特許 7542912 ＨＴＴリプレッサーおよびその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-08-23

(45)【発行日】2024-09-02

(54)【発明の名称】ＨＴＴリプレッサーおよびその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/11 20060101AFI20240826BHJP

   C07K 14/00 20060101ALI20240826BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20240826BHJP

   A61K 38/17 20060101ALI20240826BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20240826BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20240826BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240826BHJP

   A61P 25/14 20060101ALI20240826BHJP

【ＦＩ】

C12N15/11 Z

C07K14/00 ZNA

C12N15/864 100Z

A61K38/17

A61K31/7088

A61K35/76

A61P43/00 105

A61P25/14

【請求項の数】 16

(21)【出願番号】P 2021540305

(86)(22)【出願日】2020-01-15

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-03-11

(86)【国際出願番号】 US2020013661

(87)【国際公開番号】W WO2020150338

(87)【国際公開日】2020-07-23

【審査請求日】2023-01-13

(31)【優先権主張番号】62/792,701

(32)【優先日】2019-01-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】508241200

【氏名又は名称】サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド

(73)【特許権者】

【識別番号】000002934

【氏名又は名称】武田薬品工業株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】キャリー， ガレン

(72)【発明者】

【氏名】チオッコ， マシュー

(72)【発明者】

【氏名】チョイ， ヴィヴィアン

(72)【発明者】

【氏名】フェリス， ブライアン

(72)【発明者】

【氏名】フローリック， スティーブン

(72)【発明者】

【氏名】クラッテ， デブラ

(72)【発明者】

【氏名】ミラー， ジェフリー

(72)【発明者】

【氏名】パッション， デイビッド

(72)【発明者】

【氏名】リーバー， エドワード

(72)【発明者】

【氏名】ザイトラー， ブライアン

(72)【発明者】

【氏名】ジャン， レイ

(72)【発明者】

【氏名】ジャン， エイチ． スティーブ

【審査官】山本 匡子

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１８－５３２４２８（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１５－５０９９５８（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１３－５０００４５（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０２１－５２１７７５（ＪＰ，Ａ）

【文献】Gabriela Ecco， A tale of domestication: the endovirome, its polydactyl controllers and the species-specificity of human biology，Development.，2017年，144，2719-29

【文献】Zeitler, Bryan，Allele-selective transcriptional repression of mutant HTT for the treatment of Huntington's disease，Nature Medicine，2019年，25，1131-42

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００－９０

Ｃ０７Ｋ

Ｃ１２Ｑ

ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＣＡＰＬＵＳ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

４５２９４または４５７２３で指定されるジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）を含み、以下の表

の単一の行に示される順に認識ヘリックス領域を含むジンクフィンガータンパク質転写因子（ＺＦＰ－ＴＦ）。

【請求項2】

請求項１に記載のＺＦＰ－ＴＦをコードするポリヌクレオチド。

【請求項3】

請求項２に記載の１つまたは複数のポリヌクレオチドを含むｒＡＡＶベクター。

【請求項4】

核局在化シグナル（ＮＬＳ）をコードする配列、および必要に応じて構成的プロモーターなどの前記ＺＦＰ－ＴＦの発現を駆動するプロモーターをさらに含む、請求項３に記載のｒＡＡＶベクター。

【請求項5】

請求項１に記載の１つもしくは複数のＺＦＰ－ＴＦ、請求項２に記載の１つもしくは複数のポリヌクレオチド、および／または、請求項３もしくは請求項４に記載の１つもしくは複数のｒＡＡＶベクターを含む医薬組成物。

【請求項6】

細胞におけるＨＴＴ遺伝子の発現を改変するための、請求項１～４のいずれかに記載の１つもしくは複数のＺＦＰ－ＴＦ、１つもしくは複数のポリヌクレオチド、および／または１つもしくは複数のｒＡＡＶベクターを含む組成物、あるいは、請求項５に記載の医薬組成物であって、前記細胞に投与されることを特徴とする、組成物。

【請求項7】

前記ＨＴＴ遺伝子が変異体ＨＴＴ（ｍＨＴＴ）遺伝子である、請求項６に記載の組成物。

【請求項8】

前記細胞がニューロン細胞である、請求項６または７に記載の組成物。

【請求項9】

前記ニューロン細胞が脳にある、請求項８に記載の組成物。

【請求項10】

前記ニューロン細胞が脳の線条体にある、請求項８または９に記載の組成物。

【請求項11】

必要とする患者においてハンチントン病を処置および／または防止するための、請求項１～４のいずれかに記載の１つもしくは複数のＺＦＰ－ＴＦ、１つもしくは複数のポリヌクレオチド、および／または１つもしくは複数のｒＡＡＶベクターを含む組成物、あるいは、請求項５に記載の医薬組成物であって、必要に応じて、前記対象の線条体の両側に投与されることを特徴とする、組成物。

【請求項12】

必要とする患者における変異体ＨＴＴ（ｍＨＴＴ）発現を抑制するための、請求項１～４のいずれかに記載の１つもしくは複数のＺＦＰ－ＴＦ、１つもしくは複数のポリヌクレオチド、および／または１つもしくは複数のｒＡＡＶベクターを含む組成物、あるいは、請求項５に記載の医薬組成物。

【請求項13】

ハンチントン病が前記対象において処置される、請求項１２に記載の組成物。

【請求項14】

ｍＨＴＴ凝集体および／または運動障害が前記対象において低減される、請求項１２または１３に記載の組成物。

【請求項15】

前記対象の脳に、必要に応じて前記対象の線条体の両側に送達される、請求項１２から１４のいずれかに記載の組成物。

【請求項16】

前記１つまたは複数のｒＡＡＶベクターが、１×１０^７～１×１０^１５ベクターゲノム（ｖｇ）／線条体の用量で線条体の両側に投与される、請求項１５に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願への相互参照
本出願は、２０１９年１月１５日付けで出願された米国仮出願第６２／７９２，７０１号の利益を主張し、この開示は、本明細書によって参考としてその全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、これにより参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含有する。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０２０年１月３日に作成され、８３２７－０１８７４０＿ＳＬ．ｔｘｔと名付けられ、２２，１５７バイトのサイズである。

【0003】

技術分野
本開示は、ハンチントン病の診断および治療の分野にある。

【背景技術】

【0004】

背景
ハンチントン病（ＨＤ）は、ハンチントン舞踏病としても知られ、運動障害、認知障害、および精神障害の進行性の障害である。この疾患の平均発症年齢は、３５～４４歳であるが、症例の約１０％では、２１歳より前に発症し、疾患の診断後の平均寿命は１５～１８年である。発生率は、西欧人の血統で１００，０００人あたり約３～７人である。

【0005】

ハンチントン病は、三塩基リピート伸長障害の例であり、１９９０年代初期に初めて特徴付けられた（Ｄｉ Ｐｒｏｓｐｅｒｏ ａｎｄ Ｆｉｓｃｈｂｅｃｋ （２００５） Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６：７５６－７６５を参照されたい）。これらの障害は、３つのヌクレオチドセットの不安定なリピートの局所的伸長を含み、伸長したリピートが存在する遺伝子の機能喪失、毒性機能の獲得、またはその両方をもたらし得る。三塩基リピートは、非コードおよびコード遺伝子領域を含む遺伝子の任意の部分に位置し得る。コード領域内に位置するリピートは、典型的には、反復グルタミンコードトリプレット（ＣＡＧ）またはアラニンコードトリプレット（ＣＧＡ）のいずれかを伴う。非コード配列内のリピート領域の伸張は、遺伝子の異常な発現をもたらし得るが、コード領域内のリピートの伸張（コドン反復障害としても知られる）は、ミスフォールディングおよびタンパク質凝集を引き起こし得る。異常なタンパク質に関連する病理生理学の正確な原因は不明であることが多い。典型的には、三塩基伸長に供される野生型遺伝子では、これらの領域は、正常集団において様々な数のリピート配列を含有するが、罹患集団では、リピート数は倍加からリピート数の対数次数の増加まで増加し得る。ＨＤでは、リピートは、大きいサイトゾルタンパク質であるハンチンチン（ＨＴＴ）をコードする遺伝子のＮ末端コード領域内に挿入される。正常なＨＴＴ対立遺伝子は、１５～２４個のＣＡＧリピート（配列番号２３として開示される「ＣＡＧ」リピート）を含有するが、３６個またはそれより多くのリピートを含有する対立遺伝子は、潜在的にＨＤを引き起こす対立遺伝子であると考えられ、疾患を発症するリスクを付与し得る。３６～３９個のリピートを含有する対立遺伝子は、不完全浸透体であると考えられ、それらの対立遺伝子を有する個体は、疾患を発症することもしないこともあり得る（または人生の後期に症状を発生し得る）が、４０個またはそれより多くのリピートを含有する対立遺伝子は完全浸透体であると考えられる。実際には、この多くのリピートを有するＨＤ対立遺伝子を含有する人は、無症候性であることが報告されている。青年期発症（＜２１歳）ＨＤを有するそれらの個体は、しばしば６０個またはそれより多くのＣＡＧリピートを有することが見出されている。ＣＡＧリピートの増加に加えて、ＨＤは、リピート配列内に＋１および＋２のフレームシフトを含み得て、それによって領域は、ポリグルタミンではなくてポリセリンポリペプチド（＋１フレームシフトの場合ではＡＧＣリピートによってコードされる）トラックをコードし得ることも示されている（Ｄａｖｉｅｓ ａｎｄ Ｒｕｂｉｎｓｚｔｅｉｎ （２００６） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ４３：８９３－８９６）。ＨＤでは、変異体ＨＴＴ（ｍＨＴＴ）対立遺伝子は通常、優勢の形質として片親から受け継がれる。ＨＤ患者の出生子は、片親が障害に罹患していない場合、疾患を発症する確率が５０％である。一部の例では、親が中間のＨＤ対立遺伝子を有する場合があり、無症候性であり得るが、リピート伸長により子供は疾患を発症する。加えて、ＨＤ対立遺伝子はまた、精子形成の際のリピート領域の不安定な性質により、重症度の増加または発症年齢の低年齢化が数世代にわたって観察される、表現促進現象として知られる現象も示し得る。

【0006】

さらに、ＨＴＴにおける三塩基伸長は、線条体における中型有棘ガンマ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）投射ニューロンのニューロン喪失をもたらし、ニューロンの喪失はまた、新皮質でも起こる。エンケファリンを含有し、淡蒼球外節に投射する中型有棘ニューロンは、サブスタンスＰを含有し、淡蒼球内節に投射するニューロンより大きく関係している。ハンチントン病を有する人において大きく影響を受ける他の脳の領域は、黒質、皮質の３、５、および６層、海馬のＣＡ１領域、頭頂葉の角回、小脳のプルキンエ細胞、視床下部の外側隆起核、および視床の正中中心核－束傍核複合体を含む（Ｗａｌｋｅｒ （２００７） Ｌａｎｃｅｔ ３６９：２１８－２２８）。

【0007】

正常なＨＴＴタンパク質の役割はあまり理解されていないが、これは神経発生、アポトーシス細胞死、および膜小胞輸送に関係し得る。加えて、野生型ＨＴＴが、線条体ニューロンの生存促進因子である脳由来の神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の産生を刺激するという証拠がある。ＨＤの進行が、ＨＤのマウスモデルにおいてＢＤＮＦ発現の減少と相関すること（Ｚｕｃｃａｔｏ ｅｔ ａｌ． （２００５） Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５２（２）：１３３－１３９）、および組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター媒介遺伝子送達を介したＢＤＮＦまたはグリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）の送達が、マウスＨＤモデルにおいて線条体ニューロンを保護し得ることが示されている（Ｋｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ． （２００４） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ９（５）：６８２－６８８）。

【0008】

ＨＤの診断および処置の選択肢は、現在、非常に限られている。診断に関しては、変更された（変異体）ＨＴＴ（ｍＨＴＴ）レベルは、疾患負荷スコアに有意に関連し、可溶性ｍＨＴＴ種は、疾患の進行と共に濃度が増加する。しかし、少量のｍＨＴＴは、患者のＣＮＳにおいて定量することが難しく、これによりｉｎ ｖｉｖｏでのＨＤの神経病理生物学における役割に関する研究が制限され、ＨＴＴ低下剤が標的に結合することを実証できない。例えば、Ｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ． （２０１４） Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ８５：ｅ４を参照されたい。

【0009】

処置に関連して、シャペロニンの過剰発現または化合物ゲルダナマイシンによる熱ショック応答の誘導などの伸張したポリグルタミン鎖を通して起こるタンパク質凝集に関連する毒性を防止するように設計されたいくつかの有望な方法論が、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルにおいてこれらの毒性の低減を示している。他の処置は、疾患の臨床発現におけるアポトーシスの役割を標的とする。例えば、片親がＨＤ対立遺伝子を含有し、他方の親がカスパーゼ１のドミナントネガティブ対立遺伝子を有するマウスの交配の子孫における動物モデルにおいて、カスパーゼ活性の遮断を介して、疾患の症状を遅らせることが示されている。加えて、カスパーゼによるｍＨＴＴの切断は、疾患の発病において役割を果たし得る。カスパーゼ－６耐性変異体ＨＴＴを有するトランスジェニックマウスは、非カスパーゼ耐性変異体ＨＴＴ対立遺伝子を有するマウスと比較して、正常なニューロン機能を維持することが見出され、線条体の神経変性を発症しなかった（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ． （２００６） Ｃｅｌｌ １２５：１１７９－１１９１を参照されたい）。アポトーシス経路のメンバーを標的とする分子もまた、症候学に対して遅らせる効果を有することが示されている。例えば、化合物ｚＶＡＤ－ｆｍｋおよびミノサイクリンは、その両方がカスパーゼ活性を阻害するが、マウスにおいて疾患発現を遅らせることが示されている。薬物レマセミドもまた、この化合物が変異体ＨＴＴのＮＤＭＡ受容体に対する結合を防止して神経細胞に毒性効果を発揮するのを防止すると考えられることから、ＨＤの小規模ヒト臨床試験において使用されている。しかし、これらの臨床試験では、ニューロンの機能に統計学的に有意な改善は観察されなかった。加えて、ハンチントン病研究グループ（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ）は、補酵素Ｑを使用して無作為二重盲検試験を実施した。補酵素Ｑ１０によって処置した患者では疾患進行を遅らせる傾向が観察されたが、全機能の低下速度に有意な変化はなかった（Ｄｉ Ｐｒｏｓｐｅｒｏ ａｎｄ Ｆｉｓｃｈｂｅｃｋ （２００５） Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６：７５６－７６５）。

【0010】

ジンクフィンガータンパク質（「ＺＦＰ」）、ＴＡＬ－エフェクタードメイン（「ＴＡＬＥ」）、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ転写因子系（Ｃａｓおよび／またはＣｆｐ１系を含む）由来のＤＮＡ結合ドメインを含む組換え転写因子およびヌクレアーゼは、内因性の遺伝子の遺伝子発現の調節能力を有する。例えば、その開示の全体が全ての目的に関して参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第９，０４５，７６３号；同第９，００５，９７３号；同第８，９５６，８２８号；同第８，９４５，８６８号；同第８，５８６，５２６号；同第６，５３４，２６１号；同第６，５９９，６９２号；同第６，５０３，７１７号；同第６，６８９，５５８号；同第７，０６７，３１７号；同第７，２６２，０５４号；同第７，８８８，１２１号；同第７，９７２，８５４号；同第７，９１４，７９６号；同第７，９５１，９２５号；同第８，１１０，３７９号；同第８，４０９，８６１号；米国特許出願公開第２００３／０２３２４１０号；同第２００５／０２０８４８９号；同第２００５／００２６１５７号；同第２００５／００６４４７４号；同第２００６／００６３２３１号；同第２００８／０１５９９９６号；同第２０１０／００２１８２６４号；同第２０１２／００１７２９０号；同第２０１１／０２６５１９８号；同第２０１３／０１３７１０４号；同第２０１３／０１２２５９１号；同第２０１３／０１７７９８３号、同第２０１３／０１７７９６０号、同第２０１５／０３３５７０８号；および同第２０１５／００５６７０５号；Ｐｅｒｅｚ－Ｐｉｎｅｒａ ｅｔ ａｌ． （２０１３） Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ １０：９７３－９７６； Ｐｉａｔｅｋ ｅｔ ａｌ． （２０１５） Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｊ． １３（４）：５７８－８９， ｄｏｉ：１０．１１１１／ｐｂｉ．１２２８４）を参照されたい。例えば、米国特許第９，２３４，０１６号；同第９，９４３，５６５号；同第８，８４１，２６０号；同第９，４９９，５９７号；および米国特許出願公開第２０１８／０２００３３２号；同第２０１７／００９６４６０号；同第２０１７／００３５８３９号；同第２０１６／０２９６６０５号および同第２０１９／０３２２７１１号は、ＨＴＴなどのＨＤ対立遺伝子の発現をモジュレートするＤＮＡ結合タンパク質に関する。米国特許出願公開第２０１５／０３３５７０８号は、中型有棘ニューロンを改変する方法に関する。

【0011】

さらに、同様に、ゲノム編集および遺伝子治療において使用するために潜在性を有し得る標的化ヌクレアーゼが、アルゴノート系に基づいて開発されている（例えば、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来の「ＴｔＡｇｏ」として知られる、Ｓｗａｒｔｓ ｅｔ ａｌ． （２０１４） Ｎａｔｕｒｅ ５０７（７４９１）：２５８－２６１を参照されたい）。ジンクフィンガータンパク質を含有するこれらの操作された転写因子を使用する臨床試験は、これらの新規転写因子が様々な状態を処置することができることを示している（例えば、Ｙｕ ｅｔ ａｌ． （２００６） ＦＡＳＥＢ Ｊ． ２０：４７９－４８１を参照されたい）。ヌクレアーゼ媒介切断は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または修復などのエラー媒介プロセスによる切断の修復または修復鋳型（相同組換え修復、すなわちＨＤＲ）を使用する修復が、遺伝子のノックアウトまたは目的の配列の挿入（標的化組み込み）をもたらし得るように、標的ＤＮＡ配列において二本鎖切断（ＤＳＢ）またはニックを誘導するために操作されたヌクレアーゼの使用を伴う。外部から修復鋳型（例えば、「ドナー」または「導入遺伝子」）が供給されていない条件下での二本鎖切断の導入は、細胞ＮＨＥＪ経路により導入される、変異を介した標的化遺伝子の不活化（「インデル」として知られる挿入および／または欠失）のために一般的に使用されている。
しかし、脳への広範囲の送達を示すモダリティを含む、ハンチントン病の診断、試験、処置、および／または防止方法がなおも必要である。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0012】

【文献】米国特許第９，０４５，７６３号明細書

【文献】米国特許第９，００５，９７３号明細書

【文献】米国特許第８，９５６，８２８号明細書

【文献】米国特許第８，９４５，８６８号明細書

【文献】米国特許第８，５８６，５２６号明細書

【文献】米国特許第６，５３４，２６１号明細書

【文献】米国特許第６，５９９，６９２号明細書

【文献】米国特許第６，５０３，７１７号明細書

【文献】米国特許第６，６８９，５５８号明細書

【文献】米国特許第７，０６７，３１７号明細書

【文献】米国特許第７，２６２，０５４号明細書

【文献】米国特許第７，８８８，１２１号明細書

【文献】米国特許第７，９７２，８５４号明細書

【文献】米国特許第７，９１４，７９６号明細書

【文献】米国特許第７，９５１，９２５号明細書

【文献】米国特許第８，１１０，３７９号明細書

【文献】米国特許第８，４０９，８６１号明細書

【文献】米国特許出願公開第２００３／０２３２４１０号明細書

【文献】米国特許出願公開第２００５／０２０８４８９号明細書

【文献】米国特許出願公開第２００５／００２６１５７号明細書

【文献】米国特許出願公開第２００５／００６４４７４号明細書

【文献】米国特許出願公開第２００６／００６３２３１号明細書

【文献】米国特許出願公開第２００８／０１５９９９６号明細書

【文献】米国特許出願公開第２０１０／０２１８２６４号明細書

【文献】米国特許出願公開第２０１２／００１７２９０号明細書

【文献】米国特許出願公開第２０１１／０２６５１９８号明細書

【文献】米国特許出願公開第２０１３／０１３７１０４号明細書

【文献】米国特許出願公開第２０１３／０１２２５９１号明細書

【文献】米国特許出願公開第２０１３／０１７７９８３号明細書

【文献】米国特許出願公開第２０１３／０１７７９６０号明細書

【文献】米国特許出願公開第２０１５／０３３５７０８号明細書

【文献】米国特許出願公開第２０１５／００５６７０５号明細書

【文献】米国特許第９，２３４，０１６号明細書

【文献】米国特許第９，９４３，５６５号明細書

【文献】米国特許第８，８４１，２６０号明細書

【文献】米国特許第９，４９９，５９７号明細書

【文献】米国特許出願公開第２０１８／０２００３３２号明細書

【文献】米国特許出願公開第２０１７／００９６４６０号明細書

【文献】米国特許出願公開第２０１７／００３５８３９号明細書

【文献】米国特許出願公開第２０１６／０２９６６０５号明細書

【文献】米国特許出願公開第２０１９／０３２２７１１号明細書

【文献】米国特許出願公開第２０１５／０３３５７０８号明細書

【非特許文献】

【0013】

【文献】Ｄｉ Ｐｒｏｓｐｅｒｏ ａｎｄ Ｆｉｓｃｈｂｅｃｋ （２００５） Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６：７５６－７６５

【文献】Ｄａｖｉｅｓ ａｎｄ Ｒｕｂｉｎｓｚｔｅｉｎ （２００６） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ４３：８９３－８９６

【文献】Ｗａｌｋｅｒ （２００７） Ｌａｎｃｅｔ ３６９：２１８－２２８

【文献】Ｚｕｃｃａｔｏ ｅｔ ａｌ． （２００５） Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５２（２）：１３３－１３９

【文献】Ｋｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ． （２００４） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ９（５）：６８２－６８８

【文献】Ｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ． （２０１４） Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ８５：ｅ４

【文献】Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ． （２００６） Ｃｅｌｌ １２５：１１７９－１１９１

【文献】Ｐｅｒｅｚ－Ｐｉｎｅｒａ ｅｔ ａｌ． （２０１３） Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ １０：９７３－９７６

【文献】Ｐｉａｔｅｋ ｅｔ ａｌ． （２０１５） Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｊ． １３（４）：５７８－８９， ｄｏｉ：１０．１１１１／ｐｂｉ．１２２８４

【文献】Ｓｗａｒｔｓ ｅｔ ａｌ． （２０１４） Ｎａｔｕｒｅ ５０７（７４９１）：２５８－２６１

【文献】Ｙｕ ｅｔ ａｌ． （２００６） ＦＡＳＥＢ Ｊ． ２０：４７９－４８１

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0014】

ハンチントン病を診断、防止、および／または処置するための方法および組成物が本明細書で開示される。特に、ｍＨＴＴリプレッサー（ｍＨＴＴ転写物を抑制し、同様にｍＨＴＴタンパク質発現も抑制する）を含む、ハンチントン病を防止または処置するためにＨＤ ＨＴＴ対立遺伝子を改変する（例えば、その発現をモジュレートする）ための方法および組成物が本明細書で提供される。本明細書に記載される組成物（ｍＨＴＴリプレッサー）は、例えば細胞死を低減させ、アポトーシスを減少させ、細胞機能（代謝）を増加させ、および／または対象における運動障害を低減させることによって、対象において治療利益を提供する。したがって、ｍＨＴＴ遺伝子のＣＡＧリピートドメインに結合する天然に存在しないジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）であって、４５６４３、４６０２５、４５２９４、４５７２３、または３３０７４で指定されるＺＦＰの認識ヘリックス領域を含むＺＦＰを含む、本明細書に記載されるＦ１～Ｆ６のＦ１～Ｆ４、Ｆ１～Ｆ５の順の４、５、または６個のジンクフィンガードメインを含む、ジンクフィンガータンパク質が本明細書で記載される。ある特定の実施形態では、表１の１つの行に示される順に認識ヘリックス領域を含む、４５２９４または４５７２３で指定されるＺＦＰが本明細書で提供される。同様に、転写抑制ドメイン（例えば、ＫＲＡＢ、ＫＯＸ等）に作動可能に連結されたこれらのＺＦＰ、および必要に応じて核局在化シグナル（ＮＬＳ）および／またはＺＦＰ－ＴＦコード配列（例えば、転写抑制ドメインをコードする配列をさらに含み、必要に応じてＮＬＳをコードする配列および／またはＺＦＰ－ＴＦの発現を駆動するプロモーターをさらに含む４５２９４または４５７２３で指定されるＺＦＰを含むＺＦＰ－ＴＦ）の発現を駆動するプロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーターなどの構成的プロモーター）などの追加のエレメントを含む人工転写因子（ＺＦＰ－ＴＦ）も記載される。ある特定の実施形態では、表３の１つの行（特定のリプレッサー）に示されるアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を有する１つまたは複数のＺＦＰ－ＴＦ（タンパク質および／またはポリヌクレオチド型）が本明細書で提供される。
４５２９４または４５７２３で指定されるジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）を含む、または表３に示されるＺＦＰ－ＴＦのアミノ酸配列を含むジンクフィンガータンパク質転写因子（ＺＦＰ－ＴＦ）が本明細書で記載される。同様に、１つまたは複数のポリヌクレオチドが同じおよび／または異なるＺＦＰ－ＴＦの１つまたは複数をコードし得る、本明細書に記載される１つまたは複数のＺＦＰ－ＴＦをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドであって、必要に応じて１つまたは複数のｒＡＡＶベクター（例えば、４５２９４または４５７２３で指定されるＺＦＰを含む１つまたは複数のＺＦＰ－ＴＦをコードする配列を含むｒＡＡＶ、またはｒＡＡＶベクターは、表３に示す配列を有するポリヌクレオチドを含み、必要に応じて１つまたは複数のｒＡＡＶベクターが、核局在化シグナル（ＮＬＳ）をコードする配列、および必要に応じてＺＦＰ－ＴＦの発現を駆動するプロモーター、例えば構成的プロモーター（例えばＣＭＶ）などの追加のエレメントをさらに含む）を含む、１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む。同様に、本明細書に記載される１つもしくは複数のＺＦＰ－ＴＦ、１つもしくは複数のポリヌクレオチド、および／または１つもしくは複数のｒＡＡＶベクターを含む医薬組成物が本明細書で記載される。対象の細胞（例えば、脳、必要に応じて線条体におけるニューロン細胞）におけるＨＴＴ遺伝子（例えば、変異体ＨＴＴ（ｍＨＴＴ）遺伝子）の発現を改変する方法もまた提供され、方法は、本明細書に記載される１つもしくは複数のＺＦＰ－ＴＦ、１つもしくは複数のポリヌクレオチド、１つもしくは複数のｒＡＡＶベクター、および／または医薬組成物を対象の細胞に投与するステップを含む。必要とする患者においてハンチントン病（ＨＤ）を処置および／または防止する方法もまた提供され、方法は、必要とする患者に、本明細書に記載される１つもしくは複数のＺＦＰ－ＴＦ、１つもしくは複数のポリヌクレオチド、１つもしくは複数のｒＡＡＶベクターおよび／または医薬組成物を投与するステップを含み、必要に応じて１つまたは複数のＺＦＰ－ＴＦ、ポリヌクレオチド、ｒＡＡＶベクター、および／または医薬組成物は、対象の線条体の両側に投与される。同様に、必要とする患者における変異体ＨＴＴ（ｍＨＴＴ）の発現を抑制するための、本明細書に記載される１つもしくは複数のＺＦＰ－ＴＦ、１つもしくは複数のポリヌクレオチド、１つもしくは複数のｒＡＡＶベクター、および／または医薬組成物の使用も提供される。ＨＤの処置および／または防止は、対象におけるｍＨＴＴ凝集体および／または運動障害の低減を含み得る。さらに、本明細書に記載される方法または使用のいずれかにおいて、１つもしくは複数のＺＦＰ－ＴＦ、１つもしくは複数のポリヌクレオチド、１つもしくは複数のｒＡＡＶベクターおよび／または医薬組成物は、対象の脳に、必要に応じて対象の線条体の両側に、これらに限定されないが、１×１０^７～１×１０^１５ベクターゲノム（ｖｇ）／線条体の間（またはその間の任意の値）の用量を含む任意の投薬量で送達され得る。

【0015】

したがって、一態様では、操作された（天然に存在しない）ｍＨＴＴリプレッサーが提供される。リプレッサーは、ＨＤ対立遺伝子（例えば、ｍＨＴＴ）の発現をモジュレートする系（例えば、ジンクフィンガータンパク質、ＴＡＬエフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質、またはＣＲＩＳＰＲ／ｄＣａｓ－ＴＦ）を含み得る。操作されたジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥは、そのＤＮＡ結合ドメイン（例えば、認識ヘリックスまたはＲＶＤ）が予め選択された標的部位に結合するように変更されている（例えば、選択および／または合理的設計によって）天然に存在しないジンクフィンガーまたはＴＡＬＥタンパク質である。本明細書に記載されるジンクフィンガータンパク質のいずれも、１、２、３、４、５、６個またはそれより多くのジンクフィンガーを含み得て、各ジンクフィンガーは、選択された配列（例えば、遺伝子）における標的サブ部位に結合する認識ヘリックスを有する。同様に、本明細書に記載されるＴＡＬＥタンパク質のいずれも、任意の数のＴＡＬＥ ＲＶＤを含み得る。一部の実施形態では、少なくとも１つのＲＶＤは、非特異的ＤＮＡ結合を有する。一部の実施形態では、少なくとも１つの認識ヘリックス（またはＲＶＤ）は、天然に存在しない。ある特定の実施形態では、リプレッサーは、転写抑制ドメインに作動可能に連結されて、人工転写因子（リプレッサー）を作り出すＤＮＡ結合ドメイン（ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、一本鎖ガイドＲＮＡ）を含む。必要に応じて、人工リプレッサーは、これらに限定されないが、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む追加の成分を含む。一部の実施形態では、これらの人工ＴＦ（例えば、ＺＦＰ－ＴＦ、ＣＲＩＳＰＲ／ｄＣａｓ－ＴＦ、またはＴＡＬＥ－ＴＦ）は、ＤＮＡに結合すると多量体化を可能にするタンパク質相互作用ドメイン（または「二量体化ドメイン」）を含む。

【0016】

ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のＣａｓタンパク質、またはＴＡＬＥタンパク質は、融合タンパク質の一部として調節ドメイン（または機能的ドメイン）と作動可能に連結した状態で配置され得る。機能的ドメインは、例えば転写活性化ドメイン、転写抑制ドメイン、および／またはヌクレアーゼ（切断）ドメインであり得る。ＤＮＡ結合ドメインと共に使用するために活性化ドメインまたは抑制ドメインのいずれかを選択することによって、そのような分子を使用して、遺伝子発現を活性化または抑制することができる。一部の実施形態では、変異体ＨＴＴ発現をダウンレギュレートするために使用することができる転写抑制ドメインに融合された本明細書に記載されるｍＨＴＴに標的化されるＺＦＰ、ｄＣａｓ、またはＴＡＬＥを含む分子が提供される。一部の実施形態では、野生型ＨＴＴ対立遺伝子をアップレギュレートすることができる転写活性化ドメインに融合された野生型ＨＴＴ対立遺伝子に標的化されるＺＦＰ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、またはＴＡＬＥを含む融合タンパク質が提供される。ある特定の実施形態では、調節ドメインの活性は、細胞の転写機構との相互作用が外因性のリガンドの非存在下では起こらないが、他の実施形態では、外因性の小分子またはリガンドが相互作用を防止するように、外因性の小分子またはリガンドによって調節される。そのような外因性のリガンドは、ＺＦＰ－ＴＦ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ－ＴＦ、またはＴＡＬＥ－ＴＦと転写機構との相互作用の程度を制御する。調節ドメインは、１つもしくは複数のＺＦＰ、ｄＣａｓ、もしくはＴＡＬＥの間、１つもしくは複数のＺＦＰ、ｄＣａｓ、もしくはＴＡＬＥの外部、またはその任意の組合せを含む、ＺＦＰ、ｄＣａｓ、またはＴＡＬＥの１つまたは複数の任意の部分に作動可能に連結され得る。本明細書に記載される融合タンパク質のいずれも医薬組成物に製剤化され得る。

【0017】

一部の実施形態では、本明細書に記載される操作されたＤＮＡ結合ドメインは、融合タンパク質の一部としてヌクレアーゼ（切断）ドメインと作動可能に連結された状態で配置され得る。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、Ｔｔａｇｏヌクレアーゼを含む。他の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系などのヌクレアーゼ系を、特異的一本鎖ガイドＲＮＡと共に利用してＤＮＡにおける標的位置にヌクレアーゼを標的化してもよい。ある特定の実施形態では、そのようなヌクレアーゼおよびヌクレアーゼ融合体を、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）、間葉幹細胞（ＭＳＣ）、またはニューロン幹細胞などの幹細胞における変異体ＨＴＴ対立遺伝子を標的化するために利用してもよく、ヌクレアーゼ融合体の活性は、野生型の数のＣＡＧリピートを含有するＨＴＴ対立遺伝子をもたらす。したがって、本明細書に記載されるＨＴＴ（例えば、ｍＨＴＴ）リプレッサーのいずれも、二量体化ドメインおよび／または機能的ドメイン（例えば、転写活性化ドメイン、転写抑制ドメイン、またはヌクレアーゼドメイン）をさらに含み得る。ある特定の実施形態では、改変細胞（例えば、幹細胞）を含む医薬組成物が提供される。ある特定の実施形態では、リプレッサーは、表１の１つの行に示される順に認識ヘリックス領域を含むＺＦＰを含む。表３に示すＺＦＰ－ＴＦ（リプレッサー）（１行あたり１つのリプレッサーが表３に表示される）も同様に提供される。融合分子の１つまたは複数を含む組成物（例えば、表１のＺＦＰを含むＺＦＰ－ＴＦおよび／または表３に示すＺＦＰ－ＴＦ）も同様に提供される。

【0018】

なお別の態様では、本明細書に記載されるＤＮＡ結合タンパク質および／または融合分子（例えば、人工転写因子）の１つまたは複数をコードするポリヌクレオチドが提供される。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ウイルス（例えば、ＡＡＶまたはＡｄ）ベクターおよび／または非ウイルス（例えば、プラスミドまたはｍＲＮＡベクターまたはアプタマー）において運ばれる。これらのポリヌクレオチド（例えば、ｒＡＡＶベクター）を含む宿主細胞、および／または本明細書に記載されるポリヌクレオチド、タンパク質および／または宿主細胞を含む医薬組成物もまた提供される。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、表３（列２）に示される少なくとも１つの配列を含む。これらのポリヌクレオチドの１つまたは複数を含む組成物もまた提供される。

【0019】

他の態様では、本発明は、ドナー核酸の標的細胞への送達を含む。ドナーは、ヌクレアーゼをコードする核酸の前に、後に、またはそれと共に送達され得る。ドナー核酸は、細胞のゲノム内、例えば内因性の遺伝子座に組み込まれる外因性の配列（導入遺伝子）を含み得る。一部の実施形態では、ドナーは、標的化切断部位との相同性領域が隣接する全長の遺伝子またはその断片を含み得る。一部の実施形態では、ドナーは、相同領域を欠如し、相同組換え非依存的機構（すなわち、ＮＨＥＪ）を通して標的遺伝子座に組み込まれる。ドナーは、ヌクレアーゼ誘導二本鎖切断の相同組換え修復のための物質として使用する場合、ドナー特異的欠失が内因性の染色体座で生成されるか、またはあるいは（またはそれに加えて）内因性の遺伝子座の新規対立遺伝子形態（例えば、転写因子結合部位を切除する点変異）が作り出される任意の核酸配列、例えば核酸を含み得る。一部の態様では、ドナー核酸は、組み込まれると遺伝子修正事象または標的化欠失をもたらすオリゴヌクレオチドである。

【0020】

一部の実施形態では、ＤＮＡ結合タンパク質および／または人工転写因子（例えば、ＺＦＰ－ＴＦ）をコードするポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡである。一部の態様では、ｍＲＮＡは、化学修飾され得る（例えば、Ｋｏｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． （２０１１） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２９（２）：１５４－１５７を参照されたい）。他の態様では、ｍＲＮＡは、ＡＲＣＡキャップ（米国特許第７，０７４，５９６号および第８，１５３，７７３号を参照されたい）を含み得る。さらなる実施形態では、ｍＲＮＡは、非改変および改変ヌクレオチドの混合物を含み得る（米国特許出願公開第２０１２／０１９５９３６号を参照されたい）。

【0021】

なお別の態様では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドの１つまたは複数を含む遺伝子送達ベクターが提供される。ある特定の実施形態では、ベクターはアデノウイルスベクター（例えば、Ａｄ５／Ｆ３５ベクター）、組み込みコンピテントもしくは組み込み欠損レンチウイルスベクターを含むレンチウイルスベクター（ＬＶ）、または組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）とも称されるＡＡＶベクター（ＡＡＶ）である。ある特定の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ６またはＡＡＶ９ベクターである。ＡＡＶベクターは、表３の１つの行に示されるポリヌクレオチドの１つまたは複数（配列番号１３～１７のいずれか１つまたは複数）を含み得る。ある特定の実施形態では、ＡＡＶベクターは、天然に存在するカプシド配列または人工の操作されたカプシド配列を有し得る。したがって、少なくとも１つのヌクレアーゼ（ＺＦＮまたはＴＡＬＥＮ）をコードする配列および／または標的遺伝子への標的化組み込みのためのドナー配列を含む、アデノウイルス（Ａｄ）ベクター、ＬＶ、または組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）も本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、Ａｄベクターは、キメラＡｄベクター、例えばＡｄ５／Ｆ３５ベクターである。ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、インテグラーゼ欠損レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）または組み込みコンピテントレンチウイルスベクターである。ある特定の実施形態では、ベクターは、ＶＳＶ－Ｇエンベロープまたは他のエンベロープによってシュードタイプ化されている。

【0022】

加えて、核酸および／またはタンパク質（例えば、ＺＦＰ、Ｃａｓ、またはＴＡＬＥおよび／または融合タンパク質（例えば、ＺＦＰ、Ｃａｓ、またはＴＡＬＥを含む人工転写因子））を含む医薬組成物もまた提供される。例えば、ある特定の組成物は、調節配列に作動可能に連結された本明細書に記載されるＺＦＰ、Ｃａｓ、またはＴＡＬＥの１つをコードする配列を含む核酸を、薬学的に許容される担体または希釈剤と組み合わせて含み、調節配列は、細胞における核酸の発現を可能にする。ある特定の実施形態では、コードされるＺＦＰ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、またはＴＡＬＥは、ＨＤ ＨＴＴ対立遺伝子に対して特異的である。一部の実施形態では、医薬組成物は、ＨＤ ｍＨＴＴ対立遺伝子をモジュレートするＺＦＰ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、またはＴＡＬＥ、および神経栄養因子をモジュレートするおよびＺＦＰ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、またはＴＡＬＥを含む。タンパク質に基づく組成物は、本明細書に開示される１つまたは複数のＺＦＰ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、またはＴＡＬＥ、および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、ＨＴＴの抑制のために表３のタンパク質および／またはポリヌクレオチドの１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるＡＡＶベクターを含む医薬組成物は、ＡＡＶ－ＺＦＰ－ＴＦの１×１０^７～５×１０^１５ｖｇの間（またはその間の任意の値）、さらにより好ましくは１×１０^７～１×１０^１１ｖｇの間（またはその間の任意の値）、さらにより好ましくは１×１０^８～１×１０^１０ｖｇの間（またはその間の任意の値）を含む。ある特定の実施形態では、ＡＡＶベクターは、これらに限定されないが、各線条体あたり３ｅ８、３ｅ９、または３ｅ１０、９．２ｅ９、３．１ｅ１０、または９．２ｅ１０ｖｇを含む、各線条体あたり１×１０^８～１×１０^１０ｖｇの間（またはその間の任意の値）の用量で投与される。線条体内投与は、片方の半球であり得るが、または好ましくは両側（同じまたは異なる用量で）であり得る。なお別の態様では、本明細書に記載されるタンパク質、ポリヌクレオチド、および／または組成物のいずれかを含む単離された細胞もまた提供される。

【0023】

別の態様では、細胞（例えば、対象の脳、例えば線条体におけるｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでのニューロン細胞）におけるＨＴＴ遺伝子の発現を改変する方法であって、細胞に本明細書に記載される１つまたは複数のタンパク質、ポリヌクレオチド、医薬組成物、および／または細胞を投与することを含む方法が本明細書で記載される。投与（例えば、本明細書に記載されるＡＡＶ ＺＦＰ－ＴＦを含む医薬組成物の投与）は、任意の用量（例えば、１×１０^７～５×１０^１５ＡＡＶ ｖｇの間（またはその間の任意の値））で疾患症状の発生前および／または後であり得る。投与は、１回であってもよく、または間隔を開けて繰り返してもよく、反復投与は、同じまたは異なる用量で行ってもよい。ＨＴＴ遺伝子は、少なくとも１つの野生型および／または変異体ＨＴＴ対立遺伝子を含み得る。ある特定の実施形態では、ＨＴＴ発現は、例えば変異体ＨＴＴ（ｍＨＴＴ）発現が野生型発現と比較して優先的に抑制される場合、抑制される。ｍＨＴＴの選択的抑制を含むＨＴＴの抑制は、本明細書に記載されるＺＦＰ－ＴＦの１回または複数回の投与後、数日間、数週間、数ヶ月間、または数年間持続し得る。ある特定の実施形態では、ｍＨＴＴ（野生型ＨＴＴと比較して）の選択的抑制は、１回投与後６ヶ月またはそれより長く持続する。

【0024】

別の態様では、本明細書に記載される方法および組成物（タンパク質、ポリヌクレオチド、および／または細胞）を使用してハンチントン病を処置および／または防止する方法が本明細書で提供される。一部の実施形態では、方法は、ポリヌクレオチドおよび／またはタンパク質がウイルスベクター、非ウイルスベクター（例えば、プラスミド）および／またはその組合せを使用して送達され得る組成物を含む。医薬組成物は、標準的な技術を使用して対象に送達され得る。一部の実施形態では、方法は、ＺＦＰもしくはＴＡＬＥを含む、または本発明のＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、Ｔｔａｇｏ、もしくはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系によって変更された幹細胞集団を含む組成物を含む。対象は、少なくとも１つの変異体および／または野生型ＨＴＴ対立遺伝子を含み得る。

【0025】

なおさらなる態様では、ｒＡＡＶ（例えば、カプシドＡＡＶ９またはＡＡＶ６）ベクターを使用して対象の脳にＨＴＴ（例えば、ｍＨＴＴ）の１つまたは複数のリプレッサーを送達する方法が本明細書で記載される。送達は、カニューレの使用を介する送達（例えば、頭蓋内注射）を含む任意の好適な手段による、脳の任意の領域、例えば線条体（例えば、被殻；定位線条体注射を含む線条体内注射）への送達であり得る。脳（例えば、線条体）への投与は、片側の半球への投与であり得るか、または両側（例えば、両側の場合には同じまたは異なる用量）であり得る。一部の実施形態では、送達は、髄腔内腔への直接注射を通しての送達である。さらなる実施形態では、静脈内注射を通しての送達である。ｒＡＡＶベクターは、ベクターが直接投与されない脳の領域（例えば、線条体への送達）への順行性軸索輸送および逆行性軸索輸送を含む、対象の脳へのリプレッサーの広範な送達を提供し、前脳、後脳皮質、黒質、視床等などの他の構造への送達をもたらす。ある特定の実施形態では、対象はヒトであり、他の実施形態では、対象は非ヒト霊長類である。ある特定の実施形態では、表３の１つまたは複数のタンパク質および／またはポリヌクレオチド（またはこれらのタンパク質および／またはポリヌクレオチドを含む医薬組成物）が対象に送達される。表３に示すリプレッサーの任意の１つまたは組合せを使用してもよい（例えば、１、２、３、４、または５個のリプレッサーの任意の組合せ）。

【0026】

したがって、他の態様では、対象におけるＨＤを防止および／または処置する方法であって、変異体ＨＴＴ（ｍＨＴＴ）対立遺伝子の少なくとも１つのリプレッサーを対象に投与するステップを含む方法が本明細書で記載される。リプレッサーは、例えばウイルス（例えば、ＡＡＶ）および／もしくは非ウイルスベクター（例えば、プラスミドおよび／またはｍＲＮＡ）を使用するポリヌクレオチド型、タンパク質型、ならびに／または本明細書に記載される医薬組成物（例えば、本明細書に記載される１つもしくは複数のポリヌクレオチド、１つもしくは複数のＡＡＶベクター、１つもしくは複数の融合分子、および／または１つもしくは複数の細胞を含む医薬組成物）を介して投与され得る。ある特定の実施形態では、リプレッサーは、対象のＣＮＳ（例えば、線条体）に投与される。リプレッサーは、これらに限定されないが、ＨＤを有する対象のＨＤニューロンにおけるｍＨＴＴ凝集体の形成の低減（核凝集に影響を及ぼさないｍＨＴＴ凝集の低減を含む）、ニューロンもしくはニューロン集団（例えば、ＨＤニューロンまたはＨＤニューロン集団）における細胞死、および／またはＨＤ対象における運動障害（例えば、四肢をつかむ、舞踏病、平衡感覚の問題等）の低減を含む治療利益を提供し得る。ある特定の実施形態では、変異体ＨＴＴの発現は、対象への投与によって抑制され、表３の１つまたは複数のタンパク質および／またはポリヌクレオチド（またはこれらのタンパク質および／またはポリヌクレオチドを含む医薬組成物）が対象に送達される。

【0027】

本明細書に記載される方法のいずれかにおいて、変異体ＨＴＴ対立遺伝子のリプレッサーは、ＺＦＰ－ＴＦ、例えば変異体ＨＴＴ対立遺伝子に特異的に結合するＺＦＰおよび転写抑制ドメイン（例えば、ＫＯＸ、ＫＲＡＢ等）を含む融合タンパク質であり得る。ある特定の実施形態では、ＺＦＰ－ＴＦは、表３に示されるアミノ酸配列を有するまたはポリヌクレオチドによってコードされるＺＦＰ－ＴＦリプレッサーを含む、表１の１つの行に示されるＺＦＰの認識ヘリックス領域を有するＺＦＰを含む。他の実施形態では、変異体ＨＴＴ対立遺伝子のリプレッサーは、ＴＡＬＥ－ＴＦまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ－ＴＦであり得て、Ｃａｓタンパク質におけるヌクレアーゼドメインは、タンパク質がもはやＤＮＡを切断しないように不活化されている。なおさらなる実施形態では、リプレッサーは、変異体ＨＴＴ対立遺伝子を切断し、それによって不活化することによって変異体ＨＴＴ対立遺伝子を抑制する１つまたは複数のヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）を含み得る。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、ヌクレアーゼによる切断後に非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を介して挿入および／または欠失（「インデル」）を導入する。一部の実施形態では、２つのヌクレアーゼは、大きい欠失が領域において作製されるようにＣＡＧ伸長領域を切断する。他の実施形態では、ヌクレアーゼは、ドナーの組み込みによって変異体ＨＴＴ対立遺伝子を不活化するドナー配列を導入する（例えば、相同性または非相同的方法によって）。

【0028】

本明細書に記載される方法のいずれかにおいて、リプレッサーは、タンパク質、ポリヌクレオチド、またはタンパク質とポリヌクレオチドの任意の組合せとして対象（例えば、脳）に送達され得る。ある特定の実施形態では、リプレッサーは、ＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ９またはＡＡＶ６）ベクターを使用して送達される。他の実施形態では、リプレッサーの少なくとも１つの成分（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のｓｇＲＮＡ）は、ＲＮＡ型で送達される。他の実施形態では、リプレッサーは、本明細書に記載される任意の発現構築物の組合せ、例えば１つの発現構築物（例えば、ＡＡＶ９またはＡＡＶ６などのＡＡＶ）上に１つのリプレッサー（またはその一部）、および異なる発現構築物（ｒＡＡＶまたは他のウイルスもしくは非ウイルス構築物）上の１つのリプレッサー（またはその一部）を使用して送達される。

【0029】

さらに、本明細書に記載される方法のいずれかにおいて、リプレッサーは、所望の効果を提供する任意の濃度（用量）で送達することができる。本明細書に示されるように、ＨＴＴ抑制は、対象において１ＶＧ／細胞もの低い曝露でｉｎ ｖｉｖｏで達成され得る。好ましい実施形態では、リプレッサーは、１０，０００～５００，０００ベクターゲノム／細胞（またはその間の任意の値）の組換えアデノ随伴ウイルスベクターを使用して送達される。ある特定の実施形態では、リプレッサーは、２５０～１０，０００（またはその間の任意の値）のＭＯＩでレンチウイルスベクターを使用して送達される。他の実施形態では、リプレッサーは、１５０～１，５００ｎｇ／細胞１００，０００個（またはその間の任意の値）でプラスミド構築物を使用して送達される。他の実施形態では、リプレッサーは、０．００３～１，５００ｎｇ／細胞１００，０００個（またはその間の任意の値）でｍＲＮＡとして送達される。一部の実施形態では、ＡＡＶの用量は、動物（対象）あたりで計算される。例えば、本明細書において記載されるＡＡＶベクターは、１×１０^７～５×１０^１５ｖｇの間（またはその間の任意の値）、さらにより好ましくは１×１０^７～１×１０^１３ｖｇの間（またはその間の任意の値）、さらにより好ましくは１×１０^８～１×１０^１３ｖｇの間（またはその間の任意の値）のＡＡＶ－ＺＦＰ－ＴＦを含み得る。線条体内投与は、片側の半球、または好ましくは両側への投与（同じまたは異なる用量で）であり得る。例えば、一部の実施形態では、リプレッサーは、およそ９ｅ９ ＶＧ／マウス、またはおよそ９ｅ９ ＶＧ／マウス～３ｅ１０ ＶＧ／マウスの間、またはおよそ３ｅ１０ ＶＧ／マウス～９ｅ１０ ＶＧ／マウスの間で送達される。一部の実施形態では、ＡＡＶ用量は、９ｅ９ ＶＧ／マウス未満（例えば、６ｅ８ ＶＧ／マウスまたはそれ未満）であり、他の実施形態では、ＡＡＶ用量は９ｅ１０ ＶＧ／マウスより多い。

【0030】

本明細書に記載される方法のいずれかにおいて、本明細書に記載される組成物および方法は、対象の１つまたは複数のＨＤニューロンにおける変異体ＨＴＴ対立遺伝子発現の約７０％またはそれより多く、約７５％またはそれより多く、約８５％またはそれより多く、約９０％またはそれより多く、約９２％またはそれより多く、または約９５％またはそれより多くの抑制を生じることができる。さらに、本明細書に記載される組成物および方法は、ＨＴＴ（例えば、ｍＨＴＴ）抑制（オフターゲット部位の抑制と比較して）に関して、対照と比較して少なくとも５０％の、好ましくは５０％～９０％（またはその間の任意の値）の、さらにより好ましくは９０％より高い選択性を示すことができる。

【0031】

さらなる態様では、本明細書に記載される本発明は、１つまたは複数のＨＴＴモジュレート転写因子、例えばジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ ＴＦ）、ＴＡＬＥ（ＴＡＬＥ－ＴＦ）、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ－ＴＦ、例えばＺＦＰ－ＴＦ、ＴＡＬＥ－ＴＦ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ－ＴＦの１つまたは複数を含むＨＴＴモジュレート転写因子を含む。ある特定の実施形態では、ＨＴＴモジュレート転写因子は、対象の１つまたは複数のＨＤニューロンにおける変異体ＨＴＴ対立遺伝子の発現を抑制することができる。抑制は、対象の未処置（例えば、野生型）ニューロンと比較して対象の１つまたは複数のＨＤニューロンにおいて変異体ＨＴＴ対立遺伝子の約７０％またはそれより多く、約７５％またはそれより多く、約８５％またはそれより多く、約９０％またはそれより多く、約９２％またはそれより多く、または約９５％もしくはそれより多くの抑制であり得る。ある特定の実施形態では、ＨＴＴモジュレート転写因子を使用して、本明細書に記載される方法の１つまたは複数を達成することができる。ある特定の実施形態では、ＺＦＰ－ＴＦは、表３に示されるｍＨＴＴリプレッサーのアミノ酸配列を含む。

【0032】

一部の実施形態では、治療有効性は、明白な臨床症状の分析のための統一ハンチントン病評価尺度（ＵＨＤＲＳ）（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ （１９９６） Ｍｏｖ Ｄｉｓｏｒｄ １１（２）：１３６－１４２）を使用して測定される。他の実施形態では、患者における有効性は、ＰＥＴおよびＭＲＩイメージングを使用して測定される。一部の実施形態では、変異体ＨＴＴモジュレート転写因子による処置は、明白な臨床症状の任意のさらなる発生を防止し、ニューロン機能性の任意のさらなる喪失を防止する。他の実施形態では、変異体ＨＴＴモジュレート転写因子による処置は、臨床症状（例えば、四肢をつかむ行動、ローターロッド分析等などの公知の測定を使用して決定される運動機能）を改善し、ニューロン機能を改善する。

【0033】

同様に、本明細書に記載されるＨＴＴモジュレーター（例えば、リプレッサー）、ならびに／またはＨＴＴモジュレーターの成分を含む、および／もしくはＨＴＴモジュレーター（またはその成分）をコードするポリヌクレオチドの１つまたは複数を含むキットも提供される。キットは、細胞（例えば、ニューロン）、試薬（例えば、ＣＳＦにおいてｍＨＴＴタンパク質を検出および／または定量するため）、および／または本明細書に記載される方法を含む使用のための指示をさらに含み得る。

【0034】

これらおよび他の態様は、全体として開示を考慮すれば当業者に容易に明らかになる。 本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
４５２９４または４５７２３で指定されるジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）を含む、または表３に示されるＺＦＰ－ＴＦのアミノ酸配列を含むジンクフィンガータンパク質転写因子（ＺＦＰ－ＴＦ）。
（項目２）
項目１に記載のＺＦＰ－ＴＦをコードするポリヌクレオチド。
（項目３）
項目２に記載の１つまたは複数のポリヌクレオチドを含むｒＡＡＶベクターであって、前記ＺＦＰ－ＴＦが４５２９４もしくは４５７２３で指定されるＺＦＰを含むか、または前記ｒＡＡＶベクターが表３に示される配列を有するポリヌクレオチドを含む、ｒＡＡＶベクター。
（項目４）
前記ＺＦＰ－ＴＦが４５２９４または４５７２３で指定されるＺＦＰを含み、核局在化シグナル（ＮＬＳ）をコードする配列、および必要に応じて構成的プロモーター（例えば、ＣＭＶ）などの前記ＺＦＰ－ＴＦの発現を駆動するプロモーターをさらに含む、項目３に記載のｒＡＡＶベクター。
（項目５）
前記項目のいずれかに記載の１つもしくは複数のＺＦＰ－ＴＦ、１つもしくは複数のポリヌクレオチド、および／または１つもしくは複数のｒＡＡＶベクターを含む医薬組成物。
（項目６）
細胞におけるＨＴＴ遺伝子の発現を改変する方法であって、前記細胞に、前記項目のいずれかに記載の１つもしくは複数のＺＦＰ－ＴＦ、１つもしくは複数のポリヌクレオチド、１つもしくは複数のｒＡＡＶベクター、および／または医薬組成物を投与するステップを含む方法。
（項目７）
前記ＨＴＴ遺伝子が変異体ＨＴＴ（ｍＨＴＴ）遺伝子である、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記細胞がニューロン細胞である、項目６または７に記載の方法。
（項目９）
前記ニューロン細胞が脳にある、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記ニューロン細胞が脳の線条体にある、項目８または９に記載の方法。
（項目１１）
必要とする患者においてハンチントン病を処置および／または防止する方法であって、前記項目のいずれかに記載の１つもしくは複数のＺＦＰ－ＴＦ、１つもしくは複数のポリヌクレオチド、１つもしくは複数のｒＡＡＶベクターおよび／または医薬組成物を、必要とする患者に投与するステップを含み、必要に応じて前記１つまたは複数のＺＦＰ－ＴＦ、ポリヌクレオチド、ｒＡＡＶベクターおよび／または医薬組成物が、前記対象の線条体の両側に投与される、方法。
（項目１２）
必要とする患者における変異体ＨＴＴ（ｍＨＴＴ）発現を抑制するための、前記項目のいずれかに記載の１つもしくは複数のＺＦＰ－ＴＦ、１つもしくは複数のポリヌクレオチド、１つもしくは複数のｒＡＡＶベクターおよび／または医薬組成物の使用。
（項目１３）
ハンチントン病が前記対象において処置される、項目１２に記載の使用。
（項目１４）
ｍＨＴＴ凝集体および／または運動障害が前記対象において低減される、項目１２または１３に記載の使用。
（項目１５）
前記１つもしくは複数のＺＦＰ－ＴＦ、１つもしくは複数のポリヌクレオチド、１つもしくは複数のｒＡＡＶベクターおよび／または医薬組成物が、前記対象の脳に、必要に応じて前記対象の線条体の両側に送達される、項目１２から１４のいずれかに記載の使用。
（項目１６）
前記１つまたは複数のｒＡＡＶベクターが、１×１０ ^７ ～１×１０ ^１５ ベクターゲノム（ｖｇ）／線条体の用量で線条体の両側に投与される、項目１５に記載の使用。

【図面の簡単な説明】

【0035】

【図1】図１は、示されたＺＦＰ－ＴＦ（配列番号１８～２２）のタンパク質（アミノ酸）配列のアライメントを示す。同様に表３を参照されたい。

【0036】

【図2A】図２Ａおよび図２Ｂは、示されたＺＦＰ－ＴＦの導入後の相対的ＨＴＴ発現（ｗｔＨＴＴおよびｍＨＴＴ）を示すグラフである。図２Ａは、示されたＺＦＰ－ＴＦまたは対照（ＧＦＰまたは偽）のｍＲＮＡ型の導入後の、１７ＣＡＧリピート（ＣＡＧ１７を各対の棒グラフの左側に示す）（配列番号２３として開示される「ＣＡＧ」リピート）または４８ＣＡＧリピート（ＣＡＧ４８を各対の棒グラフの右側に示す）（配列番号２３として開示される「ＣＡＧ」リピート）のいずれかを含むヒト神経幹細胞（ＮＳＣ）におけるＨＴＴの発現を示す。各ＺＦＰの最も左側の棒グラフの対は、ｍＲＮＡ １５００ｎｇを細胞にトランスフェクトとした場合の結果を示し、左から２番目の棒グラフの対は、ｍＲＮＡ ３００ｎｇを細胞にトランスフェクトした場合の結果を示す。右から２番目の棒グラフの対は、ｍＲＮＡ １５０ｎｇを細胞にトランスフェクトとした場合の結果を示し、および最も右側の棒グラフの対は、ｍＲＮＡ １５ｎｇを細胞にトランスフェクトした場合の結果を示す。図２Ｂの上のグラフは、示されたＺＦＰ－ＴＦまたは対照（図２Ａに示すように）をコードするｒＡＡＶ６ベクターによる感染後２１日目でのＨＤニューロン（図２Ａと同様に示されたＣＡＧリピートによる）における相対的ＨＴＴ発現を示す。各棒グラフの対のｒＡＡＶ ＭＯＩ（ＣＡＧ１７（配列番号２３として開示される１７「ＣＡＧ」リピート）、およびＣＡＧ４８（配列番号２３として開示される４８「ＣＡＧ」リピート））をグラフの下に示す（５００Ｋ、３００Ｋ、１００Ｋ、１０Ｋ、左から右に棒グラフにおいて２連で表す）。図２Ｂの下のグラフは、示された条件下でのＺＦＰ－ＴＦコピー数を示す。ＺＦＰ－ＴＦ（４５６４３および４６０２５）を使用した結果を枠で囲む。

【図2B】同上。

【0037】

【図3】図３は、低用量（３Ｅ１０）または高用量（９Ｅ１０）のＺＦＰ－ＴＦおよびＧＦＰ対照（ＧＦＰ）を有するｒＡＡＶ、ならびにビヒクルおよび非注射対照によって処置した対象における変異体または野生型ＨＴＴのｉｎ ｖｉｖｏでの相対的発現レベルを示す。４８ＣＡＧリピートのノックイン（ＫＩ ＣＡＧ４８）（配列番号２３として開示される４８「ＣＡＧ」リピート）を有するＱ５０マウスにおける変異体ＨＴＴ（ＫＩ対立遺伝子 Ｑ５０）発現の抑制を示す。

【0038】

【図4】図４は、ＨＤニューロンにおける４つの示されたＺＦＰによるオフターゲット調節のマイクロアレイ分析の結果を示す。影をつけていない領域は、対照の５０～９０％のオフターゲット発現を示す。斜線の領域は、対照の９０％より大きいオフターゲット発現レベルを示す。交差斜線の枠（４５２９４、４５６４３、および４５７２３の列１）は、対照の５０％未満のオフターゲット発現を示す。示されるように、最も特異的から最も特異的でないＺＦＰ－ＴＦの特異性は、以下の通りである：４６０２５＞４５７２３＞４５６４３＞４５２９４。オフターゲット部位は、遺伝子の略称で称される（例えば、ＳＲＰＸは、Ｓｕｓｈｉ－リピート含有タンパク質、Ｘ連鎖遺伝子等を指す）。

【0039】

【図5】図５Ａおよび図５Ｂは、ＺＦＰ ４５６４３ ｍＲＮＡ（ｎｇ）の示された投薬量を投与後の、野生型ＨＴＴ（ＣＡＧ１８（配列番号２３として開示される１８「ＣＡＧ」リピート）または変異体ＨＴＴ（ｍＨＴＴ（ＣＡＧ４５（配列番号２３として開示される４５「ＣＡＧ」リピート）））のいずれかをコードする示されたｍＲＮＡの相対的発現を示すグラフである。各条件（投薬量）における左（白色）の棒グラフはＨＴＴｍＲＮＡ発現を示し、右（黒色）の棒グラフはｍＨＴＴ発現を示す。図５Ａは、示されたＺＦＰ ｍＲＮＡ投薬量での線維芽細胞における結果を示す。図５Ｂは、ニューロンにおける結果（ＧＦＰ発現の％としてのｍＲＮＡ発現）を示す。

【0040】

【図6】図６は、ニューロン（上）および線維芽細胞（下）におけるＺＦＰ－ＴＦ ４５６４３のオフターゲット分析を示す。影をつけていない領域は、対照の２倍未満または２倍に等しい抑制のオフターゲット抑制を示す。斜線の領域は、対照と比較してモジュレーションに変化がないことを示す。交差斜線の枠（列１はニューロンにおけるｓｐｒｘ標的を示し、列１～５（線維芽細胞におけるＳＰＲＸ、ＴＴＣ１２、ＭＡＢ２１１．１、ＳＴＣ１、およびＣＮＫ５Ｒ２標的部位））は、２倍より大きいオフターゲット抑制を示す。

【0041】

【図7】図７は、ヒト変異体ハンチンチン対立遺伝子のノックイン対立遺伝子を有する齧歯類ＨＤモデルであるＱ１７５マウスを、示された投薬量のＧＦＰまたはＺＦＰ－ＴＦ ４５６４３をコードするｒＡＡＶベクターによって処置した１１週間後の、対照（未処置）および処置Ｑ１７５マウスの線条体における野生型およびｍＨＴＴ発現を表すグラフを示す。左側のグラフは変異体（ｍＨＴＴ）の相対的発現を示し、右のグラフは野生型ＨＴＴ（ｗｔＨＴＴ）の相対的発現を示す。示されるように、ｍＨＴＴの有意で優先的な抑制が、全ての投薬量でＺＦＰ－ＴＦ処置動物において認められた。

【0042】

【図8】図８は、示された投薬量でＧＦＰまたはＺＦＰ－ＴＦ ４５６４３をコードするＡＡＶベクターによって処置した１１週間後の、対照（未処置）および処置Ｑ１７５マウスの線条体におけるウイルスゲノムコピー／細胞およびｍＨＴＴ ｍＲＮＡレベルを表すグラフを示す。左側のグラフは、示された条件下でのウイルスゲノムコピー／細胞を示し、右のグラフは、示された条件下でのＧＦＰレベルのパーセンテージとしてのｍＨＴＴ ｍＲＮＡレベルを示す。ｍＨＴＴ ｍＲＮＡレベルの有意な抑制が、１ＶＧ／細胞もの低い曝露を含む全ての投薬量でＺＦＰ－ＴＦ処置動物において観察された。

【0043】

【図9】図９は、示された投薬量のＧＦＰまたはＺＦＰ－ＴＦ ４５６４３を有するｒＡＡＶベクターによるＱ１７５マウスの処置後１１週目（左のグラフ）および３３週目（右のグラフ）での、脳の示された領域（線条体、前脳皮質、および後脳皮質）における可溶性ｍＨＴＴタンパク質（％ＧＦＰ処置）を表すグラフを示す。左から右に脳の各領域の棒グラフを示す：ＧＦＰ ５．５ｅ１０ ＶＧ／マウス；ＺＦＰ－ＴＦ ４５６４３ ９．２ｅ９ ＶＧ／マウスをコードするｒＡＡＶベクター；ＺＦＰ－ＴＦ ４５６４３ ３．１ｅ１０ ＶＧ／マウスをコードするｒＡＡＶベクター；およびＺＦＰ－ＴＦ ４５６４３ ９．２ｅ１０ ＶＧ／マウスをコードするｒＡＡＶベクター。可溶性ｍＨＴＴにおける用量依存的な有意な低減は、ＺＦＰ－ＴＦ ４５６４３をコードするｒＡＡＶベクターの１回投与後３３週間持続した。

【0044】

【図10】図１０は、示された投薬量のＧＦＰまたはＺＦＰ－ＴＦ ４５６４３を有するＡＡＶベクターによるＲ６／２ＨＤマウスの処置後の、脳の示された領域（線条体、前脳皮質、および後脳皮質）における可溶性ｍＨＴＴタンパク質（％ＧＦＰ処置）を表すグラフである。左から右に脳の各領域の棒グラフを示す：ＧＦＰ ５．５ｅ１０ ＶＧ／マウス；ＺＦＰ－ＴＦ ４５６４３ ９．２ｅ９ ＶＧ／マウスをコードするｒＡＡＶベクター；ＺＦＰ－ＴＦ ４５６４３ ３．１ｅ１０ ＶＧ／マウスをコードするｒＡＡＶベクター；およびＺＦＰ－ＴＦ ４５６４３ ９．２ｅ１０ ＶＧ／マウスをコードするｒＡＡＶベクター。ＺＦＰ－ＴＦは、重度のＲ６／２ ＨＤマウスモデルにおいて可溶性ｍＨＴＴタンパク質産生を有意に低減させた。

【0045】

【図11】図１１は、示された用量のＺＦＰ－ＴＦ ４５６４３をコードするｒＡＡＶベクターを投与後のＱ１７５およびＲ６／２マウスにおけるｍＨＴＴ核凝集を表すグラフを示す。左のグラフは、Ｑ１７５対象における導入遺伝子陽性ニューロン（スポット数／導入遺伝子陽性ニューロン数）におけるｍＨＴＴ核凝集体を示す。右のグラフは示された条件下での全てのニューロンにおけるｍＨＴＴ核凝集体（スポット数／ニューロン数）を示す。ＺＦＰ－ＴＦ投与は、Ｑ１７５およびＲ６／２対象の両方においてｍＨＴＴ核凝集体を低減させた。

【0046】

【図12】図１２は、１回用量による示された条件下で投与後８週目に分析した１２ヶ月齢のＱ１７５マウスの線条体ニューロンにおける野生型（ｗｔＨＴＴ）および変異体（ｍＨＴＴ）ｍＲＮＡ発現の相対的発現を表すグラフである。

【0047】

【図13】図１３は、示された処置条件下で投与後８週目および１６週目の１２ヶ月齢Ｑ１７５マウスにおける核周囲凝集体（ビヒクルのパーセントとしての）を表すグラフである。ＺＦＰ－ＴＦ ４５６４３は、１２ヶ月齢Ｑ１７５マウスにおいて治療的に投与した場合に核周囲ｍＨＴＴ凝集体を低減させた。

【0048】

【図14】図１４は、示された処置条件下でＲ６／２マウスにおける運動機能を表すグラフを示す。左のグラフは、対象がローターロッドに留まることができる時間を測定するローターロッド性能試験の結果を示す。右のグラフは、示された週齢での示された条件下で、四肢をつかむ行動を示すマウスのパーセンテージを示す。

【発明を実施するための形態】

【0049】

ハンチントン病（ＨＤ）を検出する、疾患進行をモニターする、処置する、および／または防止するための組成物の広範なＣＮＳ送達のための組成物および方法が本明細書で開示される。特に、本明細書に記載される組成物および方法は、送達部位を超えて機能的ｍＨＴＴリプレッサーの広がりを提供するｍＨＴＴリプレッサーの送達のためのＡＡＶ９ベクターを使用する。ｍＨＴＴリプレッサー（例えば、ｍＨＴＴモジュレート転写因子、例えばジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ ＴＦ）、ＴＡＬＥ（ＴＡＬＥ－ＴＦ）、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ－ＴＦ、例えば変異体ＨＴＴ対立遺伝子の発現を抑制するＺＦＰ－ＴＦ、ＴＡＬＥ－ＴＦ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ－ＴＦを含むｍＨＴＴモジュレート転写因子）は、例えばＨＤニューロンにおけるＨＴＴの凝集を低減させることによって、ＨＤニューロンのエネルギー論を増加させることによって（例えば、ＡＴＰレベルの増加）、ＨＤニューロンにおけるアポトーシスを低減させることによって、および／またはＨＤ対象における運動障害を低減することによって、ＨＤの作用および／または症状を低減または消失させるようにＣＮＳを改変する。
総論

【0050】

方法の実施、ならびに本明細書で開示される組成物の調製および使用は、別段の指定がない限り、当業界の技術範囲内ものとして、分子生物学、生化学、クロマチン構造および分析、計算機化学、細胞培養、組換えＤＮＡならびに関連分野における従来の技術を用いる。これらの技術は、文献で十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ， Ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８９ ａｎｄ Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， ２００１；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８７および定期のアップデート；ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹのシリーズ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ；Ｗｏｌｆｆｅ， ＣＨＲＯＭＡＴＩＮ ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮ， Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， １９９８；ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ， Ｖｏｌ． ３０４， ”Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ” （Ｐ．Ｍ． Ｗａｓｓａｒｍａｎ ａｎｄ Ａ． Ｐ． Ｗｏｌｆｆｅ， ｅｄｓ．）， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， １９９９；ならびにＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ， Ｖｏｌ． １１９， ”Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ” （Ｐ．Ｂ． Ｂｅｃｋｅｒ， ｅｄ．） Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ， １９９９を参照されたい。

【0051】

"
定義
用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」は、同義的に使用され、直鎖状または環状のコンフォメーションの、一本鎖または二本鎖形態のいずれかの、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示の目的のために、これらの用語は、ポリマーの長さに関する限定と解釈されないものとする。用語は、天然ヌクレオチドの公知のアナログ、ならびに塩基、糖および／またはリン酸部分において改変されたヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート主鎖）を包含し得る。一般的に、特定のヌクレオチドのアナログは、同じ塩基対形成の特異性を有し、すなわち、Ａのアナログは、Ｔと塩基対を形成する。

【0052】

用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、同義的に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。用語は、１つまたは複数のアミノ酸が、対応する天然に存在するアミノ酸の化学的アナログまたは改変された誘導体であるアミノ酸ポリマーにも適用される。

【0053】

「結合」は、高分子間の（例えば、タンパク質と核酸との間の）配列特異的な非共有結合の相互作用を指す。全体としての相互作用が配列特異的である限り、必ずしも結合相互作用の全ての成分が配列特異的であること（例えば、ＤＮＡ主鎖中のリン酸残基との接触）を必要としない。このような相互作用は、一般的に１０^－６Ｍ^－１またはそれよりも低い解離定数（Ｋ_ｄ）によって特徴付けられる。「親和性」は、結合の強度を指し、結合親和性の増加は、より低いＫ_ｄと相関する。

【0054】

「結合タンパク質」は、非共有結合によって別の分子に結合することができるタンパク質である。結合タンパク質は、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）および／またはタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）に結合することができる。タンパク質結合タンパク質の場合、それは、それ自体に結合することができ（ホモ二量体、ホモ三量体などを形成する）、および／またはそれは、異なるタンパク質（単数または複数）の１つもしくは複数の分子に結合することができる。結合タンパク質は、１つよりも多くのタイプの結合活性を有していてもよい。例えば、ジンクフィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合、ＲＮＡ結合およびタンパク質結合活性を有する。

【0055】

「ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質」（または結合ドメイン）は、配列特異的な方式で、構造が亜鉛イオンの配位を介して安定化された結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である１つまたは複数のジンクフィンガーを介してＤＮＡに結合する、タンパク質、またはより大きいタンパク質内のドメインである。ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質という用語は、しばしばジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰと略記される。

【0056】

「ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン」または「ＴＡＬＥ」は、１つまたは複数のＴＡＬＥ反復ドメイン／単位を含むポリペプチドである。反復ドメインは、ＴＡＬＥのそのコグネート標的ＤＮＡ配列への結合に関与する。単一の「反復単位」（「反復」とも称される）は、典型的には３３～３５アミノ酸の長さであり、天然に存在するＴＡＬＥタンパク質内の他のＴＡＬＥ反復配列と少なくともある程度の配列相同性を示す。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号を参照されたい。

【0057】

「ＴｔＡｇｏ」は、遺伝子サイレンシングに関与すると考えられる原核生物アルゴノートタンパク質である。ＴｔＡｇｏは、細菌Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来である。例えば、Ｓｗａｒｔｓ ｅｔ ａｌ，（２０１４） Ｎａｔｕｒｅ ５０７（７４９１）：２５８－２６１；Ｇ． Ｓｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．， （２０１３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． １１１， ６５２を参照されたい。「ＴｔＡｇｏ系」は、例えばＴｔＡｇｏ酵素による切断のためのガイドＤＮＡを含む必要な全ての成分である。
「組換え」は、これらに限定されないが、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によるドナー捕捉および相同組換えを含む、２つのポリヌクレオチド間の遺伝情報の交換プロセスを指す。この開示の目的のために、「相同組換え（ＨＲ）」は、例えば、相同組換え修復メカニズムを介した細胞における二本鎖切断の修復中に起こる、このような交換の特殊化した形態を指す。このプロセスは、ヌクレオチド配列相同性を必要とし、「標的」分子（すなわち、二本鎖切断を経たもの）の鋳型修復に「ドナー」分子を使用し、ドナーから標的への遺伝情報の移入をもたらすことから、「非交差遺伝子変換」または「ショートトラクト遺伝子変換」として様々な形で公知である。いかなる特定の理論にも縛られることは望まないが、このような移入は、切断した標的とドナーとの間で形成されるヘテロ二重鎖ＤＮＡのミスマッチ修正、ならびに／またはドナーを使用して標的および／もしくは関連プロセスの一部になる遺伝情報を再合成する「合成依存性鎖アニーリング」を含み得る。このような特殊化したＨＲは、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部または全部が標的ポリヌクレオチドに取り込まれるような、標的分子の配列の変更をもたらすことが多い。

【0058】

ジンクフィンガー結合ドメインおよびＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインは、例えば天然に存在するジンクフィンガータンパク質の認識へリックス領域を操作すること（１つまたは複数のアミノ酸を変更すること）を介して、またはＴＡＬＥタンパク質のＲＶＤを操作することによって、所定のヌクレオチド配列に結合するように「操作」することができる。それゆえに、操作されたジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥは、天然に存在しないタンパク質である。ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥを操作するための方法の非限定的な例は、設計および選択である。「設計された」ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥは、その設計／組成が主として合理的な基準に起因する天然に存在しないタンパク質である。設計に関する合理的な基準としては、置換ルールの適用、ならびに既存のＺＦＰ設計および結合データのデータベース保存情報における情報を処理するためのコンピューター化されたアルゴリズムが挙げられる。「選択された」ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥは、天然に見出されないタンパク質であり、それらの産生は主として、実験的なプロセス、例えばファージディスプレイ、相互作用トラップまたはハイブリッド選択に起因する。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号；同第６，１４０，０８１号；同第６，４５３，２４２号；同第６，７４６，８３８号；同第７，２４１，５７３号；同第６，８６６，９９７号；同第７，２４１，５７４号、および同第６，５３４，２６１号を参照されたい；同様に、国際公報ＷＯ０３／０１６４９６号も参照されたい。

【0059】

用語「配列」は、ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、直鎖状、環状または分岐状であってもよく、一本鎖または二本鎖のいずれであってもよい、任意の長さのヌクレオチド配列を指す。用語「ドナー配列」は、ゲノムに挿入されるヌクレオチド配列を指す。ドナー配列は、任意の長さ、例えば、２～１０，０００ヌクレオチドの間の長さ（またはそれらの間の、またはそれらを超える任意の整数値）、好ましくは、約１００～１，０００ヌクレオチドの間の長さ（またはそれらの間の任意の整数）、より好ましくは、約２００～５００ヌクレオチドの間の長さ（またはそれらの間の任意の値）のものであってもよい。

【0060】

「標的部位」または「標的配列」は、結合に十分な条件が存在することを条件として、結合分子が結合する核酸の部分を定義する核酸配列である。

【0061】

「外因性」分子は、細胞中に通常存在しないが、１つまたは複数の遺伝学的、生化学的または他の方法によって細胞に導入できる分子である。「細胞中に通常存在すること」は、細胞の特定の発生段階および環境条件に関して決定される。したがって、例えば、筋肉の胚発生中にのみ存在する分子は、成体筋肉細胞にとって外因性分子である。同様に、熱ショックにより誘導された分子は、熱ショックを受けていない細胞にとって外因性分子である。外因性分子は、例えば、正常に機能しない内因性分子の機能するバージョン、または正常に機能する内因性分子の正常に機能しないバージョンを含んでいてもよい。

【0062】

外因性分子は、とりわけ、コンビナトリアルケミストリープロセスによって生成されたなどの小分子、またはタンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖などの高分子、上記の分子の任意の改変された誘導体、または上記の分子の１つもしくは複数を含む任意の複合体であってもよい。核酸としては、ＤＮＡおよびＲＮＡが挙げられ、これらは、一本鎖または二本鎖であってもよく、直鎖状、分岐状または環状であってもよく、任意の長さのものであってもよい。核酸としては、二重鎖を形成することが可能なもの、ならびに三重鎖形成核酸が挙げられる。例えば、米国特許第５，１７６，９９６号および同第５，４２２，２５１号を参照されたい。タンパク質としては、これらに限定されないが、ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子、クロマチン再構築因子、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイレースおよびヘリカーゼが挙げられる。

【0063】

外因性分子は、内因性分子と同じタイプの分子、例えば、外因性タンパク質または核酸であってもよい。例えば、外因性核酸は、細胞中に通常存在しない、細胞または染色体に導入される感染性のウイルスゲノム、プラスミドまたはエピソームを含んでいてもよい。外因性分子の細胞への導入のための方法は、当業者に公知であり、これらに限定されないが、脂質媒介性移入（すなわち、中性およびカチオン脂質を含むリポソーム）、エレクトロポレーション、直接注射、細胞融合、粒子衝撃、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介性移入およびウイルスベクター媒介性移入が挙げられる。また外因性分子は、内因性分子と同じタイプの分子であってもよいが、細胞が由来するものとは異なる種に由来する。例えば、ヒト核酸配列は、元々はマウスまたはハムスター由来の細胞系に導入されてもよい。

【0064】

それに対して、「内因性」分子は、特定の細胞中に、特定の発生段階で、特定の環境条件下で通常存在するものである。例えば、内因性核酸は、染色体、ミトコンドリアのゲノム、葉緑体もしくは他の細胞器官、または天然に存在するエピソームの核酸を含み得る。追加の内因性分子としては、タンパク質、例えば、転写因子および酵素を挙げることができる。

【0065】

「融合」分子は、２つまたはそれよりも多くのサブユニット分子が好ましくは共有結合によって連結されている分子である。サブユニット分子は、同じ化学的タイプの分子であってもよく、異なる化学的タイプの分子であってもよい。第１のタイプの融合分子の例としては、これらに限定されないが、融合タンパク質（例えば、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインと、１つまたは複数活性化ドメインとの融合体）、および融合核酸（例えば、上記の融合タンパク質をコードする核酸）が挙げられる。第２のタイプの融合分子の例としては、これらに限定されないが、三重鎖形成核酸とポリペプチドとの間の融合体、および副溝結合体と核酸との間の融合体が挙げられる。用語はまた、ポリヌクレオチド成分が、ポリペプチド成分と会合して機能的分子を形成する系も含む（例えば、単一ガイドＲＮＡが機能的ドメインと会合して遺伝子発現をモジュレートするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）。

【0066】

細胞における融合タンパク質の発現は、細胞への融合タンパク質の送達から、または細胞への融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの送達によって生じてもよく、ポリヌクレオチドが転写され、転写物が翻訳されて、融合タンパク質を生成する。また、細胞におけるタンパク質の発現に、トランススプライシング、ポリペプチドの切断およびポリペプチドのライゲーションが含まれていてもよい。細胞へのポリヌクレオチドおよびポリペプチド送達のための方法は、この開示の他所で提示される。

【0067】

「多量体化ドメイン」（同様に、「二量体化ドメイン」または「タンパク質相互作用ドメイン」とも称される）は、ＺＦＰ ＴＦまたはＴＡＬＥ ＴＦのアミノ、カルボキシ、またはアミノおよびカルボキシ末端領域に組み込まれたドメインである。これらのドメインは、三塩基リピートドメインのより大きい経路が、野生型の長さの数を有するより短い経路と比較して多量体化ＺＦＰ ＴＦまたはＴＡＬＥ ＴＦによって優先的に結合されるように複数のＺＦＰ ＴＦまたはＴＡＬＥ ＴＦ単位の多量体化を可能にする。多量体化ドメインの例は、ロイシンジッパーを含む。多量体化ドメインはまた、小分子によっても調節され得るが、多量体化ドメインは、小分子または外部のリガンドの存在下に限って別の多量体化ドメインとの相互作用を可能にする適切な立体構造をとる。したがって、外因性のリガンドを使用して、これらのドメインの活性を調節することができる。

【0068】

「遺伝子」は、本開示の目的に関して、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域（下記を参照）、ならびに遺伝子産物の産生を調節する全てのＤＮＡ領域を含み、このような調節配列がコード配列および／または転写された配列に隣接しているかどうかは問わない。したがって、遺伝子としては、必ずしもこれらに限定されないが、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳調節配列、例えばリボソーム結合部位および内部リボソーム進入部位、エンハンサー、サイレンサー、インシュレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス結合部位および遺伝子座制御領域が挙げられる。

【0069】

「遺伝子発現」は、遺伝子に含有される情報の遺伝子産物への変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接的な転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡまたは他の任意のタイプのＲＮＡ）、またはｍＲＮＡの翻訳によって産生されたタンパク質であり得る。遺伝子産物は、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、および編集などのプロセスによって改変されたＲＮＡ、ならびに例えばメチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰ－リボシル化、ミリスチル化（ｍｙｒｉｓｔｉｌａｔｉｏｎ）、およびグリコシル化によって改変されたタンパク質も含む。

【0070】

遺伝子発現の「モジュレーション」は、遺伝子の活性の変化を指す。発現のモジュレーションとしては、これらに限定されないが、遺伝子の活性化および遺伝子の抑制を挙げることができる。ゲノム編集（例えば、切断、変更、不活性化、ランダム変異）を使用して、発現をモジュレートすることができる。遺伝子の不活性化は、本明細書に記載されるＺＦＰ、またはＴＡＬＥタンパク質を含まない細胞と比較した、遺伝子発現における任意の低減を指す。したがって、遺伝子の不活性化は、部分的であっても、完全であってもよい。

【0071】

「目的の領域」は、外因性分子に結合することが望ましい、細胞クロマチンの任意の領域、例えば、遺伝子、または遺伝子内のもしくは遺伝子に隣接する非コード配列などである。結合は、標的化されたＤＮＡ切断および／または標的化された組換えの目的のためであり得る。目的の領域は、例えば、染色体、エピソーム、細胞小器官のゲノム（例えば、ミトコンドリア、葉緑体）、または感染性のウイルスゲノム中に存在していてもよい。目的の領域は、遺伝子のコード領域内、例えば、リーダー配列、トレーラー配列もしくはイントロンなどの転写された非コード領域内、またはコード領域の上流もしくは下流のいずれかの転写されなかった領域内であってもよい。目的の領域は、単一のヌクレオチド対ほど小さくてもよく、もしくは最長２，０００ヌクレオチド対の長さであってもよく、または任意の整数値のヌクレオチド対であってもよい。

【0072】

「真核」細胞としては、これらに限定されないが、真菌細胞（例えば酵母）、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞およびヒト細胞（例えば、Ｔ細胞）が挙げられる。

【0073】

用語「作用的な連結」および「作動可能に（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ）連結した」（または「作用的に（ｏｐｅｒａｂｌｙ）連結した」）は、両方の成分が正常に機能し、成分の少なくとも１つが、他の成分の少なくとも１つで発揮される機能を媒介し得る可能性をもたらすように成分が配列されている２つまたはそれよりも多くの成分（例えば配列エレメント）の並置に関連して、同義的に使用される。例証として、プロモーターなどの転写調節配列が、１つまたは複数の転写調節因子の存在または非存在に応答してコード配列の転写レベルを制御する場合、転写調節配列は、コード配列に作用的に連結している。転写調節配列は、一般的に、コード配列とシスで作用的に連結しているが、必ずしもそれと直接隣接していなくてもよい。例えば、エンハンサーは、それらが連続していないとしても、コード配列に作用的に連結した転写調節配列である。

【0074】

融合ポリペプチドに関して、用語「作動可能に連結した」とは、成分のそれぞれが、連結されていない場合と同様に、他の成分と連結されても同じ機能を発揮するという事実を指し得る。例えば、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが活性化ドメインに融合されている融合ポリペプチドの場合、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインは、融合ポリペプチドにおいてＺＦＰまたはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合部位に結合することができるが、活性化ドメインが遺伝子発現をアップレギュレートすることができる場合、作動可能な連結にある。遺伝子発現を調節することが可能なドメインに融合されたＺＦＰは、集合的に「ＺＦＰ－ＴＦ」、または「ジンクフィンガー転写因子」と称されるが、遺伝子発現を調節することが可能なドメインに融合されたＴＡＬＥは、集合的に「ＴＡＬＥ－ＴＦ」または「ＴＡＬＥ転写因子」と称される。ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインが切断ドメイン（「ＺＦＮ」または「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」）に融合されている融合ポリペプチドの場合、融合ポリペプチドにおいて、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合部位に結合することができるが、切断ドメインが、標的部位の近傍でＤＮＡを切断することができる場合、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインおよび切断ドメインは作動可能な連結にある。ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが切断ドメイン（「ＴＡＬＥＮ」、または「ＴＡＬＥヌクレアーゼ」）に融合されている融合ポリペプチドの場合、融合ポリペプチドにおいて、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合部位に結合することができるが、切断ドメインが、標的部位の近傍でＤＮＡを切断することができる場合、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインおよび切断ドメインは作動可能な連結にある。Ｃａｓ ＤＮＡ結合ドメインが活性化ドメインに融合されている融合ポリペプチドの場合、融合ポリペプチドにおいて、Ｃａｓ ＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合部位に結合することができるが、活性化ドメインが遺伝子発現をアップレギュレートすることができる場合、Ｃａｓ ＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインは作動可能な連結にある。Ｃａｓ ＤＮＡ結合ドメインが切断ドメインに融合されている融合ポリペプチドの場合、融合ポリペプチドにおいて、Ｃａｓ ＤＮＡ結合ドメインがその標的部位および／またはその結合部位に結合することができるが、切断ドメインが標的部位の近傍でＤＮＡを切断することができる場合、Ｃａｓ ＤＮＡ結合ドメインおよび切断ドメインは作動可能な連結にある。

【0075】

タンパク質、ポリペプチドまたは核酸の「機能的な断片」は、その配列が全長のタンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同一ではないが、全長のタンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同じ機能を依然として保持している、タンパク質、ポリペプチドまたは核酸である。機能的な断片は、対応するネイティブの分子よりも多くの、それよりも少ない、もしくはそれと同じ数の残基を有していてもよいし、および／または１つもしくは複数のアミノ酸もしくはヌクレオチド置換を含有していてもよい。核酸の機能を決定するための方法（例えば、コード化機能、別の核酸にハイブリダイズする能力）は、当業界において周知である。同様に、タンパク質の機能を決定する方法も周知である。例えば、ポリペプチドのＤＮＡ結合機能は、例えばフィルター結合、電気泳動移動度のシフト、または免疫沈降アッセイによって決定することができる。ＤＮＡ切断は、ゲル電気泳動によってアッセイすることができる。Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．、前記を参照されたい。タンパク質が別のタンパク質と相互作用する能力は、例えば共免疫沈降、２ハイブリッドアッセイ、または遺伝的および生化学的相補性によって決定することができる。例えば、Ｆｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４５－２４６；米国特許第５，５８５，２４５号、および国際公報ＷＯ９８／４４３５０号を参照されたい。

【0076】

「ベクター」は、遺伝子配列を標的細胞に移入させることが可能である。典型的には、「ベクター構築物」、「発現ベクター」、および「遺伝子移入ベクター」は、目的の遺伝子の発現を指示することが可能な、遺伝子配列を標的細胞に移入させることができる任意の核酸構築物を意味する。したがって、用語は、クローニング、および発現ビヒクル、ならびに組み込み型ベクターを含む。用語は、これらに限定されないがプラスミド、ｍＲＮＡ、ＡＡＶ（本明細書において「組換えＡＡＶ」または「ｒＡＡＶ」とも称される）、アデノウイルスベクター（Ａｄ）、レンチウイルスベクター（例えば、ＩＤＬＶ）等を含む、ウイルスおよび非ウイルスベクターを含む。

【0077】

「レポーター遺伝子」または「レポーター配列」は、必ずしもそうでなくてもよいが、好ましくは慣例的なアッセイで容易に測定されるタンパク質生成物を産生する任意の配列を指す。好適なレポーター遺伝子としては、これらに限定されないが、抗生物質耐性（例えば、アンピシリン耐性、ネオマイシン耐性、Ｇ４１８耐性、ピューロマイシン耐性）を媒介するタンパク質をコードする配列、有色または蛍光または発光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、強化緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ）、ならびに強化された細胞成長および／または遺伝子増幅（例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ）を媒介するタンパク質をコードする配列が挙げられる。エピトープタグとしては、例えば、ＦＬＡＧ、Ｈｉｓ、ｍｙｃ、Ｔａｐ、ＨＡまたは任意の検出可能なアミノ酸配列の１つまたは複数のコピーが挙げられる。「発現タグ」は、目的の遺伝子の発現をモニターするために所望の遺伝子配列に作動可能に連結され得るレポーターをコードする配列を含む。
ＤＮＡ結合ドメイン

【0078】

本明細書に記載される方法は、ＨＴＴ遺伝子における標的配列に特異的に結合する、特に複数の三塩基リピートを含む変異体ＨＴＴ対立遺伝子（ｍＨＴＴ）に結合するＤＮＡ結合ドメインを含む組成物、例えばＨＴＴモジュレート転写因子を利用する。任意のポリヌクレオチドまたはポリペプチドＤＮＡ結合ドメイン、例えばＤＮＡ結合タンパク質（例えば、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ）またはＤＮＡ結合ポリヌクレオチド（例えば、単一ガイドＲＮＡ）を、本明細書に開示される組成物および方法において使用することができる。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号６のヌクレオチドの９～２８（または１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２７を含むその間の任意の値）連続コピーを含む標的部位に結合する。

【0079】

ある特定の実施形態では、ｍＨＴＴモジュレート転写因子、またはその中のＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガータンパク質を含む。標的部位の選択；融合タンパク質（およびそれをコードするポリヌクレオチド）の設計および構築のためのＺＦＰおよび方法は、当業者に公知であり、米国特許第６，１４０，０８１号；同第５，７８９，５３８号；同第６，４５３，２４２号；同第６，５３４，２６１号；同第５，９２５，５２３号；同第６，００７，９８８号；同第６，０１３，４５３号；および同第６，２００，７５９号；ならびに国際特許公開ＷＯ９５／１９４３１；ＷＯ９６／０６１６６；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ９８／５４３１１；ＷＯ００／２７８７８；ＷＯ０１／６０９７０ ＷＯ０１／８８１９７；ＷＯ０２／０９９０８４；ＷＯ９８／５３０５８；ＷＯ９８／５３０５９；ＷＯ９８／５３０６０；ＷＯ０２／０１６５３６およびＷＯ０３／０１６４９６で詳細に記載されている。

【0080】

ある特定の実施形態では、ＺＦＰは、変異体ＨＴＴ対立遺伝子または野生型ＨＴＴ配列のいずれかに選択的に結合することができる。ＨＴＴ標的部位は典型的に、少なくとも１つのジンクフィンガーを含むが複数のジンクフィンガー（例えば、２、３、４、５、６、またはそれより多くのフィンガー）を含み得る。例えば、米国特許第９，２３４，０１６号；同第９，９４３，５６５号；同第８，８４１，２６０号；同第９，４９９，５９７号；および米国特許出願公開第２０１５／０３３５７０８号；同第２０１８／０２００３３２号；同第２０１７／００９６４６０号；同第２０１７／００３５８３９号；同第２０１６／０２９６６０５号；および同第２０１９／０３２２７１１号を参照されたい。通常、ＺＦＰは、少なくとも３つのフィンガーを含む。ＺＦＰのある特定のものは、４、５または６つのフィンガーを含むが、一部のＺＦＰは、７、８、９、１０、１１または１２のフィンガーを含む。３つのフィンガーを含むＺＦＰは、典型的には、９または１０ヌクレオチドを含む標的部位を認識し；４つのフィンガーを含むＺＦＰは、典型的には、１２～１４ヌクレオチドを含む標的部位を認識し；一方で６つのフィンガーを有するＺＦＰは、１８～２１ヌクレオチドを含む標的部位を認識することができる。ＺＦＰはまた、１つまたは複数の調節ドメインを含む融合タンパク質であってもよく、このドメインは、転写活性化または抑制ドメインであってもよい。一部の実施形態では、融合タンパク質は、共に連結された２つのＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインを含む。したがって、これらのジンクフィンガータンパク質は、８、９、１０、１１、１２個またはそれより多くのフィンガーを含み得る。一部の実施形態では、２つのＤＮＡ結合ドメインは、１つのＤＮＡ結合ドメインが、４、５、または６個のジンクフィンガーを含み、第２のＤＮＡ結合ドメインが追加の４、５、または５個のジンクフィンガーを含むように、伸張可能なフレキシブルリンカーを介して連結される。一部の実施形態では、リンカーは、フィンガーアレイが、８、９、１０、１１、または１２個またはそれより多くのフィンガーを含む１つのＤＮＡ結合ドメインを含むように、標準的なフィンガー間リンカーである。他の実施形態では、リンカーはフレキシブルリンカーなどの非定型リンカーである。ＤＮＡ結合ドメインは、少なくとも１つの調節ドメインに融合され、「ＺＦＰ－ＺＦＰ－ＴＦ」構造であると考えることができる。これらの実施形態の特定の例は、フレキシブルリンカーによって連結され、ＫＯＸリプレッサーに融合された２つのＤＮＡ結合ドメインを含む「ＺＦＰ－ＺＦＰ－ＫＯＸ」、および２つのＺＦＰ－ＫＯＸ融合タンパク質がリンカーを介して共に融合されている「ＺＦＰ－ＫＯＸ－ＺＦＰ－ＫＯＸ」と称され得る。

【0081】

あるいは、ＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼ由来であってもよい。例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼの認識配列、例えばＩ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＣｅｕＩ、ＰＩ－ＰｓｐＩ、ＰＩ－Ｓｃｅ、Ｉ－ＳｃｅＩＶ、Ｉ－ＣｓｍＩ、Ｉ－ＰａｎＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩ、Ｉ－ＰｐｏＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＴｅｖＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩおよびＩ－ＴｅｖＩＩＩが公知である。米国特許第５，４２０，０３２号；米国特許第６，８３３，２５２号；Ｂｅｌｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３７９－３３８８；Ｄｕｊｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｇｅｎｅ ８２：１１５－１１８；Ｐｅｒｌｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２２， １１２５－１１２７；Ｊａｓｉｎ （１９９６） Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． １２：２２４－２２８； Ｇｉｍｂｌｅ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２６３：１６３－１８０；Ａｒｇａｓｔ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２８０：３４５－３５３およびＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓのカタログも参照されたい。加えて、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合特異性は、非天然の標的部位に結合するように操作することができる。例えば、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ． （２００２） Ｍｏｌｅｃ． Ｃｅｌｌ １０：８９５－９０５；Ｅｐｉｎａｔ ｅｔ ａｌ． （２００３） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３１：２９５２－２９６２；Ａｓｈｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ． （２００６） Ｎａｔｕｒｅ ４４１：６５６－６５９；Ｐａｑｕｅｓ ｅｔ ａｌ． （２００７） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７：４９－６６；米国特許公開第２００７／０１１７１２８号を参照されたい。

【0082】

「２ハンド」のジンクフィンガータンパク質とは、２つのジンクフィンガードメインが２つの不連続な標的部位に結合するように、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインの２つのクラスターが介在するアミノ酸によって離れているそれらのタンパク質である。２ハンド型のジンクフィンガー結合タンパク質の例は、４つのジンクフィンガーのクラスターがタンパク質のアミノ末端に位置し、３つのフィンガーのクラスターがカルボキシル末端に位置するＳＩＰ１である（Ｒｅｍａｃｌｅ ｅｔ ａｌ． （１９９９） ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ １８（１８）：５０７３－５０８４を参照されたい）。これらのタンパク質におけるジンクフィンガーのそれぞれのクラスターは、固有の標的配列に結合することができ、２つの標的配列間の間隔は多くのヌクレオチドを含み得る。２ハンド型ＺＦＰは、例えばＺＦＰの１つまたは両方に融合した機能的ドメインを含み得る。したがって、機能的ドメインは、１つまたは両方のＺＦＰの外部に結合され得る（図１Ｃを参照されたい）か、またはＺＦＰ間に位置し得る（両方のＺＦＰに結合する）ことは明白である（図４）。

【0083】

ＨＴＴ標的化ＺＦＰの特定の例は、表１ならびにその全体が全ての目的に関して参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第９，２３４，０１６号；同第８，８４１，２６０号；および同第６，５３４，２６１号；米国特許出願公開第２０１７／００９６４６０号；同第２０１５／００５６７０５号；同第２０１５／０３３５７０８号；および同第２０１９／０３２２７１１号に開示される。この表の第１列は、ＺＦＰの内部参照名（番号）であり、表２の列１の同じ名称に対応する。「Ｆ」はフィンガーを指し、「Ｆ」の後の数字はどのジンクフィンガーであるかを指す（例えば、「Ｆ１」はフィンガー１を指す）。

【表1】

【0084】

これらのタンパク質の標的部位の配列および位置を表２に開示する。ＺＦＰ認識ヘリックスが接触する標的部位中のヌクレオチドを、大文字で示し、非接触ヌクレオチドを小文字で示す。

【表2】

【0085】

本明細書に記載されるＺＦＰ－ＴＦはまた、認識ヘリックス領域（すなわち、骨格領域）外に、米国特許出願公開第２０１８／００８７０７２号に記載される変異を含む、１つまたは複数の変異を含み得る。

【0086】

ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、天然に存在するまたは操作された（天然に存在しない）ＴＡＬエフェクター（ＴＡＬＥ）ＤＮＡ結合ドメインを含む。例えばその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，５８６，５２６号を参照されたい。

【0087】

Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属の植物病原菌は、重要な穀物植物において多くの疾患を引き起こすことが公知である。Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓの病原性は、２５個よりも多くの異なるエフェクタータンパク質を植物細胞に注入する保存されたＩＩＩ型分泌（Ｔ３Ｓ）系に依存する。これらの注入されたタンパク質のなかでも、植物転写活性化因子を模倣し、植物トランスクリプトームをマニピュレートする転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）がある（Ｋａｙ ｅｔ ａｌ （２００７） Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８：６４８－６５１を参照）。これらのタンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインを含有する。最もよく特徴付けられたＴＡＬＥの１つは、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｇｒｉｓ ｐｖ．Ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ由来のＡｖｒＢｓ３である（Ｂｏｎａｓ ｅｔ ａｌ （１９８９） Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２１８：１２７－１３６および国際特許公開ＷＯ２０１０／０７９４３０を参照）。ＴＡＬＥは、タンデム反復の集中型ドメインを含有し、各反復は、これらのタンパク質のＤＮＡ結合特異性にとって重要なおよそ３４アミノ酸を含有する。加えて、それらは、核局在化配列および酸性転写活性化ドメインを含有する（総説に関して、Ｓ． Ｓｃｈｏｒｎａｃｋ ｅｔ ａｌ （２００６） Ｊ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １６３（３）：２５６－２７２を参照）。加えて、植物病原性細菌であるＲａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍにおいて、Ｒ．ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ ｂｉｏｖａｒ １株ＧＭＩ１０００およびｂｉｏｖａｒ ４株ＲＳ１０００においてＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓのＡｖｒＢｓ３ファミリーに相同な、ｂｒｇ１１およびｈｐｘ１７と名付けられた２つの遺伝子が見出されている（Ｈｅｕｅｒ ｅｔ ａｌ （２００７） Ａｐｐｌ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒ Ｍｉｃｒｏ ７３（１３）：４３７９－４３８４を参照）。これらの遺伝子は、ヌクレオチド配列において互いに９８．９％同一であるが、ｈｐｘ１７の反復ドメインにおける１，５７５ｂｐの欠失により異なる。しかしながら、両方の遺伝子産物は、ＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓのＡｖｒＢｓ３ファミリータンパク質と４０％未満の配列同一性を有する。

【0088】

これらのＴＡＬＥの特異性は、タンデム反復に見出される配列に依存する。繰り返しの配列は、およそ１０２塩基対を含み、反復は、典型的には、互いに９１～１００％相同である（Ｂｏｎａｓ ｅｔ ａｌ （１９８９） Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２１８：１２７－１３６）。反復の多型は通常、１２および１３位に位置し、ＴＡＬＥの標的配列における連続するヌクレオチドの同一性と、１２および１３位における高度可変二残基の同一性と間に１対１の対応が存在すると考えられる（Ｍｏｓｃｏｕ ａｎｄ Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ， （２００９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６：１５０１およびＢｏｃｈ ｅｔ ａｌ （２００９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６：１５０９－１５１２を参照）。実験的に、これらのＴＡＬＥのＤＮＡ認識に関するコードは、１２および１３位におけるＨＤ配列により、シトシン（Ｃ）への結合が起こり、ＮＧがＴに、ＮＩがＡ、Ｃ、ＧまたはＴに結合し、ＮＮがＡまたはＧに結合し、ＮＧがＴに結合すると決定された。これらのＤＮＡ結合反復が、新しい組合せおよび多数の反復を有するタンパク質に組み立てることができる人工転写因子が作製された。加えて、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，５８６，５２６号および米国特許出願公開第２０１３／０１９６３７３号は、Ｎ－キャップポリペプチド、Ｃ－キャップポリペプチド（例えば、＋６３、＋２３１、または＋２７８）および／または新規（非定型）ＲＶＤを有するＴＡＬＥを記載する。

【0089】

例示的なＴＡＬＥは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１３／０２５３０４０号に記載される。

【0090】

ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、二量体化および／または多量体化ドメイン、例えばコイルドコイル（ＣＣ）および二量体化ジンクフィンガー（ＤＺ）を含む。米国特許出願公開第２０１３／０２５３０４０号を参照されたい。

【0091】

なおさらなる実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の単一ガイドＲＮＡ、例えば米国特許出願公開第２０１５／００５６７０５号に開示されるｓｇＲＮＡを含む。

【0092】

古細菌および多くの細菌におけるＲＮＡ媒介ゲノム防御経路の存在に関して説得力のある証拠が最近出現しており、これらは真核生物ＲＮＡｉ経路と相似であると仮説が立てられている（再検討に関しては、Ｇｏｄｄｅ ａｎｄ Ｂｉｃｋｅｒｔｏｎ （２００６） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｅｖｏｌ． ６２：７１８－７２９； Ｌｉｌｌｅｓｔｏｌ ｅｔ ａｌ． （２００６） Ａｒｃｈａｅａ ２：５９－７２； Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ． （２００６） Ｂｉｏｌ． Ｄｉｒｅｃｔ １：７； Ｓｏｒｅｋ ｅｔ ａｌ． （２００８） Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６：１８１－１８６を参照されたい）。この経路はＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系または原核生物ＲＮＡｉ（ｐＲＮＡｉ）として公知であり、２つの進化的におよびしばしば物理的に連鎖した遺伝子座：系のＲＮＡ成分をコードするＣＲＩＳＰＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔ）遺伝子座、およびタンパク質をコードするｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）遺伝子座から生じることが提唱されている（Ｊａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ． （２００２） Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ４３：１５６５－１５７５； Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ． （２００２） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３０：４８２－４９６； Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ． （２００６） Ｂｉｏｌ． Ｄｉｒｅｃｔ １：７； Ｈａｆｔ ｅｔ ａｌ． （２００５） ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ． Ｂｉｏｌ． １：ｅ６０）。微生物宿主におけるＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子ならびにＣＲＩＳＰＲ媒介核酸切断の特異性をプログラミングすることが可能な非コードＲＮＡエレメントの組合せを含有する。個々のＣａｓタンパク質は、真核生物ＲＮＡｉ機構のタンパク質成分との有意な配列類似性を共有しないが、類似の予想される機能（例えば、ＲＮＡ結合、ヌクレアーゼ、ヘリカーゼ等）を有する（Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ． （２００６） Ｂｉｏｌ． Ｄｉｒｅｃｔ １：７）。ＣＲＩＳＰＲ関連（ｃａｓ）遺伝子はしばしば、ＣＲＩＳＰＲリピート－スペーサーアレイに関連している。４０を超える異なるＣａｓタンパク質ファミリーが記載されている。これらのタンパク質ファミリーの中で、Ｃａｓ１は、異なるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系において遍在するように思われる。ｃａｓ遺伝子およびリピート構造の特定の組合せが、８個のＣＲＩＳＰＲサブタイプを定義するために使用されており（Ｅｃｏｌｉ、Ｙｐｅｓｔ、Ｎｍｅｎｉ、Ｄｖｕｌｇ、Ｔｎｅａｐ、Ｈｍａｒｉ、Ａｐｅｒｎ、およびＭｔｕｂｅ）、そのうち一部は、リピート関連の不可思議なタンパク質（ＲＡＭＰ）をコードする追加の遺伝子モジュールに関連している。１つより多くのＣＲＩＳＰＲサブタイプが単一のゲノムに起こり得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓサブタイプが散在性に分布していることは、系が微生物進化の間に水平遺伝子伝播に供されることを示唆している。

【0093】

最初にＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓにおいて記載されたＩＩ型ＣＲＩＳＰＲは、最もよく特徴付けられた系の１つであり、４つの逐次ステップで標的化されたＤＮＡ二本鎖切断を実行する。第１に、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から、２つの非コードＲＮＡ、ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡアレイおよびｔｒａｃｒＲＮＡが転写される。第２に、ｔｒａｃｒＲＮＡをｐｒｅ－ｃｒＲＮＡの反復領域にハイブリダイズさせ、ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡの、個々のスペーサー配列を含有する成熟ｃｒＲＮＡへのプロセシングを媒介させ、プロセシングはＣａｓ９タンパク質の存在下で二本鎖特異的ＲＮａｓｅ ＩＩＩによって生じる。第３に、成熟ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体が、Ｃａｓ９を、ｃｒＲＮＡ上のスペーサーと標的ＤＮＡ上のプロトスペーサーとの間のワトソン－クリック塩基対形成を介して標的ＤＮＡに、次に、標的認識のための追加の必要条件であるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に向ける。加えて、ｔｒａｃｒＲＮＡもまた、その３’末端でｃｒＲＮＡと塩基対を形成することから存在しなければならず、この会合はＣａｓ９活性を誘発する。最後に、Ｃａｓ９は標的ＤＮＡの切断を媒介して、プロトスペーサー内に二本鎖切断を作り出す。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の活性は、３つのステップ：（ｉ）「適合」と呼ばれるプロセスにおける将来的な攻撃を防止するための外来のＤＮＡ配列のＣＲＩＳＰＲアレイへの挿入、（ｉｉ）関連タンパク質の発現、ならびにアレイの発現およびプロセシング、それに続く（ｉｉｉ）外来の核酸でのＲＮＡ媒介性干渉を含む。したがって、細菌細胞において、いわゆる「Ｃａｓ」タンパク質のいくつかは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の天然の機能に関連する。

【0094】

タイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲ系は、多くの異なる細菌において見出されている。Ｆｏｎｆａｒａ ｅｔ ａｌ． （（２０１３） Ｎｕｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ ４２（４）：２３７７－２５９０）による公開されたゲノムに関するＢＬＡＳＴ検索により、３４７種の細菌においてＣａｓ９オルトログが見出された。加えて、このグループは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ、Ｓ．ｔｈｅｒｏｐｈｉｌｕｓ、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、およびＦ．ｎｏｖｉｃｉｄａからのＣａｓ９オルトログを使用して、ＤＮＡ標的がｉｎ ｖｉｔｒｏでＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓによって切断されることを実証した。したがって、用語「Ｃａｓ９」は、ＤＮＡ結合ドメインおよび２つのヌクレアーゼドメインを含むＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼを指し、Ｃａｓ９をコードする遺伝子は任意の好適な細菌に由来し得る。

【0095】

Ｃａｓ９タンパク質は、少なくとも２つのヌクレアーゼドメインを有し：１つのヌクレアーゼドメインはＨＮＨエンドヌクレアーゼと類似であり、他方のヌクレアーゼドメインは、Ｒｕｖエンドヌクレアーゼドメインと類似である。ＨＮＨ型ドメインは、ｃｒＲＮＡと相補的であるＤＮＡ鎖の切断に関与するように思われるが、Ｒｕｖドメインは、非相補鎖を切断する。Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ヌクレアーゼドメインの１つのみが機能的であり、Ｃａｓニッカーゼを作り出すことができるように操作することができる（Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ． （２０１２） Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：８１６を参照されたい）。ニッカーゼは、酵素の触媒ドメインにおけるアミノ酸の特異的変異によって、またはドメインがもはや機能的でなくなるようにドメインの一部もしくは全ての切断によって生成することができる。Ｃａｓ９は、２つのヌクレアーゼドメインを含むことから、このアプローチはいずれかのドメインで起こり得る。２つのそのようなＣａｓ９ニッカーゼを使用することによって、二本鎖切断を標的ＤＮＡにおいて達成することができる。ニッカーゼは、それぞれがＤＮＡの１つの鎖を切断し、２つを使用すると二本鎖切断を作り出す。

【0096】

ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体の必要条件は、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡのアニーリングによって通常形成されるヘアピンを含む操作された「単一ガイドＲＮＡ」（ｓｇＲＮＡ）を使用することによって回避することができる（Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ． （２０１２） Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：８１６ ａｎｄ Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌ． （２０１３） Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９（６１２１）：８１９－８２３， Ｓｃｉｅｎｃｅｘｐｒｅｓｓ／１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２３１１４３を参照されたい）。Ｓ．ｐｙｒｏｇｅｎｅｓでは、操作されたｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ融合体またはｓｇＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二量体がＣａｓ会合ＲＮＡと標的ＤＮＡとの間で形成する場合に、Ｃａｓ９が標的ＤＮＡを切断するように誘導する。Ｃａｓ９タンパク質およびＰＡＭ配列を含有する操作されたｓｇＲＮＡを含むこの系は、ゲノム編集のために使用されており（Ｒａｍａｌｉｎｇａｍ （２０１３） Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ． １４（２）：１０７を参照されたい）、ｉｎ ｖｉｖｏでのゼブラフィッシュ胚のゲノム編集にとって有用であり（Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ． （２０１３） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３１（３）：２２７を参照されたい）、編集効率はＺＦＮおよびＴＡＬＥＮと類似である。

【0097】

ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の主生成物は、侵入物標的化配列を含有する短いＲＮＡであるように思われ、経路におけるその仮説上の役割に基づいてガイドＲＮＡまたは原核生物沈黙化ＲＮＡ（ｐｓｉＲＮＡ）と呼ばれる（Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ． （２００６） Ｂｉｏｌ． Ｄｉｒｅｃｔ １：７； Ｈａｌｅ ｅｔ ａｌ． （２００８） ＲＮＡ １４：２５７２－２５７９）。ＲＮＡ分析により、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の転写物がリピート配列内で切断されて、個々の侵入物標的化配列および隣接するリピート断片を含有する約６０ヌクレオチド～約７０ヌクレオチドのＲＮＡ中間体を放出することが示されている（Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ． （２００２） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９９：７５３６－７５４１； Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ． （２００５） Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ５５：４６９－４８１； Ｌｉｌｌｅｓｔｏｌ ｅｔ ａｌ． （２００６） Ａｒｃｈａｅａ ２：５９－７２； Ｂｒｏｕｎｓ ｅｔ ａｌ． （２００８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２１：９６０－９６４； Ｈａｌｅ ｅｔ ａｌ． （２００８） ＲＮＡ １４：２５７２－２５７９）。古細菌であるＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓでは、これらの中間ＲＮＡは、豊富で安定な約３５ヌクレオチド～４５ヌクレオチドの成熟ｐｓｉＲＮＡへとさらに処理される（Ｈａｌｅ ｅｔ ａｌ． （２００８） ＲＮＡ １４：２５７２－２５７９）。

【0098】

ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体の必要条件は、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡをアニールすることによって通常形成されるヘアピンを含む操作された「単一ガイドＲＮＡ」（ｓｇＲＮＡ）を使用することによって回避することができる（Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ． （２０１２） Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：８１６ ａｎｄ Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌ． （２０１３） Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９（６１２１）：８１９－８２３， Ｓｃｉｅｎｃｅｘｐｒｅｓｓ／１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２３１１４３を参照されたい）。Ｓ．ｐｙｒｏｇｅｎｅｓでは、操作されたｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ融合体またはｓｇＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二量体がＣａｓ会合ＲＮＡと標的ＤＮＡとの間で形成する場合に、Ｃａｓ９が標的ＤＮＡを切断するように誘導する。Ｃａｓ９タンパク質およびＰＡＭ配列を含有する操作されたｓｇＲＮＡを含むこの系は、ＲＮＡガイドゲノム編集のために使用されており（Ｒａｍａｌｉｎｇａｍ （２０１３） Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ． １４（２）：１０７を参照されたい）、ｉｎ ｖｉｖｏでのゼブラフィッシュ胚のゲノム編集にとって有用であり（Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ． （２０１３） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３１（３）：２２７を参照されたい）、編集効率はＺＦＮおよびＴＡＬＥＮと類似である。

【0099】

キメラまたはｓｇＲＮＡは、任意の所望の標的と相補的な配列を含むように操作することができる。一部の実施形態では、ガイド配列は、約５ヌクレオチドもしくはそれより長い、１０ヌクレオチドもしくはそれより長い、１１ヌクレオチドもしくはそれより長い、１２ヌクレオチドもしくはそれより長い、１３ヌクレオチドもしくはそれより長い、１４ヌクレオチドもしくはそれより長い、１５ヌクレオチドもしくはそれより長い、１６ヌクレオチドもしくはそれより長い、１７ヌクレオチドもしくはそれより長い、１８ヌクレオチドもしくはそれより長い、１９ヌクレオチドもしくはそれより長い、２０ヌクレオチドもしくはそれより長い、２１ヌクレオチドもしくはそれより長い、２２ヌクレオチドもしくはそれより長い、２３ヌクレオチドもしくはそれより長い、２４ヌクレオチドもしくはそれより長い、２５ヌクレオチドもしくはそれより長い、２６ヌクレオチドもしくはそれより長い、２７ヌクレオチドもしくはそれより長い、２８ヌクレオチドもしくはそれより長い、２９ヌクレオチドもしくはそれより長い、３０ヌクレオチドもしくはそれより長い、３５ヌクレオチドもしくはそれより長い、４０ヌクレオチドもしくはそれより長い、４５ヌクレオチドもしくはそれより長い、５０ヌクレオチドもしくはそれより長い、７５ヌクレオチドもしくはそれより長い、またはそれより長い長さである。一部の実施形態では、ガイド配列は、約７５ヌクレオチド未満、５０ヌクレオチド未満、４５ヌクレオチド未満、４０ヌクレオチド未満、３５ヌクレオチド未満、３０ヌクレオチド未満、２５ヌクレオチド未満、２０ヌクレオチド未満、１５ヌクレオチド未満、１２ヌクレオチド未満、またはそれより少ないヌクレオチドの長さである。一部の実施形態では、ＲＮＡは、標的と相補的でＧ［ｎ１９］型の２２塩基を含み、その後にＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系と共に使用するためのＮＧＧまたはＮＡＧ型のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）が続く。したがって、１つの方法では、ｓｇＲＮＡは：（ｉ）ＺＦＮヘテロ二量体の認識配列を関連するゲノムの参照配列（ヒト、マウス、または特定の植物種）と整列させることによって；（ｉｉ）ＺＦＮハーフ部位の間のスペーサー領域を同定することによって；（ｉｉｉ）スペーサー領域に最も近いモチーフＧ［Ｎ２０］ＧＧの位置を同定することによって（１つより多くのそのようなモチーフがスペーサーと重複する場合、スペーサーと比較して中心にあるモチーフを選択する）；（ｉｖ）そのモチーフをｓｇＲＮＡのコアとして使用することによって、目的の遺伝子における公知のＺＦＮ標的を利用することによって設計することができる。この方法は、都合よくは証明されたヌクレアーゼ標的に依存する。あるいは、ｓｇＲＮＡを、Ｇ［ｎ２０］ＧＧ式に従う好適な標的配列を単に同定することによって目的の任意の領域を標的とするように設計することができる。相補的領域と共に、ｓｇＲＮＡは、追加のヌクレオチドを含み、ｓｇＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ部分のテール領域へと伸張し得る（Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ． （２０１３） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２６４７を参照されたい）。テールは、＋６７～＋８５ヌクレオチドのテールであり得るか、または＋８５ヌクレオチドの好ましい長さを有するその間の任意の数字のテールであり得る。切断されたｓｇＲＮＡ、「ｔｒｕ－ｇＲＮＡ」もまた使用してもよい（Ｆｕ ｅｔ ａｌ． （２０１４） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ ３２（３）：２７９を参照されたい）。ｔｒｕ－ｇＲＮＡでは、相補性領域は１７または１８ヌクレオチドの長さへと減少する。

【0100】

さらに、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９を使用して、ＰＡＭ配列がＮＧＧの代替としてのＮＡＧであり得る代替のＰＡＭ配列もまた、利用してもよい（Ｈｓｕ （２０１３） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ ３１：８２７－８３２， ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２６４７）。追加のＰＡＭ配列はまた、最初のＧを欠如する配列も含み得る（Ｓａｎｄｅｒ ａｎｄ Ｊｏｕｎｇ （２０１４） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ ３２（４）：３４７）。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓコードＣａｓ９ ＰＡＭ配列に加えて、他の細菌起源からのＣａｓ９タンパク質に対して特異的な他のＰＡＭ配列を使用することができる。例えば、以下に示すＰＡＭ配列（Ｓａｎｄｅｒ ａｎｄ Ｊｏｕｎｇ、前記、およびＥｓｖｅｌｔ ｅｔ ａｌ． （２０１３） Ｎａｔ Ｍｅｔｈ １０（１１）：１１１６から改作）は、これらのＣａｓ９タンパク質に対して特異的である：
種 ＰＡＭ
Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ ＮＧＧ
Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ ＮＡＧ
Ｓ．ｍｕｔａｎｓ ＮＧＧ
Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｓ ＮＧＧＮＧ
Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｓ ＮＮＡＡＡＷ
Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｓ ＮＮＡＧＡＡ
Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｓ ＮＮＮＧＡＴＴ
Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＮＮＮＮＡＣＡ
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ ＮＮＮＮＧＡＴＴ
Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ ＧＮＮＮＣＮＮＡ
Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ ＮＧ

【0101】

したがって、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系と共に使用するために好適な標的配列は、以下のガイドライン：［ｎ１７、ｎ１８、ｎ１９、またはｎ２０］（Ｇ／Ａ）Ｇに従って選択することができる。あるいは、ＰＡＭ配列は、ガイドラインＧ［ｎ１７、ｎ１８、ｎ１９、ｎ２０（Ｇ／Ａ）Ｇに従うことができる。非Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ細菌に由来するＣａｓ９タンパク質の場合、代替ＰＡＭがＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ ＰＡＭ配列の代わりに置換されている同じガイドラインを使用してもよい。

【0102】

潜在的オフターゲット配列を回避する特異性の最高の可能性を有する標的配列を選択することが最も好ましい。これらの望ましくないオフターゲット配列は、以下の属性：ｉ）利用されるＣａｓ９タンパク質と共に機能することが公知のＰＡＭ配列が後に続く標的配列における類似性；ｉｉ）所望の標的配列とのミスマッチが３個未満である類似の標的配列；ｉｉｉ）ミスマッチが全てＰＡＭ近位領域ではなくてＰＡＭ遠位領域に位置する、ｉｉ）と類似の標的配列（時に「シード」領域と称されるＰＡＭに直ちに隣接するかまたは近位のヌクレオチド１～５（Ｗｕ ｅｔ ａｌ． （２０１４） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ ３２：６７０－６７６， ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ２８８９）は、認識にとって最も重要であるという証拠があり、そのため、シード領域内に位置するミスマッチを有する推定のオフターゲット部位は、ｓｇＲＮＡによって認識される可能性が最も低くなり得る）；およびｉｖ）その結果ミスマッチが間隔を開けずにまたは４ヌクレオチドより大きい間隔を開けて存在する類似の標的配列（Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ． （２０１４） Ｃｅｌｌ １５７（６）：１２６２－７８）を考慮することによって同定することができる。したがって、上記のこれらの基準を使用して、どのＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓ系が使用されているかに関してゲノムにおける潜在的なオフターゲット部位の数の分析を実施することによって、ｓｇＲＮＡの好適な標的配列が同定され得る。

【0103】

一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１系が使用される。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１系は、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｓｐｐで同定されており、ヒト細胞においてロバストなＤＮＡ干渉を媒介するクラス２ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である。機能的に保存されているにもかかわらず、Ｃｐｆ１およびＣａｓ９は、それらのガイドＲＮＡおよび基質特異性を含む多くの態様において異なる（Ｆａｇｅｒｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ， （２０１５） Ｇｅｎｏｍ Ｂｉｏ １６：２５１を参照）。Ｃａｓ９とＣｐｆ１タンパク質との主要な差は、Ｃｐｆ１はｔｒａｃｒＲＮＡを利用しないことであり、したがってｃｒＲＮＡのみを必要とする。ＦｎＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡは、４２～４４ヌクレオチドの長さ（１９ヌクレオチドの反復および２３～２５ヌクレオチドのスペーサー）であり、単一のステムループを含有し、これが２次構造を保持する配列の変化を許容する。加えて、Ｃｐｆ１ ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ９が必要とする約１００ヌクレオチドの操作されたｓｇＲＮＡよりも著しく短く、ＦｎＣｐｆｌのＰＡＭの必要条件は、置き換えられた鎖における５’－ＴＴＮ－３’および５’－ＣＴＡ－３’である。Ｃａｓ９およびＣｐｆ１の両方が標的ＤＮＡ中に二本鎖切断を生じるが、Ｃａｓ９は、ガイドＲＮＡのシード配列内に平滑末端化された切断を生じるのに、そのＲｕｖＣおよびＨＮＨ様ドメインを使用し、それに対してＣｐｆ１は、シードの外側に付着切断を生じるのに、ＲｕｖＣ様ドメインを使用する。Ｃｐｆ１は、重要なシード領域から離れて付着切断を生じるため、ＮＨＥＪは、標的部位を破壊せず、それゆえに、Ｃｐｆ１は、所望のＨＤＲ組換え事象が起こるまで同じ部位を確実に切り続けることができる。したがって、本明細書に記載される方法および組成物では、用語「Ｃａｓ」は、Ｃａｓ９およびＣｆｐ１タンパク質の両方を含むことが理解される。したがって、本明細書で使用される場合、「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系」は、ヌクレアーゼおよび／または転写因子系の両方を含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓおよび／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｆｐ１系の両方を指す。

【0104】

一部の実施形態では、他のＣａｓタンパク質を使用してもよい。一部の例示的なＣａｓタンパク質としては、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａとしても公知）、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２（Ｃａｓ１３ａとしても公知）、Ｃ２ｃ３、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、Ｃａｓ４、ＣａｓＸ、およびＣａｓＹ；ならびにその操作されたおよび天然のバリアント（Ｂｕｒｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ． （２０１７） Ｎａｔｕｒｅ ５４２：２３７－２４１）、例えばＨＦ１／ｓｐＣａｓ９（Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ． （２０１６） Ｎａｔｕｒｅ ５２９：４９０－４９５； Ｃｅｂｒｉａｎ－Ｓｅｒｒａｎｏ ａｎｄ Ｄａｖｉｅｓ （２０１７） Ｍａｍｍ Ｇｅｎｏｍｅ ２８（７）：２４７－２６１）；スプリットＣａｓ９系（Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ． （２０１５） Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３３（２）：１３９－１４２）、インテイン－エクステイン系に基づくトランススプライシングされたＣａｓ９（Ｔｒｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ． （２０１５） Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ ４３（１３）：６４５０－８）；小型ＳａＣａｓ９（Ｍａ ｅｔ ａｌ． （２０１８） ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈ Ｂｉｏｌ ７（４）：９７８－９８５）が挙げられる。したがって、本明細書に記載される方法および組成物において、用語「Ｃａｓ」は、天然のおよび操作された全てのＣａｓバリアントタンパク質を含むと理解される。

【0105】

ある特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、天然に存在するＣａｓタンパク質の「機能的な誘導体」であってもよい。ネイティブ配列のポリペプチドの「機能的な誘導体」は、ネイティブ配列のポリペプチドと共通の定性的な生物学的特性を有する化合物である。「機能的な誘導体」としては、これらに限定されないが、対応するネイティブ配列のポリペプチドと共通の生物学的活性をそれらが有するという条件で、ネイティブ配列の断片、ならびにネイティブ配列のポリペプチドの誘導体およびその断片が挙げられる。本明細書において企図される生物学的活性は、ＤＮＡ基質を断片に加水分解する機能的な誘導体の能力である。用語「誘導体」は、ポリペプチドのアミノ酸配列バリアント、共有結合による改変体の両方、およびそれらの融合体を包含する。一部の態様では、機能的誘導体は、天然に存在するＣａｓタンパク質の単一の生物特性を含み得る。他の態様では、機能的誘導体は、天然に存在するＣａｓタンパク質の生物特性のサブセットを含み得る。Ｃａｓポリペプチドまたはその断片の好適な誘導体としては、これらに限定されないが、Ｃａｓタンパク質またはその断片の、変異体、融合体、共有結合による改変体が挙げられる。Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓタンパク質またはその断片、ならびにＣａｓタンパク質またはその断片の誘導体を含み、これらは、細胞から得ることができる、または化学的に合成される、またはこれらの２つの手順の組合せによってであり得る。細胞は、天然にＣａｓタンパク質を産生する細胞、または天然にＣａｓタンパク質を産生し、内因性Ｃａｓタンパク質をより高い発現レベルで産生するように、もしくは内因性Ｃａｓと同じもしくは異なるＣａｓをコードする外因的に導入された核酸からＣａｓタンパク質を産生するように遺伝子操作された細胞であってもよい。一部の場合では、細胞は、天然にＣａｓタンパク質を産生せず、Ｃａｓタンパク質を産生するように遺伝子操作されている。

【0106】

特定の遺伝子に標的化される例示的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系は、例えば米国特許出願公開第２０１５／００５６７０５号に開示される。

【0107】

したがって、ヌクレアーゼは、ＤＮＡを切断するヌクレアーゼドメインと組み合わせてドナー（導入遺伝子）を挿入することが望ましい任意の遺伝子における標的部位に特異的に結合するＤＮＡ結合ドメインを含む。
融合分子

【0108】

ＤＮＡ結合ドメインを、本明細書に記載される方法に使用するために任意の追加の分子（例えば、ポリペプチド）に融合してもよい。ある特定の実施形態では、方法は、少なくとも１つのＤＮＡ結合分子（例えば、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、または単一ガイドＲＮＡ）および異種の通常の（機能的）ドメイン（またはその機能的断片）を含む融合分子を使用する。

【0109】

ある特定の実施形態では、機能的ドメインは、転写調節ドメインを含む。一般的なドメインは、例えば転写因子ドメイン（アクチベーター、リプレッサー、コアクチベーター、コリプレッサー）、サイレンサー、腫瘍遺伝子（例えば、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍｙｂ、ｍａｘ、ｍａｄ、ｒｅｌ、ｅｔｓ、ｂｃｌ、ｍｙｂ、ｍｏｓファミリーメンバー等）；ＤＮＡ修復酵素およびその関連因子および改変剤；ＤＮＡ再構成酵素およびその関連する因子および改変剤；クロマチン関連タンパク質およびその改変剤（例えば、キナーゼ、アセチラーゼ、およびデアセチラーゼ）；ならびにＤＮＡ改変酵素（例えば、メチルトランスフェラーゼ、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼ、リガーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ）およびその関連する因子および改変剤を含む。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１３／０２５３０４０号を参照されたい。

【0110】

活性化を達成するために適したドメインとしては、ＨＳＶ ＶＰ１６活性化ドメイン（例えば、Ｈａｇｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７１：５９５２－５９６２を参照されたい）核内ホルモン受容体（例えば、Ｔｏｒｃｈｉａ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １０：３７３－３８３を参照されたい）；核内因子カッパＢのｐ６５サブユニット（Ｂｉｔｋｏ ＆ Ｂａｒｉｋ （１９９８） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：５６１０－５６１８ ａｎｄ Ｄｏｙｌｅ ＆ Ｈｕｎｔ （１９９７） Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ ８：２９３７－２９４２； Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ５：３－２８）、または人工キメラ機能的ドメイン、例えばＶＰ６４（Ｂｅｅｒｌｉ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５：１４６２３－３３）、およびデグロン（Ｍｏｌｉｎａｒｉ ｅｔ ａｌ． （１９９９） ＥＭＢＯ Ｊ． １８：６４３９－６４４７）が挙げられる。追加の例示的な活性化ドメインとしては、Ｏｃｔ１、Ｏｃｔ－２Ａ、Ｓｐ１、ＡＰ－２、およびＣＴＦ１（Ｓｅｉｐｅｌ ｅｔ ａｌ． （１９９２） ＥＭＢＯ Ｊ． １１：４９６１－４９６８）、ならびにｐ３００、ＣＢＰ、ＰＣＡＦ、ＳＲＣ１ ＰｖＡＬＦ、ＡｔＨＤ２Ａ、およびＥＲＦ－２が挙げられる。例えば、Ｒｏｂｙｒ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｍｏｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． １４：３２９－３４７； Ｃｏｌｌｉｎｇｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． ２３：２５５－２７５； Ｌｅｏ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｇｅｎｅ ２４５：１－１１； Ｍａｎｔｅｕｆｆｅｌ－Ｃｙｍｂｏｒｏｗｓｋａ （１９９９） Ａｃｔａ Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｐｏｌ． ４６：７７－８９； ＭｃＫｅｎｎａ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｊ． Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ６９：３－１２； Ｍａｌｉｋ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ． ２５：２７７－２８３； ａｎｄ Ｌｅｍｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｇｅｎｅｔ． Ｄｅｖ． ９：４９９－５０４を参照されたい。追加の例示的な活性化ドメインとしては、これらに限定されないが、ＯｓＧＡＩ、ＨＡＬＦ－１、Ｃ１、ＡＰ１、ＡＲＦ－５、－６、－７、および－８、ＣＰＲＦ１、ＣＰＲＦ４、ＭＹＣ－ＲＰ／ＧＰ、およびＴＲＡＢ１が挙げられる。例えば、Ｏｇａｗａ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｇｅｎｅ ２４５：２１－２９； Ｏｋａｎａｍｉ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ １：８７－９９； Ｇｏｆｆ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． ５：２９８－３０９； Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４０：４１９－４２９； Ｕｌｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６：５８４４－５８４９； Ｓｐｒｅｎｇｅｒ－Ｈａｕｓｓｅｌｓ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｐｌａｎｔ Ｊ． ２２：１－８； Ｇｏｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４１：３３－４４； ａｎｄ Ｈｏｂｏ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６：１５，３４８－１５，３５３を参照されたい。

【0111】

例示的な抑制性ドメインとしては、これらに限定されないが、ＫＲＡＢ Ａ／Ｂ、ＫＯＸ、ＴＧＦ－ベータ誘導可能初期遺伝子（ＴＩＥＧ）、ｖ－ｅｒｂＡ、ＳＩＤ、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３、ＤＮＭＴファミリーメンバー（例えば、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ）、Ｒｂ、およびＭｅＣＰ２が挙げられる。例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｃｅｌｌ ９９：４５１－４５４； Ｔｙｌｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｃｅｌｌ ９９：４４３－４４６； Ｋｎｏｅｐｆｌｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｃｅｌｌ ９９：４４７－４５０； ａｎｄ Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． ２５：３３８－３４２を参照されたい。追加の例示的な抑制性ドメインとしては、これらに限定されないが、ＲＯＭ２およびＡｔＨＤ２Ａが挙げられる。例えば、Ｃｈｅｍ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ８：３０５－３２１； ａｎｄ Ｗｕ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｐｌａｎｔ Ｊ． ２２：１９－２７を参照されたい。

【0112】

融合分子は、当業者に周知のクローニングおよび生化学コンジュゲーションの方法によって構築される。融合分子は、ＤＮＡ結合ドメインおよび機能的ドメイン（例えば、転写活性化または抑制ドメイン）を含む。融合分子はまた、必要に応じて、核局在化シグナル（例えば、ＳＶ４０中等度Ｔ抗原を形成するもの）およびエピトープタグ（例えば、ＦＬＡＧおよびヘマグルチニン）を含む。融合タンパク質（およびそれらをコードする核酸）は、翻訳読み取り枠が融合体の成分の間で保存されるように設計される。

【0113】

一方で機能的ドメイン（またはその機能的断片）のポリペプチド成分と他方での非タンパク質ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、抗生物質、インターカレート剤、副溝結合剤、核酸）との間の融合は、当業者に公知の生化学的なコンジュゲーションの方法によって構築される。例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）のカタログを参照されたい。副溝結合剤とポリペプチドとの間の融合体を作製する方法および組成物が記載されている。Ｍａｐｐ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９７：３９３０－３９３５。

【0114】

融合分子は、当業者に公知であるように薬学的に許容される担体と共に製剤化され得る。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １７ｔｈ ｅｄ．， １９８５；および共同所有の国際特許出願ＷＯ００／４２２１９号を参照されたい。

【0115】

融合分子の機能的成分／ドメインは、融合分子がそのＤＮＡ結合ドメインを介して標的配列に結合すると、遺伝子の転写に影響を及ぼすことが可能な様々な異なる成分のいずれかから選択することができる。したがって、機能的成分は、これらに限定されないが、様々な転写因子ドメイン、例えばアクチベーター、リプレッサー、コアクチベーター、コリプレッサー、およびサイレンサーを含み得る。

【0116】

ある特定の実施形態では、融合分子は、ＺＦＰが転写リプレッサードメインに作動可能に連結された１つまたは複数のＺＦＰ－ＴＦ（リプレッサー）を含む。抑制性ドメインの非制限的な例としては、ＫＯＸ（ＫＲＡＢ）ドメイン等が挙げられる。追加の要素、例えばＮＬＳを含んでもよく、ジンクフィンガードメイン間および／またはＺＦＰと抑制性ドメイン（および／または任意の追加のエレメント）との間で任意のリンカーを使用してもよい。これらのＺＦＰ－ＴＦリプレッサーをコードするポリヌクレオチドはまた、さらに追加のエレメント、例えばＺＦＰ－ＴＦの発現を駆動するプロモーター、エンハンサー、インスレーター等を含み得る。

【0117】

表３は、本明細書に記載されるＺＦＰを含む例示的なＺＦＰ－ＴＦ（最初の列の名称によって同定される）のポリヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。認識ヘリックス領域配列（表１）を表３において下線で示し、ＮＬＳペプチドを太字で示し、抑制性ドメインをイタリック体で示す。

【表3-1】

【表3-2】

【表3-3】

【表3-4】

【0118】

本明細書に記載されるリプレッサーをコードするポリヌクレオチドは、これらに限定されないが、ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ、Ａｄ等）、および非ウイルスベクター（例えば、ｍＲＮＡ、プラスミド、ミニサークル等）を含む任意の好適な発現ベクターを使用して送達され得る。発現ベクターは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）および／またはリプレッサーの発現を駆動するためのプロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーターなどの構成的プロモーター）などの追加のエレメントを含み得る。同じまたは異なる形態（例えば、ウイルスおよび／または非ウイルスベクター）の１つまたは複数のポリヌクレオチド（例えば、発現ベクター）を対象に送達し、１つまたは複数の医薬組成物に製剤化してもよい。本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、エピソームによって（染色体外で）維持されてもよく、および／または送達後細胞に安定に組み込まれてもよい。

【0119】

ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼドメインを含み、その操作された（ＺＦＰまたはＴＡＬＥ）ＤＮＡ結合ドメインを通してその意図される核酸標的を認識することができる機能的実体を作り出し、ヌクレアーゼ活性を介してＤＮＡ結合部位の近傍でＤＮＡを切断させるヌクレアーゼ（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはＴＡＬＥヌクレアーゼ）を作り出すことができる。

【0120】

したがって、本明細書に記載される方法および組成物は、広範囲に適用可能であり、目的の任意のヌクレアーゼを含み得る。ヌクレアーゼの非限定的な例としては、メガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮおよびジンクフィンガーヌクレアーゼが挙げられる。ヌクレアーゼは、異種ＤＮＡ結合および切断ドメイン（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ；ＴＡＬＥＮ；異種切断ドメインを有するメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメイン）を含んでいてもよく、あるいは、天然に存在するヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、選択された標的部位（例えば、コグネート結合部位と異なる部位に結合するように操作されたメガヌクレアーゼ）に結合するように変更されてもよい。

【0121】

ヌクレアーゼドメインは、任意のヌクレアーゼ、例えば任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼに由来し得る。本明細書に記載されるＨＴＴ ＤＮＡ結合ドメインに融合され得る好適なヌクレアーゼ（切断）ドメインの非制限的な例としては、任意の制限酵素、例えばＩＩＳ型制限酵素（例えば、ＦｏｋＩ）からのドメインが挙げられる。ある特定の実施形態では、切断ドメインは、切断活性のために二量体化を必要とする切断ハーフドメインである。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，５８６，５２６号；同第８，４０９，８６１号；および同第７，８８８，１２１号を参照されたい。一般的に、融合タンパク質が切断ハーフドメインを含む場合、２つの融合タンパク質が切断に必要である。あるいは、２つの切断ハーフドメインを含む単一のタンパク質を使用してもよい。２つの切断ハーフドメインは、同じエンドヌクレアーゼ（またはその機能的な断片）由来であってもよく、各切断ハーフドメインは、異なるエンドヌクレアーゼ（またはその機能的な断片）由来であってもよい。加えて、２つの融合タンパク質のための標的部位は、好ましくは、２つの融合タンパク質のそれらそれぞれの標的部位への結合によって、切断ハーフドメインが例えば二量体化により機能的な切断ドメインを形成することが可能な空間的な配向で互いに切断ハーフドメインが配列されるように互いに配置される。

【0122】

ヌクレアーゼドメインはまた、切断活性を有する任意のメガヌクレアーゼ（ホーミングエンドヌクレアーゼ）ドメインに由来してもよく、同様に、これらに限定されないが、Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＣｅｕＩ、ＰＩ－ＰｓｐＩ、ＰＩ－Ｓｃｅ、Ｉ－ＳｃｅＩＶ、Ｉ－ＣｓｍＩ、Ｉ－ＰａｎＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩ、Ｉ－ＰｐｏＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＴｅｖＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩ、およびＩ－ＴｅｖＩＩＩを含む、本明細書に記載されるヌクレアーゼと共に使用され得る。

【0123】

ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、ｃｏｍｐａｃｔ ＴＡＬＥＮ（ｃＴＡＬＥＮ）を含む。これらは、ＴｅｖＩヌクレアーゼドメインにＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインを連結させる一本鎖融合タンパク質である。融合タンパク質は、ＴＡＬＥ領域によって局在化されるニッカーゼとして作用し得るか、またはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインがメガヌクレアーゼ（例えば、ＴｅｖＩ）ヌクレアーゼドメインに関してどこに位置するかに応じて二本鎖切断を作り出すことができる（Ｂｅｕｒｄｅｌｅｙ ｅｔ ａｌ． （２０１３） Ｎａｔ Ｃｏｍｍ ４：１７６２， ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ２７８２を参照されたい）。他の実施形態では、ＴＡＬＥヌクレアーゼはメガＴＡＬである。これらのメガＴＡＬヌクレアーゼは、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインおよびメガヌクレアーゼ切断ドメインを含む融合タンパク質である。メガヌクレアーゼ切断ドメインは、単量体として活性であり、活性のために二量体化を必要としない（Ｂｏｉｓｓｅｌ ｅｔ ａｌ． （２０１３） Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ ４２（４）：２５９１－６０１， ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｔ１２２４を参照されたい）。

【0124】

加えて、メガヌクレアーゼのヌクレアーゼドメインはまた、ＤＮＡ結合機能性も示し得る。任意のＴＡＬＥＮを、追加のＴＡＬＥＮ（例えば、１つまたは複数のＴＡＬＥＮ（ｃＴＡＬＥＮまたはＦｏｋＩ－ＴＡＬＥＮ）を１つまたは複数のメガ－ＴＡＬと共に）および／またはＺＦＮと組み合わせて使用してもよい。

【0125】

加えて、切断ドメインは、例えばオフターゲット切断効果を低減させるまたは除去する絶対ヘテロ二量体の形成のために、野生型と比較して１つまたは複数の変更を含み得る。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，９１４，７９６号；同第８，０３４，５９８号；および同第８，６２３，６１８号を参照されたい。

【0126】

本明細書に記載されるヌクレアーゼは、二本鎖標的（例えば、遺伝子）において二本鎖または一本鎖切断を生成し得る。一本鎖切断（「ニック」）の生成は、例えば参照により本明細書に組み込まれ、ヌクレアーゼドメインの１つの触媒ドメインの変異がどのようにニッカーゼをもたらすかを記載する、米国特許第８，７０３，４８９号に記載されている。

【0127】

したがって、ヌクレアーゼ（切断）ドメインまたは切断ハーフドメインは、切断活性を保持する、または多量体化して（例えば、二量体化して）機能的な切断ドメインを形成する能力を保持するタンパク質の任意の部分であってもよい。

【0128】

あるいは、ヌクレアーゼは、いわゆる「スプリット酵素」技術を使用して、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて核酸標的部位で組み立てられてもよい（例えば米国特許公開第２００９／００６８１６４号を参照）。このようなスプリット酵素の成分は、別々の発現構築物で発現させてもよく、または例えば自己切断２ＡペプチドまたはＩＲＥＳ配列によって個々の成分が離れている１つのオープンリーディングフレーム中で連結させることができる。成分は、個々のジンクフィンガー結合ドメインまたはメガヌクレアーゼ核酸結合ドメインのドメインであり得る。

【0129】

ヌクレアーゼは、例えば米国特許公開第２００９／０１１１１１９号に記載されたような酵母ベースの染色体系で、使用前に、活性に関してスクリーニングすることができる。ヌクレアーゼ発現構築物は、当業界において公知の方法を使用して容易に設計することができる。

【0130】

融合タンパク質の発現は、構成的プロモーターまたは誘導型プロモーター、例えばラフィノースおよび／またはガラクトースの存在下で活性化され（脱抑制され）、グルコースの存在下で抑制されるガラクトキナーゼプロモーターの制御下にあり得る。ある特定の実施形態では、プロモーターは、融合タンパク質の発現を、例えば高親和性結合部位を含むことを介して自己調節する。例えば米国特許第９，６２４，４９８号を参照されたい。
送達

【0131】

タンパク質および／またはポリヌクレオチド（例えば、ＨＴＴリプレッサー）ならびに本明細書に記載されるタンパク質および／またはポリヌクレオチドを含む組成物は、例えばタンパク質の注射によって、ｍＲＮＡを介して、および／または発現構築物（例えば、プラスミド、レンチウイルスベクター、ＡＡＶベクター、Ａｄベクター等）を使用することを含む任意の好適な手段によって標的細胞に送達され得る。好ましい実施形態では、リプレッサーは、ＡＡＶ９またはＡＡＶ６を使用して送達される。

【0132】

本明細書に記載されるジンクフィンガータンパク質を含むタンパク質を送達する方法は、例えば、米国特許第６，４５３，２４２号；同第６，５０３，７１７号；同第６，５３４，２６１号；同第６，５９９，６９２号；同第６，６０７，８８２号；同第６，６８９，５５８号；同第６，８２４，９７８号；同第６，９３３，１１３号；同第６，９７９，５３９号；同第７，０１３，２１９号；および同第７，１６３，８２４号に記載されており、これらの全ての開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0133】

これらに限定されないが、プラスミドベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター；ヘルペスウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターなどを含む任意のベクター系を使用することができる。参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる米国特許第８，５８６，５２６号；同第６，５３４，２６１号；同第６，６０７，８８２号；同第６，８２４，９７８号；同第６，９３３，１１３号；同第６，９７９，５３９号；同第７，０１３，２１９号；および同第７，１６３，８２４号も参照されたい。さらに、これらのベクターのいずれも、１つまたは複数のＤＮＡ結合タンパク質をコードする配列を含んでいてもよいことが明らかである。したがって、１つまたは複数のＨＴＴリプレッサーが細胞に導入されるとき、タンパク質成分をコードする配列および／またはポリヌクレオチド成分は、同じベクターに、または異なるベクターに担持されてもよい。複数のベクターが使用される場合、各ベクターが、１つのまたは複数ＨＴＴリプレッサーまたはその成分をコードする配列を含んでいてもよい。

【0134】

従来のウイルスおよび非ウイルスベースの遺伝子移入方法を使用して、細胞（例えば、哺乳動物細胞）および標的組織中に操作されたＨＴＴリプレッサーをコードする核酸を導入することができる。このような方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでそのようなリプレッサー（またはその成分）をコードする核酸を細胞に投与することにも使用できる。ある特定の実施形態では、リプレッサーをコードする核酸は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの遺伝子療法での使用のために投与される。非ウイルスベクター送達系としては、ＤＮＡプラスミド、裸の核酸、およびリポソームまたはポロキサマーなどの送達ビヒクルと複合体化した核酸が挙げられる。ウイルスベクター送達系としては、細胞への送達の後にエピソームのまたは組み込まれたゲノムのいずれかを有するＤＮＡおよびＲＮＡウイルスが挙げられる。遺伝子療法手順の総説については、Ａｎｄｅｒｓｏｎ， （１９９２） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：８０８－８１３；Ｎａｂｅｌ ＆ Ｆｅｌｇｎｅｒ， （１９９３） ＴＩＢＴＥＣＨ １１：２１１－２１７；Ｍｉｔａｎｉ ＆ Ｃａｓｋｅｙ， （１９９３） ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６２－１６６；Ｄｉｌｌｏｎ， （１９９３） ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６７－１７５；Ｍｉｌｌｅｒ，０ （１９９２） Ｎａｔｕｒｅ ３５７：４５５－４６；Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ， （１９８８） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６（１０）：１１４９－１１５４；Ｖｉｇｎｅ， （１９９５） Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ８：３５－３６；Ｋｒｅｍｅｒ ＆ Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ， （１９９５） Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ５１（１）：３１－４４；Ｈａｄｄａｄａ ｅｔ ａｌ．， ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｄｏｅｒｆｌｅｒ ａｎｄ Ｂｏｅｈｍ （ｅｄｓ．） （１９９５）；およびＹｕ ｅｔ ａｌ．， （１９９４） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：１３－２６を参照されたい。

【0135】

核酸の非ウイルス送達の方法としては、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、微粒子銃、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸コンジュゲート、裸のＤＮＡ、裸のＲＮＡ、人工ビリオン、およびＤＮＡの作用物質増強取り込み（ａｇｅｎｔ－ｅｎｈａｎｃｅｄ ｕｐｔａｋｅ）が挙げられる。例えば、Ｓｏｎｉｔｒｏｎ ２０００システム（Ｒｉｃｈ－Ｍａｒ）を使用するソノポレーションも核酸の送達に使用することができる。好ましい実施形態では、１つまたは複数の核酸は、ｍＲＮＡとして送達される。翻訳効率および／またはｍＲＮＡ安定性を増加させるためのキャップされたｍＲＮＡの使用も好ましい。特に好ましくは、ＡＲＣＡ（ａｎｔｉ－ｒｅｖｅｒｓｅ ｃａｐ ａｎａｌｏｇ；アンチリバースキャップアナログ）キャップまたはそれらのバリアントである。参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，０７４，５９６号および同第８，１５３，７７３号を参照されたい。

【0136】

追加の例示的な核酸送達系としては、Ａｍａｘａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃｏｌｏｇｎｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）、ＢＴＸ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ）およびＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃによって提供されるものが挙げられる（例えばＵＳ特許６，００８，３３６を参照）。リポフェクションは、例えば、ＵＳ特許５，０４９，３８６、４，９４６，７８７；および４，８９７，３５５に記載されており、リポフェクション試薬は、商業的に販売されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）、およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）、およびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸ）。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに好適なカチオン性および中性脂肪としては、Ｆｅｌｇｎｅｒ、国際特許公開ＷＯ９１／１７４２４、およびＷＯ９１／１６０２４のものが挙げられる。送達は、細胞（ｅｘ ｖｉｖｏ投与）または標的組織（ｉｎ ｖｉｖｏ投与）への送達であってもよい。

【0137】

標的化されたリポソームを含む脂質：核酸複合体、例えばイムノリピド（ｉｍｍｕｎｏｌｉｐｉｄ）複合体の調製は当業者に周知である（例えば、Ｃｒｙｓｔａｌ， （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４０４－４１０；Ｂｌａｅｓｅ ｅｔ ａｌ．， （１９９５） Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ２：２９１－２９７；Ｂｅｈｒ ｅｔ ａｌ．， （１９９４） Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ５：３８２－３８９；Ｒｅｍｙ ｅｔ ａｌ．， （１９９４） Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ５：６４７－６５４；Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．， （１９９５） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７１０－７２２；Ａｈｍａｄ ｅｔ ａｌ．， （１９９２） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５２：４８１７－４８２０；米国特許第４，１８６，１８３号、同第４，２１７，３４４号、同第４，２３５，８７１号、同第４，２６１，９７５号、同第４，４８５，０５４号、同第４，５０１，７２８号、同第４，７７４，０８５号、同第４，８３７，０２８号、および同第４，９４６，７８７号を参照）。

【0138】

追加の送達方法としては、送達しようとする核酸のＥｎＧｅｎｅＩＣ送達ビヒクル（ＥＤＶ）へのパッケージングの使用が挙げられる。これらのＥＤＶは、二重特異性抗体を使用して標的組織に特異的に送達され、抗体の一方のアームは、標的組織に対する特異性を有し、他方のアームは、ＥＤＶに対する特異性を有する。抗体は、ＥＤＶを標的細胞表面に運び、次いでＥＤＶがエンドサイトーシスによって細胞に持ち込まれる。細胞中に入ると、内容物が放出される（ＭａｃＤｉａｒｍｉｄ ｅｔ ａｌ （２００９） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２７（７） ６４３を参照）。

【0139】

操作されたＺＦＰ、ＴＡＬＥまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をコードする核酸の送達のためのＲＮＡまたはＤＮＡウイルスベースの系の使用は、ウイルスを体内の特定の細胞に標的化する、およびウイルスペイロードを核にトラフィッキングするための高度に進化したプロセスを利用する。ウイルスベクターは、患者に直接投与してもよく（ｉｎ ｖｉｖｏ）、ウイルスベクターを使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞を処置してもよく、改変された細胞が患者に投与される（ｅｘ ｖｉｖｏ）。ＺＦＰ、ＴＡＬＥまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の送達のための従来のウイルスベースの系としては、これらに限定されないが、遺伝子移入のための、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴、ワクシニアおよび単純疱疹ウイルスベクターが挙げられる。宿主ゲノム中での組み込みは、レトロウイルス、レンチウイルス、およびアデノ随伴ウイルス遺伝子移入方法を用いて可能であり、これは、挿入された導入遺伝子の長期にわたる発現をもたらすことが多い。加えて、高い形質導入効率が多くの様々な細胞型および標的組織で観察された。

【0140】

レトロウイルスの向性は、外来性エンベロープタンパク質を取り入れ、標的細胞の潜在的な標的集団を拡張することによって変更することができる。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞に形質導入するかまたは感染することができるレトロウイルスベクターであり、典型的には、高いウイルス力価を生じる。レトロウイルス遺伝子移入系の選択は、標的組織に依存する。レトロウイルスベクターは、最大６～１０ｋｂの外来性配列のためのパッケージング能力を有するシス作用性長末端反復で構成される。最小限のシス作用性ＬＴＲが、ベクターの複製およびパッケージングに十分であり、これは次いで、治療用遺伝子を標的細胞に組み込んで永続的な導入遺伝子発現を提供するのに使用される。広く使用されるレトロウイルスベクターとしては、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に基づくもの、およびそれらの組合せが挙げられる（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， （１９９２） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６６：２７３１－２７３９；Ｊｏｈａｎｎ ｅｔ ａｌ．， （１９９２） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６６：１６３５－１６４０；Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔ ｅｔ ａｌ．， （１９９０） Ｖｉｒｏｌ． １７６：５８－５９；Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， （１９８９） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６３：２３７４－２３７８；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， （１９９１） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６５：２２２０－２２２４；国際特許公開ＷＯ９４／２６８７７を参照）。

【0141】

一過性発現が好ましい適用において、アデノウイルスベースの系を使用することができる。アデノウイルスベースベクターは、多くの細胞型で非常に高い形質導入効率を可能にし、細胞分裂を必要としない。このようなベクターを用いて、高い力価および高いレベルの発現が得られている。このベクターは、比較的単純な系で大量に産生することができる。アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターは、例えば、核酸およびペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏの産生において、ならびにｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏでの遺伝子療法手順のために細胞を標的核酸で形質導入することにも使用される（例えば、Ｗｅｓｔ ｅｔ ａｌ．， （１９８７） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６０：３８－４７；米国特許第４，７９７，３６８号；国際特許公開ＷＯ９３／２４６４１；Ｋｏｔｉｎ， （１９９４） Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３－８０１；Ｍｕｚｙｃｚｋａ， （１９９４） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９４：１３５１を参照。組換えＡＡＶベクターの構築は、米国特許第５，１７３，４１４号；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．， （１９８５） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ５：３２５１－３２６０；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ， ｅｔ ａｌ．， （１９８４） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ４：２０７２－２０８１；Ｈｅｒｍｏｎａｔ ＆ Ｍｕｚｙｃｚｋａ， （１９８４） ＰＮＡＳ ８１：６４６６－６４７０；およびＳａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， （１９８９） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６３：０３８２２－３８２８を含むいくつかの出版物に記載されている。

【0142】

臨床試験における遺伝子移入のために、少なくとも６つのウイルスベクターアプローチが現在利用可能であり、これらは、ヘルパー細胞系に挿入された遺伝子によって不完全なベクターを補完し、形質導入剤を生成することを含むアプローチを利用する。

【0143】

ｐＬＡＳＮおよびＭＦＧ－Ｓは、臨床試験で使用されてきたレトロウイルスベクターの例である（Ｄｕｎｂａｒ ｅｔ ａｌ．， （１９９５） Ｂｌｏｏｄ ８５：３０４８－３０５；Ｋｏｈｎ ｅｔ ａｌ．， （１９９５） Ｎａｔ． Ｍｅｄ． １：１０１７－１０２；Ｍａｌｅｃｈ ｅｔ ａｌ．， （１９９７） ＰＮＡＳ ９４：２２ １２１３３－１２１３８）。ＰＡ３１７／ｐＬＡＳＮは、遺伝子療法試験で使用された最初の治療用ベクターであった。（Ｂｌａｅｓｅ ｅｔ ａｌ．， （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４７５－４８０）。ＭＦＧ－Ｓをパッケージングしたベクターの場合、５０％またはそれよりも大きい形質導入効率が観察されている。（Ｅｌｌｅｍ ｅｔ ａｌ．， （１９９７） Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． ４４（１） ：１０－２０；Ｄｒａｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ．， （１９９７） Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １：１１１－２）。

【0144】

組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）は、不完全で非病原性のパルボウイルスアデノ随伴２型ウイルスに基づく有望な代替遺伝子送達系である。全てのベクターは、導入遺伝子発現カセットに隣接するＡＡＶの１４５ｂｐの逆位末端反復のみを保持するプラスミド由来である。形質導入される細胞のゲノムへの組み込みによる効率的な遺伝子移入および安定な導入遺伝子送達が、このベクター系の主要な特色である。（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， （１９９８） Ｌａｎｃｅｔ ３５１：９１１７ １７０２－３， Ｋｅａｒｎｓ ｅｔ ａｌ．， （１９９６） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ９：７４８－５５）。ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ８．２、ＡＡＶ９およびＡＡＶｒｈ１０ならびにシュードタイプＡＡＶ、例えばＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／５およびＡＡＶ２／６を含む他のＡＡＶ血清型も、本発明に従って使用することができる。好ましい実施形態では、ＡＡＶ９またはＡＡＶ６のカプシドが使用される。

【0145】

複製欠損型組換えアデノウイルスベクター（Ａｄ）を高い力価で産生し、いくつかの異なる細胞型に容易に感染させることができる。ほとんどのアデノウイルスベクターは、導入遺伝子がＡｄ Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、および／またはＥ３遺伝子を置き換えるように操作されており、その後、複製欠損ベクターは、欠失した遺伝子機能をトランスで供給するヒト２９３細胞中で増える。Ａｄベクターは、ｉｎ ｖｉｖｏで、非分裂性の分化細胞、例えば肝臓、腎臓および筋肉に見出されるものを含むなどの複数のタイプの組織に形質導入することができる。従来のＡｄベクターは、大きい運搬能力を有する。臨床試験におけるＡｄベクターの使用の例は、筋肉内注射での抗腫瘍免疫のためのポリヌクレオチド療法を伴うものであった（Ｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．， （１９９８） Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ７：１０８３－９）。臨床試験における遺伝子移入のためのアデノウイルスベクターの使用の追加の例としては、Ｒｏｓｅｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， （１９９６） Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ２４：１ ５－１０；Ｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．， （１９９８） Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ９：７ １０８３－１０８９；Ｗｅｌｓｈ ｅｔ ａｌ．， （１９９５） Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ２：２０５－１８；Ａｌｖａｒｅｚ ｅｔ ａｌ．， （１９９７） Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ５：５９７－６１３；Ｔｏｐｆ ｅｔ ａｌ．， （１９９８） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ５：５０７－５１３；Ｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．， （１９９８） Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ７：１０８３－１０８９が挙げられる。

【0146】

パッケージング細胞は、宿主細胞に感染することが可能なウイルス粒子を形成するのに使用される。このような細胞としては、アデノウイルスをパッケージングする２９３細胞、およびレトロウイルスをパッケージングするψ２細胞またはＰＡ３１７細胞が挙げられる。遺伝子療法で使用されるウイルスベクターは通常、核酸ベクターをウイルス粒子にパッケージングするプロデューサー細胞系によって生成される。ベクターは、典型的には、パッケージングおよびそれに続く宿主への組み込み（適切な場合）に必要な最小のウイルス配列を含有し、他のウイルス配列は、発現させようとするタンパク質をコードする発現カセットによって置き換えられている。失われたウイルス機能は、パッケージング細胞系によってトランスで供給される。例えば、遺伝子療法で使用されるＡＡＶベクターは、ＡＡＶ複製タンパク質が存在する場合には、典型的には、パッケージングおよび宿主ゲノムへの組み込みに必要なＡＡＶゲノム由来の逆位末端反復（ＩＴＲ）配列のみを有する。ウイルス遺伝子は、他のＡＡＶ遺伝子、すなわちｒｅｐおよびｃａｐをコードするがＩＴＲ配列を欠くヘルパープラスミドを含有する細胞系中にトランスで補充される。細胞系も、ヘルパーとしてのアデノウイルスで感染させる。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶゲノムの複製およびヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列の欠如のために相当量でパッケージングされない。アデノウイルスでの汚染は、例えば、ＡＡＶよりもアデノウイルスが感受性を示す熱処理によって低減することができる。

【0147】

多くの遺伝子療法適用において、遺伝子療法用ベクターが特定の組織タイプに対して高度な向性で送達されることが望ましい。したがって、ウイルスの外面上のウイルスコートタンパク質との融合タンパク質としてリガンドを発現することによって所与の細胞型に対して向性を有するように、ウイルスベクターを改変してもよい。リガンドは、目的の細胞型に存在することがわかっている受容体に対して親和性を有するように選択される。例えば、Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．， （１９９５） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２：９７４７－９７５１は、モロニーマウス白血病ウイルスは、ｇｐ７０に融合したヒトヘレグリンを発現するように改変することができ、組換えウイルスは、ヒト上皮成長因子受容体を発現するある特定のヒト乳がん細胞に感染することを報告した。この原理は、標的細胞が受容体を発現し、ウイルスが細胞表面受容体に対するリガンドを含む融合タンパク質を発現する他のウイルス標的細胞の対に拡張することができる。例えば、線状ファージは、実質的に全ての選択された細胞受容体に対して特異的な結合親和性を有する抗体断片（例えば、ＦＡＢまたはＦｖ）を提示するように操作することができる。上の記載は主としてウイルスベクターに適用されるが、同じ原理を非ウイルスベクターに適用することができる。このようなベクターは、特定の標的細胞による取込みに有利な特定の取り込み配列を含有するように操作することができる。

【0148】

遺伝子療法用ベクターは、典型的には、後述するように、全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、または頭蓋内注入、脳への直接注射を含む）または局所的適用による個々の患者への投与によって、ｉｎ ｖｉｖｏで送達することができる。あるいは、ベクターは、ｅｘ ｖｉｖｏで、個々の患者からの体外培養した細胞（例えば、リンパ球、骨髄穿刺液、組織生検）またはユニバーサルドナー造血幹細胞などの細胞に送達することができ、続いて細胞は、通常ベクターを取り込んだ細胞の選択の後に、患者に再び埋め込まれる。

【0149】

ある特定の実施形態では、本明細書に記載される組成物（例えば，ポリヌクレオチドおよび／またはタンパク質）は、ｉｎ ｖｉｖｏで直接送達される。組成物（細胞、ポリヌクレオチド、および／またはタンパク質）は、これらに限定されないが、脳または脊髄への直接注射を含む中枢神経系（ＣＮＳ）に直接投与され得る。これらに限定されないが、海馬、黒質、マイネルト基底核（ＮＢＭ）、線条体、および／または新皮質を含む、脳の１つまたは複数の領域を標的化してもよい。あるいはまたはＣＮＳ送達に加えて、組成物は全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、心臓内、筋肉内、髄腔内、皮下、および／または頭蓋内注入）され得る。本明細書に記載される組成物を対象に直接（ＣＮＳに直接を含む）送達するための方法および組成物としては、これらに限定されないが、ニードルアセンブリを介しての直接注射（例えば、定位注射）が挙げられる。そのような方法は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、脳への組成物（発現ベクターを含む）の送達に関する米国特許第７，８３７，６６８号；同第８，０９２，４２９号、および米国特許出願公開第２００６／０２３９９６６号に記載されている。

【0150】

投与される有効量は、患者ごとにおよび投与様式および投与部位に従って変化し得る。したがって、有効量は当業者によって決定され得る。リプレッサーの発現にとって十分な期間の後（例えば、典型的に４～１５日）、治療ポリペプチドの血清または他の組織レベルの分析および投与前の初回レベルとの比較により、投与される量が低すぎるか否か、正しい範囲内にあるか、または高すぎるかが決定される。ある特定の実施形態では、ＡＡＶなどのウイルスベクターを使用する場合、投与される用量は、１×１０^７～５×１０^１５ｖｇ／ｍｌの間（またはその間の任意の値）、さらにより好ましくは１×１０^１１～１×１０^１４ｖｇ／ｍｌの間（またはその間の任意の値）、さらにより好ましくは１×１０^１２～１×１０^１３ｖｇ／ｍｌの間（またはその間の任意の値）である。ＡＡＶの投薬量はまた、１×１０^７～５×１０^１５ｖｇ／ｋｇもしくはｖｇ／線条体の間（またはその間の任意の値）、さらにより好ましくは１×１０^７～１×１０^１３ｖｇ／ｋｇもしくはｖｇ／線条体の間（またはその間の任意の値）、さらにより好ましくは１×１０^８～１×１０^１２ｖｇ／ｋｇもしくはｖｇ／線条体の間（またはその間の任意の値）の任意の投薬量を含む、対象のキログラムあたりまたは線条体あたりで投与され得る。

【0151】

組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを使用してＺＦＰをヒト脳に直接送達するために、１×１０^７～５×１０^１５ｖｇ／ｍＬ（例えば１×１０^１１～１×１０^１４ｖｇ／ｍｌの間のいずれか、または１×１０^１２～１×１０^１３ｖｇ／ｍＬの間のいずれかを含むその間の任意の値）ベクターゲノム／線条体の間の用量範囲を適用することができる。１×１０^７～５×１０^１５ｖｇ／ｋｇもしくはｖｇ／線条体（またはその間の任意の値）、さらにより好ましくは１×１０^７～１×１０^１３ｖｇ／ｋｇもしくはｖｇ／線条体の間（またはその間の任意の値）、さらにより好ましくは１×１０^８～１×１０^１２ｖｇ／ｋｇもしくはｖｇ／線条体の間（またはその間の任意の値）の用量範囲を適用することができる。指摘したように、投薬量は、他の脳の構造および異なる送達プロトコールに関して変化し得る。ｒＡＡＶベクターを脳に直接送達する方法は、当業界において公知である。例えば、米国特許第９，０８９，６６７号：同第９，０５０，２９９号：同第８，３３７，４５８号：同第８，３０９，３５５号：同第７，１８２，９４４号：同第６，９５３，５７５号：および同第６，３０９，６３４号を参照されたい。

【0152】

診断、研究、または遺伝子治療のためのｅｘ ｖｉｖｏ細胞トランスフェクション（例えば、トランスフェクトした細胞の宿主生物への再注入を介して）は、当業者に周知である。好ましい実施形態では、細胞は、少なくとも１つのＨＴＴリプレッサーまたはその成分をトランスフェクトされた対象生物から単離され、対象生物（例えば、患者）に再注入される。好ましい実施形態では、ＨＴＴリプレッサーの１つまたは複数の核酸は、ＡＡＶ９を使用して送達される。他の実施形態では、ＨＴＴリプレッサーの１つまたは複数の核酸は、ｍＲＮＡとして送達される。翻訳効率および／またはｍＲＮＡ安定性を増加させるためのキャップされたｍＲＮＡの使用も好ましい。特に好ましくは、ＡＲＣＡ（ａｎｔｉ－ｒｅｖｅｒｓｅ ｃａｐ ａｎａｌｏｇ；アンチリバースキャップアナログ）キャップまたはそれらのバリアントである。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第７，０７４，５９６号および同第８，１５３，７７３号を参照されたい。ｅｘ ｖｉｖｏでのトランスフェクションに好適な様々な細胞型が当業者に周知である（例えば、どのように患者から細胞を単離および培養するかの考察に関して、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ， Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ （３ｒｄ ｅｄ． １９９４）およびそこで引用された文献を参照）。

【0153】

一実施形態では、細胞トランスフェクションおよび遺伝子療法のためのｅｘ ｖｉｖｏの手順で、幹細胞が使用される。幹細胞を使用する利点は、それらがｉｎ ｖｉｔｒｏで他の細胞型に分化することができる、または哺乳動物（例えば細胞のドナー）に導入することができることであり、それらは骨髄に移植される。ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－αなどのサイトカインを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏでＣＤ３４＋細胞を臨床的に重要な免疫細胞型に分化させるための方法が公知である（Ｉｎａｂａ ｅｔ ａｌ．， （１９９２） Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７６：１６９３－１７０２を参照）。

【0154】

幹細胞は、公知の方法を使用して、形質導入および分化のために単離される。例えば、幹細胞は、望まれない細胞、例えばＣＤ４＋およびＣＤ８＋（Ｔ細胞）、ＣＤ４５＋（ｐａｎＢ細胞）、ＧＲ－１（顆粒細胞）、ならびにＩａｄ（分化した抗原提示細胞）に結合する抗体で骨髄細胞をパニングすることによって、骨髄細胞から単離される（Ｉｎａｂａ ｅｔ ａｌ．， （１９９２） Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７６：１６９３－１７０２を参照）。

【0155】

一部の実施形態では、改変された幹細胞も使用することができる。例えば、アポトーシスに対する耐性が付与された神経幹細胞が、治療用組成物として使用することができ、幹細胞も本発明のＺＦＰ ＴＦを含有する。アポトーシスに対する耐性は、例えば、幹細胞においてＢＡＸもしくはＢＡＫ特異的ＴＡＬＥＮまたはＺＦＮを使用してＢＡＸおよび／もしくはＢＡＫをノックアウトすることによって（米国特許第８，５９７，９１２号を参照）、またはここでも例えばカスパーゼ－６特異的なＺＦＮを使用してカスパーゼにおいて破壊されているものによって、生じ得る。これらの細胞に、変異体または野生型ＨＴＴを調節することが公知であるＺＦＰ ＴＦまたはＴＡＬＥ ＴＦをトランスフェクトすることができる。

【0156】

治療用ＺＦＰ核酸を含有するベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、リポソームなど）は、ｉｎ ｖｉｖｏでの細胞の形質導入のために、生物に直接投与することもできる。あるいは、裸のＤＮＡを投与してもよい。投与は、これらに限定されないが、注射、注入、局所的適用およびエレクトロポレーションを含む、最終的な血液または組織細胞との接触に分子を導くのに通常使用される経路のいずれかによる。このような核酸を投与する好適な方法は利用可能で、当業者に周知であり、特定の組成物を投与するのに１つよりも多くの経路を使用することができるが、特定の経路が、別の経路よりも即時かつ有効な反応を提供できることが多い。

【0157】

造血幹細胞へのＤＮＡの導入のための方法は、例えば、米国特許第５，９２８，６３８号に開示されている。造血幹細胞、例えばＣＤ３４＋細胞に導入遺伝子を導入するのに有用なベクターとしては、アデノウイルス３５型が挙げられる。

【0158】

免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）への導入遺伝子の導入に好適なベクターとしては、非組み込み型レンチウイルスベクターが挙げられる。例えば、Ｎａｌｄｉｎｉ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：１１３８２－１１３８８；Ｄｕｌｌ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：８４６３－８４７１；Ｚｕｆｆｅｒｙ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：９８７３－９８８０；Ｆｏｌｌｅｎｚｉ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２５：２１７－２２２を参照されたい。

【0159】

薬学的に許容される担体は、部分的に、投与される特定の組成物によって、ならびに組成物を投与するのに使用される特定の方法によって決定される。したがって、後述するように、利用可能な医薬組成物の多種多様の好適な製剤がある（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １７ｔｈ ｅｄ．， １９８９を参照）。

【0160】

上述したように、開示された方法および組成物は、これらに限定されないが、原核細胞、真菌細胞、古細菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞、脊椎動物細胞、哺乳動物細胞およびヒト細胞を含む任意のタイプの細胞で使用することができる。タンパク質発現のための好適な細胞系は、当業者に公知であり、これらに限定されないが、ＣＯＳ、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ－Ｓ、ＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ－ＤＧ４４、ＣＨＯ－ＤＵＸＢ１１）、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８－Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０－Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３（例えば、ＨＥＫ２９３－Ｆ、ＨＥＫ２９３－Ｈ、ＨＥＫ２９３－Ｔ）、ｐｅｒＣ６、昆虫細胞、例えばＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ）、ならびに真菌細胞、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、ＰｉｓｃｈｉａおよびＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓが挙げられる。これらの細胞系の後代、変種および派生物も使用することができる。好ましい実施形態では、方法および組成物は、脳細胞、例えば線条体に直接送達される。
応用

【0161】

本明細書で記載されるＨＴＴ結合分子（例えば、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、Ｔｔａｇｏ等）、およびそれらをコードする核酸は、様々な応用のために使用することができる。これらの応用は、ＨＴＴ結合分子（ＤＮＡ結合タンパク質をコードする核酸を含む）が対象（例えば、ＡＡＶ９などのＡＡＶ）に投与され、対象内で標的遺伝子（したがってタンパク質）の発現をモジュレートするために使用される治療方法を含む。モジュレーションは、抑制の形態、例えばＨＤ疾患状態に寄与しているｍＨＴＴの抑制であり得る。あるいは、モジュレーションは、内因性の細胞遺伝子の発現の活性化または発現の増加が疾患状態を改善することができる場合、活性化の形態であり得る。なおさらなる実施形態では、モジュレーションは、例えば変異体ＨＴＴ遺伝子を不活化するための切断（例えば、１つまたは複数のヌクレアーゼによる）であり得る。上記のように、そのような応用に関して、ＨＴＴ結合分子またはより典型的にはそれらをコードする核酸は、医薬組成物として薬学的に許容される担体と共に製剤化される。

【0162】

ＨＴＴ結合分子またはそれらをコードするベクターを、単独でまたは他の適した成分（例えば、リポソーム、ナノ粒子、または当業界において公知の他の成分）と組み合わせて、吸入を介して投与されるエアロゾル製剤に作製することができる（すなわち、それらを「噴霧化」することができる）。エアロゾル製剤は、加圧された許容される噴射剤、例えばジクロロフルオロメタン、プロパン、窒素等の下に置くことができる。非経口投与、例えば、静脈内、筋肉内、皮内、および皮下経路にとって好適な製剤は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および製剤を意図されるレシピエントの血液と等張にする溶質を含有し得る水性および非水性の等張滅菌注射液、ならびに懸濁剤、溶解剤、濃化剤、安定剤、および保存剤を含み得る水性および非水性の滅菌懸濁液を含む。化合物は、例えば、静脈内注入、経口、局所、腹腔内、膀胱内、頭蓋内、又は髄腔内に投与することができる。化合物の製剤は、アンプルおよびバイアルなどの単一用量または多用量密封容器に提示することができる。注射溶液および懸濁液は、すでに記載された種類の滅菌粉末、顆粒剤、および錠剤から調製することができる。

【0163】

患者に投与される用量は、患者における有益な治療応答に経時的に影響を及ぼすために十分でなければならない。用量は、使用される特定のＨＴＴ結合分子の有効性およびＫ_ｄ、標的細胞、および患者の状態、ならびに処置される患者の体重または体表面積によって決定される。用量のサイズは、特定の患者における特定の化合物またはベクターの投与に伴う任意の有害な副作用の存在、性質、および程度によって決定される。

【0164】

有益な治療応答は、いくつかの方法で測定することができる。例えば、ハンチントン病関連運動障害、例えば不随意のけいれんまたはもがくような動き、筋肉の障害、例えば強直または筋拘縮（ジストニア）、遅いまたは異常な眼球運動、歩行、姿勢、および平衡の障害、言語の物的生産困難または嚥下困難、ならびに随意運動の障害の改善を測定することができる。他の障害、例えば認知障害および精神障害もまた、処置に関連する改善の兆候に関してモニターすることができる。ＵＨＤＲＳ尺度を使用して、疾患の臨床特徴を定量することができる。他のバイオマーカー測定もまた、ＣＳＦにおけるｍＨＴＴの測定を含むアウトカムを決定するために使用することができる。

【0165】

発症前である患者の場合、処置は、ＨＤにおいて広範な神経変性が起こる前に疾患を処置する機会を与えることから特に重要であり得る。この損傷は、上記の明白な症状が発生する前に始まる。ＨＤの病態は、主に線条体中型有棘ニューロンにおける変異体ＨＴＴの毒性効果を含む。これらの中型有棘ニューロンは、遺伝子転写因子、神経伝達物質受容体、および電位依存的転写因子に関係するｃＡＭＰおよびｃＧＭＰシグナル伝達カスケードを調節する高レベルのホスホジエステラーゼ１０Ａ（ＰＤＥ１０Ａ）を発現し（Ｎｉｃｃｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ． （２０１５） Ｂｒａｉｎ １３８：３０１６－３０２９）、ＰＤＥ１０Ａの発現は、ＨＤマウスにおいて低減していること、およびヒトにおける死後の試験でも同じことが見出されることが示されている。最近、ＰＤＥ１０Ａ酵素（例えば^１１Ｃ－ＩＭＡ１０７、例えばＮｉｃｃｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．、上記を参照されたい；^１８ＦＭＮＩ－６５９、例えばＲｕｓｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ． （２０１４） ＪＡＭＡ Ｎｅｕｒｏｌ ７１（１２）：１５２０－１５２８を参照されたい）のリガンドであるポジトロンエミッショントモグラフィー（ＰＥＴ）リガンドが開発されており、これらの分子は、発症前のＨＤ患者を評価するために使用されている。試験は、ＰＤＥ１０Ａレベルが、症状が発生する前であってもＨＤ患者において変更されていることを示している。このように、ＰＥＴによるＰＤＥ１０Ａの評価を、本発明の組成物の治療有効性を測定するために処置前、処置の間、および処置後に行うことができる。「治療有効性」は、臨床および分子測定の改善を意味し得て、同様に中型有棘ニューロンの機能の任意のさらなる減少、または有棘ニューロンの喪失の増加、またはＨＤに関連する明白な臨床提示のさらなる発生からの患者の保護を意味し得る。

【0166】

以下の実施例は、ＨＴＴモジュレーターがジンクフィンガータンパク質を含む本開示の例示的な実施形態に関する。これは単に例示目的であり、これらに限定されないが、ＴＡＬＥ－ＴＦ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、追加のＺＦＰ、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、追加のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系（例えば、Ｃｆｐ系）、操作されたＤＮＡ結合ドメインを有するホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）を含む、他のＨＴＴモジュレーター（例えば、リプレッサー）を使用することができることが認識される。

【実施例】

【0167】

（実施例１）
ｍＨＴＴリプレッサー
ｍＨＴＴに標的化されるジンクフィンガータンパク質は、本質的に米国特許第９，２３４，０１６号：同第８，８４１，２６０号：同第６，５３４，２６１号：米国特許出願公開第２０１９／０３２２７１１号：同第２０１７／００９６４６０号：同第２０１５／００５６７０５号：および同第２０１５／０３３５７０８号：および同第２０１９／０３２２７１１に記載されているように操作された。表１は、これらのＺＦＰのＤＮＡ結合ドメインの認識ヘリックスを示し、表２はこれらのＺＦＰの標的配列を示す。ＺＦＰを評価して、その標的部位に結合することが示された。

【0168】

ＺＦＰは、ＫＯＸ抑制ドメインに作動可能に連結して、ＨＴＴを抑制するＺＦＰ－ＴＦを形成した。表３は、示されたＺＦＰ－ＴＦリプレッサーのアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。

【0169】

ＺＦＰ ＴＦ転写物をヒト細胞（例えば、ＨＤ患者に由来する細胞）にトランスフェクトし、ＨＴＴおよびｍＨＴＴ転写物の発現をリアルタイムｑＲＴ－ＰＣＲを使用してモニターした。ＺＦＰ－ＴＦは全て、変異体ＨＴＴ発現の選択的抑制において有効であることが見出された。ＺＦＰ－ＴＦは、プラスミドとして、ｍＲＮＡ型で、Ａｄベクター、レンチウイルスベクターおよび／またはＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ９またはＡＡＶ６）を含む組換えウイルスベクターにおいて製剤化される場合、機能的リプレッサーである。
（実施例２）
ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験

【0170】

表１および３に示したＺＦＰ－ＴＦが、ｗｔＨＴＴ対立遺伝子と比較してｍＨＴＴの転写を選択的に抑制する能力を、ＨＤ患者の線維芽細胞および幹細胞由来ニューロンにおいて評価した。

【0171】

簡単に説明すると、ヒトニューロン幹細胞（ＣＡＧ１７またはＣＡＧ４８（配列番号２３として開示される１７および４８「ＣＡＧ」リピート））に、表３のＺＦＰ－ＴＦまたはＧＦＰをコードするｍＲＮＡの０～１５００ｎｇ（１５００、３００、１５０、または１５ｎｇ）をトランスフェクトし、ｗｔＨＴＴおよびｍＨＴＴのレベルを２４時間後にｑＰＣＲによって測定した。加えて、ＨＤニューロンに、表３のＺＦＰ－ＴＦコード配列を有するＡＡＶ６またはＧＦＰを１０Ｋ～５００Ｋ（５００Ｋ、３００Ｋ、１００Ｋ、または１０Ｋ）のＭＯＩで形質導入した。

【0172】

図２に示すように、ＺＦＰ－ＴＦは、ｍＨＴＴ発現を有意に抑制し、野生型ＨＴＴの抑制は最小限であった。

【0173】

ＺＦＰ－ＴＦ ４５６４３をさらなる試験のために選択し、導入遺伝子ｍＲＮＡのＨＤ患者線維芽細胞への一過性のトランスフェクションを実施し、導入遺伝子タンパク質がｍＨＴＴおよびｗｔＨＴＴ遺伝子転写を抑制する能力を評価した。ＧＭ０２１５１線維芽細胞（ＣＡＧ１８またはＣＡＧ４５（配列番号２３として開示される１８または４５「ＣＡＧ」リピート）に、ｒＡＡＶ９－ＺＦＰ－ＴＦ ４５６４３導入遺伝子またはＧＦＰのいずれかをコードするｍＲＮＡ ０～１０００ｎｇをトランスフェクトし、ｗｔＨＴＴおよびｍＨＴＴ ｍＲＮＡのレベルを２４時間後にｑＰＣＲによって測定した。

【0174】

６つの独立した実験（ダネットの多重比較試験を伴う一元配置ＡＮＯＶＡ）からのデータのメタ分析から、導入遺伝子ｍＲＮＡ≧０．３ｎｇをトランスフェクトした細胞においてｗｔＨＴＴ ｍＲＮＡの有意な低減を伴わないｍＨＴＴ ｍＲＮＡの有意な低減（ＧＦＰトランスフェクト細胞と比較してｐ＜０．００１）が示された。図５を参照されたい。これらの結果を、２つの追加のＨＤ線維芽細胞株ＧＭ０４７２３（ＣＡＧ１５またはＣＡＧ６７（配列番２３として開示される１５または６７「ＣＡＧ」リピート））およびＮＤ３０２５９（ＣＡＧ２１またはＣＡＧ３８（配列番号２３に開示される２１または３８「ＣＡＧ」リピート））において確認した。

【0175】

ニューロンにおけるｍＨＴＴの抑制を評価するために、ＨＤ患者のＥＳ細胞（ＧＥＮＥＡ０２０；ＣＡＧ１７またはＣＡＧ４８（配列番号２３として開示される１７または４８「ＣＡＧ」リピート））を、ニューロンに分化させ、ＺＦＰ－ＴＦ ４５６４３導入遺伝子をコードするｍＲＮＡ ０、１５、１５０、もしくは３００ｎｇまたはＧＦＰのいずれかを一過性にトランスフェクトし、ｗｔＨＴＴおよびｍＨＴＴ ｍＲＮＡのレベルを４８時間後にｑＰＣＲによって測定した。ＺＦＰ－ＴＦ ４５６４３導入遺伝子をコードするｍＲＮＡをトランスフェクトしたニューロンは、同等量のＧＦＰを発現するｍＲＮＡをトランスフェクトした細胞よりおよそ９０％少ないｍＨＴＴ ｍＲＮＡを有した。ｗｔＨＴＴ ｍＲＮＡのレベルは、全ての処置群に対して不変であった。図５を参照されたい。

【0176】

加えて、ｍＨＴＴおよびｗｔＨＴＴ転写の抑制を、ｒＡＡＶ９－ＺＦＰ－ＴＦｓ ４５６４３を、ＨＤ患者ＥＳ細胞（ＧＥＮＥＡ０２０；ＣＡＧ１７／４８（配列番号２３として開示される「ＣＡＧ」リピート））に由来するニューロンに形質導入後１７日目に調べた。細胞に、ｒＡＡＶ９－ＺＦＰ－ＴＦ ４５６４３を、５ｅ４、１ｅ５、５ｅ５、５ｅ６、または１ｅ７ｖｇ／細胞で形質導入し、導入遺伝子ｍＲＮＡ、ｗｔＨＴＴ、およびｍＨＴＴ ｍＲＮＡのレベルを、１７日後にｑＰＣＲによって測定した。導入遺伝子ｍＲＮＡ／細胞のレベルを、形質導入された細胞数に基づいて概算したところ、２～１２３コピー／細胞へと用量依存的に増加した。導入遺伝子ｍＲＮＡのこの用量依存的増加にもかかわらず、ｍＨＴＴおよびｗｔＨＴＴ ｍＲＮＡのレベルは、全ての用量で同等であった。ｍＨＴＴのレベルは、偽またはＡＡＶ９－ＧＦＰ形質導入細胞よりおよそ７５％低かったが、ｗｔＨＴＴ ｍＲＮＡのレベルは影響を受けなかった。

【0177】

併せて考慮すると、これらの結果は、本明細書に記載のＺＦＰ－ＴＦタンパク質がｍＨＴＴ対立遺伝子における伸張したＣＡＧリピートを選択的に標的とすることを実証している。さらに、結果は、ｍＨＴＴの最大の抑制を達成するために、低レベルの導入遺伝子発現で十分であることを示している。
（実施例３）
特異性

【0178】

ゲノムワイドな選択性を、オンターゲットおよびオフターゲット部位に関するマイクロアレイ分析を使用してＨＤ患者の細胞においてｉｎ ｖｉｔｒｏで評価した。オフターゲット遺伝子のサブセットも同様にｑＰＣＲ分析によって分析した。

【0179】

図４および６に示すように、記載のオフターゲット部位に関して示されるように、ＺＦ－ＴＦは、ｑＰＣＲ分析によって決定した場合にその標的部位に対して高い程度の特異性を示した。
（実施例４）
ｉｎ ｖｉｖｏ試験

【0180】

ｒＡＡＶ９－ＺＦＰ－ＴＦ ４５６４３のｉｎ ｖｉｖｏ薬理学を、２つのＨＤマウスモデル、すなわちＲ６／２モデルおよびより進行性のＱ１７５モデルを使用して評価した。例えば、Ｃｒｏｏｋ ＆ Ｈｏｕｓｍａｎ （２０１１） Ｎｅｕｒｏｎ ６９：４２３－４３５を参照されたい。一部の試験では、ｒＡＡＶ９－ＺＦＰ－ＴＦ ４５６４３を、疾患症状の発生前に投与し、他の試験では、投与は疾患の発症後に行った。これらの試験の全てにおいて、主要評価項目は、ｍＨＴＴ発現の抑制であった。加えて、運動機能および認知機能に及ぼすｒＡＡＶ９－ＺＦＰ－ＴＦ ４５６４３の影響もまた一部の試験において評価した。

【0181】

ｍＨＴＴ ｍＲＮＡおよびタンパク質凝集体に及ぼすｒＡＡＶ９－ＺＦＰ－ＴＦ ４５６４３の効果を、加齢Ｑ１７５マウスモデルにおいて評価した。５２／５３週齢のＱ１７５マウスに、ビヒクル、ｒＡＡＶ９－ＺＦＰ－ＴＦ ４５６４３（３ｅ８、３ｅ９、または３ｅ１０ ＶＧ／線条体）、またはｒＡＡＶ９－ＧＦＰ（３ｅ８、３ｅ９、または３ｅ１０ ＶＧ／線条体）を、定位固定線条体内注射によって投与した。図１３を参照されたい。組織をｑＰＣＲ分析のために術後８週目に収集し、ＩＨＣ分析のために術後８または１６週目に収集した。

【0182】

さらに、ｒＡＡＶ９－ＺＦＰ－ＴＦ ４５６４３による処置は、トランスジェニックｍＲＮＡの用量依存的増加およびｍＨＴＴ ｍＲＮＡの用量依存的減少をもたらした。図７および８を参照されたい。野生型マウスＨＴＴに及ぼす効果は、ｒＡＡＶ９－ＧＦＰ処置群において観察された効果と類似であった。細胞質ｍＨＴＴタンパク質凝集体は、ｒＡＡＶ９－ＺＦＰ－ＴＦ ４５６４３処置線条体では、ビヒクルまたはｒＡＡＶ９－ＧＦＰ処置線条体と比較して減少した。核凝集体に及ぼす効果は、いかなる処置群においても観察されなかった。したがって、ｒＡＡＶ９－ＺＦＰ－ＴＦ ４５６４３は、Ｑ１７５マウスモデルにおいて、疾患の発症後に投与した場合に、ｍＨＴＴ転写を抑制し、細胞質ｍＨＴＴ凝集体のレベルを低減させることができる。

【0183】

ｍＨＴＴ ｍＲＮＡ、可溶性ｍＨＴＴタンパク質、およびｍＨＴＴ凝集体に及ぼすｒＡＡＶ９－ＺＦＰ－ＴＦ ４５６４３の効果を若いＱ１７５マウスにおいて評価した。５週齢のＱ１７５マウスに、ｒＡＡＶ９－ＺＦＰ－ＴＦ ４５６４３（９．２ｅ９、３．１ｅ１０、９．２ｅ１０ＶＧ／マウス）、またはｒＡＡＶ９－ＧＦＰ（５．５ｅ１０ＶＧ／マウス）を、定位固定の両側の線条体内注射によって投与した。組織を術後１１週目にｑＰＣＲ、ＥＬＩＳＡ、およびＩＨＣ分析のために収集した。

【0184】

処置後３３週目でのｍＨＴＴ ｍＲＮＡ、可溶性ｍＨＴＴタンパク質、およびｍＨＴＴ凝集体に及ぼすｒＡＡＶ９－ＺＦＰ－ＴＦ ４５６４３の効果を、Ｑ１７５マウスにおいて評価した。５週齢のＱ１７５マウスに、ｒＡＡＶ９－ＺＦＰ－ＴＦ ４５６４３（９．２ｅ９、３．１ｅ１０、９．２ｅ１０ＶＧ／マウス）、またはｒＡＡＶ９－ＧＦＰ（５．５ｅ１０ＶＧ／マウス）を、定位固定の両側の線条体内注射によって投与した。運動機能（オープンフィールド、ローターロッド、Ｃａｒｔｅｒ （１９９９） Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １９（８）：３２４８－３２５７に記載されるテーパードバランスビーム）を、１６／１７、２６／２７、および３６／３７週齢で評価し、認知機能（ＦＲ５／ＰＲ）を、２８～３５週齢で評価した。組織を、術後３３週目（３８週齢）にｑＰＣＲ、ＥＬＩＳＡ、およびＩＨＣ分析のために収集した。試験終了時、生存しているマウス（４～６匹／群）の脳を組織病理学のために処理した。

【0185】

ｍＨＴＴ ｍＲＮＡ、可溶性ｍＨＴＴタンパク質およびｍＨＴＴ凝集体に及ぼすｒＡＡＶ９－ＺＦＰ－ＴＦ ４５６４３の効果を、Ｒ６／２マウスにおいて評価した。４週齢のＲ６／２マウスに、ｒＡＡＶ９－ＺＦＰ－ＴＦ ４５６４３（９．２ｅ９、３．１ｅ１０、９．２ｅ１０ ＶＧ／マウス）、またはｒＡＡＶ９－ＧＦＰ（５．５ｅ１０ ＶＧ／マウス）を定位固定の両側の線条体内注射によって投与した。運動機能を、５、７、９、および１１週齢で評価した。組織を、術後７日目（１１週齢）に、ｑＰＣＲ、ＥＬＩＳＡ、およびＩＨＣ分析のために収集した。

【0186】

図７～１３に示すように、結果は、ｒＡＡＶ９－ＺＦＰ－ＴＦ ４５６４３の線条体内注射が、導入遺伝子タンパク質を発現する細胞においてｍＨＴＴの合成を抑制することを実証する。特に、図７および８は、全てのＺＦＰ－ＴＦ用量（野生型ＨＴＴ発現レベルに低減がない）でｍＨＴＴの統計学的に有意な選択的抑制を示す。図９は、処置後１１週目での線条体および前脳皮質における、ならびに処置後３３週目での線条体、前脳皮質、および後脳皮質におけるＺＦＰ－ＴＦ（全ての投薬量）によって処置した対象における可溶性ｍＨＴＴタンパク質の有意な低減を示す。図１０は、高用量による処置後８週目での線条体における可溶性ｍＨＴＴの有意な低減を示す（９．２×１０^１２ｖｇ）。図１１は、ＧＦＰ対照またはＺＦＰ－ＴＦ（全ての投薬量）を発現するニューロンにおけるｍＨＴＴタンパク質凝集体（ＧＦＰ対照と比較して）の有意な低減を示す。図１２および１３は、本明細書に記載されるＡＡＶ ＺＦＰ－ＴＦによって処置した対象におけるｍＨＴＴ発現の有意な抑制を示す。

【0187】

さらに図１４は、処置した対象における運動機能が対照と比較して顕著に改善したことを示す。

【0188】

類似のｉｎ ｖｉｖｏ結果が、本明細書に記載される任意のＺＦＰ－ＴＦ（４６０２５、４５２９４、４５７２３、または３３０７４で指定されるＺＦＰを含むＺＦＰ－ＴＦ）を使用して得られる。

【0189】

本明細書に記載されるＺＦＰ－ＴＦは、ＨＤ患者の細胞におけるｉｎ ｖｉｔｒｏでのｗｔＨＴＴ対立遺伝子または他のＣＡＧリピート含有遺伝子に有意な作用を及ぼすことなく、ｍＨＴＴ対立遺伝子の転写を抑制する。２つの異なるＨＤマウスモデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏ試験は、疾患症状の発生前または発生後のいずれかに与えたｒＡＡＶ９－ＺＦＰ－ＴＦ ４５６４３の１回線条体内（線条体内）投与がｍＨＴＴ ｍＲＮＡおよびタンパク質の合成を最大３３週間、有効に抑制したことを実証する。

【0190】

本明細書で述べられた全ての特許、特許出願および刊行物は、これにより参照により全ての目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。

【0191】

理解を明確にする目的のために図解と実施例によってある程度詳細に開示を提供したが、本開示の趣旨または範囲から逸脱することなく様々な変更や改変を実施することができることが当業者には明らかである。したがって、前述の記載および実施例は、限定として解釈されるべきではない。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【配列表】

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