３５ｅを備える。また、粒子収集装置５０が備える流路構造３５ａ～３５ｅの数は特に限定されないが、５つ以上とすることができる。また、第４実施形態の粒子収集装置５０は、粒子径分布測定装置であってもよい。本実施形態では、排出側流路１４が第３流路となる。
流路構造３５ａ～３５ｅは、第１実施形態の粒子収集装置５０の流路構造３５と同様の構造を有する。ただし、流路構造３５ａ～３５ｅの第１連通流路６は、それぞれ異なる流路幅Ｗａａ、Ｗａｂ、Ｗａｃ、Ｗａｄ、Ｗａｅを有する。また、第２連通流路９の流路幅Ｗｃは、第１収集チャンバ８ａ～８ｅの液体に含まれる粒子が第３流路（排出側流路１４）に排出されず、液体のみが第３流路（排出側流路１４）に排出される幅に設定することができる。
図６は、第４実施形態の粒子収集装置５０の部分拡大図である。第４実施形態の粒子収集装置５０は、複数の流路構造３５ａ～３５ｅを備える。また、粒子収集装置５０が備える流路構造３５ａ～３５ｅの数は特に限定されないが、５つ以上とすることができる。また、第４実施形態の粒子収集装置５０は、粒子径分布測定装置であってもよい。本実施形態では、排出側流路１４が第３流路となる。
流路構造３５ａ～３５ｅは、第１実施形態の粒子収集装置５０の流路構造３５と同様の構造を有する。ただし、流路構造３５ａ～３５ｅの第１連通流路６は、それぞれ異なる流路幅Ｗａａ、Ｗａｂ、Ｗａｃ、Ｗａｄ、Ｗａｅを有する。また、第２連通流路９の流路幅Ｗｃは、第１収集チャンバ８ａ～８ｅの液体に含まれる粒子が第３流路（排出側流路１４）に排出されず、液体のみが第３流路（排出側流路１４）に排出される幅に設定することができる。
【0049】
例えば、液体に含まれる５０ｎｍ以上２００ｎｍ以下の粒子の粒径分布を測定する場合、粒子収集装置５０は、３１個の流路構造３５を有することができる。３１個の流路構造３５の第１連通流路６の流路幅Ｗａは、５０ｎｍ、５５ｎｍ、６０ｎｍ、６５ｎｍ、７０ｎｍ、７５ｎｍ、８０ｎｍ、８５ｎｍ、９０ｎｍ、９５ｎｍ、１００ｎｍ、１０５ｎｍ、１１０ｎｍ、１１５ｎｍ、１２０ｎｍ、１２５ｎｍ、１３０ｎｍ、１３５ｎｍ、１４０ｎｍ、１４５ｎｍ、１５０ｎｍ、１５５ｎｍ、１６０ｎｍ、１６５ｎｍ、１７０ｎｍ、１７５ｎｍ、１８０ｎｍ、１８５ｎｍ、１９０ｎｍ、１９５ｎｍ、２００ｎｍとすることができる。また、第２連通流路９の流路幅Ｗｃは、２０ｎｍとすることができる。
【0050】
次に、第４実施形態の粒子収集装置５０を用いて粒子径分布を測定する方法について説明する。なお、ここでは、粒子は硬く球状である。また、液体に含まれる粒子を蛍光観察するために、各粒子は蛍光色素又は蛍光タンパク質を有する。
【0051】
まず、各流路構造３５ａ～３５ｅの第１流路４ａ～４ｅに様々な粒径の粒子を含む液体を流す。ここでは、毛管現象を利用して第１流路４ａ～４ｅに液体を流すことができる。
流路構造３５ａでは、Ｗａａより小さな粒子は第１連通流路６を通過し、第１収集チャンバ８ａに収集される。Ｗａａより大きな粒子は第１流路４ａを流れ第３流路（排出側流路１４）へ排出される。Ｗａａと同程度の大きさの粒子は、第１連通流路６に詰る。流路構造３５ｂ～３５ｅでも同じように、粒子の一部が第１収集チャンバ８に収集され、粒子の一部が第３流路（排出側流路１４）へ排出され、粒子の一部が第１連通流路６に詰る。その後、必要に応じて粒子を含まない液体を第１流路４ａ～４ｅに流し、第１流路４ａ～４ｅ及び第２流路５ａ～５ｅの粒子を下流（排出側流路側）へと流す。
流路構造３５ａでは、Ｗａａより小さな粒子は第１連通流路６を通過し、第１収集チャンバ８ａに収集される。Ｗａａより大きな粒子は第１流路４ａを流れ第３流路（排出側流路１４）へ排出される。Ｗａａと同程度の大きさの粒子は、第１連通流路６に詰る。流路構造３５ｂ～３５ｅでも同じように、粒子の一部が第１収集チャンバ８に収集され、粒子の一部が第３流路（排出側流路１４）へ排出され、粒子の一部が第１連通流路６に詰る。その後、必要に応じて粒子を含まない液体を第１流路４ａ～４ｅに流し、第１流路４ａ～４ｅ及び第２流路５ａ～５ｅの粒子を下流（排出側流路側）へと流す。
【0052】
次に、第１収集チャンバ８ａ～８ｅに収集された粒子の第１粒子量を計測する。具体的には、第１収集チャンバ８ａ～８ｅを蛍光観察し、粒子由来の蛍光の輝度値から第１粒子量を定量化する。
次に、圧力調整部を用いて第１流路４ａの圧力が第２流路５ａの圧力よりも大きくなるように流路構造３５ａ～３５ｅ内の圧力を調整する。具体的には、送液ポンプ２５の送液圧力を大きくする。このことにより、第１連通流路６に詰っていた粒子が圧力により第２流路５ａ～５ｅへと押し出され、第１収集チャンバ８ａ～８ｅに流入し収集される。
次に、第１収集チャンバ８ａ～８ｅに収集された粒子の第２粒子量を計測する。具体的には、第１収集チャンバ８ａ～８ｅを蛍光観察し、粒子由来の蛍光の輝度値から第２粒子量を定量化する。
次に、第１粒子量と第２粒子量との差（粒子の増加量）を算出する。
次に、圧力調整部を用いて第１流路４ａの圧力が第２流路５ａの圧力よりも大きくなるように流路構造３５ａ～３５ｅ内の圧力を調整する。具体的には、送液ポンプ２５の送液圧力を大きくする。このことにより、第１連通流路６に詰っていた粒子が圧力により第２流路５ａ～５ｅへと押し出され、第１収集チャンバ８ａ～８ｅに流入し収集される。
次に、第１収集チャンバ８ａ～８ｅに収集された粒子の第２粒子量を計測する。具体的には、第１収集チャンバ８ａ～８ｅを蛍光観察し、粒子由来の蛍光の輝度値から第２粒子量を定量化する。
次に、第１粒子量と第２粒子量との差（粒子の増加量）を算出する。
【0053】
この粒子の増加量は、第１連通流路６に詰っていた粒子が圧力により押し出され第１収集チャンバ８ａ～８ｅに流入した粒子の量に相当する。また、流路構造３５ａの第１連通流路６に詰っていた粒子の粒子径は第１連通流路６の流路幅Ｗａａとほぼ同じであり、第１収集チャンバ８ａの粒子増加量はＷａａの粒径を有する粒子の量に相当する。流路構造３５ｂ～３５ｅでも同様で、第１収集チャンバ８ｂの粒子増加量はＷａｂの粒径を有する粒子の量に相当し、第１収集チャンバ８ｃの粒子増加量はＷａｃの粒径を有する粒子の量に相当し、第１収集チャンバ８ｄの粒子増加量はＷａｄの粒径を有する粒子の量に相当し、第１収集チャンバ８ｅの粒子増加量はＷａｅの粒径を有する粒子の量に相当する。
したがって、各流路構造３５ａ～３５ｅにおける第１粒子量と第２粒子量との差（粒子の増加量）に基づき、第１流路４ａ～４ｅに流した液体に含まれる粒子の粒径分布を作成することができる。
その他の構成は第１、第２又は第３実施形態と同様である。また、第１、第２又は第３実施形態についての記載は矛盾がない限り第４実施形態についても当てはまる。
したがって、各流路構造３５ａ～３５ｅにおける第１粒子量と第２粒子量との差（粒子の増加量）に基づき、第１流路４ａ～４ｅに流した液体に含まれる粒子の粒径分布を作成することができる。
その他の構成は第１、第２又は第３実施形態と同様である。また、第１、第２又は第３実施形態についての記載は矛盾がない限り第４実施形態についても当てはまる。
【0054】
粒子収集装置作製実験
図１～３に示したような粒子収集装置を作製した。第１基板及び第２基板には石英ガラス板を用いた。
第１基板の表面上にレジストを塗布した後、電子ビームによりレジストの一部を除去しレジストにパターンを形成した。その後、レジストをマスクとしてエッチングを行い第１基板の一部を除去し溝を形成した。このようなエッチング処理により、第１基板に扁平流路、第１流路、第１連通流路、第２流路、第１収集チャンバ、第２連通流路などとなる溝を形成した。また、フォトリソグラフィとエッチング技術により、第２基板に導入流路及び排出側流路となる溝を形成した。第１連通流路の流路幅Ｗａは１４０ｎｍとし、第２連通流路の流路幅Ｗｃは１１０ｎｍとした。また、第１及び第２流路の深さ、第１及び第２連通流路の深さ、並びに第１収集チャンバの深さは、２５０ｎｍとした。
その後、洗浄した第１基板及び第２基板を接触させて真空炉内に入れ、１０６０℃で熱処理することにより第１基板と第２基板とを融着させた。このようにして、第１基板と第２基板との間に導入流路、扁平流路、第１流路、第１連通流路、第２流路、第１収集チャンバ、第２連通流路、排出側流路などが形成された粒子収集装置を製造した。
図７（ａ）は作製した粒子収集装置の写真であり、図７（ｂ）は作製した粒子収集装置の流路構造のＳＥＭ写真である。
図１～３に示したような粒子収集装置を作製した。第１基板及び第２基板には石英ガラス板を用いた。
第１基板の表面上にレジストを塗布した後、電子ビームによりレジストの一部を除去しレジストにパターンを形成した。その後、レジストをマスクとしてエッチングを行い第１基板の一部を除去し溝を形成した。このようなエッチング処理により、第１基板に扁平流路、第１流路、第１連通流路、第２流路、第１収集チャンバ、第２連通流路などとなる溝を形成した。また、フォトリソグラフィとエッチング技術により、第２基板に導入流路及び排出側流路となる溝を形成した。第１連通流路の流路幅Ｗａは１４０ｎｍとし、第２連通流路の流路幅Ｗｃは１１０ｎｍとした。また、第１及び第２流路の深さ、第１及び第２連通流路の深さ、並びに第１収集チャンバの深さは、２５０ｎｍとした。
その後、洗浄した第１基板及び第２基板を接触させて真空炉内に入れ、１０６０℃で熱処理することにより第１基板と第２基板とを融着させた。このようにして、第１基板と第２基板との間に導入流路、扁平流路、第１流路、第１連通流路、第２流路、第１収集チャンバ、第２連通流路、排出側流路などが形成された粒子収集装置を製造した。
図７（ａ）は作製した粒子収集装置の写真であり、図７（ｂ）は作製した粒子収集装置の流路構造のＳＥＭ写真である。
【0055】
エクソソーム収集実験１
作製した粒子収集装置の注入口２８ａに、ＨＴ－２９細胞由来の蛍光標識エクソソームを含む液体を注液し、この液体を毛管現象により又は送液圧力を１００ｋＰａ、２００ｋＰａ、３００ｋＰａ又は４００ｋＰａとして導入流路、扁平流路、第１流路、第１連通流路、第２流路、第１収集チャンバ、第２連通流路に流した。その後、第１収集チャンバの蛍光観察を行い、エクソソーム由来の蛍光の輝度値から粒子量を定量化した。
図８はＨＴ－２９細胞由来のエクソソームの粒径分布を示すグラフであり、図９はエクソソーム収集実験１の結果を示すグラフである。図９のグラフのように、第１収集チャンバに収集される粒子量は、送液圧力を大きくするほど多くなることがわかった。
図８のグラフのように、ＨＴ－２９細胞由来のエクソソームは、１１０ｎｍ（Ｗｃ）以上１４０ｎｍ（Ｗａ）以下の粒径範囲内のものが多いため、送液圧力の増加に伴い第１収集チャンバに収集される粒子量が多くなったと考えられる。
作製した粒子収集装置の注入口２８ａに、ＨＴ－２９細胞由来の蛍光標識エクソソームを含む液体を注液し、この液体を毛管現象により又は送液圧力を１００ｋＰａ、２００ｋＰａ、３００ｋＰａ又は４００ｋＰａとして導入流路、扁平流路、第１流路、第１連通流路、第２流路、第１収集チャンバ、第２連通流路に流した。その後、第１収集チャンバの蛍光観察を行い、エクソソーム由来の蛍光の輝度値から粒子量を定量化した。
図８はＨＴ－２９細胞由来のエクソソームの粒径分布を示すグラフであり、図９はエクソソーム収集実験１の結果を示すグラフである。図９のグラフのように、第１収集チャンバに収集される粒子量は、送液圧力を大きくするほど多くなることがわかった。
図８のグラフのように、ＨＴ－２９細胞由来のエクソソームは、１１０ｎｍ（Ｗｃ）以上１４０ｎｍ（Ｗａ）以下の粒径範囲内のものが多いため、送液圧力の増加に伴い第１収集チャンバに収集される粒子量が多くなったと考えられる。
【0056】
エクソソーム収集実験２
作製した粒子収集装置の注入口２８ａに、ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞由来の蛍光標識エクソソームを含む液体を注液し、この液体を毛管現象により又は送液圧力を１００ｋＰａ、２００ｋＰａ、３００ｋＰａ又は４００ｋＰａとして導入流路、扁平流路、第１流路、第１連通流路、第２流路、第１収集チャンバ、第２連通流路に流した。その後、第１収集チャンバの蛍光観察を行い、エクソソーム由来の蛍光の輝度値から粒子量を定量化した。
図１０はＨＥＫ－２９３Ｔ細胞由来のエクソソームの粒径分布を示すグラフであり、図１１はエクソソーム収集実験２の結果を示すグラフである。図１１のグラフのように、第１収集チャンバに収集される粒子量は、毛管現象で第１流路などに液体を流したときよりも、シリンジポンプを利用して第１流路などに流したときの方が多くなったが、シリンジポンプの送液圧力を増加させても第１収集チャンバに収集される粒子量はほぼ一定であった。
図１０のグラフのように、ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞由来のエクソソームは、１１０ｎｍ（Ｗｃ）以上１４０ｎｍ（Ｗａ）以下の粒径のものが少ないため、送液圧力を増加させても第１収集チャンバに収集される粒子量は多くならなかったと考えられる。
作製した粒子収集装置の注入口２８ａに、ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞由来の蛍光標識エクソソームを含む液体を注液し、この液体を毛管現象により又は送液圧力を１００ｋＰａ、２００ｋＰａ、３００ｋＰａ又は４００ｋＰａとして導入流路、扁平流路、第１流路、第１連通流路、第２流路、第１収集チャンバ、第２連通流路に流した。その後、第１収集チャンバの蛍光観察を行い、エクソソーム由来の蛍光の輝度値から粒子量を定量化した。
図１０はＨＥＫ－２９３Ｔ細胞由来のエクソソームの粒径分布を示すグラフであり、図１１はエクソソーム収集実験２の結果を示すグラフである。図１１のグラフのように、第１収集チャンバに収集される粒子量は、毛管現象で第１流路などに液体を流したときよりも、シリンジポンプを利用して第１流路などに流したときの方が多くなったが、シリンジポンプの送液圧力を増加させても第１収集チャンバに収集される粒子量はほぼ一定であった。
図１０のグラフのように、ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞由来のエクソソームは、１１０ｎｍ（Ｗｃ）以上１４０ｎｍ（Ｗａ）以下の粒径のものが少ないため、送液圧力を増加させても第１収集チャンバに収集される粒子量は多くならなかったと考えられる。
【0057】
粒子抽出口作製実験
第１基板又は第２基板となる石英ガラス板に粒子抽出口となる開口を形成する実験を行った。具体的には、石英ガラス板にフェムト秒レーザを照射することにより粒子抽出口となる開口を形成した。粒子抽出口を形成した石英ガラス板の写真を図１２に示す。
図１２の写真に見られるような直径１μｍ～５μｍのマイクロ孔（粒子抽出口）を石英ガラス板に形成することができた。
第１基板又は第２基板となる石英ガラス板に粒子抽出口となる開口を形成する実験を行った。具体的には、石英ガラス板にフェムト秒レーザを照射することにより粒子抽出口となる開口を形成した。粒子抽出口を形成した石英ガラス板の写真を図１２に示す。
図１２の写真に見られるような直径１μｍ～５μｍのマイクロ孔（粒子抽出口）を石英ガラス板に形成することができた。
【符号の説明】
【0058】
２：第１基板 ３：第２基板 ４、４ａ～４ｅ：第１流路 ５、５ａ～５ｅ：第２流路 ６：第１連通流路 ８、８ａ～８ｅ：第１収集チャンバ ９：第２連通流路 １０：導入流路 １２：扁平流路 １４：排出側流路 １５：ネック流路 １６：進入流路 １８：ネック構造 ２１：第２収集チャンバ ２３：第３流路 ２４：第３連通流路 ２５：送液ポンプ（圧力調整部） ２８ａ、２８ｂ：注入口 ２９ａ、２９ｂ：排出口 ３０：粒子抽出口 ３１：栓 ３５、３５ａ～３５ｅ：流路構造 ５０：粒子収集装置
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
