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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-09-05
(45)【発行日】2024-09-13
(54)【発明の名称】家畜の乳房炎の検査方法及び検査システム
(51)【国際特許分類】
G01N 24/08 20060101AFI20240906BHJP
【ＦＩ】
G01N24/08 510L
G01N24/08 510Q
【請求項の数】
5
(21)【出願番号】P 2021552448
(86)(22)【出願日】2020-10-16
(86)【国際出願番号】 JP2020039008
(87)【国際公開番号】W WO2021075519
(87)【国際公開日】2021-04-22
【審査請求日】2023-09-27
(31)【優先権主張番号】P 2019190477
(32)【優先日】2019-10-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】503359821
【氏名又は名称】国立研究開発法人理化学研究所
(73)【特許権者】
【識別番号】501203344
【氏名又は名称】国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構
(74)【代理人】
【識別番号】110000338
【氏名又は名称】弁理士法人 ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ
(72)【発明者】
【氏名】田島 右副
(72)【発明者】
【氏名】横田 秀夫
(72)【発明者】
【氏名】菊 佳男
(72)【発明者】
【氏名】林 智人
(72)【発明者】
【氏名】三上 修
(72)【発明者】
【氏名】長澤 裕哉
【審査官】嶋田 行志
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１２－０２１９８６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１４－５２１９３０（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１６－１９７１０４（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００２－１４８９５７（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許第０６２８８５３９（ＵＳ，Ｂ１）
【文献】Nuclear magnetic resonance metabonomics reveals strong association between milk metabolites and soma，Journal of Dairy Science，米国，American Dairy Science Association，2013年01月，Volume 96, Issue 1，pp. 290-299，doi: 10.3168/jds.2012-5819
【文献】Rapid Surface Area Determination via NMR Spin-Lattice Relaxation Measurements，Powder Technology，Elsevier Squoia，1987年11月，Volume 53, Issue 1，pp. 39-47，doi: 10.1016/0032-5910(87)80123-7
【文献】The Effect of Lipopolysaccharide Induced Experimental Bovine Mastitis on Clinical Parameters, Inflam，Frontiers in Immunology，2018年06月25日，Volume 9，Article 1487，doi: 10.3389/fimmu.2018.01487
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ ２４／００－Ｇ０１Ｎ ２４／１４
Ａ０１Ｊ ５／００－Ａ０１Ｊ ５／１６
Ａ０１Ｊ ７／００－Ａ０１Ｊ ７／０４
Ａ６１Ｂ ８／００－Ａ６１Ｂ ８／１５
Ｇ０１Ｎ １／００－Ｇ０１Ｎ １／４４
Ｇ０１Ｎ １５／００－Ｇ０１Ｎ １５／１４９２
Ｇ０１Ｎ ２１／００－Ｇ０１Ｎ ２１／８３
Ｇ０１Ｎ ２２／００－Ｇ０１Ｎ ２２／０４
Ｇ０１Ｎ ２３／００－Ｇ０１Ｎ ２３／２２７６
Ｇ０１Ｎ ２７／００－Ｇ０１Ｎ ２７／９２
Ｇ０１Ｎ ２９／００－Ｇ０１Ｎ ２９／５２
Ｇ０１Ｎ ３３／４８－Ｇ０１Ｎ ３３／９８
Ｇ０１Ｎ ３５／００－Ｇ０１Ｎ ３５／１０
Ｇ０１Ｎ ３７／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０ （ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＪＳＴＣｈｉｎａ（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＫＡＫＥＮ
Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｉｒｅｃｔ
ＰｕｂＭｅｄ
ＡｇｒｉＫｎｏｗｌｅｄｇｅ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
核磁気共鳴（ＮＭＲ）法によって、家畜の乳分房から採取した乳汁のスピン－スピン緩和時間を測定する工程、および、
上記乳汁に含まれる体細胞数を、所定の基準Ｓ２と比較する工程を含む、家畜の乳房炎の検査方法。
【請求項2】
上記スピン－スピン緩和時間を、又は、当該スピン－スピン緩和時間から換算して得た上記乳汁に含まれる粒子の比表面積を、所定の基準Ｓ１と比較する、請求項１に記載の検査方法。
【請求項3】
家畜は乳牛である、請求項１又は２に記載の検査方法。
【請求項4】
搾乳機と、ＮＭＲ測定装置と体細胞測定装置とを備え、
上記搾乳機のミルカーユニットからミルククローの手前までの所定の位置に、上記ＮＭＲ測定装置のＮＭＲ用のフローセルが構成されている、家畜の乳房炎の検査システム。
【請求項5】
家畜は乳牛である、請求項４に記載の検査システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、家畜の乳房炎の検査方法及び検査システムに関する。
【背景技術】
【0002】
乳牛の感染症の１つである乳房炎による日本国内の経済損失は年間８００億円に達している。乳房炎の早期発見によって治療費と乳量減少を抑制することが可能になるため、乳房炎の早期発見に対する研究開発が進められている。
【0003】
例えば、特許文献１には、乳汁の体細胞数測定によって乳房炎を診断する方法が記載されている。特許文献２には、乳汁の電気伝導度の測定によって乳房炎を診断する方法が記載されている。特許文献３には、乳汁中の体細胞を分解してサイトカイン等を生成し、体細胞を活性化させてから体細胞数を測定して、乳房炎を診断する方法が記載されている。特許文献４には、遠心分離後の乳汁の電気伝導度の測定によって乳房炎を診断する方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【文献】日本国特表２００２－５０３０９７号公報
【文献】日本国特開２０１０－２３０３６３号公報
【文献】日本国特開２０１０－２５６２３１号公報
【文献】日本国特開２０１１－３３５９９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
体細胞数測定による乳房炎の診断方法では、体細胞数測定装置が高価であるという課題がある。また、顕微鏡観察による体細胞数測定は、操作が煩雑であるという課題がある。乳汁の電気伝導度の測定による乳房炎の診断方法では、病原体侵入後の炎症反応による変化を観察するため、乳房炎の初期診断には適さないという課題がある。また、同じ個体の各乳分房または各個体によって乳汁に含まれる電解質の成分比率が異なるため、乳汁の電気伝導度の測定は再現性が芳しくないという課題がある。したがって、乳牛などの家畜の乳房炎の早期発見を簡便に行うことができる技術の実現には至っていない。
本発明の一態様は、乳牛などの家畜の乳房炎の早期発見を簡便に行うことができる検査を実現することを目的とする。
本発明の一態様は、乳牛などの家畜の乳房炎の早期発見を簡便に行うことができる検査を実現することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0006】
上記の課題を解決するために、本発明は、以下に示す態様を含む。
・核磁気共鳴（ＮＭＲ）法によって、家畜の乳分房から採取した乳汁のスピン－スピン緩和時間を測定する工程を含む、家畜の乳房炎の検査方法。
・搾乳機と、ＮＭＲ測定装置と、を備え、上記搾乳機のミルカーユニットからミルククローの手前までの所定の位置に、ＮＭＲ測定用のフローセルが構成されている、家畜の乳房炎の検査システム。
・核磁気共鳴（ＮＭＲ）法によって、家畜の乳分房から採取した乳汁のスピン－スピン緩和時間を測定する工程を含む、家畜の乳房炎の検査方法。
・搾乳機と、ＮＭＲ測定装置と、を備え、上記搾乳機のミルカーユニットからミルククローの手前までの所定の位置に、ＮＭＲ測定用のフローセルが構成されている、家畜の乳房炎の検査システム。
【発明の効果】
【0007】
本発明の一態様によれば、乳牛などの家畜の乳房炎の早期発見を簡便に行うことができる検査を実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【0008】
【図1】実施例１における各乳房から採取した乳汁の分析結果を示すグラフである。
【図2】実施例２における各乳房から採取した乳汁の分析結果を示すグラフである。
【図3】実施例３における各乳房から採取した乳汁の分析結果を示すグラフである。
【図4】実施例４における各乳房から採取した乳汁の分析結果を示すグラフである。
【図5】評価例１における黄色ブドウ球菌（ＳＡ－ＶＢ）添加による乳汁の分析結果を示すグラフである。
【図6】評価例１における黄色ブドウ球菌（ＳＡ－ＶＲ）添加による乳汁の分析結果を示すグラフである。
【図7】評価例２における乳酸菌添加による乳汁の分析結果を示すグラフである。
【図8】本発明の実施形態に係る検査システムの一例を示す模式図である。
【図9】本発明の実施形態に係る検査システムの要部構成を示すブロック図である。
【図10】実施例５における各乳房から採取した乳汁の分析結果を示すグラフである。
【図11】実施例６における各乳牛から採取した乳汁の分析結果を示すグラフである。
【図12】実施例７における各乳牛から採取した乳汁の分析結果を示すグラフである。
【図13】評価例３における黄色ブドウ球菌添加による乳汁の分析結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0009】
〔１．家畜の乳房炎の検査方法〕
本発明に係る家畜の乳房炎の検査方法（以下、「本発明の検査方法」と略記する場合がある）は、核磁気共鳴（ＮＭＲ）法によって、家畜の乳分房から採取した乳汁（以下、「サンプル乳汁」と略記する場合がある）のスピン－スピン緩和時間を測定する工程を含む。
本発明に係る家畜の乳房炎の検査方法（以下、「本発明の検査方法」と略記する場合がある）は、核磁気共鳴（ＮＭＲ）法によって、家畜の乳分房から採取した乳汁（以下、「サンプル乳汁」と略記する場合がある）のスピン－スピン緩和時間を測定する工程を含む。
【0010】
家畜の例として、乳牛等の牛、山羊、水牛、羊及び馬などが挙げられる。例えば、乳牛等の牛は、右前乳房、右後乳房、左前乳房及び左後乳房の４つの独立した乳分房（乳房）を有する。
【0011】
本発明の検査方法で使用する核磁気共鳴（ＮＭＲ）法は、サンプル乳汁のスピン－スピン緩和時間（Ｔ２）を測定することができればよく、例えば、パルスＮＭＲ法等が挙げられる。測定装置の小型化等の点で、パルスＮＭＲ法を用いることが好ましい。
【0012】
乳汁は、搾乳機などの当業者が通常使用する手段によって、家畜の乳分房から採取することができる。搾乳機にＮＭＲ測定装置を取り付けることによって、簡便かつ非侵襲的に乳汁のスピン－スピン緩和時間（Ｔ２）を測定することができる。また、ＮＭＲ法（特に、パルスＮＭＲ法）は、１回の測定時間が数十秒と短い。さらに、自動搾乳機にＮＭＲ測定装置を取り付けることによって、一定の間隔で連続的にスピン－スピン緩和時間（Ｔ２）を測定することができる。また、自動搾乳機にＮＭＲ測定装置を取り付けることによって、乳房炎検査用に乳汁をサンプリングする必要が無く、家畜管理者の負担を軽減することができる。したがって、本発明の検査方法によって、リアルタイムの計測（検査）が可能である。なお、上記のように、搾乳機にＮＭＲ測定装置を取り付け、搾乳機の一部分をＮＭＲ測定用のフローセルとする構成が好ましいが、特にこれに限定されない。
【0013】
上記スピン－スピン緩和時間を、又は、当該スピン－スピン緩和時間から換算して得た上記乳汁に含まれる粒子の比表面積を、所定の基準Ｓ１と比較してもよい。当該比較により、乳汁を採取した乳分房が乳房炎を有しているか、又は乳房炎を有している可能性が高いかを判断することができる。具体的には、サンプル乳汁の測定データ（スピン－スピン緩和時間又は比表面積）と、所定の基準Ｓ１とを比較して、サンプル乳汁の測定データが有意に増加又は減少している場合は、サンプル乳汁を採取した乳分房が乳房炎を有しているか、又は乳房炎を有している可能性が高いかを判断することができる。サンプル乳汁のデータと、所定の基準Ｓ１とを比較する場合、その有意差は、例えば、ｔ検定、Ｆ検定、カイ二乗検定、またはMann-Whitney's U testなどの統計学的手法によって判断できる。
【0014】
乳汁に含まれる粒子の比表面積は、以下の式（１）から求めることができる。
Ｒａｖ＝ΨｐＳＬρｐ（Ｒｓ－Ｒｂ）＋Ｒｂ ・・・（１）
式（１）中、Ｒａｖは平均緩和時間の逆数である。Ψｐは、乳汁に含まれる粒子の体積分率（体積濃度）である。Ｌは、乳汁に含まれる粒子表面に吸着する液層の厚さ（濡れ厚み）である。ρｐは、乳汁に含まれる粒子の密度である。Ｒｓは、乳汁に含まれる粒子表面に吸着する液体分子の緩和時間の逆数である。Ｒｂは、溶媒水の緩和時間の逆数である。
Ｒａｖ＝ΨｐＳＬρｐ（Ｒｓ－Ｒｂ）＋Ｒｂ ・・・（１）
式（１）中、Ｒａｖは平均緩和時間の逆数である。Ψｐは、乳汁に含まれる粒子の体積分率（体積濃度）である。Ｌは、乳汁に含まれる粒子表面に吸着する液層の厚さ（濡れ厚み）である。ρｐは、乳汁に含まれる粒子の密度である。Ｒｓは、乳汁に含まれる粒子表面に吸着する液体分子の緩和時間の逆数である。Ｒｂは、溶媒水の緩和時間の逆数である。
【0015】
上記所定の基準Ｓ１の例として、（１）サンプル乳汁を採取した乳分房から、サンプル乳汁とは異なる時点で採取（例えば、予め採取）した乳汁のデータ、（２）サンプル乳汁を採取した個体の他の乳分房から採取した乳汁のデータ、及び、（３）サンプル乳汁を採取した個体とは異なる個体の乳分房から採取した乳汁のデータ、等が挙げられる。上記データ（１）～（３）は、乳汁のスピン－スピン緩和時間、又は、当該スピン－スピン緩和時間から換算して得た乳汁に含まれる粒子の比表面積である。上記データ（２）および（３）は、サンプル乳汁の採取と同時に採取した乳汁のデータ、または、サンプル乳汁の採取前に予め採取した乳汁のデータであってもよい。上記所定の基準Ｓ１において、予め乳房炎を有していない対照乳分房から採取した乳汁のスピン－スピン緩和時間（比表面積）を測定して、これに基づいて正常範囲（例えば、閾値となる基準Ｓ１）を定めておいてもよい。
【0016】
所定の基準Ｓ１は、例えば、サンプル乳汁を採取した乳分房に関して、複数の時点で取得された経時的なデータの集合であってもよい。この場合は、サンプル乳汁を採取した乳分房における、乳汁のスピン－スピン緩和時間、又は、当該スピン－スピン緩和時間から換算して得た乳汁に含まれる粒子の比表面積、の経時的な変動を評価することとなる。
【0017】
本発明の検査方法は、サンプル乳汁に含まれる体細胞数を、所定の基準Ｓ２と比較する工程をさらに含んでいてもよい。サンプル乳汁の体細胞数と、所定の基準Ｓ２とを比較する場合、その有意差は、例えば、ｔ検定、Ｆ検定、カイ二乗検定、またはMann-Whitney's U testなどの統計学的手法によって判断できる。本明細書において、「乳汁に含まれる体細胞数」とは、乳汁中に含まれる白血球などの血液由来細胞と、乳腺上皮細胞との総数である。体細胞数は、公知の測定方法によって、測定することができる。
【0018】
上記所定の基準Ｓ２の例として、（４）サンプル乳汁を採取した乳分房から、サンプル乳汁とは異なるタイミングで採取（例えば、予め採取）した乳汁の体細胞数、（５）サンプル乳汁を採取した個体の他の乳分房から採取した乳汁の体細胞数、及び、（６）サンプル乳汁を採取した個体とは異なる個体の乳分房から採取した乳汁の体細胞数、等が挙げられる。上記データ（５）および（６）は、サンプル乳汁の採取と同時に採取した乳汁の体細胞数、または、サンプル乳汁の採取前に予め採取された乳汁の体細胞数であってもよい。上記所定の基準Ｓ２において、予め乳房炎を有していない対照乳分房から採取した乳汁の体細胞数を測定して、これに基づいて正常範囲（例えば、閾値となる基準Ｓ２）を定めておいてもよい。
【0019】
所定の基準Ｓ２は、例えば、サンプル乳汁を採取した乳分房に関して、複数の時点で取得された経時的なデータの集合であってもよい。この場合は、サンプル乳汁を採取した乳分房における、乳汁の体細胞数の経時的な変動を評価することとなる。
【0020】
実施例に示すように、黄色ブドウ球菌等のグラム陽性菌感染による乳房炎を発症している場合、体細胞数の増加に伴って、乳汁に含まれる粒子の比表面積が減少する。これは、グラム陽性菌が産生する酸性物質（例えば、乳酸）によって、乳汁に分散するカゼイン微粒子が凝集することによるものと考えられる。一方、グラム陽性菌感染による乳房炎以外の乳房炎（例えば、大腸菌などのグラム陰性菌感染による乳房炎及び外傷による乳房炎、等）を発症している場合、体細胞数の増加に伴って、乳汁に含まれる粒子の比表面積が増加する。よって、ＮＭＲ測定に加えて、体細胞測定を行うことによって、乳房炎の原因（グラム陽性菌感染由来か否か）を推定することができる。
【0021】
〔２．家畜の乳房炎の検査システム〕
図８を参照して、本発明の家畜の乳房炎の検査システム（以下、「本発明の検査システム」と略記する場合がある）１００について説明する。検査システム１００は、搾乳機２００と、ＮＭＲ測定装置３００と、を備える。搾乳機２００は、乳分房に取り付けて採取した乳汁を回収するミルカーユニット２０１と、各乳分房から採取した乳汁を混合するミルククロー（合乳タンク）２０２と、ＮＭＲ測定用のフローセル２０３と、を備える。
図８を参照して、本発明の家畜の乳房炎の検査システム（以下、「本発明の検査システム」と略記する場合がある）１００について説明する。検査システム１００は、搾乳機２００と、ＮＭＲ測定装置３００と、を備える。搾乳機２００は、乳分房に取り付けて採取した乳汁を回収するミルカーユニット２０１と、各乳分房から採取した乳汁を混合するミルククロー（合乳タンク）２０２と、ＮＭＲ測定用のフローセル２０３と、を備える。
【0022】
搾乳機２００は、公知の搾乳機を使用することができる。例えば、乳牛の４つの乳分房を同時に検査する場合、ミルカーユニットの数を４つ備えていてもよい。フローセル２０３は、ミルカーユニット２０１からミルククロー２０２の手前までの所定の位置に設置される。これにより、各乳分房から採取した乳汁のスピン－スピン緩和時間を測定することができる。
【0023】
ＮＭＲ測定装置３００は、搾乳機２００のフローセル２０３に取り付けることができればよく、例えば公知のＮＭＲ測定装置を使用することができる。搾乳機２００への取付けのし易さや測定装置の小型化等の点で、ＮＭＲ測定装置３００はパルスＮＭＲ測定装置であることが好ましい。
【0024】
また、図９を参照して、別の実施形態である本発明の検査システム１０１について説明する。図９は、検査システムの要部構成を示すブロック図である。検査システム１０１は、搾乳機２００と、ＮＭＲ測定装置３００と、管理端末（例えば、スマートフォン等の小型携帯端末）４００と、体細胞測定装置５００と、を備える。
【0025】
ＮＭＲ測定装置３００は、通信部３０１と、測定部３０３と、計算部３０４と、測定部３０３及び計算部３０４を制御する制御部３０２と、を備える。通信部３０１は管理端末４００と通信する。測定部３０３は、各乳分房から採取した乳汁のスピン－スピン緩和時間を測定する。計算部３０４は、スピン－スピン緩和時間から乳汁に含まれる粒子の比表面積を換算する。
【0026】
管理端末４００は、通信部４０１と、ＮＭＲ測定値比較部４０５と、体細胞数比較部４０６と、判定部４０７と、異常通知部４０８と、記憶部４０３と、表示部４０４と、制御部４０２と、を備える。通信部４０１は、ＮＭＲ測定装置３００及び体細胞測定装置５００と通信する。ＮＭＲ測定値比較部４０５は、サンプル乳汁のスピン－スピン緩和時間又は比表面積と、所定の基準Ｓ１とを比較する。体細胞数比較部４０６は、サンプル乳汁の体細胞数と所定の基準Ｓ２とを比較する。判定部４０７は、ＮＭＲ測定値比較部４０５の比較結果から、サンプル乳汁を採取した乳分房が乳房炎を有しているか又は乳房炎を有している可能性が高いかを判定する。異常通知部４０８は、判定部４０７において乳分房が乳房炎を有しているか又は乳房炎を有している可能性が高いと判定した場合に管理端末４００のユーザに通知する。表示部４０４は、ＮＭＲ測定装置３００及び体細胞測定装置５００の測定結果、並びに異常通知部４０８による通知を表示する。
【0027】
判定部４０７は、ＮＭＲ測定値比較部４０５の比較結果に加えて、体細胞数比較部４０６の結果から、乳房炎の原因（グラム陽性菌感染由来か否か）を推定してもよい。
【0028】
体細胞測定装置５００は、管理端末４００と通信する通信部５０１と、各乳分房から採取した乳汁の体細胞数を測定する測定部５０３と、測定部５０３を制御する制御部５０２と、を備える。
【0029】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【0030】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【0031】
〔３．実施形態のまとめ〕
本発明の実施形態は、例えば、以下に示す態様を含む。
＜１＞核磁気共鳴（ＮＭＲ）法によって、家畜の乳分房から採取した乳汁（サンプル乳汁）のスピン－スピン緩和時間を測定する工程を含む、家畜の乳房炎の検査方法。
＜２＞上記スピン－スピン緩和時間を、又は、当該スピン－スピン緩和時間から換算して得た上記乳汁に含まれる粒子の比表面積を、所定の基準Ｓ１と比較する、＜１＞に記載の検査方法。
＜３＞上記乳汁に含まれる体細胞数を、所定の基準Ｓ２と比較する工程をさらに含む、＜１＞又は＜２＞に記載の検査方法。
＜４＞家畜は乳牛である、＜１＞～＜３＞の何れかに記載の検査方法。
＜５＞搾乳機と、ＮＭＲ測定装置と、を備え、上記搾乳機のミルカーユニットからミルククローの手前までの所定の位置に、ＮＭＲ測定用のフローセルが構成されている、家畜の乳房炎の検査システム。
＜６＞体細胞測定装置をさらに備える、＜５＞に記載の検査システム。
＜７＞家畜は乳牛である、＜５＞又は＜６＞に記載の検査システム。
＜８＞所定の基準Ｓ１との比較によって、乳房炎の発症の有無を推定する、＜２＞に記載の検査方法。
＜９＞所定の基準Ｓ２との比較によって、乳房炎の原因を推定する、＜３＞に記載の検査方法。
＜１０＞なお、＜１＞から＜４＞の検査方法は、家畜の乳房炎の検査を行うためのデータの取得方法、及び当該データの解析方法と捉えることもできる。
本発明の実施形態は、例えば、以下に示す態様を含む。
＜１＞核磁気共鳴（ＮＭＲ）法によって、家畜の乳分房から採取した乳汁（サンプル乳汁）のスピン－スピン緩和時間を測定する工程を含む、家畜の乳房炎の検査方法。
＜２＞上記スピン－スピン緩和時間を、又は、当該スピン－スピン緩和時間から換算して得た上記乳汁に含まれる粒子の比表面積を、所定の基準Ｓ１と比較する、＜１＞に記載の検査方法。
＜３＞上記乳汁に含まれる体細胞数を、所定の基準Ｓ２と比較する工程をさらに含む、＜１＞又は＜２＞に記載の検査方法。
＜４＞家畜は乳牛である、＜１＞～＜３＞の何れかに記載の検査方法。
＜５＞搾乳機と、ＮＭＲ測定装置と、を備え、上記搾乳機のミルカーユニットからミルククローの手前までの所定の位置に、ＮＭＲ測定用のフローセルが構成されている、家畜の乳房炎の検査システム。
＜６＞体細胞測定装置をさらに備える、＜５＞に記載の検査システム。
＜７＞家畜は乳牛である、＜５＞又は＜６＞に記載の検査システム。
＜８＞所定の基準Ｓ１との比較によって、乳房炎の発症の有無を推定する、＜２＞に記載の検査方法。
＜９＞所定の基準Ｓ２との比較によって、乳房炎の原因を推定する、＜３＞に記載の検査方法。
＜１０＞なお、＜１＞から＜４＞の検査方法は、家畜の乳房炎の検査を行うためのデータの取得方法、及び当該データの解析方法と捉えることもできる。
【実施例】
【0032】
乳牛には、４つの乳房（乳分房）を有する。各乳房はそれぞれ独立した器官である。したがって、各乳房から産出される乳汁は乳房の健康状態によって成分濃度等が異なる。また、乳房炎も乳房ごとに発症する。そこで、以下の実施例において、乳牛の各乳房から採取した乳汁を分析した。実施例１および２においては、乳汁に含まれる体細胞数が２０×１０４／ｍＬ以上である場合、乳汁を採取した乳房は乳房炎を発症していると判断した。実施例３および４においては、乳汁に含まれる体細胞数が５０×１０４／ｍＬ以上である場合、乳汁を採取した乳房は乳房炎を発症していると判断した。
【0033】
〔実施例１〕各乳房から採取した乳汁の分析
国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 動物衛生研究部門にて飼育管理されている研究用乳牛Ａの４つの乳房（右前、右後、左前、左後）からそれぞれ乳汁を採取した。そして、採取した乳汁の体細胞数とスピン－スピン緩和時間（Ｔ２）を測定した。体細胞数は、セルカウンターDCC（デラバル製）によって測定した。採取した乳汁を転倒混和したのち、専用カセットで吸引して本体に挿入し測定を行った。緩和時間（Ｔ２）は乳汁を希釈や添加することなくそのままＮＭＲチューブに入れ、パルスＮＭＲ装置（Xigo Nanotools社製、装置名ACORN AREA）を使用して、２５℃にて測定した。Ｔ２測定モードはCPMG（Carr-Purcell Meiboom-Gill sequence）法で行った。
国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 動物衛生研究部門にて飼育管理されている研究用乳牛Ａの４つの乳房（右前、右後、左前、左後）からそれぞれ乳汁を採取した。そして、採取した乳汁の体細胞数とスピン－スピン緩和時間（Ｔ２）を測定した。体細胞数は、セルカウンターDCC（デラバル製）によって測定した。採取した乳汁を転倒混和したのち、専用カセットで吸引して本体に挿入し測定を行った。緩和時間（Ｔ２）は乳汁を希釈や添加することなくそのままＮＭＲチューブに入れ、パルスＮＭＲ装置（Xigo Nanotools社製、装置名ACORN AREA）を使用して、２５℃にて測定した。Ｔ２測定モードはCPMG（Carr-Purcell Meiboom-Gill sequence）法で行った。
【0034】
測定した緩和時間（Ｔ２）から、以下の式（１）を用いて、乳汁に含まれる粒子の比表面積（Ｓ）を計算した。
Ｒａｖ＝ΨｐＳＬρｐ（Ｒｓ－Ｒｂ）＋Ｒｂ ・・・（１）
式（１）中、Ｒａｖは平均緩和時間の逆数である。Ψｐは、乳汁に含まれる粒子の体積分率（体積濃度）である。Ｌは、乳汁に含まれる粒子表面に吸着する液層の厚さ（濡れ厚み）である。ρｐは、乳汁に含まれる粒子の密度である。Ｒｓは、乳汁に含まれる粒子表面に吸着する液体分子の緩和時間の逆数である。Ｒｂは、溶媒水の緩和時間の逆数である。
Ｒａｖ＝ΨｐＳＬρｐ（Ｒｓ－Ｒｂ）＋Ｒｂ ・・・（１）
式（１）中、Ｒａｖは平均緩和時間の逆数である。Ψｐは、乳汁に含まれる粒子の体積分率（体積濃度）である。Ｌは、乳汁に含まれる粒子表面に吸着する液層の厚さ（濡れ厚み）である。ρｐは、乳汁に含まれる粒子の密度である。Ｒｓは、乳汁に含まれる粒子表面に吸着する液体分子の緩和時間の逆数である。Ｒｂは、溶媒水の緩和時間の逆数である。
【0035】
【0036】
図１に示すように、右後乳房と左前乳房からそれぞれ採取した乳汁の体細胞数は２０×１０４／ｍＬ以下であり、健常であることが分かった。一方、右前乳房および左後乳房から採取した乳汁の体細胞数はそれぞれ３０×１０４／ｍＬ、１８２×１０４／ｍＬを示し、いずれも乳房炎に発症していることを示した。また、これらの乳汁の細菌検査からは黄色ブドウ球菌は発見されておらず、大腸菌または外傷による乳房炎であると判定した。また、右前乳房および左後乳房の乳汁に含まれる粒子の比表面積は、右後乳房および左前乳房よりも高い数値を示し、比表面積は体細胞数の数に対応していることを確認した。
【0037】
〔実施例２〕各乳房から採取した乳汁の分析
実施例１で乳汁を採取してから２日間研究用乳牛Ａを飼育した後、再度各乳房から乳汁を採取した。そして、実施例１と同様の手順で、体細胞数および緩和時間（Ｔ２）を測定し、比表面積を算出した。測定した体細胞数および測定した緩和時間（Ｔ２）により算出した比表面積の結果を図２に示す。
実施例１で乳汁を採取してから２日間研究用乳牛Ａを飼育した後、再度各乳房から乳汁を採取した。そして、実施例１と同様の手順で、体細胞数および緩和時間（Ｔ２）を測定し、比表面積を算出した。測定した体細胞数および測定した緩和時間（Ｔ２）により算出した比表面積の結果を図２に示す。
【0038】
図２に示すように、右後乳房と左前乳房からそれぞれ採取した乳汁の体細胞数は２０×１０４／ｍＬ以下であり、実施例１の結果と同様に健常であった。右前乳房は実施例１に比べて体細胞数が健常に近づいていることが分かった。一方、左後乳房から採取した乳汁の体細胞数は７８０×１０４／ｍＬであり、乳房炎が治っていないことを示した。また、右前乳房、右後乳房および左前乳房それぞれの乳汁に含まれる粒子の比表面積は低い値を示したが、左後乳房においては体細胞数の数に対応して高い数値を示した。
【0039】
〔実施例３〕各乳房から採取した乳汁の分析
乳牛を、国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 動物衛生研究部門にて飼育管理されている研究用乳牛Ｂに変更した以外は、実施例１と同様の手順で、体細胞数および緩和時間（Ｔ２）を測定し、比表面積を算出した。測定した体細胞数および測定した緩和時間（Ｔ２）により算出した比表面積の結果を図３に示す。
乳牛を、国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 動物衛生研究部門にて飼育管理されている研究用乳牛Ｂに変更した以外は、実施例１と同様の手順で、体細胞数および緩和時間（Ｔ２）を測定し、比表面積を算出した。測定した体細胞数および測定した緩和時間（Ｔ２）により算出した比表面積の結果を図３に示す。
【0040】
図３に示すように、右前乳房、右後乳房および左前乳房から採取した乳汁の体細胞数は５０×１０４／ｍＬ以下であり、健常であることが分かった。一方、左後乳房から採取した乳汁の体細胞数は１８０×１０４／ｍＬを示し、乳房炎を発症していることを示した。また左後乳房の乳汁の細菌検査において黄色ブドウ球菌が発見され、左後乳房で発症している乳房炎が黄色ブドウ球菌による乳房炎であると判定した。また、乳房炎を発症している左後乳房の乳汁に含まれる粒子の比表面積は、右前乳房、右後乳房および左前乳房と比較して、顕著に低かった。これは、黄色ブドウ球菌等のグラム陽性菌から発生するタイコ酸によって乳汁中に分散する微粒子（カゼイン等）が凝集し、比表面積が減少したためである。
【0041】
〔実施例４〕各乳房から採取した乳汁の分析
乳牛を、国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 動物衛生研究部門にて飼育管理されている研究用乳牛Ｃに変更した以外は、実施例１と同様の手順で、体細胞数および緩和時間（Ｔ２）を測定し、比表面積を算出した。測定した体細胞数および測定した緩和時間（Ｔ２）により算出した比表面積の結果を図４に示す。
乳牛を、国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 動物衛生研究部門にて飼育管理されている研究用乳牛Ｃに変更した以外は、実施例１と同様の手順で、体細胞数および緩和時間（Ｔ２）を測定し、比表面積を算出した。測定した体細胞数および測定した緩和時間（Ｔ２）により算出した比表面積の結果を図４に示す。
【0042】
図４に示すように、右前乳房、右後乳房および左前乳房から採取した乳汁の体細胞数は５０×１０４／ｍＬ以下であり、健常であることが分かった。一方、左後乳房から採取した乳汁の体細胞数は２５０×１０４／ｍＬを示し、乳房炎を発症していることを示した。また左後乳房の乳汁の細菌検査において黄色ブドウ球菌が発見され、左後乳房で発症している乳房炎が黄色ブドウ球菌による乳房炎であると判定した。また、乳房炎を発症している左後乳房の比表面積は、右前乳房、右後乳房および左前乳房と比較して顕著に低く、実施例３と同様の結果が得られた。
【0043】
〔評価例１〕黄色ブドウ球菌添加による乳汁中の粒子の比表面積の変化
健常である乳房から採取した乳汁３ｍＬに２種類の異なる系統の黄色ブドウ球菌（ＳＡ－ＶＢおよびＳＡ－ＶＲ）をそれぞれ約３０ｍｇの量を添加した。黄色ブドウ球菌は国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 動物衛生研究部門に保存されている菌を使用し、ＳＡ－ＶＲはＳＡ－ＶＢよりも毒性が強い。黄色ブドウ球菌を添加後、乳汁を３７℃に保温した。黄色ブドウ球菌を添加してから０時間、３時間、６時間および９時間後に、実施例１と同様の手順で乳汁の緩和時間（Ｔ２）を測定し、比表面積を算出した。また、乳汁のｐＨを測定した。測定したｐＨおよび測定した緩和時間（Ｔ２）により算出した比表面積の結果を図５（ＳＡ－ＶＢ）および図６（ＳＡ－ＶＲ）に示す。
健常である乳房から採取した乳汁３ｍＬに２種類の異なる系統の黄色ブドウ球菌（ＳＡ－ＶＢおよびＳＡ－ＶＲ）をそれぞれ約３０ｍｇの量を添加した。黄色ブドウ球菌は国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 動物衛生研究部門に保存されている菌を使用し、ＳＡ－ＶＲはＳＡ－ＶＢよりも毒性が強い。黄色ブドウ球菌を添加後、乳汁を３７℃に保温した。黄色ブドウ球菌を添加してから０時間、３時間、６時間および９時間後に、実施例１と同様の手順で乳汁の緩和時間（Ｔ２）を測定し、比表面積を算出した。また、乳汁のｐＨを測定した。測定したｐＨおよび測定した緩和時間（Ｔ２）により算出した比表面積の結果を図５（ＳＡ－ＶＢ）および図６（ＳＡ－ＶＲ）に示す。
【0044】
図５及び図６中、左軸は比表面積（ｍ２／ｇ）を示す。右軸はｐＨを示す。横軸は評価例１で使用した黄色ブドウ球菌株の番号である。「乳」は、黄色ブドウ球菌を添加しなかったコントロールである。各株の４本の棒は、左から、黄色ブドウ球菌を添加してから０時間、３時間、６時間および９時間後の乳汁の測定結果を示す。
【0045】
【0046】
〔評価例２〕乳酸発酵による乳汁中の粒子の比表面積の変化
健常である乳房から採取した乳汁１００ｍＬに乳酸菌を含む発酵乳１ｇの量を添加した。乳酸菌添加後、乳汁を３７℃に保温した。乳酸菌添加してから１時間ごとに、実施例１と同様の手順で乳汁の緩和時間（Ｔ２）を測定し、比表面積を算出した。測定した緩和時間（Ｔ２）により算出した比表面積の結果を図７に示す。
健常である乳房から採取した乳汁１００ｍＬに乳酸菌を含む発酵乳１ｇの量を添加した。乳酸菌添加後、乳汁を３７℃に保温した。乳酸菌添加してから１時間ごとに、実施例１と同様の手順で乳汁の緩和時間（Ｔ２）を測定し、比表面積を算出した。測定した緩和時間（Ｔ２）により算出した比表面積の結果を図７に示す。
【0047】
図７中、左軸は比表面積（ｍ２／ｇ）を示す。横軸は、乳酸菌添加後の経過時間を示す。図７に示すように、評価例１の黄色ブドウ球菌添加の結果と同様、乳酸菌添加後に比表面積の減少が観察された。これは、乳汁に分散するカゼイン微粒子が乳酸発酵による生成した乳酸によってゼータ電位を失って凝集したことによる。評価例１の黄色ブドウ球菌添加においても、乳酸発酵によるカゼイン微粒子の凝集により、比表面積が低下したと考えられる。
【0048】
〔実施例５〕各乳房から採取した乳汁の分析
乳牛を、国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 動物衛生研究部門にて飼育管理されている研究用乳牛Ｄに変更した以外は、実施例１と同様の手順で、体細胞数および緩和時間（Ｔ２）を測定し、比表面積を算出した。測定した体細胞数および測定した緩和時間（Ｔ２）により算出した比表面積の結果を図１０に示す。
乳牛を、国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 動物衛生研究部門にて飼育管理されている研究用乳牛Ｄに変更した以外は、実施例１と同様の手順で、体細胞数および緩和時間（Ｔ２）を測定し、比表面積を算出した。測定した体細胞数および測定した緩和時間（Ｔ２）により算出した比表面積の結果を図１０に示す。
【0049】
図１０中、左軸は比表面積（ｍ２／ｇ）を示し、右軸は体細胞数（１０４／ｍＬ）を示す。折れ線グラフは比表面積の測定結果、棒グラフは体細胞数の測定結果を示す。
【0050】
図１０に示すように、７月２１日の測定結果では、右前乳房（ＲＦ）の体細胞数が約１，０００×１０４／ｍＬと、他の分房の体細胞数よりも大幅に増加していた。この結果から、７月２１日に右前乳房において乳房炎が発症したことが分かった。また、７月２１日の数日前に右前乳房の乳汁に含まれる粒子の比表面積の減少が観察されたことから、右前乳房で発症した乳房炎は黄色ブドウ球菌感染による乳房炎であると判定した。また、右前乳房の体細胞数が大幅に増加した７月２８日の数日前にも右前乳房の乳汁に含まれる粒子の比表面積の減少が観察された。乳汁に含まれる粒子の比表面積の減少は、黄色ブドウ球菌の増殖に伴う乳汁中のｐＨ低下およびカゼインミセルの凝集が原因であると考えられる。
【0051】
〔実施例６〕各乳牛から採取した乳汁の分析
酪農学園大学で飼育されている乳牛２頭からカテーテルを用いて乳房内部から直接採取した乳汁サンプルについて、実施例１と同様の手順で、体細胞数および緩和時間（Ｔ２）を連続測定し、比表面積を算出した。測定した体細胞数および測定した緩和時間（Ｔ２）により算出した比表面積の結果を図１１に示す。
酪農学園大学で飼育されている乳牛２頭からカテーテルを用いて乳房内部から直接採取した乳汁サンプルについて、実施例１と同様の手順で、体細胞数および緩和時間（Ｔ２）を連続測定し、比表面積を算出した。測定した体細胞数および測定した緩和時間（Ｔ２）により算出した比表面積の結果を図１１に示す。
【0052】
図１１中、左軸は比表面積（ｍ２／ｇ）を示し、右軸は体細胞数（１０４／ｍＬ）を示す。２つの折れ線グラフはそれぞれ、比表面積（破線）および乳量（実線）の測定結果、棒グラフは体細胞数の測定結果を示す。
【0053】
図１１に示すように、乳牛No.1256の乳房から採取した乳汁の体細胞数が８月３１日に１００×１０４／ｍＬ以上に増加した。乳牛No.1256については、体細胞数増加前に乳汁に含まれる粒子の比表面積の変動が観察された。また、乳牛No.1405の乳房から採取した乳汁の体細胞数が９月４日に１００×１０４／ｍＬ以上に増加した。乳牛No.1405についても、細胞数増加前に乳汁に含まれる粒子の比表面積の変動が観察された。
【0054】
〔実施例７〕各乳牛から採取した乳汁の分析
学校法人八紘学園 北海道農業専門学校で飼育されている乳牛３頭から採取した乳汁サンプルについて、実施例１と同様の手順で、体細胞数および緩和時間（Ｔ２）を連続測定し、比表面積を算出した。測定した体細胞数および測定した緩和時間（Ｔ２）により算出した比表面積の結果を図１２に示す。乳汁は朝（ＡＭ）と夕方（ＰＭ）の１日２回採取した。
学校法人八紘学園 北海道農業専門学校で飼育されている乳牛３頭から採取した乳汁サンプルについて、実施例１と同様の手順で、体細胞数および緩和時間（Ｔ２）を連続測定し、比表面積を算出した。測定した体細胞数および測定した緩和時間（Ｔ２）により算出した比表面積の結果を図１２に示す。乳汁は朝（ＡＭ）と夕方（ＰＭ）の１日２回採取した。
【0055】
図１２中、左軸は比表面積（ｍ２／ｇ）を示し、右軸は体細胞数（１０４／ｍＬ）を示す。乳牛３頭中、ローズおよびジャスティスについては、２つの乳房からそれぞれ乳汁を採取した。
【0056】
図１２に示すように、乳牛３頭とも、乳汁中に含まれる粒子の比表面積は、朝と夕方において周期的に変動することが分かった。一般的に、乳汁中のカルシウム含有量が朝よりも夕方に採取した乳汁の方が高いことが高いことが知られている。したがって、比表面積の周期的な変動は、カルシウム媒体となっているカゼインミセル自体が夕方に採取した乳汁により多く含まれることに起因していると考えられる。
【0057】
また、図１１と同様に、体細胞数が１００×１０４／ｍＬを超えた乳汁サンプルがいくつか存在していたが、各乳牛において特に比表面積の変動が見られなかった。体細胞数が増加した乳汁サンプル（ジャスティスとミッシェル）に含まれる粒子の比表面積は、体細胞数が増加しなかった乳汁サンプルに含まれる粒子の比表面積と比較して、低い傾向を示した。
【0058】
〔評価例３〕スキムミルク分散液中での黄色ブドウ球菌の培養
黄色ブドウ球菌増殖によるカゼインミセルの凝集をin vitroで定量観察するため、スキムミルクの３％水溶液に黄色ブドウ球菌を添加した。そして、各サンプルの細菌数が、１．０×１０１０ＣＦＵ／ｍＬ、５．０×１０９ＣＦＵ／ｍＬ、２．５×１０９ＣＦＵ／ｍＬ、および１．２５×１０９ＣＦＵ／ｍＬとなるように調整した。そして、各サンプルを３７℃において培養した。培養開始から１時間毎に、実施例１と同様の手順で乳汁の緩和時間（Ｔ２）を測定し、比表面積を算出した。測定結果を図１３に示す。
黄色ブドウ球菌増殖によるカゼインミセルの凝集をin vitroで定量観察するため、スキムミルクの３％水溶液に黄色ブドウ球菌を添加した。そして、各サンプルの細菌数が、１．０×１０１０ＣＦＵ／ｍＬ、５．０×１０９ＣＦＵ／ｍＬ、２．５×１０９ＣＦＵ／ｍＬ、および１．２５×１０９ＣＦＵ／ｍＬとなるように調整した。そして、各サンプルを３７℃において培養した。培養開始から１時間毎に、実施例１と同様の手順で乳汁の緩和時間（Ｔ２）を測定し、比表面積を算出した。測定結果を図１３に示す。
【0059】
図１３中、縦軸は比表面積（ｍ２／ｇ）を示し、横軸は培養時間を示す。図１３に示すように、黄色ブドウ球菌の添加量が多いサンプルほど、比表面積の減少がより早く確認された。また、比表面積の減少に伴って、乳汁のｐＨも減少することが確認された。
【0060】
〔実施例のまとめ〕
以上の結果から、ＮＭＲ法によって、乳牛等の家畜の各乳房から採取した乳汁のスピン－スピン緩和時間（Ｔ２）を計測することによって、乳房が乳房炎を発症しているか否かを判定することができることが分かった。また、体細胞測定も同時に行うことによって、乳房炎の種類（黄色ブドウ球菌等のグラム陽性菌感染による乳房炎であるか否か）も推定できることが分かった。
以上の結果から、ＮＭＲ法によって、乳牛等の家畜の各乳房から採取した乳汁のスピン－スピン緩和時間（Ｔ２）を計測することによって、乳房が乳房炎を発症しているか否かを判定することができることが分かった。また、体細胞測定も同時に行うことによって、乳房炎の種類（黄色ブドウ球菌等のグラム陽性菌感染による乳房炎であるか否か）も推定できることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【0061】
本発明は、家畜の乳房炎の検査に利用することができる。よって、本発明は、食品分野および診断医療分野等に広く利用することができる。
【符号の説明】
【0062】
１００、１０１ 検査システム
２００ 搾乳機
２０１ ミルカーユニット
２０２ ミルククロー
２０３ フローセル
３００ ＮＭＲ装置
３０１、４０１、５０１ 通信部
３０２、４０２、５０２ 制御部
３０３、５０３ 測定部
３０４ 計算部
４００ 管理端末
４０３ 記憶部
４０４ 表示部
４０５ ＮＭＲ測定値比較部
４０６ 体細胞数比較部
４０７ 判定部
４０８ 異常通知部
５００ 体細胞測定装置
２００ 搾乳機
２０１ ミルカーユニット
２０２ ミルククロー
２０３ フローセル
３００ ＮＭＲ装置
３０１、４０１、５０１ 通信部
３０２、４０２、５０２ 制御部
３０３、５０３ 測定部
３０４ 計算部
４００ 管理端末
４０３ 記憶部
４０４ 表示部
４０５ ＮＭＲ測定値比較部
４０６ 体細胞数比較部
４０７ 判定部
４０８ 異常通知部
５００ 体細胞測定装置
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】