特許 7548305 切断可能なＤＮＡコード化ライブラリ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-09-02

(45)【発行日】2024-09-10

(54)【発明の名称】切断可能なＤＮＡコード化ライブラリ

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/10 20060101AFI20240903BHJP

   C40B 40/06 20060101ALI20240903BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20240903BHJP

   C12Q 1/44 20060101ALI20240903BHJP

   C12Q 1/6813 20180101ALI20240903BHJP

   C12Q 1/686 20180101ALI20240903BHJP

【ＦＩ】

C12N15/10 Z ZNA

C40B40/06

C12N15/11 Z

C12Q1/44

C12Q1/6813 Z

C12Q1/686 Z

【請求項の数】 89

(21)【出願番号】P 2022526549

(86)(22)【出願日】2021-05-24

(86)【国際出願番号】 JP2021019685

(87)【国際公開番号】W WO2021241528

(87)【国際公開日】2021-12-02

【審査請求日】2024-05-23

(31)【優先権主張番号】P 2020090304

(32)【優先日】2020-05-25

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】000003986

【氏名又は名称】日産化学株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110001508

【氏名又は名称】弁理士法人 津国

(72)【発明者】

【氏名】丹羽 雅俊

(72)【発明者】

【氏名】▲徳▼川 宗史

(72)【発明者】

【氏名】林田 潤

(72)【発明者】

【氏名】深野 一

【審査官】小林 薫

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１９／０６０８５７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２００７－５２４６６２（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１８／１４３４７５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２００６－５１５７５２（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１２－５１７８１２（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０２０－５１０４０３（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００

Ｃ１２Ｑ １／００－ ３／００

Ｃ４０Ｂ １０／００；４０／０２；４０／０６－４０／１０；５０／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ （ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

式（ＩＩ）

【化1】

（式中、
ＸおよびＹは、オリゴヌクレオチド鎖であり、
ＥおよびＦは、それぞれ独立して
ヌクレオチド又は核酸アナログにより構成されるオリゴマーであり、
ただし、ＥとＦが互いに相補的な塩基配列を含み、二重鎖オリゴヌクレオチドを形成し、
ＬＰは、

【化2】

で表されるループ部位であり、
ＬＳは、以下の（Ａ）ないし（Ｃ）に記載される化合物群から選ばれる部分構造であり、
（Ａ）ヌクレオチド
（Ｂ）核酸アナログ
（Ｃ）置換基を有してもよいＣ１～１４の３価の基
（ＬＰ１）ｐは、ＬＰ１が、以下の（１）および（２）に記載される化合物群から単独もしくは異なってｐ個選ばれる各部分構造であり、
（１）ヌクレオチド
（２）核酸アナログ
（ＬＰ２）ｑは、ＬＰ２が、以下の（１）および（２）に記載される化合物群から単独もしくは異なってｑ個選ばれる各部分構造であり、
（１）ヌクレオチド
（２）核酸アナログ
ｐとｑの総数は、０～４０であり、
Ｌは、リンカーであり、
Ｄは、反応性官能基由来の２価の基であり、
Ｓｐは、結合又は２官能性スペーサーであり、
Ａｎは、低分子有機化合物又はポリペプチドである。）
で表される化合物であって、
ＸとＹは、少なくとも一部で二重鎖を形成しうる配列を有し、
Ｘは５‘末端でＥに結合し、
Ｙは３‘末端でＦに結合し、
Ｅ、Ｆ、又はＬＰの少なくともいずれか１つの部位に、少なくとも１つの選択的に切断可能な部位を有する、化合物。

【請求項2】

Ｅ又はＦの少なくともいずれか１つの部位に、少なくとも１つの選択的に切断可能な部位を有する、請求項１に記載の化合物。

【請求項3】

式（ＩＩＩ）
Ａｎ－Ｓｐ－Ｃ－Ｂｎ （ＩＩＩ）
（式中、
ＡｎおよびＳｐは、請求項１と同じ意味を表し、
Ｂｎは、オリゴヌクレオチド鎖Ｘとオリゴヌクレオチド鎖Ｙとで形成される２本鎖オリゴヌクレオチドタグを表し、
Ｃは、式（Ｉ）

【化3】

（式中、Ｅ、ＬＰ、Ｌ、ＤおよびＦは、請求項１又は２と同じ意味を表し、ただし、ＤはＡｎと直接結合するか、または２官能性スペーサーを介して結合し、ＥとＦとは２本鎖オリゴヌクレオチドタグＢｎのそれぞれ対応する末端側に結合する。）
で表される、
請求項１又は２に記載の化合物。

【請求項4】

Ｂｎが、オリゴヌクレオチド鎖Ｘとオリゴヌクレオチド鎖Ｙとで形成される２本鎖オリゴヌクレオチドタグであり、かつ、Ａｎの構造を同定することができる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを含む部分構造である、請求項３に記載の化合物。

【請求項5】

ｐとｑの総数が２～２０である、請求項１～４のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項6】

ｐとｑの総数が２～１０である、請求項５に記載の化合物。

【請求項7】

ｐとｑの総数が２～７である、請求項６に記載の化合物。

【請求項8】

ｐとｑの総数が０である、請求項１～４のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項9】

ＬＰ１、ＬＰ２およびＬＳが、それぞれ以下の構造：
（Ａ）ヌクレオチド
または
（Ｂ）以下の（Ｂ１１）から（Ｂ１５）を要件とする核酸アナログ
（Ｂ１１）リン酸（または相当部位）および水酸基（またはその相当部位）を有する、
（Ｂ１２）炭素、水素、酸素、窒素、リン又は硫黄により構成される、
（Ｂ１３）分子量が１４２から１５００である、
（Ｂ１４）残基間原子数が３～３０である、
（Ｂ１５）残基間の原子の結合様式は、全て単結合であるか、または１乃至２つの二重結合を含み残りは単結合である、
から単独もしくは異なって選ばれる構造である、請求項１～７のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項10】

ＬＰ１、ＬＰ２およびＬＳが、それぞれ以下の構造：
（Ａ）ヌクレオチド
または
（Ｂ）以下の（Ｂ２１）から（Ｂ２５）を要件とする核酸アナログ
（Ｂ２１）リン酸および水酸基を有する、
（Ｂ２２）炭素、水素、酸素、窒素又はリンにより構成される、
（Ｂ２３）分子量が１４２から１０００である、
（Ｂ２４）残基間原子数が３～１５である、
（Ｂ２５）残基間の原子の結合様式は、全て単結合である、
から単独もしくは異なって選ばれる構造である、請求項１～７及び９のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項11】

ＬＰ１、ＬＰ２およびＬＳが、それぞれ以下の構造：
（Ａ）ヌクレオチド
または
（Ｂ）以下の（Ｂ３１）から（Ｂ３５）を要件とする核酸アナログ
（Ｂ３１）リン酸および水酸基を有する、
（Ｂ３２）炭素、水素、酸素、窒素又はリンにより構成される、
（Ｂ３３）分子量が１４２から７００である、
（Ｂ３４）残基間原子数が４～７である、
（Ｂ３５）残基間の原子の結合様式は、全て単結合である、
から単独もしくは異なって選ばれる構造である、請求項１～７、９及び１０のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項12】

ＬＰ１およびＬＰ２が、それぞれ以下：
（Ｂ４１）d-Spacer、
（Ｂ５）ポリアルキレングリコールリン酸エステル
のいずれかである、請求項１～７及び９～１１のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項13】

ＬＰ１およびＬＰ２が、それぞれジエチレングリコールリン酸エステルまたはトリエチレングリコールリン酸エステルである、請求項１～７及び９～１２のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項14】

ＬＰ１およびＬＰ２が、それぞれトリエチレングリコールリン酸エステルである、請求項１～７及び９～１３のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項15】

ＬＰ１およびＬＰ２が、それぞれd-Spacerである、請求項１～７及び９～１２のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項16】

ＬＰ１およびＬＰ２が、それぞれヌクレオチドである、請求項１～７及び９～１１のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項17】

ＬＳが、式（ａ）～式（ｇ）：

【化4】

（式中、＊はリンカーとの結合位置を意味し、＊＊はＬＰ１又はＬＰ２との結合位置を意味し、Ｒは、水素原子またはメチル基である。）
のいずれかである、請求項１～７及び９～１６のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項18】

ＬＳが、式（ｈ）：

【化5】

（式中、＊はリンカーとの結合位置を意味し、＊＊はＬＰ１又はＬＰ２との結合位置を意味する）
である、請求項１～７及び９～１６のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項19】

ＬＳが、ポリアルキレングリコールリン酸エステルである、請求項１～１６のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項20】

ＬＳが、式（ｉ）～式（ｋ）：

【化6】

（式中、ｎ１、ｍ１、ｐ１、及びｑ１はそれぞれ独立して、１～２０の整数であり、＊はリンカーとの結合位置を意味し、＊＊はＬＰ１又はＬＰ２との結合位置を意味する。）
である、請求項１～７及び９～１６のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項21】

ＬＳが、式（ｌ）：

【化7】

（式中、＊はリンカーとの結合位置を意味し、＊＊はＬＰ１又はＬＰ２との結合位置を意味する）
である、請求項１～７及び９～１６のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項22】

ＬＳが、（Ｂ４２）、（Ｂ４３）又は（Ｂ４４）：
（Ｂ４２）Amino C6 dT
（Ｂ４３）mdC（TEG-Amino）
（Ｂ４４）Uni-Link（商標登録）Amino Modifier
のいずれかである、請求項１～１６のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項23】

ＬＳが、ヌクレオチドである、請求項１～１６のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項24】

ＬＳが、（Ｃ）置換基を有してもよいＣ１～１４の３価の基であり、（Ｃ）が以下の構造：
（１）置換基を有してもよく、１～３個のヘテロ原子で置き換えられてもよいＣ１～１０脂肪族炭化水素、
（２）置換基を有してもよいＣ６～１４芳香族炭化水素、
（３）置換基を有してもよいＣ２～９芳香族複素環、または
（４）置換基を有してもよいＣ２～９非芳香族複素環
のいずれかである、請求項１～８及び１２～１６のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項25】

ＬＳが、（Ｃ）置換基を有してもよいＣ１～１４の３価の基であり、（Ｃ）が以下の構造：
（１）置換基を有してもよいＣ１～６脂肪族炭化水素、
（２）置換基を有してもよいＣ６～１０芳香族炭化水素、または
（３）置換基を有してもよいＣ２～５芳香族複素環
のいずれかである請求項１～８及び１２～１６のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項26】

ＬＳが、（Ｃ）置換基を有してもよいＣ１～１４の３価の基であり、（Ｃ）が以下の構造：
（１）Ｃ１～６脂肪族炭化水素、
（２）ベンゼン、または
（３）Ｃ２～５含窒素芳香族複素環
ここで、前記（１）～（３）は無置換であるか、または置換基群ＳＴ１から単独もしくは異なって選ばれる１～３個の置換基で置換されてもよく、置換基群ＳＴ１は、Ｃ１～６アルキル基、Ｃ１～６アルコキシ基、フッ素原子および塩素原子により構成される群であり、ただし、置換基群ＳＴ１が脂肪族炭化水素に置換する場合、置換基群ＳＴ１からアルキル基は選択されない、
のいずれかである請求項１～８及び１２～１６のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項27】

ＬＳが、（Ｃ）置換基を有してもよいＣ１～１４の３価の基であり、（Ｃ）が以下の構造：
（１）Ｃ１～６アルキル基、または
（２）無置換であるか１つまたは２つのＣ１～３アルキル基若しくはＣ１～３アルコキシ基で置換されたベンゼン
のいずれかである請求項１～８及び１２～１６のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項28】

ＬＳが、（Ｃ）置換基を有してもよいＣ１～１４の３価の基であり、（Ｃ）が以下の構造：
（１）Ｃ１～６アルキル基
である、請求項１～８及び１２～１６のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項29】

ＥおよびＦが、それぞれ独立してヌクレオチド又は核酸アナログにより構成されるオリゴマーであり、
ＥおよびＦの鎖長が、それぞれ３乃至４０である、
請求項１～２８のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項30】

ＥおよびＦが、それぞれ独立してヌクレオチド又は核酸アナログにより構成されるオリゴマーであり、
ＥおよびＦの鎖長が、それぞれ４乃至３０である
請求項１～２９のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項31】

ＥおよびＦが、それぞれ独立してヌクレオチド又は核酸アナログにより構成されるオリゴマーであり、
ＥおよびＦの鎖長が、それぞれ６乃至２５である
請求項１～３０のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項32】

ＥおよびＦが、それぞれ独立してヌクレオチド又は核酸アナログにより構成されるオリゴマーであり、
ＥとＦが互いに相補的な塩基配列を含み、二重鎖オリゴヌクレオチドを形成し、
ＥとＦの二重鎖オリゴヌクレオチドが突出末端である、
請求項１～３１のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項33】

前記突出末端の突出部が、２塩基以上の長さである、請求項３２に記載の化合物。

【請求項34】

ＥおよびＦが、それぞれ独立してヌクレオチド又は核酸アナログにより構成されるオリゴマーであり、
ＥとＦが互いに相補的な塩基配列を含み、二重鎖オリゴヌクレオチドを形成し、
ＥとＦの二重鎖オリゴヌクレオチドが平滑末端である、
請求項１～３１のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項35】

ＥとＦに含まれる、互いに相補的な塩基配列の鎖長が、それぞれ３塩基以上である、請求項１～３４のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項36】

ＥとＦに含まれる、互いに相補的な塩基配列の鎖長が、それぞれ４塩基以上である、請求項１～３５のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項37】

ＥとＦに含まれる、互いに相補的な塩基配列の鎖長が、それぞれ６塩基以上である、請求項１～３６のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項38】

ＥおよびＦが、それぞれ独立してヌクレオチドにより構成されるオリゴマーである、請求項１～３７のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項39】

ヌクレオチドが、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドである、請求項１～３８のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項40】

ヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチドである、請求項１～３９のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項41】

ヌクレオチドが、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、チミジン、又はデオキシシチジンである、請求項１～４０のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項42】

ＥおよびＦが、それぞれ独立して核酸アナログにより構成されるオリゴマーである、請求項１～３７のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項43】

Ｌが、
（１）置換基を有してもよく、１～３個のヘテロ原子で置き換えられてもよいＣ１～２０脂肪族炭化水素、
又は
（２）置換基を有してもよいＣ６～１４芳香族炭化水素
である、請求項１～４２のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項44】

Ｌが、置換基を有してもよいＣ１～６脂肪族炭化水素、１若しくは２個の酸素原子で置き換えられてもよいＣ１～６脂肪族炭化水素、又は置換基を有してもよいＣ６～１０芳香族炭化水素である、請求項１～４３のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項45】

Ｌが、置換基群ＳＴ１で置換可能なＣ１～６脂肪族炭化水素、又は置換基群ＳＴ１で置換可能なベンゼンであり、ここで、置換基群ＳＴ１は、Ｃ１～６アルキル基、Ｃ１～６アルコキシ基、フッ素原子および塩素原子により構成される群である（ただし、置換基群ＳＴ１が脂肪族炭化水素に置換する場合、置換基群ＳＴ１からアルキル基は選択されない。）、請求項１～４４のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項46】

Ｌが、Ｃ１～６アルキレン基、又は無置換であるか１つまたは２つのＣ１～３アルキル基若しくはＣ１～３アルコキシ基で置換されたベンゼンである、請求項１～４５のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項47】

Ｌが、Ｃ１～６アルキレン基である、請求項１～４６のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項48】

Ｄの反応性官能基が、Ｃ―Ｃ、アミノ、エーテル、カルボニル、アミド、エステル、ウレア、スルフィド、ジスルフィド、スルホキシド、スルホンアミド、又はスルホニル結合を構成しうる反応性官能基である、請求項１～４７のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項49】

Ｄの反応性官能基が、脱離基を有するＣ１炭化水素、アミノ基、水酸基、カルボニル基の前駆体、チオール基、又はアルデヒド基である、請求項１～４８のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項50】

Ｄの反応性官能基が、ハロゲン原子を有するＣ１炭化水素、スルホン酸系脱離基を有するＣ１炭化水素、アミノ基、水酸基、カルボキシ基、ハロゲン化カルボキシ基、チオール基、又はアルデヒド基である、請求項１～４９のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項51】

Ｄの反応性官能基が、－ＣＨ_２Ｃｌ、－ＣＨ_２Ｂｒ、－ＣＨ_２ＯＳＯ_２ＣＨ_３、－ＣＨ_２ＯＳＯ_２ＣＦ_３、アミノ基、水酸基、又はカルボキシ基である、請求項１～５０のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項52】

Ｄの反応性官能基が、第１級アミノ基である、請求項１～５１のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項53】

選択的に切断可能な部位が、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、チミジン、及びデオキシシチジンのいずれでもないデオキシリボヌクレオシドである、請求項１～５２のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項54】

選択的に切断可能な部位が、デオキシウリジン、ブロモデオキシウリジン、デオキシイノシン、８－ヒドロキシデオキシグアノシン、３－メチル－２’－デオキシアデノシン、Ｎ６－エテノ－２’－デオキシアデノシン、７－メチル－２’－デオキシグアノシン、２’－デオキシキサントシン、又は５，６－ジヒドロキシ－５，６ジヒドロデオキシチミジンである、請求項１～５３のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項55】

選択的に切断可能な部位が、デオキシウリジン、又はデオキシイノシンである、請求項５４に記載の化合物。

【請求項56】

選択的に切断可能な部位が、デオキシウリジンである、請求項５５に記載の化合物。

【請求項57】

選択的に切断可能な部位が、デオキシイノシンである、請求項５５に記載の化合物。

【請求項58】

選択的に切断可能な部位が、デオキシイノシンから３‘方向に２番目のホスホジエステル結合である、請求項１～５２のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項59】

選択的に切断可能な部位が、リボヌクレオシドである、請求項１～５２のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項60】

選択的に切断可能な部位が、１つである、請求項１～５９のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項61】

少なくとも１つの切断可能な部位を、Ｅ又は（ＬＰ１）ｐに含み、かつ少なくとも１つの切断可能な部位を、Ｆ又は（ＬＰ２）ｑに含む、請求項１～５９のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項62】

Ｅ又は（ＬＰ１）ｐに含まれる切断可能な部位と、Ｆ又は（ＬＰ２）ｑに含まれる切断可能な部位が異なる条件で切断可能である、請求項６１に記載の化合物。

【請求項63】

Ａｎがｎ個のビルディングブロックα１～αｎ（ｎは、２～１０の整数である。）により構築され、ビルディングブロックが分子量５００以下である、請求項１～６２のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項64】

前記分子量が３００以下である、請求項６３に記載の化合物。

【請求項65】

前記分子量が１５０以下である、請求項６４に記載の化合物。

【請求項66】

Ａｎが、Ｈ、Ｂ、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓｉ、Ｐ、Ｓ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩからなる元素群より単独又は異なって選ばれる元素を含む低分子有機化合物である、請求項１～６５のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項67】

Ａｎが、アリール基、非芳香族シクリル基、ヘテロアリール基及び非芳香族ヘテロシクリル基からなる置換基群より単独又は異なって選ばれる置換基を有する低分子有機化合物である、請求項１～６６のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項68】

Ａｎが、分子量５０００以下である、請求項１～６２のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項69】

Ａｎが、分子量８００以下である、請求項６８に記載の化合物。

【請求項70】

Ａｎが、分子量５００以下である、請求項６９に記載の化合物。

【請求項71】

Ｓｐが結合である、請求項１～７０のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項72】

Ｓｐが２官能性スペーサーであり、
該２官能性スペーサーがＳｐＤ－ＳｐＬ－ＳｐＸであり、
ＳｐＤが、Ｃ―Ｃ、アミノ、エーテル、カルボニル、アミド、エステル、ウレア、スルフィド、ジスルフィド、スルホキシド、スルホンアミド、又はスルホニル結合を構成しうる反応性基由来の２価の基であり、
ＳｐＬが、ポリアルキレングリコール、ポリエチレン、任意にヘテロ原子で置き換えられてもよいＣ１～２０脂肪族炭化水素、ペプチド、オリゴヌクレオチド、またはこれらの組み合わせあり、
ＳｐＸが、アミノ、カルボニル、アミド、エステル、ウレア、又はスルホンアミド結合を形成する反応基由来の２価の基である、
請求項１～７０のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項73】

Ｓｐが２官能性スペーサーであり、
該２官能性スペーサーがＳｐＤ－ＳｐＬ－ＳｐＸであり、
ＳｐＤが、第一級アミノ基由来の２価の基であり、
ＳｐＬが、ポリエチレングリコール、またはポリエチレンであり、
ＳｐＸが、カルボキシ基由来の２価の基である、
請求項１～７０のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項74】

オリゴヌクレオチド鎖Ｘとオリゴヌクレオチド鎖Ｙとが、二重鎖を形成可能な配列である、請求項１～７３のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項75】

オリゴヌクレオチド鎖Ｘとオリゴヌクレオチド鎖Ｙとが、相補的な塩基配列を含む、請求項１～７４のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項76】

オリゴヌクレオチド鎖Ｘとオリゴヌクレオチド鎖Ｙとが、それぞれ１～２００塩基の長さである、請求項１～７５のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項77】

オリゴヌクレオチド鎖Ｘとオリゴヌクレオチド鎖Ｙとが、それぞれ３～１５０塩基の長さである、請求項１～７６のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項78】

オリゴヌクレオチド鎖Ｘとオリゴヌクレオチド鎖Ｙとが、それぞれ３０～１５０塩基の長さである、請求項１～７７のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項79】

オリゴヌクレオチド鎖Ｘとオリゴヌクレオチド鎖Ｙとが、平滑末端を有する、請求項１～７８のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項80】

オリゴヌクレオチド鎖Ｘとオリゴヌクレオチド鎖Ｙとが、突出末端を有する、請求項１～７８のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項81】

突出末端の突出部が、１～３０塩基の長さである、請求項８０に記載の化合物。

【請求項82】

突出末端の突出部が、２～５塩基の長さである、請求項８１に記載の化合物。

【請求項83】

オリゴヌクレオチド鎖Ｘとオリゴヌクレオチド鎖Ｙとが、突出末端を有し、当該突出末端に、さらに特定分子識別配列が結合する、請求項８０～８２のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項84】

ＸおよびＹのいずれか一方に、機能性分子が結合した、請求項１～８３のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項85】

ＸおよびＹのいずれか一方に、ビオチンが結合した、請求項１～８３のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項86】

請求項１～８５のいずれか１項に記載の化合物を含む、化合物ライブラリ。

【請求項87】

請求項１～８５のいずれか１項に記載の化合物を含む、ＤＮＡコード化ライブラリ。

【請求項88】

１０００以上の異なる化合物により構成される、請求項８６又は８７に記載のライブラリ。

【請求項89】

請求項３～８５のいずれか１項に記載の化合物であるＡｎ－Ｓｐ－Ｃ－Ｂｎの製造方法であって、
Ａｎは、ｎ個のビルディングブロックα１～αｎ（ｎは、２～１０の整数である。）により構築される低分子有機化合物又はポリペプチドであり、
Ｓｐは、結合又は２官能性スペーサーであり、
Ｃは、少なくとも一つの「選択的に切断可能な部位」を有するヘアピン型のヘッドピースであり、
Ｂｎは、Ａｎの構造を同定することができる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを含む部分構造であり、
Ｃに対し、以下の工程；
（ａ）α１－Ｓｐを結合させること、またはＳｐおよびα１を結合させること、及び
（ｂ）α１の構造を同定することができる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドタグを結合させること、
により化合物Ａ１－Ｓｐ－Ｃ－Ｂ１を得ること、
次いで、Ａ（ｍ－１）－Ｓｐ－Ｃ－Ｂ（ｍ－１）（ｍは、２～ｎの整数である）に対し、以下の工程（ｃ）及び（ｄ）を、ｍが２～ｎまで昇順で繰り返すこと；
（ｃ）Ａ（ｍ－１）部分にαｍを結合させること、及び
（ｄ）Ｂ（ｍ－１）部分の末端にαｍの構造を同定することができる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドタグを結合させること
により化合物Ａｎ－Ｓｐ－Ｃ－Ｂｎを得ることを含み、
工程（ａ）及び（ｂ）、工程（ｃ）及び（ｄ）は、任意の順序で行うことができる、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、切断可能な部位をＤＮＡ鎖中に含むＤＮＡコード化ライブラリに関する。

【背景技術】

【0002】

化合物ライブラリとは、医薬品候補化合物など、特定の活性を有する可能性のある化合物を系統的に集めた化合物誘導体群である。この化合物ライブラリは、多くの場合コンビナトリアル化学の合成技術と方法論に基づき合成される。コンビナトリアル化学とは、組み合わせ論に基づいて列挙し設計された一連の化合物ライブラリを系統的な合成経路で効率的に多品種合成するための実験手法とそれに関する研究分野である。
コンビナトリアル化学に基づく化合物ライブラリの一つの種として、ＤＮＡコード化ライブラリがある。以下、ＤＮＡコード化ライブラリを適宜ＤＥＬと略す。ＤＥＬでは、ライブラリ化された各化合物に、ＤＮＡのタグが付加される。ＤＮＡのタグは、各化合物の各構造を同定できるように配列が設計されており、化合物の標識として機能する（特許文献１乃至３）。
従来知られているＤＥＬのＤＮＡ鎖構造は、２本鎖とヘアピン鎖の２つが代表的である。
以下、２本鎖ＤＥＬとヘアピン鎖ＤＥＬの概要と長所短所について概説する。
（１）ヘアピン鎖ＤＥＬ
ヘアピン鎖ＤＮＡをもちいるＤＥＬは、相補的な２本のＤＮＡ鎖がつながった１本鎖構造であり、種々のビルディングブロック導入のための官能基を有するヘアピン型ＤＮＡを出発原料（ヘッドピース）として用いて合成される（特許文献３、非特許文献１及２）。
（Ａ）長所
（ａ）短いＤＮＡタグが使用できる。
本手法では、多くの場合、２ｍｅｒの粘着末端を有する９～１３ｍｅｒ程度の比較的短い２本鎖ＤＮＡタグが使用されており、２本鎖ＤＮＡタグはＤＮＡリガーゼによるライゲーション反応により導入される。このような短いＤＮＡタグの使用は、ヘアピン鎖ＤＮＡが分子内で強く二重鎖を形成し、粘着末端以外のＤＮＡ部位がＤＮＡタグと干渉しないことにより可能となっている。短い２本鎖ＤＮＡタグの使用は、ＤＥＬ合成において、いくつかの利点を有する。一つの利点として、ＤＮＡタグの合成にかかるコストが低いことが挙げられる。また、もう一つの利点として、より短いＤＮＡタグの使用は、同じ反応サイクル数をコードする場合、ＤＥＬの全長が短く抑えられることが挙げられる。すなわち、より多くのサイクル数をコードしても、次世代シーケンサーによって効率的にＤＮＡ配列を読み取り可能な範囲までＤＥＬの全長を抑えられる。実際に非特許文献３では、ヘアピン鎖ＤＮＡをもちいることにより、６サイクルもの反応をコードしたヘアピン鎖ＤＮＡをもちいたＤＥＬの構築が達成されている。
（ｂ）化学的安定性が高い
２本鎖と異なりヘアピン鎖では、加熱反応中に二重鎖構造が融解しても、その後の再アニール条件下で、鎖交換を生じることなく、元の分子内での二重鎖が再形成される。したがって、ヘアピン鎖ＤＮＡをもちいるＤＥＬは、より広範な化学条件で使用可能という利点を有する（非特許文献２）。また、一般に核酸鎖は、同じ鎖長であればヘアピン鎖の方が２本鎖よりも強く二重鎖を形成する（Ｔｍ値が高い）。したがって、ビルディングブロック導入時の種々の化学的条件下において、ヘアピン鎖ＤＮＡの各化学構造、特に塩基部の構造は２本鎖に比べ構造変換に抵抗するはずである。
（Ｂ）短所
ヘアピン鎖ＤＮＡは、その強い二重鎖形成能がゆえ、二重鎖を融解させプライマーオリゴヌクレオチドを結合させてポリメラーゼ反応開始させることが難しく、ＰＣＲ効率が低いという課題を有している（特許文献４）。
（２）２本鎖ＤＥＬ
２本鎖ＤＮＡをもちいるＤＥＬは、種々のビルディングブロック導入のための官能基を有する１本鎖ＤＮＡ（ヘアピン鎖でない１本鎖ＤＮＡ）又は２本鎖ＤＮＡを出発原料（ヘッドピース）として合成される。
（Ａ）短所
ヘアピン鎖ＤＮＡをもちいるＤＥＬと対照的に、多くの場合、４～１０ｍｅｒの粘着末端を有する２０～３０ｍｅｒ程度の比較的長い１本鎖または２本鎖ＤＮＡタグが使用されおり（特許文献２、非特許文献４）、３サイクル程度の反応をコードしたＤＥＬが一般的である。
（Ｂ）長所
２本鎖ＤＮＡをもちいるＤＥＬは、ＰＣＲ効率の観点ではヘアピン鎖ＤＮＡのような課題を有していない。さらに、ヘアピン鎖ＤＮＡと異なり、２本鎖ＤＮＡは変性により１本鎖ＤＮＡにすること、もしくは鎖交換反応を実施することが可能であり、様々用途に即したＤＮＡ構造に変換することで、幅広い評価手法に適応できるという利点を有する。例えばＤＮＡの２本鎖形成能を利用した感度比の高い評価手法が開発されている（非特許文献５及６）。

【0003】

このように、ヘアピン鎖ＤＮＡと２本鎖ＤＮＡは、それぞれＤＥＬの合成時、評価時において長所を有するものの、長所を両立する技術は知られていない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【文献】国際公開第９３／２０２４３号

【文献】国際公開第２００４／０３９８２５号

【文献】国際公開第２００５／０５８４７９号

【文献】国際公開第２０１０／０９４０３６号

【非特許文献】

【0005】

【文献】ネイチャー・ケミカル・バイオロジー、２００９年、５巻、６４７－６５４頁

【文献】Ａ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｆｏｒ ＤＮＡ－Ｅｎｃｏｄｅｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｒｏｂｅｒｔ Ａ．Ｇｏｏｄｎｏｗ，Ｊｒ．編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．

【文献】エーシーエス・ケミカル・バイオロジー、２０１８年、１３巻、５３－５９頁

【文献】ネイチャー・ケミストリー、２０１８年、１０巻、４４１－４４８頁

【文献】アニューアル・レビュー・オブ・バイオケミストリー、２０１８年、８７巻、４７９－５０２頁

【文献】エーシーエス・コンビナトリアル・サイエンス、２０２０年、２２巻、２０４－２１２頁

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明は切断可能な部位をＤＮＡ鎖中に含むＤＥＬ、およびＤＥＬの製造方法を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0007】

ＤＮＡなどの核酸化学の一つとして核酸の切断技術がある。例えば、ＤＮＡ鎖中にデオキシウリジンを導入すると、ＵＳＥＲ（登録商標）酵素により選択的に切断することができる。
本発明者は、鋭意研究の結果、例えばデオキシウリジンのような切断可能な部位をＤＮＡ鎖中に導入することで、ヘアピン鎖ＤＮＡと２本鎖ＤＮＡの長所を両立できることを見出し、本発明を完成させた。
したがって、本発明は、以下のとおりである。

【0008】

［１］ 式（Ｉ）

【化1】

（式中、
ＥおよびＦは、それぞれ独立して
ヌクレオチド又は核酸アナログにより構成されるオリゴマーであり、
ただし、ＥとＦが互いに相補的な塩基配列を含み、二重鎖オリゴヌクレオチドを形成し、
ＬＰは、ループ部位であり、
Ｌは、リンカーであり、
Ｄは、反応性官能基である。）
で表される化合物であり、
Ｅ、Ｆ、又はＬＰの少なくともいずれか１つの部位に、少なくとも１つの選択的に切断可能な部位を有する化合物。
［２］ ［１］に記載の化合物を含む、化合物ライブラリのヘッドピースの調製に用いるための組成物。
［３］ ［１］に記載の化合物を含む、ＤＮＡコード化ライブラリのヘッドピースの調製に用いるための組成物。
［４］ 式（Ｉ）

【化2】

（式中、
ＥおよびＦは、それぞれ独立して
ヌクレオチド又は核酸アナログにより構成されるオリゴマーであり、
ただし、ＥとＦが互いに相補的な塩基配列を含み、二重鎖オリゴヌクレオチドを形成し、
ＬＰは、ループ部位であり、
Ｌは、リンカーであり、
Ｄは、反応性官能基である。）
で表される化合物であり、
Ｅ、Ｆ、又はＬＰの少なくともいずれか１つの部位に、少なくとも１つの選択的に切断可能な部位を有し、
化合物ライブラリのヘッドピースとして用いる化合物。
［５］ 式（Ｉ）

【化3】

（式中、
ＥおよびＦは、それぞれ独立して
ヌクレオチド又は核酸アナログにより構成されるオリゴマーであり、
ただし、ＥとＦが互いに相補的な塩基配列を含み、二重鎖オリゴヌクレオチドを形成し、
ＬＰは、ループ部位であり、
Ｌは、リンカーであり、
Ｄは、反応性官能基である。）
で表される化合物であり、
Ｅ、Ｆ、又はＬＰの少なくともいずれか１つの部位に、少なくとも１つの選択的に切断可能な部位を有し、
ＤＮＡコード化ライブラリのヘッドピースとして用いる化合物。
［６］ 式（Ｉ）

【化4】

（式中、
ＥおよびＦは、それぞれ独立して
ヌクレオチド又は核酸アナログにより構成されるオリゴマーであり、
ただし、ＥとＦが互いに相補的な塩基配列を含み、二重鎖オリゴヌクレオチドを形成し、
ＬＰは、ループ部位であり、
Ｌは、リンカーであり、
Ｄは、反応性官能基である。）
で表される化合物であり、
Ｅ、Ｆ、又はＬＰの少なくともいずれか１つの部位に、少なくとも１つの選択的に切断可能な部位を有する化合物ライブラリのヘッドピース。
［７］ 式（Ｉ）

【化5】

（式中、
ＥおよびＦは、それぞれ独立して
ヌクレオチド又は核酸アナログにより構成されるオリゴマーであり、
ただし、ＥとＦが互いに相補的な塩基配列を含み、二重鎖オリゴヌクレオチドを形成し、
ＬＰは、ループ部位であり、
Ｌは、リンカーであり、
Ｄは、反応性官能基である。）
で表される化合物であり、
Ｅ、Ｆ、又はＬＰの少なくともいずれか１つの部位に、少なくとも１つの選択的に切断可能な部位を有するＤＮＡコード化ライブラリのヘッドピース。
［８］
式（ＩＩ）

【化6】

（式中、
ＸおよびＹは、オリゴヌクレオチド鎖であり、
ＥおよびＦは、それぞれ独立して
ヌクレオチド又は核酸アナログにより構成されるオリゴマーであり、
ただし、ＥとＦが互いに相補的な塩基配列を含み、二重鎖オリゴヌクレオチドを形成し、
ＬＰは、ループ部位であり、
Ｌは、リンカーであり、
Ｄは、反応性官能基由来の２価の基であり、
Ｓｐは、結合又は２官能性スペーサーであり、
Ａｎは、少なくとも１つのビルディングブロックにより構成される部分構造である。）
で表される化合物であり、
ＸとＹは、少なくとも一部で二重鎖を形成しうる配列を有し、
Ｘは５‘末端でＥに結合し、
Ｙは３‘末端でＦに結合し、
Ｅ、Ｆ、又はＬＰの少なくともいずれか１つの部位に、少なくとも１つの選択的に切断可能な部位を有する化合物。
［９］
式（ＩＩＩ）
Ａｎ－Ｓｐ－Ｃ－Ｂｎ （ＩＩＩ）
（式中、
ＡｎおよびＳｐは、［８］と同じ意味を表し、
Ｂｎは、オリゴヌクレオチド鎖Ｘとオリゴヌクレオチド鎖Ｙとで形成される２本鎖オリゴヌクレオチドタグを表し、
Ｃは、式（Ｉ）

【化7】

（式中、Ｅ、ＬＰ、Ｌ、ＤおよびＦは、［８］と同じ意味を表し、ただしＤはＳｐに結合し、ＥとＦとは２本鎖オリゴヌクレオチドタグＢｎのそれぞれ対応する末端側に結合する。）
で表される、
［８］に記載の化合物。
［１０］ Ａｎが、［８］と同じであり、かつ、ｎ個のビルディングブロックα１～αｎ（ｎは、１～１０の整数である。）により構築される部分構造であり、
Ｂｎが、オリゴヌクレオチド鎖Ｘとオリゴヌクレオチド鎖Ｙとで形成される２本鎖オリゴヌクレオチドタグであり、かつ、Ａｎの構造を同定することができる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを含む部分構造である、
［８］又は［９］に記載の化合物。
［１１］ ＬＰが、
（ＬＰ１）ｐ－ＬＳ－（ＬＰ２）ｑで表されるループ部位であり、
ＬＳは、以下の（Ａ）ないし（Ｃ）に記載される化合物群から選ばれる部分構造であり、
（Ａ）ヌクレオチド
（Ｂ）核酸アナログ
（Ｃ）置換基を有してもよいＣ１～１４の３価の基
ＬＰ１は、以下の（１）および（２）に記載される化合物群から単独もしくは異なってｐ個選ばれる各部分構造であり、
（１）ヌクレオチド
（２）核酸アナログ
ＬＰ２は、以下の（１）および（２）に記載される化合物群から単独もしくは異なってｑ個選ばれる各部分構造であり、
（１）ヌクレオチド
（２）核酸アナログ
ｐとｑの総数が０～４０である、
［１］、［４］、［５］、［８］～［１０］のいずれかに記載の化合物。
［１２］ ｐとｑの総数が２～２０である、［１１］に記載の化合物。
［１３］ ｐとｑの総数が２～１０である、［１１］に記載の化合物。
［１４］ ｐとｑの総数が２～７である、［１１］に記載の化合物。
［１５］ ｐとｑの総数が０である、［１１］に記載の化合物。
［１６］ ＬＰ１、ＬＰ２およびＬＳが、それぞれ以下の構造：
（Ａ）ヌクレオチド
または
（Ｂ）以下の（Ｂ１１）から（Ｂ１５）を要件とする核酸アナログ
（Ｂ１１）リン酸（または相当部位）および水酸基（またはその相当部位）を有する、
（Ｂ１２）炭素、水素、酸素、窒素、リン又は硫黄により構成される、
（Ｂ１３）分子量が１４２から１５００である、
（Ｂ１４）残基間原子数が３～３０である、
（Ｂ１５）残基間の原子の結合様式は、全て単結合であるか、または１乃至２つの二重結合を含み残りは単結合である、
から単独もしくは異なって選ばれる構造である、［１１］～［１５］のいずれかに記載の化合物。
［１７］ ＬＰ１、ＬＰ２およびＬＳが、それぞれ以下の構造：
（Ａ）ヌクレオチド
または
（Ｂ）以下の（Ｂ２１）から（Ｂ２５）を要件とする核酸アナログ
（Ｂ２１）リン酸および水酸基を有する、
（Ｂ２２）炭素、水素、酸素、窒素又はリンにより構成される、
（Ｂ２３）分子量が１４２から１０００である、
（Ｂ２４）残基間原子数が３～１５である、
（Ｂ２５）残基間の原子の結合様式は、全て単結合である、
から単独もしくは異なって選ばれる構造である、［１１］～［１６］のいずれかに記載の化合物。
［１８］ ＬＰ１、ＬＰ２およびＬＳが、それぞれ以下の構造：
（Ａ）ヌクレオチド
または
（Ｂ）以下の（Ｂ３１）から（Ｂ３５）を要件とする核酸アナログ
（Ｂ３１）リン酸および水酸基を有する、
（Ｂ３２）炭素、水素、酸素、窒素又はリンにより構成される、
（Ｂ３３）分子量が１４２から７００である、
（Ｂ３４）残基間原子数が４～７である、
（Ｂ３５）残基間の原子の結合様式は、全て単結合である、
から単独もしくは異なって選ばれる構造である［１１］～［１７］のいずれかに記載の化合物。
［１９］ ＬＰ１およびＬＰ２が、それぞれ以下：
（Ｂ４１）d-Spacer、
（Ｂ５）ポリアルキレングリコールリン酸エステル
のいずれかである、［１１］～［１８］のいずれかに記載の化合物。
［２０］ ＬＰ１およびＬＰ２が、それぞれジエチレングリコールリン酸エステルまたはトリエチレングリコールリン酸エステルである、［１１］～［１９］のいずれかに記載の化合物。
［２１］ ＬＰ１およびＬＰ２が、それぞれトリエチレングリコールリン酸エステルである、［１１］～［２０］のいずれかに記載の化合物。
［２２］ ＬＰ１およびＬＰ２が、それぞれd-Spacerである、［１１］～［１９］のいずれかに記載の化合物。
［２３］
ＬＰ１およびＬＰ２が、それぞれヌクレオチドである、
［１１］～［１８］のいずれかに記載の化合物。
［２４］ ＬＳが、式（ａ）～式（ｇ）：

【化8】

（式中、＊はリンカーとの結合位置を意味し、＊＊はＬＰ１又はＬＰ２との結合位置を意味し、Ｒは、水素原子またはメチル基である。）
のいずれかである、［１１］～［２３］のいずれかに記載の化合物。
［２５］ ＬＳが、式（ｈ）：

【化9】

（式中、＊はリンカーとの結合位置を意味し、＊＊はＬＰ１又はＬＰ２との結合位置を意味する）
である、［１１］～［２３］のいずれかに記載の化合物。
［２６］ ＬＳが、ポリアルキレングリコールリン酸エステルである、［１１］～［２３］のいずれかに記載の化合物。
［２７］ ＬＳが、式（ｉ）～式（ｋ）：

【化10】

（式中、ｎ１、ｍ１、ｐ１、及びｑ１はそれぞれ独立して、１～２０の整数であり、＊はリンカーとの結合位置を意味し、＊＊はＬＰ１又はＬＰ２との結合位置を意味する）
である、［１１］～［２３］のいずれかに記載の化合物。
［２８］ ＬＳが、式（ｌ）：

【化11】

（式中、＊はリンカーとの結合位置を意味し、＊＊はＬＰ１又はＬＰ２との結合位置を意味する）
である、［１１］～［２３］のいずれかに記載の化合物。
［２９］ ＬＳが、（Ｂ４２）、（Ｂ４３）又は（Ｂ４４）：
（Ｂ４２）Amino C6 dT
（Ｂ４３）mdC（TEG-Amino）
（Ｂ４４）Uni-Link（商標登録）Amino Modifier
のいずれかである、［１１］～［２３］のいずれかに記載の化合物。
［３０］ ＬＳが、ヌクレオチドである、
［１１］～［２３］のいずれかに記載の化合物。
［３１］ ＬＳが、（Ｃ）置換基を有してもよいＣ１～１４の３価の基であり、（Ｃ）が以下の構造：
（１）置換基を有しても良く、１～３個のヘテロ原子で置き換えられても良いＣ１～１０脂肪族炭化水素、
（２）置換基を有してもよいＣ６～１４芳香族炭化水素、
（３）置換基を有してもよいＣ２～９芳香族複素環、 または
（４）置換基を有してもよいＣ２～９非芳香族複素環
のいずれかである、［１１］～［１５］及び［１９］～［２３］のいずれかに記載の化合物。
［３２］ ＬＳが、（Ｃ）置換基を有してもよいＣ１～１４の３価の基であり、（Ｃ）が以下の構造：
（１）置換基を有しても良いＣ１～６脂肪族炭化水素、
（２）置換基を有しても良いＣ６～１０芳香族炭化水素、または
（３）置換基を有してもよいＣ２～５芳香族複素環
のいずれかである［１１］～［１５］及び［１９］～［２３］のいずれかに記載の化合物。
［３３］ ＬＳが、（Ｃ）置換基を有してもよいＣ１～１４の３価の基であり、（Ｃ）が以下の構造：
（１）Ｃ１～６脂肪族炭化水素、
（２）ベンゼン、または
（３）Ｃ２～５含窒素芳香族複素環
ここで、前記（１）～（３）は無置換であるか、または置換基群ＳＴ１から単独もしくは異なって選ばれる１～３個の置換基で置換されてもよく、置換基群ＳＴ１は、Ｃ１～６アルキル基、Ｃ１～６アルコキシ基、フッ素原子および塩素原子により構成される群であり、ただし、置換基群ＳＴ１が脂肪族炭化水素に置換する場合、置換基群ＳＴ１からアルキル基は選択されない、
のいずれかである［１１］～［１５］及び［１９］～［２３］のいずれかに記載の化合物。
［３４］ ＬＳが、（Ｃ）置換基を有してもよいＣ１～１４の３価の基であり、（Ｃ）が以下の構造：
（１）Ｃ１～６アルキル基、または
（２）無置換であるか１つまたは２つのＣ１～３アルキル基若しくはＣ１～３アルコキシ基で置換されたベンゼン
のいずれかである［１１］～［１５］及び［１９］～［２３］のいずれかに記載の化合物。
［３５］ ＬＳが、（Ｃ）置換基を有してもよいＣ１～１４の３価の基であり、（Ｃ）が以下の構造：
（１）Ｃ１～６アルキル基
である、［１１］～［１５］及び［１９］～［２３］のいずれかに記載の化合物。
［３６］ ＥおよびＦが、それぞれ独立してヌクレオチド又は核酸アナログにより構成されるオリゴマーであり、
ＥおよびＦの鎖長が、それぞれ３乃至４０である、
［１］、［４］、［５］、［８］～［３５］のいずれかに記載の化合物。
［３７］ ＥおよびＦが、それぞれ独立してヌクレオチド又は核酸アナログにより構成されるオリゴマーであり、
ＥおよびＦの鎖長が、それぞれ４乃至３０である
［１］、［４］、［５］、［８］～［３６］のいずれかに記載の化合物。
［３８］ ＥおよびＦが、それぞれ独立してヌクレオチド又は核酸アナログにより構成されるオリゴマーであり、
ＥおよびＦの鎖長が、それぞれ６乃至２５である
［１］、［４］、［５］、［８］～［３７］のいずれかに記載の化合物。
［３９］ ＥおよびＦが、それぞれ独立してヌクレオチド又は核酸アナログにより構成されるオリゴマーであり、
ＥとＦが互いに相補的な塩基配列を含み、二重鎖オリゴヌクレオチドを形成し、
ＥとＦの二重鎖オリゴヌクレオチドが突出末端である、
［１］、［４］、［５］、［８］～［３８］のいずれかに記載の化合物。
［４０］ 前記突出末端の突出部が、２塩基以上の長さである、［３９］に記載の化合物。
［４１］ ＥおよびＦが、それぞれ独立してヌクレオチド又は核酸アナログにより構成されるオリゴマーであり、
ＥとＦが互いに相補的な塩基配列を含み、二重鎖オリゴヌクレオチドを形成し、
ＥとＦの二重鎖オリゴヌクレオチドが平滑末端である、
［１］、［４］、［５］、［８］～［３８］のいずれかに記載の化合物。
［４２］ ＥとＦに含まれる、互いに相補的な塩基配列の鎖長が、それぞれ３塩基以上 である、
［１］、［４］、［５］、［８］～［４１］のいずれかに記載の化合物。
［４３］ ＥとＦに含まれる、互いに相補的な塩基配列の鎖長が、それぞれ４塩基以上である、
［１］、［４］、［５］、［８］～［４２］のいずれかに記載の化合物。
［４４］ ＥとＦに含まれる、互いに相補的な塩基配列の鎖長が、それぞれ６塩基以上である、
［１］、［４］、［５］、［８］～［４３］のいずれかに記載の化合物。
［４５］ ＥおよびＦが、それぞれ独立してヌクレオチドにより構成されるオリゴマーである、［１］、［４］、［５］、［８］～［４４］のいずれかに記載の化合物。
［４６］ ヌクレオチドが、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドである、
［１］、［４］、［５］、［８］～［４５］のいずれかに記載の化合物。
［４７］ ヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチドである、
［１］、［４］、［５］、［８］～［４６］のいずれかに記載の化合物。
［４８］ ヌクレオチドが、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、チミジン、又はデオキシシチジンである、
［１］、［４］、［５］、［８］～［４７］のいずれかに記載の化合物。
［４９］ ＥおよびＦが、それぞれ独立して核酸アナログにより構成されるオリゴマーである、［１］、［４］、［５］、［８］～［４４］のいずれかに記載の化合物。
［５０］ Ｌが、
（１）置換基を有しても良く、１～３個のヘテロ原子で置き換えられても良いＣ１～２０脂肪族炭化水素、
又は
（２）置換基を有してもよいＣ６～１４芳香族炭化水素
である、［１］、［４］、［５］、［８］～［４９］のいずれかに記載の化合物。
［５１］ Ｌが、置換基を有しても良いＣ１～６脂肪族炭化水素、１若しくは２個の酸素原子で置き換えられても良いＣ１～６脂肪族炭化水素、又は置換基を有しても良いＣ６～１０芳香族炭化水素である、［１］、［４］、［５］、［８］～［５０］のいずれかに記載の化合物。
［５２］ Ｌが、置換基群ＳＴ１で置換可能なＣ１～６脂肪族炭化水素、又は置換基群ＳＴ１で置換可能なベンゼンであり、ここで、置換基群ＳＴ１は、Ｃ１～６アルキル基、Ｃ１～６アルコキシ基、フッ素原子および塩素原子により構成される群である（ただし、置換基群ＳＴ１が脂肪族炭化水素に置換する場合、置換基群ＳＴ１からアルキル基は選択されない。）、［１］、［４］、［５］、［８］～［５１］のいずれかに記載の化合物。
［５３］ Ｌが、Ｃ１～６アルキル基、又は無置換であるか１つまたは２つのＣ１～３アルキル基若しくはＣ１～３アルコキシ基で置換されたベンゼンである、［１］、［４］、［５］、［８］～［５２］のいずれかに記載の化合物。
［５４］ Ｌが、Ｃ１～６アルキル基である、［１］、［４］、［５］、［８］～［５３］のいずれかに記載の化合物。
［５５］ Ｄの反応性官能基が、
Ｃ―Ｃ、アミノ、エーテル、カルボニル、アミド、エステル、ウレア、スルフィド、ジスルフィド、スルホキシド、スルホンアミド、又はスルホニル結合を構成しうる反応性官能基である、［１］、［４］、［５］、［８］～［５４］のいずれかに記載の化合物。
［５６］ Ｄの反応性官能基が、脱離基を有するＣ１炭化水素、アミノ基、水酸基、カルボニル基の前駆体、チオール基、又はアルデヒド基である、［１］、［４］、［５］、［８］～［５５］のいずれかに記載の化合物。
［５７］ Ｄの反応性官能基が、ハロゲン原子を有するＣ１炭化水素、スルホン酸系脱離基を有するＣ１炭化水素、アミノ基、水酸基、カルボキシ基、ハロゲン化カルボキシ基、チオール基、又はアルデヒド基である、［１］、［４］、［５］、［８］～［５６］のいずれかに記載の化合物。
［５８］ Ｄの反応性官能基が、－ＣＨ_２Ｃｌ、－ＣＨ_２Ｂｒ、－ＣＨ_２ＯＳＯ_２ＣＨ_３、－ＣＨ_２ＯＳＯ_２ＣＦ_３、アミノ基、水酸基、又はカルボキシ基である、［１］、［４］、［５］、［８］～［５７］のいずれかに記載の化合物。
［５９］ Ｄの反応性官能基が、第１級アミノ基である、［１］、［４］、［５］、［８］～［５８］のいずれかに記載の化合物。
［６０］ 選択的に切断可能な部位が、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、チミジン、及びデオキシシチジンのいずれでもないデオキシリボヌクレオシドである、
［１］、［４］、［５］、［８］～［５９］のいずれかに記載の化合物。
［６１］ 選択的に切断可能な部位が、デオキシウリジン、ブロモデオキシウリジン、デオキシイノシン、８－ヒドロキシデオキシグアノシン、３－メチル－２’－デオキシアデノシン、Ｎ６－エテノ－２’－デオキシアデノシン、７－メチル－２’－デオキシグアノシン、２’－デオキシキサントシン、又は５，６－ジヒドロキシ－５，６ジヒドロデオキシチミジンである、
［１］、［４］、［５］、［８］～［６０］のいずれかに記載の化合物。
［６２］ 選択的に切断可能な部位が、デオキシウリジン、又はデオキシイノシンである、
［１］、［４］、［５］、［８］～［６１］のいずれかに記載の化合物。
［６３］ 選択的に切断可能な部位が、デオキシウリジンである、
［１］、［４］、［５］、［８］～［６２］のいずれかに記載の化合物。
［６４］ 選択的に切断可能な部位が、デオキシイノシンである、
［１］、［４］、［５］、［８］～［６２］のいずれかに記載の化合物。
［６５］ 選択的に切断可能な部位が、デオキシイノシンから３‘方向に２番目のホスホジエステル結合である、
［１］、［４］、［５］、［８］～［５９］のいずれかに記載の化合物。
［６６］ 選択的に切断可能な部位が、リボヌクレオシドである、
［１］、［４］、［５］、［８］～［５９］のいずれかに記載の化合物。
［６７］ 選択的に切断可能な部位が、１つである、
［１］、［４］、［５］、［８］～［６６］のいずれかに記載の化合物。
［６８］ 少なくとも１つの切断可能な部位を、Ｅ又は（ＬＰ１）ｐに含み、かつ少なくとも１つの切断可能な部位を、Ｆ又は（ＬＰ２）ｑに含む、
［１］、［４］、［５］、［８］～［６６］のいずれかに記載の化合物。
［６９］ Ｅ又は（ＬＰ１）ｐに含まれる切断可能な部位と、Ｆ又は（ＬＰ２）ｑに含まれる切断可能な部位が異なる条件で切断可能である、［６８］に記載の化合物。
［７０］ Ａｎが、ｎ個のビルディングブロックα１～αｎ（ｎは、１～１０の整数である。）により構築される部分構造である、［８］～［６９］のいずれかに記載の化合物。
［７１］ Ａｎが、低分子有機化合物である、［８］～［７０］のいずれかに記載の化合物。
［７２］ Ａｎのビルディングブロックが、分子量５００以下の化合物である、［８］～［７１］のいずれかに記載の化合物。
［７３］ Ａｎのビルディングブロックが、分子量３００以下の化合物である、［８］～［７２］のいずれかに記載の化合物。
［７４］ Ａｎのビルディングブロックが、分子量１５０以下の化合物である、［８］～［７３］のいずれかに記載の化合物。
［７５］ Ａｎが、Ｈ、Ｂ、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓｉ、Ｐ、Ｓ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩからなる元素群より単独又は異なって選ばれる元素により構成される有機化合物である、［８］～［７４］のいずれかに記載の化合物。
［７６］ Ａｎが、アリール基、非芳香族シクリル基、ヘテロアリール基及び非芳香族ヘテロシクリル基からなる置換基群より単独又は異なって選ばれる置換基を有する低分子有機化合物である、［８］～［７５］のいずれかに記載の化合物。
［７７］ Ａｎが、分子量５０００以下である、［８］～［７６］のいずれかに記載の化合物。
［７８］ Ａｎが、分子量８００以下である、［８］～［７７］のいずれかに記載の化合物。
［７９］ Ａｎが、分子量５００以下である、［８］～［７８］のいずれかに記載の化合物。
［８０］ Ａｎが、ポリペプチドである、［８］～［７０］のいずれかに記載の化合物。
［８１］ Ｓｐが結合である、［８］～［８０］のいずれかに記載の化合物。
［８２］ Ｓｐが２官能性スペーサーであり、
該２官能性スペーサーがＳｐＤ－ＳｐＬ－ＳｐＸであり、
ＳｐＤが、Ｃ―Ｃ、アミノ、エーテル、カルボニル、アミド、エステル、ウレア、スルフィド、ジスルフィド、スルホキシド、スルホンアミド、又はスルホニル結合を構成しうる反応性基由来の２価の基であり、
ＳｐＬが、ポリアルキレングリコール、ポリエチレン、任意にヘテロ原子で置き換えられても良いＣ１～２０脂肪族炭化水素、ペプチド、オリゴヌクレオチド、またはこれらの組み合わせあり、
ＳｐＸが、アミド、アミノ、又はスルホンアミド結合を形成する反応基由来の２価の基である、
［８］～［８０］のいずれかに記載の化合物。
［８３］ Ｓｐが２官能性スペーサーであり、
該２官能性スペーサーがＳｐＤ－ＳｐＬ－ＳｐＸであり、
ＳｐＤが、第一級アミノ基由来の２価の基であり、
ＳｐＬが、ポリエチレングリコール、またはポリエチレンであり、
ＳｐＸが、カルボキシ基由来の２価の基である、
［８］～［８１］のいずれかに記載の化合物。
［８４］ オリゴヌクレオチド鎖Ｘとオリゴヌクレオチド鎖Ｙとが、二重鎖を形成可能な配列である、［８］～［８３］のいずれかに記載の化合物。
［８５］ オリゴヌクレオチド鎖Ｘとオリゴヌクレオチド鎖Ｙとが、相補的な塩基配列を含む、［８］～［８４］のいずれかに記載の化合物。
［８６］ オリゴヌクレオチド鎖Ｘとオリゴヌクレオチド鎖Ｙとが、それぞれ１～２００塩基の長さである、［８］～［８５］のいずれかに記載の化合物。
［８７］ オリゴヌクレオチド鎖Ｘとオリゴヌクレオチド鎖Ｙとが、それぞれ３～１５０塩基の長さである、［８］～［８６］のいずれかに記載の化合物。
［８８］ オリゴヌクレオチド鎖Ｘとオリゴヌクレオチド鎖Ｙとが、それぞれ３０～１５０塩基の長さである、［８］～［８７］のいずれかに記載の化合物。
［８９］ オリゴヌクレオチド鎖Ｘとオリゴヌクレオチド鎖Ｙとが、平滑末端を有する、［８］～［８８］のいずれかに記載の化合物。
［９０］ オリゴヌクレオチド鎖Ｘとオリゴヌクレオチド鎖Ｙとが、突出末端を有する、［８］～［８８］のいずれかに記載の化合物。
［９１］ 突出末端の突出部が、１～３０塩基の長さである、［９０］に記載の化合物。
［９２］ 突出末端の突出部が、２～５塩基の長さである、［９０］又は［９１］に記載の化合物。
［９３］ オリゴヌクレオチド鎖Ｘとオリゴヌクレオチド鎖Ｙとが、突出末端を有し、当該突出末端に、さらに特定分子識別配列が結合する、［９０］～［９２］のいずれかに記載の化合物。
［９４］ ＸおよびＹのいずれか一方に、機能性分子が結合した、［８］～［９３］のいずれかに記載の化合物。
［９５］ ＸおよびＹのいずれか一方に、ビオチンが結合した、［８］～［９３］のいずれかに記載の化合物。
［９６］ ［１］、［４］、［５］、［８］～［９５］のいずれかに記載の化合物を含む化合物ライブラリ。
［９７］ ［１］、［４］、［５］、［８］～［９５］のいずれかに記載の化合物を含むＤＮＡコード化ライブラリ。
［９８］ １０００以上の異なる化合物により構成される、［９６］又は［９７］に記載のライブラリ。
［９９］ 化合物Ａｎ－Ｓｐ－Ｃ－Ｂｎの製造方法であって、
Ａｎは、ｎ個のビルディングブロックα１～αｎ（ｎは、２～１０の整数である。）により構築される部分構造であり、
Ｓｐは、結合または２官能性スペーサーであり、
Ｃは、少なくとも一つの「選択的に切断可能な部位」を有するヘアピン型のヘッドピースであり、
Ｂｎは、Ａｎの構造を同定することができる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを含む部分構造であり、
Ｃに対し、以下の工程；
（ａ）α１－Ｓｐを結合させること、またはＳｐおよびα１を結合させること、及び
（ｂ）α１の構造を同定することができる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドタグを結合させること、
により化合物Ａ１－Ｓｐ－Ｃ－Ｂ１を得ること、
次いで、Ａ（ｍ－１）－Ｓｐ－Ｃ－Ｂ（ｍ－１）（ｍは、２～ｎの整数である）に対し、以下の工程（ｃ）及び（ｄ）を、ｍが２～ｎまで昇順で繰り返すこと；
（ｃ）Ａ部分にαｎを結合させること、及び
（ｄ）Ｂ部分の末端にαｎの構造を同定することができる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドタグを結合させること
により化合物Ａｍ－Ｓｐ－Ｃ－Ｂｍを得ることを含み、
工程（ａ）及び（ｂ）、工程（ｃ）及び（ｄ）は、任意の順序で行うことができる、方法。
［１００］ ［９］～［９５］のいずれかに記載の化合物であるＡｎ－Ｓｐ－Ｃ－Ｂｎの製造方法であって、
Ａｎは、ｎ個のビルディングブロックα１～αｎ（ｎは、２～１０の整数である。）により構築される部分構造であり、
Ｓｐは、結合又は２官能性スペーサーであり、
Ｃは、少なくとも一つの「選択的に切断可能な部位」を有するヘアピン型のヘッドピースであり、
Ｂｎは、Ａｎの構造を同定することができる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを含む部分構造であり、
Ｃに対し、以下の工程；
（ａ）α１－Ｓｐを結合させること、またはＳｐおよびα１を結合させること、及び
（ｂ）α１の構造を同定することができる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドタグを結合させること、
により化合物Ａ１－Ｓｐ－Ｃ－Ｂ１を得ること、
次いで、Ａ（ｍ－１）－Ｓｐ－Ｃ－Ｂ（ｍ－１）（ｍは、２～ｎの整数である）に対し、以下の工程（ｃ）及び（ｄ）を、ｍが２～ｎまで昇順で繰り返すこと；
（ｃ）Ａ部分にαｎを結合させること、及び
（ｄ）Ｂ部分の末端にαｎの構造を同定することができる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドタグを結合させること
により化合物Ａｍ－Ｓｐ－Ｃ－Ｂｍを得ることを含み、
工程（ａ）及び（ｂ）、工程（ｃ）及び（ｄ）は、任意の順序で行うことができる、方法。
［１０１］ ［９］～［９５］のいずれかに記載の化合物であるＡｎ－Ｓｐ－Ｃ－Ｂｎ（Ａｎ、Ｓｐ、ＣおよびＢｎは前記と同じ意味を表す）の製造方法であって、
Ｃに対し、以下の工程；
（ａ）α１－Ｓｐを結合させること、またはＳｐおよびα１を結合させること、及び
（ｂ）α１の構造を同定することができる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドタグを結合させること、
により化合物Ａ１－Ｓｐ－Ｃ－Ｂ１を得ること、
次いで、Ａ（ｍ－１）－Ｓｐ－Ｃ－Ｂ（ｍ－１）（ｍは、２～ｎの整数である）に対し、以下の工程（ｃ）及び（ｄ）を、ｍが２～ｎまで昇順で繰り返すこと；
（ｃ）Ａ部分にαｎを結合させること、及び
（ｄ）Ｂ部分の末端にαｎの構造を同定することができる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドタグを結合させること
により化合物Ａｍ－Ｓｐ－Ｃ－Ｂｍを得ることを含み、
工程（ａ）及び（ｂ）、工程（ｃ）及び（ｄ）は、任意の順序で行うことができる、方法。
［１０２］ 少なくとも１つの式（ＩＩＩ）
Ａｎ－Ｓｐ－Ｃ－Ｂｎ （ＩＩＩ）
（式中、
Ａｎは、ｎ個のビルディングブロックα１～αｎ（ｎは、１～１０の整数である。）により構築される部分構造であり、
Ｓｐは、結合又は２官能性スペーサーであり、
Ｃは、少なくとも一つの「選択的に切断可能な部位」を有するヘアピン型のヘッドピースであり、
Ｂｎは、Ａｎの構造を同定することができる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを含む部分構造である。）
で表される化合物を含む化合物ライブラリの評価方法であって、以下のステップ：
（１）化合物ライブラリを、生物学的標的と、化合物ライブラリの少なくとも１つのライブラリ分子が標的と結合するために適した条件下で接触させる、
（２）標的と結合しないライブラリ分子を除去し、生物学的標的に親和性のあるライブラリ分子を選抜する、
（３）選択的に切断可能な部位を切断する、
（４）Ｂｎを構成するオリゴヌクレオチドの配列を同定する、
（５）（４）において決定された配列を使用し、生物学的標的と結合する１以上の化合物の構造を同定する、
により構成される方法。
［１０３］ 少なくとも１つの式（ＩＩＩ）
Ａｎ－Ｓｐ－Ｃ－Ｂｎ （ＩＩＩ）
（式中、
Ａｎは、ｎ個のビルディングブロックα１～αｎ（ｎは、１～１０の整数である。）により構築される部分構造であり、
Ｓｐは、結合又は２官能性スペーサーであり、
Ｃは、少なくとも一つの「選択的に切断可能な部位」を有するヘアピン型のヘッドピースであり、
Ｂｎは、Ａｎの構造を同定することができる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを含む部分構造である。）
で表される［８］～［９２］のいずれかに記載の化合物を含む化合物ライブラリの評価方法であって、以下のステップ：
（１）化合物ライブラリを、生物学的標的と、化合物ライブラリの少なくとも１つのライブラリ分子が標的と結合するために適した条件下で接触させる、
（２）標的と結合しないライブラリ分子を除去し、生物学的標的に親和性のあるライブラリ分子を選抜する、
（３）選択的に切断可能な部位を切断する、
（４）Ｂｎを構成するオリゴヌクレオチドの配列を同定する、
（５）（４）において決定された配列を使用し、生物学的標的と結合する１以上の化合物の構造を同定する、
により構成される方法。
［１０４］ ステップ（３）と（４）の間に、Ｂｎを構成するオリゴヌクレオチドを増幅するステップを含む、［１０２］又は［１０３］に記載の方法。
［１０５］ 選択的に切断可能な部位を切断するステップが、酵素により選択的に切断可能な部位を切断するステップである、［１０２］～［１０４］のいずれかに記載の方法。
［１０６］ 選択的に切断可能な部位を切断するステップが、
酵素と化学的条件変化の組み合わせにより選択的に切断可能な部位を切断するステップである、［１０２］～［１０４］のいずれかに記載の方法。
［１０７］ 酵素がグリコシラーゼ、及びヌクレアーゼから少なくとも１つ選択される、［１０５］又は［１０６］に記載の方法。
［１０８］ 酵素がウラシルＤＮＡグリコシラーゼである、［１０７］に記載の方法。
［１０９］ 酵素がエンドヌクレアーゼＶＩＩＩである、［１０７］に記載の方法。
［１１０］ 酵素がウラシルＤＮＡグリコシラーゼとエンドヌクレアーゼＶＩＩＩの組み合わせである、［１０７］に記載の方法。
［１１１］ 酵素がアルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼである、［１０７］に記載の方法。
［１１２］ 酵素がエンドヌクレアーゼＶである、［１０７］に記載の方法。
［１１３］ 化学的条件変化が、水を含んだ溶液中での５０～１００℃の加熱である、［１０６］～［１１２］のいずれかに記載の方法。
［１１４］ 化学的条件変化が、水を含んだ溶液中での８０～９５℃の加熱である、［１０３］～［１１３］のいずれかに記載の方法。
［１１５］ 化学的条件変化が、ｐＨ８～１３の塩基性条件である、［１０６］～［１１４］のいずれかに記載の方法。
［１１６］ 化学的条件変化が、ｐＨ８～１１の塩基性条件である、［１０６］～［１１５］のいずれかに記載の方法。
［１１７］ 化学的条件変化が、ｐＨ９～１０の塩基性条件である、［１０６］～［１１６］のいずれかに記載の方法。
［１１８］ ＤＮＡタグの末端近くに切断可能な部位を設け、所望に応じて当該部位を切断し、新たな突出末端を生成し、当該粘着末端に、特定分子識別配列をライゲートし、Ｂｎを構成するオリゴヌクレオチドの配列を同定する、［１０２］～［１１７］のいずれかに記載の方法。
［１１９］ ＤＮＡタグの末端近くに設けた切断可能な部位と、Ｃに含まれる切断可能な部位が異なる条件で切断される、［１１８］に記載の方法。
［１２０］ 切断可能部位およびヘアピン構造を有する化合物と結合する核酸を用い、切断可能部位を切断することで２本鎖核酸として利用する方法。
［１２１］ 切断可能部位およびヘアピン構造を有する化合物と結合する、２本鎖核酸よりも化学的に安定である核酸を用い、切断可能部位を切断することで２本鎖核酸として利用する、［１２０］に記載の方法。
［１２２］ 切断可能部位およびヘアピン構造を有する化合物と結合する核酸を用い、前記化合物に化学構造変換を施したのち、切断可能部位を切断することで２本鎖核酸として利用する［１２０］又は［１２１］に記載の方法。
［１２３］ 切断可能部位およびヘアピン構造を有する化合物と結合する核酸を用い、さらに前記核酸に化学構造変換を施したのち、切断可能部位を切断することで２本鎖核酸として利用する、［１２０］～［１２２］のいずれかに記載の方法。
［１２４］ 切断可能部位およびヘアピン構造を有する化合物と結合する核酸を用い、さらに前記核酸に核酸伸長反応を施したのち、切断可能部位を切断することで２本鎖核酸として利用する、［１２０］～［１２３］のいずれかに記載の方法。
［１２５］ 切断可能部位およびヘアピン構造を有する化合物と結合する核酸を用い、切断可能部位を切断することで２本鎖核酸として利用可能とし、ＰＣＲ反応を施す、［１２０］～［１２４］のいずれかに記載の方法。
［１２６］ 化合物の機能性評価のために用いる、［１２０］～［１２５］のいずれかに記載の方法。
［１２７］ 化合物の生物活性評価のために用いる、［１２０］～［１２６］のいずれかに記載の方法。
［１２８］ ＤＥＬに用いる、［１２０］～［１２７］のいずれかに記載の方法。
［１２９］ ＤＥＬの製造に用いる、［１２０］～［１２４］のいずれかに記載の方法。
［１３０］ 切断可能部位およびヘアピン構造を有する化合物と結合する核酸を用い合成されたＤＥＬ化合物に対し、切断可能な部位を切断し、１本鎖ＤＮＡを有するＤＥＬに変換する方法。
［１３１］ 切断可能部位およびヘアピン構造を有する化合物と結合する核酸を用い合成されたＤＥＬ化合物に対し、切断可能な部位を切断し、１本鎖ＤＮＡを有するＤＥＬに変換し、クロスリンカー修飾ＤＮＡと２本鎖を形成させる方法。
［１３２］ 切断可能部位およびヘアピン構造を有する化合物と結合する核酸を用い合成されたＤＥＬ化合物に対し、切断可能な部位を切断し、クロスリンカー修飾プライマーを付与し、付与したプライマーを伸長させ、クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬ化合物を合成する方法。

【発明の効果】

【0009】

本発明では、切断可能な部位をＤＮＡ鎖中に含むＤＥＬ、及びその合成用組成物を提供し、従来よりも利便性の高いＤＥＬの製造が可能となる。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】様式１の例示的なＤＥＬ製造方法を示す。切断可能な部位をＤＮＡ鎖中に含む第１のオリゴヌクレオチド鎖、ループ部位および第２のオリゴヌクレオチド鎖を含むヘッドピースを出発原料とし、ビルディングブロックの結合と、該ビルディングブロックに対応するオリゴヌクレオチドタグの２本鎖ライゲーションとを繰り返し（図１では３回）、さらに所望によりプライマー領域を含むオリゴヌクレオチドタグの２本鎖ライゲーションをすることによって、ＤＥＬの製造が達成される。

【図2】様式１の例示的なＤＥＬの使用方法を示す。切断可能な部位をヘッドピースの第１のオリゴヌクレオチド鎖中に含むＤＥＬに対し、酵素などの切断手段を用いて切断可能な部位を切断し、ループ部位で結合されていない２本鎖オリゴヌクレオチドへと誘導することで、高い効率でＰＣＲを行うことができる。

【図3】様式２の例示的なＤＥＬの使用方法を示す。切断可能な部位をヘッドピースの第２のオリゴヌクレオチド鎖中に含むＤＥＬに対し、酵素などの切断手段を用いて切断可能な部位を切断し、ループ部位で結合されていない２本鎖オリゴヌクレオチドへと誘導することで、高い効率でＰＣＲを行うことができる。

【図4】様式３の例示的なＤＥＬの使用方法を示す。切断可能な部位をヘッドピースの第１のオリゴヌクレオチド鎖中および第２のオリゴヌクレオチド鎖中に含むＤＥＬに対し、酵素などの切断手段を用いて切断可能な部位の双方を切断し、ループ部位が結合していない２本鎖オリゴヌクレオチドへと誘導することで、高い効率でＰＣＲを行うことができる。

【図5】様式４の例示的なＤＥＬの使用法を示す。互いに異なる２種の切断可能な部位をヘッドピースの第１のオリゴヌクレオチド鎖中および第２のオリゴヌクレオチド鎖中に含むＤＥＬに対し、切断条件を選択することで、第１のオリゴヌクレオチド鎖中または第２のオリゴヌクレオチド鎖の一方を選択的に切断することができる。

【図6】様式５の例示的なＤＥＬの使用法を示す。ＤＮＡタグの末端近くに切断可能な部位を設け、所望に応じて当該部位を切断することで、新たな突出末端を生成することができる。当該突出末端は粘着末端として利用して、所望の核酸配列、例えばＵＭＩｓ（特定分子識別配列）などをライゲートすることができ、新たな機能を付与することができる。

【図7】様式６の例示的なＤＥＬの使用法を示す。本発明では、切断可能な部位と、修飾基や機能性分子を組み合わせて使用することでき、例えば、ヘアピン鎖ＤＮＡを１本鎖ＤＮＡに変換したＤＥＬを調製することが可能である。例えば、合成されたＤＥＬ化合物に対し、３‘末端に機能性分子（例えばビオチン）を有する２本鎖オリゴヌクレオチド鎖をライゲートし（Ａ）、切断可能な部位を切断し（Ｂ）、機能性分子の機能に応じた処理を加える（Ｃ）。例えば機能性分子がビオチンの場合、ビオチン親和性を有するストレプトアビジンビーズなどを用い、ビオチンが結合したオリゴヌクレオチド鎖を選択的に系中から除去する。それにより、１本鎖ＤＮＡを有するＤＥＬを取得することが可能である。

【図8】様式６で取得したＤＥＬの例示的な使用法を示す。様式６で取得した１本鎖ＤＮＡを有するＤＥＬは、所望の機能部位を有する修飾オリゴヌクレオチド（例えば光反応性クロスリンカーなどのクロスリンカー修飾ＤＮＡ）と２本鎖を形成させることで、新たな機能を付与することが可能となる。

【図9】様式７の例示的なＤＥＬの使用法を示す。本発明では、切断可能な部位を利用し、クロスリンカーを導入することができる。合成されたＤＥＬ化合物に対し、切断可能な部位を切断し（Ａ）、修飾プライマーを付与し（Ｂ）、付与したプライマーをもとに、クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬ化合物を合成することができる（Ｃ）。クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬ化合物は、ＤＥＬライブラリのスクリーニングにおいて検出感度を顕著に向上させることができる（非特許文献５，６など参照）。

【図10】実施例１において、デオキシウリジンを含むヘアピン型ＤＥＬの部分構造（Ｕ－ＤＥＬ１－ｓｈ、Ｕ－ＤＥＬ２－ｓｈ、Ｕ－ＤＥＬ３－ｓｈ、Ｕ－ＤＥＬ４－ｓｈ、Ｕ－ＤＥＬ５－ＨＰ、Ｕ－ＤＥＬ６－ＨＰ、Ｕ－ＤＥＬ７－ＨＰ、Ｕ－ＤＥＬ８－ＨＰ、Ｕ－ＤＥＬ９－ＨＰ、及びＵ－ＤＥＬ１０－ＨＰの１０種）のＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅによる切断反応の検証を実施した際の、各インキュベーション時間における切断反応の転化率を表したグラフである。

【図11】実施例２、３、４、５、及び７において、各種ヘアピンＤＥＬ（Ｕ－ＤＥＬ１、Ｕ－ＤＥＬ２、Ｕ－ＤＥＬ４、Ｕ－ＤＥＬ７、Ｕ－ＤＥＬ８、Ｕ－ＤＥＬ９、Ｕ―ＤＥＬ１０、Ｈ－ＤＥＬ、Ｕ－ＤＥＬ５、Ｕ－ＤＥＬ１１、Ｕ－ＤＥＬ１２、Ｕ－ＤＥＬ１３、Ｉ－ＤＥＬ１、Ｉ－ＤＥＬ２、Ｉ－ＤＥＬ３、Ｒ－ＤＥＬ１、及びＢＩＯ－ＤＥＬ）の合成手順を示す概略図である。それぞれに対応するヘッドピースを原料とし、２本鎖オリゴヌクレオチドＰｒ＿ＴＡＧ、及びＣＰとの２段階の２本鎖ライゲーションによりヘアピンＤＥＬ合成が達成される。

【図12】実施例２において、８種のヘアピンＤＥＬ（Ｕ－ＤＥＬ１、Ｕ－ＤＥＬ２、Ｕ－ＤＥＬ４、Ｕ－ＤＥＬ７、Ｕ－ＤＥＬ８、Ｕ－ＤＥＬ９、Ｕ－ＤＥＬ１０、及びＨ－ＤＥＬ）、及び２本鎖ＤＥＬ（ＤＳ－ＤＥＬ）のリアルタイムＰＣＲにより測定したＣｔ値を示す、サンプル量ごとのグラフである。各種ＤＥＬをＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅにより処理した試料を “ＵＳＥＲ（＋）”と表示し、未処理の試料を“ＵＳＥＲ（－）”と表示している。デオキシウリジンを含む切断可能なヘアピンＤＥＬ（Ｕ－ＤＥＬ１、Ｕ－ＤＥＬ２、Ｕ－ＤＥＬ４、Ｕ－ＤＥＬ７、Ｕ－ＤＥＬ８、Ｕ－ＤＥＬ９、及びＵ－ＤＥＬ１０）は、ＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅ処理後に２本鎖ＤＥＬ（ＤＳ－ＤＥＬ）と同等のＣｔ値を示している。

【図13】実施例３において、６種のデオキシウリジンを含むヘアピンＤＥＬ（Ｕ－ＤＥＬ５、Ｕ－ＤＥＬ７、Ｕ－ＤＥＬ９、Ｕ－ＤＥＬ１１、Ｕ－ＤＥＬ１２及びＵ－ＤＥＬ１３）のＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅによる切断反応の進行を示す、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により得られたゲルの画像である。なお、図中の数字は各レーンの番号を示している。

【図14】実施例４において、４種のデオキシイノシンを含むヘアピンＤＥＬ（Ｉ－ＤＥＬ１、Ｉ－ＤＥＬ２、Ｉ－ＤＥＬ３及びＩ－ＤＥＬ４）のエンドヌクレアーゼＶによる切断反応の進行を示す、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により得られたゲルの画像である。なお、図中の数字は各レーンの番号を示している。

【図15】実施例５において、リボヌクレオシドを含むヘアピンＤＥＬ（Ｒ－ＤＥＬ１）のＲＮａｓｅＨＩＩによる切断反応の進行を示す、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により得られたゲルの画像である。なお、図中の数字は各レーンの番号を示している。

【図16】Ｕ－ＤＥＬ９－ＨＰを原料とした、３×３×３（２７）化合物種を含むモデルライブラリの合成手順を示す概略図である。実施例６において、Ｕ－ＤＥＬ９－ＨＰを原料とし、３回（サイクルＡ、Ｂ，Ｃ）のスプリット・アンド・プール工程によりモデルライブラリの合成が達成される。また、各サイクルでは、２本鎖オリゴヌクレオチドタグのライゲーション反応と、ビルディングブロック導入のための化学反応が含まれている。

【図17】実施例６のモデルライブラリ合成における、各サイクルのライゲーション反応の進行を示す、アガロースゲル電気泳動により得られたゲルの画像である。なお、図中の数字は各レーンの番号を示している。

【図18】図１８Ａは、実施例６のモデルライブラリ合成における、サイクルＣ完了後のサンプルより得られたクロマトグラフである。図１８Ｂは、実施例６のモデルライブラリ合成における、サイクルＣ完了後のサンプルより得られたＭＳスペクトルのデコンボリューション結果である。

【図19】実施例６において、モデルライブラリのＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅによる切断反応の進行を示す、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により得られたゲルの画像である。なお、図中の数字は各レーンの番号を示している。

【図20】実施例７において、３’末端にビオチンを有するＤＥＬ化合物「ＢＩＯ－ＤＥＬ」のＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅによる切断反応の進行を示す、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により得られたゲルの画像である。なお、図中の数字は各レーンの番号を示している。

【図21】実施例７において、１本鎖ＤＮＡを有するＤＥＬ化合物「ＳＳ－ＤＥＬ」、及び光反応性クロスリンカー修飾プライマー「ＰＸＬ－Ｐｒ」を用いて、プライマー伸長反応を実施した結果を示す、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により得られたゲルの画像である。なお、図中の数字は各レーンの番号を示している。

【発明を実施するための形態】

【0011】

前述のとおりであり、また当業者に周知の概念であるが、本発明において、化合物ライブラリとは、医薬品候補化合物など、特定の活性を有する可能性のある化合物を系統的に集めた化合物誘導体群を意味する。この化合物ライブラリは、多くの場合コンビナトリアル化学の合成技術と方法論に基づき合成される。コンビナトリアル化学とは、組み合わせ論に基づいて列挙し設計された一連の化合物ライブラリを系統的な合成経路で効率的に多品種合成するための実験手法とそれに関する研究分野である。

【0012】

前述のとおりであり、また当業者には周知であるが、コンビナトリアル化学に基づく化合物ライブラリの一つの種として、ＤＮＡコード化ライブラリがある。ＤＮＡコード化ライブラリは適宜ＤＥＬと略される。またＤＥＬは、ＤＮＡコード化化合物ライブラリとも本質的に同義である。
本発明において、ＤＮＡコード化ライブラリは、ライブラリ化された各化合物に、ＤＮＡのタグが付加されたライブラリを意味する。ＤＮＡのタグは、各化合物の各構造を同定できるように配列が設計されており、化合物の標識として機能する。

【0013】

ヌクレオチドとは、一般に、ヌクレオシドにリン酸基が結合した物質として理解される。ヌクレオチドやヌクレオシドは当業者に周知の用語であるが、ヌクレオシドは一つの一般的な態様として、五単糖などの糖の１位に、プリン塩基又はピリミジン塩基などの核酸塩基がグリコシド結合したものとして理解される。ヌクレオシドやヌクレオチドは、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸を構成する単位でもある。
また、核酸も当業者に周知の概念であるが、一般的な態様として、ヌクレオチドのポリマーとして理解される。
一つの態様として、本発明の核酸とは、後述するヌクレオチド及び核酸アナログにより構成されるポリマーである。

【0014】

また、本明細書中において、ヌクレオチドや核酸アナログにより構成される核酸ポリマーのほか、ヌクレオチドや核酸アナログなどの核酸モノマーのことも単に核酸と記載されることがある。後者の用法も技術常識に従った用法であり、当業者であれば適宜文脈に従って理解することができる。

【0015】

広義のヌクレオチドには、天然のヌクレオチド（本来のヌクレオチド）のほか、人工のヌクレオチド（各種の核酸アナログ）も含まれる。
本発明における広義のヌクレオチドは、以下の態様を含む。
（Ａ）天然のヌクレオシドのヌクレオチド
（当該ヌクレオシドの例としては、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシウリジン、デオキシグアノシン、デオキシシチジン、イノシン又はジアミノプリンデオキシリボシドが挙げられる。）
（Ｂ）核酸塩基のアナログを有するヌクレオシドのヌクレオチド
（当該核酸塩基アナログを有するヌクレオシドの例としては、２－アミノアデノシン、２－チオチミジン、ピロロピリミジンデオキシリボシド、３－メチルアデノシン、Ｃ５－プロピニルシチジン、Ｃ５－プロピニルウリジン、Ｃ５－ブロモウリジン、Ｃ５－フルオロウリジン、Ｃ５－ヨードウリジン、Ｃ５－メチルシチジン、７－デアザアデノシン、７－デアザグアノシン、８－オキソアデノシン、８－オキソグアノシン、６－Ｏ－メチルグアノシン又は２－チオシチジンが挙げられる。）
（Ｃ）インターカレートされた核酸塩基を有するヌクレオチド
（Ｄ）リボース又は２’－デオキシリボースを有する非天然のヌクレオチド
（Ｅ）修飾された糖を糖部分に有するヌクレオチド
（当該修飾された糖の例としては、修飾されたリボース、修飾された２’－デオキシリボース、２’－Ｏ－メチルリボース、２’－フルオロリボース、Ｄ－トレオニノール、アラビノース、ヘキソース、アンヒドロヘキシトール、アルトリトール又はマンニトールが挙げられる。）
（Ｆ）核酸類縁体
（当該核酸類縁体の例としては、シクロヘキサニル核酸、シクロヘキセニル核酸、モルホリノ核酸（ＰＭＯ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、セリノール核酸（ＳＮＡ）、アサイクリックスレオニノール核酸（ａＴＮＡ）又はリボース中の酸素が置き換えられた核酸が挙げられる。）
以下、各核酸類縁体について詳細に説明する。
（Ｆ１）ＰＭＯ
ＰＭＯは、糖部にモルフォリン環を、リン酸ジエステル部位に電荷のないホスホロジアミデート構造を有する核酸類縁体である。
（Ｆ２）ＬＮＡ
ＬＮＡは、糖部分に架橋構造を有する核酸類縁体であり、最も典型的な例としては、リボースの２’－ヒドロキシルが同じリボース糖の４’－炭素にＣ１～６アルキレン又はＣ１～６ヘテロアルキレンによって架橋されている。架橋構造の例としては、メチレン、プロピレン、エーテル又はアミノ架橋構造が挙げられる。
典型的なＬＮＡとしては、２’，４’－ＢＮＡ（２'－Ｏ,４'－Ｃ－メタノ架橋核酸）が挙げられる。
（Ｆ３）ＧＮＡ
グリコール核酸はＧＮＡとも呼ぶ。例えばＲ－ＧＮＡ又はＳ－ＧＮＡが挙げられる。この場合、リボースはホスホジエステル結合に結合されたグリコール単位により置き換えられる。
（Ｆ４）ＴＮＡ
トレオース核酸はＴＮＡとも呼ぶ。この場合、リボースはα－Ｌ－トレオフラノシル－（３’→２’）で置き換えられる。
（Ｆ５）ＳＮＡ
セリノール核酸はＳＮＡとも呼ぶ。この場合、リボースはホスホジエステル結合に結合されたセリノール単位により置き換えられる。
（Ｆ６）ａＴＮＡ
アサイクリックスレオニノール核酸はａＴＮＡとも呼ぶ。例えば、Ｄ－ａＴＮＡ又はＬ－ａＴＮＡが挙げられる。この場合、リボースはホスホジエステル結合に結合されたスレオニノール単位により置き換えられる。
（Ｆ７）リボース中の酸素が置き換えられた糖
具体的な例としては、酸素の、Ｓ、Ｓｅ、又はアルキレン（例えば、メチレンもしくはエチレンが挙げられる。）との置換体が挙げられる。
（Ｇ）骨格が修飾されたヌクレオチド
（当該骨格が修飾されたヌクレオチドの例としては、ペプチド核酸（該ペプチド核酸はＰＮＡとも呼ぶ。この場合、２－アミノエチル－グリシンリンケージがリボース及びホスホジエステル骨格に取って代わる。）が挙げられる。）
（Ｈ）リン酸基が修飾されたヌクレオチド
（当該リン酸基が修飾されたヌクレオチドの例としては、ホスホロチオエート、５’－Ｎ－ホスホロアミダイト、ホスホロセレネート、ボラノリン酸、ボラノリン酸エステル、水素ホスホネート、ホスホルアミダート、ホスホロジアミダート、アルキル若しくはアリールホスホネート、ホスホトリエステル、架橋ホスホルアミダート、架橋ホスホロチオエート又は架橋メチレン－ホスホネートなどが挙げられる。）
以下の説明における、本発明のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド鎖、２本鎖オリゴヌクレオチド、２本鎖オリゴヌクレオチド鎖、及び２本鎖ＤＮＡは、上記定義のヌクレオチドである。

【0016】

本発明において、特に限定なくヌクレオチドと記載する場合は、天然のヌクレオチドを意味する。天然のヌクレオチドは、当業者に周知の用語であり、本質的に天然に存在するヌクレオチドであれば特に限定されない。一つの態様として、本発明における天然のヌクレオチドは、前記（Ａ）に記載のヌクレオチドである。
（核酸アナログ）
核酸アナログとは当業者に周知の用語であり、本発明における核酸アナログの構造は、本発明の効果を有する限り限定はされない。
一つの態様として、核酸アナログとは、前記（Ｂ）乃至（Ｈ）の態様の化合物である。
一つの態様として、本発明における核酸アナログとは、核酸モノマーにおけるリン酸相当部位と水酸基相当部位とを有する化合物である。核酸アナログは、より好ましくはリン酸部位と水酸基とを有する化合物である。
一つの態様として、本発明における核酸アナログとは、核酸合成機においてモノマーとして利用可能な化合物である。当業者には周知であるが、核酸合成機では、核酸アナログのリン酸（または相当部位）をホスホロアミダイト化し、水酸基（またはその相当部位）を保護基で保護したモノマーとして利用することで、核酸オリゴマーを合成することができる。
また、核酸アナログにおける、リン酸部位（または相当部位）および水酸基（または相当部位）以外の部分構造は、核酸アナログ残基ということができる。核酸アナログ残基の構造は、本発明の効果を有する限り限定されないが、ここで参照として天然の核酸（デオキシアデノシン、チミジン、デオキシシチジン、デオキシグアノシン）のそれぞれの構造の特徴を確認すると、分子量が３２２（チミジン一リン酸）から３４７（デオキシグアノシン一リン酸）程度であり、かつ核酸鎖を構成する３‘位の水酸基酸素原子から５’位のリン原子の間の原子数（酸素原子およびリン原子を含む。以下残基間原子数とも呼ぶ）が６つであることが挙げられる。また、核酸合成機に利用可能な核酸アナログとして、以下が知られている。
Amino C6 dT 分子量：４７６、残基原子数：６
mdC（TEG-Amino） 分子量：５２６、残基原子数：６
Uni-Link（商標登録）Amino Modifier 分子量：２２７、残基原子数：６
（文献ヌクレイック アシッド リサーチ、１９９２年、２０巻、６２５３－６２５９頁参照）
d-Spacer 分子量：１９８、残基原子数：６
トリエチレングリコールリン酸エステル（Spacer9） 分子量：２３０、残基原子数：１１

【0017】

参考として各核酸アナログの構造を以下に記載する。

【化12】

【0018】

したがって、一つの態様として、核酸アナログは、以下を特徴とする化合物（Ｂ１）である。
（Ｂ１１）リン酸（または相当部位）および水酸基（またはその相当部位）を有する。
（Ｂ１２）炭素、水素、酸素、窒素、リン又は硫黄により構成される。
（Ｂ１３）分子量が１４２から１５００である。
（Ｂ１４）残基間原子数が５～３０である。
（Ｂ１５）残基間の原子の結合様式は、全て単結合であるか、または１乃至２つの二重結合を含み残りは単結合である。

【0019】

一つの態様として、核酸アナログは、以下を特徴とする化合物（Ｂ２）である。
（Ｂ２１）リン酸および水酸基を有する。
（Ｂ２２）炭素、水素、酸素、窒素又はリンにより構成される。
（Ｂ２３）分子量が１４２から１０００である。
（Ｂ２４）残基間原子数が５～２０である。
（Ｂ２５）残基間の原子の結合様式は、全て単結合である。

【0020】

一つの態様として、核酸アナログは、以下を特徴とする化合物（Ｂ３）である。
（Ｂ３１）リン酸および水酸基を有する。
（Ｂ３２）炭素、水素、酸素、窒素又はリンにより構成される。
（Ｂ３３）分子量が１４２から７００である。
（Ｂ３４）残基間原子数が５～１２である。
（Ｂ３５）残基間の原子の結合様式は、全て単結合である。

【0021】

一つの態様として、核酸アナログは、以下の化合物（Ｂ４１）、（Ｂ４２）、（Ｂ４３）、（Ｂ４４）、（Ｂ５）、（Ｂ５１）、または（Ｂ５２）である。
（Ｂ４１）d-Spacer
（Ｂ４２）Amino C6 dT
（Ｂ４３）mdC（TEG-Amino）
（Ｂ４４）Uni-Link（商標登録）Amino Modifier
（Ｂ５）ポリアルキレングリコールリン酸エステル
（Ｂ５１）ジエチレングリコールリン酸エステルまたはトリエチレングリコールリン酸エステル
（Ｂ５２）トリエチレングリコールリン酸エステル

【0022】

本発明でオリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド鎖とは、５’末端と３’末端、及び５’末端と３’末端の間の内部位置に１個以上のヌクレオチドを有するヌクレオチドの重合体を意味する。

【0023】

互いに相補的な塩基配列とは、核酸の２本のオリゴヌクレオチドの間で、アデニンとチミン（又はウラシル）、又はグアニンとシトシンという決まった組みを作り、水素結合でつながるいわゆる相補的塩基対を形成することができるヌクレオチドの配列を意味する。相補的塩基対の形成はハイブリダイズとも呼ばれる。
なお、相補的塩基対は、一般に「ワトソン・クリック型塩基対」「天然型塩基対」と呼ばれる概念である。ただし、塩基対はワトソン・クリック型であっても、フーグスティーン型塩基対、もしくは他の水素結合モチーフ(例えば、ジアミノプリンとＴ、５－メチルＣとＧ、２―チオチミンとＡ、６－ヒドロキシプリンとＣ、プソイドイソシトシンとＧ)形成による塩基対などであっても良い。２本のオリゴヌクレオチドが２本鎖を組みうる配列であり、本発明の目的に利用できる限りで、「互いに相補的な塩基配列」の配列に制限はなく、２つの配列の相同性にも制限はない。相同性は、より好ましい順に、９９％以上、９８％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上、７０％以上、６０％以上又は５０％以上であることが好ましい。

【0024】

繰り返しになるが、本発明でハイブリダイズするとは、互いに相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド鎖同士で２本鎖を形成させる行為、及び相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド鎖同士が二重鎖を形成する現象を意味する。

【0025】

本発明で二重鎖とは、２つの核酸鎖が相補的塩基対を形成している（ハイブリダイズしている）状態のことを意味する。２つの核酸鎖は、２本の核酸鎖に由来するものでも良く、１本の核酸鎖分子内の２つの核酸配列に由来するものでも良い。

【0026】

本発明で２本鎖オリゴヌクレオチド及び２本鎖オリゴヌクレオチド鎖とは、２つ以上の異なるオリゴヌクレオチド鎖がハイブリダイズすることで形成される二次構造体を意味する。２つのオリゴヌクレオチドの鎖長は異なっていてもよく、ハイブリダイズされない領域を有していてもよい。
なお、２本鎖がハイブリダイズしている領域は、二重鎖である。

【0027】

本発明で２本鎖ＤＮＡとは、２つの異なるＤＮＡ鎖がハイブリダイズすることで形成される二次構造体を意味する。それぞれのＤＮＡ鎖の鎖長は異なっていてもよく、ハイブリダイズされない領域を有していてもよい。ＤＮＡ鎖は天然に存在するデオキシリボヌクレオチドに限定されず、ＤＮＡポリメラーゼにより増幅可能なオリゴヌクレオチド鎖全般を意味する。

【0028】

本発明で「二重鎖を形成する」とは、例えば４～４０℃の温度、水性溶媒、ｐＨ４～１０のような、オリゴヌクレオチドを取り扱うにあたって標準的な条件において二重鎖を形成すればよい。例えば、特定の溶媒、条件によって二重鎖を形成しない場合があっても、当該核酸が標準的な条件において二重鎖を形成するのであれば、当該核酸は二重鎖を形成する核酸である。

【0029】

本発明でＴｍ値とは、ＤＮＡ分子の半数が、相補鎖とアニールするときの温度をいう。

【0030】

本発明で平滑末端とは、２本鎖オリゴヌクレオチドの末端が、どちらもが突き出ることなく対になっていることを意味する。

【0031】

本発明で突出末端とは、２本鎖オリゴヌクレオチドの末端のうち、一方の鎖が突出部を有していることを意味する。突出末端の突出部は、任意の長さであることができるが、好ましくは、１～５０塩基、より好ましくは１～３０塩基、さらに好ましくは１～１５塩基、最も好ましくは、２～６塩基の長さである。特定の態様では、前記突出部は、粘着末端のライゲーションを実施する際のハイブリダイズ領域として使用することが可能である。

【0032】

ＰＣＲとは、ポリメラーゼ連鎖反応を意味する。ＰＣＲは、オリゴヌクレオチド鎖の増幅手段であり、当業者に周知の技術である。ＰＣＲのプロセスの概略を説明すると、ＰＣＲでは、（１）増幅対象の２本鎖オリゴヌクレオチド鎖を加熱処理などにより２つの１本鎖に解離させ、（２）酵素反応に適した温度に調整したのち、反応系中に存在させている酵素（ＤＮＡポリメラーゼなど）により、それぞれの１本鎖に相補的な鎖を合成する。すなわち、１つの２本鎖オリゴヌクレオチドを２つに増幅することができる。ＰＣＲでは、（１）と（２）のプロセスを温度調整により繰り返すことで、高い効率でオリゴヌクレオチド鎖を増幅することができる。

【0033】

本発明でプライマーとは、鋳型となるオリゴヌクレオチド鎖にアニールし、鋳型依存的にポリメラーゼにより伸長され得るオリゴヌクレオチドを意味する。

【0034】

本発明でＰＣＲ用のプライマー配列とは、オリゴヌクレオチド鎖中にあって、プライマーがアニールする部分の配列を意味し、当該分野で公知であるようなＰＣＲに適した配列であることが好ましく、オリゴヌクレオチド鎖の末端に存在することが好ましい。

【0035】

本発明でニックとは、２本鎖オリゴヌクレオチド鎖において、ヌクレオチド間結合が欠如しており、オリゴヌクレオチド鎖が断裂している部分を意味する。この欠如部の５’側は、リン酸基を有していても、リン酸基を有していなくても良い。

【0036】

本発明でギャップとは、２本鎖オリゴヌクレオチド鎖において、１つ以上連続したヌクレオチドが欠失しており、オリゴヌクレオチド鎖が乖離している部分を意味する。欠失部の５’側に、リン酸基を有していても、リン酸基を有していなくても良い。

【0037】

本発明でヘアピン鎖とは、相補的な２本の核酸鎖がつながった１本鎖構造であり、ヘアピン鎖やヘアピン鎖ＤＥＬの特徴は前記のとおりである。本発明で用いられる「ヘアピン部位」、「ヘアピン構造」、「ヘアピン型」という用語は、前述の「ヘアピン鎖」と同概念のヘアピンに由来する用語として理解される。

【0038】

本発明で核酸連結反応及びライゲーションとは、核酸の末端どうしを連結する反応を意味する。

【0039】

酵素による核酸連結反応及び酵素的ライゲーションとは、酵素を用いて核酸の末端どうしを連結する反応を意味する。

【0040】

核酸連結反応に用いることができる酵素は、例えば、ＤＮＡリガーゼ、ＲＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、又はトポイソメラーゼである。

【0041】

一つの態様として、ＤＮＡリガーゼは、ＤＮＡ鎖の末端同士をリン酸ジエステル結合でつなぐ酵素である。一つの態様として、ＤＮＡリガーゼは、ＥＣ番号：６．５．１．１又は６．５．１．２に属するリガーゼとして理解される。ＤＮＡリガーゼは、ポリデオキシリボヌクレオチドシンターゼ又はポリヌクレオチドリガーゼなどとも呼ばれる。ＤＮＡリガーゼの例としては、ＤＮＡリガーゼＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶやＴ４ＤＮＡリガーゼなどが挙げられる。

【0042】

一つの態様として、ＲＮＡリガーゼは、ＲＮＡ鎖の末端同士をリン酸ジエステル結合でつなぐ酵素である。一つの態様として、ＲＮＡリガーゼは、ＥＣ番号：６．５．１．３に属するリガーゼとして理解される。また、一つの態様としてＲＮＡリガーゼは、ポリ（リボヌクレオチド):ポリ（リボヌクレオチド)リガーゼの系統に属す。ＲＮＡリガーゼは、ポリリボヌクレオチドシンターゼ又はポリリボヌクレオチドリガーゼとも呼ばれる。

【0043】

本発明で化学的ライゲーションとは、核酸の末端どうしを、酵素を用いずに結合する反応を意味する。

【0044】

化学的ライゲーションにおいては、化学反応の対となる官能基を有する核酸の末端どうしが反応することで連結部が形成される。化学反応の対となる官能基は、例えば、置換されていてもよいアルキニル基と置換されていてもよいアジド基との対、４π電子系を有する置換されていてもよいジエン（例えば、置換されていてもよい１，３－不飽和化合物、例えば、置換されていてもよい１，３－ブタジエン、１－メトキシ－３－トリメチルシリルオキシ－１，３－ブタジエン、シクロペンタジエン、シクロヘキサジエン又はフランが挙げられる。)と２π電子系を有する置換されていてもよいジエノフィル又は置換されていてもよいヘテロジエノフィル(例えば、置換されていてもよいアルケニル基又は置換されていてもよいアルキニル基が挙げられる。)との対、置換されてもよいアミノ基とカルボン酸基の対、ホスホロチオエート基とヨード基 (例えば、３’末端のホスホロチオエート基と５’末端のヨード基が挙げられる。)との対又はリン酸基とヒドロキシ基の対(例えば、５’末端のリン酸基と３’末端のヒドロキシ基の対又は５’末端のヒドロキシ基と３’末端のリン酸基の対が挙げられる。)である。
化学的ライゲーションは、当業者に周知の概念であり、当業者は技術常識に基づき適宜、化学的ライゲーションを達成できる。上記のほか、アーティフィシアル・ＤＮＡ；ＰＮＡ＆ＸＮＡ、２０１４年、５巻、ｅ２７８９６、キャレント・オピニオン・イン・ケミカル・バイオロジー、２０１５年、２６巻、８０－８８頁なども参照される。

【0045】

本発明で「選択的に切断可能」とは、ある化合物において、化合物のその他の分子構造に変化を与えることなく、所定の条件で特定の部位のみ選択的に切断できることを意味する。

【0046】

本発明で「選択的に切断可能な部位」とは、ある化合物において、所定の条件で選択的に切断できる部位を意味する。

【0047】

一つの態様として、本発明における「選択的に切断可能な部位」の好ましい構造は、「選択的に切断可能な核酸」である。当該部位は、複数の核酸により構成され特定の配列が奏功して切断される部位でもよく、単一の核酸による部位でも良い。切断可能な部位が核酸である場合、（１）核酸合成機などの確立された製造方法を利用することができ製造効率が良いこと、（２）ＤＥＬのビルディングブロック構築の反応条件は、ＤＮＡタグ部分の核酸が分解しないことが必須であるため、切断可能な部位が核酸であればやはり分解しないこと、などの観点で好ましい。

【0048】

前記「選択的に切断可能な核酸」のより好ましい構造は、ＤＥＬのＤＮＡタグの配列に含まれないヌクレオチドを含む核酸である。切断可能な部位が、ＤＮＡタグの配列に含まれないヌクレオチドであれば、ＤＮＡタグ部分の切断を避けるために、ＤＮＡタグの配列を限定することなく利用可能となる。

【0049】

ＤＮＡタグの配列に使用する核酸としては、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、チミジン、及びデオキシシチジンが好ましい。したがって、選択的に切断可能な部位の好ましい構造は、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、チミジン、及びデオキシシチジンのいずれでもない核酸である。

【0050】

「選択的に切断可能な部位」の例として、「切断可能な塩基を有するヌクレオチド」が挙げられる。例えば、ＤＥＬ中の「切断可能な塩基を有するヌクレオチド」は、ＤＮＡグリコシラーゼの作用によって、塩基部と糖部の間のＮ－グリコシド結合が切断され、脱塩基部位を残す。脱塩基部位に隣接するホスホジエステル結合は、化学的条件変化（例えば温度上昇、塩基性加水分解など）、又は脱プリン／脱ピリミジン（ＡＰ）エンドヌクレアーゼ活性やＡＰリアーゼ活性を有する酵素（例えば、エンドヌクレアーゼＩＩＩ、エンドヌクレアーゼＩＶ、エンドヌクレアーゼＶ、エンドヌクレアーゼＶＩ、エンドヌクレアーゼＶＩＩ、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、ＡＰＥ１（ヒト由来ＡＰエンドヌクレアーゼ）、Ｆｐｇ（ホルムアミドピリジン－ＤＮＡグリコシラーゼ）など）によって切断され、１塩基分のギャップ、あるいはニックを形成する。

【0051】

「切断可能な塩基を有するヌクレオチド」の例としては、デオキシウリジン、ブロモデオキシウリジン、デオキシイノシン、８－ヒドロキシデオキシグアノシン、３－メチル－２’－デオキシアデノシン、Ｎ６－エテノ－２’－デオキシアデノシン、７－メチル－２’－デオキシグアノシン、２’－デオキシキサントシン、５，６－ジヒドロキシデオキシチミジンなどが挙げられる。他の切断可能な塩基を有するヌクレオチドは、当業者にとって明白である。これらの「切断可能な塩基を有するヌクレオチド」をＤＥＬ中に組み込み、その構造を特異的に認識するＤＮＡグリコシラーゼを用いることでＤＥＬは選択的に脱塩基される。

【0052】

本発明でＤＮＡグリコシラーゼとは、グリコシラーゼ活性を有する任意の酵素であって、オリゴヌクレオチド中の任意の核酸塩基部を認識し、その塩基部と糖部の間のＮ－グリコシド結合を切断し、脱塩基部位を作成する酵素である。例えば、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（デオキシウリジンを認識）、アルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ（３－メチル－２’－デオキシアデノシン、７－メチル－２’－デオキシグアノシン、及びデオキシイノシンを認識）、Ｆｐｇ（８－ヒドロキシデオキシグアノシンを認識）、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ（５，６－ジヒドロキシデオキシチミジンやウラシルグリコールなどの分解されたピリミジン塩基を認識）、ＳＵＭＧ１（１本鎖選択的ウラシルＤＮＡグリコシラーゼの略称、デオキシウリジンを認識）などが挙げられる。

【0053】

本発明で「選択的に切断可能な部位」のより好ましい例として、デオキシイノシン、デオキシウリジンが挙げられる。

【0054】

本発明で「選択的に切断可能な部位」の特に好ましい例として、デオキシウリジンが挙げられる。

【0055】

一つの態様として、本発明における「選択的に切断可能な部位」は、好ましくは酵素を用いて切断される。酵素は一般的に基質特異性が高く、ＤＥＬのＤＮＡタグ部分、及び複数のビルディングブロックにより構築された化合物部分を基質として認識せず、「選択的に切断可能な部位」のみを認識して作用させられるため、好ましい。また、前記酵素を用いた切断は、「選択的に切断可能な部位」を酵素により構造変化させたのちに、化学的条件を変化させることで達成されても良い。該酵素の例としては、グリコシラーゼ、及びヌクレアーゼが挙げられる。

【0056】

本発明でグリコシラーゼとは、グリコシド結合（糖分子と別の有機化合物とが脱水縮合して形成する共有結合）を加水分解する機能を有する酵素である。そのなかでもＤＮＡグリコシラーゼは、前述したように、オリゴヌクレオチド中の核酸塩基部を認識し、そのグリコシド結合を加水分解する酵素である。

【0057】

本発明でヌクレアーゼとは、核酸の糖とリン酸の間のホスホジエステル結合を加水分解する機能を有する酵素である。ヌクレアーゼには、例えば、ＡＰエンドヌクレアーゼ、ニッキングエンドヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼが含まれる。

【0058】

ＡＰエンドヌクレアーゼは、前述したように、任意のＤＮＡグリコシラーゼの作用によって生成した脱塩基部位に隣接するホスホジエステル結合を切断する。したがって、本発明において、ＤＮＡグリコシラーゼとＡＰエンドヌクレアーゼを併用することが好ましい。

【0059】

ニッキングエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｎｂ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｂ．ＢｓｍＩ、Ｎｂ.ＢｓｒＤＩなど）は、特定のＤＮＡ配列を認識し、２本鎖のうち一方の鎖だけホスホジエステル結合が切断されたニックを生じさせる。また、エンドヌクレアーゼＶは、デオキシイノシンから３’方向に２番目のホスホジエステル結合が切断されたニックを生じさせることが可能であり、本発明の実施において有用である。

【0060】

リボヌクレアーゼはＲＮＡを分解する酵素である。本発明においては、リボヌクレオシドを「選択的に切断可能な部位」として用い、リボヌクレアーゼを作用させることで利用が可能である。リボヌクレアーゼの一種であるＲＮａｓｅＨＩＩは、ＤＮＡ配列中に組み込まれたリボヌクレオチドの５’側のホスホジエステル結合が切断されたニックを生じさせることが可能であり、本発明の実施において有用である。

【0061】

本発明でＵＳＥＲ（登録商標）とは、「Uracil-Specific Excision Reagent」 Enzymeを意味する。ＵＳＥＲは、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）とエンドヌクレアーゼＶＩＩＩとを含むウラシルを除去するエンドヌクレアーゼカクテルである。ＵＳＥＲは、２本鎖ＤＮＡ中のウラシルを除去して１塩基のギャップを生じ、ＤＮＡ鎖を切断する。ＵＳＥＲによるプロセスでは、まずＵＤＧがウラシル塩基を除去して脱塩基部位をつくる。続いてエンドヌクレアーゼがホスホジエステル結合を分解して塩基が無いデオキシリボースを遊離して１塩基分のギャップをつくる。
本明細書の説明における、ＵＳＥＲ（登録商標）酵素、及びＵＳＥＲ（登録商標）Ｅｎｚｙｍｅは上記定義のＵＳＥＲ（登録商標）である。

【0062】

本発明でビルディングブロックとは、官能基を有し、化合物の一部を構成することができる部分であり、化合物の形態であってもよい。

【0063】

本発明でそれぞれのビルディングブロックを同定することができる塩基配列とは、それぞれのビルディングブロックの構造に対応するように設計された特定の塩基配列を意味する。配列を設計するとは、例えば、ビルディングブロック構造Ａには核酸塩基配列ＡＡＡを、構造Ｂには核酸塩基配列ＴＴＴを、構造Ｃには核酸塩基配列ＣＧＣというように、構造ごとに核酸塩基配列を割り当てることを意味する。配列は、本発明の目的が達せられる限りにおいて自由に設計することができる。例えば、任意の数の塩基配列を１つのビルディングブロックに割り当てることができる。

【0064】

本発明でオリゴヌクレオチドタグとは、ビルディングブロックにより構築される部分構造の構造を同定することができる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを含む部分構造である。本発明でオリゴヌクレオチドタグとは、各ビルディングブロックに対応するオリゴヌクレオチドであっても良く、複数のビルディングブロックに対応するオリゴヌクレオチドを含む、より長鎖のオリゴヌクレオチドであっても良い。
本発明のオリゴヌクレオチドタグを構成するヌクレオチドは、本発明の効果を達成する限り制限されないが、ＰＣＲによる増幅やシーケンサーによる解析の容易さという観点において、これらの操作に適応したヌクレオチドであることが望ましい。このような好ましいヌクレオチドの例としては、塩基部として前記した天然の核酸塩基を有し、糖部として前記したリボース又は２’－デオキシリボースを有するヌクレオチドが挙げられ、より好ましい例としてはデオキシアデノシン、チミジン、デオキシシチジン又はデオキシグアノシンが挙げられる。

【0065】

（ヘッドピース）
本発明でヘッドピースとは、ＤＥＬなどの化合物ライブラリ製造のための出発化合物を意味する。本発明のヘッドピースの構造は、本発明の目的を達成する限り限定を受けないが、最も典型的な態様として、ビルディングブロックが連結され得る少なくとも１つの部位と、オリゴヌクレオチドタグが連結され得る少なくとも１つの部位とを有し、さらに少なくとも一つの選択的に切断可能な部位を構造中に含む。
後述のとおり、ＤＮＡタグは好ましくは２本鎖オリゴヌクレオチド鎖であり、オリゴヌクレオチドタグが連結され得る部位は、好ましくは２つである。

【0066】

一つの態様として、ヘッドピースは下記の模式図で示される化合物である。

【化13】

【0067】

一つの態様として、ヘッドピースは、化学的に安定であることが望ましい。
また、一つの態様として、ヘッドピースは、ＤＮＡタグとビルディングブロックとを適切な空間に配置できる構造であることが好ましい。
一つの態様として、ヘッドピースは、適度なフレキシビリティーを有することが好ましい。
ここで、さらに適度な空間配置やフレキシビリティー（ヘッドピースの構造特性）について説明する。なお、ここで説明するヘッドピースの構造特性は、ヘッドピース単体で達成されてもよく、ヘッドピースと２官能性スペーサーを結合させることで達成されてもよい。
一つの態様として、好ましいヘッドピースの構造特性は、ビルディングブロックの形成反応をヘッドピースやＤＮＡタグが阻害しない、逆に、ＤＮＡタグの伸長反応をヘッドピースやビルディングブロックが阻害しないような構造特性である。
一つの態様として、好ましいヘッドピースの構造特性は、ビルディングブロック化合物（ライブラリ化合物）とターゲット（標的タンパク質など）との相互作用に対し、ヘッドピースやＤＮＡタグ部分が影響を与えないような構造特性である。
一つの態様として、好ましいヘッドピースの構造特性は、ＤＮＡタグとビルディングブロック部位を、反対側（たとえば９０度以上反対側）に配向するような構造特性である。
一つの態様として、好ましいヘッドピースの構造特性は、ヘッドピースのループ部位とビルディングブロックとを、有機化合物の骨格換算で数原子から十数原子分隔てるような構造特性である。
一つの態様として、ヘッドピースは、ＤＮＡタグ部分、ビルディングブロック部分と適度な親和性を有することが好ましい。適度な親和性とは、例えば、本発明を実施するために、所望の条件で結合を形成し、維持し、切断できるような化学的反応性および安定性を意味する。
なお、本発明において、２官能性スペーサーとは、ビルディングブロック部位とヘッドピースとの結合を可能にする少なくとも２つの反応基を有するスペーサー部分を意味する。

【0068】

本発明の説明において、「ヘッドピース」、「ヘッドピース化合物」、「ヘッドピースのための化合物」という用語は、同概念の化合物を示す用語である。
本発明の説明において、「ヘッドピースとして用いる化合物」は、使用の観点からすると「化合物のヘッドピースとしての使用」と本質的に同様に理解することができ、方法の観点からすると「化合物をヘッドピースとして用いる方法」と本質的に同様に理解することができる。化合物ライブラリについても同様である。

【0069】

以下、好ましいヘッドピースの構造を説明するが、ヘッドピースの構造は本発明の効果を達成する限りにおいて限定はされない。

【0070】

一つの態様として、ヘッドピースは、
（Ｄ）ビルディングブロックと直接連結するか、または２官能性スペーサーを介して間接的に連結し得る少なくとも１つの部位を有する反応性官能基、
（Ｌ）反応性官能基から伸長するリンカー、
（Ｅ）オリゴヌクレオチドタグの一方の鎖と連結され得る１つの結合部位を有する第１のオリゴヌクレオチド鎖、
（Ｆ）オリゴヌクレオチドタグのもう一方の鎖と連結され得る１つの結合部位を有する第２のオリゴヌクレオチド鎖、および
（ＬＰ）前記リンカーと２つのオリゴヌクレオチド鎖に結合するループ部位、
により構成され、
Ｅ、Ｆ、又はＬＰの少なくともいずれか１つの部位に、少なくとも１つの選択的に切断可能な部位を有する。

【0071】

一つの態様として、ヘッドピースは次の式（Ｉ）で示される化合物である。

【化14】

（式中、ＥおよびＦは、それぞれ独立して
ヌクレオチド又は核酸アナログにより構成されるオリゴマーであり、
ただし、ＥとＦが互いに相補的な塩基配列を含み、二重鎖オリゴヌクレオチドを形成し、
ＬＰは、ループ部位であり、
Ｌは、リンカーであり、
Ｄは、反応性官能基である。）
で表される化合物であり、
Ｅ、Ｆ、又はＬＰの少なくともいずれか１つの部位に、少なくとも１つの選択的に切断可能な部位を有する化合物。

【0072】

なお、本発明において、ループ部位のうち、リンカーと結合する部位の部分構造のことを連結部位または（ＬＳ）と呼ぶことがある。
また、本発明においてＥ－ＬＰ－Ｆを合わせてヘアピン部位と呼ぶことがある。

【0073】

（第１および第２のオリゴヌクレオチド鎖）
以下に、第１のオリゴヌクレオチド鎖（Ｅ）および第２のオリゴヌクレオチド鎖（Ｆ）の好ましい態様について説明する。

【0074】

第１のオリゴヌクレオチド鎖（Ｅ）と第２のオリゴヌクレオチド鎖（Ｆ）は、ループ部位（ＬＰ）を介して分子内で二重鎖を形成し、ヘッドピースがヘアピン構造を形成することが好ましい。分子内での二重鎖の形成に好ましい鎖長とは３塩基以上であり、より好ましくは４塩基以上であり、さらに好ましくは６塩基以上である。
ＥおよびＦの鎖長は、一つの態様としてそれぞれ３乃至４０である。
ＥおよびＦの鎖長は、一つの態様としてそれぞれ４乃至４０である。
ＥおよびＦの鎖長は、一つの態様としてそれぞれ６乃至２５である。

【0075】

オリゴヌクレオチドタグが連結される部位は、酵素的ライゲーション、又は化学的ライゲーションに適した構造であることが好ましい。一つの態様として、ヘッドピースとオリゴヌクレオチドタグとの連結は、酵素を用いた２本鎖ライゲーションにより実施される。その場合、第１および第２のオリゴヌクレオチド鎖はライゲーションのための突出末端を形成することが好ましい。前記該突出末端の鎖長は、好ましくは２塩基以上であり、より好ましくは２乃至１０塩基であり、さらに好ましくは２乃至５塩基である。したがって、第１および第２のオリゴヌクレオチド鎖の一方は、もう一方の鎖よりも突出末端の鎖長分長いことが好ましい。また、ＤＮＡリガーゼによるライゲーションのためには、第１および第２のオリゴヌクレオチド鎖のうち、ヘッドピースの５‘末端を有している鎖の５‘末端はリン酸化されていることが好ましい。

【0076】

また、第１および第２のオリゴヌクレオチド鎖はＰＣＲのためのプライマー結合配列の一部又は全部を含んでいても良い。プライマー結合配列として適切な鎖長は１７乃至２５塩基である。

【0077】

（リンカー）
以下に、リンカー（Ｌ）の好ましい態様について説明する。
リンカーは、前記のとおり、反応性官能基から伸長し、連結部位と結合する部位である。典型的には、リンカーは以下の態様に由来する２価の基（－Ｌ－）である。

【0078】

一つの態様として、リンカーは、以下の態様（Ｌ１）である。
（Ｌ１）置換基を有しても良く、１～３個のヘテロ原子で置き換えられても良いＣ１～２０脂肪族炭化水素、又は（２）置換基を有してもよいＣ６～１４芳香族炭化水素。

【0079】

その他の態様として、Ｌは、以下の態様（Ｌ２）、（Ｌ３）、（Ｌ４）又は（Ｌ５）である。
（Ｌ２）
置換基を有しても良いＣ１～６脂肪族炭化水素、１若しくは２個の酸素原子で置き換えられても良いＣ１～６脂肪族炭化水素、又は置換基を有しても良いＣ６～１０芳香族炭化水素。
（Ｌ３）
置換基群ＳＴ１で置換可能なＣ１～６脂肪族炭化水素、又は置換基群ＳＴ１で置換可能なベンゼン。ここで、置換基群ＳＴ１は、Ｃ１～６アルキル基、Ｃ１～６アルコキシ基、フッ素原子および塩素原子により構成される群である。ただし、置換基群ＳＴ１が脂肪族炭化水素に置換する場合、置換基群ＳＴ１からアルキル基は選択されない。
（Ｌ４）
Ｃ１～６アルキル、又は無置換であるか１つまたは２つのＣ１～３アルキル基若しくはＣ１～３アルコキシ基で置換されたベンゼン。
（Ｌ５）
Ｃ１～６アルキル。

【0080】

（反応性官能基）
以下に、反応性官能基（Ｄ）の好ましい態様について説明する。
反応性官能基は、前記のとおり、ビルディングブロックと直接連結するか、または２官能性スペーサーを介して間接的に連結し得る少なくとも１つの部位を有し、リンカー基と結合する部位である。典型的には、反応性官能基は、ヘッドピースにおいて一価の基（Ｄ－）となり、ＤＥＬにおいては前記（Ｄ－）に基づく「反応性官能基由来の２価の基」（－Ｄ－）となる。
たとえば、Ｄがアミノ基の場合、（Ｄ－）の具体的構造は（Ｒ－ＨＮ－）である（Ｒは以下に説明される置換基）。例えば、活性化カルボキシ基、反応性スルホニル基、又はイソシアネート基と反応し、それぞれアミド結合、スルホンアミド結合、又はウレア結合を形成する。その際（－Ｄ－）の具体的構造は（－ＮＲ－）となる。
Ｒは、本発明の効果を達成する限り限定されないが、以下の（Ｄ１）～（Ｄ５）の態様において、Ｒは、好ましくは、（１）水素原子、または（２）無置換であるかまたはＣ１～６アルコキシ基、フッ素原子および塩素原子からなる置換基群より単独もしくは異なって選択される１～３個の置換基で置換されたＣ１～６アルキル基、である。
Ｒは、より好ましくは、水素原子またはＣ１～３アルキル基であり、さらに好ましくは水素原子である。
また、たとえば、（Ｄ－）が、脱離基（Ｘ－）を有するメチレン基である場合、（Ｄ－）の具体的構造は（Ｘ－ＣＨ_２－）であり、例えば、アミノ基、ヒドロキシ基、又はチオール基といった求核試薬と反応し、炭素―窒素結合、炭素―酸素結合、又は炭素―硫黄結合を形成する。その際、（－Ｄ－）の具体的構造は（－ＣＨ_２－）となる。また、たとえば、（Ｄ－）が、アルデヒド基である場合、（Ｄ－）の具体的構造は（ＨＯＣ－）である。アルデヒド基は、例えばアミノ基との還元的アミノ化反応により、炭素―窒素結合を形成し、その際（－Ｄ－）は－ＣＨ_２－となり、例えばリンイリド基との反応により炭素―炭素二重結合を形成し、その際（－Ｄ－）は－ＣＨ＝となり、例えばα－ジアゾホスホネート基と反応により炭素―炭素三重結合を形成し、その際（－Ｄ－）は－Ｃ≡となる。

【0081】

一つの態様として、部位（Ｄ－）は、以下の態様（Ｄ１）である。
（Ｄ１）
Ｃ―Ｃ、アミノ、エーテル、カルボニル、アミド、エステル、ウレア、スルフィド、ジスルフィド、スルホキシド、スルホンアミド、又はスルホニル結合を構成しうる官能基。
（字義どおりであるが、この場合、（－Ｄ－）は、Ｃ―Ｃ、アミノ、エーテル、カルボニル、アミド、エステル、ウレア、スルフィド、ジスルフィド、スルホキシド、スルホンアミド、又はスルホニル結合となる。）

【0082】

その他の態様として、（Ｄ－）は、以下の態様（Ｄ２）、（Ｄ３）、（Ｄ４）又は（Ｄ５）である。
（Ｄ２）
脱離基を有するＣ１炭化水素、アミノ基、水酸基、カルボニル基の前駆体、チオール基、またはアルデヒド基。
なお、この場合、（－Ｄ－）は、－（Ｃ１炭化水素）－、－ＮＲ－、－Ｏ－、－（Ｃ＝Ｏ）－、－Ｓ－、－ＣＨ_２－、－ＣＨ＝、又は－Ｃ≡、などとなりうる。
（Ｄ３）
ハロゲン原子を有するＣ１炭化水素、スルホン酸系脱離基を有するＣ１炭化水素、アミノ基、水酸基、カルボキシ基、ハロゲン化カルボキシ基、チオール基、又はアルデヒド基。
なお、この場合、（－Ｄ－）は、－（Ｃ１炭化水素）－、－ＮＲ－、－Ｏ－、－（Ｃ＝Ｏ）－、－Ｓ－、－ＣＨ_２－、－ＣＨ＝、又は－Ｃ≡、などとなりうる。
（Ｄ４）
－ＣＨ_２Ｃｌ、－ＣＨ_２Ｂｒ、－ＣＨ_２ＯＳＯ_２ＣＨ_３、－ＣＨ_２ＯＳＯ_２ＣＦ_３、アミノ基、水酸基、又はカルボキシ基。
なお、この場合、（－Ｄ－）は、それぞれ、－ＣＨ_２－、－ＮＲ－、－Ｏ－、又は－（Ｃ＝Ｏ）－となる。
（Ｄ５）
第一級アミノ基。
なお、この場合、（－Ｄ－）は、－ＮＨ－となる。

【0083】

以下に、ループ部位（ＬＰ）の好ましい態様について説明する。
ループ部位（ＬＰ）は、第１のオリゴヌクレオチド鎖（Ｅ）と第２のオリゴヌクレオチド鎖（Ｆ）が分子内で二重鎖を形成し、ヘッドピースがヘアピン構造を形成可能なように設計されることが好ましい。すなわち、ループ部位（ＬＰ）は、ループ構造が熱力学的に安定となる鎖長、及び結合の柔軟性を有していることが好ましい。
したがって、一つの態様として、ループ部位（ＬＰ）は以下である。
ＬＰが、
（ＬＰ１）ｐ－ＬＳ－（ＬＰ２）ｑで表されるループ部位であり、
ＬＳは、以下の（Ａ）ないし（Ｃ）に記載される化合物群から選ばれる部分構造であり、
（Ａ）ヌクレオチド
（Ｂ）核酸アナログ
（Ｃ）置換基を有してもよいＣ１～１４の３価の基
ＬＰ１は、以下の（１）および（２）に記載される化合物群から単独もしくは異なってｐ個選ばれる各部分構造であり、
（１）ヌクレオチド
（２）核酸アナログ
ＬＰ２は、以下の（１）および（２）に記載される化合物群から単独もしくは異なってｑ個選ばれる各部分構造であり、
（１）ヌクレオチド
（２）核酸アナログ
ｐとｑの総数が０～４０である。

【0084】

ループ部位のさらに好ましい態様は、前記説明のとおりである。
以下、さらにループ部位の構造について補足する。

【0085】

ここで、ヌクレオチドは前記説明の天然ヌクレオチドであり、核酸アナログは前記説明のとおりである。

【0086】

ここで、ＬＰ１は、以下の（１）および（２）に記載される化合物群から単独もしくは異なってｐ個選ばれる各部分構造であり、ＬＰ２は、以下の（１）および（２）に記載される化合物群から単独もしくは異なってｑ個選ばれる各部分構造である。
（１）ヌクレオチド
（２）核酸アナログ
単独もしくは異なってｐ個選ばれるとは、例えば、ｐが４である場合、ＬＰ１はＡＡＴＧ、ＡＴＣＧ、ＴＣ（d-Spacer）ＧあるいはＡ（d-Spacer）（d-Spacer）Ｃといったように、（１）と（２）に記載の化合物群より単独もしくは異なって選ぶことができる。ＬＰ２も同様である。

【0087】

また、ループ部位は、ＰＣＲのためのプライマー結合配列の一部または全部を含んでいても良い。

【0088】

（ＬＳについて）
一つの態様として、ＬＳは（Ａ）ヌクレオチドまたは（Ｂ）核酸アナログである。
ＬＳが（Ａ）ヌクレオチドまたは（Ｂ）核酸アナログの場合、ループ部位は、核酸オリゴマーとなる。本発明の核酸オリゴマーとは、ヌクレオチドまたは核酸アナログをモノマーとして連結させたオリゴマーである。オリゴマーは、鎖状化合物ともいうことができる。
したがって、本発明の核酸オリゴマーとは、オリゴヌクレオチド鎖、核酸アナログ鎖、またはヌクレオチドと核酸アナログの混合鎖のいずれかである。

【0089】

ＬＳが（Ａ）ヌクレオチドまたは（Ｂ）核酸アナログの場合、ループ部位は核酸オリゴマーとなる。その場合、ヘッドピースは核酸合成機で製造できることになり、実務上、顕著に好ましい。

【0090】

ＬＳが（Ａ）ヌクレオチドまたは（Ｂ）核酸アナログの場合、ヘッドピースの製造においては、一つの態様として、リンカー部位（Ｌ）および反応性官能基部位（Ｄ）が、ＬＳと結合した核酸合成用モノマーを調製し、そののち核酸オリゴマーを合成することができる。
そのような核酸合成モノマーの例としては、前述のAmino C6 dT、mdC（TEG-Amino）、Uni-Link（商標登録）Amino Modifierなどが挙げられる。
この態様の場合、たとえば当該モノマーであるmdC（TEG-Amino）の構造のうち、ヌクレオチド部分が連結部位（ＬＳ）に相当し、塩基から伸長する側鎖部分がリンカー部位（Ｌ）および反応性官能基部位（Ｄ）に相当する。
調製において、反応性官能基（Ｄ）は保護基で保護されていても良い。

【0091】

その場合、一つの態様として、核酸アナログは、以下の化合物（Ｂ６）である。
（Ｂ６）ヌクレオチドの塩基部に、前記（－Ｌ－Ｄ）が結合した化合物。

【0092】

一つの態様として、核酸アナログは、以下の化合物（Ｂ６１）、（Ｂ６２）、（Ｂ６３）、（Ｂ６４）または（Ｂ６５）である。
（Ｂ６１）（－Ｌ－Ｄ）が（－Ｌ１－Ｄ１）である（Ｂ６）
（Ｂ６２）（－Ｌ－Ｄ）が（－Ｌ２－Ｄ２）である（Ｂ６）。
（Ｂ６３）（－Ｌ－Ｄ）が（－Ｌ３－Ｄ３）である（Ｂ６）。
（Ｂ６４）（－Ｌ－Ｄ）が（－Ｌ４－Ｄ４）である（Ｂ６）。
（Ｂ６５）（－Ｄ）が（－Ｄ５）である（Ｂ６１）～（Ｂ６４）のいずれかに記載の化合物。

【0093】

ＬＳが（Ａ）ヌクレオチドまたは（Ｂ）核酸アナログの場合、ヘッドピースの製造においては、一つの態様として、先に核酸オリゴマーを合成し、そののち前記リンカー部位（Ｌ）および反応性官能基部位（Ｄ）を結合させることができる。
その場合において、リンカー部位が結合する相手の「特定の核酸アナログ」を、連結部位（ＬＳ）としてヘアピン部位（核酸アナログオリゴマー）の中に入れておくことが好ましい。当該「特定の核酸アナログ」の例としては、前述のAmino C6 dT、mdC（TEG-Amino）、Uni-Link（商標登録）Amino Modifierを挙げることができる。
この態様の場合、たとえばmdC（TEG-Amino）自体が連結部位（ＬＳ）に相当し、塩基側鎖から、さらに結合する付加部位が、リンカー部位（Ｌ）および反応性官能基部位（Ｄ）に相当する。

【0094】

（ｐとｑについて）
前述のとおり、前記ループ部位の鎖長は、第１のオリゴヌクレオチド鎖（Ｅ）と第２のオリゴヌクレオチド鎖（Ｆ）が分子内で二重鎖を形成し、ヘッドピースがヘアピン構造を形成する鎖長であることが好ましい。
一つの態様として、ｐとｑの総数は１～４０である。
一つの態様として、ｐとｑの総数は２～２０である。
一つの態様として、ｐとｑの総数は２～１０である。
一つの態様として、ｐとｑの総数は２～７である。

【0095】

一つの態様として、本発明のループ部位は、
（Ａ）ヌクレオチド
および以下の核酸アナログ（Ｂ４１）、（Ｂ４２）、（Ｂ４３）、（Ｂ４４）または（Ｂ５２）により構成される。
（Ｂ４１）d-Spacer
（Ｂ４２）Amino C6 dT
（Ｂ４３）mdC（TEG-Amino）
（Ｂ４４）Uni-Link（商標登録）Amino Modifier
（Ｂ５２）トリエチレングリコールリン酸エステル

【0096】

一つの態様として、ＬＳはＢ４２、Ｂ４３またはＢ４４が好ましい。
また一つの態様として、ＬＰ１およびＬＰ２は、Ａ、Ｂ４１またはＢ５２が好ましい。

【0097】

一つの態様として、ループ部位は、以下の（Ｘ１）乃至（Ｘ９）記載の配列による核酸オリゴマーである。
（Ｘ１）Ａ－Ｂ４１－Ｂ４２－Ｂ４１－Ａ
（Ｘ２）Ａ－Ｂ４１－Ｂ４３－Ｂ４１－Ａ
（Ｘ３）Ａ－Ｂ４１－Ｂ４４－Ｂ４１－Ａ
（Ｘ４）Ｂ４１－Ｂ４１－Ｂ４２－Ｂ４１－Ｂ４１
（Ｘ５）Ｂ４１－Ｂ４１－Ｂ４３－Ｂ４１－Ｂ４１
（Ｘ６）Ｂ４１－Ｂ４１－Ｂ４４－Ｂ４１－Ｂ４１
（Ｘ７）Ｂ５２－Ｂ４２－Ｂ５２
（Ｘ８）Ｂ５２－Ｂ４３－Ｂ５２
（Ｘ９）Ａ５２－Ａ４４－Ａ５２

【0098】

前記のヘッドピースにおいて、切断可能な部位の数は、好ましくは５つ以内であり、１乃至２つがより好ましい。

【0099】

前記のヘッドピースにおいて、切断可能な部位が２つ以上の場合、少なくとも１つの切断可能な部位は、第１のオリゴヌクレオチド鎖中にあるか、第１のオリゴヌクレオチド鎖とリンカー結合部位との間にあり、かつ少なくとも１つの切断可能な部位は、第２のオリゴヌクレオチド鎖中にあるか、第２のオリゴヌクレオチド鎖とリンカー結合部位との間にあることが好ましい。

【0100】

一つの態様として、前記のヘッドピースにおいて、切断可能な部位の位置は、ループ部位と、第１のオリゴヌクレオチド鎖もしくは第２のオリゴヌクレオチド鎖との結合部分を起点として、好ましくは２０塩基以内であり、より好ましくは１０塩基以内であり、さらに好ましくは３塩基以内である。

【0101】

念のための説明であるが、「選択的に切断可能な部位」の好ましい態様と、例えばＥ、Ｆ又はＬＰなどの好ましい態様は、それぞれ別の概念である。すなわち、「選択的に切断可能な部位」の位置が、Ｅに含まれた場合であっても、Ｅの好ましい態様が、「選択的に切断可能な部位」に適用されるわけではない。

【0102】

一つの態様として、本発明のＤＥＬを構成する化合物は次の式（ＩＩ）で示される化合物である。

【化15】

（式中、
ＸおよびＹは、オリゴヌクレオチド鎖であり、
ＥおよびＦは、それぞれ独立して
ヌクレオチド又は核酸アナログにより構成されるオリゴマーであり、
ただし、ＥとＦが互いに相補的な塩基配列を含み、二重鎖オリゴヌクレオチドを形成し、
ＬＰは、ループ部位であり、
Ｌは、リンカーであり、
Ｄは、反応性官能基由来の２価の基であり、
Ｓｐは、結合又は２官能性スペーサーであり、
Ａｎは、少なくとも１つのビルディングブロックにより構成される部分構造である。）
で表される化合物であり、
ＸとＹは、少なくとも一部で二重鎖を形成しうる配列を有し、
Ｘは５‘末端でＥに結合し、
Ｙは３‘末端でＦに結合し、
Ｅ、Ｆ、又はＬＰの少なくともいずれか１つの部位に、少なくとも１つの選択的に切断可能な部位を有する化合物。

【0103】

一つの態様として、前述の式（ＩＩ）で示される化合物におけるＥ、Ｆ、ＬＰ、ＬおよびＤの好ましい態様は、前述の式（Ｉ）に関し説明したＥ、Ｆ、ＬＰ、ＬおよびＤの好ましい態様と同様である。
Ｘ、Ｙ、Ｓｐ、およびＡｎの好ましい態様は別途説明される。

【0104】

（２官能性スペーサー）
前記のとおり、２官能性スペーサーは、化合物ライブラリの部分構造Ａｎとヘッドピースとの結合を可能にする少なくとも２つの反応基を有するスペーサー部分である。一つの態様として、２官能性スペーサーはＳｐＤ－ＳｐＬ－ＳｐＸである。
ＳｐＸは、ヘッドピースの反応性官能基と共有結合を形成する反応基である。
ＳｐＤは、化合物ライブラリの部分構造Ａｎと共有結合を形成する反応基である。
ＳｐＬは、化学的に不活性なスペーシング部分である。
なお、反応性官能基（Ｄ）と同様に、反応基（ＳｐＸ）は、２官能性スペーサー単体（ヘッドピースと結合させる前の試薬の状態）において一価の基（－ＳｐＸ）となり、ＤＥＬ（ヘッドピースと結合した状態）においては前記（－ＳｐＸ）に基づく「反応基由来の２価の基」（－ＳｐＸ－）となる。
また同様に、反応基（ＳｐＤ）は、Ａｎと結合させる前の状態において一価の基（ＳｐＤ－）となり、ＤＥＬ（Ａｎと結合した状態）においては前記（ＳｐＤ－）に基づく「反応基由来の２価の基」（－ＳｐＤ－）となる。

【0105】

ＳｐＸの好ましい態様は、アミノ、カルボニル、アミド、エステル、ウレア、又はスルホンアミド結合を形成する反応性基である。一つの態様として、ＳｐＸはヘッドピースの反応性官能基がアミノ基であった場合に適した反応性基である、以下の（ＳｐＸ１）、（ＳｐＸ２）または（ＳｐＸ３）の構造である。
（ＳｐＸ１）：カルボキシ基、ハロゲン化カルボキシ基、アルデヒド基、またはハロゲン化スルホニル基
（ＳｐＸ２）：カルボキシ基、またはハロゲン化スルホニル基
（ＳｐＸ３）：カルボキシ基

【0106】

ＳｐＤの好ましい態様は、前述のＤと同じである。
一つの態様として、ＳｐＤは前述の（Ｄ１）、（Ｄ２）、（Ｄ３）、（Ｄ４）または（Ｄ５）である。

【0107】

ＳｐＬの好ましい態様は、下記の態様である。
一つの態様として、ＳｐＬは前述の（Ｌ１）、（Ｌ２）、（Ｌ３）、（Ｌ４）又は（Ｌ５）である。
一つの態様として、ＳｐＬは以下の（ＳｐＬ１）、（ＳｐＬ２）または（ＳｐＬ３）である。
（ＳｐＬ１）ポリアルキレングリコール、ポリエチレン、任意にヘテロ原子で置き換えられても良いＣ１～２０脂肪族炭化水素、ペプチド、オリゴヌクレオチド、またはこれらの組み合わせ。
（ＳｐＬ２）ポリアルキレングリコール、ポリエチレン、Ｃ１～１０脂肪族炭化水素、またはペプチド
（ＳｐＬ３）ポリエチレングリコール、またはポリエチレン

【0108】

一つの態様として、２官能性スペーサーは、以下のとおりである。
（Ｓｐ１）：（Ｄ４）－（ＳｐＬ１）－（ＳｐＸ１）
（Ｓｐ２）：（Ｄ４）－（ＳｐＬ２）－（ＳｐＸ２）
（Ｓｐ３）：（Ｄ４）－（ＳｐＬ３）－（ＳｐＸ３）
（Ｓｐ４）：（Ｄ５）－（ＳｐＬ１）－（ＳｐＸ１）
（Ｓｐ５）：（Ｄ５）－（ＳｐＬ２）－（ＳｐＸ２）
（Ｓｐ６）：（Ｄ５）－（ＳｐＬ３）－（ＳｐＸ３）

【0109】

一つの態様として、ＤＥＬを構成する化合物の（Ｓｐ－Ｄ－Ｌ）部分は、以下の（ＳｐＤＬ１）、（ＳｐＤＬ２）、（ＳｐＤＬ３）（ＳｐＤＬ４）、（ＳｐＤＬ５）、（ＳｐＤＬ６）、（ＳｐＤＬ７）、（ＳｐＤＬ８）、（ＳｐＤＬ９）、または（ＳｐＤＬ１０）のように構成される。
（ＳｐＤＬ１）：（Ｄ４）－（Ｌ１）
（ＳｐＤＬ２）：（Ｄ５）－（Ｌ１）
（ＳｐＤＬ３）：（Ｄ４）－（Ｌ２）
（ＳｐＤＬ４）：（Ｄ５）－（Ｌ２）
（ＳｐＤＬ５）：（Ｓｐ１）－（Ｄ５）－（Ｌ５）
（ＳｐＤＬ６）：（Ｓｐ２）－（Ｄ５）－（Ｌ５）
（ＳｐＤＬ７）：（Ｓｐ３）－（Ｄ５）－（Ｌ５）
（ＳｐＤＬ８）：（Ｓｐ４）－（Ｄ５）－（Ｌ５）
（ＳｐＤＬ９）：（Ｓｐ５）－（Ｄ５）－（Ｌ５）
（ＳｐＤＬ１０）：（Ｓｐ６）－（Ｄ５）－（Ｌ５）
なお、（ＳｐＤＬ１）、（ＳｐＤＬ２）、（ＳｐＤＬ３）、（ＳｐＤＬ４）において、Ｓｐは結合を意味する。

【0110】

本発明の実施において、ヘッドピースは核酸合成装置で合成できると有利である。当該実施においては、前述のとおり、一つの態様として、リンカー部位（Ｌ）および反応性官能基部位（Ｄ）が、ＬＳと結合した核酸合成用モノマーを調製し、そののち核酸オリゴマーを合成することができる。そのような核酸合成モノマーの例としては、前述のAmino C6 dT、mdC（TEG-Amino）、Uni-Link（商標登録）Amino Modifierなどが挙げられる。
一方、上記のような市販の核酸合成モノマーまたは核酸合成機で使用可能な核酸アナログを用いた場合、リンカー部位の長さが制限される可能性がある。そのような場合、一つの態様として、適切な２官能性スペーサーを導入することで、ヘッドピースとＡｎの距離を調整することが可能となり、発明の実施において有利となる。

【0111】

本発明の説明において、「Ｃ１～Ｃ６のアルキル基」や「Ｃ１～６アルキル基」のような用語における「Ｃ１～Ｃ６の」や「Ｃ１～６」とは炭素数が１乃至６個であることを意味する。同様にｍ、ｎが整数の場合に、「Ｃｍ～Ｃｎの」や「Ｃｍ～ｎ」との記載があった場合、当該記載は炭素数がｍ～ｎ個であることを意味する。したがって「Ｃ１～Ｃ６のアルキル基」や「Ｃ１～６アルキル基」とは炭素数が１乃至６個であるアルキル基を、「Ｃ１～Ｃ６のアルキレン」や「Ｃ１～６アルキレン」とは炭素数が１乃至６個であるアルキレンを意味する。

【0112】

本発明で「Ｃ１～６アルキル」とは、炭素原子数が１ないし６個である直鎖または分岐鎖状のアルキル基を意味する。具体例としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ペンチル、ヘキシルなどが挙げられる。

【0113】

本発明で「Ｃ１～３アルキル」とは、炭素原子数が１ないし３個である直鎖または分岐鎖状のアルキル基を意味する。具体例は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピルである。

【0114】

本発明で「Ｃ１～６アルコキシ」とは、炭素原子数が１ないし６個である直鎖または分岐鎖状のアルコキシを意味する。具体例としては、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ－ブトキシ、ｔｅｒｔ－ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシなどが挙げられる。

【0115】

本発明で「Ｃ１～３アルコキシ」とは、炭素原子数が１ないし３個である直鎖または分岐鎖状のアルコキシを意味する。具体例は、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシである。

【0116】

本発明で「炭化水素」とは、炭素原子および水素原子のみから構成される鎖状、分岐鎖状または環状の飽和または不飽和の化合物を意味する。

【0117】

本発明で「脂肪族炭化水素」とは、炭化水素のうち、非芳香族のものを意味する。「脂肪族炭化水素」は、鎖状、分岐鎖状または環状であっても良く、また飽和または不飽和であって良い。構造の具体例としては、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル若しくはシクロアルケニル、又はこれらの組合せによる構造が挙げられる。
本発明で「Ｃ１～２０脂肪族炭化水素」とは、炭素原子数が１ないし２０個である脂肪族炭化水素を意味する。
本発明で「Ｃ１～１０脂肪族炭化水素」とは、炭素原子数が１ないし１０個である脂肪族炭化水素を意味する。
本発明で「Ｃ１～６脂肪族炭化水素」とは、炭素原子数が１ないし６個である脂肪族炭化水素を意味する。

【0118】

本発明で「芳香族炭化水素」とは、炭化水素のうち、芳香族のものを意味する。
本発明で「Ｃ６～１４芳香族炭化水素」とは、炭素原子数が６ないし１４個である芳香族炭化水素を意味する。具体例としては、ベンゼン、ナフタレン、アントラセンが挙げられる。
本発明で「Ｃ６～１０芳香族炭化水素」とは、炭素原子数が６ないし１０個である芳香族炭化水素を意味する。具体例は、ベンゼン又はナフタレンである。

【0119】

本発明の芳香族複素環は、環構造内にヘテロ原子として、窒素、酸素及び硫黄からなる群より単独又は異なって選ばれる元素を有する芳香族の複素環である。
一つの態様として、芳香族複素環は、炭素原子を１～９個有する「Ｃ１～９芳香族複素環」であり、一つの態様として、「Ｃ１～９芳香族複素環」は、５～１０員の芳香族複素環」である。
一つの態様として、芳香族複素環は、炭素原子を１～５個有する「Ｃ１～５芳香族複素環」であり、一つの態様として、「Ｃ１～５芳香族複素環」は、５～６員の芳香族複素環」である。
一つの態様として、芳香族複素環は、炭素原子を２～９個有する「Ｃ２～９芳香族複素環」であり、一つの態様として、「Ｃ２～９芳香族複素環」は、５～１０員の芳香族複素環」である。
一つの態様として、芳香族複素環は、炭素原子を２～５個有する「Ｃ２～５芳香族複素環」であり、一つの態様として、「Ｃ２～５芳香族複素環」は、５～６員の芳香族複素環」である。

【0120】

本発明の含窒素芳香族複素環は、環構造内にヘテロ原子として、窒素を有する芳香族の複素環である。
一つの態様として、含窒素芳香族複素環は、炭素原子を１～５個有する「Ｃ１～５含窒素芳香族複素環」であり、一つの態様として、「Ｃ１～５含窒素芳香族複素環」は、５～６員の芳香族複素環」である。
一つの態様として、含窒素芳香族複素環は、炭素原子を２～５個有する「Ｃ２～５含窒素芳香族複素環」であり、一つの態様として、「Ｃ２～５含窒素芳香族複素環」は、５～６員の芳香族複素環」である。

【0121】

本発明の非芳香族複素環は、環構造内にヘテロ原子として、窒素、酸素及び硫黄からなる群より単独又は異なって選ばれる元素を有する非芳香族の複素環である。
非芳香族複素環は部分不飽和結合を含んでも良い。
一つの態様として、非芳香族複素環は、炭素原子を２～９個有する「Ｃ２～９非芳香族複素環」であり、一つの態様として、「Ｃ２～９非芳香族複素環」は、５～１０員の非芳香族複素環」である。

【0122】

本発明で「Ｃ１～１４の３価の基」とは、炭素原子数が１ないし１４個である化合物に由来する３価の基を意味する。本発明の効果を達成する限り、構造は限定されない。

【0123】

本発明で「ヘテロ原子で置き換えられても良い」との記載があった場合、ヘテロ原子とは、炭素および水素以外の原子を意味する。
当該ヘテロ原子は、好ましくは、酸素原子、窒素原子、ケイ素原子、リン原子、又は硫黄原子であり、より好ましくは、酸素原子、窒素原子又は硫黄原子である。
したがって、例えば炭化水素の例としてプロピル（－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_３）を挙げると、「ヘテロ原子で置き換えられても良いプロピル」とは、アルキル中のメチレン（－ＣＨ_２－）が、酸素に置き換えられたエーテル（（－ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_３）若しくは（－Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_３））や、窒素に置き換えられたアミン（（－ＣＨ_２－ＮＨ－ＣＨ_３）若しくは（－ＮＨ－ＣＨ_２－ＣＨ_３））などの構造を含有する概念である。

【0124】

本発明で「置換基を有しても良い」との記載があった場合、その置換基は、本発明の目的を達成するかぎり限定されない。
当該置換基は、好ましくは、Ｃ１～６アルキル基、Ｃ１～６アルコキシ基、アミノ基、ヒドロキシ基、ニトロ基、シアノ基、オキソ基若しくはハロゲン原子である。
当該置換基は、より好ましくは、Ｃ１～６アルキル基、Ｃ１～６アルコキシ基、フッ素原子若しくは塩素原子である。

【0125】

本発明でポリペプチド及びペプチドとは、アミノ酸がつながって形成される化合物又は部分構造を意味する。アミノ酸とは、アミノ基とカルボキシ基の両方の官能基を持つ有機化合物の総称である。本発明のポリペプチド及びペプチドを構成するアミノ酸は、特に限定されず修飾アミノ酸などを含む。生命科学分野における一般的な用法にしたがい、本発明ではプロリン（イミノ酸に分類される）もアミノ酸に含める。本発明のポリペプチド及びペプチドを構成するアミノ酸は、好ましくはαアミノ酸であり、より好ましくは「タンパク質を構成するアミノ酸」である。

【0126】

本発明の、ハロゲン原子はフッ素原子、塩素原子、臭素原子及びヨウ素原子が挙げられる。

【0127】

Ｃ―Ｃ、アミノ、エーテル、カルボニル、アミド、エステル、ウレア、スルフィド、ジスルフィド、スルホキシド、スルホンアミド、及びスルホニル結合とは、各々の名称により理解される化学構造を有する化学結合である。当業者は、例えば、エーテル結合は一般に“－Ｏ－”で表現されうる結合であり、カルボニル結合は一般に“－Ｃ（＝Ｏ）－”で表現されうる結合であることを理解する。アミノ、アミド及びウレア結合は、窒素原子上に水素原子又はその他の置換基を有するが、本発明の効果を有する限り窒素原子上の構造は限定されない。前記窒素原子上の置換基は、好ましくはＣ１～６アルキル基又は水素原子であり、より好ましくは水素原子である。また、言及するまでもないが、Ｃ－Ｃ結合とは炭素―炭素結合を意味する。Ｃ－Ｃ結合には単結合、二重結合、及び三重結合が含まれる。一つの態様として、本発明の製造方法の工程ａ及び／又はｃでは、上記１１種から適宜選択される結合が構築される。これら１１種の結合は、有機化学における特に基本的な結合様式であり、それらを構築するための反応も当業者に周知である。したがって本発明の化合物ライブラリの部分構造Ａｎを設計・構築するにあたり、当業者であれば、これら１１種の結合を適宜組みわせて用いることができる。

【0128】

Ｈ、Ｂ、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓｉ、Ｐ、Ｓ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩからなる元素群より単独又は異なって選ばれる元素により構成される有機化合物とは、前記１２種の元素の結合により構築される有機化合物である。

【0129】

一つの態様として、本発明の化合物ライブラリの部分構造Ａｎは、上記１２種の元素により構築される。これら１２種の元素は、有機化合物における特に基本的な元素であり、それらを構築するための反応も当業者に周知である。したがって本発明の化合物ライブラリの部分構造Ａｎを設計・構築するにあたり、当業者であれば、これら１２種の元素を適宜組みあわせて用いることができる。

【0130】

アリール基、非芳香族シクリル基、ヘテロアリール基及び非芳香族ヘテロシクリル基からなる置換基群より単独又は異なって選ばれる置換基を有する低分子有機化合物とは、各々の名称により理解される化学構造を有する低分子有機化合物である。低分子化合物は、当業者に周知の概念であり、本発明における低分子化合物の好ましい分子量の例は、別途言及される。

【0131】

本発明のアリール基は、好ましくはＣ６～１０アリール基であり、より好ましくはフェニル基である。

【0132】

本発明の非芳香族シクリル基は、好ましくは、５員から８員の非芳香族シクリル基であり、より好ましくは５員又は６員の非芳香族シクリル基である。当該非芳香族シクリル基は部分不飽和結合を含んでも良い。

【0133】

本発明のヘテロアリール基及び非芳香族ヘテロシクリル基は、環構造内にヘテロ原子として、窒素、酸素及び硫黄からなる群より単独又は異なって選ばれる元素を有する基である。本発明のヘテロアリール基、非芳香族ヘテロシクリル基は、好ましくは、５員から８員の基であり、より好ましくは５員又は６員の基であり、非芳香族ヘテロシクリル基は部分不飽和結合を含んでも良い。

【0134】

一つの態様として、本発明の化合物ライブラリの部分構造Ａｎは、上記４種の基を有する。これら４種の基は、有機化合物における特に基本的な部分構造であり、それらを化合物中に構築するための反応も当業者に周知である。したがって本発明の化合物ライブラリの部分構造Ａｎを設計・構築するにあたり、当業者であれば、これら４種の基を適宜組みわせて用いることができる。

【0135】

前記の好ましい態様、すなわち、１１種の結合、１２種の元素、及び／又は４種の基で構築される化合物ライブラリは、特に核心的な価値を有する。したがって、これらの好ましい態様を外して構築した化合物ライブラリは、一般的には用途が限定され、多くの場合に商業的価値も限定されたものになることを、当業者は理解するであろう。

【0136】

Ａｎの合成履歴とは、Ａｎが合成されるまでに行われた操作全般の記録を意味し、とくに、Ａｎが合成されるまでに使用されたビルディングブロックの構造とその順序を意味する。例えば、２つ以上の別個の反応容器にて、それぞれ異なるビルディングブロックの使用、及び／又は異なる反応条件により反応が実行される場合に、反応の前、もしくは後に、あらかじめ決めておいた配列のオリゴヌクレオチド鎖を、それぞれの反応容器中の生成物に連結させることで、合成履歴がオリゴヌクレオチドの配列情報として付与される。このような操作をＡｎが構築されるまでの間、繰り返し行うことで、Ａｎの合成履歴を有するＢｎのオリゴヌクレオチドが構築される。

【0137】

スプリット・アンド・プール合成とは、ゲイセンらがコンビナトリアル化学の創成期に固相合成法を利用したペプチドライブラリのコンビナトリアル化学的な構築法として開発した合成法である。スプリット・アンド・プール合成は、スプリット・ミックス法などとも呼ばれる。

【0138】

上記経緯に従い、固相合成法を利用したペプチドライブラリの合成を例に説明すると、スプリット・アンド・プール合成では、ペプチド増端の段階ごとに、アミノ酸をペプチド結合させた固相担体からサンプルを切り出すことなく、一旦Ｎ種の担体を混合均一化させた後に等分して次のＮ種のアミノ酸を増端させる。

【0139】

すなわち担体ごとに１種類のペプチド鎖が生成することになり、各段階で天然アミノ酸２０種全てを適用すれば特定の長さのペプチドについて全ての組み合わせ可能なペプチドライブラリを構築することになる。

【0140】

このペプチドライブラリは抗原提示や受容体結合でスクリーニングするのであれば、ＥＬＩＳＡ法などを利用すれば固相担体上のペプチドを利用してアッセイを実施できる。つまり担体から試料のペプチドを切り出す必要は無く、アッセイに反応した担体粒子を拾い上げる（たとえは光学顕微鏡で０．１ｍｍほどの蛍光標識された担体粒子を拾い上げる）。そしてその粒子のペプチドを機器分析装置（ペプチドアナライザー等）で目的のペプチド配列を決定したり、他のコンビナトリアル化学的同定方法（例えばタグ法）などで間接的にスクリーニングの候補となったペプチド配列を決定したりすることができる。

【0141】

さらに本発明の製造方法において、ｍが２のときにｖ種類、ｍが３の場合にｗ種類の構造を、スプリット・アンド・プール合成で合成する場合を例として説明する。なお、本説明では、工程を（ｃ）（ｄ）の順で繰り返す。
（ｍ＝２）
ｍ＝２のステップは、Ａ１－Ｓｐ－Ｃ－Ｂ１に対し、工程（ｃ）でα２を、工程（ｄ）でβ２をそれぞれ付加し、Ａ２－Ｓｐ－Ｃ－Ｂ２を製造する。
ここで、ｖ種類の構造のα２（α２（ａ－ｖ））とそれに対応するｖ種類のβ２（β２（ａ－ｖ））を準備し、各構造について工程（ｃ）（ｄ）をそれぞれ行うと、ｖ種類のＡ２－Ｓｐ－Ｃ－Ｂ２（Ａ２（ａ）－Ｓｐ－Ｃ－Ｂ２（ａ）、Ａ２（ｂ）－Ｓｐ－Ｃ－Ｂ２（ｂ）．．．Ａ２（ｖ）－Ｓｐ－Ｃ－Ｂ２（ｖ）：すなわちＡ２（ａ－ｖ）－Ｓｐ－Ｃ－Ｂ２（ａ－ｖ））が得られる。スプリット・アンド・プール合成では、ｖ種類のＡ２－Ｓｐ－Ｃ－Ｂ２を混合したのち、ｗ個に分割する。分割とは、最も具体的にはｗ個の反応容器に小分けすることを意味する。
（ｍ＝３）
ｍ＝３のステップは、Ａ２－Ｓｐ－Ｃ－Ｂ２に対し、工程（ｃ）でα３を、工程（ｄ）でβ３をそれぞれ付加し、Ａ３－Ｓｐ－Ｃ－Ｂ３を製造する。
ここで、ｗ種類の構造のα３（α３（ａ－ｗ））と、それに対するｗ種類のβ３（β２（ａ－ｗ））を用意し、ｗ個の（Ａ２（ａ－ｖ）－Ｓｐ－Ｃ－Ｂ２（ａ－ｖ）混合物）に対し、それぞれ工程（ｃ）（ｄ）を実施する。すると、ｎ＝２と３のステップを通じ、（ｖ＋ｗ）回の合成で、（ｖ×ｗ）種類のＡ３－Ｓｐ－Ｃ－Ｂ３が効率よく合成できることになる。

【0142】

（生物評価）
得られたｗ個の生成物を混合すると、（ｖ×ｗ）種類のＡ３－Ｓｐ－Ｃ－Ｂ３化合物ライブラリの混合物が得られる。例えば、この混合物に対し薬物受容体の結合試験を行えば、（ｖ×ｗ）種類の化合物のスクリーニングを１回で行えることとなる。薬物受容体に結合しなかった化合物を洗い流すことで、結合した化合物のみを単離することができる。本発明のようなＤＥＬでは、単離したＡ３－Ｓｐ－Ｃ－Ｂ３化合物のＤＮＡを配列解読可能な量にまで増幅し、その配列情報によりＡ３の構造が把握できることとなる。

【0143】

なお、化合物ライブラリ、ビルディングブロック、スプリット・アンド・プールなどは、コンビナトリアル化学などの分野で当業者に周知に用語であり、以下の文献等を参考に適時行うことができる。
（１）高橋孝志、土井隆行「コンビナトリアルケミストリー」、有機合成化学協会誌、２００２年、 ６０巻、４２６－４３３頁
（２）コンビナトリアルケミストリー研究会編、「コンビナトリアルケミストリー」、化学同人

【0144】

ＤＮＡコード化ライブラリ（又はＤＥＬ）とは、ＤＮＡ、もしくはＤＮＡと実質的に同等の機能を有するオリゴヌクレオチドによって標識された化合物（ＤＮＡコード化化合物）の群からなる化合物ライブラリである。上記に記載したようなスプリット・アンド・プール合成によって、標識ＤＮＡには各化合物の構造、もしくは合成履歴が配列情報として付与される。このような特性から、ＤＮＡコード化ライブラリは１０^２～１０^２０種の化合物の混合物の形態で、スクリーニングし、取得された化合物に含まれるＤＮＡ配列を当技術分野で知られる手法（例えば、次世代シーケンサーの使用及び／又はマイクロアレイの使用）によって同定することにより、化合物の構造を同定することが可能となる。前記スクリーニングの手法の一つの態様として、タンパク質などの標的をＤＮＡコード化ライブラリと接触させ、標的と結合した化合物を選別するという手法が選択されうる。

【0145】

「生物学的標的」とは当業者に周知の用語であるが、一つの態様として、本発明において、「生物学的標的」とは、医農薬に代表される薬剤等の開発において標的となりうる生物学的な物質群のことであり、例えば酵素（たとえば、キナーゼ、ホスファターゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、プロテアーゼ、およびＤＮＡ修復酵素）、タンパク質：タンパク質相互作用に関係するタンパク質（たとえば、受容体のリガンド）、受容体標的（たとえば、ＧＰＣＲ）、イオンチャンネル、細胞、細菌、ウイルス、寄生虫、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プリオン、または糖質が含まれる。
「生物活性評価」とは当業者に周知の用語であるが、一つの態様として、本発明において、「生物活性評価」とは、化合物の有する生物活性（例えば、生物学的標的との結合能、酵素活性の阻害機能、酵素活性の促進機能など）の有無、又は強弱を評価することである。生物活性評価の具体例として、前述の特許文献２および３、非特許文献１～６なども参照できる。
「機能性評価」とは当業者に周知の用語であるが、一つの態様として、本発明において、「機能性評価」とは、化合物の有する特定の機能（例えば、結合能、生物活性、発光特性など）の有無、又は強弱を評価することである。

【0146】

本発明は、切断可能な部位を有するＤＮＡ鎖を用いることで、ＤＥＬ、及びＤＥＬの製造方法に関して、いくつかの利点を有する複数の手法を提供する。様式１乃至７を以下に詳細に記述する。

【0147】

様式１
本発明は、前記の「切断可能な部位を有するヘアピン型のヘッドピース」を用いたＤＥＬを提供する。

【0148】

図１で例示されるように、様式１では、切断可能な部位をＤＮＡ鎖中に含む第１のオリゴヌクレオチド鎖、ループ部位および第２のオリゴヌクレオチド鎖を含むヘッドピースを出発原料とし、ビルディングブロックの結合と、該ビルディングブロックに対応するオリゴヌクレオチドタグの２本鎖ライゲーションとを繰り返し（図１では３回）、さらに所望によりプライマー領域を含むオリゴヌクレオチドタグの２本鎖ライゲーションをすることによって、ＤＥＬの製造が達成される。

【0149】

図２で例示されるように、様式１では、切断可能な部位をヘッドピースの第１のオリゴヌクレオチド鎖中に含むＤＥＬに対し、酵素などの切断手段を用いて切断可能な部位を切断し、ループ部位で結合されていない２本鎖オリゴヌクレオチドへと誘導することで、高い効率でＰＣＲを行うことができる。

【0150】

（様式２について）
図３で例示されるように、「切断可能な部位を有するヘアピン型のヘッドピース」を用いたＤＥＬでは、切断可能な部位が第２のオリゴヌクレオチド鎖に存在しても良い。様式２の特徴は、切断可能な部位以外には、様式１と同様である。

【0151】

（様式３について）
図４で例示されるように、「切断可能な部位を有するヘアピン型のヘッドピース」を用いたＤＥＬでは、切断可能な部位が、第１と第２の双方のオリゴヌクレオチド鎖に存在しても良い。本態様では、ループ部位が双方のオリゴヌクレオチド鎖から切断されることで、ＰＣＲ効率がさらに向上することが期待される。

【0152】

（様式４について）
図５で例示されるように、本発明では、切断可能な部位が、第１のオリゴヌクレオチド鎖（Ｅ）と第２のオリゴヌクレオチド鎖（Ｆ）の双方に存在しても良く、さらに切断可能な部位の構造は異なっていても良い。そのような場合、２つの（またはそれ以上の）切断可能な部位の特性の差を利用し、切断部位を制御することができる。
たとえば、第１のオリゴヌクレオチド鎖（Ｅ）での切断可能な部位としてデオキシウリジンを、第２のオリゴヌクレオチド鎖（Ｆ）での切断可能な部位としてデオキシイノシンを用いても良い。
この場合ＵＳＥＲ酵素を用いると、第１のオリゴヌクレオチド鎖（Ｅ）のデオキシウリジンを選択的に切断できる。

【化16】

一方、アルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼとエンドヌクレアーゼＶＩＩＩを用いると、第２のオリゴヌクレオチド鎖（Ｆ）において、デオキシイノシンを起点とする切断部位を選択的に切断できる。

【化17】

このように、切断部位を所望に応じ選択することで、より幅広いＤＥＬの修飾が可能となり、その後の評価もより幅広い手法が適応可能となる。
が期待できる。

【0153】

（様式５について）
図６で例示されるように、本発明では、切断可能な部位を、ＤＮＡタグ部分（例えばオリゴヌクレオチド鎖（Ｙ））に有することもできる。ＤＮＡタグの末端近くに切断可能な部位を設け、所望に応じて当該部位を切断することで、新たな突出末端を生成することができる。

【化18】

当該突出末端は粘着末端として利用して、所望の核酸配列、例えばＵＭＩｓ（特定分子識別配列）などをライゲートすることができる。

【化19】

生物評価ののち、選抜されたＤＥＬ化合物に対し、上記のようにＵＭＩｓ領域を付与し、ＤＮＡシーケンシングすることで、ＰＣＲによる増幅バイアスが減少した解析が可能となる。
このように、本発明では、核酸配列に選択的に切断可能な部位を有することで、ＤＥＬ化合物の製造や使用の局面で、従来にない性能を付与することができる。

【0154】

ここでＵＭＩｓ（特定分子識別配列）とは、あるサンプル中に含まれるＤＮＡに付与することで、ＤＮＡ分子一つ一つに個別のＤＮＡ配列を与える分子識別子である（文献ネイチャー メソッド、２０１２年、９巻、７２－７４頁参照）。このような分子識別子をＰＣＲ増幅前に付与することで、サンプル中の特定配列を有するＤＮＡ分子数を定量する際、ＰＣＲ重複（同一分子由来配列）の識別が可能となり、ＰＣＲ増幅バイアスを減少させた定量が可能となる。

【0155】

（様式６について）
図７で例示されるように、本発明では、切断可能な部位と、修飾基や機能性分子を組み合わせて使用することでき、例えば、ヘアピン鎖ＤＮＡを１本鎖ＤＮＡに変換したＤＥＬを調製することが可能である。
図７に従い、Ｅ部分に切断可能な部位を有するヘッドピースを用いたＤＥＬ化合物を例に挙げる。
（ステップＡ）合成されたＤＥＬ化合物に対し、３‘末端に固相担持除去可能な修飾基（例えばビオチン）を有する２本鎖オリゴヌクレオチド鎖をライゲートする。
（ステップＢ）切断可能な部位を切断する。
（ステップＣ）修飾基の機能に応じた処理を加える。例えばビオチンの場合、ビオチン親和性を有するストレプトアビジンビーズなどを用い、ビオチンが結合したオリゴヌクレオチド鎖を選択的に系中から除去する。それにより、１本鎖ＤＮＡを有するＤＥＬを取得することが可能である。

【0156】

ここで機能性分子とは、特定の化学的、又は生物学的機能（例えば、溶解性、光反応性、基質特異的反応性、標的タンパク分解誘導特性）を有する分子のことであり、ＤＥＬに付与することで、機能に応じたＤＥＬの評価や精製が可能となる。

【0157】

ここでビオチンとは、アビジンと結合するビオチン類全般を意味し、ビタミンＢ_７だけでなく、例えばデスチオビオチンをも含む。

【0158】

図８で例示されるように、１本鎖ＤＮＡを有するＤＥＬは、所望の機能部位を有する修飾オリゴヌクレオチド（例えば光反応性クロスリンカーなどのクロスリンカー修飾ＤＮＡ）と２本鎖を形成させることで、新たな機能を付与することが可能となる。

【0159】

（様式７について）
図９で例示されるように、本発明では、切断可能な部位を利用し、クロスリンカーを導入することができる。
図９に従い、Ｅ部分に切断可能な部位を有するヘッドピースを用いたＤＥＬ化合物を例に挙げる。
（ステップＡ）合成されたＤＥＬ化合物に対し、切断可能な部位を切断する。
（ステップＢ）所望の機能部位を有する修飾プライマー（例えば光反応性クロスリンカーなどのクロスリンカー修飾プライマー）を付与する。
（ステップＣ）付与したプライマーを伸長し、クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬ化合物を合成する。
ＤＥＬ評価の場面において、クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬ化合物は、ビルディングブロック化合物（ライブラリ低分子化合物）が標的タンパクに結合する際、さらにクロスリンク構造を標的タンパクに結合させることができ、検出感度を顕著に向上させることができる（非特許文献５，６など参照）。非常に多数のライブラリ化合物を評価するＤＥＬ技術の実務上、ライブラリ化合物のアフィニティーを増強し、検出感度を向上させることは、非常に有用である。
本発明は、斬新で高効率なクロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬ化合物の製造法を提供するものであり、非常に有用である。

【0160】

以下に実施例を示し、本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
なお、実施例における各種の配列の核酸は、例えば、核酸自動合成機により定法にしたがい調製することができる。核酸自動合成機の例としては、ｎＳ－８II（ジーンデザイン社製）などが挙げられる。また、核酸の調製には、委託合成やコントラクトラボなどを利用することもできる。当業者に周知にコントクトラボとしては、ジーンデザイン社やＬＧＣ Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社などが挙げられる。一般に
これらコントラクトラボは、秘密保持契約のもと、委託者の指定した配列の核酸を調製し、委託者に納入する。

【0161】

実施例１
［デオキシウリジンを含むヘアピン型ＤＥＬの部分構造のＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅによる切断反応の検証］
表１に示す配列の化合物を、核酸自動合成機ｎＳ－８II（ジーンデザイン社製）を使用して調製した。なお、表１中の配列表記において、当業者には明らかであるが、各配列単位間はリン酸ジエステル結合で結合していて、「Ａ」はデオキシアデノシンを意味し、「Ｔ」はチミジンを意味し、「Ｇ」はデオキシグアノシンを意味し、「Ｃ」はデオキシシチジンを意味し、「（ｄＵ）」はデオキシウリジンを意味し、「（ｐ）」はリン酸を意味し、「（ａｍｉｎｏ－Ｃ６－ｄＴ）」は次の式（１）

【化20】

で表される修飾核酸を意味し、「（ａｍｉｎｏ－ＮＣ６－ｄＴ）」は次の式（２）

【化21】

で表される修飾核酸を意味し、「（ｄＳｐａｃｅｒ）」は次の式（３）

【化22】

で表される基を意味し、「（ａｍｉｎｏＣ７）」は次の式（４）

【化23】

で表される基を意味する。また、ａｍｉｎｏ－ＮＣ６－ｄＴは、（米国化学会誌，１９９３年、１１５巻、７１２８－７１３４貢）に記載の方法に準じて合成した次の式（５）

【化24】

の核酸合成試薬を用いて導入した。

【0162】

表１中、左カラムの“Ｎｏ．”は配列番号を表し、右カラムの“Ｓｅｑ．”は配列を表す。配列は左側が５‘側を表し、右側が３’側を表す。また、各配列番号（Ｎｏ．）に該当する化合物の名称は以下のとおりである。
Ｎｏ．１：Ｕ－ＤＥＬ１－ｓｈ Ｎｏ．２：Ｕ－ＤＥＬ２－ｓｈ
Ｎｏ．３：Ｕ－ＤＥＬ３－ｓｈ Ｎｏ．４：Ｕ－ＤＥＬ４－ｓｈ
Ｎｏ．５：Ｕ－ＤＥＬ５－ＨＰ Ｎｏ．６：Ｕ－ＤＥＬ６－ＨＰ
Ｎｏ．７：Ｕ－ＤＥＬ７－ＨＰ Ｎｏ．８：Ｕ－ＤＥＬ８－ＨＰ
Ｎｏ．９：Ｕ－ＤＥＬ９－ＨＰ Ｎｏ．１０：Ｕ－ＤＥＬ１０－ＨＰ

【0163】

【表1】

【0164】

表１に示す配列の化合物それぞれ０．１ｍＭ水溶液を調製し、以下の手順でＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅによる切断反応の検討を行った。

【0165】

ＰＣＲチューブに、１μＬの表１に示す配列の化合物０．１ｍＭ水溶液；１０μＬのＣｕｔＳｍａｒｔ（登録商標） Ｂｕｆｆｅｒ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ製、カタログ番号Ｂ７２０４Ｓ）及び７９μＬの脱イオン水を加えた。溶液に１０μＬのＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ製、カタログ番号Ｍ５５０５Ｓ）を加え、得られた溶液を３７℃でインキュベーションを開始した。

【0166】

各反応溶液をインキュベーション開始後、１時間、及び３時間経過した後に、それぞれ２０μＬサンプリングした。Ｕ－ＤＥＬ１－ｓｈ、Ｕ－ＤＥＬ５－ＨＰ、Ｕ－ＤＥＬ６－ＨＰ、Ｕ－ＤＥＬ７－ＨＰ、Ｕ－ＤＥＬ８－ＨＰ、Ｕ－ＤＥＬ９－ＨＰ、及びＵ－ＤＥＬ１０－ＨＰは２０時間経過後もそれぞれ２０μＬサンプリングした。Ｕ－ＤＥＬ８－ＨＰ、及びＵ－ＤＥＬ９－ＨＰは、さらに９０℃で１時間インキュベーションした後に、それぞれ２０μＬサンプリングした。

【0167】

サンプリングした溶液のうち、Ｕ－ＤＥＬ１－ｓｈ、Ｕ－ＤＥＬ２－ｓｈ、Ｕ－ＤＥＬ３－ｓｈ、及びＵ－ＤＥＬ４－ｓｈは以下に示す分析条件１で分析を行い、Ｕ－ＤＥＬ５－ＨＰ、Ｕ－ＤＥＬ６－ＨＰ、Ｕ－ＤＥＬ７－ＨＰ、Ｕ－ＤＥＬ８－ＨＰ、Ｕ－ＤＥＬ９－ＨＰ、及びＵ－ＤＥＬ１０－ＨＰは以下に示す分析条件２で分析を行った。

【0168】

分析条件１：
装置：ｍａＸｉｓ（Ｂｒｕｋｅｒ製）、ＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００（Ｄｉｏｎｅｘ製）
カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＢＥＨ Ｃ１８ Ｃｏｌｕｍｎ（１３０Å、１．７μｍ、２．１×５０ｍｍ）
カラム温度：５０℃
溶媒：
Ａ液：水（０．７５％ ｖ／ｖ ヘキサフルオロイソプロパノール；０．０３８％ ｖ／ｖ トリエチルアミン；５μＭ エチレンジアミン四酢酸）
Ｂ液：９０％ ｖ／ｖ メタノール水溶液（０．７５％ ｖ／ｖ ヘキサフルオロイソプロパノール；０．０３８％ ｖ／ｖ トリエチルアミン；５μＭ エチレンジアミン四酢酸）
グラジエント条件：
流速０．３６ｍＬ／ｍｉｎ、Ａ液とＢ液の混合比を９５／５（ｖ／ｖ）に固定して測定開始し、０．５６分後に５．５分間でＡ液とＢ液の混合比を４０／６０（ｖ／ｖ）に直線的に変えた。
検出波長：２６０ｎｍ

【0169】

分析条件２：
装置：Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ／ＳＱ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ
カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＢＥＨ Ｃ１８ Ｃｏｌｕｍｎ（１３０Å、１．７μｍ、２．１×５０ｍｍ）
カラム温度：５０℃
溶媒：
Ａ液：水（０．７５％ ｖ／ｖ ヘキサフルオロイソプロパノール；０．０３８％ ｖ／ｖ トリエチルアミン；５μＭ エチレンジアミン四酢酸）
Ｂ液：９０％ ｖ／ｖ メタノール水溶液（０．７５％ ｖ／ｖ ヘキサフルオロイソプロパノール；０．０３８％ ｖ／ｖ トリエチルアミン；５μＭ エチレンジアミン四酢酸）
グラジエント条件：
流速０．３６ｍＬ／ｍｉｎ、Ａ液とＢ液の混合比を９５／５（ｖ／ｖ）に固定して測定開始し、０．５６分後に５．５分間でＡ液とＢ液の混合比を４０／６０（ｖ／ｖ）に直線的に変えた。
検出波長：２６０ｎｍ

【0170】

各反応溶液において想定される生成物（デオキシウリジン部分の脱塩基体、及び切断されたフラグメント）の配列と理論分子量、及び各反応溶液において検出された分子量を表２、表３に示す。なお、表２、表３中、の各カラムの表記は以下のとおりである。

【0171】

“Ｅｎｔｒｙ”（ 一番左）:
実験番号を示し、各実験番号（Ｅｎｔｒｙ）に該当する基質は以下のとおりである。
Ｅｎｔｒｙ．１：Ｕ－ＤＥＬ１－ｓｈ Ｅｎｔｒｙ．２：Ｕ－ＤＥＬ２－ｓｈ
Ｅｎｔｒｙ．３：Ｕ－ＤＥＬ３－ｓｈ Ｅｎｔｒｙ．４：Ｕ－ＤＥＬ４－ｓｈ
Ｅｎｔｒｙ．５：Ｕ－ＤＥＬ５－ＨＰ Ｅｎｔｒｙ．６：Ｕ－ＤＥＬ６－ＨＰ
Ｅｎｔｒｙ．７：Ｕ－ＤＥＬ７－ＨＰ Ｅｎｔｒｙ．８：Ｕ－ＤＥＬ８－ＨＰ
Ｅｎｔｒｙ．９：Ｕ－ＤＥＬ９－ＨＰ Ｅｎｔｒｙ．１０：Ｕ－ＤＥＬ１０－ＨＰ

【0172】

“Ｎｏ．”（左から２番目）：
配列番号を表す。なお、各配列番号（Ｎｏ．）のうち、Ｎｏ．１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０は各反応溶液の基質であり、Ｎｏ．１１、１４、１７、２０、２２、２５、２９ 、３１、３３、及び３５は、各基質のデオキシウリジン部分の脱塩基体であり、残りの配列番号は各基質が切断されたフラグメントである。

【0173】

“Ｓｅｑ．” （左から３番目）：
配列を表し、左側が５‘側を表し、右側が３’側を表す。
なお、配列表記において、「（Ｂ）」は次の式（６）

【化25】

で表される基（脱塩基部位）を意味し、その他の表記は表１と同じである。

【0174】

“Ｅｘｐｅｃｔｅｄ ＭＷ．” （左から４番目）：
各配列の理論分子量（Ｄａ）の数値を表す。

【0175】

“Ｏｂｓｅｒｖｅｄ ＭＷ．” （ 一番右）：
各配列として同定した検出された分子量（Ｄａ）の数値を表す。なお、「－」表記は未検出であることを表す。

【0176】

【表2】

【0177】

【表3】

【0178】

検出された各配列に該当するピークの面積比から、脱塩基反応および切断反応の転化率を算出した。脱塩基反応はすべての基質において、３７℃、１ｈの段階で９９％以上転化していた（基質のピークが１％未満であり、残りのピークが脱塩基体と切断されたフラグメントのみ）。
また、切断反応の転化率を表したグラフを図１０に示す。グラフに示すように、Ｕ－ＤＥＬ８－ＨＰとＵ－ＤＥＬ９－ＨＰを除く、すべての基質において３７℃、２０ｈまでに９５％以上切断反応が進行しており、Ｕ－ＤＥＬ８－ＨＰとＵ－ＤＥＬ９－ＨＰにおいても、９０℃、１ｈのインキュベーションを追加することで、切断反応が１００％完了した。

【0179】

以上の結果から、各種デオキシウリジンを含むヘアピン型ＤＥＬの部分構造は、デオキシウリジン部位でＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅによる脱塩基反応、続いて切断反応が進行することが示された。

【0180】

実施例２
［従来型ヘアピンＤＥＬと切断可能なヘアピンＤＥＬ（デオキシウリジンを含むヘアピン型ＤＥＬ）のＰＣＲ効率の比較］

【0181】

図１１に示す概略図のように、表４に示す配列の化合物（ヘアピンＤＥＬ）を以下の手順にて合成した。なお、表４中の配列表記において、「Ｓ」は次の式（７）

【化26】

で表される基を意味し、その他の表記は表１と同じである。
各配列番号（Ｎｏ．）に該当する化合物の名称は以下のとおりである。
Ｎｏ．３７：Ｕ－ＤＥＬ１ Ｎｏ．３８：Ｕ－ＤＥＬ２
Ｎｏ．３９：Ｕ－ＤＥＬ４ Ｎｏ．４０：Ｕ－ＤＥＬ７
Ｎｏ．４１：Ｕ－ＤＥＬ８ Ｎｏ．４２：Ｕ－ＤＥＬ９
Ｎｏ．４３：Ｕ－ＤＥＬ１０ Ｎｏ．４４：Ｈ－ＤＥＬ

【表4】

なお、各ヘアピンＤＥＬを合成するための原料ヘッドピースの化合物名はそれぞれ以下のとおりである。
ヘアピンＤＥＬ ：原料ヘッドピース
Ｕ－ＤＥＬ１ ：Ｕ－ＤＥＬ１－ＨＰ
Ｕ－ＤＥＬ２ ：Ｕ－ＤＥＬ２－ＨＰ
Ｕ－ＤＥＬ４ ：Ｕ－ＤＥＬ４－ＨＰ
Ｕ－ＤＥＬ７ ：Ｕ－ＤＥＬ７－ＨＰ
Ｕ－ＤＥＬ８ ：Ｕ－ＤＥＬ８－ＨＰ
Ｕ－ＤＥＬ９ ：Ｕ－ＤＥＬ９－ＨＰ
Ｕ－ＤＥＬ１０ ：Ｕ－ＤＥＬ１０－ＨＰ
Ｈ－ＤＥＬ ：Ｈ－ＤＥＬ－ＨＰ
さらに、Ｕ－ＤＥＬ１－ＨＰ、Ｕ－ＤＥＬ２－ＨＰ、Ｕ－ＤＥＬ４－ＨＰ、及びＨ－ＤＥＬ－ＨＰの配列番号“Ｎｏ．”および配列“Ｓｅｑ”は以下の表５のとおりである。

【表5】

【0182】

表５に示す原料ヘッドピースを、実施例１と同様に核酸自動合成機ｎＳ－８II（ジーンデザイン社製）を使用して調製した。

【0183】

ＰＣＲチューブに、２．０μＬの各種原料ヘッドピースの１ｍＭ水溶液；２．４μＬのＰｒ＿ＴＡＧの１ｍＭ水溶液（実施例１と同様に合成したＰｒ＿ＴＡＧ＿ａとＰｒ＿ＴＡＧ＿ｂをアニーリングして調製、表６に配列を示す）；０．８μＬの１０Ｘリガーゼ緩衝液（５００ｍＭ トリス塩酸、ｐＨ７．５；５００ｍＭ 塩化ナトリウム；１００ｍＭ 塩化マグネシウム；１００ｍＭ ジチオスレイトール；２０ｍＭ アデノシン三リン酸）及び２．０μＬの脱イオン水を加えた。溶液に０．８μＬのＴ４ＤＮＡリガーゼ（サーモフィッシャー製、カタログ番号ＥＬ００１３）の１０倍希釈水溶液を加え、得られた溶液を１６℃で２４時間インキュベーションした。なお、表６中の配列表記は表１と同じである。また、各配列番号（Ｎｏ．）に該当する化合物の名称は以下のとおりである。
Ｎｏ．４９：Ｐｒ_ＴＡＧ_ａ Ｎｏ．５０：Ｐｒ_ＴＡＧ_ｂ

【表6】

【0184】

反応溶液を、０．８μＬの５Ｍの塩化ナトリウム水溶液および１７．６μＬの冷却された（－２０℃）エタノールにより処理し、－７８℃で２時間精置した。遠心分離後、上清を除き、得られたペレットを風乾した。各ペレットに２．０μＬ脱イオン水を加え溶液を調製した。

【0185】

得られた各溶液に、２．４μＬのＣＰの１ｍＭ水溶液（実施例１と同様に合成したＣＰ＿ａとＣＰ＿ｂをアニーリングして調製、表７に配列を示す）；０．８μＬの１０Ｘリガーゼ緩衝液（５００ｍＭ トリス塩酸、ｐＨ７．５；５００ｍＭ 塩化ナトリウム；１００ｍＭ 塩化マグネシウム；１００ｍＭ ジチオスレイトール；２０ｍＭ アデノシン三リン酸）及び２．０μＬの脱イオン水を加えた。溶液に０．８μＬのＴ４ＤＮＡリガーゼ（サーモフィッシャー製、カタログ番号ＥＬ００１３）の１０倍希釈水溶液を加え、得られた溶液を１６℃で２４時間インキュベーションした。なお、表７中の配列表記は表１と同じである。また、各配列番号（Ｎｏ．）に該当する化合物の名称は以下のとおりである。
Ｎｏ．５１：ＣＰ＿ａ Ｎｏ．５２：ＣＰ＿ｂ

【表7】

【0186】

反応溶液を、０．８μＬの５Ｍの塩化ナトリウム水溶液および１７．６μＬの冷却された（－２０℃）エタノールにより処理し、－７８℃で２時間精置した。遠心分離後、上清を除き、得られたペレットを風乾した。ペレットに１０μＬ脱イオン水を加え溶液にした。

【0187】

得られた溶液のうち１．０μＬをサンプリングし、脱イオン水で希釈したのち、実施例１の分析条件２の条件にて、ＥＳＩ－ＭＳによる質量分析を行い、目的物を同定した（各配列の理論分子量、及び検出された分子量を表４中に示す）。溶液の残りを凍結乾燥した後、それぞれ脱イオン水を加え、２０μＭに調製した。

【0188】

上記で得られた８種ヘアピン型ＤＥＬのうち、Ｈ－ＤＥＬは従来型ヘアピンＤＥＬであり、残りの７種はデオキシウリジンを含む切断可能なヘアピンＤＥＬである。各種ヘアピン型ＤＥＬのＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅによる処理前のＰＣＲ効率と、処理後のＰＣＲ効率を比較するため、リアルタイムＰＣＲ解析を実施した。また、比較対象の２本鎖ＤＥＬとして表７に示すＤＳ－ＤＥＬ（配列Ｎｏ．４７とＮｏ．４８の化合物をアニーリングして調製）を用いた。なお、表８中の配列表記において、「（ａｍｉｎｏ－Ｃ６－Ｌ）」は次の式（８）

【化27】

で表される基を意味し、その他の表記は表１と同じである。

【表8】

【0189】

＜ＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅによる処理工程＞
８種のヘアピンＤＥＬ、及び２本鎖ＤＥＬ（ＤＳ－ＤＥＬ）のＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅによる処理を以下の手順で行った。

【0190】

ＰＣＲチューブに、１μＬの各種ＤＥＬ２０μＭ水溶液；１μＬのＣｕｔＳｍａｒｔ（登録商標）Ｂｕｆｆｅｒ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ製、カタログ番号Ｂ７２０４Ｓ）及び７μＬの脱イオン水を加えた。溶液に１μＬのＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ製、カタログ番号Ｍ５５０５Ｓ）を加え、得られた溶液を３７℃で１時間インキュベーションした。

【0191】

＜ＤＥＬ試料の調製＞
各種ＤＥＬのＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅ処理前のサンプル、および処理後の反応溶液をそれぞれ脱イオン水で希釈し、０．０５ｐＭ、０．５ｐＭ、および５ｐＭのＤＥＬ試料を調製した。

【0192】

＜リアルタイムＰＣＲのよるＣｔ値の測定＞
上記で得られた各種ＤＥＬ試料を、リアルタイムＰＣＲによりＣｔ値を測定し、ＰＣＲ効率を比較した。条件は以下のとおりであり、結果を図１２に示す。なお、Ｃｔ値とは、リアルタイムＰＣＲにおいて、ＤＮＡの増幅に伴って生じる蛍光シグナルが任意の閾値に到達するサイクル数のことである。すなわち、初期のＤＮＡ分子数が同等である場合、ＰＣＲ効率が高いほどＣｔ値が低くなる。

【0193】

装置：７５００リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）
プレート：ＭｉｃｒｏＡｍｐ ９６－Ｗｅｌｌプレート（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、カタログ番号Ｎ８０１０５６０）
ＰＣＲ反応溶液：
・ＴＢ Ｇｒｅｅｎ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ ｔａｑII（タカラバイオ社製、カタログ番号ＲＲ８２０） ：１０μＬ
・フォワードプライマー（表９、配列番号５５） ：０．８０μＬ
・リバースプライマー（表９、配列番号５６） ：０．８０μＬ
・ＲＯＸ Ｒｅｆｆｅｒｅｎｃｅ ＤｙｅII（タカラバイオ社製、カタログ番号ＲＲ３９ＬＲ） ：０．４０μＬ
・各種ＤＥＬ試料の水溶液（０．０５ｐＭ、０．５ｐＭ、５ｐＭ）＊１ ：２．０μＬ
・脱イオン水 ：６．０μＬ
＊ １ ：ＤＥＬ試料のモル数は、０．１ａｍоｌ、１ａｍоｌ、１０ａｍоｌとなる。
温度条件：
・９５℃で２分間保持した後、以下のサイクルを３５サイクル繰り返した。
・９５℃、５秒間
・５２℃、３０秒間
・７２℃、３０秒間

【表9】

なお、表９中の配列表記は表１と同じである。

【0194】

図１２に示すように、従来型ヘアピンＤＥＬ（Ｈ－ＤＥＬ）はＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅ処理の前後でＣｔ値が変化しないが、デオキシウリジンを含む切断可能なヘアピンＤＥＬ（Ｕ－ＤＥＬ１、Ｕ－ＤＥＬ２、Ｕ－ＤＥＬ４、Ｕ－ＤＥＬ７、Ｕ－ＤＥＬ８、Ｕ－ＤＥＬ９、及びＵ－ＤＥＬ１０）は、ＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅ処理後に２本鎖ＤＥＬであるＤＳ－ＤＥＬと同等までＣｔ値が低下した。

【0195】

本結果は、ＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅにより切断されたＤＥＬは、切断前よりもＰＣＲ効率が向上していること、及び、デオキシウリジンを含む切断可能なヘアピンＤＥＬは、ＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅにより高効率、高選択的に切断されていることを示している。

【0196】

実施例３
［デオキシウリジンを含むヘアピンＤＥＬのＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅによる切断反応の検証］
＜４種のヘアピンＤＥＬ（Ｕ－ＤＥＬ５、Ｕ－ＤＥＬ１１、Ｕ－ＤＥＬ１２、及びＵ－ＤＥＬ１３）の合成＞
表１０に示す配列の化合物（ヘアピンＤＥＬ）を以下の手順にて合成した。なお、表１０中の配列表記において、「［ｍｄＣ（ＴＥＧ－ａｍｉｎｏ）］」は次の式（９）

【化28】

で表される基を意味し、その他の表記は表４と同じである。
各配列番号（Ｎｏ．）に該当する化合物の名称は以下のとおりである。
Ｎｏ．５７：Ｕ－ＤＥＬ５ Ｎｏ．５８：Ｕ－ＤＥＬ１１
Ｎｏ．５９：Ｕ－ＤＥＬ１２ Ｎｏ．６０：Ｕ－ＤＥＬ１３

【表10】

なお、各ヘアピンＤＥＬを合成するための原料ヘッドピースの化合物名はそれぞれ以下のとおりである。
ヘアピンＤＥＬ ：原料ヘッドピース
Ｕ－ＤＥＬ５ ：Ｕ－ＤＥＬ５－ＨＰ
Ｕ－ＤＥＬ１１ ：Ｕ－ＤＥＬ１１－ＨＰ
Ｕ－ＤＥＬ１２ ：Ｕ－ＤＥＬ１２－ＨＰ
Ｕ－ＤＥＬ１３ ：Ｕ－ＤＥＬ１３－ＨＰ
さらに、Ｕ－ＤＥＬ１１－ＨＰ、Ｕ－ＤＥＬ１２－ＨＰ、及びＵ－ＤＥＬ１３－ＨＰの配列番号“Ｎｏ．”および配列“Ｓｅｑ”は以下の表１１のとおりである。なお、表１１中の表記は表１０と同じである。

【0197】

【表11】

【0198】

表１１に示す原料ヘッドピースのうちＵ－ＤＥＬ１２－ＨＰ及びＵ－ＤＥＬ１３－ＨＰは、実施例１と同様に核酸自動合成機ｎＳ－８II（ジーンデザイン社製）を使用して調製した。Ｕ－ＤＥＬ１１－ＨＰも同様に定法に従い調製した。

【0199】

実施例２と同様に、各種原料ヘッドピースを用い、２本鎖オリゴヌクレオチドＰｒ＿ＴＡＧ、及びＣＰとの２段階の２本鎖ライゲーションを実施した。

【0200】

得られた溶液の一部をサンプリングし、脱イオン水で希釈したのち、以下に示す分析条件３にて、ＥＳＩ－ＭＳによる質量分析を行い、目的物を同定した（各配列の理論分子量、及び検出された分子量を表１０中に示す）。溶液の残りを凍結乾燥した後、それぞれ脱イオン水を加え、２０μＭに調製した。

【0201】

分析条件３：
装置：Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ／ＳＱ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ
カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＢＥＨ Ｃ１８ Ｃｏｌｕｍｎ（１３０Å、１．７μｍ、２．１×５０ｍｍ）
カラム温度：６０℃
溶媒：
Ａ液：水（０．７５％ ｖ／ｖ ヘキサフルオロイソプロパノール；０．０３８％ ｖ／ｖ トリエチルアミン；５μＭ エチレンジアミン四酢酸）
Ｂ液：９０％ ｖ／ｖ メタノール水溶液（０．７５％ ｖ／ｖ ヘキサフルオロイソプロパノール；０．０３８％ ｖ／ｖ トリエチルアミン；５μＭ エチレンジアミン四酢酸）
グラジエント条件：
流速０．３６ｍＬ／ｍｉｎ、Ａ液とＢ液の混合比を９５／５（ｖ／ｖ）に固定して測定開始し、０．５６分後に５．５分間でＡ液とＢ液の混合比を４０／６０（ｖ／ｖ）に直線的に変えた。
検出波長：２６０ｎｍ
デコンボリューション：
イオンシグナルをＰｒｏＭａｓｓ ｆｏｒ ＭａｓｓＬｙｎｘ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｗａｔｅｒｓ製）を用いて解析した。

【0202】

＜ＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅによる切断反応＞
６種のデオキシウリジンを含むヘアピンＤＥＬ（Ｕ－ＤＥＬ５、Ｕ－ＤＥＬ７、Ｕ－ＤＥＬ９、Ｕ－ＤＥＬ１１、Ｕ－ＤＥＬ１２、及びＵ－ＤＥＬ１３）のＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅによる切断反応の検討を以下の手順で行った。

【0203】

ＰＣＲチューブに、２μＬの各種ヘアピンＤＥＬ２０μＭ水溶液；２μＬのＣｕｔＳｍａｒｔ（登録商標）Ｂｕｆｆｅｒ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ製、カタログ番号Ｂ７２０４Ｓ）及び１４μＬの脱イオン水を加えた。溶液に２μＬのＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ製、カタログ番号Ｍ５５０５Ｓ）を加え、得られた溶液を３７℃で１６時間インキュベーションした後、さらに９０℃で１時間インキュベーションした。

【0204】

＜ＬＣ―ＭＳ測定による切断後の生成物の確認＞
得られた反応溶液のうち５．０μＬをサンプリングし、脱イオン水で希釈したのち、分析条件３にて、ＥＳＩ－ＭＳによる質量分析を行った。各反応溶液において想定される切断後の生成物の配列と理論分子量、及び各反応溶液において検出された分子量を表１２に示す。なお、各実験番号（Ｅｎｔｒｙ）に該当する基質は以下のとおりであり、その他の表記は表１０と同じである。
Ｅｎｔｒｙ．１：Ｕ－ＤＥＬ５ Ｅｎｔｒｙ．２：Ｕ－ＤＥＬ７
Ｅｎｔｒｙ．３：Ｕ－ＤＥＬ９ Ｅｎｔｒｙ．４：Ｕ－ＤＥＬ１１
Ｅｎｔｒｙ．５：Ｕ－ＤＥＬ１２ Ｅｎｔｒｙ．６：Ｕ－ＤＥＬ１３

【0205】

【表12】

【0206】

いずれのサンプルも基質のＭＳは検出されず、切断後の生成物のＭＳがメインピークとして観測された。

【0207】

＜ゲル電気泳動による切断反応の確認＞
また、得られた反応溶液のうち一部をサンプリングし、以下に示す条件で、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析を行った。図１３に示す結果から、いずれの基質も高収率で切断反応が進行していることが確認された。なお、図１３の各レーンのサンプルは以下のとおりである。
レーン１：２０ｂｐ ＤＮＡラダー（ロンザ製、Ｌｏｎｚａ ２０ ｂｐ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ、カタログ番号５０３３０）
レーン２：Ｕ－ＤＥＬ５
レーン３：Ｕ－ＤＥＬ５の切断反応実施後サンプル
レーン４：Ｕ－ＤＥＬ７
レーン５：Ｕ－ＤＥＬ７の切断反応実施後サンプル
レーン６：Ｕ－ＤＥＬ９
レーン７：Ｕ－ＤＥＬ９の切断反応実施後サンプル
レーン８：Ｕ－ＤＥＬ１１
レーン９：Ｕ－ＤＥＬ１１の切断反応実施後サンプル
レーン１０：Ｕ－ＤＥＬ１２
レーン１１：Ｕ－ＤＥＬ１２の切断反応実施後サンプル
レーン１２：Ｕ－ＤＥＬ１３
レーン１３：Ｕ－ＤＥＬ１３の切断反応実施後サンプル
変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動：
ゲル：Ｎｏｖｅｘ（商品商標）１０％ＴＢＥ－ウレアゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｂｙ ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ製、カタログ番号ＥＣ６８７５５ＢＯＸ）
ローディングバッファー：Ｎｏｖｅｘ（商品商標）１０％ＴＢＥ－Ｕｒｅａ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（２×）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｂｙ ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ製、カタログ番号ＬＣ６８７６）
温度：６０℃
電圧：１８０Ｖ
泳動時間：３０分
染色試薬：ＳＹＢＥＲ（商品商標） ＧｒｅｅｎII Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｇｅｌ Ｓｔａｉｎ（タカラバイオ社製、カタログ番号５７７０Ａ）

【0208】

以上の結果から、各種デオキシウリジンを含むヘアピン型ＤＥＬは、デオキシウリジン部位でＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅによる切断反応が進行することが示された。

【0209】

実施例４
［デオキシイノシンを含むヘアピンＤＥＬのエンドヌクレアーゼＶによる切断反応の検証］
＜４種のデオキシイノシンを含むヘアピンＤＥＬ（Ｉ－ＤＥＬ１、Ｉ－ＤＥＬ２、Ｉ－ＤＥＬ３、及びＩ－ＤＥＬ４）の合成＞
表１３に示す配列の化合物（ヘアピンＤＥＬ）を以下の手順にて合成した。なお、表１３中の配列表記において、「Ｉ」はデオキシイノシンを意味し、その他の表記は表２と同じである。
各配列番号（Ｎｏ．）に該当する化合物の名称は以下のとおりである。
Ｎｏ．７３：Ｉ－ＤＥＬ１ Ｎｏ．７４：Ｉ－ＤＥＬ２
Ｎｏ．７５：Ｉ－ＤＥＬ３ Ｎｏ．７６：Ｉ－ＤＥＬ４

【表13】

なお、各ヘアピンＤＥＬを合成するための原料ヘッドピースの化合物名はそれぞれ以下のとおりである。
ヘアピンＤＥＬ ：原料ヘッドピース
Ｉ－ＤＥＬ１ ：Ｉ－ＤＥＬ１－ＨＰ
Ｉ－ＤＥＬ２ ：Ｉ－ＤＥＬ２－ＨＰ
Ｉ－ＤＥＬ３ ：Ｉ－ＤＥＬ３－ＨＰ
Ｉ－ＤＥＬ４ ：Ｉ－ＤＥＬ４－ＨＰ
さらに、Ｉ－ＤＥＬ１－ＨＰ、Ｉ－ＤＥＬ２－ＨＰ、Ｉ－ＤＥＬ３－ＨＰ、及びＩ－ＤＥＬ４－ＨＰの配列番号“Ｎｏ．”および配列“Ｓｅｑ”は以下の表１４のとおりである。なお、表１４中の表記は表１３と同じである。

【0210】

【表14】

【0211】

表１４に示す原料ヘッドピースは、定法に従い調製した。

【0212】

実施例２と同様に、各種原料ヘッドピースを用い、２本鎖オリゴヌクレオチドＰｒ＿ＴＡＧ、及びＣＰとの２段階の２本鎖ライゲーションを実施した。

【0213】

得られた溶液の一部をサンプリングし、脱イオン水で希釈したのち、分析条件３にて、ＥＳＩ－ＭＳによる質量分析を行い、目的物を同定した（各配列の理論分子量、及び検出された分子量を表１３中に示す）。溶液の残りを凍結乾燥した後、それぞれ脱イオン水を加え、２０μＭに調製した。

【0214】

＜エンドヌクレアーゼＶによる切断反応＞
４種のデオキシイノシンを含むヘアピンＤＥＬ（Ｉ－ＤＥＬ１、Ｉ－ＤＥＬ２、Ｉ－ＤＥＬ３、Ｉ－ＤＥＬ４）のエンドヌクレアーゼＶによる切断反応の検討を以下の手順で行った。

【0215】

ＰＣＲチューブに、１μＬの各種ヘアピンＤＥＬ２０μＭ水溶液；２μＬのＮＥＢｕｆｆｅｒ（登録商標）４（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ製、カタログ番号Ｂ７００４）及び１５μＬの脱イオン水を加えた。溶液に２μＬのＥｎｄｎｕｃｌｅａｓｅ Ｖ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ製、カタログ番号Ｍ０３０５Ｓ）を加え、得られた溶液を３７℃で２４時間インキュベーションした。

【0216】

＜ＬＣ―ＭＳ測定による切断後の生成物の確認＞
得られた反応溶液のうち８．０μＬをサンプリングし、脱イオン水で希釈したのち、分析条件３にて、ＥＳＩ－ＭＳによる質量分析を行った。各反応溶液において想定される切断後の生成物の配列と理論分子量、及び各反応溶液において検出された分子量を表１５に示す。なお、各実験番号（Ｅｎｔｒｙ）に該当する基質は以下のとおりであり、その他の表記は表１３と同じである。
Ｅｎｔｒｙ．１：Ｉ－ＤＥＬ１ Ｅｎｔｒｙ．２：Ｉ－ＤＥＬ２
Ｅｎｔｒｙ．３：Ｉ－ＤＥＬ３ Ｅｎｔｒｙ．４：Ｉ－ＤＥＬ４

【0217】

【表15】

【0218】

いずれのサンプルも基質のＭＳは検出されず、切断後の生成物のＭＳがメインピークとして観測された。

【0219】

＜ゲル電気泳動による切断反応の確認＞
また、得られた反応溶液のうち一部をサンプリングし、実施例３と同じ条件で、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析を行った。図１４に示す結果から、いずれの基質も高収率で切断反応が進行していることが確認された。なお、図１４の各レーンのサンプルは以下のとおりである。
レーン１：２０ｂｐ ＤＮＡラダー（ロンザ製、Ｌｏｎｚａ ２０ ｂｐ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ、カタログ番号５０３３０）
レーン２：Ｉ－ＤＥＬ１
レーン３：Ｉ－ＤＥＬ１の切断反応実施後サンプル
レーン４：Ｉ－ＤＥＬ２
レーン５：Ｉ－ＤＥＬ２の切断反応実施後サンプル
レーン６：Ｉ－ＤＥＬ３
レーン７：Ｉ－ＤＥＬ３の切断反応実施後サンプル
レーン８：Ｉ－ＤＥＬ４
レーン９：Ｉ－ＤＥＬ４の切断反応実施後サンプル

【0220】

以上の結果から、各種デオキシイノシンを含むヘアピン型ＤＥＬは、エンドヌクレアーゼＶにより、デオキシイノシンから３‘方向に２番目のホスホジエステル結合が切断されることが示された。

【0221】

実施例５
［リボヌクレオシドを含むヘアピンＤＥＬのＲＮａｓｅＨＩＩによる切断反応の検証］
＜リボヌクレオシドを含むヘアピンＤＥＬ（Ｒ－ＤＥＬ１）の合成＞
表１６に示す配列の化合物（ヘアピンＤＥＬ）を以下の手順にて合成した。なお、表１６中の配列表記において、「ｕ」はウリジンを意味し、その他の表記は表２と同じである。
配列番号（Ｎｏ．）に該当する化合物の名称は以下のとおりである。
Ｎｏ．８７：Ｒ－ＤＥＬ１

【表16】

なお、各ヘアピンＤＥＬを合成するための原料ヘッドピースの化合物名は以下のとおりである。
ヘアピンＤＥＬ ：原料ヘッドピース
Ｒ－ＤＥＬ１ ：Ｒ－ＤＥＬ１－ＨＰ
さらに、Ｒ－ＤＥＬ１－ＨＰの配列番号“Ｎｏ．”および配列“Ｓｅｑ”は以下の表１７のとおりである。なお、表１７中の表記は表１６と同じである。

【0222】

【表17】

【0223】

表１７に示す原料ヘッドピースは、定法に従い調製した。

【0224】

実施例２と同様に、原料ヘッドピースを用い、２本鎖オリゴヌクレオチドＰｒ＿ＴＡＧ、及びＣＰとの２段階の２本鎖ライゲーションを実施した。

【0225】

得られた溶液の一部をサンプリングし、脱イオン水で希釈したのち、分析条件３にて、ＥＳＩ－ＭＳによる質量分析を行い、目的物を同定した（各配列の理論分子量、及び検出された分子量を表１６中に示す）。溶液の残りを凍結乾燥した後、それぞれ脱イオン水を加え、２００μＭに調製した。

【0226】

＜ＲＮａｓｅＨＩＩによる切断反応＞
リボヌクレオシドを含むヘアピンＤＥＬ（Ｒ－ＤＥＬ１）のＲＮａｓｅＨＩＩによる切断反応の検討を以下の手順で行った。

【0227】

ＰＣＲチューブに、０．５μＬのヘアピンＤＥＬ２００μＭ水溶液；４．９μＬのＴｈｅｒｍｏＰｏｌ（登録商標） Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ Ｐａｃｋ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ製、カタログ番号Ｂ９００４）及び４３．６μＬの脱イオン水を加えた。溶液に１μＬのＲＮａｓｅ ＨＩＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ製、カタログ番号Ｍ０２８８Ｓ）を加え、得られた溶液を３７℃で８時間インキュベーションした。

【0228】

＜ＬＣ―ＭＳ測定による切断後の生成物の確認＞
得られた反応溶液のうち１０μＬをサンプリングし、分析条件３にて、ＥＳＩ－ＭＳによる質量分析を行った。想定される切断後の生成物の配列と理論分子量、及び検出された分子量を表１８に示す。なお、実験番号（Ｅｎｔｒｙ）に該当する基質は以下のとおりであり、その他の表記は表１６と同じである。
Ｅｎｔｒｙ．１：Ｒ－ＤＥＬ１

【0229】

【表18】

【0230】

いずれのサンプルも基質のＭＳは検出されず、切断後の生成物のＭＳがメインピークとして観測された。

【0231】

＜ゲル電気泳動による切断反応の確認＞
また、得られた反応溶液のうち一部をサンプリングし、実施例３と同じ条件で、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析を行った。図１５に示す結果から、いずれの基質も高収率で切断反応が進行していることが確認された。なお、図１５の各レーンのサンプルは以下のとおりである。
レーン１：２０ｂｐ ＤＮＡラダー（ロンザ製、Ｌｏｎｚａ ２０ ｂｐ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ、カタログ番号５０３３０）
レーン２：Ｒ－ＤＥＬ１
レーン３：Ｒ－ＤＥＬ１の切断反応実施後サンプル

【0232】

以上の結果から、リボヌクレオシドを含むヘアピン型ＤＥＬは、ＲＮａｓｅＨＩＩにより、リボヌクレオチドの５’側のホスホジエステル結合が切断されることが示された。
実施例６
［Ｕ－ＤＥＬ９－ＨＰを原料としたモデルライブラリの作成］
図１６に示す概略図のように、Ｕ－ＤＥＬ９－ＨＰを原料とし、スプリット・アンド・プール合成により３×３×３（２７）化合物種を含むモデルライブラリの合成を、以下の試薬を用いて実施した。
・Ｕ－ＤＥＬ９－ＨＰ
・ビルディングブロック３種（ＢＢ１、ＢＢ２、及びＢＢ３）：

【化29】

・２本鎖オリゴヌクレオチドタグ１０種（表１９のタグ番号：Ｐｒ、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｃ１、Ｃ２、及びＣ３）

【0233】

表１９中、 “Ｔａｇ Ｎｏ．”（一番左）はタグ番号を表し、“Ｎｏ．”（左から２番目）は配列番号を表し、“Ｓｅｑ．”（左から３番目）は配列を表す。なお、配列表記は表１と同じである。

【0234】

なお、各２本鎖オリゴヌクレオチドタグは、表１９中に示すように、各タグ番号に対応する配列番号２種のオリゴヌクレオチドをアニーリングして調製した。

【0235】

【表19】

【0236】

＜化合物「ＡＯＰ－Ｕ－ＤＥＬ９－ＨＰ」の合成＞
表２０中に示す配列の化合物「ＡＯＰ－Ｕ－ＤＥＬ９－ＨＰ」を以下の手順にて合成した。なお、表２０中の配列表記において、「（ＡＯＰ－ＡｍｉｎｏＣ７）」は次の式（１０）

【化30】

で表される基を意味し、その他の表記は表２と同じである。

【0237】

【表20】

【0238】

４個のビオラモ遠沈管チューブに、１０℃に冷却したホウ酸ナトリウム緩衝液（１５０ｍＭ、ｐＨ９．４）のＵ－ＤＥＬ９－ＨＰの溶液（２．５ｍＬ、１ｍＭ）を加えた。それぞれのチューブに、４０当量のＮ－Ｆｍｏｃ－１５－アミノ－４，７，１０，１３－テトラオキサオクタデカン酸（２５０μＬ、０．４Ｍ Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド溶液）、続いて４０当量の塩化４－（４，６－ジメトキシ［１．３．５］トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウム水和物（ＤＭＴＭＭ）（２００μＬ、０．５Ｍ水溶液）を加え、得られた溶液を１０℃で５時間振とうした。

【0239】

上記溶液を、それぞれ２９５μＬの５Ｍの塩化ナトリウム水溶液及び９．７ｍＬの冷却された（－２０℃）エタノールにより処理し、－７８℃で終夜静置した。遠心分離後、上清を除き、得られたペレットを風乾した。ペレットにそれぞれ２．７５ｍＬの脱イオン水を加え溶解し、０℃で３０６μＬのピペリジンを加え、１０℃で３時間振とうした。混合物を遠心分離した後、沈殿物をろ過により除去し、１．４７ｍＬの脱イオン水で２回洗浄した。得られたろ液を、それぞれ６００μＬの５Ｍの塩化ナトリウム水溶液及び１９．８ｍＬの冷却された（－２０℃）エタノールにより処理し、－７８℃で終夜精置した。遠心分離後、上清を除き、得られたペレットを風乾した。

【0240】

得られたペレットに、１０ｍＬの脱イオン水を加え溶液にした。得られた溶液のうち、一部をサンプリングし、脱イオン水で希釈した後、実施例１の分析条件２の条件にて、ＥＳＩ－ＭＳによる質量分析を行い、目的物を同定した（化合物の理論分子量、及び検出された分子量を表２０中に示す）。溶液の残りを凍結乾燥した後、脱イオン水を加え、５ｍＭに調製した。

【0241】

＜２本鎖オリゴヌクレオチドタグ「Ｐｒ」の導入＞
化合物「ＡＯＰ－Ｕ－ＤＥＬ９－ＨＰ」と２本鎖オリゴヌクレオチドタグ「Ｐｒ」をライゲーションすることで表２１中に示す配列の化合物「ＡＯＰ－Ｕ－ＤＥＬ９－ＨＰ－Ｐｒ」を以下の手順にて合成した。なお、表２１中の配列表記は表２０と同じである。

【0242】

【表21】

【0243】

ビオラモ遠沈管チューブに、４０μＬの化合物「ＡＯＰ－Ｕ－ＤＥＬ９－ＨＰ」の５ｍＭ水溶液；１６０μＬの１００ｍＭ 炭酸水素ナトリウム水溶液水；２４０μＬの２本鎖オリゴヌクレオチドタグ「Ｐｒ」の１ｍＭ水溶液；８０μＬの１０Ｘリガーゼ緩衝液（５００ｍＭ トリス塩酸、ｐＨ７．５；５００ｍＭ 塩。化ナトリウム；１００ｍＭ 塩化マグネシウム；１００ｍＭ ジチオスレイトール；２０ｍＭ アデノシン三リン酸）及び２７２μＬの脱イオン水を加えた。溶液に８．０μＬのＴ４ＤＮＡリガーゼ（サーモフィッシャー製、カタログ番号ＥＬ００１３）を加え、得られた溶液を１６℃で２４時間インキュベーションした。

【0244】

反応溶液を、８０μＬの５Ｍの塩化ナトリウム水溶液および２６４０μＬの冷却された（－２０℃）エタノールにより処理し、－７８℃で２時間精置した。遠心分離後、上清を除き、得られたペレットに４００μＬの脱イオン水を加えた。得られた溶液をＡｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌフィルタ（３０ｋＤカットオフ）により濃縮した。得られた溶液の一部をサンプリングし、分析条件２の条件にて、ＥＳＩ－ＭＳによる質量分析を行い、目的物を同定した（化合物の理論分子量、及び検出された分子量を表２１中に示す）。以上の工程により、純度８４．５％の化合物「ＡＯＰ－Ｕ－ＤＥＬ９－ＨＰ－Ｐｒ」が１３３ｎｍｏｌ得られた。得られた化合物「ＡＯＰ－Ｕ－ＤＥＬ９－ＨＰ－Ｐｒ」に１００ｍＭ 炭酸水素ナトリウム水溶液水を加え、１ｍＭに調製した。

【0245】

＜サイクルＡ＞
３本の各ＰＣＲチューブに、２０μＬの上記で得られた化合物「ＡＯＰ－Ｕ－ＤＥＬ９－ＨＰ－Ｐｒ」の１ｍＭ溶液；３０μＬの２本鎖オリゴヌクレオチドタグＡ１～Ａ３のうちの一つの１ｍＭ水溶液；８．０μＬの１０Ｘリガーゼ緩衝液（５００ｍＭ トリス塩酸、ｐＨ７．５；５００ｍＭ 塩化ナトリウム；１００ｍＭ 塩化マグネシウム；１００ｍＭ ジチオスレイトール；２０ｍＭ アデノシン三リン酸）及び２１．６μＬの脱イオン水を加えた。溶液に０．４μＬのＴ４ＤＮＡリガーゼ（サーモフィッシャー製、カタログ番号ＥＬ００１３）を加え、得られた溶液を１６℃で１８時間インキュベーションした。

【0246】

反応溶液をそれぞれ、８．０μＬの５Ｍの塩化ナトリウム水溶液および２６４μＬの冷却された（－２０℃）エタノールにより処理し、－７８℃で３０分間静置した。遠心分離後、上清を除き、得られたペレットをそれぞれ、２０μＬの１５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．４）に溶解させた。

【0247】

それぞれのチューブに、４０当量のビルディングブロックＢＢ１～ＢＢ３（４．０μＬ、２００ｍＭ Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド溶液）のうちの一つ、続いて４０当量の塩化４－（４，６－ジメトキシ［１．３．５］トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウム水和物（ＤＭＴＭＭ）（４．０μＬ、２００ｍＭ水溶液）を加え、１０℃で２時間振とうした。さらに、それぞれのチューブに、２０当量のビルディングブロック（２．０μＬ、２００ｍＭ Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド溶液）、続いて２０当量のＤＭＴＭＭ（２．０μＬ、２００ｍＭ水溶液）を加え、１０℃で３０分間振とうした。

【0248】

反応溶液をそれぞれ、３．２μＬの５Ｍの塩化ナトリウム水溶液および１０６μＬの冷却された（－２０℃）エタノールにより処理し、－７８℃で３０分間静置した。遠心分離後、上清を除き、得られたペレットにそれぞれ１８μＬの脱イオン水を加えたのち、３種の溶液を１本のＰＣＲチューブに混合した。

【0249】

混合した溶液に、０℃で６．０μＬのピペリジンを加え、室温で１時間振とうした。反応溶液を、６．０μＬの５Ｍの塩化ナトリウム水溶液および１９８μＬの冷却された（－２０℃）エタノールにより処理し、－７８℃で１８時間静置した。遠心分離後、上清を除き、得られたペレットに４００μＬの脱イオン水を加えた。得られた溶液をＡｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌフィルタ（３０ｋＤカットオフ）により濃縮し、１００ｍＭ 炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、１ｍＭに調製し、次工程の出発原料として使用した。

【0250】

＜サイクルＢ＞
３本の各ＰＣＲチューブに、１３．７μＬのサイクルＡで得られた出発原料１ｍＭ溶液；２０．６μＬの２本鎖オリゴヌクレオチドタグＢ１～Ｂ３のうちの一つの１ｍＭ水溶液；５．５μＬの１０Ｘリガーゼ緩衝液（５００ｍＭ トリス塩酸、ｐＨ７．５；５００ｍＭ 塩化ナトリウム；１００ｍＭ 塩化マグネシウム；１００ｍＭ ジチオスレイトール；２０ｍＭ アデノシン三リン酸）及び１４．８μＬの脱イオン水を加えた。溶液に０．３μＬのＴ４ＤＮＡリガーゼ（サーモフィッシャー製、カタログ番号ＥＬ００１３）を加え、得られた溶液を１６℃で１６時間インキュベーションした。

【0251】

反応溶液をそれぞれ、５．５μＬの５Ｍの塩化ナトリウム水溶液および１８１μＬの冷却された（－２０℃）エタノールにより処理し、－７８℃で３０分間静置した。遠心分離後、上清を除き、得られたペレットをそれぞれ、１３．７μＬの１５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．４）に溶解させた。

【0252】

それぞれのチューブに、８０当量のビルディングブロックＢＢ１～ＢＢ３（５．５μＬ、２００ｍＭ Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド溶液）のうちの一つ、続いて８０当量のＤＭＴＭＭ（５．５μＬ、２００ｍＭ水溶液）を加え、１０℃で１時間振とうした。さらに、それぞれのチューブに、４０当量のビルディングブロック（２．３μＬ、２００ｍＭ Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド溶液）、続いて４０当量のＤＭＴＭＭ（２．３μＬ、２００ｍＭ水溶液）を加え、１０℃で２時間振とうした。

【0253】

反応溶液をそれぞれ、２．５μＬの５Ｍの塩化ナトリウム水溶液および８１．４μＬの冷却された（－２０℃）エタノールにより処理し、－７８℃で３０分間静置した。遠心分離後、上清を除き、得られたペレットにそれぞれ１２．３μＬの脱イオン水を加えたのち、３種の溶液を１本のＰＣＲチューブに混合した。

【0254】

混合した溶液に、０℃で４．1μＬのピペリジンを加え、室温で３時間振とうした。反応溶液を、４．１μＬの５Ｍの塩化ナトリウム水溶液および１３６μＬの冷却された（－２０℃）エタノールにより処理し、－７８℃で３時間静置した。遠心分離後、上清を除き、得られたペレットに４００μＬの脱イオン水を加えた。得られた溶液をＡｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌフィルタ（３０ｋＤカットオフ）により濃縮し、１００ｍＭ 炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、０．４８ｍＭに調製し、次工程の出発原料として使用した。

【0255】

＜サイクルＣ＞
３本の各ＰＣＲチューブに、１４．５μＬのサイクルＢで得られた出発原料０．４８ｍＭ溶液；１０．５μＬの２本鎖オリゴヌクレオチドタグＣ１～Ｃ３のうちの一つの１ｍＭ水溶液；及び２．８μＬの１０Ｘリガーゼ緩衝液（５００ｍＭ トリス塩酸、ｐＨ７．５；５００ｍＭ 塩化ナトリウム；１００ｍＭ 塩化マグネシウム；１００ｍＭ ジチオスレイトール；２０ｍＭ アデノシン三リン酸）を加えた。溶液に０．１４μＬのＴ４ＤＮＡリガーゼ（サーモフィッシャー製、カタログ番号ＥＬ００１３）を加え、得られた溶液を１６℃で１６時間インキュベーションした。

【0256】

反応溶液をそれぞれ、２．８μＬの５Ｍの塩化ナトリウム水溶液および９２μＬの冷却された（－２０℃）エタノールにより処理し、－７８℃で３０分間静置した。遠心分離後、上清を除き、得られたペレットをそれぞれ、７．０μＬの１５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．４）に溶解させた。

【0257】

それぞれのチューブに、８０当量のビルディングブロックＢＢ１～ＢＢ３（２．８μＬ、２００ｍＭ Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド溶液）のうちの一つ、続いて８０当量のＤＭＴＭＭ（２．８μＬ、２００ｍＭ水溶液）を加え、１０℃で１時間振とうした。さらに、それぞれのチューブに、４０当量のビルディングブロック（１．４μＬ、２００ｍＭ Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド溶液）、続いて４０当量のＤＭＴＭＭ（１．４μＬ、２００ｍＭ水溶液）を加え、１０℃で２時間振とうした。

【0258】

反応溶液をそれぞれ、１．３μＬの５Ｍの塩化ナトリウム水溶液および４１．４μＬの冷却された（－２０℃）エタノールにより処理し、－７８℃で３０分間静置した。遠心分離後、上清を除き、得られたペレットにそれぞれ６．３μＬの脱イオン水を加えたのち、３種の溶液を１本のＰＣＲチューブに混合した。

【0259】

混合した溶液に、０℃で２．1μＬのピペリジンを加え、室温で２時間振とうした。反応溶液を、２．１μＬの５Ｍの塩化ナトリウム水溶液および６９μＬの冷却された（－２０℃）エタノールにより処理し、－７８℃で３時間静置した。遠心分離後、上清を除き、得られたペレットに４００μＬの脱イオン水を加えた。得られた溶液をＡｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌフィルタ（３０ｋＤカットオフ）により濃縮し、１００ｍＭ 炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、０．４１ｍＭに調製し、次工程の出発原料として使用した。

【0260】

＜ＣＰのライゲーション＞
ＰＣＲチューブに、１２．２μＬのサイクルＣで得られた出発原料０．４１ｍＭ溶液；６．０μＬのＣＰの１ｍＭ水溶液（実施例２で使用したものと同じである）；２．１μＬの１０Ｘリガーゼ緩衝液（５００ｍＭ トリス塩酸、ｐＨ７．５；５００ｍＭ 塩化ナトリウム；１００ｍＭ 塩化マグネシウム；１００ｍＭ ジチオスレイトール；２０ｍＭ アデノシン三リン酸）及び０．７μＬの脱イオン水を加えた。溶液に０．１μＬのＴ４ＤＮＡリガーゼ（サーモフィッシャー製、カタログ番号ＥＬ００１３）を加え、得られた溶液を１６℃で１６時間インキュベーションした。

【0261】

反応溶液を、２．１μＬの５Ｍの塩化ナトリウム水溶液および６９．６μＬの冷却された（－２０℃）エタノールにより処理し、－７８℃で３０分間静置した。遠心分離後、上清を除き、得られたペレットに４００μＬの脱イオン水を加えた。得られた溶液をＡｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌフィルタ（３０ｋＤカットオフ）により濃縮し、脱イオン水を加え２０μＭに調製した。

【0262】

＜結果＞
各サイクルの２本鎖オリゴヌクレオチドタグのライゲーション後のサンプルを２．２％アガロースゲル（ロンザ製、ＦｌａｓｈＧｅｌ（登録商標）カセット、カタログ番号５７０３１）を用いて、電気泳動により分析した。図１７に示す結果から、各サイクルにおいて、２本鎖オリゴヌクレオチドタグによるコード化が、高効率で達成されたことが確認された。なお、図１７の各レーンのサンプルは以下のとおりである。
レーン１：ＡＯＰ－Ｕ－ＤＥＬ９－ＨＰ－Ｐｒ
レーン２：サイクルＡの２本鎖オリゴヌクレオチドタグＡ１ライゲーション後のサンプル
レーン３：サイクルＡの２本鎖オリゴヌクレオチドタグＡ２ライゲーション後のサンプル
レーン４：サイクルＡの２本鎖オリゴヌクレオチドタグＡ３ライゲーション後のサンプル
レーン５：サイクルＢの２本鎖オリゴヌクレオチドタグＢ１ライゲーション後のサンプル
レーン６：サイクルＢの２本鎖オリゴヌクレオチドタグＢ２ライゲーション後のサンプル
レーン７：サイクルＢの２本鎖オリゴヌクレオチドタグＢ３ライゲーション後のサンプル
レーン８：サイクルＣの２本鎖オリゴヌクレオチドタグＣ１ライゲーション後のサンプル
レーン９：サイクルＣの２本鎖オリゴヌクレオチドタグＣ２ライゲーション後のサンプル
レーン１０：サイクルＣの２本鎖オリゴヌクレオチドタグＣ３ライゲーション後のサンプル
レーン１１：ＣＰライゲーション後のサンプル
レーン１２：２０ｂｐ ＤＮＡラダー（ロンザ製、Ｌｏｎｚａ ２０ ｂｐ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ、カタログ番号５０３３０）

【0263】

サイクルＣ完了後のサンプルを、分析条件３にて分析を行った。図１８クロマトグラフとマススペクトルの結果を示す。得られたマススペクトルのデコンボリューションにより、平均分子量として３５５３２．４が観測された。この結果は、サイクルＣ完了後に予想される平均分子量（３５５１４．２）と一致し、ライブラリ合成のための反応（２本鎖オリゴヌクレオチドタグのライゲーション、およびビルディングブロックの導入）が高効率で達成されていることが示された。

【0264】

以上により、上記合成手順にて、Ｕ－ＤＥＬ９－ＨＰを原料とした３×３×３（２７）化合物種を含むモデルライブラリの合成が達成された。

【0265】

＜得られたモデルライブラリのＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅによる切断＞
上記にて得られたモデルライブラリのＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅによる切断反応を以下の手順で実施した。

【0266】

ＰＣＲチューブに、２．０μＬのモデルライブラリ２０μＭ水溶液；２μＬのＣｕｔＳｍａｒｔ（登録商標）Ｂｕｆｆｅｒ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ製、カタログ番号Ｂ７２０４Ｓ）及び１４μＬの脱イオン水を加えた。溶液に２μＬのＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ製、カタログ番号Ｍ５５０５Ｓ）を加え、得られた溶液を３７℃で１６時間インキュベーションした後、さらに９０℃で１時間インキュベーションした。

【0267】

得られた反応溶液のうち一部をサンプリングし、実施例３と同じ条件で、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析を行った。図１９に示す結果から、Ｕ－ＤＥＬ９－ＨＰを原料としたモデルライブラリが、ＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅにより、高効率で切断反応が進行することが確認された。なお、図１９の各レーンのサンプルは以下のとおりである。
レーン１：２０ｂｐ ＤＮＡラダー（ロンザ製、Ｌｏｎｚａ ２０ ｂｐ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ、カタログ番号５０３３０）
レーン２：モデルライブラリ
レーン３：モデルライブラリのＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅによる切断反応実施後サンプル

【0268】

実施例７
［ＤＥＬ化合物のヘアピンＤＮＡから１本鎖ＤＮＡへの変換、及び新たな機能の付与］
＜３’末端にビオチンを有するＤＥＬ化合物「ＢＩＯ－ＤＥＬ」の合成＞
実施例２と同様に、表２２に示す配列のＤＥＬ化合物「ＢＩＯ－ＤＥＬ」を以下の手順にて合成した。なお、表２２中の配列表記において、「（ＢＩＯ）」は次の式（１１）

【化31】

で表される基を意味し、その他の表記は表２０と同じである。

【表22】

【0269】

ＰＣＲチューブに、２０μＬのＡＯＰ－Ｕ－ＤＥＬ９－ＨＰ（実施例６にて合成）の１ｍＭ水溶液；２４μＬのＰｒ＿ＴＡＧ２の１ｍＭ水溶液（実施例１と同様に合成したＰｒ＿ＴＡＧ２＿ａとＰｒ＿ＴＡＧ２＿ｂをアニーリングして調製、表２３に配列を示す）；８μＬの１０Ｘリガーゼ緩衝液（５００ｍＭ トリス塩酸、ｐＨ７．５；５００ｍＭ 塩化ナトリウム；１０ｍＭ 塩化マグネシウム；１００ｍＭ ジチオスレイトール；２０ｍＭ アデノシン三リン酸）及び２０μＬの脱イオン水を加えた。溶液に８μＬのＴ４ＤＮＡリガーゼ（サーモフィッシャー製、カタログ番号ＥＬ００１３）の１０倍希釈水溶液を加え、得られた溶液を１６℃で２２時間インキュベーションした。なお、表２３中の配列表記は表１と同じである。また、各配列番号に（Ｎｏ．）に該当する化合物の名称は以下のとおりである。
Ｎｏ．１１４：Ｐｒ_ＴＡＧ２_ａ Ｎｏ．１１５：Ｐｒ_ＴＡＧ２_ｂ

【表23】

【0270】

反応溶液を、８μＬの５Ｍの塩化ナトリウム水溶液及び２６４μＬの冷却された（－２０℃）エタノールにより処理し、－７８℃で終夜精置した。遠心分離後、上清を除き、得られたペレットを風乾した。ペレットを脱イオン水に溶解させ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ Ｃ１８カラムを用いる逆相ＨＰＬＣにより精製した。二元移動相勾配プロファイルを用いて、５０ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液（ｐＨ７．５）及びアセトニトリル／５０ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液（９：１、ｖ／ｖ）を使用し、目的物を溶出した。目的物を含む画分を収集し、混合し、濃縮した。得られた溶液をＡｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌフィルタ（３ｋＤカットオフ）により脱塩し、エタノール沈殿を実施した後、ペレットに２５μＬの脱イオン水を加え溶液にした。

【0271】

得られた溶液のうち、一部をサンプリングし、脱イオン水で希釈したのち、実施例１の分析条件２の条件にて、ＥＳＩ－ＭＳによる質量分析を行い、目的物を同定した（化合物の理論分子量、及び検出された分子量を表ｄ中に示す）。溶液の残りを凍結乾燥した後、それぞれ１００ｍＭ炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、１ｍＭに調製した。

【0272】

上記で得られた溶液６．２μＬに、７．４μＬのＣＰ－ＢＩＯの１ｍＭ水溶液（実施例１と同様に合成したＣＰ＿aとＣＰ－ＢＩＯ＿bをアニーリングして調製、表２４に配列を示す）；２．５μＬの１０Ｘリガーゼ緩衝液（５００ｍＭ トリス塩酸、ｐＨ７．５；５００ｍＭ 塩化ナトリウム；１０ｍＭ 塩化マグネシウム；１００ｍＭ ジチオスレイトール；２０ｍＭ アデノシン三リン酸）及び６．２μＬの脱イオン水を加えた。溶液に２．４７μＬのＴ４ＤＮＡリガーゼ（サーモフィッシャー製、カタログ番号ＥＬ００１３）の１０倍希釈水溶液を加え、得られた溶液を１６℃で１６時間インキュベーションした。なお、表２４中の配列表記は表２３と同じである。また、各配列番号に（Ｎｏ．）に該当する化合物の名称は以下のとおりである。
Ｎｏ．５１：ＣＰ＿ａ Ｎｏ．１１６：ＣＰ－ＢＩＯ＿ｂ

【0273】

【表24】

【0274】

反応溶液を、２．５μＬの５Ｍの塩化ナトリウム水溶液及び８１．５μＬの冷却された（－２０℃）エタノールにより処理し、－７８℃で３０分間静置した。遠心分離後、上清を除き、得られたペレットを風乾し、ペレットを脱イオン水に溶解した。得られた溶液をＡｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌフィルタ（３ｋＤカットオフ）により脱塩した。

【0275】

得られた上清のうち、一部をサンプリングし、脱イオン水で希釈したのち、実施例３の分析条件３にて、ＥＳＩ－ＭＳによる質量分析を行い、目的物を同定した（理論分子量、及び検出された分子量を表２２中に示す）。溶液の残りを凍結乾燥した後、脱イオン水を加え、１２０μＭに調製し、ＢＩＯ－ＤＥＬを得た。

【0276】

＜ＢＩＯ－ＤＥＬのＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅによる切断＞
上記で得られたＤＥＬ化合物「ＢＩＯ－ＤＥＬ」のＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅによる切断反応を以下の手順で行い、表２５に示す配列の２本鎖核酸を有するＤＥＬ化合物「ＤＳ－ＢＩＯ－ＤＥＬ」を合成した。なお、表２５中の配列表記は表２２と同じであり、ＤＳ－ＢＩＯ－ＤＥＬが、配列番号１１８と配列番号１１９のオリゴヌクレオチド鎖の２本鎖により形成されていることを意味する。

【0277】

【表25】

【0278】

３本のＰＣＲチューブに、それぞれ１０μＬのＤＥＬ化合物「ＢＩＯ－ＤＥＬ」１２０μＭ水溶液；１００μＬのＣｕｔＳｍａｒｔ（登録商標）Ｂｕｆｆｅｒ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ製、カタログ番号７２４０Ｓ）及び８６０μＬの脱イオン水を加えた。溶液にそれぞれ３０μＬのＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ製、カタログ番号５５０５Ｓ）を加え、得られた溶液を３７℃で２４時間インキュベーションした。

【0279】

得られた反応溶液を、それぞれＡｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌフィルタ（３ｋＤカットオフ）により脱塩し、脱イオン水を加え、６０μＬの溶液に調製した。その後、それぞれの溶液を６μＬの５Ｍの塩化ナトリウム水溶液及び１９８μＬの冷却された（－２０℃）エタノールにより処理し、－７８℃で３０分間静置した。遠心分離後、上清を除き、得られたペレットに脱イオン水を加えて溶液にし、一つのチューブにまとめた。

【0280】

得られた溶液の一部をサンプリングし、脱イオン水で希釈したのち、実施例３の分析条件３にて、ＥＳＩ－ＭＳによる質量分析を行い、目的の２本鎖核酸を有するＤＥＬ化合物「ＤＳ－ＢＩＯ－ＤＥＬ」を同定した（化合物の理論分子量、及び検出された分子量を表２５中に示す）

【0281】

また、得られた反応溶液のうち一部をサンプリングし、実施例３と同じ条件で、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析を行った。図２０に示す結果から、ＢＩＯ－ＤＥＬが、高収率で切断され、ＤＳ－ＢＩＯ－ＤＥＬに変換されていることが確認された。なお、図２０の各レーンのサンプルは以下のとおりである。
レーン１：ＢＩＯ－ＤＥＬ（濃度１：ＢＩＯ－ＤＥＬが約４０ｎｇになるように調製）
レーン２：ＢＩＯ－ＤＥＬ（濃度２：ＢＩＯ－ＤＥＬが約８０ｎｇになるように調製）
レーン３：ＢＩＯ－ＤＥＬのＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅによる切断反応実施後のサンプル（濃度１：目的物が約４０ｎｇになるように調製）
レーン４：ＢＩＯ－ＤＥＬのＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅによる切断反応実施後のサンプル（濃度２：目的物が約８０ｎｇになるように調製）
レーン５：２０ｂｐ ＤＮＡラダー（ロンザ製、Ｌｏｎｚａ ２０ ｂｐ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ、カタログ番号５０３３０）

【0282】

＜ストレプトアビジンビーズを用いた１本鎖ＤＮＡを有するＤＥＬの調製＞
上記で得られた２本鎖核酸を有するＤＥＬ化合物「ＤＳ－ＢＩＯ－ＤＥＬ」を、ストレプトアビジンビーズにて処理し、以下の手順で１本鎖ＤＮＡを有するＤＥＬ化合物「ＳＳ－ＤＥＬ」に調製した。なお、ＳＳ－ＤＥＬは、表２５中の配列番号１１９のオリゴヌクレオチド鎖である。

【0283】

２本のＰＣＲチューブに、それぞれ４５０μＬのＭａｇｎｏｓｐｈｅｒｅ（商品商標）ＭＳ１６０／Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＪＳＲ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号Ｊ－ＭＳ－Ｓ１６０Ｓ）を加え、磁気分離により上清を除去した後、９００μＬの１×バインディング緩衝液（１０ｍＭ トリス塩酸、ｐＨ７．５；０．５ｍＭ エチレンジアミン四酢酸；１Ｍ 塩化ナトリウム；０．０５％ ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ２０）を加え磁気分離により上清を除去した。得られた粒子にそれぞれ、ＤＳ－ＢＩＯ－ＤＥＬ水溶液ｋ（７００ｐｍｏｌ、４５０μＬ）、及び４５０μＬの２×バインディング緩衝液（２０ｍＭ トリス塩酸、ｐＨ７．５；１ｍＭ エチレンジアミン四酢酸；２Ｍ 塩化ナトリウム；０．１％ ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ２０）を加えて混合し、室温で２０分間振とうした。

【0284】

混合物から磁気分離により上清を除去し、９００μＬの１×バインディング緩衝液（１０ｍＭ トリス塩酸、ｐＨ７．５；０．５ｍＭ エチレンジアミン四酢酸；１Ｍ 塩化ナトリウム；０．０５％ ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ２０）を用いた粒子の洗浄及び磁気分離による上清の除去をそれぞれ３回繰り返した。その後、それぞれ９００μＬの水溶液（０．１Ｍ 水酸化ナトリウム；０．１Ｍ 塩化ナトリウム）を加え、磁気分離により上清を回収した。

【0285】

得られた上清に、それぞれ９００μＬの３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸緩衝液（１．０Ｍ、ｐＨ７．０）を加え、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌフィルタ（３ｋＤカットオフ）により脱塩した。得られた上清を一つのチューブにまとめ、１３．６μＬの５Ｍの塩化ナトリウム水溶液及び４４８μＬの冷却された（－２０℃）エタノールにより処理し、－７８℃で６０分間静置した。遠心分離後、上清を除き、得られたペレットを風乾した。ペレットに６０μＬの脱イオン水を加え溶液にした。

【0286】

得られた溶液のうち、一部をサンプリングし、脱イオン水で希釈したのち、実施例３の分析条件３の条件にて、ＥＳＩ－ＭＳによる質量分析を行ったところ、分子量２３９８４．８が観測され、目的の１本鎖ＤＮＡを有するＤＥＬ化合物「ＳＳ－ＤＥＬ」を同定した。

【0287】

＜光反応性クロスリンカー修飾プライマーの合成＞
２６に示す配列の光反応性クロスリンカー修飾プライマー「ＰＸＬ－Ｐｒ」を以下の手順にて合成した。なお、表２６中の配列表記において、「（Ｘ）」は次の式（１２）

【化32】

で表される基を意味し、その他の表記は表２と同じである。

【表26】

【0288】

ＰＣＲチューブに、１０℃に冷却したホウ酸ナトリウム緩衝液（１５０ｍＭ、ｐＨ９．４）のＬ－Ｐｒ（実施例１と同様に合成、表２７に配列を示す）の溶液（２００μＬ、１ｍＭ）を加えた。チューブに、４０当量のＮ－Ｆｍｏｃ－１５－アミノ－４，７，１０，１３－テトラオキサオクタデカン酸（２０μＬ、０．４Ｍ Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド溶液）、続いて４０当量の、塩化４－（４，６－ジメトキシ［１．３．５］トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウム水和物（ＤＭＴＭＭ）（１６μＬ、０．５Ｍ 水溶液）を加え、生じた混合物を１０℃で５時間振とうした。なお、表２７中の配列表記は表８と同じである。

【表27】

【0289】

反応液を、２３．６μＬの５Ｍの塩化ナトリウム水溶液及び７７８．８μＬの冷却された（－２０℃）エタノールにより処理し、－７８℃で終夜精置した。遠心分離後、上清を除き、得られたペレットを風乾した。ペレットに１８０μＬの脱イオン水を加え溶液にした後、２０μＬのピペリジンを加え、１０℃で３時間振とうした。

【0290】

得られた溶液を、２０μＬの５Ｍの塩化ナトリウム水溶液及び６６０μＬの冷却された（－２０℃）エタノールにより処理し、－７８℃で３０分間精置した。遠心分離後、上清を除き、得られたペレットに２００μＬの脱イオン水を加え１ｍＭの溶液にした。

【0291】

上記で得られた溶液１００μＬに、７５μＬのトリエチルアミン塩酸緩衝液（５００ｍＭ、ｐＨ１０）、続いて５０当量の、１－（（３－（３－メチル－３Ｈ－ジアジリン－３－イル）プロパノイル）オキシ）－２，５－ジオキソピロリジン－３－スルホン酸ナトリウム（Ｓｕｌｆｏ－ＳＤＡ）（２５μＬ、２００ｍＭ水溶液）を加え、３７℃で２時間振とうした。

【0292】

得られた溶液を、２０μＬの５Ｍの塩化ナトリウム水溶液及び６６０μＬの冷却された（－２０℃）エタノールにより処理し、－７８℃で３０分間静置した。遠心分離後、上清を除き、得られたペレットに１００μＬの脱イオン水を加え、続いて７５μＬのトリエチルアミン塩酸緩衝液（５００ｍＭ、ｐＨ１０）、５０当量のＳｕｌｆｏ－ＳＤＡ（２５μＬ、２００ｍＭ水溶液）を加え、３７℃で１時間２０分振とうした。さらに５０当量のＳｕｌｆｏ－ＳＤＡ（２５μＬ、２００ｍＭ水溶液）を加え、３７℃で４０分間振とうした。

【0293】

得られた溶液を、２２．５μLの５Ｍの塩化ナトリウム水溶液及び７４３μＬの冷却された（－２０℃）エタノールにより処理し、－７８℃で終夜静置した。遠心分離後、上清を除き、得られたペレットに１００μＬの脱イオン水を加え、続いて７５μＬのトリエチルアミン塩酸緩衝液（５００ｍＭ、ｐＨ１０）、続いて５０当量の、Ｓｕｌｆｏ－ＳＤＡ（２５μＬ、２００ｍＭ水溶液）を加え、３７℃で３時間振とうした。

【0294】

得られた溶液を、２０μＬの５Ｍの塩化ナトリウム水溶液及び６６０μＬの冷却された（－２０℃）エタノールにより処理し、－７８℃で終夜静置した。遠心分離後、上清を除き、得られたペレットを風乾した。ペレットを５０ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解させ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ Ｃ１８カラムを用いる逆相ＨＰＬＣにより精製した。二元移動相勾配プロファイルを用いて、５０ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液（ｐＨ７．５）及びアセトニトリル／水（１００：１、ｖ／ｖ）を使用し、目的物を溶出した。目的物を含む画分を収集し、混合し、濃縮した。得られた溶液をＡｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌフィルタ（３ｋＤカットオフ）により脱塩し、エタノール沈殿を実施した後、ペレットに１００μＬの脱イオン水を加え溶液にした。

【0295】

得られた溶液のうち、一部をサンプリングし、脱イオン水で希釈したのち、実施例３の分析条件３の条件にて、ＥＳＩ－ＭＳによる質量分析を行い、目的物の光反応性クロスリンカー修飾プライマー「ＰＸＬ－Ｐｒ」を同定した（化合物の理論分子量、及び検出された分子量を表２６中に示す）。

【0296】

＜光反応性クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬの合成＞
上記で得られたＳＳ－ＤＥＬ、及びＰＸＬ－Ｐｒを用いてプライマー伸長反応を以下の手順で行い、表２８に示す配列の光反応性クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬ「ＰＸＬ－ＤＳ－ＤＥＬ」を合成した。なお、表２８中の配列表記は表２６と同じであり、ＰＸＬ－ＤＳ－ＤＥＬが、配列番号１２２と配列番号１１９のオリゴヌクレオチド鎖の２本鎖により形成されていることを意味する。

【表28】

【0297】

ＰＣＲチューブに、５０μＬの「ＳＳ－ＤＥＬ」８μＭ水溶液；０．６７３μＬの「ＰＸＬ－Ｐｒ」５９４μＭ水溶液；８０μＬの１０× ＮＥＢｕｆｆｅｒ（商品商標）２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ製、カタログ番号Ｂ７００２Ｓ）及び６４５μＬの脱イオン水を加えた。溶液に８μＬのＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｉ、Ｌａｒｇｅ（Ｋｌｅｎｏｗ）Ｆｒａｇｍｅｎｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ製、カタログ番号Ｍ０２１０）及び１６μＬのＤｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（ｄＮＴＰ）Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ製、カタログ番号Ｎ０４４７）を加え、得られた溶液を２５℃で９０分間インキュベーションした。

【0298】

得られた溶液を、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌフィルタ（３ｋＤカットオフ）により脱塩した。得られた上清に、１７μＬの脱イオン水を加え、その後６μＬの５Ｍの塩化ナトリウム水溶液及び１９８μＬの冷却された（－２０℃）エタノールにより処理し、－７８℃で６０分間静置した。遠心分離後、上清を除き、得られたペレットを風乾した。ペレットに４０μＬの脱イオン水を加え溶液にした。

【0299】

得られた溶液のうち、一部をサンプリングし、脱イオン水で希釈したのち、実施例３の分析条件３の条件にて、ＥＳＩ－ＭＳによる質量分析を行い、目的物の光反応性クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬ「ＰＸＬ－ＤＳ－ＤＥＬ」を同定した（化合物の理論分子量、及び検出された分子量を表２８中に示す）。

【0300】

また、得られた反応溶液のうち一部をサンプリングし、以下に示す条件で、ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析を行った。図２１に示す結果から、プライマーの伸長反応により、高収率でＰＸＬ－ＤＳ－ＤＥＬが生成していることが確認された。なお、図２１の各レーンのサンプルは以下のとおりである。
レーン１：２０ｂｐ ＤＮＡラダー（ロンザ製、Ｌｏｎｚａ ２０ ｂｐ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ、カタログ番号５０３３０）
レーン２：ＤＳ－ＢＩＯ－ＤＥＬ
レーン３：ＳＳ－ＤＥＬ
レーン４：ＳＳ－ＤＥＬのプライマー伸長反応実施後のサンプル（ＰＸＬ－ＤＳ－ＤＥＬ）

【0301】

ポリアクリルアミドゲル電気泳動：
ゲル：ＳｕｐｅｒＳｅｐ（商品商標）ＤＮＡ１５％ＴＢＥゲル（富士フイルム和光純薬製、カタログ番号１９０－１５４８１）
ローディングバッファー：６× Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ社製、カタログ番号９１５６）
温度：室温
電圧：２００Ｖ
泳動時間：５０分
染色試薬：ＳＹＢＥＲ（商品商標） ＧｒｅｅｎII Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｇｅｌ Ｓｔａｉｎ（タカラバイオ社製、カタログ番号５７７０Ａ）

【産業上の利用可能性】

【0302】

本発明では、選択的に切断可能な部位を含む核酸化合物を利用することができる。さらに本発明では、選択的に切断可能な部位を含むＤＮＡコード化ライブラリ、その合成用組成物及びその使用方法を提供し、従来よりも利便性の高いＤＮＡコード化ライブラリの製造が可能となる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【配列表】

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