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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-09-25
(45)【発行日】2024-10-03
(54)【発明の名称】生体組織損傷の修復剤の製造方法および生体組織損傷の修復剤
(51)【国際特許分類】
A61K 35/28 20150101AFI20240926BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240926BHJP
A61P 1/02 20060101ALI20240926BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20240926BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20240926BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20240926BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20240926BHJP
A61P 11/04 20060101ALI20240926BHJP
A61P 13/12 20060101ALI20240926BHJP
A61P 17/02 20060101ALI20240926BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20240926BHJP
A61P 19/08 20060101ALI20240926BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20240926BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20240926BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20240926BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240926BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20240926BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240926BHJP
C12N 5/0775 20100101ALI20240926BHJP
【ＦＩ】
A61K35/28
A61K48/00
A61P1/02
A61P1/16
A61P3/10
A61P9/10
A61P9/10 101
A61P11/00
A61P11/04
A61P13/12
A61P17/02
A61P19/02
A61P19/08
A61P25/00
A61P25/28
A61P27/02
A61P35/00
A61P37/02
A61P43/00 105
C12N5/0775
【請求項の数】
3
(21)【出願番号】P 2021549037
(86)(22)【出願日】2020-09-25
(86)【国際出願番号】 JP2020036252
(87)【国際公開番号】W WO2021060460
(87)【国際公開日】2021-04-01
【審査請求日】2022-03-17
(31)【優先権主張番号】P 2019175648
(32)【優先日】2019-09-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【権利譲渡・実施許諾】特許権者において、権利譲渡・実施許諾の用意がある。
(73)【特許権者】
【識別番号】503328193
【氏名又は名称】株式会社ツーセル
(73)【特許権者】
【識別番号】504136568
【氏名又は名称】国立大学法人広島大学
(74)【代理人】
【識別番号】110000338
【氏名又は名称】弁理士法人 ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ
(72)【発明者】
【氏名】加藤 幸夫
(72)【発明者】
【氏名】前田 悟
(72)【発明者】
【氏名】辻 紘一郎
(72)【発明者】
【氏名】邵 金昌
(72)【発明者】
【氏名】中島 歩
(72)【発明者】
【氏名】正木 崇生
(72)【発明者】
【氏名】土井 盛博
(72)【発明者】
【氏名】石内 直樹
【審査官】濱田 光浩
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１４／２０００６８（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１８／１２３９６８（ＷＯ，Ａ１）
【文献】KOJIMA, Yuichi et al.，Regenerative Therapy，2019年09月20日，Vol. 11，p. 269-281，https://doi.org/10.1016/j.reth.2019.08.005
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３５／２８
Ａ６１Ｋ ４８／００
Ａ６１Ｐ １／０２
Ａ６１Ｐ １／１６
Ａ６１Ｐ ３／１０
Ａ６１Ｐ ９／１０
Ａ６１Ｐ １１／００
Ａ６１Ｐ １１／０４
Ａ６１Ｐ １３／１２
Ａ６１Ｐ １７／０２
Ａ６１Ｐ １９／０２
Ａ６１Ｐ １９／０８
Ａ６１Ｐ ２５／００
Ａ６１Ｐ ２５／２８
Ａ６１Ｐ ２７／０２
Ａ６１Ｐ ３５／００
Ａ６１Ｐ ３７／０２
Ａ６１Ｐ ４３／００
Ｃ１２Ｎ ５／０７７５
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
無血清培地中において間葉系幹細胞を１％以下の酸素濃度で培養する工程と、上記工程によって得られた無血清培地を回収した後、当該無血清培地を有効成分として用いて生体組織損傷の修復剤を調製する工程と、を有することを特徴とする、生体組織損傷の修復剤の製造方法。
【請求項2】
上記無血清培地は、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、少なくとも１つのリン脂質、および、少なくとも１つの脂肪酸を含有しているものであることを特徴とする、請求項１に記載の製造方法。
【請求項3】
上記培養する工程では、間葉系幹細胞を少なくとも１回継代することを特徴とする、請求項１または２に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、生体組織損傷の修復剤の製造方法および生体組織損傷の修復剤に関する。
【背景技術】
【0002】
間葉系幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ：ＭＳＣ）は、骨髄、脂肪、滑膜、歯髄、および歯根膜等の組織からだけでなく、胎盤、臍帯血、および臍帯等の種々の組織からも単離することができる細胞であって、しかも生体外で培養して増殖させることができる細胞である。さらに、間葉系幹細胞は、間葉系の細胞（例えば、骨芽細胞、脂肪細胞、および軟骨細胞）だけでなく、非間葉系の細胞（例えば、神経前駆細胞、および肝細胞）に分化可能な、多分化能を有することから、再生医療または／および細胞治療に用いられる細胞を製造するための原料としての利用が期待されている。
【0003】
間葉系幹細胞の培養手段として、例えばウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ、ＦＢＳ）を含有する培地（血清培地）を用いる他に、異種動物由来のタンパク質の混入が少ない培地（無血清培地）を用いる手法が挙げられる。例えば、特許文献１～３には、間葉系幹細胞の培養に用いられる無血清培地が記載されている。
【0004】
間葉系幹細胞が有する機能は多種多様であって、未知の機能が多く存在することが期待されている。それ故に、間葉系幹細胞が有する未知の機能を見出そうとする試みがなされている。例えば、特許文献４には、無血清培地中で培養された間葉系幹細胞を含有している生体組織損傷の修復剤、および、当該修復剤の製造方法が記載されている。当該技術では、大気程度の通常酸素濃度にて間葉系幹細胞を培養し、当該間葉系幹細胞を修復剤の有効成分として用いている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【文献】国際公開第２００７／０８０９１９号公報
【文献】国際公開第２０１１／１１１７８７号公報
【文献】国際公開第２０１５／０１６３５７号公報
【文献】国際公開第２０１８／１２３９６８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
特許文献４に記載の生体組織損傷の修復剤は十分な治療効果を有するものであるが、更に治療効果の高い生体組織損傷の修復剤が得られれば医療分野において有効である。
【0007】
そこで、本発明の一態様は、従来の生体組織損傷の修復剤よりも、生体組織損傷の修復効果が著しく高い、新たな生体組織損傷の修復剤、および、当該修復剤の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
上記の課題を解決するために、本発明の一態様に係る生体組織損傷の修復剤の製造方法は、無血清培地中において間葉系幹細胞を５％未満の酸素濃度で培養する工程を有する。
【0009】
本発明の一態様に係る生体組織損傷の修復剤の製造方法では、上記無血清培地は、ＦＧＦ（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、ＰＤＧＦ（ｐｌａｔｅｌｅｔ ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、ＥＧＦ（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、少なくとも１つのリン脂質、および、少なくとも１つの脂肪酸を含有しているものである。
【0010】
本発明の一態様に係る生体組織損傷の修復剤の製造方法は、上記培養する工程では、間葉系幹細胞を少なくとも１回継代する。
【0011】
上記の課題を解決するために、本発明の一様態に係る生体組織損傷の修復剤は、５％以上の酸素濃度にて血清含有培地中で培養した間葉系幹細胞と比較して、ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ－ｌｉｋｅ ４をコードする遺伝子、Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ ３をコードする遺伝子、ｄｅｌｔａ－ｌｉｋｅ ２ ｈｏｍｏｌｏｇ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）をコードする遺伝子、Ｆｒｕｃｔｏｓｅ－Ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ａｌｄｏｌａｓｅ Ｃをコードする遺伝子、ＴＲＰＭ８ ｃｈａｎｎｅｌ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒ ２をコードする遺伝子、および、ＲＥＳＴ ｃｏｒｅｐｒｅｓｓｏｒ ２をコードする遺伝子の発現量が少なくとも３倍以上である間葉系幹細胞を含有している。
【0012】
本発明の一態様に係る生体組織損傷の修復剤は、（ｉ）生体組織の線維化を抑制するためのもの、（ｉｉ）炎症細胞の浸潤を抑制するためのもの、または、（ｉｉｉ）マクロファージの活性を制御するためのものである。
【0013】
本発明の一態様に係る生体組織損傷の修復剤において、上記生体組織損傷は、急性腎障害、慢性腎臓病、慢性腎不全、慢性糸球体腎炎、糖尿病性腎症、腎硬化症、急速進行性糸球体腎炎、多発性嚢胞腎、尿細管間質性腎炎、薬剤性腎炎、ループス腎炎、水腎症、痛風腎、肝硬変、肺線維症、熱傷、間質性肺炎、薬剤性肺炎、放射線肺臓炎、慢性閉塞性肺疾患、急性呼吸促進症候群、軟骨損傷、骨欠損、脊髄損傷、歯周病、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、クローン病、糖尿病、動脈硬化、心筋梗塞、脳卒中、アルツハイマー病、黄斑変性症、ウイルス性肝炎、アルコール性肝炎、非アルコール性脂肪肝炎、顎骨再建、口蓋裂、骨置換材、骨欠損、骨系統疾患、ドライアイ、角膜障害、咽頭炎、関節炎、癌、癌周囲線維化、または、線維症に伴う組織損傷である。
【発明の効果】
【0014】
本発明の一実施形態によれば、無血清培地を用いて大気程度の通常酸素濃度にて培養した間葉系幹細胞を含む生体組織損傷の修復剤よりも、生体組織損傷の修復効果が著しく高い、新たな生体組織損傷の修復剤、および、当該修復剤の製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1】本発明の一実施例における、ウエスタンブロット法によるα－ＳＭＡの検出結果を示す像である。
【図2】本発明の一実施例における、α－ＳＭＡ、Ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅＩ、およびＣｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅＩＩＩの免疫染色結果の像である。
【図3】本発明の一実施例における、ウエスタンブロット法によるα－ＳＭＡの検出結果を示す像である。
【図4】本発明の一実施例における、ウエスタンブロット法によるα－ＳＭＡの検出結果を示す像である。
【図5】本発明の一実施例における、修復剤として用いるヒト骨髄由来間葉系幹細胞に発現する表面抗原の発現量を対比したグラフである。
【図6】本発明の一実施例における、酸素濃度が異なる条件下にて、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞におけるＶＥＧＦおよびＨＧＦの発現量を対比したグラフである。
【図7】本発明の一実施例における、培養時間が異なる条件下にて、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞におけるＶＥＧＦの発現量を対比したグラフである。
【図8】本発明の一実施例における、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞に発現する遺伝子の発現量を対比したグラフである。
【図9】本発明の一実施例における、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞の細胞数を対比したグラフである。
【図10】本発明の一実施例における、培地および酸素濃度が異なる条件下にて、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞におけるＶＥＧＦおよびＨＧＦの発現量を対比したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0016】
本発明の実施の形態について以下に説明する。本発明は、以下に説明する各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態または実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態および実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考文献として援用される。また、本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ～Ｂ」は、「Ａ以上、Ｂ以下」を意図する。
【0017】
〔１．修復剤の製造方法〕
本発明の一実施形態に係る生体組織損傷の修復剤の製造方法（以下、「本実施形態の製造方法」とも称する）は、無血清培地中において間葉系幹細胞を５％未満の酸素濃度で培養する工程を有する。
本発明の一実施形態に係る生体組織損傷の修復剤の製造方法（以下、「本実施形態の製造方法」とも称する）は、無血清培地中において間葉系幹細胞を５％未満の酸素濃度で培養する工程を有する。
【0018】
上記無血清培地の組成は、間葉系幹細胞の培養を行い得る無血清培地であれば特に限定されず、公知の無血清培地が適宜使用され得る。公知の無血清培地としては、例えばＳＴＫ１（株式会社ツーセル）、ＳＴＫ２（株式会社ツーセル）、ヒト間葉系幹細胞専用完全合成培地キット（ＭＳＣＧＭ－ＣＤ ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ）（Ｌｏｎｚａ）、間葉系幹細胞増殖培地ＤＸＦ：Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ ＤＸＦ （Ｒｅａｄｙ－ｔｏｕｓｅ）（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ ＧｍｂＨ．）、Ｓｔｅｍ Ｐｒｏ ＭＳＣ ＳＦＭ Ｘｅｎｏ ｆｒｅｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）、および、ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ－ＡＣＦ Ｍｅｄｉｕｍ Ｋｉｔ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）等を用いることができる。
【0019】
上記無血清培地の具体的な組成としては、例えば、（ｉ）ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、少なくとも１つのリン脂質、および、少なくとも１つの脂肪酸を含有している無血清培地、（ｉｉ）ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦ－β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－β）、少なくとも１つのリン脂質、および、少なくとも１つの脂肪酸を含有している無血清培地、（ｉｉｉ）ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、デキサメタゾン、インスリン、血清アルブミン、少なくとも１つのリン脂質、および、少なくとも１つの脂肪酸を含有している無血清培地、（ｉＶ）ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦ－β、デキサメタゾン、インスリン、血清アルブミン、少なくとも１つのリン脂質、および、少なくとも１つの脂肪酸を含有している無血清培地を挙げることができる。なお、無血清培地がデキサメタゾン、インスリンおよび血清アルブミンの少なくとも何れか１つを含有していれば、間葉系幹細胞の生存期間の延長、および間葉系幹細胞の増殖亢進という効果を奏する。
【0020】
なお、上記（ｉ）および（ｉｉｉ）の無血清培地は、ＴＧＦ－β、および／または、ＨＧＦを含有していないものであってもよい。また、上記（ｉｉ）および（ｉｖ）の無血清培地は、ＨＧＦを含有していないものであってもよい。
【0021】
上記リン脂質としては、特に限定されず、例えば、フォスファチジン酸、リゾフォスファチジン酸、フォスファチジルイノシトール、フォスファチジルセリン、フォスファチジルエタノールアミン、フォスファチジルコリン、およびフォスファチジルグリセロール等が挙げられ、これらのリン脂質を単独で用いてもよいし、組み合わせて（例えば、フォスファチジン酸とフォスファチジルコリンとを組み合わせて）用いてもよい。これらのリン脂質は、動物由来のものであっても、植物由来のものであってもよい。
【0022】
上記脂肪酸としては、特に限定されず、例えば、リノール酸、オレイン酸、リノレイン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸、パルミトイル酸、パルミチン酸、およびステアリン酸等が挙げられ、これらの脂肪酸を単独で用いてもよいし、組み合わせて用いてもよい。
【0023】
本実施形態において使用される無血清培地は、任意で、上述した組成以外の成分（例えば、コレステロール、および／または、ＨＧＦ（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）等）を含有していてもよい。後述する基礎培地に対するＨＧＦの含有量は、終濃度で、０．１～５０ｎｇ／ｍｌであることが好ましく、さらに好ましくは５ｎｇ／ｍｌである。勿論、これらの成分は、本願発明にとって必須の成分ではない。
【0024】
以下に、本実施形態の製造方法をより具体的に説明する。
【0025】
（Ａ．前培養工程）
本実施形態の製造方法では、無血清培地（例えば、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ－β、ＥＧＦ、少なくとも１つのリン脂質、および少なくとも１つの脂肪酸を含有する無血清培地、より好ましくは、デキサメタゾン、インスリンおよび血清アルブミンの少なくとも何れか１つをさらに含有する無血清培地）において、間葉系幹細胞を培養してもよい（以下、「前培養工程」と称する）。なお、当該前培養工程は、本発明にとって必須ではない。当該構成によれば、生体組織損傷の修復能が向上した間葉系幹細胞を効率よく大量に得ることができる。なお、無血清培地は、ＨＧＦを含有していないものであってもよく、ＤＭＥＭ培地などの基礎培地であってもよい。
本実施形態の製造方法では、無血清培地（例えば、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ－β、ＥＧＦ、少なくとも１つのリン脂質、および少なくとも１つの脂肪酸を含有する無血清培地、より好ましくは、デキサメタゾン、インスリンおよび血清アルブミンの少なくとも何れか１つをさらに含有する無血清培地）において、間葉系幹細胞を培養してもよい（以下、「前培養工程」と称する）。なお、当該前培養工程は、本発明にとって必須ではない。当該構成によれば、生体組織損傷の修復能が向上した間葉系幹細胞を効率よく大量に得ることができる。なお、無血清培地は、ＨＧＦを含有していないものであってもよく、ＤＭＥＭ培地などの基礎培地であってもよい。
【0026】
前培養工程にて間葉系幹細胞を培養するときの酸素濃度は、特に限定されない。例えば、２１％以下の酸素濃度、または、５％以下の酸素濃度であってもよい。当該酸素濃度の下限値は、特に限定されず、例えば、１％、３％、５％、１０％、または、２０％であり得る。
【0027】
前培養工程に用いる無血清培地を構成するための基礎培地は、当該分野において周知の動物細胞用培地であれば特に限定されず、好ましい基礎培地としては、例えば、Ｈａｍ’ｓＦ１２培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ－１６４０培地、ＭＣＤＢ培地等が挙げられる。これらの基礎培地は、単独で使用されても、複数を混合して使用されてもよい。一実施形態において、無血清培地を構成するための基礎培地は、ＭＣＤＢとＤＭＥＭとを１：１の比率で混合した培地が好ましい。一実施形態において、上記の基礎培地に、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、少なくとも１つのリン脂質、および少なくとも１つの脂肪酸を添加した無血清培地を前培養工程に用いればよい。
【0028】
基礎培地に対するＦＧＦの含有量は、終濃度で、０．１～１００ｎｇ／ｍｌであることが好ましく、さらに好ましくは３ｎｇ／ｍｌである。基礎培地に対するＰＤＧＦの含有量は、終濃度で、０．５～１００ｎｇ／ｍｌであることが好ましく、さらに好ましくは１０ｎｇ／ｍｌである。基礎培地に対するＥＧＦの含有量は、終濃度で、０．５～２００ｎｇ／ｍｌであることが好ましく、さらに好ましくは２０ｎｇ／ｍｌである。基礎培地に対するリン脂質の総含有量は、終濃度で、０．１～３０μｇ／ｍｌであることが好ましく、さらに好ましくは１０μｇ／ｍｌである。基礎培地に対する脂肪酸の総含有量は、基礎培地の重量の１／１０００～１／１０であることが好ましく、さらに好ましくは１／１００である。
【0029】
基礎培地に対するデキサメタゾンの含有量は、終濃度で、１０－１０～１０－５Ｍであることが好ましく、更に好ましくは１０－９～１０－６Ｍである。基礎培地に対するインスリンの含有量は、終濃度で、０．０１～５００μｇ／ｍｌであることが好ましく、更に好ましくは０．１～５０μｇ／ｍｌである。基礎培地に対する血清アルブミンの含有量は、終濃度で、０．０１～５０ｍｇ／ｍｌであることが好ましく、更に好ましくは０．１～５ｍｇ／ｍｌである。
【0030】
このような無血清培地を使用することによって、無血清培地中への異種タンパク質の混入を防ぎつつ、血清含有培地と同等以上の増殖促進効果が得られ、間葉系幹細胞を所望の通り増殖させることができる。
【0031】
無血清培地が含有しているリン脂質、および脂肪酸は、既に説明した具体的なリン脂質、および脂肪酸であり得る。
【0032】
本明細書中で使用される場合、ＦＧＦは、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ：ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）ファミリーから選択される増殖因子が意図され、ＦＧＦ－２（ｂＦＧＦ）であることが好ましいが、ＦＧＦ－１等他のＦＧＦファミリーから選択されてもよい。また、本明細書中で使用される場合、ＰＤＧＦは、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ：ｐｌａｔｅｌｅｔ ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）ファミリーから選択される増殖因子が意図され、ＰＤＧＦ－ＢＢまたはＰＤＧＦ－ＡＢであることが好ましい。
【0033】
ＥＧＦは、上皮増殖因子（ＥＧＦ：ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）ファミリーから選択される増殖因子が意図される。
【0034】
また、一実施形態において、無血清培地は、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ：ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ ｔｉｓｓｕｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ：ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）およびアスコルビン酸化合物からなる群より選択される少なくとも２つの因子をさらに含有していてもよい。
【0035】
本明細書中で使用される場合、アスコルビン酸化合物は、アスコルビン酸（ビタミンＣ）もしくはアスコルビン酸２リン酸、またはこれらに類似する化合物が意図される。
【0036】
１つの局面において、無血清培地は、脂質酸化防止剤を含有していることが好ましい。一実施形態において、無血清培地に含有される脂質酸化防止剤は、ＤＬ－α－トコフェロールアセテート（ビタミンＥ）であり得る。無血清培地は、界面活性剤をさらに含有していてもよい。一実施形態において、無血清培地に含有される界面活性剤は、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８またはＴｗｅｅｎ ８０であり得る。
【0037】
無血清培地は、インスリン、トランスフェリン、デキサメタゾン、血清アルブミンおよびセレネートをさらに含有していてもよい。本明細書中で使用される場合、インスリンは、インスリン様増殖因子であってもよく、天然の細胞由来であっても、遺伝子組換えによって製造されたものでもよい。
【0038】
前培養工程においては、上述した無血清培地に、ヒト等の動物組織から従来公知の方法により単離された間葉系幹細胞を播種し、所望の細胞数に増殖するまで培養する（勿論、前培養工程においては、間葉系幹細胞を増殖させることなく、無血清培地中に維持するのみであってもよい）。培養条件として、培地１ｍｌに対して、１～５００ｍｇの組織片（間葉系幹細胞を含む）から分離した間葉系幹細胞を播種することが好ましく、培養温度は３７℃±１℃、かつ間葉系幹細胞を培養する環境における二酸化炭素（ＣＯ２）の濃度が１０％以下であることが好ましい。
【0039】
一実施形態において、上記の基礎培地に対するＴＧＦ－βの含有量は、終濃度で、０．５～１００ｎｇ／ｍｌであることが好ましく、さらに好ましくは１０ｎｇ／ｍｌである。
【0040】
前培養工程においては、間葉系幹細胞を播種し、所望の細胞数に増殖するまで培養する。培養条件として、培地１ｍｌに対して１～２×１０４個の間葉系幹細胞を播種することが好ましく、培養温度は３７℃±１℃、かつ間葉系幹細胞を培養する環境における二酸化炭素（ＣＯ２）の濃度が５％以下であることが好ましい。
【0041】
細胞培養時間は、目的とする細胞数が十分に得られる培養時間であれば、特に限定されない。例えば、培養時間は、１～５時間であってもよいし、１～１０時間であってもよいし、１～２０時間であってもよいし、１時間～１日間であってもよいし、１時間～１０日間であってもよいし、１時間～３０日間であってもよいし、１時間～５０日間であってもよい。
【0042】
前培養工程では、培養に用いる培養容器は、間葉系幹細胞が増殖し得るものであれば特に限定されない。例えば、ファルコン社製７５ｃｍ２フラスコ、住友ベークライト社製７５ｃｍ２フラスコ等を好適に用いることができる。但し、細胞によっては、用いる培養容器の種類によって細胞の培養が影響を受ける場合がある。このため、間葉系幹細胞をより効率よく培養させるために、培養させる対象となる間葉系幹細胞（以下、「培養対象細胞」とも称する）毎に、培養に適した培養容器を用いて前培養工程を行うことが好ましい。
【0043】
前培養工程に供される間葉系幹細胞に特に制限はないが、初期の間葉系幹細胞、すなわち、ヒト等の動物組織から採取してから一度も継代培養を経ていない細胞であることが好ましい。
【0044】
また、前培養工程において間葉系幹細胞をより効率よく増殖させるために、前培養工程において培養させる対象となる間葉系幹細胞（以下、「前培養対象細胞」とも称する）毎に、培養に適した培養容器を用いて前培養工程を行うことが好ましい。前培養工程対象細胞の培養に適した培養容器の選択方法としては、例えば、最適な培養容器を前培養工程対象細胞に選択させる方法を挙げることができる。具体的に説明すると、複数種類の培養容器を準備し、培養容器の種類が異なる以外は同一の培養条件で前培養工程対象細胞を増殖させ、培養開始から２週間後の細胞数を公知の方法によって計測し、細胞数が多いものから順に前培養工程対象細胞の培養に適した培養容器であると判断することができる。また、上記前培養工程対象細胞の増殖速度が速い場合は、培養開始から２週間経過する前であっても、コンフルエント状態の８０～９０％の細胞数に達する期間が短いものから順に前培養工程対象細胞の培養に適した培養容器であると判断することができる。
【0045】
本実施形態の製造方法の前培養工程においては、前培養工程対象細胞の増殖に適した培養容器が既に明らかになっている場合は、その培養容器を用いればよい。これに対して、前培養工程対象細胞の培養に適した培養容器が明らかになっていない等の場合には、本実施形態の製造方法は、前培養工程対象細胞の培養に適した培養容器を選択するための「培養容器選択工程」を前培養工程の前にさらに包含していてもよい。
【0046】
なお、間葉系幹細胞の増殖には、細胞が培養容器に接着することが必須条件のため、培養容器に対する間葉系幹細胞の接着が弱い場合は、前培養工程において、上記無血清培地に、細胞接着分子をさらに含有させることが好ましい。上記「細胞接着分子」としては、例えば、フィブロネクチン、コラーゲン、ゼラチン等を挙げることができる。これらの細胞接着分子は、一種類を単独で用いてもよく、複数種類を組み合わせて用いてもよい。
【0047】
また、前培養工程では、間葉系幹細胞を少なくとも１回継代してもよい。間葉系幹細胞は足場依存的に増殖するので、間葉系幹細胞が局所的に偏って増殖している等の場合に、前記前培養工程の途中で間葉系幹細胞を継代することによって培養条件を改善することができる。なお、前培養工程は、初代培養（Ｐ０）～継代３回目（Ｐ３）までの期間行うことが好ましい。
【0048】
間葉系幹細胞の継代方法としては特に限定されず、従来公知の間葉系幹細胞の継代方法を用いて継代することできる。継代後の間葉系幹細胞の状態が良好であることから、上記前培養工程では、継代を行う場合に哺乳類および微生物由来の成分を含有していない細胞剥離剤を用いて上記間葉系幹細胞を剥離することが好ましい。上記「哺乳類および微生物由来の成分を含有していない細胞剥離剤」としては、例えば、ＡＣＣＵＴＡＳＥ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ, Ｉｎｃ.）を挙げることができる。
【0049】
ここで、上記「哺乳類および微生物由来の成分を含有していない細胞剥離剤」としてＡＣＣＵＴＡＳＥを用いる場合の継代方法の一例を説明する。（ｉ）～（ｖｉ）の手順によって間葉系幹細胞を剥離し、継代する。なお、以下に説明する継代方法では、培養容器としてＴ－２５フラスコ（ファルコン社）を用いた場合について説明する。
【0050】
（ｉ）フラスコ上の細胞層をＰＢＳ（－）５ｍＬを用いて洗浄する。
【0051】
（ｉｉ）細胞層にＡＣＣＵＴＡＳＥを２ｍＬ添加する。
【0052】
（ｉｉｉ）細胞層を室温にて２分程度静置し、フラスコからの細胞の剥離を確認のうえ、遠心管に剥離した細胞を含むＰＢＳ（－）を移す。
【0053】
（ｉｖ）フラスコにＰＢＳ（－）を７ｍＬ添加し、当該フラスコの底面をリンスする。
【0054】
（ｖ）上記（ｉｉｉ）の遠心管に上記（ｉｖ）の溶液を移し、１５００ｒｐｍ（２００～１０００×ｇ）で５分間遠心する。
【0055】
（ｖｉ）遠心管から上清を除き、５，０００個－細胞／ｃｍ２の播種濃度にて、無血清培地を用いて、細胞を新しいフラスコ上に播種する。
【0056】
（Ｂ．低酸素培養工程）
本実施形態の製造方法においては、上記前培養工程の後に、間葉系幹細胞を、無血清培地（例えば、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、少なくとも１つのリン脂質、および少なくとも１つの脂肪酸を含有する無血清培地、より好ましくは、デキサメタゾン、インスリンおよび血清アルブミンの少なくとも何れか１つをさらに含有する無血清培地）において、間葉系幹細胞を５％未満の酸素濃度で培養する（以下、「低酸素培養工程」と称する）。なお、無血清培地は、ＴＧＦ－β、および／または、ＨＧＦを含有していないものであってもよいし、含有しているものであってもよい。
本実施形態の製造方法においては、上記前培養工程の後に、間葉系幹細胞を、無血清培地（例えば、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、少なくとも１つのリン脂質、および少なくとも１つの脂肪酸を含有する無血清培地、より好ましくは、デキサメタゾン、インスリンおよび血清アルブミンの少なくとも何れか１つをさらに含有する無血清培地）において、間葉系幹細胞を５％未満の酸素濃度で培養する（以下、「低酸素培養工程」と称する）。なお、無血清培地は、ＴＧＦ－β、および／または、ＨＧＦを含有していないものであってもよいし、含有しているものであってもよい。
【0057】
間葉系幹細胞の培養時に当該間葉系幹細胞（より具体的に、間葉系幹細胞の培養に用いられている培地）が接触可能なガス（以下、「間葉系幹細胞を培養する環境」とも称する）に含まれる酸素の濃度は、５％未満であってもよいし、４％以下であってもよいし、３％以下であってもよいし、２％以下であってもよいし、１％以下であってもよいが、３％以下であることが好ましく、１％以下であればさらによい。上記ガスに含まれる酸素の濃度の下限値は、特に限定されず、例えば０％よりも高く設定され得る。上記ガスに含まれる酸素の濃度の下限値は、間葉系幹細胞が生育可能で死滅しない程度であればよい。
【0058】
間葉系幹細胞を培養する環境における酸素濃度が、５％未満であることにより、培養した間葉系幹細胞における生体組織損傷の修復作用（例えば、抗線維化作用、炎症細胞の浸潤抑制作用、マクロファージの活性制御作用）が増強される。
【0059】
間葉系幹細胞を培養する環境には、酸素以外のガス成分が含まれ得る。当該ガス成分は、ガス成分中で間葉系幹細胞が死滅することなく生育可能なガス成分であれば特に限定されず、大気に含まれている酸素以外のガス成分（例えば、窒素、二酸化炭素、アルゴン、またはこれらの混合物）であってもよい。
【0060】
本明細書において、酸素等のガス成分の濃度を示す「％」は、より具体的に「体積％」を意図している。
【0061】
間葉系幹細胞の培養に用いるガスについては、間葉系幹細胞を培養する際に通常用いられるインキュベータ等の機器の内部に当該ガスを満たしてもよいし、インキュベータ等の機器の内部に気密性の容器を設置し、当該容器の内部に当該ガスを満たしてもよいし、インキュベータ等の機器を囲うように気密性の容器（例えば、部屋）を設置し、当該気密性の容器の内部に当該ガスを満たしてもよい。なお、当該ガスは、培地のｐＨを調整するため、二酸化炭素（ＣＯ２）を５％程度含むことが好ましい。
【0062】
ここで、低酸素培養工程における「無血清培地」は、ＴＧＦ－βを含有していてもよい。本明細では前培養工程で使用する無血清培地を「無血清培地Ａ」と称し、低酸素培養工程で使用する無血清培地を「無血清培地Ｂ」と称する場合がある。ＴＧＦ－β以外の成分（ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、デキサメタゾン、インスリン、血清アルブミン、少なくとも１つのリン脂質、および少なくとも１つの脂肪酸等）および基礎培地については、上記前培養工程の項で無血清培地Ａに関して説明したとおりであるので、ここでは説明を省略する。また、前培養工程で使用する無血清培地Ａに含有されている上記成分の含有量は、無血清培地Ｂに関して説明した含有量と同じであり得る。なお、無血清培地Ａとして、無血清培地Ｂを用いてよい。
【0063】
低酸素培養工程における培養時間は、間葉系幹細胞が目的とする細胞数に達する培養時間であれば、特に限定されない。例えば、培養時間は、６～１２時間であってもよいし、６時間～２４時間（１日間）であってもよいし、６時間～４８時間であってもよいし、１２時間～２４時間であってもよいし、２４時間～４８時間であってもよいが、１２時間以上であることが好ましく、２４時間であればさらによい。
【0064】
低酸素培養工程対象細胞の増殖に適した培養容器の選択方法としては、上記「前培養工程」の項で説明したとおりであるのでここでは説明を省略する。
【0065】
また、培養容器に対する間葉系幹細胞の接着が弱い場合には、上記無血清培地Ｂに、細胞接着分子をさらに含有させてもよい。上記細胞接着分子については、上記「前培養工程」の項で説明したとおりであるのでここでは説明を省略する。
【0066】
低酸素培養工程では、間葉系幹細胞を少なくとも１回継代してもよい。低酸素培養工程の途中で間葉系幹細胞を継代することによって培養条件を改善することができる。
【0067】
なお、低酸素培養工程には、ヒト等の動物組織から採取してから継代１回目（Ｐ１）以降の間葉系幹細胞を供することが好ましい。
【0068】
上記低酸素培養工程の途中で間葉系幹細胞を継代する方法および前培養工程後の細胞を低酸素培養工程に供する際の継代方法については、上記「前培養工程」の項で説明したとおりであるのでここでは説明を省略する。
【0069】
本実施の形態の製造方法は、上記低酸素培養工程の前（または上記前培養工程の前）に、間葉系幹細胞の増殖に適した培養容器を選択する培養容器選択工程をさらに包含していてもよい。間葉系幹細胞の増殖に適した培養容器の選択方法としては、上記「前培養工程」の項で説明したとおりであるのでここでは説明を省略する。
【0070】
（Ｃ．スクリーニング工程）
本実施形態の製造方法は、前培養工程および／または低酸素培養工程の後に、間葉系幹細胞から、造腫瘍性を有していない間葉系幹細胞をスクリーニングするスクリーニング工程をさらに包含していてもよく、スクリーニング工程を包含しなくてもよい。
本実施形態の製造方法は、前培養工程および／または低酸素培養工程の後に、間葉系幹細胞から、造腫瘍性を有していない間葉系幹細胞をスクリーニングするスクリーニング工程をさらに包含していてもよく、スクリーニング工程を包含しなくてもよい。
【0071】
スクリーニング工程にて選別した間葉系幹細胞を修復剤として使用することによって、造腫瘍性を有していない間葉系幹細胞を含有している修復剤を実現することができ、修復剤の安全性を向上させることができる。
【0072】
スクリーニング工程では、間葉系幹細胞の造腫瘍性について、ｉｎ ｖｉｖｏの高感度免疫不全マウス（ＮＯＧマウス）による造腫瘍性試験法により検討することが可能である。
【0073】
具体的には、上述した無血清培地において５％未満の酸素濃度で培養した間葉系幹細胞（例えば、１,０００,０００個）、および、Ｈｅｌａ細胞（例えば、１,０００個）を、各々、ＮＯＧマウスの皮下１０ヵ所に移植する。このとき、Ｈｅｌａ細胞の造腫瘍性（具体的には、移植箇所における腫瘍の発生）が確認できる条件下（例えば、特定のマウス飼育時間等）において、無血清培地で培養した間葉系幹細胞の造腫瘍性が確認できなければ、当該間葉系幹細胞は、造腫瘍性を有していない間葉系幹細胞であると判定することができる。
【0074】
〔２．生体組織損傷の修復剤〕
本発明の一実施形態にかかる生体組織損傷の修復剤（以下、「本実施形態の修復剤」とも称する）は、５％以上の酸素濃度にて血清含有培地中で培養した間葉系幹細胞と比較して、ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ－ｌｉｋｅ ４（または、そのホモログ）をコードする遺伝子、Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ ３（または、そのホモログ）をコードする遺伝子、ｄｅｌｔａ－ｌｉｋｅ ２ ｈｏｍｏｌｏｇ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）をコードする遺伝子、Ｆｒｕｃｔｏｓｅ－Ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ａｌｄｏｌａｓｅ Ｃ（または、そのホモログ）をコードする遺伝子、ＴＲＰＭ８ ｃｈａｎｎｅｌ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒ ２（または、そのホモログ）をコードする遺伝子、および、ＲＥＳＴ ｃｏｒｅｐｒｅｓｓｏｒ ２（または、そのホモログ）をコードする遺伝子の発現量が少なくとも３倍以上（好ましくは、各遺伝子独立して、３倍以上、４倍以上、５倍以上、１０倍以上、２０倍以上、４０倍以上、または５０倍以上）である間葉系幹細胞を含有している。
本発明の一実施形態にかかる生体組織損傷の修復剤（以下、「本実施形態の修復剤」とも称する）は、５％以上の酸素濃度にて血清含有培地中で培養した間葉系幹細胞と比較して、ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ－ｌｉｋｅ ４（または、そのホモログ）をコードする遺伝子、Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ ３（または、そのホモログ）をコードする遺伝子、ｄｅｌｔａ－ｌｉｋｅ ２ ｈｏｍｏｌｏｇ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）をコードする遺伝子、Ｆｒｕｃｔｏｓｅ－Ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ａｌｄｏｌａｓｅ Ｃ（または、そのホモログ）をコードする遺伝子、ＴＲＰＭ８ ｃｈａｎｎｅｌ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒ ２（または、そのホモログ）をコードする遺伝子、および、ＲＥＳＴ ｃｏｒｅｐｒｅｓｓｏｒ ２（または、そのホモログ）をコードする遺伝子の発現量が少なくとも３倍以上（好ましくは、各遺伝子独立して、３倍以上、４倍以上、５倍以上、１０倍以上、２０倍以上、４０倍以上、または５０倍以上）である間葉系幹細胞を含有している。
【0075】
また、本実施形態の修復剤は、１％以下の酸素濃度にて血清含有培地中で培養した間葉系幹細胞と比較して、ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ－ｌｉｋｅ ４（または、そのホモログ）をコードする遺伝子、Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ ３（または、そのホモログ）をコードする遺伝子、ｄｅｌｔａ－ｌｉｋｅ ２ ｈｏｍｏｌｏｇ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）をコードする遺伝子、Ｆｒｕｃｔｏｓｅ－Ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ａｌｄｏｌａｓｅ Ｃ（または、そのホモログ）をコードする遺伝子、ＴＲＰＭ８ ｃｈａｎｎｅｌ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒ ２（または、そのホモログ）をコードする遺伝子、および、ＲＥＳＴ ｃｏｒｅｐｒｅｓｓｏｒ ２（または、そのホモログ）をコードする遺伝子の発現量が少なくとも２倍以上（好ましくは、各遺伝子独立して、３倍以上、４倍以上、５倍以上、１０倍以上、または１５倍以上）である間葉系幹細胞を含有している。
【0076】
さらに、本実施形態の修復剤は、５％以上の酸素濃度にて無血清培地で培養した間葉系幹細胞と比較して、ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ－ｌｉｋｅ ４（または、そのホモログ）をコードする遺伝子、Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ ３（または、そのホモログ）をコードする遺伝子、ｄｅｌｔａ－ｌｉｋｅ ２ ｈｏｍｏｌｏｇ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）をコードする遺伝子、Ｆｒｕｃｔｏｓｅ－Ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ａｌｄｏｌａｓｅ Ｃ（または、そのホモログ）をコードする遺伝子、ＴＲＰＭ８ ｃｈａｎｎｅｌ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒ ２（または、そのホモログ）をコードする遺伝子、および、ＲＥＳＴ ｃｏｒｅｐｒｅｓｓｏｒ ２（または、そのホモログ）をコードする遺伝子の発現量が２倍以上（好ましくは、各遺伝子独立して、３倍以上、４倍以上、５倍以上、７倍以上、または１０倍以上）である間葉系幹細胞を含有している。換言すれば、本発明の一実施形態に係る生体組織損傷の修復剤は、無血清培地中において５％未満の酸素濃度で培養した間葉系幹細胞を含有していてもよい。
【0077】
ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ－ｌｉｋｅ ４は、糖質代謝および脂質代謝に関与するタンパク質であり、ヒトではＡＮＧＰＴＬ４遺伝子によってコードされる。
【0078】
Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ ３は、脂肪酸結合タンパク質であり、ヒトではＦＡＢＰ３遺伝子によってコードされる。
【0079】
ｄｅｌｔａ－ｌｉｋｅ ２ Ｈｈｏｍｏｌｏｇ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）は、上皮成長因子様タンパク質であり、ＤＬＫ２遺伝子によってコードされる。
【0080】
Ｆｒｕｃｔｏｓｅ－Ｂｉｓｐｈａｔｅ Ａｌｄｏｌａｓｅ Ｃは、Ｃ型アルドラーゼであり、ヒトではＡＬＤＯＣ遺伝子によってコードされる。
【0081】
ＴＲＰＭ８ ｃｈａｎｎｅｌ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒ ２は、ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｍｅｌａｓｔａｔｉｎ ｍｅｍｂｅｒ ８（ＴＲＰＭ８）を調節するタンパク質であり、ヒトではＴＣＡＦ２遺伝子によってコードされる。
【0082】
ＲＥＳＴ ｃｏｒｅｐｒｅｓｓｏｒ ２は、ニューロンの遺伝子発現を調節するタンパク質であり、ヒトではＲＣＯＲ２遺伝子によってコードされる。
【0083】
ここで、本実施形態の修復剤は、生体組織損傷の修復を促進する効果を有する薬剤を意図する。本実施形態の修復剤は、生体組織の線維化を抑制するための薬剤（換言すれば、線維化抑制剤）であるともいえ、また炎症細胞の浸潤を抑制するための薬剤（換言すれば、炎症細胞の浸潤抑制剤）であるともいえ、マクロファージの活性を制御するための薬剤（換言すれば、マクロファージ活性制御剤）であるともいえる。
【0084】
ここで「生体組織の線維化を抑制する」とは、結合組織の異常増殖あるいは結合組織でのコラーゲンの異常蓄積による組織硬化を抑制することを意図する。例えば、生体組織が損傷を受けると、治癒の過程において、生体組織を構成する結合組織が異常増殖する場合がある。「生体組織の線維化を抑制する」とは、例えば、生体組織が損傷を受けた後に、生体組織を構成する結合組織が異常増殖、あるいは結合組織でのコラーゲンの異常蓄積による組織硬化を抑制することを意図する。
【0085】
ここで「炎症細胞の浸潤を抑制する」とは、炎症細胞（例えば、マクロファージ、リンパ球、および好中球等）が、組織を破壊すること、または、組織の中に侵入して増殖することを抑制することを意図する。
【0086】
ここで「マクロファージ活性を制御する」とは、マクロファージの表現型を変化させることを意図する。「マクロファージ活性を制御する」とは、例えば、マクロファージを、組織の炎症を促進するＰｒｏ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ（Ｍ１型）マクロファージから、Ｉｍｍｕｎｅ－ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ（Ｍ２型）マクロファージへ変化させることを意図する。マクロファージをＭ１型からＭ２型へ変化させることにより、一例として、組織の炎症を鎮静化させることもできる。
【0087】
また、間葉系幹細胞を培養する場合には、単一の無血清培地中でのみ間葉系幹細胞を培養してもよいし、複数の無血清培地中で間葉系幹細胞を培養してもよい。複数の無血清培地中で間葉系幹細胞を培養する場合には、例えば、所望の無血清培地中で間葉系幹細胞を培養した後、当該所望の無血清培地を別の無血清培地に置換して、更に、当該別の無血清培地中で間葉系幹細胞を培養してもよい。
【0088】
上記無血清培地の組成は、上述した〔１．修復剤の製造方法〕の項にて説明したので、ここではその説明を省略する。
【0089】
本実施形態の修復剤に用いられる間葉系幹細胞は、骨髄、脂肪、滑膜、歯髄、および歯根膜等の組織から単離された間葉系幹細胞だけでなく、胎盤、臍帯血、および臍帯等の組織から単離された間葉系幹細胞をも包含する。より修復作用が高い修復剤を実現する観点から、脂肪から単離された間葉系幹細胞が好ましい。また、本実施の形態の修復剤に用いられる間葉系幹細胞は、ヒト間葉系幹細胞（例えば、採取されたヒト間葉系幹細胞）であってもよいし、ラット、および対象とする生体組織は、特に限定されず、例えば、腎臓、肝臓、肺、皮膚、軟骨、骨、脊髄、歯、関節、血管（動脈、および、静脈）、心臓、脳、顎、口、目、角膜、および、咽頭を挙げることができる。つまり、上記修復剤は、これらの生体組織の損傷を修復するものであり得る。
【0090】
本発明に用いる間葉系幹細胞は、無血清培地を用いて大気程度の通常酸素濃度にて培養した間葉系幹細胞に比べて著しく高い、組織線維化抑制効果、炎症細胞浸潤抑制効果および炎症促進型マクロファージ（Ｍ１）を炎症抑制型マクロファージ（Ｍ２）に変化させる効果を有する。
【0091】
上記修復剤が効能を奏する、生体組織損傷を伴う病態としては、特に限定されない。病態として、例えば、急性腎障害、慢性腎臓病、慢性腎不全、慢性糸球体腎炎（ＩｇＡ腎症、膜性腎症、膜性増殖性糸球体腎炎、巣状糸球体硬化症など）、その他の腎臓病（例えば、糖尿病性腎症、腎硬化症、急速進行性糸球体腎炎、多発性嚢胞腎、尿細管間質性腎炎、薬剤性腎炎、ループス腎炎、水腎症、通風腎など）、肝硬変、肺線維症、熱傷、間質性肺炎、薬剤性肺炎、放射線肺臓炎、慢性閉塞性肺疾患、急性呼吸促進症候群、軟骨損傷、骨欠損、脊髄損傷、歯周病、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、クローン症、糖尿病、動脈硬化、心筋梗塞、脳卒中、アルツハイマー病、黄斑変性症、ウイルス性肝炎、アルコール性肝炎、非アルコール性脂肪肝炎、顎骨再建、口蓋裂、骨置換材、骨欠損、骨系統疾患、ドライアイ、角膜障害、咽頭炎、関節炎、癌、癌周囲線維化、または、線維症等が挙げられる。
【0092】
本実施形態の修復剤は、５％以上の酸素濃度にて血清含有培地中で培養した間葉系幹細胞と比較して、ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ－ｌｉｋｅ ４をコードする遺伝子、Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ ３をコードする遺伝子、ｄｅｌｔａ－ｌｉｋｅ ２ ｈｏｍｏｌｏｇ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）をコードする遺伝子、Ｆｒｕｃｔｏｓｅ－Ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ａｌｄｏｌａｓｅ Ｃをコードする遺伝子、ＴＲＰＭ８ ｃｈａｎｎｅｌ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒ ２をコードする遺伝子、および、ＲＥＳＴ ｃｏｒｅｐｒｅｓｓｏｒ ２をコードする遺伝子の発現量が少なくとも３倍以上である間葉系幹細胞の他に、薬学的に許容される添加剤（例えば、緩衝剤、酸化防止剤、増粘剤、および、賦形剤）を含み得る。
【0093】
上記添加剤の量は、特に限定されないが、例えば、本実施形態の修復剤の０．０１～５０重量％、０．０１～４０重量％、０．０１～３０重量％、０．０１～２０重量％、０．０１～１０重量％、または、０．０１～１重量％であり得る。
【0094】
本実施形態の修復剤に含まれる間葉系幹細胞の数は、特に限定されず、投与対象の体重に応じて適宜設定することが可能である。例えば、１服（１投与）あたり、１×１０２細胞～１×１０１０細胞、１×１０３細胞～１×１０１０細胞、１×１０４細胞～１×１０１０細胞、１×１０５細胞～１×１０１０細胞、１×１０６細胞～１×１０１０細胞であり得る。勿論、１服（投与）あたり、１０１０細胞以上であってもよい。
【0095】
上記修復剤の投与方法として、例えば、血管注射、および局所（脊髄（例えば、脊髄腔）、筋肉、関節、脳等）への注射が挙げられる。
【0096】
本発明の一実施形態に係る生体組織損傷の修復剤の投与対象は、特に限定されない。上記投与対象として、ヒトおよびヒト以外の哺乳類（ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ラット等）が挙げられる。
【0097】
本実施形態の修復剤の１回あたりの投与量は、特に限定されないが、投与対象において体重１ｋｇあたりに投与される間葉系幹細胞の数は１×１０６細胞～１×１０７細胞、１×１０５細胞～１×１０８細胞、１×１０４細胞～１×１０９細胞であってよい。ヒト１人あたりに投与される間葉系幹細胞の数は、１×１０４細胞～１×１０９細胞であり得、投与対象とヒトとの体表面積の違いを考慮すれば、２×１０３細胞～２×１０８細胞であり得る。
【0098】
〔３．その他〕
本発明は、以下のように構成することも可能である。なお、以下に記載する「生体組織損傷の修復方法」は、「生体組織損傷の予防方法」または「生体組織損傷の治療方法」であってもよい。
本発明は、以下のように構成することも可能である。なお、以下に記載する「生体組織損傷の修復方法」は、「生体組織損傷の予防方法」または「生体組織損傷の治療方法」であってもよい。
【0099】
＜１＞５％以上の酸素濃度にて血清含有培地中で培養した間葉系幹細胞と比較して、ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ－ｌｉｋｅ ４をコードする遺伝子、Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ ３をコードする遺伝子、ｄｅｌｔａ－ｌｉｋｅ ２ ｈｏｍｏｌｏｇ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）をコードする遺伝子、Ｆｒｕｃｔｏｓｅ－Ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ａｌｄｏｌａｓｅ Ｃをコードする遺伝子、ＴＲＰＭ８ ｃｈａｎｎｅｌ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒ ２をコードする遺伝子、および、ＲＥＳＴ ｃｏｒｅｐｒｅｓｓｏｒ ２をコードする遺伝子の発現量が少なくとも３倍以上である間葉系幹細胞を含有している生体組織損傷の修復剤を対象生物（例えば、ヒトまたはヒト以外の哺乳類（ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ラットなど））に投与する工程を有することを特徴とする、生体組織損傷の修復方法。
【0100】
＜２＞上記生体組織損傷の修復剤は、（ｉ）生体組織の線維化を抑制するためのもの、（ｉｉ）炎症細胞の浸潤を抑制するためのもの、または、（ｉｉｉ）マクロファージの活性を制御するためのものであることを特徴とする、＜１＞に記載の修復方法。
【0101】
＜３＞上記生体組織損傷は、急性腎障害、慢性腎臓病、慢性腎不全、慢性糸球体腎炎、糖尿病性腎症、腎硬化症、急速進行性糸球体腎炎、多発性嚢胞腎、尿細管間質性腎炎、薬剤性腎炎、ループス腎炎、水腎症、痛風腎、肝硬変、肺線維症、熱傷、間質性肺炎、薬剤性肺炎、放射線肺臓炎、慢性閉塞性肺疾患、急性呼吸促進症候群、軟骨損傷、骨欠損、脊髄損傷、歯周病、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、クローン病、糖尿病、動脈硬化、心筋梗塞、脳卒中、アルツハイマー病、黄斑変性症、ウイルス性肝炎、アルコール性肝炎、非アルコール性脂肪肝炎、顎骨再建、口蓋裂、骨置換材、骨欠損、骨系統疾患、ドライアイ、角膜障害、咽頭炎、関節炎、癌、癌周囲線維化、または、線維症に伴う組織損傷であることを特徴とする、＜１＞または＜２＞に記載の修復方法。
【実施例】
【0102】
〔実施例１〕
無血清培地を用いて培養した間葉系幹細胞を移植することによる腎線維化の抑制効果の検討を行った。
無血清培地を用いて培養した間葉系幹細胞を移植することによる腎線維化の抑制効果の検討を行った。
【0103】
＜方法：ＭＳＣの作製＞
本実施例１では、ＭＳＣとして、無血清培地（ＳＴＫ２培地、株式会社ツーセル：「ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、少なくとも１つのリン脂質、および少なくとも１つの脂肪酸を含有している無血清培地」に対応）を用いて培養したヒト間葉系幹細胞を用いた。
本実施例１では、ＭＳＣとして、無血清培地（ＳＴＫ２培地、株式会社ツーセル：「ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、少なくとも１つのリン脂質、および少なくとも１つの脂肪酸を含有している無血清培地」に対応）を用いて培養したヒト間葉系幹細胞を用いた。
【0104】
実施例では、１％酸素環境下にて２４時間培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞（１％Ｏ２ｈＭＳＣ）を用いた。一方、比較例では、２１％酸素環境下にて２４時間培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞（２１％Ｏ２ｈＭＳＣ）を用いた。なお、いずれのヒト骨髄由来間葉系幹細胞においても、大気圧下で培養した。
【0105】
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞を培養する環境へ、酸素（１％または２１％）、二酸化炭素５％、および、窒素（９４％または７４％）を含むように調製したガスを格納するガスボンベから、当該ガスを供給した。
【0106】
＜方法：疾患のモデルの作製＞
腎線維化モデルは、８週齢、雄のＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（ＳＤラット）の左腎動脈を６０分間遮断した後で当該遮断を開放すること（腎虚血再灌流障害（ＩＲＩ））によって作製した。ＩＲＩは、周知の方法にしたがった。
腎線維化モデルは、８週齢、雄のＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（ＳＤラット）の左腎動脈を６０分間遮断した後で当該遮断を開放すること（腎虚血再灌流障害（ＩＲＩ））によって作製した。ＩＲＩは、周知の方法にしたがった。
【0107】
＜方法：薬剤の投与＞
作製したＭＳＣ（２１％Ｏ２ｈＭＳＣおよび１％Ｏ２ｈＭＳＣ）５０万ｃｅｌｌｓをそれぞれＰＢＳ２００μＬに懸濁させた。懸濁させたＭＳＣを、ＩＲＩを施したＳＤラットの血管内に投与した（２１％Ｏ２ｈＭＳＣを投与した群を「２１％Ｏ２ｈＭＳＣ群」、１％Ｏ２ｈＭＳＣを投与した群を「１％Ｏ２ｈＭＳＣ群」とも称する）。対照として、ＰＢＳ２００μＬのみを、ＩＲＩを施したＳＤラットの血管内に投与した（「ＰＢＳ群」とも称する）。
作製したＭＳＣ（２１％Ｏ２ｈＭＳＣおよび１％Ｏ２ｈＭＳＣ）５０万ｃｅｌｌｓをそれぞれＰＢＳ２００μＬに懸濁させた。懸濁させたＭＳＣを、ＩＲＩを施したＳＤラットの血管内に投与した（２１％Ｏ２ｈＭＳＣを投与した群を「２１％Ｏ２ｈＭＳＣ群」、１％Ｏ２ｈＭＳＣを投与した群を「１％Ｏ２ｈＭＳＣ群」とも称する）。対照として、ＰＢＳ２００μＬのみを、ＩＲＩを施したＳＤラットの血管内に投与した（「ＰＢＳ群」とも称する）。
【0108】
「２１％Ｏ２ｈＭＳＣ群」ではｎ＝２（２匹のＩＲＩを施したＳＤラットから採取した左腎）、「ＰＢＳ群」および「１％Ｏ２ｈＭＳＣ群」では、ｎ＝３（３匹のＩＲＩを施したＳＤラットから採取した左腎）を用いて、薬剤の影響を評価した。
【0109】
＜方法：屠殺および採材＞
薬剤（１％Ｏ２ｈＭＳＣ、２１％Ｏ２ｈＭＳＣ、または、ＰＢＳ）の投与後２１日経過した後、ＳＤラットの左腎を採取した。採取した腎臓に対して、抗α－ＳＭＡ抗体を用いたウエスタンブロット法、および、抗α－ＳＭＡ抗体、抗ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅＩ抗体、抗ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅＩＩＩ抗体を用いた免疫染色により、腎線維化および腎線維化に伴う細胞外基質の増減について評価した。なお、ウエスタンブロット法は、周知のウエスタンブロット法のプロトコールに基づいて確認した。また、免疫染色は、市販の抗体を用いて、周知のプロトコールに基づいて行った。
薬剤（１％Ｏ２ｈＭＳＣ、２１％Ｏ２ｈＭＳＣ、または、ＰＢＳ）の投与後２１日経過した後、ＳＤラットの左腎を採取した。採取した腎臓に対して、抗α－ＳＭＡ抗体を用いたウエスタンブロット法、および、抗α－ＳＭＡ抗体、抗ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅＩ抗体、抗ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅＩＩＩ抗体を用いた免疫染色により、腎線維化および腎線維化に伴う細胞外基質の増減について評価した。なお、ウエスタンブロット法は、周知のウエスタンブロット法のプロトコールに基づいて確認した。また、免疫染色は、市販の抗体を用いて、周知のプロトコールに基づいて行った。
【0110】
＜結果＞
図１に抗α－ＳＭＡ抗体を用いたウエスタンブロット法による結果を示し、図２に抗α－ＳＭＡ抗体、抗ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅＩ抗体、および抗ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅＩＩＩ抗体を用いた免疫染色の結果を示す。
図１に抗α－ＳＭＡ抗体を用いたウエスタンブロット法による結果を示し、図２に抗α－ＳＭＡ抗体、抗ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅＩ抗体、および抗ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅＩＩＩ抗体を用いた免疫染色の結果を示す。
【0111】
図１に示すように、「２１％Ｏ２ｈＭＳＣ群」では、「ＰＢＳ群」に比べ、腎線維化の分子マーカーであるα－ＳＭＡの発現が抑制された。さらに、「１％Ｏ２ｈＭＳＣ群」では、「２１％Ｏ２ｈＭＳＣ群」に比べ、α－ＳＭＡの発現が一層抑制された。
【0112】
図２に示す様に、ＳＤラットにＩＲＩを施すことによって誘導された、腎線維化の分子マーカーであるα－ＳＭＡと、腎線維化に伴って発現が増強される細胞外基質であるｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅＩおよびｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅＩＩＩとの発現は、「ＰＢＳ群」に比べ「２１％Ｏ２ｈＭＳＣ群」では抑制された。さらに、「１％Ｏ２ｈＭＳＣ群」では、「２１％Ｏ２ｈＭＳＣ群」に比べ一層強くα‐ＳＭＡ、ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅＩおよびｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅＩＩＩの発現が抑制された。
【0113】
＜総括＞
低酸素濃度の環境において２４時間培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞（１％Ｏ２ｈＭＳＣ群）は、通常酸素濃度の環境において２４時間培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞（２１％Ｏ２ｈＭＳＣ群）と比較して、腎線維化の進展を抑制する作用が増強することが認められた。
低酸素濃度の環境において２４時間培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞（１％Ｏ２ｈＭＳＣ群）は、通常酸素濃度の環境において２４時間培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞（２１％Ｏ２ｈＭＳＣ群）と比較して、腎線維化の進展を抑制する作用が増強することが認められた。
【0114】
〔実施例２－１〕
無血清培地で培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞の培養上清による、線維化の抑制効果の検討を行った。
無血清培地で培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞の培養上清による、線維化の抑制効果の検討を行った。
【0115】
ヒト近位尿細管細胞（ＨＫ２）に対してＴＧＦ－β１刺激による線維化誘導を行ない、当該ヒト近位尿細管細胞（ＨＫ２）にヒト骨髄由来間葉系幹細胞の培養上清（以下、「ＭＳＣ－ＣＭ」とも称する）を加え、α－ＳＭＡの発現レベルを評価した。
【0116】
＜培養上清の作製＞
ＳＴＫ２培地を用いてヒト骨髄由来間葉系幹細胞を２１％酸素環境下で２４時間培養した。培養物からＳＴＫ２培地を除去してヒト骨髄由来間葉系幹細胞を得た後、ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ ＤＭＥＭを用いて、当該ヒト間葉系幹細胞を２１％酸素環境下にて２４時間培養した。２４時間培養後のヒト骨髄由来間葉系幹細胞の培養上清を「２１％Ｏ２ＭＳＣ－ＣＭ」とした。
ＳＴＫ２培地を用いてヒト骨髄由来間葉系幹細胞を２１％酸素環境下で２４時間培養した。培養物からＳＴＫ２培地を除去してヒト骨髄由来間葉系幹細胞を得た後、ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ ＤＭＥＭを用いて、当該ヒト間葉系幹細胞を２１％酸素環境下にて２４時間培養した。２４時間培養後のヒト骨髄由来間葉系幹細胞の培養上清を「２１％Ｏ２ＭＳＣ－ＣＭ」とした。
【0117】
また、ＳＴＫ２培地を用いてヒト骨髄由来間葉系幹細胞を１％酸素環境下で２４時間培養した。培養物からＳＴＫ２培地を除去してヒト骨髄由来間葉系幹細胞を得た後、ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ ＤＭＥＭを用いて、当該ヒト骨髄由来間葉系幹細胞を１％酸素環境下にて２４時間培養した。２４時間培養後のヒト骨髄由来間葉系幹細胞の培養上清を「１％Ｏ２ＭＳＣ－ＣＭ」とした。なお、「２１％Ｏ２ＭＳＣ－ＣＭ」および「１％Ｏ２ＭＳＣ－ＣＭ」ともに、大気圧下でヒト骨髄由来間葉系幹細胞を培養した。
【0118】
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞を培養する環境へ、酸素（１％または２１％）、二酸化炭素５％、および、窒素（９４％または７４％）を含むように調製したガスを格納するガスボンベから、当該ガスを供給した。
【0119】
＜評価方法＞
ヒト近位尿細管細胞（ＨＫ２）を、６ウェルプレートに１×１０５細胞／ウェルで播種し、１０％ウシ血清含有ＤＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）で１８時間培養し、培養後の細胞数がサブコンフルエント（コンフルエント状態の８０～９０％の細胞数）であることを確認した。そして、１０％ウシ血清含有ＤＭＥＭ培地を吸引除去し、ＰＢＳでＨＫ２を洗浄した。当該ＨＫ２を、ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ ＤＭＥＭに播種した後、２１％Ｏ２ＭＳＣ－ＣＭまたは１％Ｏ２ＭＳＣ－ＣＭを加え、大気雰囲気下にて２４時間培養した。２４時間の培養の後、培養物に対してＴＧＦ－β１を添加した。ＴＧＦ－β１を培養物に添加後、更に１２時間培養し、その後、ＨＫ２におけるα－ＳＭＡの発現をウエスタンプロット法で評価した。
ヒト近位尿細管細胞（ＨＫ２）を、６ウェルプレートに１×１０５細胞／ウェルで播種し、１０％ウシ血清含有ＤＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）で１８時間培養し、培養後の細胞数がサブコンフルエント（コンフルエント状態の８０～９０％の細胞数）であることを確認した。そして、１０％ウシ血清含有ＤＭＥＭ培地を吸引除去し、ＰＢＳでＨＫ２を洗浄した。当該ＨＫ２を、ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ ＤＭＥＭに播種した後、２１％Ｏ２ＭＳＣ－ＣＭまたは１％Ｏ２ＭＳＣ－ＣＭを加え、大気雰囲気下にて２４時間培養した。２４時間の培養の後、培養物に対してＴＧＦ－β１を添加した。ＴＧＦ－β１を培養物に添加後、更に１２時間培養し、その後、ＨＫ２におけるα－ＳＭＡの発現をウエスタンプロット法で評価した。
【0120】
＜結果＞
図３に、ＨＫ２における抗α－ＳＭＡ抗体を用いたウエスタンブロット法の結果を示す。図３は、（ｉ）培養上清およびＴＧＦ－β１を添加しなかった（ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ
ＤＭＥＭを添加し、ＴＧＦ－β１を添加しなかった）場合のα－ＳＭＡの発現レベル（図３の左から１～３レーン）、（ｉｉ）培養上清を添加せずＴＧＦ－β１を添加した（ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ ＤＭＥＭおよびＴＧＦ－β１を添加した）場合のα－ＳＭＡの発現レベル（図３の左から４～６レーン）、（ｉｉｉ）培養上清として２１％Ｏ２ＭＳＣ－ＣＭを添加し、さらにＴＧＦ－β１を添加した場合におけるα－ＳＭＡの発現レベル（図３の左から７～９レーン）、（ｉｖ）培養上清として１％Ｏ２ＭＳＣ－ＣＭを添加し、さらにＴＧＦ－β１を添加した場合におけるα－ＳＭＡの発現レベル（図３の左から１０～１２レーン）を示す。
図３に、ＨＫ２における抗α－ＳＭＡ抗体を用いたウエスタンブロット法の結果を示す。図３は、（ｉ）培養上清およびＴＧＦ－β１を添加しなかった（ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ
ＤＭＥＭを添加し、ＴＧＦ－β１を添加しなかった）場合のα－ＳＭＡの発現レベル（図３の左から１～３レーン）、（ｉｉ）培養上清を添加せずＴＧＦ－β１を添加した（ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ ＤＭＥＭおよびＴＧＦ－β１を添加した）場合のα－ＳＭＡの発現レベル（図３の左から４～６レーン）、（ｉｉｉ）培養上清として２１％Ｏ２ＭＳＣ－ＣＭを添加し、さらにＴＧＦ－β１を添加した場合におけるα－ＳＭＡの発現レベル（図３の左から７～９レーン）、（ｉｖ）培養上清として１％Ｏ２ＭＳＣ－ＣＭを添加し、さらにＴＧＦ－β１を添加した場合におけるα－ＳＭＡの発現レベル（図３の左から１０～１２レーン）を示す。
【0121】
図３に示すように、ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ ＤＭＥＭおよびＴＧＦ－β１を添加した場合におけるα－ＳＭＡの発現レベルは、ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ ＤＭＥＭを添加し、ＴＧＦ－β１を添加しなかった場合におけるα－ＳＭＡの発現レベルに比べ、α－ＳＭＡの発現レベルが上昇した。このことは、ＴＧＦ－βによって、ヒト近位尿細管細胞を線維化した状態に誘導できることを示している。
【0122】
培養上清として２１％Ｏ２ＭＳＣ－ＣＭを添加しさらにＴＧＦ－β１を添加した場合におけるα－ＳＭＡの発現レベルは、ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ ＤＭＥＭおよびＴＧＦ－β１を添加した場合におけるα－ＳＭＡの発現レベルに比べ、α－ＳＭＡの発現の抑制が認められた。
【0123】
培養上清として１％Ｏ２ＭＳＣ－ＣＭを添加しさらにＴＧＦ－β１を添加した場合におけるα－ＳＭＡの発現レベルは、培養上清として２１％Ｏ２ＭＳＣ－ＣＭを添加しさらにＴＧＦ－β１を添加した場合におけるα－ＳＭＡの発現レベルと比較して、よりα－ＳＭＡの発現レベルの抑制が認められた。
【0124】
＜総括＞
低酸素濃度（酸素濃度が１％）の環境において２４時間以上培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞（１％Ｏ２ＭＳＣ－ＣＭ）は、酸素濃度が２１％の環境において培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞（２１％Ｏ２ＭＳＣ－ＣＭ）と比較して、ＴＧＦ－β１の刺激による線維化の誘導をより強く抑制した。
低酸素濃度（酸素濃度が１％）の環境において２４時間以上培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞（１％Ｏ２ＭＳＣ－ＣＭ）は、酸素濃度が２１％の環境において培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞（２１％Ｏ２ＭＳＣ－ＣＭ）と比較して、ＴＧＦ－β１の刺激による線維化の誘導をより強く抑制した。
【0125】
〔実施例２－２〕
ＭＳＣとして、ヒト脂肪由来間葉系幹細胞を用いて、〔実施例２－１〕と同様に、無血清培地で培養したヒト脂肪由来間葉系幹細胞の培養上清による、線維化の抑制効果の検討を行った。
ＭＳＣとして、ヒト脂肪由来間葉系幹細胞を用いて、〔実施例２－１〕と同様に、無血清培地で培養したヒト脂肪由来間葉系幹細胞の培養上清による、線維化の抑制効果の検討を行った。
【0126】
＜培養上清の作製＞
ＳＴＫ２培地を用いてヒト脂肪由来間葉系幹細胞を２１％酸素環境下で２４時間培養した。培養物からＳＴＫ２培地を除去してヒト脂肪由来間葉系幹細胞を得た後、ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ ＤＭＥＭを用いて、当該ヒト脂肪由来間葉系幹細胞を２１％酸素環境下にて２４時間培養した。２４時間培養後のヒト脂肪由来間葉系幹細胞の培養上清を「２１％Ｏ２ＡＭＳＣ－ＣＭ」とした。
ＳＴＫ２培地を用いてヒト脂肪由来間葉系幹細胞を２１％酸素環境下で２４時間培養した。培養物からＳＴＫ２培地を除去してヒト脂肪由来間葉系幹細胞を得た後、ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ ＤＭＥＭを用いて、当該ヒト脂肪由来間葉系幹細胞を２１％酸素環境下にて２４時間培養した。２４時間培養後のヒト脂肪由来間葉系幹細胞の培養上清を「２１％Ｏ２ＡＭＳＣ－ＣＭ」とした。
【0127】
また、ＳＴＫ２培地を用いてヒト脂肪由来間葉系幹細胞を１％酸素環境下で２４時間培養した。培養物からＳＴＫ２培地を除去してヒト脂肪由来間葉系幹細胞を得た後、ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ ＤＭＥＭを用いて、当該ヒト脂肪由来間葉系幹細胞を１％酸素環境下にて２４時間培養した。２４時間培養後のヒト脂肪由来間葉系幹細胞の培養上清を「１％Ｏ２ＡＭＳＣ－ＣＭ」とした。なお、「２１％Ｏ２ＡＭＳＣ－ＣＭ」および「１％Ｏ２ＡＭＳＣ－ＣＭ」ともに、大気圧下でヒト脂肪由来間葉系幹細胞を培養した。
【0128】
ヒト脂肪由来間葉系幹細胞を培養する環境へ、酸素（１％または２１％）、二酸化炭素５％、および、窒素（９４％または７４％）を含むように調製したガスを格納するガスボンベから、当該ガスを供給した。
【0129】
＜評価方法＞
ヒト近位尿細管細胞（ＨＫ２）を、６ウェルプレートに１×１０５細胞／ウェルで播種し、１０％ウシ血清含有ＤＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）で１８時間培養し、培養後の細胞数がサブコンフルエント（コンフルエント状態の８０～９０％の細胞数）であることを確認した。そして、１０％ウシ血清含有ＤＭＥＭ培地を吸引除去し、ＰＢＳでＨＫ２を洗浄した。当該ＨＫ２を、ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ ＤＭＥＭに播種した後、２１％Ｏ２ＡＭＳＣ－ＣＭまたは１％Ｏ２ＡＭＳＣ－ＣＭを加え、大気雰囲気下にて２４時間培養した。２４時間の培養の後、培養物に対してＴＧＦ－β１を添加した。ＴＧＦ－β１を培養物に添加後、更に１２時間培養し、その後、ＨＫ２におけるα－ＳＭＡの発現をウエスタンプロット法で評価した。
ヒト近位尿細管細胞（ＨＫ２）を、６ウェルプレートに１×１０５細胞／ウェルで播種し、１０％ウシ血清含有ＤＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）で１８時間培養し、培養後の細胞数がサブコンフルエント（コンフルエント状態の８０～９０％の細胞数）であることを確認した。そして、１０％ウシ血清含有ＤＭＥＭ培地を吸引除去し、ＰＢＳでＨＫ２を洗浄した。当該ＨＫ２を、ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ ＤＭＥＭに播種した後、２１％Ｏ２ＡＭＳＣ－ＣＭまたは１％Ｏ２ＡＭＳＣ－ＣＭを加え、大気雰囲気下にて２４時間培養した。２４時間の培養の後、培養物に対してＴＧＦ－β１を添加した。ＴＧＦ－β１を培養物に添加後、更に１２時間培養し、その後、ＨＫ２におけるα－ＳＭＡの発現をウエスタンプロット法で評価した。
【0130】
＜結果＞
図４に、ＨＫ２における抗α－ＳＭＡ抗体を用いたウエスタンブロット法の結果を示す。図４は、（ｉ）培養上清およびＴＧＦ－β１を添加しなかった（ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ ＤＭＥＭを添加し、ＴＧＦ－β１を添加しなかった）場合のα－ＳＭＡの発現レベル（図４の左から１～３レーン）、（ｉｉ）培養上清を添加せずＴＧＦ－β１を添加した（ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ ＤＭＥＭおよびＴＧＦ－β１を添加した）場合のα－ＳＭＡの発現レベル（図４の左から４～６レーン）、（ｉｉｉ）培養上清として２１％Ｏ２ＡＭＳＣ－ＣＭを添加し、さらにＴＧＦ－β１を添加した場合におけるα－ＳＭＡの発現レベル（図４の左から７～９レーン）、（ｉｖ）培養上清として１％Ｏ２ＡＭＳＣ－ＣＭを添加し、さらにＴＧＦ－β１を添加した場合におけるα－ＳＭＡの発現レベル（図４の左から１０～１２レーン）を示す。
図４に、ＨＫ２における抗α－ＳＭＡ抗体を用いたウエスタンブロット法の結果を示す。図４は、（ｉ）培養上清およびＴＧＦ－β１を添加しなかった（ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ ＤＭＥＭを添加し、ＴＧＦ－β１を添加しなかった）場合のα－ＳＭＡの発現レベル（図４の左から１～３レーン）、（ｉｉ）培養上清を添加せずＴＧＦ－β１を添加した（ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ ＤＭＥＭおよびＴＧＦ－β１を添加した）場合のα－ＳＭＡの発現レベル（図４の左から４～６レーン）、（ｉｉｉ）培養上清として２１％Ｏ２ＡＭＳＣ－ＣＭを添加し、さらにＴＧＦ－β１を添加した場合におけるα－ＳＭＡの発現レベル（図４の左から７～９レーン）、（ｉｖ）培養上清として１％Ｏ２ＡＭＳＣ－ＣＭを添加し、さらにＴＧＦ－β１を添加した場合におけるα－ＳＭＡの発現レベル（図４の左から１０～１２レーン）を示す。
【0131】
図４に示すように、ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ ＤＭＥＭおよびＴＧＦ－β１を添加した場合におけるα－ＳＭＡの発現レベルは、ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ ＤＭＥＭを添加し、ＴＧＦ－β１を添加しなかった場合におけるα－ＳＭＡの発現レベルに比べ、α－ＳＭＡの発現レベルが上昇した。このことは、ＴＧＦ－βによって、ヒト近位尿細管細胞を線維化した状態に誘導できることを示している。
【0132】
培養上清として２１％Ｏ２ＡＭＳＣ－ＣＭを添加しさらにＴＧＦ－β１を添加した場合におけるα－ＳＭＡの発現レベルは、ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ ＤＭＥＭおよびＴＧＦ－β１を添加した場合におけるα－ＳＭＡの発現レベルに比べ、α－ＳＭＡの発現の抑制が認められた。
【0133】
培養上清として１％Ｏ２ＡＭＳＣ－ＣＭを添加しさらにＴＧＦ－β１を添加した場合におけるα－ＳＭＡの発現レベルは、培養上清として２１％Ｏ２ＡＭＳＣ－ＣＭを添加しさらにＴＧＦ－β１を添加した場合におけるα－ＳＭＡの発現レベルと同程度にα－ＳＭＡの発現レベルの抑制が認められた。
【0134】
＜総括＞
酸素濃度が２１％の環境において培養したヒト脂肪由来間葉系幹細胞（２１％Ｏ２ＡＭＳＣ－ＣＭ）および低酸素濃度（酸素濃度が１％）の環境において２４時間以上培養したヒト脂肪由来間葉系幹細胞（１％Ｏ２ＡＭＳＣ－ＣＭ）は、共に、ＴＧＦ－β１の刺激による線維化の誘導を強力に抑制した。つまり、酸素濃度が２１％の環境において培養したヒト脂肪由来間葉系幹細胞（２１％Ｏ２ＡＭＳＣ－ＣＭ）および低酸素濃度（酸素濃度が１％）の環境において２４時間以上培養したヒト脂肪由来間葉系幹細胞（１％Ｏ２ＡＭＳＣ－ＣＭ）は、共に、ＴＧＦ－β１の刺激によって増加するα－ＳＭＡの発現レベルを、正常なα－ＳＭＡの発現レベルにまで戻した。
酸素濃度が２１％の環境において培養したヒト脂肪由来間葉系幹細胞（２１％Ｏ２ＡＭＳＣ－ＣＭ）および低酸素濃度（酸素濃度が１％）の環境において２４時間以上培養したヒト脂肪由来間葉系幹細胞（１％Ｏ２ＡＭＳＣ－ＣＭ）は、共に、ＴＧＦ－β１の刺激による線維化の誘導を強力に抑制した。つまり、酸素濃度が２１％の環境において培養したヒト脂肪由来間葉系幹細胞（２１％Ｏ２ＡＭＳＣ－ＣＭ）および低酸素濃度（酸素濃度が１％）の環境において２４時間以上培養したヒト脂肪由来間葉系幹細胞（１％Ｏ２ＡＭＳＣ－ＣＭ）は、共に、ＴＧＦ－β１の刺激によって増加するα－ＳＭＡの発現レベルを、正常なα－ＳＭＡの発現レベルにまで戻した。
【0135】
上記〔実施例２－１〕にて既に示したように、酸素濃度が２１％の環境において培養した間葉系幹細胞は、低酸素濃度（酸素濃度が１％）の環境において培養した間葉系幹細胞と比較して、ＴＧＦ－β１の刺激による線維化の誘導の抑制作用が弱い。当該〔実施例２－２〕では、ＴＧＦ－β１の刺激による線維化の誘導の抑制作用が弱い酸素濃度が２１％の環境において培養したヒト脂肪由来間葉系幹細胞（２１％Ｏ２ＡＭＳＣ－ＣＭ）でさえ、ＴＧＦ－β１の刺激によって増加するα－ＳＭＡの発現レベルを正常なα－ＳＭＡの発現レベルにまで戻した。このことは、ヒト脂肪由来間葉系幹細胞は、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞よりも、ＴＧＦ－β１の刺激による線維化の誘導の抑制作用が強力であることを示している。
【0136】
また、１％Ｏ２ＡＭＳＣ－ＣＭおよび２１％Ｏ２ＡＭＳＣ－ＣＭはＴＧＦ－β１の刺激による線維化の誘導を強力に抑制したことから、ヒト脂肪由来間葉系幹細胞による強い線維化抑制作用は、低酸素下環境で培養したものでも高レベルに維持されることが示された。
【0137】
〔実施例３〕
図５は、ＳＴＫ２培地を用いて大気程度の酸素環境下（換言すれば、ガス成分を調製しない環境下）にて２４時間培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞（以下、「ＳＴＫ」とも称する）およびＳＴＫ２培地を用いて大気程度の酸素濃度（換言すれば、ガス成分を調製しない環境下）にて培養した後、１％酸素環境下にて２４時間培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞（以下、「ＳＴＫ Ｈ」とも称する）に発現する、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞の表面抗原の発現量の比較結果を示す。
図５は、ＳＴＫ２培地を用いて大気程度の酸素環境下（換言すれば、ガス成分を調製しない環境下）にて２４時間培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞（以下、「ＳＴＫ」とも称する）およびＳＴＫ２培地を用いて大気程度の酸素濃度（換言すれば、ガス成分を調製しない環境下）にて培養した後、１％酸素環境下にて２４時間培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞（以下、「ＳＴＫ Ｈ」とも称する）に発現する、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞の表面抗原の発現量の比較結果を示す。
【0138】
ヒト間葉系幹細胞を培養する環境へ、酸素（１％）、二酸化炭素５％、および、窒素（９４％）を含むように調製したガスを格納するガスボンベから、当該ガスを供給した。
【0139】
＜比較方法＞
ヒト白血球型抗原（ＨＬＡ）クラスＩの抗ＨＬＡ－Ａ,Ｂ,Ｃ抗体（BioLegend, San Diego, CA）、ＨＬＡクラスＩＩの抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体（BioLegend）、また、間葉系幹細胞マーカーである抗ＣＤ－２９抗体（BioLegend）、抗ＣＤ－４４抗体（BioLegend）、抗ＣＤ－７３抗体（BioLegend）、抗ＣＤ－９０抗体（BioLegend）、および抗ＣＤ－４４抗体（BioLegend）を用いて、ＢＤ ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ（Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ）を用いたＦｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ法にて表面抗原の発現量を解析した。
ヒト白血球型抗原（ＨＬＡ）クラスＩの抗ＨＬＡ－Ａ,Ｂ,Ｃ抗体（BioLegend, San Diego, CA）、ＨＬＡクラスＩＩの抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体（BioLegend）、また、間葉系幹細胞マーカーである抗ＣＤ－２９抗体（BioLegend）、抗ＣＤ－４４抗体（BioLegend）、抗ＣＤ－７３抗体（BioLegend）、抗ＣＤ－９０抗体（BioLegend）、および抗ＣＤ－４４抗体（BioLegend）を用いて、ＢＤ ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ（Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ）を用いたＦｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ法にて表面抗原の発現量を解析した。
【0140】
＜結果＞
図５では、ＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ抗体の発現量を示すグラフを１０１、ＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ抗体の発現量のカウント値を１０２に示す。また、ＨＬＡ－ＤＲ抗体の発現量を示すグラフを１０３、ＨＬＡ－ＤＲ抗体の発現量のカウント値を１０４に示す。また、ＣＤ－２９抗体の発現量を示すグラフを１０５、ＣＤ－２９抗体の発現量のカウント値を１０６に示す。また、ＣＤ－４４抗体の発現量を示すグラフを１０７、ＣＤ－４４抗体の発現量のカウント値を１０８に示す。また、ＣＤ－７３抗体の発現量を示すグラフを１０９、ＣＤ－７３抗体の発現量のカウント値を１１０に示す。また、ＣＤ－９０抗体の発現量を示すグラフを１１１、ＣＤ－９０抗体の発現量のカウント値を１１２に示す。
図５では、ＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ抗体の発現量を示すグラフを１０１、ＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ抗体の発現量のカウント値を１０２に示す。また、ＨＬＡ－ＤＲ抗体の発現量を示すグラフを１０３、ＨＬＡ－ＤＲ抗体の発現量のカウント値を１０４に示す。また、ＣＤ－２９抗体の発現量を示すグラフを１０５、ＣＤ－２９抗体の発現量のカウント値を１０６に示す。また、ＣＤ－４４抗体の発現量を示すグラフを１０７、ＣＤ－４４抗体の発現量のカウント値を１０８に示す。また、ＣＤ－７３抗体の発現量を示すグラフを１０９、ＣＤ－７３抗体の発現量のカウント値を１１０に示す。また、ＣＤ－９０抗体の発現量を示すグラフを１１１、ＣＤ－９０抗体の発現量のカウント値を１１２に示す。
【0141】
ＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ抗体の発現量を示すグラフ１０１およびＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ抗体の発現量のカウント値１０２に示されるように、ＳＴＫに発現する抗ＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ抗体は、ＳＴＫ Ｈに発現するＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ抗体と同等の発現量であった。また、ＨＬＡ－ＤＲ抗体の発現量を示すグラフ１０３およびＨＬＡ－ＤＲ抗体の発現量のカウント値１０４に示されるように、ＳＴＫおよびＳＴＫ ＨいずれにおいてもＨＬＡ－ＤＲ抗体の発現が認められなかった。さらに、間葉系幹細胞において発現するマーカーであるＣＤ－２９、ＣＤ－４４、ＣＤ－７３およびＣＤ－９０の発現はＳＴＫおよびＳＴＫ Ｈ両者で認められ、両者における発現量に差は認められなかった（１０５～１１２ご参照）。なお、図５には示さないが、ヒト間葉系幹細胞では発現しないマーカー（ネガティブマーカー）であるＣＤ－１１ｂ、ＣＤ－３４、およびＣＤ－４５は、両者で認められなかった。
【0142】
＜総括＞
ＳＴＫ２培地を用いて２１％Ｏ２環境下において２４時間培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞と、ＳＴＫ２培地を用いて１％Ｏ２環境下において２４時間培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞とでは、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞に発現する特定の表面抗原に変化が認められなかった。そのため、１％Ｏ２環境下において２４時間培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞の免疫寛容およびヒト骨髄由来間葉系幹細胞を移植する際の安全性には、影響を与えないことが示唆された。
ＳＴＫ２培地を用いて２１％Ｏ２環境下において２４時間培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞と、ＳＴＫ２培地を用いて１％Ｏ２環境下において２４時間培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞とでは、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞に発現する特定の表面抗原に変化が認められなかった。そのため、１％Ｏ２環境下において２４時間培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞の免疫寛容およびヒト骨髄由来間葉系幹細胞を移植する際の安全性には、影響を与えないことが示唆された。
【0143】
〔実施例４〕
無血清培地で培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞の培養上清に含まれる、ＶＥＧＦおよびＨＧＦの発現量の検討を行った。
無血清培地で培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞の培養上清に含まれる、ＶＥＧＦおよびＨＧＦの発現量の検討を行った。
【0144】
＜培養上清（conditioned medium）の作製＞
ＳＴＫ２培地を用いて、３回以上継代したヒト骨髄由来間葉系幹細胞を６ウェルプレートに播種し、サブコンフルエントとなるまで培養した。培養後、培養液をＳＴＫ２培地からｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ ＤＭＥＭに変更し、５％酸素環境下にて２４時間培養した。５％酸素環境下にて２４時間培養後のヒト骨髄由来間葉系幹細胞の培養上清を「５％Ｏ２」とした。
ＳＴＫ２培地を用いて、３回以上継代したヒト骨髄由来間葉系幹細胞を６ウェルプレートに播種し、サブコンフルエントとなるまで培養した。培養後、培養液をＳＴＫ２培地からｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ ＤＭＥＭに変更し、５％酸素環境下にて２４時間培養した。５％酸素環境下にて２４時間培養後のヒト骨髄由来間葉系幹細胞の培養上清を「５％Ｏ２」とした。
【0145】
ＳＴＫ２培地を用いて、３回以上継代したヒト骨髄由来間葉系幹細胞を６ウェルプレートに播種し、サブコンフルエントになるまで培養した。培養後、培養液をＳＴＫ２培地からｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ ＤＭＥＭに変更し、３％酸素環境下にて２４時間培養した。３％酸素環境下にて２４時間培養後のヒト骨髄由来間葉系幹細胞の培養上清を「３％Ｏ２」とした。
【0146】
ＳＴＫ２培地を用いて、３回以上継代したヒト骨髄由来間葉系幹細胞を６ウェルプレートに播種しサブコンフルエントとなるまで培養した。培養後、培養液をＳＴＫ２培地からｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ ＤＭＥＭに変更し、１％酸素環境下にて２４時間培養した。１％酸素環境下にて２４時間培養後のヒト骨髄由来間葉系幹細胞の培養上清を「１％Ｏ２」とした。
【0147】
対照として、ＳＴＫ２培地を用いて、３回以上継代したヒト骨髄由来間葉系幹細胞を６ウェルプレートに播種しサブコンフルエントとなるまで培養した。培養後、培養液をＳＴＫ２培地からｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ ＤＭＥＭに変更し、２１％酸素環境下にて２４時間培養した。２１％酸素環境下にて２４時間培養後のヒト骨髄由来間葉系幹細胞の培養上清を「ｃｏｎｔｒｏｌ」とした。
【0148】
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞の培養環境のうち、１％酸素環境および２１％酸素環境へは、酸素（１％または２１％）、二酸化炭素５％、および、窒素（９４％または７４％）を含むように調製したガスを格納するガスボンベから、当該ガスを供給した。一方、３％酸素環境および５％酸素環境へは、１％酸素環境へ供給するガスと、２１％酸素環境へ供給するガスとを適切な割合で混合したガスを供給した。
【0149】
＜評価方法＞
ＶＥＧＦ濃度を測定するためのＥＬＩＳＡキット（R&D Systems, Minneapolis, Mn, USA）により、採取した培養上清（５％Ｏ２、３％Ｏ２、１％Ｏ２、およびｃｏｎｔｒｏｌ）に含まれるＶＥＧＦの濃度を、各群ｎ＝６で測定した。ＶＥＧＦ濃度の平均値を、図６の上の図に示す。なお、測定値は、培養上清に含まれる全タンパク量で補正し、Mann-Whitney U testによりｃｏｎｔｒｏｌとの有意差検定を行った。
ＶＥＧＦ濃度を測定するためのＥＬＩＳＡキット（R&D Systems, Minneapolis, Mn, USA）により、採取した培養上清（５％Ｏ２、３％Ｏ２、１％Ｏ２、およびｃｏｎｔｒｏｌ）に含まれるＶＥＧＦの濃度を、各群ｎ＝６で測定した。ＶＥＧＦ濃度の平均値を、図６の上の図に示す。なお、測定値は、培養上清に含まれる全タンパク量で補正し、Mann-Whitney U testによりｃｏｎｔｒｏｌとの有意差検定を行った。
【0150】
また、ＨＧＦ濃度を測定するためのＥＬＩＳＡキット（R&D Systems, Minneapolis, Mn, USA）により、採取した培養上清（５％Ｏ２、３％Ｏ２、１％Ｏ２、およびｃｏｎｔｒｏｌ）に含まれるＨＧＦの濃度を、各群ｎ＝６で測定した。ＨＧＦ濃度の平均値を、図６の下の図に示す。なお、測定値は、培養上清に含まれる全タンパク量で補正し、Mann-Whitney U testによりｃｏｎｔｒｏｌとの有意差検定を行った。
【0151】
＜結果＞
図６の上の図に示すように、３％Ｏ２では、ｃｏｎｔｒｏｌと比較して、ＶＥＧＦの有意な増加が認められた。また、１％Ｏ２では、ｃｏｎｔｒｏｌに対し、３％Ｏ２よりもさらに強いＶＥＧＦの増加が認められた。
図６の上の図に示すように、３％Ｏ２では、ｃｏｎｔｒｏｌと比較して、ＶＥＧＦの有意な増加が認められた。また、１％Ｏ２では、ｃｏｎｔｒｏｌに対し、３％Ｏ２よりもさらに強いＶＥＧＦの増加が認められた。
【0152】
図６の下の図に示すように、３％Ｏ２では、ｃｏｎｔｒｏｌと比較して、ＨＧＦの有意な増加が認められた。また、１％Ｏ２では、ｃｏｎｔｒｏｌに対し、３％Ｏ２よりさらに強いＨＧＦの増加が認められた。
【0153】
＜総括＞
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞において、ＶＥＧＦおよびＨＧＦの分泌能を高めるために必要な酸素濃度は、５％未満であり、好ましくは３％以下であり、最も好ましくは１％以下であった。
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞において、ＶＥＧＦおよびＨＧＦの分泌能を高めるために必要な酸素濃度は、５％未満であり、好ましくは３％以下であり、最も好ましくは１％以下であった。
【0154】
〔実施例５〕
１％酸素環境下の無血清培地でヒト骨髄由来間葉系幹細胞を培養したときの、培養上清に含まれるＶＥＧＦの量の経時的変化に関する検討を行った。
１％酸素環境下の無血清培地でヒト骨髄由来間葉系幹細胞を培養したときの、培養上清に含まれるＶＥＧＦの量の経時的変化に関する検討を行った。
【0155】
＜培養上清の作製＞
ＳＴＫ２培地を用いて、３回以上継代したヒト骨髄由来間葉系幹細胞を６ウェルプレートに播種し、サブコンフルエントとなるまで培養した。培養後、培養液をＳＴＫ２培地からｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ ＤＭＥＭに変更し、２１％酸素環境下にて１８時間培養した後、１％酸素環境下にて６時間培養した。１％酸素環境下にて６時間培養後のヒト骨髄由来間葉系幹細胞の培養上清を「１％Ｏ２ ６hr」とした。
ＳＴＫ２培地を用いて、３回以上継代したヒト骨髄由来間葉系幹細胞を６ウェルプレートに播種し、サブコンフルエントとなるまで培養した。培養後、培養液をＳＴＫ２培地からｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ ＤＭＥＭに変更し、２１％酸素環境下にて１８時間培養した後、１％酸素環境下にて６時間培養した。１％酸素環境下にて６時間培養後のヒト骨髄由来間葉系幹細胞の培養上清を「１％Ｏ２ ６hr」とした。
【0156】
ＳＴＫ２培地を用いて、３回以上継代したヒト骨髄由来間葉系幹細胞を６ウェルプレートに播種し、サブコンフルエントとなるまで培養した。培養後、培養液をＳＴＫ２培地からｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ ＤＭＥＭに変更し、２１％酸素環境下にて１２時間培養した後、１％酸素環境下にて１２時間培養した。１％酸素環境下にて１２時間培養後のヒト骨髄由来間葉系幹細胞の培養上清を「１％Ｏ２ １２hr」とした。
【0157】
ＳＴＫ２培地を用いて、３回以上継代したヒト骨髄由来間葉系幹細胞を６ウェルプレートに播種し、サブコンフルエントとなるまで培養した。培養後、培養液をＳＴＫ２培地からｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ ＤＭＥＭに変更し、１％酸素環境下にて２４時間培養した。１％酸素環境下にて２４時間培養後のヒト間葉系幹細胞の培養上清を「１％Ｏ２ ２４hr」とした。
【0158】
対照として、ＳＴＫ２培地を用いて、３回以上継代したヒト骨髄由来間葉系幹細胞を６ウェルプレートに播種し、サブコンフルエントとなるまで培養した。培養後、培養液をＳＴＫ２培地からｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ ＤＭＥＭに変更し、２１％酸素環境下にて２４時間培養した。２１％酸素環境下にて２４時間培養後のヒト骨髄由来間葉系幹細胞の培養上清を「ｃｏｎｔｒｏｌ」とした。
【0159】
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞を培養する環境へ、酸素（１％または２１％）、二酸化炭素５％、および、窒素（９４％または７４％）を含むように調製したガスを格納するガスボンベから、当該ガスを供給した。
【0160】
＜評価方法＞
ＶＥＧＦ濃度を測定するためのＥＬＩＳＡキット（R&D Systems, Minneapolis, Mn, USA）により、採取した培養上清（１％Ｏ２ ６hr、１％Ｏ２ １２hr、１％Ｏ２ ２４hr、およびｃｏｎｔｒｏｌ）に含まれるＶＥＧＦの濃度を、各群ｎ＝６で測定した。ＶＥＧＦ濃度の平均値を、図７に示す。なお、測定値は、培養上清に含まれる全タンパク量で補正し、Mann-Whitney U testによりｃｏｎｔｒｏｌとの有意差検定を行った。
ＶＥＧＦ濃度を測定するためのＥＬＩＳＡキット（R&D Systems, Minneapolis, Mn, USA）により、採取した培養上清（１％Ｏ２ ６hr、１％Ｏ２ １２hr、１％Ｏ２ ２４hr、およびｃｏｎｔｒｏｌ）に含まれるＶＥＧＦの濃度を、各群ｎ＝６で測定した。ＶＥＧＦ濃度の平均値を、図７に示す。なお、測定値は、培養上清に含まれる全タンパク量で補正し、Mann-Whitney U testによりｃｏｎｔｒｏｌとの有意差検定を行った。
【0161】
＜結果＞
図７に示すように、１％Ｏ２ １２hrでは、ｃｏｎｔｒｏｌと比較して、ＶＥＧＦの有意な増加が認められた。また、１％Ｏ２ ２４hrでは、ｃｏｎｔｒｏｌと比較して、１％Ｏ２ １２hrよりさらに強いＶＥＧＦの増加が認められた。
図７に示すように、１％Ｏ２ １２hrでは、ｃｏｎｔｒｏｌと比較して、ＶＥＧＦの有意な増加が認められた。また、１％Ｏ２ ２４hrでは、ｃｏｎｔｒｏｌと比較して、１％Ｏ２ １２hrよりさらに強いＶＥＧＦの増加が認められた。
【0162】
＜総括＞
低酸素条件下にてヒト骨髄由来間葉系幹細胞のＶＥＧＦの分泌能を高めるためには、培養時間は、１２時間以上が好ましく、２４時間以上が更に好ましいことが明らかになった。
低酸素条件下にてヒト骨髄由来間葉系幹細胞のＶＥＧＦの分泌能を高めるためには、培養時間は、１２時間以上が好ましく、２４時間以上が更に好ましいことが明らかになった。
【0163】
〔実施例６〕
＜細胞培養、および、ＲＮＡの採取＞
（ｉ）ヒト骨髄由来間葉系幹細胞を、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地を用いて３継代以上培養した。その後、当該ヒト骨髄由来間葉系幹細胞を、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地中で２１％酸素環境下にて２４時間培養した。その後、公知の方法にしたがって、当該ヒト骨髄由来間葉系幹細胞からｍＲＮＡを採取した。以下では、当該ｍＲＮＡを、ｍＲＮＡ（１）と呼ぶ。
＜細胞培養、および、ＲＮＡの採取＞
（ｉ）ヒト骨髄由来間葉系幹細胞を、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地を用いて３継代以上培養した。その後、当該ヒト骨髄由来間葉系幹細胞を、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地中で２１％酸素環境下にて２４時間培養した。その後、公知の方法にしたがって、当該ヒト骨髄由来間葉系幹細胞からｍＲＮＡを採取した。以下では、当該ｍＲＮＡを、ｍＲＮＡ（１）と呼ぶ。
【0164】
（ｉｉ）ヒト骨髄由来間葉系幹細胞を、ＳＴＫ培地を用いて３継代以上培養した。その後、当該ヒト骨髄由来間葉系幹細胞を、無血清培地中で１％酸素環境下にて２４時間培養した。その後、公知の方法にしたがって、当該ヒト骨髄由来間葉系幹細胞からｍＲＮＡを採取した。以下では、当該ｍＲＮＡを、ｍＲＮＡ（２）と呼ぶ。
【0165】
（ｉｉｉ）ヒト骨髄由来間葉系幹細胞を、ＳＴＫ培地を用いて３継代以上培養した。その後、当該ヒト骨髄由来間葉系幹細胞を、無血清培地中で２１％酸素環境下にて２４時間培養した。その後、公知の方法にしたがって、当該ヒト骨髄由来間葉系幹細胞からｍＲＮＡを採取した。以下では、当該ｍＲＮＡを、ｍＲＮＡ（３）と呼ぶ。
【0166】
（ｉｖ）ヒト骨髄由来間葉系幹細胞を、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地を用いて３継代以上培養した。その後、当該ヒト骨髄由来間葉系幹細胞を、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地中で１％酸素環境下にて２４時間培養した。その後、公知の方法にしたがって、当該ヒト骨髄由来間葉系幹細胞からｍＲＮＡを採取した。以下では、当該ｍＲＮＡを、ｍＲＮＡ（４）と呼ぶ。
【0167】
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞を培養する環境へ、酸素（１％または２１％）、二酸化炭素（５％）、および、窒素（９４％または７４％）を含むガスを供給することによって、環境内の酸素濃度を調節した。
【0168】
＜マイクロアレイによる評価＞
ＤＮＡマイクロアレイ（Agilent Gene Expression Microarray : SurePrint G3 Human Gene Expression）により、採取したｍＲＮＡ（１）～（４）の各々に含まれる、特定の遺伝子Ａ（例えば、ＡＮＧＰＴＬ４、ＦＡＢＰ３、ＤＬＫ２、ＡＬＤＯＣ、ＴＣＡＦ２、ＲＣＯＲ２など）のｍＲＮＡの量を測定した。
ＤＮＡマイクロアレイ（Agilent Gene Expression Microarray : SurePrint G3 Human Gene Expression）により、採取したｍＲＮＡ（１）～（４）の各々に含まれる、特定の遺伝子Ａ（例えば、ＡＮＧＰＴＬ４、ＦＡＢＰ３、ＤＬＫ２、ＡＬＤＯＣ、ＴＣＡＦ２、ＲＣＯＲ２など）のｍＲＮＡの量を測定した。
【0169】
次いで、各遺伝子に関して、「ｍＲＮＡ（２）に含まれる遺伝子ＡのｍＲＮＡ量／ｍＲＮＡ（１）に含まれる遺伝子ＡのｍＲＮＡ量」、「ｍＲＮＡ（３）に含まれる遺伝子ＡのｍＲＮＡ量／ｍＲＮＡ（１）に含まれる遺伝子ＡのｍＲＮＡ量」、および、「ｍＲＮＡ（４）に含まれる遺伝子ＡのｍＲＮＡ量／ｍＲＮＡ（１）に含まれる遺伝子ＡのｍＲＮＡ量」の値を算出した。
【0170】
なお、後述する図８では、「ｍＲＮＡ（２）に含まれる遺伝子ＡのｍＲＮＡ量／ｍＲＮＡ（１）に含まれる遺伝子ＡのｍＲＮＡ量」の値を「hypoxia＋serum-free」として示し、「ｍＲＮＡ（３）に含まれる遺伝子ＡのｍＲＮＡ量／ｍＲＮＡ（１）に含まれる遺伝子ＡのｍＲＮＡ量」の値を「serum-free」として示し、「ｍＲＮＡ（４）に含まれる遺伝子ＡのｍＲＮＡ量／ｍＲＮＡ（１）に含まれる遺伝子ＡのｍＲＮＡ量」の値を「hypoxia」として示している。
【0171】
＜結果＞
図８の２０１は、ＡＮＧＰＴＬ４の発現量の比較を示すグラフであり、図８の２０２は、ＦＡＢＰ３の発現量の比較を示すグラフであり、図８の２０３は、ＤＬＫ２の発現量の比較を示すグラフであり、図８の２０４は、ＡＬＤＯＣの発現量の比較を示すグラフであり、図８の２０５は、ＴＣＡＦ２の発現量の比較を示すグラフであり、図８の２０６は、ＲＣＯＲ２の発現量の比較を示すグラフである。
図８の２０１は、ＡＮＧＰＴＬ４の発現量の比較を示すグラフであり、図８の２０２は、ＦＡＢＰ３の発現量の比較を示すグラフであり、図８の２０３は、ＤＬＫ２の発現量の比較を示すグラフであり、図８の２０４は、ＡＬＤＯＣの発現量の比較を示すグラフであり、図８の２０５は、ＴＣＡＦ２の発現量の比較を示すグラフであり、図８の２０６は、ＲＣＯＲ２の発現量の比較を示すグラフである。
【0172】
図８の２０１に示されるように、hypoxia＋serum-freeにおけるＡＮＧＰＴＬ４の発現量は、およそ５２倍であり、serum-freeにおけるＡＮＧＰＴＬ４の発現量は、およそ２２倍であり、hypoxiaにおけるＡＮＧＰＴＬ４の発現量は、およそ６倍であった。
【0173】
図８の２０２に示されるように、hypoxia＋serum-freeにおけるＦＡＢＰ３の発現量は、およそ４５倍であり、serum-freeにおけるＦＡＢＰ３の発現量の発現量は、およそ１５倍であり、hypoxiaにおけるＦＡＢＰ３の発現量は、およそ３倍であった。
【0174】
図８の２０３に示されるように、hypoxia＋serum-freeにおけるＤＬＫ２の発現量は、およそ２４倍であり、serum-freeにおけるＤＬＫ２の発現量は、およそ８倍であり、hypoxiaにおけるＤＬＫ２の発現量は、およそ２倍であった。
【0175】
図８の２０４に示されるように、hypoxia＋serum-freeにおけるＡＬＤＯＣの発現量は、およそ１８倍であり、serum-freeにおけるＡＬＤＯＣの発現量は、およそ２倍であり、hypoxiaにおけるＡＬＤＯＣの発現量は、およそ７倍であった。
【0176】
図８の２０５に示されるように、hypoxia＋serum-freeにおけるＴＣＡＦ２の発現量は、およそ１４倍であり、serum-freeにおけるＴＣＡＦ２の発現量は、およそ３倍であり、hypoxiaにおけるＴＣＡＦ２の発現量は、およそ５倍であった。
【0177】
図８の２０６に示されるように、hypoxia＋serum-freeにおけるＲＣＯＲ２の発現量の割合は、およそ１３倍であり、serum-freeにおけるＲＣＯＲ２の発現量は、およそ３倍であり、hypoxiaにおけるＲＣＯＲ２の発現量は、およそ３倍であった。
【0178】
＜総括＞
無血清培地中で１％酸素環境下にて２４時間培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞から採取したｍＲＮＡにおける遺伝子Ａの発現量は、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地中で２１％酸素環境下にて２４時間培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞から採取したｍＲＮＡにおける遺伝子Ａの発現量と比べ、いずれも３倍以上であった。
無血清培地中で１％酸素環境下にて２４時間培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞から採取したｍＲＮＡにおける遺伝子Ａの発現量は、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地中で２１％酸素環境下にて２４時間培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞から採取したｍＲＮＡにおける遺伝子Ａの発現量と比べ、いずれも３倍以上であった。
【0179】
１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地中で１％酸素環境下にて２４時間培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞から採取したｍＲＮＡにおけるＤＬＫ２の発現量は、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地中で２１％酸素環境下にて２４時間培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞から採取したｍＲＮＡにおけるＤＬＫ２の発現量のおよそ２倍であった。また、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地中で１％酸素環境下にて２４時間培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞から採取したｍＲＮＡにおけるＤＬＫ２以外の遺伝子Ａの発現量は、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地中で２１％酸素環境下にて２４時間培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞から採取したｍＲＮＡにおけるＤＬＫ２以外の発現量の３倍以上であった。
【0180】
無血清培地中で２１％酸素環境下にて２４時間培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞から採取したｍＲＮＡにおけるＡＬＤＯＣの発現量は、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地中で２１％酸素環境下にて２４時間培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞から採取したｍＲＮＡにおけるＡＬＤＯＣの発現量のおよそ２倍であった。また、無血清培地中で２１％酸素環境下にて２４時間培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞から採取したｍＲＮＡにおけるＡＬＤＯＣ以外の遺伝子Ａの発現量は、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地中で２１％酸素環境下にて２４時間培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞から採取したｍＲＮＡにおけるＤＬＫ２の発現量の３倍以上であった。
【0181】
また、無血清培地中で１％酸素環境下にて２４時間培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞に含まれる遺伝子ＡのｍＲＮＡ量は、無血清培地中で２１％酸素環境下にて２４時間培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞に含まれる遺伝子ＡのｍＲＮＡ量に比べ、いずれの遺伝子Ａについても少なくとも２倍以上であった。また、無血清培地中で１％酸素環境下にて２４時間培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞に含まれる遺伝子ＡのｍＲＮＡ量は、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地中で１％酸素環境下にて２４時間培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞に含まれる遺伝子ＡのｍＲＮＡ量に比べ、いずれの遺伝子Ａについても少なくとも２倍以上であった。つまり、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞を、無血清培地中で１％酸素環境下にて２４時間培養することにより、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地中で１％酸素環境下にて２４時間培養した場合、および無血清培地中で２１％酸素環境下にて２４時間培養した場合に比べ、遺伝子Ａの発現量が大幅に増加する。
【0182】
また、無血清培地中で１％酸素環境下にて２４時間培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞に含まれる遺伝子ＡのｍＲＮＡ量は、無血清培地中で２１％酸素環境下にて２４時間培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞に含まれる遺伝子ＡのｍＲＮＡ量と、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地中で１％酸素環境下にて２４時間培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞に含まれる遺伝子ＡのｍＲＮＡ量との合計より大きく、１％酸素環境下で培養することと、無血清培地中で培養することと、の相乗効果を示した。
【0183】
〔実施例７〕
＜ＭＳＣの作製＞
ＳＴＫ２培地を用いて３回以上継代したヒト骨髄由来間葉系幹細胞を、ＳＴＫ２培地中で１％酸素環境下にて２４時間培養した。当該ヒト骨髄由来間葉系幹細胞を「ＳＴＫ Ｈ」とした。また、ＳＴＫ２培地を用いて３回以上継代したヒト骨髄由来間葉系幹細胞を、ＳＴＫ２培地中で２１％酸素環境下にて２４時間培養した。当該ヒト骨髄由来間葉系幹細胞を「ＳＴＫ」とした。
＜ＭＳＣの作製＞
ＳＴＫ２培地を用いて３回以上継代したヒト骨髄由来間葉系幹細胞を、ＳＴＫ２培地中で１％酸素環境下にて２４時間培養した。当該ヒト骨髄由来間葉系幹細胞を「ＳＴＫ Ｈ」とした。また、ＳＴＫ２培地を用いて３回以上継代したヒト骨髄由来間葉系幹細胞を、ＳＴＫ２培地中で２１％酸素環境下にて２４時間培養した。当該ヒト骨髄由来間葉系幹細胞を「ＳＴＫ」とした。
【0184】
１０％ウシ血清含有ＤＭＥＭ培地を用いて３回以上継代したヒト骨髄由来間葉系幹細胞を、１０％ウシ血清含有ＤＭＥＭ培地中で１％酸素環境下にて２４時間培養した。当該ヒト骨髄由来間葉系幹細胞を「１０％ＦＢＳ Ｈ」とした。また、１０％ウシ血清含有ＤＭＥＭ培地を用いて３回以上継代したヒト骨髄由来間葉系幹細胞を、１０％ウシ血清含有ＤＭＥＭ培地中で２１％酸素環境下にて２４時間培養した。当該ヒト骨髄由来間葉系幹細胞を「１０％ＦＢＳ」とした。
【0185】
＜評価方法＞
９６ウェルディッシュに１００μＬ／ウェルのＳＴＫ２培地または１０％ウシ血清含有ＤＭＥＭ培地を添加した。ＳＴＫ２培地には、ＳＴＫ ＨまたはＳＴＫをそれぞれ２５００細胞／ウェルずつ播種した。１０％ウシ血清含有ＤＭＥＭ培地には、１０％ＦＢＳ Ｈまたは１０％ＦＢＳをそれぞれ２５００細胞／ウェルずつ播種した。
９６ウェルディッシュに１００μＬ／ウェルのＳＴＫ２培地または１０％ウシ血清含有ＤＭＥＭ培地を添加した。ＳＴＫ２培地には、ＳＴＫ ＨまたはＳＴＫをそれぞれ２５００細胞／ウェルずつ播種した。１０％ウシ血清含有ＤＭＥＭ培地には、１０％ＦＢＳ Ｈまたは１０％ＦＢＳをそれぞれ２５００細胞／ウェルずつ播種した。
【0186】
ＳＴＫ Ｈおよび１０％ＦＢＳ Ｈは１％酸素環境下で培養を継続し、ＳＴＫおよび１０％ＦＢＳは２１％酸素環境下で培養を継続した。それぞれのウェルに対して、０時間後、１２時間後、２４時間後に、Premix WST-1（Takara bio）を１０μＬ／ウェルずつ添加した。添加してから４時間後に、４５０ｎｍの波長で吸光度を測定して、当該測定値に基づいて、細胞数を定量した（各群ｎ＝５）。
【0187】
＜結果＞
図９に示すように、１０％ＦＢＳと比較して、１０％ＦＢＳ Ｈ、ＳＴＫ、ＳＴＫ Ｈは、全ての時点（０時間、１２時間、２４時間）で有意に細胞数が多く、細胞増殖が亢進していることが示された。ＳＴＫ Ｈは、細胞増殖能が最も高く、ＳＴＫと比較して、全ての時点で有意に細胞数が多かった。
図９に示すように、１０％ＦＢＳと比較して、１０％ＦＢＳ Ｈ、ＳＴＫ、ＳＴＫ Ｈは、全ての時点（０時間、１２時間、２４時間）で有意に細胞数が多く、細胞増殖が亢進していることが示された。ＳＴＫ Ｈは、細胞増殖能が最も高く、ＳＴＫと比較して、全ての時点で有意に細胞数が多かった。
【0188】
＜総括＞
無血清培地での培養は、１０％ウシ血清含有ＤＭＥＭ培地と比較して、１％酸素環境下および２１％酸素環境下においてヒト骨髄由来間葉系幹細胞の増殖能が亢進することが示された。さらに、無血清培地を用いて１％酸素環境下で培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞は、最も細胞増殖能が亢進することが示された。
無血清培地での培養は、１０％ウシ血清含有ＤＭＥＭ培地と比較して、１％酸素環境下および２１％酸素環境下においてヒト骨髄由来間葉系幹細胞の増殖能が亢進することが示された。さらに、無血清培地を用いて１％酸素環境下で培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞は、最も細胞増殖能が亢進することが示された。
【0189】
〔実施例８〕
継代培養をＦＢＳ含有のＤＭＥＭ培地または無血清培地であるＳＴＫ２で行ったヒト骨髄由来間葉系幹細胞の培養上清に含まれる、ＶＥＧＦおよびＨＧＦの発現量の検討を行った。
継代培養をＦＢＳ含有のＤＭＥＭ培地または無血清培地であるＳＴＫ２で行ったヒト骨髄由来間葉系幹細胞の培養上清に含まれる、ＶＥＧＦおよびＨＧＦの発現量の検討を行った。
【0190】
＜培養上清（conditioned medium）の作製および評価方法＞
１０％ＦＢＳ含有のＤＭＥＭ培地を用いて、３回以上継代したヒト骨髄由来間葉系幹細胞を６ウェルプレートに播種しサブコンフルエントとなるまで培養した。培養後、培養液を１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地からｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ ＤＭＥＭ培地に変更し、１％酸素環境下または２１％酸素環境下にて２４時間培養した。１％酸素環境下にて２４時間培養後のヒト骨髄由来間葉系幹細胞の培養上清を「ＤＭＥＭ １％Ｏ２」とし、２１％酸素環境下にて２４時間培養後のヒト骨髄由来間葉系幹細胞の培養上清を「ＤＭＥＭ ２１％Ｏ２」とした。
１０％ＦＢＳ含有のＤＭＥＭ培地を用いて、３回以上継代したヒト骨髄由来間葉系幹細胞を６ウェルプレートに播種しサブコンフルエントとなるまで培養した。培養後、培養液を１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地からｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ ＤＭＥＭ培地に変更し、１％酸素環境下または２１％酸素環境下にて２４時間培養した。１％酸素環境下にて２４時間培養後のヒト骨髄由来間葉系幹細胞の培養上清を「ＤＭＥＭ １％Ｏ２」とし、２１％酸素環境下にて２４時間培養後のヒト骨髄由来間葉系幹細胞の培養上清を「ＤＭＥＭ ２１％Ｏ２」とした。
【0191】
また、ＳＴＫ２培地を用いて、３回以上継代したヒト骨髄由来間葉系幹細胞を６ウェルプレートに播種しサブコンフルエントとなるまで培養した。培養後、培養液をＳＴＫ２培地からｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ ＤＭＥＭ培地に変更し、１％酸素環境下または２１％酸素環境下にて２４時間培養した。１％酸素環境下にて２４時間培養後のヒト骨髄由来間葉系幹細胞の培養上清を「ＳＴＫ２ １％Ｏ２」とし、２１％酸素環境下にて２４時間培養後のヒト骨髄由来間葉系幹細胞の培養上清を「ＳＴＫ２ ２１％Ｏ２」とした。
【0192】
対照として、ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ ＤＭＥＭ培地を用いて、ヒト腎近位尿細管上皮細胞細胞（ＨＫ２細胞）を、２１％酸素環境下にて２４時間培養した。２１％酸素環境下にて２４時間培養後のヒト腎臓細胞の培養上清を「ＨＫ２」とした。
【0193】
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞の培養環境のうち、１％酸素環境および２１％酸素環境へは、酸素（１％または２１％）、二酸化炭素５％、および、窒素（９４％または７４％）を含むように調製したガスを格納するガスボンベから、当該ガスを供給した。
【0194】
それぞれの培養上清について、実施例４と同様の方法で、ＶＥＧＦ濃度およびＨＧＦ濃度を測定した。
【0195】
＜結果＞
図１０に示すように、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地で継代培養した場合と比較して、ＳＴＫ２培地で継代培養した場合、ＶＥＧＦおよびＨＧＦの発現量が低下することが示された。一方、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地およびＳＴＫ２培地で継代培養した両方の場合において、２１％酸素下で培養した場合と比較して、１％酸素下で培養した場合には、ＶＥＧＦおよびＨＧＦの発現量が上昇することが分かった。また、ＳＴＫ２培地で継代培養した場合のＶＥＧＦおよびＨＧＦの発現量は、ＨＫ２のＶＥＧＦおよびＨＧＦの発現量よりも非常に多いことが示された。
図１０に示すように、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地で継代培養した場合と比較して、ＳＴＫ２培地で継代培養した場合、ＶＥＧＦおよびＨＧＦの発現量が低下することが示された。一方、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地およびＳＴＫ２培地で継代培養した両方の場合において、２１％酸素下で培養した場合と比較して、１％酸素下で培養した場合には、ＶＥＧＦおよびＨＧＦの発現量が上昇することが分かった。また、ＳＴＫ２培地で継代培養した場合のＶＥＧＦおよびＨＧＦの発現量は、ＨＫ２のＶＥＧＦおよびＨＧＦの発現量よりも非常に多いことが示された。
【0196】
＜総括＞
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞におけるＶＥＧＦおよびＨＧＦの分泌能は、ヒト腎近位尿細管上皮細胞と比較して極めて高いことが示された。また、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞を無血清培地で継代培養した場合、ＶＥＧＦおよびＨＧＦの分泌能は低下するものの、１％酸素下で培養することによって、ＶＥＧＦおよびＨＧＦの発現量は回復することが示された。
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞におけるＶＥＧＦおよびＨＧＦの分泌能は、ヒト腎近位尿細管上皮細胞と比較して極めて高いことが示された。また、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞を無血清培地で継代培養した場合、ＶＥＧＦおよびＨＧＦの分泌能は低下するものの、１％酸素下で培養することによって、ＶＥＧＦおよびＨＧＦの発現量は回復することが示された。
【産業上の利用可能性】
【0197】
本発明および本発明の製造方法により作製した修復剤は、生体組織損傷の修復剤に利用することができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】