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特許7554469ジャガイモ病害ウイルスの存在の有無を識別する方法およびプライマーセット
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-09-11
(45)【発行日】2024-09-20
(54)【発明の名称】ジャガイモ病害ウイルスの存在の有無を識別する方法およびプライマーセット
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/686 20180101AFI20240912BHJP
C12Q 1/04 20060101ALI20240912BHJP
C12Q 1/6888 20180101ALI20240912BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20240912BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/686 Z
C12Q1/04 ZNA
C12Q1/6888 Z
C12N15/09 Z
【請求項の数】
8
(21)【出願番号】P 2020213212
(22)【出願日】2020-12-23
(65)【公開番号】P2022099443
(43)【公開日】2022-07-05
【審査請求日】2023-03-09
(73)【特許権者】
【識別番号】501203344
【氏名又は名称】国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構
(74)【代理人】
【識別番号】100161207
【弁理士】
【氏名又は名称】西澤 和純
(74)【代理人】
【識別番号】100188558
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100154852
【弁理士】
【氏名又は名称】酒井 太一
(72)【発明者】
【氏名】小野塚 信哉
(72)【発明者】
【氏名】大木 健広
【審査官】田中 晴絵
(56)【参考文献】
【文献】Arch Virol. ，158(2)，2013年，379-86
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｑ １／００－ ３／００
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記１）～４）のいずれか２以上のプライマーセットを使用して、マルチプレックスＰＣＲ法により、試料中のジャガイモ葉巻ウイルス（PLRV:potato leafroll virus）、ジャガイモＳウイルス（PVS:potato virus S）、ジャガイモＸウイルス（PVX:potato virus X）及びジャガイモＹウイルス(PVY：potato virus Y)からなる群から選ばれるいずれか２以上のウイルスの存在の有無を識別することを含み、前記２以上のプライマーセットが、２）と４）の一方又は両方のプライマーセットを含み、
下記１）～４）のプライマーセットを使用して増幅された各増幅産物のＴｍ値が互いに異なり、各増幅産物のＴｍ値の温度差が０．５℃以上である、方法：
１）PLRVの識別に用いられ、
配列番号１１に記載の塩基配列を３’末端に含み、１８～２５ヌクレオチドの長さのポリヌクレオチドと、
配列番号１２に記載の塩基配列を３’末端に含み、１８～２５ヌクレオチドの長さのポリヌクレオチドと、を備える、PLRV配列増幅用プライマーセット；
２）PVSの識別に用いられ、
配列番号１３に記載の塩基配列を３’末端に含み、２１～２５ヌクレオチドの長さのポリヌクレオチドと、
配列番号１４に記載の塩基配列を３’末端に含み、２０～２５ヌクレオチドの長さのポリヌクレオチドと、を備える、PVS配列増幅用プライマーセット；
３）PVXの識別に用いられ、
配列番号１５に記載の塩基配列を３’末端に含み、２１～２５ヌクレオチドの長さのポリヌクレオチドと、
配列番号１６に記載の塩基配列を３’末端に含み、１８～２５ヌクレオチドの長さのポリヌクレオチドと、を備える、PVX配列増幅用プライマーセット；
４）PVYの識別に用いられ、
配列番号１７に記載の塩基配列を３’末端に含み、１８～２５ヌクレオチドの長さのポリヌクレオチドと、
配列番号１８に記載の塩基配列を３’末端に含み、１８～２５ヌクレオチドの長さのポリヌクレオチドと、を備える、PVY配列増幅用プライマーセット。
【請求項2】
前記１）～４）の前記プライマーセットを使用して、マルチプレックスＰＣＲ法により、ジャガイモ葉巻ウイルス（PLRV:potato leafroll virus）、ジャガイモＳウイルス（PVS:potato virus S）、ジャガイモＸウイルス（PVX:potato virus X）及びジャガイモＹウイルス(PVY：potato virus Y)の存在の有無を識別することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
インターカレート色素の存在下で、前記マルチプレックスＰＣＲ法を実施する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記ウイルスのＲＮＡに対する逆転写反応に用いられる逆転写酵素、及び前記マルチプレックスＰＣＲに用いられる２以上のプライマーセットを含む反応系において、前記逆転写反応及び前記マルチプレックスＰＣＲ法を連続して実施する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
請求項１～４のいずれか一項に記載の方法に用いるためのPLRV配列増幅用プライマーセットであって、配列番号１１に記載の塩基配列を３’末端に含み、１８～２５ヌクレオチドの長さのポリヌクレオチドと、
配列番号１２に記載の塩基配列を３’末端に含み、１８～２５ヌクレオチドの長さのポリヌクレオチドと、を備える、PLRV配列増幅用プライマーセット。
【請求項6】
請求項１～４のいずれか一項に記載の方法に用いるためのPVS配列増幅用プライマーセットであって、配列番号１３に記載の塩基配列を３’末端に含み、２１～２５ヌクレオチドの長さのポリヌクレオチドと、
配列番号１４に記載の塩基配列を３’末端に含み、２０～２５ヌクレオチドの長さのポリヌクレオチドと、を備える、PVS配列増幅用プライマーセット。
【請求項7】
請求項１～４のいずれか一項に記載の方法に用いるためのPVX配列増幅用プライマーセットであって、配列番号１５に記載の塩基配列を３’末端に含み、２１～２５ヌクレオチドの長さのポリヌクレオチドと、
配列番号１６に記載の塩基配列を３’末端に含み、１８～２５ヌクレオチドの長さのポリヌクレオチドと、を備える、PVX配列増幅用プライマーセット。
【請求項8】
請求項１～４のいずれか一項に記載の方法に用いるためのPVY配列増幅用プライマーセットであって、配列番号１７に記載の塩基配列を３’末端に含み、１８～２５ヌクレオチドの長さのポリヌクレオチドと、
配列番号１８に記載の塩基配列を３’末端に含み、１８～２５ヌクレオチドの長さのポリヌクレオチドと、を備える、PVY配列増幅用プライマーセット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ジャガイモ病害ウイルスの存在の有無を識別する方法およびプライマーセットに関する。
【背景技術】
【0002】
ジャガイモ葉巻ウイルス（ＰＬＲＶ）、ジャガイモＳウイルス（ＰＶＳ）、ジャガイモＸウイルス（ＰＶＸ）およびジャガイモＹウイルス（ＰＶＹ）の４種類のジャガイモ病害ウイルスは、世界的に分布し、ジャガイモの収量及び品質を低下させる重要病原である。多くの国々では、これらのウイルス病を防ぐため、ウイルスフリーの種イモ（塊茎）を選別する種ばれいしょ検疫が行われている。日本国内では、上記の４種類のウイルスについて、特に注力して検疫が行われている。
【0003】
日本国内では、年間８万検体を超える種ばれいしょ検疫が行われており、検疫の省力化が求められている。
現行の種ばれいしょ検疫は、ELISA法（Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay）による免疫学的測定により実施されている。しかし、ELISA法では、ウイルスの種類ごとに個別にアッセイを行う必要があり、検査対象のウイルスの種類を増やすことでさらに検査数が増加してしまう。
現行の種ばれいしょ検疫は、ELISA法（Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay）による免疫学的測定により実施されている。しかし、ELISA法では、ウイルスの種類ごとに個別にアッセイを行う必要があり、検査対象のウイルスの種類を増やすことでさらに検査数が増加してしまう。
【0004】
これまで、本発明者らは、ELISA法に代えてマルチプレックスPCR法を採用することで、複数種類のウイルスを同時に検査可能な技術を開発してきた（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【文献】“Detection of four major potato viruses in Japan using a simple RNA preparation and one-step multiplex RT-PCR”,Onozuka et al., Journal of General Plant Pathology 86:290-299 (2020).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
しかし、上記非特許文献１の技術では、増幅産物長の解析に電気泳動が用いられており、検査のさらなる省力化については、未だ検討の余地がある。
【0007】
本発明は、上記のような問題点を解消するためになされたものであり、ジャガイモ病害ウイルスの存在の有無を効率的に識別可能な方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、マルチプレックスＰＣＲ法を用い、複数種類のウイルスの存在の有無を効率的に識別可能とする特定のプライマーセットを見出だし、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の態様を有する。
すなわち、本発明は以下の態様を有する。
【0009】
（１）下記１）～４）のいずれか２以上のプライマーセットを使用して、マルチプレックスＰＣＲ法により、試料中のジャガイモ葉巻ウイルス（PLRV:potato leafroll virus）、ジャガイモＳウイルス（PVS:potato virus S）、ジャガイモＸウイルス（PVX:potato virus X）及びジャガイモＹウイルス(PVY：potato virus Y)からなる群から選ばれるいずれか２以上のウイルスの存在の有無を識別することを含む、方法：
１）PLRVの識別に用いられ、
配列番号１に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチド、又は
配列番号１に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチドと、
配列番号２に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチド、又は
配列番号２に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチドと、を備える、PLRV配列増幅用プライマーセット；
２）PVSの識別に用いられ、
配列番号３に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチド、又は
配列番号３に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチドと、
配列番号４に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチド、又は
配列番号４に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチドと、を備える、PVS配列増幅用プライマーセット；
３）PVXの識別に用いられ、
配列番号５に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチド、又は
配列番号５に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチドと、
配列番号６に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチド、又は
配列番号６に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチドと、を備える、PVX配列増幅用プライマーセット；
４）PVYの識別に用いられ、
配列番号７に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチド、又は
配列番号７に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチドと、
配列番号８に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチド、又は
配列番号８に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチドと、を備える、PVY配列増幅用プライマーセット。
（２）前記１）～４）の前記プライマーセットを使用して、マルチプレックスＰＣＲ法により、ジャガイモ葉巻ウイルス（PLRV:potato leafroll virus）、ジャガイモＳウイルス（PVS:potato virus S）、ジャガイモＸウイルス（PVX:potato virus X）及びジャガイモＹウイルス(PVY：potato virus Y)の存在の有無を識別することを含む、前記（１）に記載の方法。
（３）インターカレート色素の存在下で、前記マルチプレックスＰＣＲ法を実施する前記（１）又は（２）に記載の方法。
（４）前記１）～４）の前記プライマーセットを使用して増幅された各増幅産物のＴｍ値が互いに異なり、各増幅産物のＴｍ値の温度差が０．５℃以上である、前記（１）～（３）のいずれか一つに記載の方法。
（５）前記ウイルスのＲＮＡに対する逆転写反応に用いられる逆転写酵素、及び前記マルチプレックスＰＣＲに用いられる２以上のプライマーセットを含む反応系において、前記逆転写反応及び前記マルチプレックスＰＣＲ法を連続して実施する、前記（１）～（４）のいずれか一つに記載の方法。
（６）前記（１）～（５）のいずれか一つに記載の方法において、
１）PLRVの識別に用いられ、
配列番号１に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチド、又は
配列番号１に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチドと、
配列番号２に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチド、又は
配列番号２に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチドと、を備える、PLRV配列増幅用プライマーセット。
（７）前記（１）～（５）のいずれか一つに記載の方法において、
２）PVSの識別に用いられ、
配列番号３に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチド、又は
配列番号３に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチドと、
配列番号４に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチド、又は
配列番号４に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチドと、を備える、PVS配列増幅用プライマーセット。
（８）前記（１）～（５）のいずれか一つに記載の方法において、
３）PVXの識別に用いられ、
配列番号５に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチド、又は
配列番号５に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチドと、
配列番号６に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチド、又は
配列番号６に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチドと、を備える、PVX配列増幅用プライマーセット。
（９）前記（１）～（５）のいずれか一つに記載の方法において、
４）PVYの識別に用いられ、
配列番号７に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチド、又は
配列番号７に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチドと、
配列番号８に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチド、又は
配列番号８に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチドと、を備える、PVY配列増幅用プライマーセット。
１）PLRVの識別に用いられ、
配列番号１に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチド、又は
配列番号１に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチドと、
配列番号２に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチド、又は
配列番号２に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチドと、を備える、PLRV配列増幅用プライマーセット；
２）PVSの識別に用いられ、
配列番号３に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチド、又は
配列番号３に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチドと、
配列番号４に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチド、又は
配列番号４に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチドと、を備える、PVS配列増幅用プライマーセット；
３）PVXの識別に用いられ、
配列番号５に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチド、又は
配列番号５に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチドと、
配列番号６に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチド、又は
配列番号６に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチドと、を備える、PVX配列増幅用プライマーセット；
４）PVYの識別に用いられ、
配列番号７に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチド、又は
配列番号７に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチドと、
配列番号８に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチド、又は
配列番号８に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチドと、を備える、PVY配列増幅用プライマーセット。
（２）前記１）～４）の前記プライマーセットを使用して、マルチプレックスＰＣＲ法により、ジャガイモ葉巻ウイルス（PLRV:potato leafroll virus）、ジャガイモＳウイルス（PVS:potato virus S）、ジャガイモＸウイルス（PVX:potato virus X）及びジャガイモＹウイルス(PVY：potato virus Y)の存在の有無を識別することを含む、前記（１）に記載の方法。
（３）インターカレート色素の存在下で、前記マルチプレックスＰＣＲ法を実施する前記（１）又は（２）に記載の方法。
（４）前記１）～４）の前記プライマーセットを使用して増幅された各増幅産物のＴｍ値が互いに異なり、各増幅産物のＴｍ値の温度差が０．５℃以上である、前記（１）～（３）のいずれか一つに記載の方法。
（５）前記ウイルスのＲＮＡに対する逆転写反応に用いられる逆転写酵素、及び前記マルチプレックスＰＣＲに用いられる２以上のプライマーセットを含む反応系において、前記逆転写反応及び前記マルチプレックスＰＣＲ法を連続して実施する、前記（１）～（４）のいずれか一つに記載の方法。
（６）前記（１）～（５）のいずれか一つに記載の方法において、
１）PLRVの識別に用いられ、
配列番号１に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチド、又は
配列番号１に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチドと、
配列番号２に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチド、又は
配列番号２に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチドと、を備える、PLRV配列増幅用プライマーセット。
（７）前記（１）～（５）のいずれか一つに記載の方法において、
２）PVSの識別に用いられ、
配列番号３に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチド、又は
配列番号３に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチドと、
配列番号４に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチド、又は
配列番号４に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチドと、を備える、PVS配列増幅用プライマーセット。
（８）前記（１）～（５）のいずれか一つに記載の方法において、
３）PVXの識別に用いられ、
配列番号５に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチド、又は
配列番号５に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチドと、
配列番号６に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチド、又は
配列番号６に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチドと、を備える、PVX配列増幅用プライマーセット。
（９）前記（１）～（５）のいずれか一つに記載の方法において、
４）PVYの識別に用いられ、
配列番号７に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチド、又は
配列番号７に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチドと、
配列番号８に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチド、又は
配列番号８に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチドと、を備える、PVY配列増幅用プライマーセット。
【発明の効果】
【0010】
本発明によれば、ジャガイモ病害ウイルスの存在の有無を効率的に識別可能な方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】実施例において取得された増幅産物の融解曲線を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0012】
以下、本発明の方法、及びプライマーセットの実施形態を説明する。
【0013】
≪方法≫
実施形態の方法は、下記１）～４）のいずれか２以上のプライマーセットを使用して、マルチプレックスＰＣＲ法により、試料中のジャガイモ葉巻ウイルス（PLRV:potato leafroll virus）、ジャガイモＳウイルス（PVS:potato virus S）、ジャガイモＸウイルス（PVX:potato virus X）及びジャガイモＹウイルス(PVY：potato virus Y)からなる群から選ばれるいずれか２以上のウイルスの存在の有無を識別することを含む、方法である。
実施形態の方法は、下記１）～４）のいずれか２以上のプライマーセットを使用して、マルチプレックスＰＣＲ法により、試料中のジャガイモ葉巻ウイルス（PLRV:potato leafroll virus）、ジャガイモＳウイルス（PVS:potato virus S）、ジャガイモＸウイルス（PVX:potato virus X）及びジャガイモＹウイルス(PVY：potato virus Y)からなる群から選ばれるいずれか２以上のウイルスの存在の有無を識別することを含む、方法である。
【0014】
１）PLRVの識別に用いられ、
配列番号１に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端としてを含むポリヌクレオチド、又は
配列番号１に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端としてを含むポリヌクレオチドと、
配列番号２に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端としてを含むポリヌクレオチド、又は
配列番号２に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端としてを含むポリヌクレオチドと、を備える、PLRV配列増幅用プライマーセット。
配列番号１に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端としてを含むポリヌクレオチド、又は
配列番号１に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端としてを含むポリヌクレオチドと、
配列番号２に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端としてを含むポリヌクレオチド、又は
配列番号２に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端としてを含むポリヌクレオチドと、を備える、PLRV配列増幅用プライマーセット。
【0015】
２）PVSの識別に用いられ、
配列番号３に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端としてを含むポリヌクレオチド、又は
配列番号３に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端としてを含むポリヌクレオチドと、
配列番号４に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチド、又は
配列番号４に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端としてを含むポリヌクレオチドと、を備える、PVS配列増幅用プライマーセット。
配列番号３に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端としてを含むポリヌクレオチド、又は
配列番号３に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端としてを含むポリヌクレオチドと、
配列番号４に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチド、又は
配列番号４に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端としてを含むポリヌクレオチドと、を備える、PVS配列増幅用プライマーセット。
【0016】
３）PVXの識別に用いられ、
配列番号５に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端としてを含むポリヌクレオチド、又は
配列番号５に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端としてを含むポリヌクレオチドと、
配列番号６に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端としてを含むポリヌクレオチド、又は
配列番号６に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端としてを含むポリヌクレオチドと、を備える、PVX配列増幅用プライマーセット。
配列番号５に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端としてを含むポリヌクレオチド、又は
配列番号５に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端としてを含むポリヌクレオチドと、
配列番号６に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端としてを含むポリヌクレオチド、又は
配列番号６に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端としてを含むポリヌクレオチドと、を備える、PVX配列増幅用プライマーセット。
【0017】
４）PVYの識別に用いられ、
配列番号７に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端としてを含むポリヌクレオチド、又は
配列番号７に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端としてを含むポリヌクレオチドと、
配列番号８に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端としてを含むポリヌクレオチド、又は
配列番号８に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端としてを含むポリヌクレオチドと、を備える、PVY配列増幅用プライマーセット。
配列番号７に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端としてを含むポリヌクレオチド、又は
配列番号７に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端としてを含むポリヌクレオチドと、
配列番号８に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端としてを含むポリヌクレオチド、又は
配列番号８に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端としてを含むポリヌクレオチドと、を備える、PVY配列増幅用プライマーセット。
【0018】
本実施形態に係る上記１）～４）の４つの各プライマーセットは、各プライマーセットを用いた増幅反応により、各ウイルスゲノムに対応する領域を増幅可能なよう設計されている。該当の領域の核酸を含み得る試料に対して、上記のプライマーセットを用いて増幅反応を行い、増幅産物が得られた場合には、試料に該当のウイルスが存在すると判定できる。
【0019】
上記の各プライマーセットの詳細については後述する。後述する実施形態のプライマーセットは、実施形態の方法に使用することができる。
【0020】
上記のＰＣＲ反応は、ＰＣＲ法の検査対象の試料に含まれ得る核酸を鋳型とすることができる。ウイルスの存在が“有”と識別されることは、ＰＣＲ法の検査対象の試料においてウイルスに由来する核酸が検出されたことと同義である。
【0021】
実施形態の方法において、該当のウイルスに由来する核酸を含み得る試料としては、ウイルスの存在が疑われる植物体又はその抽出物、加工品等が挙げられる。
【0022】
試料の対象となる植物種としては、ジャガイモ（Solanum tuberosum）が好適である。その他、上記のウイルスの感染が認められる場合、トマト（Solanum lycopersicum）などのSolanum属植物や、タバコ（Nicotiana tabacum）などのNicotiana属植物等であってもよい。
【0023】
植物体としては、ウイルスが存在し得る植物体の一部分であってよく、ジャガイモの場合であれば、芽、茎、葉、根、ストロン等を例示できる。種ばれいしょ検疫では、収穫した塊茎から育てた植物（次世代）を検査することが行われており、収穫した塊茎から育てた植物の葉が好適である。本実施形態の方法は、種ばれいしょ検疫に、好適に適用可能である。
【0024】
ＰＬＲＶ、ＰＶＳ、ＰＶＸ、及びＰＶＹはＲＮＡウイルスであり、ウイルスに由来する核酸はＲＮＡである。植物体からのＲＮＡの抽出は公知の手法により実施することができる。
【0025】
実施形態の方法は、植物体からＲＮＡを抽出する操作を行う工程を含むことができる。
抽出されたＲＮＡからは、公知の逆転写反応を利用してＤＮＡを得ることができる。ウイルスに由来するＲＮＡを逆転写して得られたＤＮＡをウイルスに由来する核酸として、ＰＣＲ反応の鋳型として用いることができる。逆転写反応には、ランダムプライマー又はリバースプライマーを用いることができる。
抽出されたＲＮＡからは、公知の逆転写反応を利用してＤＮＡを得ることができる。ウイルスに由来するＲＮＡを逆転写して得られたＤＮＡをウイルスに由来する核酸として、ＰＣＲ反応の鋳型として用いることができる。逆転写反応には、ランダムプライマー又はリバースプライマーを用いることができる。
【0026】
実施形態の方法の一例として、試料に対して、上記１）～４）のいずれか２以上のプライマーセットを使用して、マルチプレックスＰＣＲ法を実施する工程と、
PLRV配列増幅用プライマーセットを用いた増幅反応で、PLRVに由来する増幅産物の増幅が認められた場合には前記試料にPLRVが存在する、又は、PLRVに由来する増幅産物の増幅が認められなかった場合には前記試料にPLRVが存在しないと判定する、
PVS配列増幅用プライマーセットを用いた増幅反応で、PVSに由来する増幅産物の増幅が認められた場合には前記試料にPVSが存在する、又は、PVSに由来する増幅産物の増幅が認められなかった場合には前記試料にPVSが存在しないと判定する、
PVX配列増幅用プライマーセットを用いた増幅反応で、PVXに由来する増幅産物の増幅が認められた場合には前記試料にPVXが存在する、又は、PVXに由来する増幅産物の増幅が認められなかった場合には前記試料にPVXが存在しないと判定する、及び
PVY配列増幅用プライマーセットを用いた増幅反応で、PVYに由来する増幅産物の増幅が認められた場合には前記試料にPVYが存在する、又は、PVYに由来する増幅産物の増幅が認められなかった場合には前記試料にPVYが存在しないと判定する、ことからなる群から選ばれるいずれか２以上の判定を行う工程と、を含む方法を例示できる。
PLRV配列増幅用プライマーセットを用いた増幅反応で、PLRVに由来する増幅産物の増幅が認められた場合には前記試料にPLRVが存在する、又は、PLRVに由来する増幅産物の増幅が認められなかった場合には前記試料にPLRVが存在しないと判定する、
PVS配列増幅用プライマーセットを用いた増幅反応で、PVSに由来する増幅産物の増幅が認められた場合には前記試料にPVSが存在する、又は、PVSに由来する増幅産物の増幅が認められなかった場合には前記試料にPVSが存在しないと判定する、
PVX配列増幅用プライマーセットを用いた増幅反応で、PVXに由来する増幅産物の増幅が認められた場合には前記試料にPVXが存在する、又は、PVXに由来する増幅産物の増幅が認められなかった場合には前記試料にPVXが存在しないと判定する、及び
PVY配列増幅用プライマーセットを用いた増幅反応で、PVYに由来する増幅産物の増幅が認められた場合には前記試料にPVYが存在する、又は、PVYに由来する増幅産物の増幅が認められなかった場合には前記試料にPVYが存在しないと判定する、ことからなる群から選ばれるいずれか２以上の判定を行う工程と、を含む方法を例示できる。
【0027】
なお、上記の１）～４）の各プライマーセットは、上記の４種類のジャガイモ病害ウイルスゲノムの外被タンパク質(CP:coat protein）遺伝子の領域に設計されている。外被タンパク質遺伝子の配列は保存性が高く、個別にウイルス変異が生じたとしても、安定的に解析が可能である。
【0028】
ここで、本実施形態の方法は、前記１）～４）のいずれか２以上のプライマーセットを使用したマルチプレックスＰＣＲ法を採用する。マルチプレックスＰＣＲ法とは、１つの反応系に２以上のプライマーセットが含まれていることを意味する。即ち、実施形態の方法では、上記の４種類のジャガイモ病害ウイルスのうち、２種類以上の上記ウイルスに由来する増幅産物を同一の反応系において同時に増幅でき、２種類以上のウイルスを一度に検出することが可能である。
【0029】
上記反応系とは、例えば１つの反応容器に含まれるＰＣＲ反応液を例示でき、例えば、１つの反応チューブに収められたＰＣＲ反応液や、反応プレートの１つのウェルに収められたＰＣＲ反応液であってよい。
上記反応液には、前記１）～４）のいずれか２以上のプライマーセットの他に、ＰＣＲ反応に必要な種々の試薬類を含むことができる。試薬類としては、テンプレートの核酸を含み得る検査対象の試料、ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチド、Mg2+イオン、バッファー、塩類等が挙げられる。また、反応液は、後述するインターカレート色素やＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ等の検出試薬を含むことができる。
上記反応液には、前記１）～４）のいずれか２以上のプライマーセットの他に、ＰＣＲ反応に必要な種々の試薬類を含むことができる。試薬類としては、テンプレートの核酸を含み得る検査対象の試料、ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチド、Mg2+イオン、バッファー、塩類等が挙げられる。また、反応液は、後述するインターカレート色素やＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ等の検出試薬を含むことができる。
【0030】
上記の非特許文献１の手法では、増幅産物長に基づき増幅産物を特定するため、ＰＣＲ反応で得られた増幅産物を電気泳動によって分離する方法が用いられている。
一方、本実施形態の手法によれば、電気泳動に代えてＰＣＲ反応で得られる増幅産物を、例えばＰＣＲ装置を用いて増幅過程において検出することが可能である。ＰＣＲ装置を用いた場合には、増幅産物の量をリアルタイムで検出できるので、当該方法は、リアルタイムＰＣＲ法と称される。
一方、本実施形態の手法によれば、電気泳動に代えてＰＣＲ反応で得られる増幅産物を、例えばＰＣＲ装置を用いて増幅過程において検出することが可能である。ＰＣＲ装置を用いた場合には、増幅産物の量をリアルタイムで検出できるので、当該方法は、リアルタイムＰＣＲ法と称される。
【0031】
リアルタイムＰＣＲ法において、増幅効率を向上させる観点から、該ＰＣＲ反応で得られる各増幅産物のポリヌクレオチドの長さは、５０～４００ｂｐが好ましく、７０～２５０ｂｐがより好ましく、９０～２００ｂｐがさらに好ましい。
【0032】
実施形態の方法は、インターカレート色素の存在下で、前記マルチプレックスＰＣＲ法を実施することが好ましい。
【0033】
インターカレート色素を使用したＰＣＲ反応は、インターカレーター法と称される。
インターカレーター法では、色素が増幅産物の二本鎖核酸にインターカレーションすることにより発せられたシグナルを測定することで、増幅産物を検出可能である。
インターカレーター法では、色素が増幅産物の二本鎖核酸にインターカレーションすることにより発せられたシグナルを測定することで、増幅産物を検出可能である。
【0034】
インターカレート色素は、二本鎖核酸へのインターカレーションが可能で、インターカレーションによりシグナルが生じる又は増強される色素である。インターカレート色素としては、二本鎖核酸へのインターカレーションにより蛍光が発せられるインターカレート蛍光色素が好ましい。
インターカレート蛍光色素としては、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ、ＥｖａＧｒｅｅｎ（登録商標）Ｄｙｅ、ＴＢＧｒｅｅｎ（登録商標）等が挙げられる。
インターカレート蛍光色素としては、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ、ＥｖａＧｒｅｅｎ（登録商標）Ｄｙｅ、ＴＢＧｒｅｅｎ（登録商標）等が挙げられる。
【0035】
インターカレーター法において、ＰＣＲ反応で目的の増幅産物が得られたことは、増幅産物のＴｍ値（melting temperature：融解温度）を解析することで特定できる。Ｔｍ値は、増幅産物の長さや増幅産物に含まれる塩基の種類によって、増幅産物ごとに異なった値を示す。そのため、実際のＰＣＲ反応で得られた増幅産物のＴｍ値を測定し、推定又は予め測定されたリファレンスの増幅産物のＴｍ値と照らし合わせ、目的の増幅産物が得られているかを検証できる。リファレンスの増幅産物については、配列情報を予め解読して、該当のプライマーセットを用いて目的の増幅産物が得られるかどうかを確認することができる。
【0036】
したがって、実施形態の方法は、上記１）～４）のいずれか２以上のプライマーセットを使用して、マルチプレックスＰＣＲ法を実施する工程の後に、該工程で得られた増幅産物のＴｍ値を取得し、前記Ｔｍ値に基づき、前記増幅産物がＰＬＲＶ、ＰＶＳ、ＰＶＸ、又はＰＶＹのいずれに由来する増幅産物であるかを特定する工程、を含むことができる。
【0037】
増幅産物のＴｍ値は、ＰＣＲ反応後に、ＰＣＲ装置を使用して融解曲線解析を行うことにより測定できる。
【0038】
本実施形態の方法において、上記の１）～４）の前記プライマーセットを使用して得られる各増幅産物のＴｍ値は、互いに異なっている。
例えば、後述の実施例の表１に示される増幅産物の、同時検出時のＴｍ値（測定値）を温度の低い順から挙げると、
PVY配列増幅用プライマーセットを用いて増幅された増幅産物のＴｍ値の一例は79.8±0.1℃であり、
PVS配列増幅用プライマーセットを用いて増幅された増幅産物のＴｍ値の一例は81.3±0.1℃であり、
PVX配列増幅用プライマーセットを用いて増幅された増幅産物のＴｍ値の一例は85.3±0.2℃であり、
PLRV配列増幅用プライマーセットを用いて増幅された増幅産物のＴｍ値の一例は88.0±0.1℃である。
このように、本実施形態の前記１）～４）のいずれか２以上のプライマーセットによれば、各増幅産物のＴｍ値が互いに異なっている。そのため、目的の増幅産物を、Ｔｍ値に基づき明確に区別可能である。
例えば、後述の実施例の表１に示される増幅産物の、同時検出時のＴｍ値（測定値）を温度の低い順から挙げると、
PVY配列増幅用プライマーセットを用いて増幅された増幅産物のＴｍ値の一例は79.8±0.1℃であり、
PVS配列増幅用プライマーセットを用いて増幅された増幅産物のＴｍ値の一例は81.3±0.1℃であり、
PVX配列増幅用プライマーセットを用いて増幅された増幅産物のＴｍ値の一例は85.3±0.2℃であり、
PLRV配列増幅用プライマーセットを用いて増幅された増幅産物のＴｍ値の一例は88.0±0.1℃である。
このように、本実施形態の前記１）～４）のいずれか２以上のプライマーセットによれば、各増幅産物のＴｍ値が互いに異なっている。そのため、目的の増幅産物を、Ｔｍ値に基づき明確に区別可能である。
【0039】
Ｔｍ値に基づき、増幅産物を明確に区別可能な程度の指標の一例としては、前記１）～４）の前記プライマーセットの全てを使用したマルチプレックスＰＣＲにて増幅された各増幅産物のＴｍ値が互いに異なり、１反応あたりの各増幅産物のＴｍ値の温度差が０．５℃以上であることが好ましく、１℃以上であることがより好ましく、１．３℃以上であることがさらに好ましく、１．５℃以上であることが特に好ましい。
前記Ｔｍ値の温度差の上限値は特に制限されるものではないが、前記１）～４）の前記プライマーセットの全てを使用して増幅された各増幅産物の温度差の上限値は、一例として１０℃以下であってよく、７℃以下であってよく、５℃以下であってよく、３℃以下であってよい。
前記Ｔｍ値の温度差の数値範囲の一例としては、０．５℃以上１０℃以下であってよく、１℃以上７℃以下であってよく、１．３℃以上５℃以下であってよく、１．５℃以上３℃以下であってよい。
前記Ｔｍ値の温度差の上限値は特に制限されるものではないが、前記１）～４）の前記プライマーセットの全てを使用して増幅された各増幅産物の温度差の上限値は、一例として１０℃以下であってよく、７℃以下であってよく、５℃以下であってよく、３℃以下であってよい。
前記Ｔｍ値の温度差の数値範囲の一例としては、０．５℃以上１０℃以下であってよく、１℃以上７℃以下であってよく、１．３℃以上５℃以下であってよく、１．５℃以上３℃以下であってよい。
【0040】
上記の各増幅産物のＴｍ値の温度差は、前記１）～４）の前記プライマーセットの全てを使用したマルチプレックスＰＣＲにて増幅された、上記の４種類のウイルスに由来する増幅産物のうち、Ｔｍ値の一番近い増幅産物同士を比較するものとする。増幅産物のＴｍ値は、増幅産物の融解曲線のピーク値を採用することができる。
【0041】
実施形態の方法は、上記の１）～４）の前記プライマーセットの他に、さらに別の任意のプライマーセットを含んでもよい。
例えば、逆転写反応及びＰＣＲ反応が適切に行われているかどうかを検証する観点から、ジャガイモで発現するジャガイモの遺伝子を標的とした核酸増幅が可能なプライマーセットを使用して測定されたジャガイモの遺伝子の発現を内部標準としてもよい。当該遺伝子としては、ジャガイモにおける安定的な発現が認められることから、例えば、ジャガイモの伸長因子-1 アルファ(EF1α：elongation factor 1 alpha)遺伝子が挙げられる。
例えば、逆転写反応及びＰＣＲ反応が適切に行われているかどうかを検証する観点から、ジャガイモで発現するジャガイモの遺伝子を標的とした核酸増幅が可能なプライマーセットを使用して測定されたジャガイモの遺伝子の発現を内部標準としてもよい。当該遺伝子としては、ジャガイモにおける安定的な発現が認められることから、例えば、ジャガイモの伸長因子-1 アルファ(EF1α：elongation factor 1 alpha)遺伝子が挙げられる。
【0042】
かかるプライマーセットとして、以下を例示する。
５）EF1αの検出に用いられ、
配列番号９に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチド、又は
配列番号９に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチドと、
配列番号１０に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチド、又は
配列番号１０に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチドと、を備える、EF1α配列増幅用プライマーセット。
５）EF1αの検出に用いられ、
配列番号９に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチド、又は
配列番号９に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチドと、
配列番号１０に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチド、又は
配列番号１０に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチドと、を備える、EF1α配列増幅用プライマーセット。
【0043】
上記プライマーセットは、以下を包含する。
５’）EF1αの検出に用いられ、
配列番号１９に記載の塩基配列を３’末端側に含むポリヌクレオチド、又は
配列番号１９に記載の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を３’末端側に含むポリヌクレオチドと、
配列番号２０に記載の塩基配列３’末端側に含むポリヌクレオチド、又は
配列番号２０に記載の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を３’末端側に含むポリヌクレオチドと、を備える、EF1α配列増幅用プライマーセット。
５’）EF1αの検出に用いられ、
配列番号１９に記載の塩基配列を３’末端側に含むポリヌクレオチド、又は
配列番号１９に記載の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を３’末端側に含むポリヌクレオチドと、
配列番号２０に記載の塩基配列３’末端側に含むポリヌクレオチド、又は
配列番号２０に記載の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を３’末端側に含むポリヌクレオチドと、を備える、EF1α配列増幅用プライマーセット。
【0044】
上記のEF1α配列増幅用プライマーセットを用いて増幅された増幅産物のＴｍ値（測定値）の一例は75.7±0.1℃である。この温度は上記の１）～４）の前記プライマーセットを用いて増幅された増幅産物のＴｍ値のいずれとも重複しないため、実施形態の方法に好適に利用可能である。
【0045】
ジャガイモ遺伝子の内部標準の増幅産物の量は、ウイルス検出の閾値とすることができる。例えば、EF1α配列増幅用プライマーセットにより増幅された増幅産物の量を、ウイルス検出の閾値とすることができる。
一例として、インターカレーター法で得られ、EF1α配列増幅用プライマーセットにより増幅された増幅産物の量を示す蛍光強度を基準として、上記の１）～４）の前記プライマーセットにより増幅された増幅産物が、この閾値を超える値を示した場合、目的の増幅産物の増幅が認められるものと判断できる。
一例として、インターカレーター法で得られ、EF1α配列増幅用プライマーセットにより増幅された増幅産物の量を示す蛍光強度を基準として、上記の１）～４）の前記プライマーセットにより増幅された増幅産物が、この閾値を超える値を示した場合、目的の増幅産物の増幅が認められるものと判断できる。
【0046】
前記２以上のプライマーセットとは、前記１）～４）のいずれか３以上のプライマーセットであってもよく、前記１）～４）の４つ全てのプライマーセットであってもよい。
２以上のプライマーセットの組み合わせは任意であり、少なくともPLRV配列増幅用プライマーセットを含む組み合わせ、少なくともPVS配列増幅用プライマーセットを含む組み合わせ、少なくともPVX配列増幅用プライマーセットを含む組み合わせ、少なくともPVY配列増幅用プライマーセットを含む組み合わせを例示できる。また例えば、上記のPLRV配列増幅用プライマーセット及びPVS配列増幅用プライマーセットを含む組み合わせや、PVS配列増幅用プライマーセット及びPVY配列増幅用プライマーセットを含む組み合わせ、PVS配列増幅用プライマーセット及びPVX配列増幅用プライマーセットを含む組み合わせ等を例示できる。
２以上のプライマーセットの組み合わせは任意であり、少なくともPLRV配列増幅用プライマーセットを含む組み合わせ、少なくともPVS配列増幅用プライマーセットを含む組み合わせ、少なくともPVX配列増幅用プライマーセットを含む組み合わせ、少なくともPVY配列増幅用プライマーセットを含む組み合わせを例示できる。また例えば、上記のPLRV配列増幅用プライマーセット及びPVS配列増幅用プライマーセットを含む組み合わせや、PVS配列増幅用プライマーセット及びPVY配列増幅用プライマーセットを含む組み合わせ、PVS配列増幅用プライマーセット及びPVX配列増幅用プライマーセットを含む組み合わせ等を例示できる。
【0047】
前記プライマーセットの組み合わせにおいては、上記のPVS配列増幅用プライマーセット及び／又はPVY配列増幅用プライマーセットを含むことが好ましい。
PVSには、普通系統（PVSO:Ordinary lineage）、アンデス系統（PVSA:Andean lineage）およびフレーヤ系統（PVSP:Phureja lineage）が存在することが知られている(既報：Vallejo D, Gutierrez P, Marin M (2016) Genome characterization of a potato virus S (PVS) variant from tuber sprouts of Solanum phureja Juz. et Buk. Agron Colomb 34:51-60)。
PVYには、C系統（PVYC:C strain）、O系統（PVYO: O strain）、Eu-N系統(PVYEu-N:Eu-N-strain)、NA-N系統（PVYNA-N：NA-N strain）およびE系統(PVYE:E strain)、ならびに、これらの５つの系統間における組換え体などが存在する。組換え体とは、PVYEu-NとPVYOの組換え体であるNTN系統（PVYNTN:NTN strain）やWilga系統（PVYN-Wi:N-Wi strain）等である。（既報：Green KJ, Brown CJ, Gray SM, Karaseva AV (2017) Phylogenetic study of recombinant strains of potato virus Y. Virology 507:40-50）。
特にＰＶＳは、系統間で配列が大きく異なっており、上記３系統に対応可能なプライマーセットを構築することは容易ではない。
従来のプライマーセットでは、上記の系統を検出することは困難であったが、実施形態に係るプライマーセットによれば、例えば後述の実施例の表１に示すように、これらの系統を容易に検出可能である。
PVSには、普通系統（PVSO:Ordinary lineage）、アンデス系統（PVSA:Andean lineage）およびフレーヤ系統（PVSP:Phureja lineage）が存在することが知られている(既報：Vallejo D, Gutierrez P, Marin M (2016) Genome characterization of a potato virus S (PVS) variant from tuber sprouts of Solanum phureja Juz. et Buk. Agron Colomb 34:51-60)。
PVYには、C系統（PVYC:C strain）、O系統（PVYO: O strain）、Eu-N系統(PVYEu-N:Eu-N-strain)、NA-N系統（PVYNA-N：NA-N strain）およびE系統(PVYE:E strain)、ならびに、これらの５つの系統間における組換え体などが存在する。組換え体とは、PVYEu-NとPVYOの組換え体であるNTN系統（PVYNTN:NTN strain）やWilga系統（PVYN-Wi:N-Wi strain）等である。（既報：Green KJ, Brown CJ, Gray SM, Karaseva AV (2017) Phylogenetic study of recombinant strains of potato virus Y. Virology 507:40-50）。
特にＰＶＳは、系統間で配列が大きく異なっており、上記３系統に対応可能なプライマーセットを構築することは容易ではない。
従来のプライマーセットでは、上記の系統を検出することは困難であったが、実施形態に係るプライマーセットによれば、例えば後述の実施例の表１に示すように、これらの系統を容易に検出可能である。
【0048】
プライマーの特異性にはプライマーの３’末端側の配列が特に重要とされる。PVS配列増幅用プライマーセットにおける配列番号１３及び１４に記載の塩基配列（配列番号１３及び１４における混合塩基の全ての組み合わせを含む）は、PVSO、PVSAおよびPVSPのゲノム配列に対し、３’末端から８塩基以内にミスマッチが存在しない。同様に、PVY配列増幅用プライマーセットにおける配列番号１７に記載の塩基配列は、PVYC、PVYO、PVYEu-N、PVYNA-N、PVYE、及びPVYNTNのゲノム配列に対し、３’末端から８塩基以内にミスマッチが存在しない。
即ち、PVS配列増幅用プライマーセット及びPVY配列増幅用プライマーセットは、複数系統の解析に対応可能な有用なプライマーセットである。
即ち、PVS配列増幅用プライマーセット及びPVY配列増幅用プライマーセットは、複数系統の解析に対応可能な有用なプライマーセットである。
【0049】
前記１）～４）の４つ全てのプライマーセットを使用する場合の実施形態の方法として、下記の方法が挙げられる。
前記１）～４）の前記プライマーセットを使用して、マルチプレックスＰＣＲ法により、ジャガイモ葉巻ウイルス（PLRV:potato leafroll virus）、ジャガイモＳウイルス（PVS:potato virus S）、ジャガイモＸウイルス（PVX:potato virus X）及びジャガイモＹウイルス(PVY：potato virus Y)の存在の有無を識別することを含む、方法。
前記１）～４）の前記プライマーセットを使用して、マルチプレックスＰＣＲ法により、ジャガイモ葉巻ウイルス（PLRV:potato leafroll virus）、ジャガイモＳウイルス（PVS:potato virus S）、ジャガイモＸウイルス（PVX:potato virus X）及びジャガイモＹウイルス(PVY：potato virus Y)の存在の有無を識別することを含む、方法。
【0050】
前記１）～５）の５つ全てのプライマーセットを使用する場合の実施形態の方法として、下記の方法が挙げられる。
前記１）～５）の前記プライマーセットを使用して、マルチプレックスＰＣＲ法により、ジャガイモ葉巻ウイルス（PLRV:potato leafroll virus）、ジャガイモＳウイルス（PVS:potato virus S）、ジャガイモＸウイルス（PVX:potato virus X）及びジャガイモＹウイルス(PVY：potato virus Y)の存在の有無を識別することを含む、方法。
前記１）～５）の前記プライマーセットを使用して、マルチプレックスＰＣＲ法により、ジャガイモ葉巻ウイルス（PLRV:potato leafroll virus）、ジャガイモＳウイルス（PVS:potato virus S）、ジャガイモＸウイルス（PVX:potato virus X）及びジャガイモＹウイルス(PVY：potato virus Y)の存在の有無を識別することを含む、方法。
【0051】
マルチプレックスＰＣＲ法に用いるプライマーセットの数が増えるほど、ウイルスの検疫効率を向上させることができる。
【0052】
一方で、インターカレーター法のシグナル検出に適した増幅産物の長さは４００ｂｐ以下とされている。そのため、反応系内のプライマーセットの数を増やし、好ましい増幅産物長を保ちつつ、増幅産物を明確に区別可能な程度に、各増幅産物を識別可能な特定のプライマーセットを見出すことは困難である。
【0053】
リアルタイムＰＣＲ法では、上記のインターカレーター法の他に、プローブ法が一般的に実施されている。
一般的に、リアルタイムＰＣＲにおけるマルチプレックスＰＣＲ法では、インターカレーター法ではなく、プローブ法が採用されることが通例である。むしろ、一般的に、マルチプレックスＰＣＲ法にはインターカレーター法では適用が困難であると認識されている。
一般的に、リアルタイムＰＣＲにおけるマルチプレックスＰＣＲ法では、インターカレーター法ではなく、プローブ法が採用されることが通例である。むしろ、一般的に、マルチプレックスＰＣＲ法にはインターカレーター法では適用が困難であると認識されている。
【0054】
その理由としては、上述のように、インターカレーター法に好適な増幅産物長で、且つ増幅産物を明確に区別可能な特定のプライマーセットを見出すことは非常に困難であるためである。
【0055】
プローブ法は、蛍光色素等で標識され、標的配列にハイブリダイズ可能なプローブの存在下でＰＣＲ反応を行う。プローブとしては、ＴａｑＭａｎプローブ、サイクリングプローブ等が挙げられる。プローブ法では、プローブごとに異なる標識種を付与することができるため、標識による増幅産物の区別が容易であることも、マルチプレックスＰＣＲ法にプローブ法が用いられる要因である。標識としては、蛍光色素による蛍光標識が挙げられる。蛍光色素としては、ＦＡＭ、Ｃｙ５、ＶＩＣ等が挙げられ、市販の蛍光色素を適宜用いることができる。
【0056】
ただし、プローブ法では、標識されたプローブが高価であること、多種の標識のシグナルを一度に検出するためには、多波長を検出可能な高価なＰＣＲ装置を用いる必要がある。
【0057】
一方で、実施形態の方法によれば、マルチプレックスＰＣＲ法に、インターカレーター法を適用可能である。そのため、安価で汎用性の高い解析を実施することができる。これは、種ばれいしょ検疫のような非常に多くの検体を扱う場合において、実用面で特に重要な点である。
【0058】
本実施形態の前記１）～４）のプライマーセットによれば、インターカレーター法により、ジャガイモ葉巻ウイルス（ＰＬＲＶ）、ジャガイモＳウイルス（ＰＶＳ）、ジャガイモＸウイルス（ＰＶＸ）およびジャガイモＹウイルス（ＰＶＹ）の４種類全てのジャガイモ病害ウイルスの存在の有無を、マルチプレックスＰＣＲ法により、全て一度に識別することが可能であり、検査効率向上の観点から非常に有用である。
【0059】
また、実施形態の方法は、逆転写反応及びＰＣＲ反応を、１つの反応系で続けて行う、所謂１ステップＲＴ－ＰＣＲ法により、実施することができる。
例えば、実施形態の方法は、前記ウイルスＲＮＡに対する逆転写反応に用いられる逆転写酵素、及び前記マルチプレックスＰＣＲに用いられる２以上のプライマーセットを含む反応系において、前記逆転写反応及び前記マルチプレックスＰＣＲ法を連続して実施することができる。
例えば、実施形態の方法は、前記ウイルスＲＮＡに対する逆転写反応に用いられる逆転写酵素、及び前記マルチプレックスＰＣＲに用いられる２以上のプライマーセットを含む反応系において、前記逆転写反応及び前記マルチプレックスＰＣＲ法を連続して実施することができる。
【0060】
１ステップＲＴ－ＰＣＲ法では、逆転写反応で得られたＤＮＡに対して、非特異的なアニーリングが生じやすいところ、本実施形態の前記１）～４）のプライマーセットでは、非特異的なアニーリング及び増幅が生じ難い。本実施形態の前記１）～４）のプライマーセットによれば、１ステップＲＴ－ＰＣＲ法においても、精度の高い解析を維持できる。
【0061】
実施形態の方法によれば、マルチプレックスＰＣＲに、インターカレーター法による１ステップＲＴ－ＰＣＲを適用可能であるので、従来の検査手法と比較し、格段に省力化されたウイルス検出が可能であり、検査の効率化を飛躍的に向上可能である。
【0062】
≪プライマーセット≫
本実施形態の１）～４）のプライマーセットが備えることのできる各プライマーに係るポリヌクレオチドとして、以下の（１－１）～（８－２）のポリヌクレオチドを例示できる。
本実施形態の１）～４）のプライマーセットが備えることのできる各プライマーに係るポリヌクレオチドとして、以下の（１－１）～（８－２）のポリヌクレオチドを例示できる。
【0063】
（１－１）配列番号１に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチド、又は
（１－２）配列番号１に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチドと、
（２－１）配列番号２に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチド、又は
（２－２）配列番号２に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチドと、を備える、PLRV配列増幅用プライマーセット。
（１－２）配列番号１に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチドと、
（２－１）配列番号２に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチド、又は
（２－２）配列番号２に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチドと、を備える、PLRV配列増幅用プライマーセット。
【0064】
（３－１）配列番号３に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチド、又は
（３－２）配列番号３に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチドと、
（４－１）配列番号４に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチド、又は
（４－２）配列番号４に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチドと、を備える、PVS配列増幅用プライマーセット。
（３－２）配列番号３に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチドと、
（４－１）配列番号４に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチド、又は
（４－２）配列番号４に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチドと、を備える、PVS配列増幅用プライマーセット。
【0065】
（５－１）配列番号５に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチド、又は
（５－２）配列番号５に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチドと、
（６－１）配列番号６に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチド、又は
（６－２）配列番号６に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチドと、を備える、PVX配列増幅用プライマーセット。
（５－２）配列番号５に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチドと、
（６－１）配列番号６に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチド、又は
（６－２）配列番号６に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチドと、を備える、PVX配列増幅用プライマーセット。
【0066】
（７－１）配列番号７に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチド、又は
（７－２）配列番号７に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチドと、
（８－１）配列番号８に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチド、又は
（８－２）配列番号８に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチドと、を備える、PVY配列増幅用プライマーセット。
（７－２）配列番号７に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチドと、
（８－１）配列番号８に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチド、又は
（８－２）配列番号８に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチドと、を備える、PVY配列増幅用プライマーセット。
【0067】
配列番号３～４に記載の塩基配列のうち、ＢはＧ、Ｔ、又はＣであり、ＭはＡ又はＣであり、ＷはＡ又はＴである混合塩基を表す。
【0068】
上記の連続する１５塩基以上の塩基配列の塩基数の上限値としては、各配列番号１～８に記載の各塩基配列の塩基数が挙げられるが、４０塩基以下が好ましい。
配列番号１であれば、配列番号１に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上４０塩基以下の塩基配列であってよい。
配列番号２であれば、配列番号２に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上４０塩基以下の塩基配列であってよい。
配列番号３であれば、配列番号３に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上２３塩基以下の塩基配列であってよい。
配列番号４であれば、配列番号４に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上２８塩基以下の塩基配列であってよい。
配列番号５であれば、配列番号５に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上２３塩基以下の塩基配列であってよい。
配列番号６であれば、配列番号６に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上３２塩基以下の塩基配列であってよい。
配列番号７であれば、配列番号７に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上２９塩基以下の塩基配列であってよい。
配列番号８であれば、配列番号８に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上４０塩基以下の塩基配列であってよい。
配列番号１であれば、配列番号１に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上４０塩基以下の塩基配列であってよい。
配列番号２であれば、配列番号２に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上４０塩基以下の塩基配列であってよい。
配列番号３であれば、配列番号３に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上２３塩基以下の塩基配列であってよい。
配列番号４であれば、配列番号４に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上２８塩基以下の塩基配列であってよい。
配列番号５であれば、配列番号５に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上２３塩基以下の塩基配列であってよい。
配列番号６であれば、配列番号６に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上３２塩基以下の塩基配列であってよい。
配列番号７であれば、配列番号７に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上２９塩基以下の塩基配列であってよい。
配列番号８であれば、配列番号８に記載の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上４０塩基以下の塩基配列であってよい。
【0069】
上記の連続する塩基数の数値範囲としては、各配列番号１～８に記載の各塩基配列の塩基数に範囲において、それぞれ独立に、例えば、１５塩基以上４０塩基以下であってよく、１７塩基以上３０塩基以下であってよく、１８塩基以上２５塩基以下であってよい。プライマーの特異性を高めるとの観点からは、該塩基数は大きいほうがよいが、プライマー自体のＴｍ値を好適なものとする観点から、該塩基数は上記上限値以下であることが好ましい。
【0070】
上記の配列番号１～８は、各ウイルスゲノムの保存領域にあたる配列であり、且つプライマーとして好適な塩基配列を有するので、この連続する１５塩基以上の塩基配列を含むポリヌクレオチドであれば、各ウイルスに由来するＰＣＲ反応の鋳型のＤＮＡ鎖へ、プライマーとして容易にアニーリングさせることができる。
【0071】
プライマーのアニーリングには、プライマーの３’末端側の配列が重要であることが知られている。そのため、上記の配列番号１～８に記載の塩基配列のうち、第１５番目以降のいずれかの塩基を３’末端に有している。
【0072】
実施例で使用されたプライマーの３’末端を考慮するのであれば、
（１－１）又は（１－２）のポリヌクレオチドであれば、配列番号１に記載の塩基配列の第２１番目の塩基を３’末端に有することが好ましく、
（２－１）又は（２－２）のポリヌクレオチドであれば、配列番号２に記載の塩基配列の第４１番目の塩基を３’末端に有することが好ましく、
（３－１）又は（３－２）のポリヌクレオチドであれば、配列番号３に記載の塩基配列の第２２番目の塩基を３’末端に有することが好ましく、
（４－１）又は（４－２）のポリヌクレオチドであれば、配列番号４に記載の塩基配列の第２８番目の塩基を３’末端に有することが好ましく、
（５－１）又は（５－２）のポリヌクレオチドであれば、配列番号５に記載の塩基配列の第２１番目の塩基を３’末端に有することが好ましく、
（６－１）又は（６－２）のポリヌクレオチドであれば、配列番号６に記載の塩基配列の第２３番目の塩基を３’末端に有することが好ましく、
（７－１）又は（７－２）のポリヌクレオチドであれば、配列番号７に記載の塩基配列の第２６番目の塩基を３’末端に有することが好ましく、
（８－１）又は（８－２）のポリヌクレオチドであれば、配列番号８に記載の塩基配列の第４２番目の塩基を３’末端に有することが好ましい。
当該３’末端は、配列番号１１～１８に記載の塩基配列の３’末端に一致するものである。
（１－１）又は（１－２）のポリヌクレオチドであれば、配列番号１に記載の塩基配列の第２１番目の塩基を３’末端に有することが好ましく、
（２－１）又は（２－２）のポリヌクレオチドであれば、配列番号２に記載の塩基配列の第４１番目の塩基を３’末端に有することが好ましく、
（３－１）又は（３－２）のポリヌクレオチドであれば、配列番号３に記載の塩基配列の第２２番目の塩基を３’末端に有することが好ましく、
（４－１）又は（４－２）のポリヌクレオチドであれば、配列番号４に記載の塩基配列の第２８番目の塩基を３’末端に有することが好ましく、
（５－１）又は（５－２）のポリヌクレオチドであれば、配列番号５に記載の塩基配列の第２１番目の塩基を３’末端に有することが好ましく、
（６－１）又は（６－２）のポリヌクレオチドであれば、配列番号６に記載の塩基配列の第２３番目の塩基を３’末端に有することが好ましく、
（７－１）又は（７－２）のポリヌクレオチドであれば、配列番号７に記載の塩基配列の第２６番目の塩基を３’末端に有することが好ましく、
（８－１）又は（８－２）のポリヌクレオチドであれば、配列番号８に記載の塩基配列の第４２番目の塩基を３’末端に有することが好ましい。
当該３’末端は、配列番号１１～１８に記載の塩基配列の３’末端に一致するものである。
【0073】
また、（２－１）又は（２－２）のポリヌクレオチドは、下記のポリヌクレオチドを包含する。
配列番号２に記載の塩基配列の第１～４５番目の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、第１５～４５番目のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチド、又は
配列番号２に記載の塩基配列の第１～４５番目の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、第１５～４５番目のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチド。
配列番号２に記載の塩基配列の第１～４５番目の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列を含み、第１５～４５番目のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチド、又は
配列番号２に記載の塩基配列の第１～４５番目の塩基配列のうちの連続する１５塩基以上の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、第１５～４５番目のいずれかの塩基を３’末端として含むポリヌクレオチド。
【0074】
また、同様に実施例で使用された各プライマーの配列を考慮し、以下の（１－１ａ）～（８－２ａ）のプライマーセットを例示できる。
【0075】
（１－１ａ）配列番号１１に記載の塩基配列を３’末端側に含むポリヌクレオチド、又は
（１－２ａ）配列番号１１に記載の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を３’末端側に含むポリヌクレオチドと、
（２－１ａ）配列番号１２に記載の塩基配列を３’末端側に含むポリヌクレオチド、又は
（２－２ａ）配列番号１２に記載の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を３’末端側に含むポリヌクレオチドと、を備える、PLRV配列増幅用プライマーセット。
（１－２ａ）配列番号１１に記載の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を３’末端側に含むポリヌクレオチドと、
（２－１ａ）配列番号１２に記載の塩基配列を３’末端側に含むポリヌクレオチド、又は
（２－２ａ）配列番号１２に記載の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を３’末端側に含むポリヌクレオチドと、を備える、PLRV配列増幅用プライマーセット。
【0076】
（３－１ａ）配列番号１３に記載の塩基配列を３’末端側に含むポリヌクレオチド、又は
（３－２ａ）配列番号１３に記載の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を３’末端側に含むポリヌクレオチドと、
（４－１ａ）配列番号１４に記載の塩基配列を３’末端側に含むポリヌクレオチド、又は
（４－２ａ）配列番号１４に記載の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を３’末端側に含むポリヌクレオチドと、を備える、PVS配列増幅用プライマーセット。
（３－２ａ）配列番号１３に記載の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を３’末端側に含むポリヌクレオチドと、
（４－１ａ）配列番号１４に記載の塩基配列を３’末端側に含むポリヌクレオチド、又は
（４－２ａ）配列番号１４に記載の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を３’末端側に含むポリヌクレオチドと、を備える、PVS配列増幅用プライマーセット。
【0077】
（５－１ａ）配列番号１５に記載の塩基配列を３’末端側に含むポリヌクレオチド、又は
（５－２ａ）配列番号１５に記載の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチドと、
（６－１ａ）配列番号１６に記載の塩基配列を３’末端側に含むポリヌクレオチド、又は
（６－２ａ）配列番号１６に記載の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を３’末端側に含むポリヌクレオチドと、を備える、PVX配列増幅用プライマーセット。
（５－２ａ）配列番号１５に記載の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチドと、
（６－１ａ）配列番号１６に記載の塩基配列を３’末端側に含むポリヌクレオチド、又は
（６－２ａ）配列番号１６に記載の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を３’末端側に含むポリヌクレオチドと、を備える、PVX配列増幅用プライマーセット。
【0078】
（７－１ａ）配列番号１７に記載の塩基配列を３’末端側に含むポリヌクレオチド、又は
（７－２ａ）配列番号１７に記載の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を３’末端側に含むポリヌクレオチドと、
（８－１ａ）配列番号１８に記載の塩基配列を３’末端側に含むポリヌクレオチド、又は
（８－２ａ）配列番号１８に記載の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を３’末端側に含むポリヌクレオチドと、を備える、PVY配列増幅用プライマーセット。
（７－２ａ）配列番号１７に記載の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を３’末端側に含むポリヌクレオチドと、
（８－１ａ）配列番号１８に記載の塩基配列を３’末端側に含むポリヌクレオチド、又は
（８－２ａ）配列番号１８に記載の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を３’末端側に含むポリヌクレオチドと、を備える、PVY配列増幅用プライマーセット。
【0079】
プライマーとして好適なＴｍ値を有するとの観点から、上記の（１－１）～（８－２）及び（１－１ａ）～（８－２ａ）のポリヌクレオチドは、例えば、１５～４０ヌクレオチドであることが好ましく、１７～３０ヌクレオチドであることがより好ましく、１８～２５ヌクレオチドであることがさらに好ましい。
【0080】
また、実施形態に係るＰＣＲ反応で、ＰＬＲＶ、ＰＶＳ、ＰＶＸ、又はＰＶＹに由来する核酸を増幅可能な範囲において、上記配列番号１～１８に記載の各塩基配列は、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列であってもよく、１又は複数個の塩基が置換された塩基配列であってもよい。
【0081】
１又は複数個としては、１～５個であってもよく、１～４個であってもよく、１～３個であってもよく、１～２個であってもよい。ただし、プライマーの３’末端から２塩基、より好ましくは８塩基には、塩基の欠失、置換若しくは付加が存在しないことが好ましい。
【0082】
実施形態のプライマーセットは、PLRV配列増幅用プライマーセット、PVS配列増幅用プライマーセット、PVX配列増幅用プライマーセット、及びPVY配列増幅用プライマーセットからなる群から選ばれるいずれか２以上のプライマーセットを含むものが好ましい。
かかる４種類のプライマーセットのうちの、いずれか２以上のプライマーセットによれば、ＰＬＲＶ、ＰＶＳ、ＰＶＸ、及びＰＶＹからなる群から選ばれるいずれか２以上のウイルスに由来する核酸を増幅可能である。実施形態のプライマーセットは、上記に説明した実施形態の方法に好適に使用可能である。
かかる４種類のプライマーセットのうちの、いずれか２以上のプライマーセットによれば、ＰＬＲＶ、ＰＶＳ、ＰＶＸ、及びＰＶＹからなる群から選ばれるいずれか２以上のウイルスに由来する核酸を増幅可能である。実施形態のプライマーセットは、上記に説明した実施形態の方法に好適に使用可能である。
【実施例】
【0083】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【0084】
＜核酸抽出＞
非特許文献１に記載の手法に沿って、RNAを抽出した。
非特許文献１に記載の手法に沿って、RNAを抽出した。
【0085】
（ウイルス感染葉について）
汁液接種法又は接ぎ木接種法により、人為的にウイルス分離株を接種したジャガイモ（品種：男爵薯）の感染葉を用意した。接種には、PLRV（ChLR_2: GenBank/MLBL/DDBJ accession, LC501445）、PVX（O-IC249:AB451181）、PVSO（M:AB451180）、PVYNTN（Eu-12Jp：AB702945）を用いた。ウイルスの感染は病徴観察及びRT-PCR法により確認し、感染葉は使用直前まで-８０℃保存した。
汁液接種法又は接ぎ木接種法により、人為的にウイルス分離株を接種したジャガイモ（品種：男爵薯）の感染葉を用意した。接種には、PLRV（ChLR_2: GenBank/MLBL/DDBJ accession, LC501445）、PVX（O-IC249:AB451181）、PVSO（M:AB451180）、PVYNTN（Eu-12Jp：AB702945）を用いた。ウイルスの感染は病徴観察及びRT-PCR法により確認し、感染葉は使用直前まで-８０℃保存した。
【0086】
（RNA抽出）
ジャガイモの感染葉に対して、40倍量のRNA抽出バッファー（800 mM グアニジンイソシアネート、 50 mM Tris-HCl[pH 8.0]、 0.5% [v/v] Triton X-100、1% [v/v] Tween 20）を加えて磨砕し、磨砕液を得た。１００μｌの磨砕液を、直径３mmのろ紙片が入ったPCRチューブに加えて数回ピペッティングした後、すぐに磨砕液をPCRチューブから除去した。PCRチューブ内で、２００μｌの５０％(v/v)イソプロパノールで１回、７５％(v/v)エタノールで１回の順に加え、ピペッティングにより、ろ紙を洗浄した。５０μｌのRNase-free水をPCRチューブに添加し、９５℃で５分間処理してろ紙からRNAをRNa-free水中に溶出させた。この溶液をRNA溶液（試料）とした。
また、各ウイルスの同時検出を確認するため、各ウイルス感染葉の磨砕液を等量ずつ含む混和溶液からも、同様にRNA溶液を抽出した。
ジャガイモの感染葉に対して、40倍量のRNA抽出バッファー（800 mM グアニジンイソシアネート、 50 mM Tris-HCl[pH 8.0]、 0.5% [v/v] Triton X-100、1% [v/v] Tween 20）を加えて磨砕し、磨砕液を得た。１００μｌの磨砕液を、直径３mmのろ紙片が入ったPCRチューブに加えて数回ピペッティングした後、すぐに磨砕液をPCRチューブから除去した。PCRチューブ内で、２００μｌの５０％(v/v)イソプロパノールで１回、７５％(v/v)エタノールで１回の順に加え、ピペッティングにより、ろ紙を洗浄した。５０μｌのRNase-free水をPCRチューブに添加し、９５℃で５分間処理してろ紙からRNAをRNa-free水中に溶出させた。この溶液をRNA溶液（試料）とした。
また、各ウイルスの同時検出を確認するため、各ウイルス感染葉の磨砕液を等量ずつ含む混和溶液からも、同様にRNA溶液を抽出した。
【0087】
＜１ステップ マルチプレックスリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ＞
１）試薬類・プライマー
ジャガイモ葉巻ウイルス（PLRV）、ジャガイモＳウイルス（PVS）、ジャガイモＸウイルス（PVX）及びジャガイモＹウイルス(PVY)について、公開されている各ウイルスのゲノムの塩基配列から、保存領域である外被タンパク質(CP:coat protein）遺伝子の領域を特定し、該領域を増幅可能なプライマーを設計した。
また、逆転写反応及びＰＣＲ反応の対照（内部標準）として、ジャガイモの伸長因子-1 アルファ(EF1α：elongation factor 1 alpha)遺伝子の配列領域を特定し、該領域を増幅可能なプライマーを設計した。
１）試薬類・プライマー
ジャガイモ葉巻ウイルス（PLRV）、ジャガイモＳウイルス（PVS）、ジャガイモＸウイルス（PVX）及びジャガイモＹウイルス(PVY)について、公開されている各ウイルスのゲノムの塩基配列から、保存領域である外被タンパク質(CP:coat protein）遺伝子の領域を特定し、該領域を増幅可能なプライマーを設計した。
また、逆転写反応及びＰＣＲ反応の対照（内部標準）として、ジャガイモの伸長因子-1 アルファ(EF1α：elongation factor 1 alpha)遺伝子の配列領域を特定し、該領域を増幅可能なプライマーを設計した。
【0088】
上記の各プライマーの塩基配列及び増幅産物のＴｍ値を以下に示す。単独検出時及び同時検出時のＴｍ値（測定値）については、（平均値）±２×（標準誤差）として信頼範囲（９５％）を示している。
【0089】
【表1】
【0090】
使用した試薬類を以下に示す。
PrimeScript One Step RT PCR Kit Ver.2 （タカラバイオ株式会社）
EvaGreen Dye, 20X in Water（Biotium, Inc.）
ROX Reference Dye (サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社)
PrimeScript One Step RT PCR Kit Ver.2 （タカラバイオ株式会社）
EvaGreen Dye, 20X in Water（Biotium, Inc.）
ROX Reference Dye (サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社)
【0091】
２）反応液の調整
以下の組成にて、各試薬類及び５つのプライマーセットを含む混合液を調整した。下記の混合液の量は、１反応あたりの量を示す。なお、ROX Reference Dyeは使用するリアルタイムPCRシステムによって必要な濃度が異なるため、希釈濃度や液量によって調整が推奨される。
以下の組成にて、各試薬類及び５つのプライマーセットを含む混合液を調整した。下記の混合液の量は、１反応あたりの量を示す。なお、ROX Reference Dyeは使用するリアルタイムPCRシステムによって必要な濃度が異なるため、希釈濃度や液量によって調整が推奨される。
【0092】
【表2】
【0093】
上記の混合液をウェルプレートに９μｌずつ分注し、分注後の混合液に、上記で取得した混合溶液から取得したＲＮＡ溶液を１μｌ添加し、反応液を得た。
【0094】
３）反応
QuantStudio3リアルタイムPCRシステム(サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社)を使用し、反応液に対し、以下の条件にて反応を行った。
QuantStudio3リアルタイムPCRシステム(サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社)を使用し、反応液に対し、以下の条件にて反応を行った。
【0095】
【表3】
【0096】
４）結果
上記のＰＣＲ反応後の増幅産物の融解曲線を、図１に示す。図中の矢印は、対応するウイルスの増幅産物とその融点（Tm値）を示している。
上記のＰＣＲ反応後の増幅産物の融解曲線を、図１に示す。図中の矢印は、対応するウイルスの増幅産物とその融点（Tm値）を示している。
【0097】
なお、増幅曲線の解析において、蛍光強度が閾値以上となるサイクル数（Cycles of threshold：Ct値）が、試料のＲＮＡ溶液に代えて精製水（DW）を用いた対照群のＣｔ値以下のもの判定に用いた。例えば、今回は、DWを用いた対照群のCt値が30超であったため、Ct値が30以下となる試料を判定に用いた。試料のCt値が30より大きい場合は、RNA抽出又は検出反応が正しく行われていない可能性がある。
【0098】
また、融解曲線に現れる特異的な温度帯のピークのうち、内部標準（ジャガイモ遺伝子）に対応するピーク（７６℃付近）の蛍光強度の閾値以上のピークを、判定に用いた。
【0099】
図１に示されるとおり、PLRV、PVS、PVX、PVYの４種類のウイルスを対象とした増幅産物が得られ、試料中にウイルスが存在することを識別できた。増幅産物は、Ｔｍ値が互いに異なっており、各ウイルスの種類に対応するピークを明確且つ容易に識別可能であった。
【0100】
上記実施例によれば、上記の４種類のウイルスの存在の有無の識別を、１ステップマルチプレックスリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法を用い、簡便で高効率に実施可能であった。
【0101】
また、解析にEvaGreen Dye（インターカレート色素）を利用しているため、安価で汎用性の高い解析を実施できた。
【0102】
更には、増幅産物の増幅曲線のピークは、それぞれのＴｍ値の差が大きく、明確且つ容易に識別可能であることから、誤判定が生じ難い高精度な解析が可能であった。
【0103】
各実施形態における各構成及びそれらの組み合わせ等は一例であり、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、構成の付加、省略、置換、およびその他の変更が可能である。また、本発明は各実施形態によって限定されることはなく、請求項（クレーム）の範囲によってのみ限定される。
【図1】
【配列表】