特許 7556279 ヘモグロビン分析装置

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-09-17

(45)【発行日】2024-09-26

(54)【発明の名称】ヘモグロビン分析装置

(51)【国際特許分類】

   G01N 30/88 20060101AFI20240918BHJP

   G01N 30/86 20060101ALI20240918BHJP

【ＦＩ】

G01N30/88 Q

G01N30/86 M

G01N30/86 C

G01N30/86 D

【請求項の数】 11

(21)【出願番号】P 2020203216

(22)【出願日】2020-12-08

(65)【公開番号】P2022090737

(43)【公開日】2022-06-20

【審査請求日】2023-11-13

(73)【特許権者】

【識別番号】000003300

【氏名又は名称】東ソー株式会社

(72)【発明者】

【氏名】真仁田 大輔

【審査官】小澤 理

(56)【参考文献】

【文献】特開２０１７－２０３６７７（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００４－５０８５６６（ＪＰ，Ａ）

【文献】特公昭４８－０２６３１６（ＪＰ，Ｂ１）

【文献】欧州特許出願公開第０３４５７１２９（ＥＰ，Ａ１）

【文献】特開２０１６－１８３８７１（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１７－１９４３４９（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第０２／０２１０９９（ＷＯ，Ａ２）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ ３０／８８

Ｇ０１Ｎ ３０／８６

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

血液中のヘモグロビンを分析する分析装置であって、
検出器の信号強度の時間変化により得られたヘモグロビンのクロマトグラムデータに対して前記信号強度の微分係数を算出する演算処理部を有し、
前記微分係数の時間変化または前記微分係数の絶対値の時間変化を示す微分クロマトグラムにおいて、
前記信号強度の最小最大値を規格化し、ＨｂＡ１ｃの溶出時間とヘモグロビンＡ０の溶出時間との間の時間領域において、前記信号強度の微分縦軸の正領域に極小点が検出された場合に異常ヘモグロビンの存在を判定することを特徴とするヘモグロビン分析装置。

【請求項2】

前記信号強度が０から１０００に規格化されており、ＨｂＡ１ｃの溶出時間とヘモグロビンＡ０の溶出時間との間の時間領域において、前記信号強度の微分軸の０～５００の領域に極小点が検出された場合に異常ヘモグロビンＥの存在を判定することを特徴とする請求項１に記載のヘモグロビン分析装置。

【請求項3】

血液中のヘモグロビンを分析する分析装置であって、
検出器の信号強度の時間変化により得られたヘモグロビンのクロマトグラムデータに対して前記信号強度の微分係数を算出する演算処理部を有し、
前記微分係数の時間変化または前記微分係数の絶対値の時間変化を示す微分クロマトグラムにおいて、
前記信号強度の最小最大値を規格化し、ヘモグロビンＡ０の溶出時間より後方の時間領域において、前記信号強度の微分軸の負領域に極大点を検出した場合に異常ヘモグロビンの存在を判定することを特徴とするヘモグロビン分析装置。

【請求項4】

前記信号強度が０から１０００に規格化されており、ヘモグロビンＡ０の溶出時間より後方の時間領域において、前記信号強度の微分軸の－５００から０の負領域で極大点を検出した場合に異常ヘモグロビンＤの存在を判定することを特徴とする請求項３に記載のヘモグロビン分析装置。

【請求項5】

前記微分クロマトグラムにおいて、ＨｂＡ１ｃの溶出時間とヘモグロビンＡ０の溶出時間との間の時間領域で、前記信号強度の微分軸の正領域に極小点を検出した場合、またはヘモグロビンＡ０の溶出時間より後方の時間領域において、前記信号強度の微分軸の負領域に極大点を検出した場合に各極点の時間に基づき、もとのヘモグロビンのクロマトグラムデータに対して縦切り波形処理を実施することを特徴とする請求項１～４のいずれかに記載のヘモグロビン分析装置。

【請求項6】

前記微分クロマトグラムにおいて、ＨｂＡ１ｃの溶出時間とヘモグロビンＡ０の溶出時間との間の時間領域において、前記信号強度の微分軸の正領域に極小点を検出した場合、ＨｂＡ１ｃの溶出時間と極小点の時間座標との間の時間領域からなるヘモグロビンのクロマトグラムの一部を用いて非線形最小二乗法によるカーブフィッティングを行い、前記カーブフィッティングの結果を用いてヘモグロビンの定量計算を行うことを特徴とする請求項１～２のいずれかに記載のヘモグロビン分析装置。

【請求項7】

前記微分クロマトグラムにおいて、ＨｂＡ１ｃの溶出時間とヘモグロビンＡ０の溶出時間との間の時間領域において、前記信号強度の微分軸の正領域に極小点を検出した場合、ＨｂＡ１ｃの溶出時間と極小点の時間座標との間の時間領域におけるヘモグロビンのクロマトグラムの一部を用いて非線形最小二乗法によるカーブフィッティングを行い、得られたカーブフィッティング関数グラフと元のクロマトグラムを重ねて表示することを特徴とする請求項６に記載のヘモグロビン分析装置。

【請求項8】

前記微分クロマトグラムにおいて、ヘモグロビンＡ０の溶出時間より後方の時間領域において、前記信号強度の微分軸の負領域に極大点を検出した場合、極大点の時間座標より後方の時間領域からなるヘモグロビンのクロマトグラムの一部を用いて非線形最小二乗法によるカーブフィッティングを行い、前記カーブフィッティングの結果を用いてヘモグロビンの定量計算を行うことを特徴とする請求項３～４のいずれかに記載のヘモグロビン分析装置。

【請求項9】

前記微分クロマトグラムにおいて、ヘモグロビンＡ０の溶出時間より後方の時間領域において、前記信号強度の微分軸の負領域に極大点を検出した場合、極大点の時間座標より後方の時間領域からなるヘモグロビンのクロマトグラムの一部を用いて非線形最小二乗法によるカーブフィッティングを行い、得られたカーブフィッティング関数グラフと元のクロマトグラムを重ねて表示することを特徴とする請求項８に記載のヘモグロビン分析装置。

【請求項10】

表示部が入力部を兼ねるタッチパネル式ディスプレイを備え、異常ヘモグロビンの存在を判定した場合に、前記タッチパネル式ディスプレイのクロマトグラム領域をタッチすることで異常ヘモグロビンに対するカーブフィッティング関数グラフの表示または非表示が選択可能な請求項７または９のいずれかに記載のヘモグロビン分析装置。

【請求項11】

液体クロマトグラフィー法を原理とする請求項１～１０に記載のヘモグロビン分析装置。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、異常ヘモグロビンの影響を回避してヘモグロビンＡ１ｃを分析する装置に関する。

【背景技術】

【0002】

血中ヘモグロビンの糖化体であるグリコヘモグロビン、中でもヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ、安定型Ａ１ｃまたはｓＡ１ｃ）は糖尿病の診断または治療観察の指標として重要であり、その測定は液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、キャピラリー電気泳動法などにより実施される。ＨｂＡ１ｃの測定では異常ヘモグロビン（異常Ｈｂ、変異ヘモグロビンまたはヘモグロビンバリアント）の影響を受けずに正確なＨｂＡ１ｃの濃度を報告できるかが求められている。異常Ｈｂは、例えば主要なものとして、ヘモグロビンＳ（ＨｂＳ）、ヘモグロビンＣ（ＨｂＣ）、ヘモグロビンＤ（ＨｂＤ）、ヘモグロビンＥ（ＨｂＥ）等が挙げられる。その一方で臨床検査では即時報告や診療前検査の要求から、一検体当たりの測定時間の短縮が求められている。一般に、例えばＨＰＬＣ法により異常Ｈｂを含む試料を分析した場合に、特許文献１で示されるように、まず異常Ｈｂの少なくとも非糖化異常ＨｂをヘモグロビンＡの非糖化体であるヘモグロビンＡ０のピークから分離し、さらにヘモグロビンＡ０のピーク内に含まれる糖化異常Ｈｂの量を近似式から推定し、全ピーク面積から非糖化異常Ｈｂピーク面積と推算された糖化異常Ｈｂピークの両面積を除いて算出することで正確なＨｂＡ１ｃ濃度が求められる。近年、一台の分析装置に迅速測定と詳細測定の二つの分析モードを有するＨＰＬＣを原理としたＨｂＡ１ｃ分析装置が開発されている。詳細測定では、迅速測定より十分な時間をかけることで異常Ｈｂの分離を達成している。迅速測定では、異常Ｈｂの検知・検出をせずにＨｂＡ１ｃの定量測定に注力され、一検体当たり測定時間が３０秒程度にまで短縮されてきた。一方で、迅速測定であっても、詳細測定を実施するか否かの判断基準として異常Ｈｂの検出が求められるようになってきた。この場合、測定時間の制限からクロマトグラム上で異常Ｈｂのピークを他のピークから完全に分離することができず、他のクロマトグラムピークと重なって、異常Ｈｂピークが他ピークのリーディングやテーリングの一部に重なることでピークトップを持たないショルダーピーク形状をとることも多い。

【0003】

以上のことから、迅速な測定が求められるグリコヘモグロビン測定では、不十分な分離状態であっても異常Ｈｂを簡便に検出し、より望ましくは正確なＨｂＡ１ｃ濃度の定量が求められる。

【0004】

特許文献２では、非糖化異常ＨｂがヘモグロビンＡ０と十分に分離されておらず干渉する場合であっても、ヘモグロビンＡの面積に、クロマトグラム上でヘモグロビンＡ０と干渉する異常Ｈｂの面積を加算した面積に対するＨｂＡ１ｃの面積比率を補正係数で補正することにより、前記ヘモグロビンＡの面積に対するＨｂＡ１ｃの面積比率から、異常ヘモグロビン量を推算してＨｂＡ１ｃを精度よく測定する方法が記載されている。一方で、本補正式の算出には、異常Ｈｂ（非糖化異常Ｈｂ）がヘモグロビンＡ０との干渉に関して、吸光度が最小となる時点を想定するいわゆるクロマトグラムの谷が形成されており、異常Ｈｂは少なくともピークトップを有する山または瘤状のピークとして分離する必要があり、ヘモグロビンＡ０にピークトップが埋没した測定結果には適用できない。また定量に関しても補正係数で補正することから干渉する異常Ｈｂのピーク面積はＨｂＡ１ｃ、ヘモグロビンＡまたはヘモグロビンＡ０に対して補正係数に従って一定な状況を維持しなければ正しい結果が得られないという課題がある。検体種によって干渉する比率が変化する場合、あるいはカラム間差や溶離液間差などにより干渉する比率が変化する場合には正確な結果が得られない。またあらかじめ設定された補正係数を用いるという性質上、定量計算を正確に実施するためには様々なパターンに対応した補正係数を考慮して用意しなければならない点に課題がある。

【0005】

特許文献３では、クロマトグラム上で重なったピークの分離に混合ガウス分布による最適化アルゴリズムを使用し、複数の重なったピークやテーリングにショルダーピークがあるピークであっても分離を推定したクロマトグラムやスペクトルが得られると報告されている。この発明では、異常Ｈｂのピークと他のピークが一様な比率で重なることがない状況でも真値に近いピーク形状を推定することが可能である。しかしこの方法では、検出器として少なくとも波長走査が可能な紫外可視分光光度計などが必要であり、高価なシステムとなってしまい、またピーク間で波長スペクトルの差異が無ければフィッティングはかなり困難となる。

【0006】

特許文献４では、液体クロマトグラフィーによるＨｂＡ１ｃ測定で分離が不十分なピークであっても非正規分布関数のカーブフィッティングを施すことで正確なピーク面積が求められると報告している。非正規分布関数のカーブフィッティングはあらかじめ一つのモデル式を用意すれば様々なパターンに対して、一部のパラメータのみを可変とすることで柔軟に適用可能である。しかし、本報告ではＨｂＡ１ｃまたはヘモグロビンＡ０のピークについてのみを対象としており、波形スペクトルのフィッティングも複合ピークが現れた際の主ピークのみについて適用しており、異常Ｈｂのような小ピークについて検討されておらず、まして小ピークのピークトップが得られていないような条件では適用できない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【文献】特開２０１７－２０３６７７号公報

【文献】特開２０１７－１９４３４９号公報

【文献】ＷＯ２０１６／０３５１６７号公報

【文献】特開２０１９－１７４２４２号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

分離が不十分な異常ヘモグロビンの影響を回避し、ＨｂＡ１ｃの迅速な分析が可能なヘモグロビン分析装置を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明は以上の点に鑑みてなされ、第一の態様は、血液中のヘモグロビンを分析する分析装置であって、検出器の信号強度の時間変化により得られたクロマトグラムデータに対して前記信号強度の微分係数を算出する演算処理部を有し、前記微分係数または前記微分係数の絶対値の時間変化を示す微分クロマトグラムにおいて、信号強度軸正領域の極小点または信号強度軸負領域の極大点の存在を検出することを特徴とするヘモグロビン分析装置を提供することにある。

【0010】

また本発明の第二の態様は、前記微分クロマトグラムにおいて、ＨｂＡ１ｃの溶出時間とヘモグロビンＡ０の溶出時間との間の時間領域で、信号強度の微分軸の正領域に極小点が検出された場合に異常ヘモグロビンの存在を判定することを特徴とするヘモグロビン分析装置を提供することにある。

【0011】

また本発明の第三の態様は、前記微分クロマトグラムにおいて、ヘモグロビンＡ０の溶出時間より後方の時間領域で、信号強度の微分軸の負領域に極大点が検出された場合に異常ヘモグロビンＤの存在を判定することを特徴とするヘモグロビン分析装置を提供することにある。

【0012】

また本発明の第四の態様は、ＨｂＡ１ｃの溶出時間と前記極点の時間座標との間の時間領域におけるヘモグロビンのクロマトグラムの一部を用いて非線形最小二乗法により近似曲線の関数式によるカーブフィッティングを行い、その結果から定量計算を行うことを特徴とするヘモグロビン分析装置を提供することにある。

【発明の効果】

【0013】

異常ヘモグロビンの影響を回避することにより、ＨｂＡ１ｃを正確に測定することができる。

【0014】

本発明の技術は、異常Ｈｂが存在した場合にそれらの影響を回避して糖化ヘモグロビンを正確に分離分析することが可能であるが、異常Ｈｂのみならず血液中のビリルビンをはじめとする共存物質あるいは、アセチル化ヘモグロビン、アセトアルデヒド化ヘモグロビンそしてアルデヒド化ヘモグロビンなどの修飾ヘモグロビンが存在する場合にそれらの影響を回避してＨｂＡ１ｃを正確に分離分析することにも応用が可能である。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】異常Ｈｂを検出し、波形処理による定量計算を実施する一般的なフローチャートを示した図である。

【図2】微分係数の算出を組み合わせたフローチャートを示した図である。

【図3】ヘモグロビン分析に用いた液体クロマトグラフィー装置構成の一態様を示した図である。

【図4】非異常Ｈｂ検体のクロマトグラム（０～１０００で規格化）の拡大図である。

【図5】非異常Ｈｂ検体のクロマトグラム（０～１０００で規格化）の全体図である。

【図6】非異常Ｈｂ検体のクロマトグラムを１次微分した結果の拡大図である。

【図7】非異常Ｈｂ検体のクロマトグラムに関し、１次微分後に異常Ｈｂの判定を経て、縦切り波形処理した結果の図である。

【図8】異常ＨｂであるＨｂＳを含む検体のクロマトグラム（０～１０００で規格化）の全体図である。

【図9】異常ＨｂであるＨｂＳを含む検体のクロマトグラムを１次微分した結果の図である。

【図10】異常ＨｂであるＨｂＳを含む検体のクロマトグラムに関し、１次微分後に異常Ｈｂの判定を経て、縦切り波形処理した結果の図である。

【図11】異常ＨｂであるＨｂＤを含む検体のクロマトグラム（０～１０００で規格化）の全体図である。

【図12】異常ＨｂであるＨｂＤを含む検体のクロマトグラムを１次微分した結果の図である。

【図13】異常ＨｂであるＨｂＤを含む検体のクロマトグラムに関し、１次微分後に異常Ｈｂの判定を経て、非線形最小二乗法によるカーブフィッティング（非対称二重シグモイド曲線）の結果を示した図である。

【図14】異常ＨｂであるＨｂＥを含む検体のクロマトグラム（０～１０００で規格化）の全体図である。

【図15】異常ＨｂであるＨｂＥを含む検体のクロマトグラムを１次微分した結果の図である。

【図16】異常ＨｂであるＨｂＥを含む検体のクロマトグラムに関し、１次微分後に異常Ｈｂの判定を経て、非線形最小二乗法によるカーブフィッティング（非対称二重シグモイド曲線）の結果を示した図である。

【図17】ヘモグロビン分析装置の表示部で、異常ＨｂであるＨｂＥを含む検体のクロマトグラムを含めた結果表示の一例を示した図である。

【実施例】

【0016】

以下、実施例等を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の態様はこれらに限定されるものではない。

【0017】

本発明の、ＨＰＬＣによるＨｂＡ１ｃ測定におけるピーク検出処理の一般的な手順を以下に示す。図１は処理の手順を示したフローチャートである。但し工程の順序はフローチャートに従う必要はなく、工程の一部を省略する、または付け加えることは可能である。また電気泳動法を測定原理とするＨｂＡ１ｃ測定においてはクロマトグラムの横軸を時間から移動度などに置き換えることで本手順を適用することができる。

【0018】

（工程１：平滑化）
クロマトグラフの検出器信号強度の時間変化からクロマトグラムを取得し、電気的または溶離液の送液などに起因する微小または突発的なノイズを除去するために平滑化を実施する。平滑化は３点から２１点程度の移動平均や複数点の中心点を採用する処理方法などが例示できる。この工程は省略しても良くまた複数回繰り返しても良い。

【0019】

（工程２：規格化または正規化）
検出器信号強度の時間変化から得られたクロマトグラムまたは、前記平滑化後のクロマトグラムから最小値と最大値を求め、全ての測定に関するクロマトグラムの結果を一定の規格範囲に定める。例えば最小値を強度軸の０に設定し、最大値を強度軸の１０００に設定することができる。この工程は省略しても良い。

【0020】

（工程３：微分）
検出器信号強度の時間変化から得られたクロマトグラム、前記平滑化後のクロマトグラム、規格化後のクロマトグラム、または他の補正等がなされたクロマトグラムに関して微分を実施する。検出器信号強度の時間変化から得られたクロマトグラム等は、一定のサンプリングピッチで取得した離散型のプロットデータからなる。離散分布の結果から連続関数の近似式として処理することも可能であるが、以後離散型データとして取り扱う。
今回、微分演算には、離散型の平滑化・数値微分の代表的手法であるＳａｖｉｔｚｋｙ Ｇｏｌａｙ法（ＳＧ法）を実施したが、プロット間の変化の割合を求めるなど他の微分演算を用いることもできる。この工程では、１次微分を実施するが、同時に２次微分を実施しても良い。

【0021】

（工程４：ピーク検出）
１次微分または２次微分の結果から、ピーク検出を実施する。１次微分の結果から一時的にまたは連続的に正から負に切り替わる時間に基づきピークトップを検知する、または１次微分の結果から一時的にもしくは連続的に負から正に切り替わる時間に基づき谷位置を検知する。これらの検知に２次微分の結果を合わせてピーク検知の感度を調整することも可能である。

【0022】

（工程５：異常Ｈｂピーク検出）
工程４で得られたピークから、全ピーク数、高さ、面積または時間に依存するパラメータから通常検体のクロマトグラムから得られることがない、または通常検体のクロマトグラムと比較してピーク面積が相対的に著しく大きいピークを異常Ｈｂのピークとして検出する。

【0023】

（工程６：波形処理・定量演算）
工程１～５で得られたピーク検出結果およびベースライン処理等の結果から、縦切り波形処理等の波形処理や定量演算を実施する。工程５で異常Ｈｂが検知された場合は、そのピーク面積を前ピーク面積から除することなども可能である。

【0024】

（実施例１）
続いて本発明の構成について、異常Ｈｂのピーク検出処理の手順（図２）を説明する。
前述の工程１～５までは同様に実施し、工程６に変えて、下記の工程を実施する。

【0025】

（工程７：微分結果の評価（１））
工程４で実施した微分の結果について再評価を実施する。１次微分後に、微分縦軸の正領域で極小点（下に凸の局所的最小値）を検出する。正領域に極小点が存在した場合、その極小点の時間座標がもとのクロマトグラムのＨｂＡ１ｃの溶出時間（ピークトップ形成時間）とヘモグロビンＡ０の溶出時間の間に存在するかを評価し、存在した場合には異常Ｈｂとして検知する。ノイズと区別するために極小点の検出に２次微分の結果を合わせて使用することも可能である。また微分縦軸の特定の範囲のみに出現した極点のみを検知してもよく、または時間軸の特定の範囲のみに出現した極点のみを検知することでもよい。この工程は工程４の処理と同時あるいは先行して実施することも可能である。

【0026】

（工程８：微分結果の評価（２））
さらに工程４で実施した微分の結果について再評価を実施する。１次微分後の結果で、微分縦軸の負領域に極大点（上に凸の局所的最大値）を検出する。負領域に極大点が存在した場合、その極大点の時間座標がもとのクロマトグラムのヘモグロビンＡ０の溶出時間より後方に存在するかを評価し、存在した場合には異常Ｈｂとして検知する。ノイズと区別するために極小点の検出に２次微分の結果を合わせて使用することも可能である。また微分縦軸の特定の範囲のみに出現した極点のみを検知してもよく、または時間軸の特定の範囲のみに出現した極点のみを検知することでもよい。この工程は工程４の処理と同時あるいは先行して実施することも可能である。

【0027】

（工程９：波形処理・定量演算）
工程１～８で得られたピーク検出結果とベースライン処理等の結果から、波形処理を実施する。縦切り波形処理が一般的であるが、非線形最小二乗法によるカーブフィッティングによる波形処理と定量演算を実施することでさらに正確な定量計算が可能となる。
ここでは非線形最小二乗法によるカーブフィッティング処理について記載する。まず異常Ｈｂのピークを評価し、ピークトップが得られていればその溶出時間に対して、±５％程度の時間領域で、検出器信号強度の時間変化から得られたクロマトグラムから非線形最小二乗法により近似曲線の関数式を推定する。この場合は、シグモイド関数、ローレンツピーク関数、ガウス関数などの関数モデルを使用することで当てはまりが向上する。異常Ｈｂの存在は確認されるがピークトップが検知されないショルダーピーク形状の場合は、他のピークに干渉していないピーク部分でカーブフィッティング処理を実施するが、工程１～８までで得られた１次微分時の極点に対応する時間を含む近傍領域で近似することが望ましい。極点に対応する時間を溶出時間と仮定しても良く、または干渉部分の中にピークトップを仮定して溶出時間を設定することも可能である。

【0028】

推定された関数式に対してある時間領域で積分的に面積を算出し、クロマトグラムによって得られた全面積に対する面積比率を算出することで、異常Ｈｂの面積比率を算出することができる。非糖化異常Ｈｂピークと糖化異常Ｈｂピークの比率をあらかじめ規定しておくことで、カーブフィッティングで算出された非糖化異常Ｈｂ面積あるいは糖化異常Ｈｂ面積から、対応する糖化異常Ｈｂ面積あるいは非糖化異常Ｈｂ面積を類推することも可能であり、糖化体と非糖化体の面積を共に定量計算に用いることができる。

【0029】

（実施例２）
健常検体（異常Ｈｂ未保有検体）への適用について記載する。

【0030】

測定装置として、自動グリコヘモグロビン分析計ＨＬＣ－７２３Ｇ１１（バリアントモード）（東ソー株式会社製）を使用した。本装置は陽イオン交換クロマトグラフィーを原理とする液体クロマトグラフィー装置である。図３に主なシステム構成を示す。ただし測定の迅速化の検討を実施するため分析カラムは、ＴＳＫｇｅｌ Ｇ１１（スタンダードモード）（東ソー株式会社製）を使用し、溶離液は、Ｇ１１Ｖａｒｉａｎｔ Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ Ｎｏ．１（Ｓ）、Ｇ１１Ｖａｒｉａｎｔ Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ Ｎｏ．２（Ｓ）、Ｇ１１Ｖａｒｉａｎｔ Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ Ｎｏ．３（Ｓ）をそれぞれ使用した。迅速化した際の効果を確認するために低圧グラジエントの切り替えタイミングはそれぞれ２．０倍早い時間となるようにパラメータを変更した。検出器のアナログデータは、ＬＣ－８０２０インターフェースボード（東ソー株式会社製）を備えた汎用ＰＣで検出器出力強度を１０ミリ秒のサンプリングピッチで得た。プロットデータの解析、波形処理のアプリケーションは、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ ＶｉｓｕａｌＳｔｕｄｉｏ ２０１５（マイクロソフトコーポレーション製）の開発環境で作成した。表示部はクロマトグラム結果が表示可能なタッチパネル式液晶ディスプレイであり、指先等で操作可能な入力部を兼ねる。クロマトグラムは検出器出力強度からスムージングによる脱ノイズ処理を実施し、最小値と最大値を検出後、縦軸が０～１０００の範囲になるように規格化を実施した。微分はＳＧ法により実施し、１次微分として７点平滑化微分を２次微分として１１点平滑化微分を用いた。

【0031】

本装置では、血液検体はカラムで分離され、分離されたヘモグロビン成分は波長４１５ｎｍの吸光度により検出される（３液低圧グラジエント）。不安定型Ａ１ｃ（Ｌ－Ａ１ｃ）や修飾Ｈｂは、ＨｂＡ１ｃピークと分離される。得られたそれぞれのヘモグロビン成分のクロマトグラムピーク面積をもとに、ＨｂＡ１ｃの％濃度が求められる。異常Ｈｂ検体はＡｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、バリアントヘモグロビンコントロールＡＳ（ＨＣ－１０４）、バリアントヘモグロビンのコントロールＡＥ（ＨＣ－１１７）およびバリアントヘモグロビンのコントロールＡＤ（ＨＣ－１２０）を使用した。非異常Ｈｂ検体はＨｂＡｌｃコントロール（Ｌｅｖｅｌ２ 東ソー株式会社製）を用いた。

【0032】

図４は測定装置で得られる典型的な健常者（異常Ｈｂ未保有者、非異常Ｈｂ検体）のクロマトグラム（拡大図）であり、図５はその（全体図）である。クロマトグラムの最小値を０、最大値を１０００として規格化されたものである。ＨｂＡ１ｃ（溶出時間：約０．２５分）とヘモグロビンＡ０（溶出時間：約０．３５分）の谷（約０．３０５分）が明瞭である。図６は本測定結果のクロマトグラムに対してサンプリングピッチの１０ｍｓｅｃ毎に時間に対する１次微分を実施した結果である。微分後の結果から０．３０分から０．３１分の間にプロットデータが負領域から正領域に交差する曲線が確認でき、クロマトグラムのＨｂＡ１ｃとヘモグロビンＡ０の間の谷と対応していることがわかる。また微分後の結果から０．３５分近傍に正領域から負領域へ交差する曲線が確認でき、クロマトグラムのヘモグロビンＡ０のピークトップに対応していることがわかる。このように正領域から負領域の変化はもとのクロマトグラムの谷に、負領域から正領域への変化はクロマトグラムのピークトップに対応していることがわかる。さらに０．３４分近傍にノイズ状で正領域に極小点を形成しているが、ヘモグロビンＡ０のピークトップより早い時間領域で十分に大きい（縦軸：＞５００）位置にあるためヘモグロビンＡ０ピークを形成するための変化点であることがわかる。図７のように谷位置で縦切り波形処理を実施することでフロントピーク、ヘモグロビンＡ１ａ、ヘモグロビンＡ１ｂ、ヘモグロビンＦ、Ｌ－Ａ１ｃ、ＨｂＡ１ｃ、ヘモグロビンＡ０のピークに分画される。

【0033】

このように微分縦軸の０から乖離した位置にある極点はピークを形成するための変曲点となることが多く、その目安としてクロマトグラムの最小値を０、最大値を１０００として規格化されたクロマトグラムの１次微分結果では、－５００以下または５００以上であることがわかった。非異常Ｈｂ検体５０検体を測定した結果、ＨｂＡ１ｃの溶出時間とヘモグロビンＡ０の溶出時間との間の時間域で、１次微分の結果で縦軸の正領域で０から５００の間に極小点は確認されなかった。また同検体で、ヘモグロビンＡ０の溶出時間以降の時間域で、１次微分の結果で縦軸の負領域で－５００から０の間に極大点は確認されなかった。以上から、クロマトグラムを０から１０００に規格化した場合、１次微分の結果で縦軸の－５００から５００の領域に存在する極点を検知することで非異常Ｈｂ検体と異常Ｈｂ検体を判別することができると考えられる。当然、規格化範囲を変更することで１次微分縦軸の領域も連動して変化する。

【0034】

（実施例３）
異常Ｈｂの一例としてＨｂＳが含まれている検体への適用について記載する。特別な記載がない限り実施例２と同様の条件で実施した。

【0035】

異常Ｈｂを有する症例検体の測定では、前記分画成分のほかにピークが発生する。図８はＨｂＳが含まれている検体のクロマトグラムの全体図である。ヘモグロビンＡ０ピークの後ろにさらに明瞭なピークが存在する。図９は本測定結果のクロマトグラムに対してサンプリングピッチの１０ｍｓｅｃ毎に時間に対する１次微分を実施した結果である。０．３５分近傍に負領域から正領域に交差する曲線が確認でき、クロマトグラムのヘモグロビンＡ０とＨｂＳの間の谷と対応していることがわかる。また０．３８分近傍に正領域から負領域へ交差する曲線が確認でき、クロマトグラムのＨｂＳのピークトップに対応していることがわかる。さらに０．３３分近傍で正領域に極小点を形成しているが、ヘモグロビンＡ０のピークトップより早い時間領域で小さい（＜５００）位置にあるため異常Ｈｂの存在がこの点からも示唆される。元のクロマトグラムからも明瞭であるが、１次微分の結果を用いても図１０のように谷位置で縦切り波形処理を実施可能であり、異常ＨｂとヘモグロビンＡ０のピークを分けることができる。ＨｂＳのピークはヘモグロビンＡ０のピークから十分に離れた位置にありその主成分のヘモグロビンＡ０ピークとの干渉は小さく、縦切り波形処理の結果を用いて異常Ｈｂピークの面積値を取り除いてＨｂＡ１ｃの定量を実施しても誤差は小さい。

【0036】

（実施例４）
異常Ｈｂの一例としてＨｂＤが含まれている検体への適用について記載する。ＨｂＤはＨｂＳやＨｂＣより、ヘモグロビンＡ０より後ろ側の近傍にピークを有することが経験的に明らかであり、本発明はＨｂＤの検知でより効果を発揮する。

【0037】

図１１はＨｂＤが含まれている検体のクロマトグラム（全体図）である。ヘモグロビンＡ０ピークの後ろに肩状のピークがみられるが、ＨｂＤのピークトップやヘモグロビンＡ０とＨｂＤの間の谷は確認できない。図１２は本測定結果のクロマトグラムに対してサンプリングピッチの１０ｍｓｅｃ毎に時間に対する１次微分を実施した結果である。０．３５分近傍に負領域で極大点を形成している。ヘモグロビンＡ０のピークトップより遅い時間領域で大きい（＞－５００）位置（絶対値として小さい位置）にあるため異常Ｈｂの存在が示唆される。つまり１次微分の結果から負領域から正領域への変化が確認されていないことから、該位置を谷として同定することは困難であり、また自動的に縦切り波形処理を該位置で実施することも困難である。しかしながら、ヘモグロビンＡ０の溶出時間より後方の時間域で、時間軸と異なる軸の負領域に極大点が検出されたことから、該時間より後半にＨｂＤのピークが一部見られていると判断することができ、異常Ｈｂの存在を検知できる。さらに該時間より後半の一部領域のプロットデータを用いて、近似当てはめ（カーブフィッティング）を実施することが可能である。本例では、極点が確認された０．３５３８分からその１０５％である０．３７１５分までの領域に関して、非対称二重シグモイド関数による近似を実施した。図１３に得られたカーブフィッティング関数グラフ（近似曲線）をもとのクロマトグラム上に示した。異常Ｈｂの主成分の多くがヘモグロビンＡ０ピークと干渉しており、例えば肩ピークとして縦切り波形処理を実施して、その結果を用いて異常Ｈｂピークの面積値を取り除いてＨｂＡ１ｃの定量を実施すると、誤差が大きくなる。この場合には、近似当てはめにより得られた関数による積分的に換算された面積値を取り除いてＨｂＡ１ｃの定量を実施することで、誤差を小さくでき正確な定量結果を得ることができる。さらに非糖化異常ＨｂＤの近似面積から糖化異常ＨｂＤをさらに推定し、ＨｂＡ１ｃの定量計算に用いることでより正確な定量結果を得ることができる。

【0038】

異常ＨｂＤを有する検体であっても、ヘモグロビンＡ０と干渉する比率の割合は大きく異なるが、カーブフィッティングではクロマトグラムのごく一部領域のプロットデータを用いるため、干渉の比率によらず同等に異常Ｈｂピークの関数グラフを推定することが可能である。さらに送液流速を加速あるいは減速などしてＨｂＤピークの溶出を早めたり遅くしたりすることでヘモグロビンＡ０と干渉する比率の割合が変化しても、カーブフィッティングではクロマトグラムのごく一部領域のプロットデータを用いるため、干渉の比率によらず同等に異常Ｈｂピークの関数グラフを推定することが可能である。

【0039】

（実施例５）
異常Ｈｂの一例としてＨｂＥが含まれている検体への適用について記載する。ＨｂＥやＨｂＤは特にその糖化体がＨｂＡ１ｃとヘモグロビンＡ０の間の時間領域で見られることが多く、本発明はＨｂＥの検知でもより効果を発揮する。

【0040】

図１４はＨｂＥが含まれている検体のクロマトグラム（拡大図）である。ＨｂＡ１ｃとヘモグロビンＡ０の間に肩状のピークがみられるが、ＨｂＥのピークトップやＨｂＥとヘモグロビンＡ０の間の谷は確認できない。図１５は本測定結果のクロマトグラムに対してサンプリングピッチの１０ｍｓｅｃ毎に時間に対する１次微分を実施した結果である。０．３０分近傍に正領域で極小点を形成している。ＨｂＡ１ｃピークとヘモグロビンＡ０間の時間領域で小さい（＜５００）位置（絶対値として小さい位置）にあるため異常Ｈｂの存在が示唆される。つまり１次微分の結果のＨｂＡ１ｃとヘモグロビンＡ０の溶出時間の時間域で、正領域から負領域への変化が確認されていないことから、該位置を谷として同定することは困難であり、自動的に縦切り波形処理を該位置で実施することも困難である。しかしながら、ＨｂＡ１ｃとヘモグロビンＡ０の溶出時間の時間域で、時間軸と異なる軸の正領域に極小点が検出されたことから、該時間より前にＨｂＥのピークが一部見られていると判断することができ、異常Ｈｂの存在を検知できる。さらに該時間より前半の一部領域のプロットデータを用いて、カーブフィッティングを実施することが可能である。本例では、極点が確認された０．３０１６７分に関し、その９７％である０．２９２６分から１０１％である０．３０４７分までの領域に関して、非対称二重シグモイド関数による近似を実施した。非二重シグモイド関数の一般式を数１に示した。

【0041】

【数1】

【0042】

図１６に得られた近似関数をもとのクロマトグラム上に重ねて示した。異常Ｈｂの主成分の多くがヘモグロビンＡ０ピークと干渉しており、例えば肩ピークとして縦切り波形処理を実施して、その結果を用いて異常Ｈｂピークの面積値を取り除いてＨｂＡ１ｃの定量を実施すると、誤差が大きくなる。この場合には、近似当てはめにより得られた関数による積分的に換算された面積値を取り除いてＨｂＡ１ｃの定量を実施することで、誤差を小さくでき正確な定量結果を得ることができる。さらに糖化異常ＨｂＥの近似面積から非糖化異常ＨｂＥをさらに推定し、ＨｂＡ１ｃの定量計算に用いることでより正確な定量結果を得ることができる。

【0043】

（実施例６）
実施例５で定量した異常Ｈｂの一例としてＨｂＥが含まれている検体の表示方法について記載する。

【0044】

測定者あるいは作業者は、前述したカーブフィッティングにより得られた関数グラフの表示または非表示を切り替えることが可能である。図１７は表示部に示されたクロマトグラム結果表示の一例である。クロマト表示部（１００２）の領域や異常Ｈｂ出現部（１００３）、あるいは異常Ｈｂが検知したことを示すフラグメッセージ部（１００４）などのいずれかを選択することでカーブフィッティングにより得られた関数グラフをクロマトグラム結果上に表示あるいは非表示することができる。表示部が入力部を兼ねたタッチパネル式ディスプレイであれば、前記領域をタッチ、タップ、ピンチ、長押しあるいはスワイプ動作など実施することで切り替えを実施することが可能である。

【符号の説明】

【0045】

３０１・・・溶離液第一液
３０２・・・溶離液第二液
３０３・・・溶離液第三液
３０４・・・脱気ユニット
３０５ａ、ｂ、ｃ・・・電磁弁
３０６・・・送液ポンプ
３０７・・・サンプラーユニット（オートサンプラー）
３０８・・・分析カラム
３０９・・・検出ユニット（検出器）
１００１・・・結果表示領域
１００２・・・クロマトグラム表示領域
１００３・・・異常Ｈｂ出現部
１００４・・・フラグメッセージ部

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】