特許 7547952 ヘモグロビン調製液及びヘモグロビン調製液を用いたヘモグロビン類の測定方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-09-02

(45)【発行日】2024-09-10

(54)【発明の名称】ヘモグロビン調製液及びヘモグロビン調製液を用いたヘモグロビン類の測定方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 30/88 20060101AFI20240903BHJP

   G01N 30/06 20060101ALI20240903BHJP

【ＦＩ】

G01N30/88 Q

G01N30/06 C

【請求項の数】 7

(21)【出願番号】P 2020191417

(22)【出願日】2020-11-18

(65)【公開番号】P2022080390

(43)【公開日】2022-05-30

【審査請求日】2023-10-16

(73)【特許権者】

【識別番号】000003300

【氏名又は名称】東ソー株式会社

(72)【発明者】

【氏名】大西 達也

【審査官】高田 亜希

(56)【参考文献】

【文献】特開２０１０－１０７４３６（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１０／０６７６１２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特開２０１８－００４６０６（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２００９－１３３６５４（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１４－１９０９３８（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１５－１５８５１５（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１０／０１０８８１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特開２０１０－１６４５７９（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２０１１／０１６５６０８（ＵＳ，Ａ１）

【文献】荻野慎士 その他，東ソー自動グリコヘモグロビン分析計 HLC-723G11バリアントモード/サラセミアモードの開発，東ソー研究・技術報告，日本，東ソー株式会社，2017年12月20日，61，105-109

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ ３０／００ －３０／９６

Ｂ０１Ｊ ２０／２８１－２０／２９２

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

液体クロマトグラフィー法によるヘモグロビン類の定量分析に用いられるヘモグロビン調製液であって、調製液に少なくとも１種以上の親水性基に糖アルコール又は糖分子が含まれ、かつ親水性基と疎水性基とがエステル結合を介して結合している界面活性剤を含み、
測定試薬中における前記界面活性剤の含有量が０．０１から１．００重量％であることを特徴とする、ヘモグロビン調製液。

【請求項2】

前記界面活性剤を構成する親水性基がスクロースであることを特徴とする、請求項１に記載のヘモグロビン調製液。

【請求項3】

前記界面活性剤を構成する疎水性基が炭素数７から２２の脂肪酸である、請求項１または２に記載のヘモグロビン調製液。

【請求項4】

前記界面活性剤のｐＨが５．５から９．０である、請求項１から３のいずれか一項に記載のヘモグロビン調製液。

【請求項5】

保存剤が、少なくとも１種類以上含まれることを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載のヘモグロビン調製液。

【請求項6】

保存剤が、エチレンジアミン四酢酸、グリコールエーテルジアミン四酢酸、エチレンジアミン－Ｎ，Ｎ’－ジコハク酸、エチレンジアミン四酢酸のナトリウム塩、エチレンジアミン四酢酸のカリウム塩、エチレンジアミン－Ｎ，Ｎ’－ジコハク酸のナトリウム塩またはアジ化ナトリウムの中から、少なくとも１種類以上含まれていることを特徴とする、請求項５に記載のヘモグロビン調製液。

【請求項7】

請求項１から６のいずれか一項に記載のヘモグロビン調製液と、ヘモグロビン類を含む試料とを混合することで測定試料を得る工程と、前記の測定試料を液体クロマトグラフィーにより測定する工程を備える、ヘモグロビン類の測定方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、液体クロマトグラフィーによりヘモグロビン類を測定する際に用いる界面活性剤を含むヘモグロビン調製液、及び前記のヘモグロビン調製液を用いたヘモグロビン類の定量測定に関するものである。

【背景技術】

【0002】

血液の主要タンパク質であるヘモグロビンは、補因子として結合しているヘムを介して生体内に酸素分子を運搬する働きを持つ。ヘモグロビン分子はヘムを構成するプロトポルフィリンＩＸと２価の鉄イオンの存在により青色光を吸収するため赤色を帯びている。この性質を利用したヘモグロビン類の分析方法の一つに液体クロマトグラフィー法が挙げられる。
液体クロマトグラフィー法を用いたヘモグロビン類の分析は、測定値の精度が高く、糖尿病や先天性溶血性貧血の一種である血色素異常症（異常ヘモグロビン症，サラセミア症）などの診断方法として広く利用されている。

【0003】

通常成人のヘモグロビンはα鎖とβ鎖の２種類のグロビン鎖から構成されるヘテロテトラマー（α２β２）であるヘモグロビンＡ０がヘモグロビン類の９０％以上を占める。その他ヘモグロビン類に、ヘモグロビンＡ０にグルコース或いは種々の誘導糖が結合したヘモグロビンＡ１や、α鎖とγ鎖の２種類のグロビン鎖から構成（α２γ２）される胎児性のヘモグロビンＦ、α鎖とδ鎖の２種類のグロビン鎖から構成（α２δ２）されるヘモグロビンＡ２が例示でき、ヘモグロビンＡ１に属する成分にはヘモグロビンＡ１ａ，Ａ１ｂ，Ａ１ｃが含まれる。

【0004】

糖尿病の診断では、ヘモグロビンＡ０の安定型糖化成分であるヘモグロビンｓ－Ａ１ｃが総ヘモグロビン量に占める割合（ＨｂＡ１ｃ％）が診断指標の一つとして用いられている。また、サラセミア症の診断においては、ヘモグロビンＦとヘモグロビンＡ２が総ヘモグロビン量に占める割合（Ｆ％及びＡ２％）が診断指標として用いられている。

【0005】

液体クロマトグラフィー法を用いたヘモグロビン類の分析では、ヘモグロビンを含有する凍結乾燥試料や血液等の試料を、界面活性剤を含むヘモグロビン調製液を用いて溶血・希釈することが一般的であるが、この際に用いるヘモグロビン調製液には血液を短時間で十分に溶血させ、ヘモグロビン類を含む試料成分を溶解できることが求められる。また、液体クロマトグラフィーを用いたヘモグロビン分析装置は、手動による測定試料の調製などの前処理工程を省略し、装置内で試料とヘモグロビン調製液を混合希釈する機能を備えることが一般的である。更に、上記試料の連続する測定を精度良く行うために、上記ヘモグロビン調製液には、測定毎に装置内のサンプルループ部及びサンプラー部を洗浄する効果を有することがより好ましい。

【0006】

血液の溶血と試料成分の速やかな溶解を促進するために、ヘモグロビン調製液には界面活性剤が添加されている。

【0007】

特許文献１では、０．１ｗｔ％のポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテルを溶解させた０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）をヘモグロビン調製液として用いている。

【0008】

特許文献２では、０．１ｗｔ％のポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートが含まれたヘモグロビン調製液を用いたヘモグロビン調製液として用いられている。

【0009】

特許文献３では、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテルを含まない、種々のアルキルエーテル群について評価しており、特定の構造を持つポリオキシエチレンアルキルエーテルがポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテルと同等の水準で血液検体を溶血可能であること、また同等の精度でヘモグロビン類の測定に使用することが可能であるとしている。

【0010】

特許文献１及び３に記載されているポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテルはヘモグロビン類の調製にかぎらず、血液の調製液に幅広く利用されている。しかし、河川や海洋等へ排出された場合、環境ホルモンに分類されるアルキルフェノール等に分解されることから生物環境への悪影響が指摘されている。特に近年は、欧州においてＴｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｇｅｎｃｙ（ＥＣＨＡ）がＲｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ，Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ，Ａｕｔｈｏｒｉｓａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（ＲＥＡＣＨ規制）の対象候補リストに、オクチルフェノールエトキシレートを部分構造に持つ一連の物質を追加したため、オクチルフェノールエトキシレート構造を含んだ界面活性剤の使用は可能な限り避ける必要がある。

【0011】

特許文献２の記載の、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートが含まれたヘモグロビン調製液は調製後のヘモグロビン類の安定性に優れているものの溶血作用が弱く、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテルに比べて完全な溶血・溶解に時間を要する。このため、液体クロマトグラフィー法を用いたヘモグロビン類の分析においてポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートが含まれたヘモグロビン調製液を使用した場合、短時間で連続して多量の血液検体を測定するとカラム内に溶血・溶解が不十分な成分が蓄積し、コンタミネーションが発生する可能性がある。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0012】

【文献】特開平１０－０１０１０７号公報

【文献】特開２０１８－００４６０６号公報

【文献】特許第６６５１０６６号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0013】

液体クロマトグラフィー法によるヘモグロビン測定時には、これまで界面活性剤としてポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテルが含まれた溶血液が一般的に用いられてきていたが、上記界面活性剤は生物環境への悪影響が懸念されており、環境保全の観点からポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテルに替わる界面活性剤が必要であるという課題があった。

【0014】

本発明の目的は、これまで液体クロマトグラフィーを用いたヘモグロビン類の測定において、広く用いられてきたポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテルに替わる界面活性剤、及びそれらを添加したヘモグロビン調製液を提供することである。より具体的には、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテルと同等以上の溶血性能と高精度なヘモグロビン類の測定を実現する、少なくとも１種以上の親水性基に糖アルコール又は糖分子が含まれ、かつ親水性基と疎水性基とがエステル結合を介して結合している界面活性剤を含むヘモグロビン調製液を提供し、同時に、前記ヘモグロビン調製液を用いたヘモグロビン類の測定方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0015】

本発明者は、前記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、親水性基に糖アルコール又は糖分子が含まれ、親水性基と疎水性基とがエステル結合を介して結合している界面活性剤を添加した溶液を、ヘモグロビン調製液として用いることにより、溶解後安定性に優れ、ヘモグロビンを精度良く連続して測定可能であり、かつコンタミネーションを低減可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。

【0016】

以下、本発明について詳細に報告する。
本発明は、液体クロマトグラフィー法によるヘモグロビン類の定量分析に用いられるヘモグロビン調製液であって、調製液に少なくとも１種以上の親水性基に糖アルコール又は糖分子が含まれ、かつ親水性基と疎水性基とがエステル結合を介して結合している界面活性剤を含むことを特徴とする、ヘモグロビン調製液、及び前記ヘモグロビン調製液を用いたヘモグロビン類の測定方法に関するものである。

【0017】

前記界面活性剤の親水性基の糖アルコール又は糖分子には、単糖ではグルコース、ガラクトース、フルクトース、リボース等が、二糖ではスクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、セロビオース等が、三糖ではラフィノース、メレジトース、マルトトリオース等が、四糖ではアカルボース、スタキオース等が、糖アルコールとしてはグリセリン、エリスリトール、ソルビトール、キシリトール、イソマルト、ラクチトール、マルチトール、マンニトール等が挙げられるが特に制限はない。

【0018】

前記界面活性剤は、非イオン性であることが好ましいが、カチオン性またはアニオン性基、あるいはその両方が付加していてもよい。カチオン性基を有する糖分子としてはグルコサミン等が、アニオン性基を有する糖分子としてはグルクロン酸等が挙げられる。

【0019】

前記界面活性剤の疎水性基は、炭素数が７から２２で構成される脂肪酸であることを特徴としているが、脂肪酸中の不飽和度に関して特に制限はない。前記界面活性剤の脂肪酸には、例えばエナント酸、カプリル酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、リノール酸等が挙げられる。

【0020】

ヘモグロビン類を含む試料としては、凍結乾燥試薬、コントロール、キャリブレーター又は血液などが挙げられる。

【0021】

本発明のヘモグロビン調製液には、保存剤として防腐剤が含まれていてもよく、防腐剤には例えばアジ化ナトリウムやアジ化リチウム、ストレプトマイシン、カナマイシン、ピューロマイシン、テトラサイクリン等が挙げられるが、特に限定されない。また、保存剤としてヘモグロビン安定化剤が含まれても良く、ヘモグロビン安定化剤として例えばＥＤＴＡのナトリウム塩及びカリウム塩等が挙げられるが、特に限定されない。

【0022】

本発明のヘモグロビン調製液の界面活性剤の含有量は測定条件に合わせ０．０１～１．００ｗｔ％の濃度で用いることが可能である。好ましくは０．０１～０．１０ｗｔ％の濃度である。

【0023】

また、ｐＨ緩衝剤として例えば、カルボン酸塩、リン酸塩、アンモニウム塩、アルキルアミン等を含ませることもできる。本発明のヘモグロビン調製液ｐＨは５．０～９．０の範囲であることが望ましい。

【0024】

本発明は、前記ヘモグロビン調製液と、ヘモグロビン類を含む試料を混合することで試料を溶血・溶解させ測定試料を得る工程と、得られた測定試料を液体クロマトグラフィーにより測定する工程を備える、ヘモグロビン類の測定方法に関するものである。

【0025】

上記の混合工程は、ヘモグロビン測定装置により行われるか、或いは予め測定者により行われるかを問わない。上記ヘモグロビン類の測定方法としては、例えば、次のような操作より求めることが可能である。
１．前記ヘモグロビン類測定用試薬と、前記ヘモグロビン類を含む試料とを混合する。
２．１．で得られた溶液を、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて測定する。
３．下記の計算式Ａを用いて測定するピークの割合を算出する。
〔計算式Ａ〕対象成分の存在割合（％）＝（測定成分のピーク面積／全成分のピーク面積の和）
液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の測定では、ヘモグロビン類を含有する試料を希釈させる工程からピーク面積を算出する工程までを全自動で行うことのできる自動分析装置を使用することがより簡便である。市販されている分析装置として自動グリコヘモグロビン分析計ＨＬＣ－７２３ Ｇ１１（東ソー株式会社製）等が挙げられる。

【発明の効果】

【0026】

本発明のヘモグロビン調製液は、ヘモグロビン類が含まれた試料の溶血・溶解能力に優れ、従来、ヘモグロビン類の定量測定分野において広く用いられてきたポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテルと同等以上の連続再現性、及びキャリーオーバー値の低減が可能となる。また、上記ヘモグロビン類測定用試薬を用いることにより、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテルの使用量を削減することで、環境負荷の軽減が期待される。

【図面の簡単な説明】

【0027】

【図1】実施例１で得られたクロマトグラムを示した図である。

【図2】比較例１で得られたクロマトグラムを示した図である。

【図3】実施例７及び比較例２のクロマトグラムを示した図である。

【図4】実施例８で得られたクロマトグラムを示した図である。

【図5】実施例９，１０，１１，１２で得られたクロマトグラムを示した図である。

【図6】実施例１３，１４，１５で得られたクロマトグラムを示した図である。

【実施例】

【0028】

以下に実施例を挙げて本発明の形態について詳細に述べるが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。

【0029】

（実施例１）
下記のヘモグロビン調製液を用いて、血液検体の測定を行った。

【0030】

１．ヘモグロビン調製液の調製
純水に、界面活性剤として０．０５ｗｔ％のスクロースラウリン酸エステル（三菱ケミカル株式会社製、商品名：Ｌ－１６９５）、防腐剤として０．０５ｗｔ％アジ化ナトリウム（富士フィルム和光株式会社製）、ヘモグロビン安定化剤としてＥＤＴＡ・４Ｎａ（株式会社同仁化学研究所製）とＥＤＴＡ・２Ｋ（株式会社同仁化学研究所製）を溶解させ、ｐＨ７．５のヘモグロビン調製液Ａを得た。

【0031】

２．ヘモグロビン類の測定
ヘモグロビン類を含む試料として血液検体を用い、ヘモグロビン調製液Ａを用いてヘモグロビン自動分析計ＨＬＣ－７２３ Ｇ１１ ＳＴＤモード（測定時間：３０秒／テスト）で、血液検体を２０回連続で測定しＨｂＡ１ｃ％を測定し、続けて純水を測定してキャリーオーバー値を測定した。得られた５検体測定毎のクロマトグラムを図１に示す。また、連続測定の結果からＨｂＡ１ｃ％の平均値とそれらの変動係数（ＣＶ％）を算出した。
分析用カラムにはＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ１１（東ソー株式会社製）を使用し、溶離液にはＧ１１溶離液 第１液、第２液、第３液（東ソー株式会社製）を使用した。
キャリーオーバー値は下記の計算式Ｂより算出した。
〔計算式Ｂ〕：キャリーオーバー値（％）＝（純水測定時に検出された全ピーク面積の総和／純水測定直前の検体測定時に検出された全ピーク面積の総和）×１００
（実施例２）
実施例１においてヘモグロビン調製液に使用する界面活性剤を、スクロースラウリン酸エステルからスクロースミリスチン酸エステル（三菱ケミカル株式会社製、商品名：Ｍ－１６９５）に変更し、ヘモグロビン調製液Ｂを得た。その他の条件は、実施例１と同様に実施した。

【0032】

（実施例３）
実施例１においてヘモグロビン調製液に使用する界面活性剤を、スクロースラウリン酸エステルからスクロースパルミチン酸エステル（三菱ケミカル株式会社製、商品名：Ｐ－１６７０）に変更しヘモグロビン調製液Ｃを得た。その他の条件は、実施例１と同様に実施した。

【0033】

（実施例４）
実施例１においてヘモグロビン調製液に使用する界面活性剤を、スクロースラウリン酸エステルからスクロースオレイン酸エステル（三菱ケミカル株式会社製、商品名：Ｏ－１５７０）に変更しヘモグロビン調製液Ｄを得た。その他の条件は、実施例１と同様に実施した。

【0034】

（実施例５）
実施例１においてヘモグロビン調製液に使用する界面活性剤を、スクロースラウリン酸エステルからスクロースステアリン酸エステル（三菱ケミカル株式会社製、商品名：Ｓ－１６７０）に変更しヘモグロビン調製液Ｅを得た。その他の条件は、実施例１と同様に実施した。

【0035】

（実施例６）
実施例１においてヘモグロビン調製液に使用する界面活性剤を、スクロースラウリン酸エステルからソルビトールカプリル酸エステル（理研ビタミン株式会社製、商品名：ポエムＣ－２５０）に変更しヘモグロビン調製液Ｆを得た。その他の条件は、実施例１と同様に実施した。

【0036】

（比較例１）
実施例１においてヘモグロビン調製液に使用する界面活性剤を、スクロースラウリン酸エステルからポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（富士フィルム和光株式会社製、商品名：Ｔｗｅｅｎ２０）に変更しヘモグロビン調製液Ｘを得た。その他の条件は、実施例１と同様に実施した。比較例１で得られた５検体測定毎のクロマトグラムを図２に示した。

【0037】

図１及び図２より、比較例１では連続測定中にカラムへのコンタミネーションによりＡ０ピークの後ろに不明ピークが現れ、測定回数が進むとともに徐々に成長した。また、不明ピークの成長とともにＨｂＡ１ｃ％の低下も観察された。一方で実施例１では比較例１で見られたような不明ピークは出現せず、ＨｂＡ１ｃ％の低下も観察されなかった。

【0038】

表１に実施例１，２，３，４，５，６及び比較例１で得られたキャリーオーバー値及び２０回の連続測定におけるＨｂＡ１ｃ％の変動係数（ＣＶ％値）を表１に示した。なお、キャリーオーバー値は計算式Ｂを用いて算出した。表１の結果から、実施例１，２，３，４，５及び６のキャリーオーバー値はいずれも２％未満となっており、カラムへのコンタミネーションは認められず、血液検体を十分に溶血・溶解できていることが示されている。一方で、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートを界面活性剤として用いた比較例１のキャリーオーバー値は１０％を超えており。カラムへのコンタミネーションが生じていた。測定精度も、実施例１，２，３，４，５及び６ではＣＶ％がいずれも１％未満で良好な再現性を示した。一方、比較例１はカラムへのコンタミネーションが影響したため、約２％となった。

【0039】

【表1】

【0040】

（実施例７）
ヘモグロビン類を含む試料として血液検体を用い、実施例１にて調製したヘモグロビン調製液Ａを用いて、血液検体を２０回連続で測定したのち、続けて純水を３回連続測定し、Ａ２％の測定値及びキャリーオーバー値を測定した。測定後、連続測定の結果からＡ２％の平均値と変動係数ＣＶ％を算出した。

【0041】

なお、ヘモグロビン類の分析にはヘモグロビン自動分析計ＨＬＣ－７２３ Ｇ１１ β－Ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａモード（測定時間：５分／テスト）を使用し、陽イオン交換カラムにはＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ１１ β－Ｔｈａｌ．（東ソー株式会社製）を、溶離液にはＧ１１ β－Ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ Ｎｏ．１（Ｓ）、Ｎｏ．２（Ｓ）、Ｎｏ．３（Ｓ）（東ソー株式会社製）を使用した。

【0042】

（比較例２）
ヘモグロビン調製液Ａの代わりに比較例１にて調製したヘモグロビン調製液Ｘを使用し、実施例７と同様の評価を行った。

【0043】

実施例７及び比較例２で得られた２０測定目のクロマトグラムを図３に、得られたキャリーオーバー値、及び２０回の連続測定中におけるＡ２％の変動係数ＣＶ％を表２に示した。なお、表２におけるキャリーオーバー値は計算式Ｂを用いて算出した。図３に示すようにヘモグロビン調製液間でクロマトグラムには明らかな差は生じなかったが、表２の結果から、実施例７での測定は比較例２と比較してキャリーオーバー値が小さく、カラムのコンタミネーションが少なかった。

【0044】

【表2】

【0045】

（実施例８）
ヘモグロビン類を含む試料として血液検体を用い、実施例１にて調製したヘモグロビン調製液Ａを用いて、血液検体を２０回連続で測定したのち、続けて純水を３回連続測定し、糖化ヘモグロビン％の測定値及びキャリーオーバー値を測定した。測定後、連続測定の結果から糖化ヘモグロビン％の平均値と変動係数ＣＶ％を算出した。

【0046】

なお、分析には東ソー株式会社製ヘモグロビン自動分析計 ＨＬＣ－７２３ Ｇ８ Ａｆｆｉｎｉｔｙ モード（測定時間：２．２分／テスト）を使用し、アフィニティーカラムにはＴＳＫ ｇｅｌ ＡＦ－ＧＨｂ（東ソー株式会社製）を、溶離液にはＧ８ ｅｌｕｅｎｔ ＡＦ－ＧＨｂ Ａ（Ｓ）、Ｂ（Ｓ）（東ソー株式会社製）を使用した。

【0047】

実施例８で得られた２０測定目のクロマトグラムを図４に、得られたキャリーオーバー値、及び２０回の連続測定中における糖化ヘモグロビン％に対するＣＶ％を表３に示した。なお、表３におけるキャリーオーバー値は計算式Ｂを用いて算出した。図４に示すように、ヘモグロビン調製液Ａは、アフィニティークロマトグラフィー法によるヘモグロビン類の定量分析にも、イオン交換クロマトグラフィー法と同様に使用可能であり、また表３の結果からＣＶ％が１％未満と高い測定精度で糖化ヘモグロビン％の測定が可能であることが示されている。

【0048】

【表3】

【0049】

（実施例９）
実施例１で用いた界面活性剤の濃度を、０．０５ｗｔ％から０．０１ｗｔ％に変更したヘモグロビン調製液Ｇを得た。ヘモグロビン調製液Ａの代わりにヘモグロビン調製液Ｇを使用し、実施例１と同様の評価を行った。

【0050】

（実施例１０）
実施例１で用いた界面活性剤の濃度を、０．０５ｗｔ％から０．１０ｗｔ％に変更したヘモグロビン調製液Ｈを得た。ヘモグロビン調製液Ａの代わりにヘモグロビン調製液Ｈを使用し、実施例１と同様の評価を行った。

【0051】

（実施例１１）
実施例１で用いた界面活性剤の濃度を、０．０５ｗｔ％から０．５０ｗｔ％に変更したヘモグロビン調製液Ｉを得た。ヘモグロビン調製液Ａの代わりにヘモグロビン調製液Ｉを使用し、実施例１と同様の評価を行った。

【0052】

（実施例１２）
実施例１で用いた界面活性剤の濃度を、０．０５ｗｔ％から１．００ｗｔ％に変更したヘモグロビン調製液Ｊを得た。ヘモグロビン調製液Ａの代わりにヘモグロビン調製液Ｊを使用し、実施例１と同様の評価を行った。

【0053】

実施例９，１０，１１，１２で得られた２０回測定後のクロマトグラムを図５に、計算式Ｂから得られたキャリーオーバー値を表４示した。表４に示すように、全てのヘモグロビン調製液でキャリーオーバー値は１％未満であり、カラムへのコンタミネーションは無かった。

【0054】

【表4】

【0055】

（実施例１３）
実施例１で用いたヘモグロビン調製液のｐＨを５．５に調製したヘモグロビン調製液Ｋを得た。ヘモグロビン調製液Ａの代わりにヘモグロビン調製液Ｋを使用し、実施例１と同様の評価を行った。

【0056】

（実施例１４）
実施例１で用いたヘモグロビン調製液のｐＨを６．５に調製したヘモグロビン調製液Ｌを得た。ヘモグロビン調製液Ａの代わりにヘモグロビン調製液Ｌを使用し、実施例１と同様の評価を行った。

【0057】

（実施例１５）
実施例１で用いたヘモグロビン調製液のｐＨを８．５に調製したヘモグロビン調製液Ｍを得た。ヘモグロビン調製液Ａの代わりにヘモグロビン調製液Ｍを使用し、実施例１と同様の評価を行った。

【0058】

実施例１３，１４，１５で得られたクロマトグラムを図６に、計算式Ｂから得られたキャリーオーバー値を表５示した。図６の結果から、ヘモグロビン調製液のｐＨがｐＨ５．５から８．５の範囲でクロマトグラムに差はないことがわかった。表５に示すように、全てのヘモグロビン調製液でキャリーオーバー値は１％未満であり、カラムへのコンタミネーションは無かった。

【0059】

【表5】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】