特許 7553919 アドレノメデュリン類の測定方法および測定試薬

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-09-10

(45)【発行日】2024-09-19

(54)【発明の名称】アドレノメデュリン類の測定方法および測定試薬

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/53 20060101AFI20240911BHJP

   C07K 16/26 20060101ALI20240911BHJP

【ＦＩ】

G01N33/53 B

C07K16/26 ZNA

【請求項の数】 6

(21)【出願番号】P 2021055786

(22)【出願日】2021-03-29

(65)【公開番号】P2022152855

(43)【公開日】2022-10-12

【審査請求日】2024-01-11

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 ウェブサイトのアドレス：・ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｂｂｒｃ．２０２０．０６．０５７ ・ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｓｃｉｅｎｃｅｄｉｒｅｃｔ．ｃｏｍ／ｓｃｉｅｎｃｅ／ａｒｔｉｃｌｅ／ｐｉｉ／Ｓ０００６２９１Ｘ２０３１２７４２？ｖｉａ％３Ｄｉｈｕｂ ・ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｓｃｉｅｎｃｅｄｉｒｅｃｔ．ｃｏｍ／ｓｃｉｅｎｃｅ／ａｒｔｉｃｌｅ／ａｂｓ／ｐｉｉ／Ｓ０００６２９１Ｘ２０３１２７４２？ｖｉａ％３Ｄｉｈｕｂ 掲載日：令和２年７月１９日 ［刊行物等］ 第１２９回日本循環器学会九州地方会 開催日：令和２年１２月５日

(73)【特許権者】

【識別番号】504224153

【氏名又は名称】国立大学法人 宮崎大学

(73)【特許権者】

【識別番号】000003300

【氏名又は名称】東ソー株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100138210

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 達則

(74)【代理人】

【識別番号】100185856

【弁理士】

【氏名又は名称】朝倉 栄二

(72)【発明者】

【氏名】北村 和雄

(72)【発明者】

【氏名】五十嵐 浩二

【審査官】海野 佳子

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１８／１８１６３８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】One-Step Direct Assay for Mature-Type Adrenomedullin with Monoclonal Antibodies，Clinical Chemistry，1999年，Vol.45, No.2，pp.244-251，DOI: 10.1093/clinchem/45.2.244

【文献】Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，1999年，Vol.２８７，P.１３１－１４３

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ ３３／４８－３３／９８

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

アドレノメデュリン（ＡＭ）類を測定する方法であって、
ＡＭ類縁体の投薬治療介入を行った患者に由来する検体中のＡＭ類を、
ａＡＭ測定方法、すなわちＡＭのリング構造を特異的に認識する抗体及び
ＡＭのＣ末端がアミド化された部分を特異的に認識する抗体を用いて測定する方法
又は
ｔＡＭ測定方法、すなわちＡＭのリング構造を特異的に認識する抗体及び
ＡＭのリング構造とＣ末端の間の部分を特異的に認識する抗体を用いて測定する方法
を用いて測定することにより、
内因性のＡＭ類と投薬によるＡＭ類縁体とを等価に測定することを特徴とし、
ここでＡＭ類縁体が、配列番号１記載のアミノ酸配列を含むペプチドであり、その３２番目のアミノ酸残基ＸａａがＡｒｇ以外である、
方法。

【請求項2】

ＡＭ類を測定する方法であって、
ＡＭ類縁体の投薬治療介入を行った患者に由来する検体中のＡＭ類を、
ａＡＭ測定方法、すなわちＡＭのリング構造を特異的に認識する抗体及び
ＡＭのＣ末端がアミド化された部分を特異的に認識する抗体を用いて測定する方法
又は
ｔＡＭ測定方法、すなわちＡＭのリング構造を特異的に認識する抗体及び
ＡＭのリング構造とＣ末端の間の部分を特異的に認識する抗体を用いて測定する方法
を用いて測定することにより、
内因性のＡＭ類と投薬によるＡＭ類縁体とを等価に測定することを特徴とし、
ここでＡＭ類縁体が配列番号２から成るアミノ酸配列であり、その４４番目のアミノ酸残基ＸａａがＡｒｇ以外のアミノ酸である、
方法。

【請求項3】

配列番号１の３２番目あるいは配列番号２の４４番目のアミノ酸残基ＸａａがＬｙｓ、Ａｌａあるいは光学異性体であるＤ体のＡｒｇである請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

配列番号１あるいは配列番号２記載のＡＭ類縁体のＣ末端がアミド（-ＣＯＮＨ２）化されている、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項5】

請求項１～４のいずれか１項に記載のａＡＭ測定方法およびｔＡＭ測定方法による測定値からＡＭ類の分解をモニターリングする方法。

【請求項6】

ＡＭ類を認識する抗体として、
「ＡＭのリング構造を特異的に認識する抗体及び
ＡＭのＣ末端がアミド化された部分を特異的に認識する抗体」
及び／又は
「ＡＭのリング構造を特異的に認識する抗体及び
ＡＭのリング構造とＣ末端の間の部分を特異的に認識する抗体」
を含有することを特徴とする、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法に使用するための測定試薬。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は医薬品としてアドレノメデュリン類縁体を投薬された対象者の検体中のアドレノメデュリン類を測定し、その濃度を指標にアドレノメデュリン類縁体の投薬量を最適化することを目的とした検査方法と検査薬に関する。

【背景技術】

【0002】

アドレノメデュリンは北村らによりヒト褐色細胞腫組織から発見された血管拡張性ペプチドであり５２個のアミノ酸からなり、最終的にＣ末端がアミド化され生理活性を有した成熟型アドレノメデュリンとなる（非特許文献１、特許文献１）。

【0003】

ヒトアドレノメデュリン前駆体は１８５個のアミノ酸からなり、Ｎ末端側より２１アミノ酸からなるシグナルペプチド、２０個のアミノ酸からなるプロアドレノメデュリン（ＰＡＭＰ）、５４アミノ酸からなる中間領域プロアドレノメデュリン（ＭＲ-ｐｒｏＡＤＭ）、５２アミノ酸からなるアドレノメデュリン（ＡＭ：配列番号４）、３８アミノ酸からなるＣ末端アドレノメデュリンの構成である。ＡＭは前駆体であるｐｒｅｐｒｏＡＭからプロセッシングを受け切断された後、Ｃ末端にグリシンが付加した状態の中間体アドレノメデュリン（ｉＡＭ）を経て、アミド化酵素によりＣ末端がアミド（-ＣＯＮＨ２）の成熟型アドレノメデュリン（ｍＡＭ）となる。

【0004】

ＰＡＭＰならびにｍＡＭはそのセレプターを介した生理活性を有し、血清中での消失が通常の代謝に加え、レセプターによる取込みにより、極めて短い特徴を有している。ＡＭの生理活性は血行動態改善、臓器保護作用、抗炎症作用、組織再生等の報告があるが未だ不明な点も多いが基本的に生体防御を担っていると考えられている。ＡＭは血中半減期が極めて短いことから、血清マーカーとしての利用が困難（非特許文献２、３）とされていた。血液中のＡＭ濃度が変動する疾患としては、敗血症（非特許文献４）、心疾患（非特許文献５）等の報告がある。最近になりＡＭが炎症性疾患の治療薬として期待されており、本邦において臨床治験が進められている。具体的には、炎症性腸疾患（非特許文献６）対する臨床治験が行われている。

【0005】

さらに最近になりＡＭのポリエチレングリコール修飾体（非特許文献７）やＡＭ類縁体（非特許文献８）の血中安定性が優れていることが示され薬剤として期待されている。これら報告によればＡＭ類縁体ならびにＡＭ修飾体は天然型ＡＭとほぼ同一の生物学的活性を示すことが明らかにされている。従って、ＡＭ類縁体を薬剤として用いる際は、内因性の、即ち、患者自身から分泌されたＡＭ類と薬剤として投与したＡＭ類縁体とを等価に、かつ活性のあるＡＭ類のみを定量できれば、ＡＭ類総和の薬効として血液中濃度を維持でき、薬効継続のためのＡＭ類縁体の投与量を最適化できる。

【0006】

５２アミノ酸からなるヒトＡＭはＣ末端がアミド化されて活性のあるｍＡＭとなるが、Ｎ末端から１６番目と２１番目のシステイン間のジスルフィド結合により生じるリング構造よりもＮ末端側のペプチド配列が活性に与える影響については未だ不明な点も多い。ＡＭのリング構造を認識する抗体とアミド化されたＣ末端を認識する抗体を用いたＯｎｅ－ｓｔｅｐ ｔｗｏ－ｓｉｔｅ ｉｍｍｕｎｏｒａｄｉｏｍｅｔｒｉｃ ａｓｓａｙ （ＩＲＭＡ）が報告されているが、リング構造よりもＮ末端側のペプチドが切断されたＡＭやその活性についての記載はない（非特許文献１０、１１）。

【0007】

敗血症をはじめとする各種炎症性疾患ではトロンビンが活性化し、血栓が生じることが報告されている。我々は、ヒトＡＭがトロンビンによって切断されて新たなペプチド断片を生じること、及びヒトＡＭのＮ末端の１２残基からなる配列はＡＭの活性に不要であることを見出した。また、トロンビンによる切断を回避し、かつＡＭ活性を有する各種ＡＭ類縁体を作製した。さらに、内因性ＡＭ類とＡＭ類縁体とを等価に測定し、かつ活性のあるＡＭ類のみを測定できる検査方法と検査薬を開発し、本目的を達成することが可能になった。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【文献】特開平７-１９６６９３号公報

【非特許文献】

【0009】

【文献】Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９９３；１９２：５５３－５６０

【文献】Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．１９９７；８２：９５－１００

【文献】Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．１９９８；４４：５７１－５７７

【文献】Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ ２０１８；２２：３５４

【文献】Ａｍ．Ｊ．Ｅｍｅｒｇ．Ｍｅｄ． ２０１６；３４：２５７－２６２

【文献】Ｉｎｆｌａｍｍ．Ｂｏｗｅｌ．Ｄｉｓ． ２０１３；１９：Ｅ２６－２７

【文献】Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ２０１４；５７：１１８－１２１

【文献】Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０２０；５２９：７７８－７８３

【文献】Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．１９９７；２５：９５３－９５７

【文献】Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．１９９９；４５：２４４－２５１

【文献】Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ １９９９；２８７：１３１－１４３

【文献】Ｅｎｄｏｃｒ．Ｃｏｎｎｅｃｔ．２０１５；４：４３－４９

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

血液中の安定性が良好なＡＭ類縁体による治療を行う際に投与量を最適に保つため、疾患により大きく変動する内因性ＡＭ類と薬剤として投与したＡＭ類縁体とを等価に測定できる検査薬が期待されている。また、炎症性疾患等の病態ではトロンビン等のプロテアーゼが活性化し、ＡＭ類が分解されることにより各種ペプチド断片が生じる可能性があるため、活性のあるＡＭ類のみを測定できる検査薬が期待されている。本発明は内因性ＡＭとＡＭ類縁体とを等価に、かつ活性のあるＡＭ類のみを測定し、ＡＭ類縁体を最適量投与するための免疫学的な検査方法と検査薬を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明者らは、薬剤として投与したＡＭ類縁体を内因性ＡＭ類と等価に、かつ活性のあるＡＭ類のみを測定し、ＡＭ類縁体投与治療における血液中のＡＭ類濃度を最適化できる検査方法を見出し、本発明に到達した。
即ち本発明は下記の発明を包含する：

【0012】

［１］検体中に含まれる、活性のあるアドレノメデュリン（ＡＭ）類のみを測定する免疫学的な方法であって、ＡＭのリング構造を特異的に認識する抗体、及びＡＭのＣ末端がアミド化された部分を特異的に認識する抗体を用いて測定する方法。
［２］ＡＭのリング構造を特異的に認識する抗体が、配列番号２におけるアミノ酸１６～２１のリング構造部位を含むアミノ酸配列１２～２５を認識する抗体である、［１］に記載の方法。
［３］検体が、培養上清、組織抽出液、血液、血清、血漿、尿である、［１］または［２］に記載の方法。
［４］ＡＭ類が配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列を含み、Ｃ末端がアミド（-ＣＯＮＨ２）化されている、［１］～［３］のいずれか１項に記載の方法。
［５］配列番号１の３２番目あるいは配列番号２のアミノ酸配列の４４番目のアミノ酸残基ＸａａがＬｙｓ、Ａｌａあるいは光学異性体であるＤ体のＡｒｇである［１］～［４］のいずれか１項に記載の方法。
［６］ＡＭ類を測定する方法であって、
ＡＭ類縁体の投薬治療介入を行った患者に由来する検体中のＡＭ類を、
ａＡＭ測定方法（ＡＭのリング構造を特異的に認識する抗体及び
ＡＭのＣ末端がアミド化された部分を特異的に認識する抗体を用いて測定する方法）
又は
ｔＡＭ測定方法（ＡＭのリング構造を特異的に認識する抗体及び
ＡＭのリング構造とＣ末端の間の部分を特異的に認識する抗体を用いて測定する方法）
を用いて測定することにより、
内因性のＡＭ類と投薬によるＡＭ類縁体とを等価に測定することを特徴とする方法。
［７］ＡＭ類縁体が、配列番号１記載のアミノ酸配列を含むペプチドであり、その３２番目のアミノ酸残基ＸａａがＡｒｇ以外である、［６］に記載の方法。
［８］ＡＭ類縁体が配列番号２から成るアミノ酸配列であり、その４４番目のアミノ酸残基ＸａａがＡｒｇ以外のアミノ酸である、［６］又は［７］に記載の方法。
［９］配列番号１の３２番目あるいは配列番号２の４４番目のアミノ酸残基ＸａａがＬｙｓ、Ａｌａあるいは光学異性体であるＤ体のＡｒｇである［６］～［８］のいずれか１項に記載の方法。
［１０］配列番号１あるいは配列番号２記載のＡＭ類縁体のＣ末端がアミド（-ＣＯＮＨ２）化されている、［６］～［９］のいずれか１項に記載の方法。
［１１］［６］～［１０］のいずれか１項に記載のａＡＭ測定方法およびｔＡＭ測定方法による測定値からＡＭ類の分解をモニターリングする方法。
［１２］ＡＭ類を認識する抗体として、
「ＡＭのリング構造を特異的に認識する抗体及び
ＡＭのＣ末端がアミド化された部分を特異的に認識する抗体」
及び／又は
「ＡＭのリング構造を特異的に認識する抗体及び
ＡＭのリング構造とＣ末端の間の部分を特異的に認識する抗体」
を含有することを特徴とする、［６］～［１１］のいずれか１項に記載の方法に使用するための測定試薬。

【発明の効果】

【0013】

本発明によれば、ＡＭ類縁体投与患者検体中の活性のあるＡＭ類の濃度をモニターすることにより、適切なＡＭ類縁体投与量に関する情報を提供することが可能である。本発明によれば、短時間でＡＭ類を定量可能であり、適切な投薬管理を可能とする簡便かつ低コストな検査試薬を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】ヒト血清（Ａ）及びトロンビン（Ｂ）によるヒトＡＭの分解、並びにｄａｂｉｇａｔｒａｎによる分解抑制（Ｃ）を示す。

【図2】ＡＭ及びＡＭ類縁体ペプチドの活性を示す。

【図3】ヒト血清によるＡＭ及びＡＭ類縁体ペプチドの分解を示す。

【図4】ａＡＭ測定系における天然型ＡＭに対するＡＭ類縁体の測定濃度回収率を示す。

【図5】ｔＡＭ測定系における天然型ＡＭに対するＡＭ類縁体の測定濃度回収率を示す。

【発明を実施するための形態】

【0015】

以下、本発明をさらに詳細に説明する。但し、本発明は以下の実施の形態に束縛されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において、任意の形態で実施することが可能である。

【0016】

本開示で引用する特許公報、特許出願公開公報、及び非特許文献等は、何れもその全体が援用により、あらゆる目的において本開示に組み込まれるものとする。

【0017】

本開示で表記するアミノ酸は特に記載がなければ、天然のペプチドに含まれるＬ体のアミノ酸である。

【0018】

本発明において、「アドレノメジュリン（ＡＭ）類」とは、ＡＭ、ＡＭ由来の分解（部分）ペプチド、ＡＭ類縁体及びこれらの修飾ペプチドである。該修飾ペプチドの例としては、ポリエチレングリコールが結合したペプチドや抗体の定常領域（Ｆｃ）、アルブミンが融合したペプチドが挙げられる（非特許文献７）。本発明においてＡＭ類は、配列番号４のアミノ酸配列を有するヒトＡＭ、またはヒトＡＭに由来するペプチドであることが好ましい。

【0019】

本発明において「ＡＭ類縁体」とは、ＡＭまたはＡＭ部分ペプチドのペプチド配列のうち、１、２、３、４または５個のアミノ酸残基を変異（置換、削除または挿入）させたペプチドである。ＡＭ類縁体が有する変異は連続して導入してもよく、不連続であってもよい。また、Ｌ体のアミノ酸を非天然のＤ体のアミノ酸に変異させてもよい。本発明のＡＭ類縁体は、配列番号４のアミノ酸配列に変異を有するヒトＡＭの変異体、又は配列番号３のアミノ酸配列に変異を有するヒトＡＭ部分ペプチドの変異体であることが好ましい。本発明のＡＭ類縁体に導入する変異は、配列番号４のＮ末端側から２５番目のリジンから４５番目のセリン（以下、「アミノ酸配列２５～４５」ということもある。以下同様。）の範囲でのアミノ酸変異、または配列番号３のＮ末端側から１３番目のリジンから３３番目のセリン（アミノ酸配列１３～３３）の範囲でのアミノ酸変異であることが好ましく、配列番号１または配列番号２のアミノ酸残基ＸａａをＬ－アルギニン以外のアミノ酸に変異させることが好ましい。本発明のＡＭ類縁体の例として、非限定的に配列番号１または２のアミノ酸残基Ｘａａをリジン、アラニンまたはＤ－アルギニンに変異したペプチドが挙げられる。

【0020】

本発明においてＡＭの「活性」は例えば、ＡＭを細胞に作用させたときのアデニルシクラーゼ活性を測定することにより調べることができる。活性のあるＡＭを細胞に作用させた場合、細胞内のｃＡＭＰの濃度がＡＭの濃度依存的に上昇する。ＡＭを作用させる細胞としては例えばＡＭ１受容体を安定に発現するＨＥＫ－２９３細胞（Ｋｕｗａｓａｋｏら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７８ （２００３） ２２６２；Ｎａｇｏｓｈｉら、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ４５０ （２００２） ２３７）が挙げられる。ＡＭのＮ末端のペプチドはＡＭの活性に不要であり、Ｃ末端のアミド化は活性のあるｍＡＭに必要であることから、少なくともリング構造とＣ末端のアミド構造を有するＡＭ類は活性があるといえ、リング構造またはアミド構造を失ったペプチドは失活する。

【0021】

本発明において用いられる検体は特に限定はなく、培養上清、組織抽出液、組織洗浄液（例えば、肺胞洗浄液）、血液成分、血液、血清、血漿、尿等をあげることができ、その中でも培養上清、組織抽出液、組織洗浄液、全血、血清、血漿などが好ましく、血清、血漿が更に好ましい。また、検体採取後のＡＭ類の分解を抑える目的でトロンビン等のプロテアーゼに対する阻害剤を添加する、あるいは添加された採血管の使用、あるいは採血後冷蔵保存することが好ましい。プロテアーゼ阻害剤の例としては、ａｎｔｉｐａｉｎ （ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、Ｂｅｓｔａｔｉｎ、Ｃｈｙｍｏｓｔａｔｉｎ、Ｌ－ｔｒａｎｓ－３－Ｃａｒｂｏｘｙｏｘｉｒａｎ－２－ｃａｒｂｏｎｙｌ－Ｌ－ｌｅｕｃｙｌａｇｍａｔｉｎｅ（Ｅ－６４）、Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ、Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｏｎ、Ｐｅｆａｂｌｏｃ ＳＣ、ＥＤＴＡ（２Ｎａ）、Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ及びｄａｂｉｇａｔｒａｎが挙げられるが、ｄａｂｉｇａｔｒａｎ、ａｎｔｉｐａｉｎ （ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ） 、Ｐｅｆａｂｌｏｃ ＳＣが好ましい（非特許文献８）。

【0022】

本発明において用いられる検体としては、ＡＭ濃度が病態と関連する疾患患者由来の検体があげられる。当該疾患の例としては、うっ血性心不全、心筋梗塞、腎臓病、高血圧性障害、糖尿病、炎症性腸疾患、脳梗塞、敗血症、新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ１９）がある。

【0023】

本発明の一実施態様は、検体中に含まれる活性のあるＡＭ類を測定する免疫学的な方法であって、ＡＭのリング構造を特異的に認識する抗体、及びＡＭのＣ末端がアミド化された部分を特異的に認識する抗体を用いて測定する方法である。

【0024】

本発明において「ＡＭのリング構造を特異的に認識する抗体」とは、配列番号２のアミノ酸配列１６～２１のリング構造を特異的に認識する抗体であり、例えばＡｄＲ－１抗体が挙げられる（非特許文献１０）。ＡＭのリング構造を特異的に認識する抗体は、リング構造を有する、配列番号２のアミノ酸配列１２～２５からなるペプチドをマウスに免疫することにより取得することができる。

【0025】

本発明において「ＡＭのＣ末端がアミド化された部分を特異的に認識する抗体」とは、配列番号２のＣ末端のチロシンのカルボキシル基がアミド化されている構造を特異的に認識する抗体であり、例えばＡｄＣ－１抗体が挙げられる（非特許文献１０）。ＡＭのＣ末端がアミド化された部分を特異的に認識する抗体は、配列番号２のアミノ酸配列４６～５２からなるペプチドであって、Ｃ末端のチロシンのカルボキシル基がアミド化されているペプチドをマウスに免疫することにより取得することができる。

【0026】

本発明の一実施態様において、そのような測定方法は、酵素標識、化学発光標識、電気化学発光標識を含むが、それらに限定されない任意の種類の検出技術を用いるサンドイッチイムノアッセイ、好ましくは完全自動化アッセイである。本発明の一実施態様において、そのような測定方法は、酵素標識サンドイッチアッセイである。自動化または完全自動化の測定方法の例は、以下のシステム：自動免疫測定装置ＡＩＡシリーズ（東ソー社製）、Ｒｏｃｈｅ Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）、Ａｂｂｏｔｔ Ａｒｃｈｉｔｅｃｔ（登録商標）、Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｃｅｎｔａｕｅｒ（登録商標）、Ｂｒａｈｍｓ Ｋｒｙｐｔｏｒ（登録商標）、Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ Ｖｉｄａｓ（登録商標）、Ａｌｅｒｅ Ｔｒｉａｇｅ（登録商標）のうちの１つのために使用されうる測定方法を含む。

【0027】

多様な免疫学的測定方法が知られており、本発明の測定方法のために使用されることができ、これらは、以下の：ラジオイムノアッセイ（「ＲＩＡ」）、均一酵素増殖イムノアッセイ（「ＥＭＩＴ」）、酵素結合免疫吸着剤アッセイ（「ＥＬＩＳＡ」）、アポ酵素再活性化イムノアッセイ（「ＡＲＩＳ」）、ディップスティックイムノアッセイおよび免疫クロマトグラフィーアッセイを含む。

【0028】

本発明の測定方法にかかる好ましい検出方法は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ：放射性ヨウ素標識等を使用）、化学発光および蛍光発光イムノアッセイ、酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、Ｌｕｍｉｎｅｘに基づくビーズアレイ、タンパク質マイクロアレイアッセイなどの多様なフォーマット、および例えば、免疫クロマトグラフィーストリップテストなどの迅速試験フォーマットの免疫学的測定方法を含む。

【0029】

本発明の測定方法において、蛍光発光イムノアッセイは蛍光色素の使用を含み、それは例えば、ＦＡＭ（５－または６－カルボキシフルオレセイン）、ＶＩＣ、ＮＥＤ、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ＩＲＤ－７００／８００、ＣＹ３、ＣＹ５、ＣＹ３．５、ＣＹ５．５、Ｃｙ７などのシアニン色素、キサンテン、６－カルボキシ－２’，４’，７’，４，７－ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、ＴＥＴ、６－カルボキシ－４’，５’－ジクロロ－２’，７’－ジメトジフルオレセイン（ＪＯＥ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－６－カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、６－カルボキシ－Ｘ－ローダミン（ＲＯＸ）、５－カルボキシローダミン－６Ｇ（Ｒ６Ｇ５）、６－カルボキシローダミン－６Ｇ（ＲＧ６）、ローダミン、ローダミングリーン、ローダミンレッド、ローダミン１１０、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲなどのＢＯＤＩＰＹ色素、オレゴン・グリーン、Ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅなどのクマリン、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８などのベンズイミド；テキサス・レッド、ヤキマ・イエロー、アレクサ・フルオルなどのフェナントリジン、ＰＥＴ、臭化エチジウム、アクリジニウム色素、カルバゾール色素、フェノキサジン色素、ポルフィリン色素、ポリメチン色素などを含む群から選ばれる。

【0030】

本発明の測定方法において、化学発光イムノアッセイは化学発光標識体を使用し、例えばアクリジニウムエステル標識、イソルミノール標識を含むステロイド標識などである。

【0031】

本発明の測定方法において、酵素結合イムノアッセイは酵素標識を使用し、例えばラクテートデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、クレアチンキナーゼ（ＣＰＫ）、アルカリホスファターゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、酸ホスファターゼ、グルコース－６－ホスフェートデヒドロゲナーゼの標識などである。

【0032】

本発明において、「ＡＭ類縁体投薬治療患者」とは特に限定されるものではないが、例えば疾患によりＡＭ類が変動するうっ血性心不全、心筋梗塞、腎臓病、高血圧性障害、糖尿病、炎症性腸疾患、脳梗塞、敗血症、新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ１９）が疑われる患者等を上げることができる。

【0033】

また、投与する（外因性の）ＡＭ類縁体とは、内因性ＡＭ類に比較し血液中での安定性向上を目的に改変されたＡＭ類であり、特に限定されるものではないが、上記したように例えば配列番号１あるいは２などで、そのＣ末端がアミド化されたものを例示することができる。

【0034】

本発明において用いられる検体は特に限定はなく、ＡＭ類縁体の投薬治療介入を行った患者に由来する細胞の培養上清、組織抽出液、組織洗浄液（例えば、肺胞洗浄液）、血液成分、血液、血清、血漿、尿等をあげることができ、その中でも全血、血清、血漿などが好ましく、血清、血漿が更に好ましい。また、検体採取後のＡＭ類の分解を抑える目的でトロンビン等のプロテアーゼに対する阻害剤を添加する、あるいは添加された採血管の使用、あるいは採血後冷蔵保存することが好ましい。プロテアーゼ阻害剤の例としては、ａｎｔｉｐａｉｎ （ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、Ｂｅｓｔａｔｉｎ、Ｃｈｙｍｏｓｔａｔｉｎ、Ｌ－ｔｒａｎｓ－３－Ｃａｒｂｏｘｙｏｘｉｒａｎ－２－ｃａｒｂｏｎｙｌ－Ｌ－ｌｅｕｃｙｌａｇｍａｔｉｎｅ（Ｅ－６４）、Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ、Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｏｎ、Ｐｅｆａｂｌｏｃ ＳＣ、ＥＤＴＡ（２Ｎａ）、Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ及びｄａｂｉｇａｔｒａｎが挙げられるが、ｄａｂｉｇａｔｒａｎ、ａｎｔｉｐａｉｎ （ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ） 、Ｐｅｆａｂｌｏｃ ＳＣが好ましい（非特許文献８）。

【0035】

本発明の方法により、ＡＭ類縁体投与治療患者の血液中のＡＭ類濃度情報が提供される。そして医師等は、提供された情報等を参照して、投薬量のコントロールならびに治療効果を評価する。即ち本発明の方法自体は、ＡＭ類縁体投与治療患者の最終的な診断行為は含まず、医師等に判断材料を提供する段階までを含むものである。

【0036】

本発明において、アドレノメデュリン類には特に限定はないが、配列番号１あるいは２記載のアミノ酸配列を含むものが好ましい。

【0037】

また配列番号１あるいは２記載のアドレノメデュリンＣ末端がアミノ基であるもの、中間体アドレノメデュリン、又はＣ末端がアミド化された成熟型アドレノメデュリンならびにこれらのＡＭ類縁体が測定対象となる。さらに、アドレノメデュリン部分ペプチドを測定してもよい。このアドレノメデュリン部分ペプチドとは、ＡＭ、ｉＡＭ、ｍＡＭなどの天然型アドレノメデュリン類ならびにこれらのＡＭ類縁体がペプチダーゼなどにより分解を受けた部分ペプチド（例えば、配列番号３のペプチド）のことを意味する。

【0038】

測定方法として、一つはリング構造を有し、Ｃ末端がアミド化されているＡＭ類を特異的に測定する方法、二つ目として、リング構造を有し、ＡＭ類のリング構造とＣ末端の中間部分（以下、「中間構造」という）を有するＡＭ類を特異的に測定する方法である。前者の測定方法は活性のあるＡＭ類のみを測定し、後者の測定方法は、活性のあるＡＭ類に加え、中間体アドレノメデュリン、リング構造及び中間構造を有するアドレノメデュリン部分ペプチドも測定することができる。本発明では前者の測定方法をａＡＭ（ａｃｔｉｖｅ ＡＭ）測定方法、後者の測定方法をｔＡＭ（ｔｏｔａｌ ＡＭ）測定方法と記載する場合もある。以上のように測定対象のアドレノメデュリン類には種々のものがあるが、本発明の方法においてはａＡＭ測定方法又はｔＡＭ測定方法で測定する。

【0039】

本発明において上述のようなＡＭ類を測定する方法は、抗体を用いた免疫化学的方法である。より具体的には、測定対象のＡＭ類を認識する抗体を含有する試薬を用いて行うことができる。このとき、例えば測定対象のＡＭ類を認識する固相化抗体と、それとは異なる部位で測定対象のＡＭ類を認識する標識化抗体を利用した試薬を用いて、サンドイッチ法により行うことができる。このときの標識としては、酵素等があげられる。なお、ｔＡＭ測定方法及びａＡＭ測定方法は非特許文献９、１０および１１に記載の抗体を用いて作製された非特許文献１２に記載の測定法などにより行うことができる。

【0040】

本発明において利用可能な抗体は配列番号１のアミノ酸３２番あるいは配列番号２のアミノ酸４４番を抗体認識部位に含まない抗体である。具体的には配列番号２におけるアミノ酸１６～２１のリング構造部位を含むアミノ酸配列１２～２５を認識する抗体（例えばＡｄＲ－１）とアミノ酸配列２５～３６を認識する抗体（例えばＡｄＭ－２）の２種類の抗体を用いればｔＡＭ測定方法が可能であり、配列番号２におけるアミノ酸１６～２１のリング構造部位を含むアミノ酸配列１２～２５を認識する抗体（例えばＡｄＲ－１）とＣ末端のアミド基を含むアミノ酸配列を特異的に認識する抗体（例えばＡｄＣ）を組み合わせればａＡＭ測定方法が可能である。ただし、これら抗体の組み合わせを利用した測定方法でも、天然型ＡＭとＡＭ類縁体が等価に測定されるとは限らない。実際、天然型ＡＭと、それとアミノ酸配列が同一のポリエチレングリコール標識されたＡＭ修飾体ではその測定値は７８％を示すこと（非特許文献７）より、必ずしも天然型ＡＭとＡＭ類縁体が等価に測定できるとは限らない。天然型ＡＭ類は血中半減期が短く、治療投与したＡＭ類縁体とは代謝されるまでの時間が異なること、天然型ＡＭ類に限らずＡＭ類縁体も患者ごとにその代謝速度やＡＭ類縁体の血中到達濃度に差異があることより、天然型ＡＭ類と投与したＡＭ類縁体の総和を評価しＡＭ類の生理作用を一定に保持するような治療には血液中のＡＭ類濃度を評価可能な検査方法が要求される。我々は天然型ＡＭ類とＡＭ類縁体を等価に測定できる測定方法を見出し本発明に至った。

【0041】

本発明の一実施態様は、ａＡＭ測定方法およびｔＡＭ測定方法による測定値からＡＭ類の分解をモニターリングする方法である。当該モニターリングにより、例えばプロテアーゼ耐性のＡＭ類縁体をスクリーニングすることができる。

【実施例】

【0042】

以下に実施例を示すが、本発明は実施例に記載された例に限られるものではない。以下の実験を行うに当たっては、各施設の研究倫理委員会での承認のもと実施した。ｔＡＭ測定ならびにａＡＭ測定は、前述の非特許文献９、１０および１１に記載の抗体（ＡｄＲ－１及びＡｄＣまたはＡｄＭ－２）を用いて作製された非特許文献１２に記載の測定法により、自動免疫測定装置ＡＩＡシリーズ（東ソー社製）を用い実施した。なお、以下の実施例の一部は非特許文献８に開示される。

【0043】

実施例１：トロンビンによるヒトＡＭの分解
ヒトＡＭ（ペプチド研社製）を１００μＬの［２０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．１）、２００ｍＭ ＮａＣｌ］溶液に溶解し、等量のヒト血清（シグマーアルドリッチ社製）またはヒト血漿（シグマーアルドリッチ社製）と混合して３７℃でインキュベートした。一定時間経過後、３０μＬの反応液を採取し、１７０μＬの０．１％トリフルオロ酢酸を添加して－８０℃で保存した。サンプル中のＡＭをａＡＭ測定法により定量した。血漿中と比較して、血清中でヒトＡＭは速やかに分解された（図１Ａ）。血清の代わりにヒトトロンビン（シグマーアルドリッチ社製）の溶液（４Ｕ／ｍＬ）を使用したところ、ヒトＡＭは速やかに分解された（図１Ｂ）。トロンビンの特異的阻害剤のｄａｂｉｇａｔｒａｎ（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）（８０μＭ）は血清によるＡＭの分解を阻害した（図１Ｃ）。
ヒトＡＭの血清による分解物を逆相ＨＰＬＣ（東ソー社製ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ－１２０Ａ）により分取し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦマススペクトロメトリーで分析したところ、分子量は３６７０．８であった。分取したペプチドを気相ペプチドシークエンサーで分析したところ、配列番号４のアミノ酸配列１３～４４（ＡＭ１３－４４）であることが分かった。
以上のことから、ヒトＡＭはトロンビンにより配列番号４のＮ末端側から１２番目のＡｒｇと１３番目のＳｅｒの間、及び４４番目のＡｒｇと４５番目のＳｅｒの間で切断されることが分かった。

【0044】

実施例２：プロテアーゼ阻害剤によるＡＭの分解抑制
各種プロテアーゼ阻害剤（５０μｇ／ｍＬのａｎｔｉｐａｉｎ ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、４０μｇ／ｍＬのＢｅｓｔａｔｉｎ、６０μｇ／ｍＬのＣｈｙｍｏｓｔａｔｉｎ、１０μｇ／ｍＬのＬ－ｔｒａｎｓ－３－Ｃａｒｂｏｘｙｏｘｉｒａｎ－２－ｃａｒｂｏｎｙｌ－Ｌ－ｌｅｕｃｙｌａｇｍａｔｉｎｅ（Ｅ－６４）、１０μｇ／ｍＬのＬｅｕｐｅｐｔｉｎ、０．７μｇ／ｍＬのＰｅｐｓｔａｔｉｎ、３３０μｇ／ｍＬのＰｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｏｎ、１ｍｇ／ｍＬのＰｅｆａｂｌｏｃ ＳＣ、０．５ｍｇ／ｍＬＥＤＴＡ（２Ｎａ）及び２ｍｇ／ｍＬのＡｐｒｏｔｉｎｉｎ）（何れもロッシュダイアグノスティックスＧｍＢＨ社製）をヒト血清含有の前記反応液（０．１ｍＬ）に添加した。３７℃でのインキュベーション後のＡＭをａＡＭ測定法により定量し、プロテアーゼ阻害剤の分解抑制効果を調べた。１０種類のプロテアーゼ阻害剤のうち、ａｎｔｉｐａｉｎ ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、Ｐｅｆａｂｌｏｃ ＳＣが強くＡＭの分解を抑制した（表１；ｎ＝２又は３）。

【0045】

【表1】

【0046】

実施例３：ＡＭ類縁体
以下のＡＭ及びＡＭ類縁体ペプチドを合成した（ペプチド研）。いずれの合成ペプチドもＣ末端がアミド化されている。これらはペプチド合成により調製し高純度であることを確認した。その濃度は重量により濃度決定し、生理的緩衝液や血清に溶解し実験に使用した。
・ＡＭ１－５２（配列番号４）
・ＡＭ１３－５２（配列番号３）
・ＡＭ－ｌｙｓ４４（配列番号１：Ｘａａ＝Ｌｙｓ）
・ＡＭ－Ｄ－ａｒｇ４４（配列番号１：Ｘａａ＝Ｄ体のＡｒｇ）
・ＡＭ－ａｌａ４４（配列番号１：Ｘａａ＝Ａｌａ）

【0047】

ＡＭ及びＡＭ類縁体ペプチドの活性を調べた。ＡＭ１受容体を安定に発現するＨＥＫ－２９３細胞（Ｋｕｗａｓａｋｏら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７８ （２００３） ２２６２；Ｎａｇｏｓｈｉら、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ４５０ （２００２） ２３７）を１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地に懸濁し、ヒトファイブロネクチン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）をコートした２４ウェルプレートに播種し、５％ＣＯ２、３７℃で培養した。０．０３５％ＮａＨＣＯ３、０．１％ＢＳＡを含むハンクスバランスド塩溶液に培地を交換して、ＡＭ又はＡＭ類縁体ペプチドを０．５ｍＭイソブチルメチルキサンチン存在下で添加し３７℃で１５分間インキュベートした。細胞溶解液を添加し、上清中のｃＡＭＰの濃度をエンザイムイムノアッセイ（ＧＥヘルスケア社製）で測定した。図２に示すように、いずれのペプチドも同程度の活性を有していた。

【0048】

ＡＭ及びＡＭ類縁体ペプチドがヒト血清により分解されるかを実施例1に記載の方法で調べた。図３に示すようにＡＭ１－５２及びＡＭ１３－５２は速やかにヒト血清により分解されたものの、ＡＭ－ｌｙｓ４４、ＡＭ－Ｄ－ａｒｇ４４及びＡＭ－ａｌａ４４の血清による分解は抑制されていた。

【0049】

実施例４：ＡＭ類縁体投与実験
以下動物実験は宮崎大学動物実験委員会の承認のもと実施した。７週令のウスターラット雄に対し、各ペプチドを５０ｎｍｏｌ／ｋｇで３匹に皮下投与し、指定時間に尾静脈より採血を行いサンプルとした。指定時間ごとのａＡＭ濃度（表２）とｔＡＭ濃度（表３）を測定し平均値±標準偏差（ｐｍｏｌ／Ｌ）を算出した。具体的にａＡＭならびにｔＡＭ測定に使用した抗体に関しては、ａＡＭにおいてはＡｄＲ－１ならびにＡｄＣの組み合わせ、ｔＡＭにおいてはＡｄＲ－１ならびにＡｄＭ－２である。その結果、ａＡＭおよびｔＡＭいずれにおいても標準偏差より個体差が大きいこと、ならびに到達濃度が大きく異なることが明らかである。また、投与したＡＭ類縁体の種類により到達濃度が異なることも明らかである。
各ペプチドのｔＡＭ濃度に対するａＡＭ濃度の割合を投与後１５分及び３０分の検体について算出すると、それぞれ、１１及び１７％（ＡＭ１－５２）、３７％及び４１％（ＡＭ１３－５２）、６４％及び６２％（ＡＭ－ｌｙｓ４４）、８１％及び８８％（ＡＭ－Ｄ－ａｒｇ４４）、８１％及び８４％（ＡＭ－ａｌａ４４）であり、ｉｎ ｖｉｖｏにおいても特にＡＭ－Ｄ－ａｒｇ４４やＡＭ－ａｌａ４４が分解抵抗性であることが示された。ｔＡＭ測定法とａＡＭ測定法を組み合わせることにより、ＡＭ類の分解をモニターリングすることができ、分解抵抗性のＡＭ類縁体をスクリーニングすることができることが分かった。

【0050】

【表2】

【0051】

【表3】

【0052】

実施例５：ＡＭ－ａｌａ４４投与時の濃度推移
実施例１の実験を代表しＡＭ－ａｌａ４４投与時の３個体の指定時間ごとのａＡＭ濃度（表４）とｔＡＭ濃度（表５）（ｐｍｏｌ／Ｌ）を示す。ａＡＭおよびｔＡＭいずれにおいても１５分後にラット３がラット１、２に比較し到達濃度が１．５倍の最高値を示している。一方、１２０分後では最高到達濃度を示したラット３が最低濃度を示している。本結果は個体によりＡＭ類縁体の代謝速度が個体間で差異があることを示しており、ＡＭ類縁体投与治療において投薬量による血液中の濃度管理が困難であり、血液中の濃度を測定することが必要であることを示している。

【0053】

【表4】

【0054】

【表5】

【0055】

実施例６：天然型ＡＭとＡＭ類縁体の等価測定検証実験
実施例１に示した５種類のＡＭ類縁体を、実施例１に使用したａＡＭ測定系、ならびにｔＡＭ測定系にて等価に測定できるか検証した。実施例１に示した５種類のＡＭ類縁体を同一濃度に調整し、ＡＭ１－５２を標準物質としたときの各ＡＭ類縁体の濃度を測定し、その測定値ならびに理論濃度に対する回収率を検証した。その結果、実施例１に使用したａＡＭ測定系（表６、７、図４）ならびにｔＡＭ測定系（表８、９、図５）が、天然型ＡＭとＡＭ類縁体を等価に測定可能であることが示された。

【0056】

【表6】

【0057】

【表7】

【0058】

【表8】

【0059】

【表9】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【配列表】

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