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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-09-26
(45)【発行日】2024-10-04
(54)【発明の名称】蛍光偏光免疫分析法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/542 20060101AFI20240927BHJP
G01N 21/64 20060101ALI20240927BHJP
【ＦＩ】
G01N33/542 A
G01N21/64 A
G01N21/64 F
G01N21/64 B
【請求項の数】
6
(21)【出願番号】P 2020080767
(22)【出願日】2020-04-30
(65)【公開番号】P2021173731
(43)【公開日】2021-11-01
【審査請求日】2023-03-22
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２８年度、国立研究開発法人科学技術振興機構、先端計測分析技術・機器開発プログラム「オンサイト蛍光偏光イムノアッセイ装置の開発」委託研究開発、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】504157024
【氏名又は名称】国立大学法人東北大学
(73)【特許権者】
【識別番号】303018827
【氏名又は名称】Ｔｉａｎｍａ Ｊａｐａｎ株式会社
(73)【特許権者】
【識別番号】504173471
【氏名又は名称】国立大学法人北海道大学
(74)【代理人】
【識別番号】100095407
【弁理士】
【氏名又は名称】木村 満
(74)【代理人】
【識別番号】100183955
【弁理士】
【氏名又は名称】齋藤 悟郎
(74)【代理人】
【識別番号】100132883
【弁理士】
【氏名又は名称】森川 泰司
(74)【代理人】
【識別番号】100177149
【弁理士】
【氏名又は名称】佐藤 浩義
(74)【代理人】
【識別番号】100174067
【弁理士】
【氏名又は名称】湯浅 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100136342
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 成美
(72)【発明者】
【氏名】福山 真央
(72)【発明者】
【氏名】火原 彰秀
(72)【発明者】
【氏名】今井 阿由子
(72)【発明者】
【氏名】重村 幸治
(72)【発明者】
【氏名】渡慶次 学
【審査官】倉持 俊輔
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１９－５０３４７７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０２０－５０３０６２（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２００３／０８１２４３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２００９／０１４２８５３（ＵＳ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ ３３／５４２，
Ｇ０１Ｎ ２１／６４，
Ｃ０７Ｋ １６／００
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
試料中の測定対象物質を分析するための蛍光偏光免疫分析法であって、前記測定対象物質に結合能を有するシングルドメイン抗体を蛍光色素で標識した蛍光標識物質を、前記試料に含まれる前記測定対象物質と結合させる結合工程、および
前記測定対象物質が結合した前記蛍光標識物質の蛍光偏光度変化を測定する測定工程、を含み、
該測定工程では、前記蛍光標識物質、または前記測定対象物質が結合した前記蛍光標識物質を含む前記試料をＰＤＭＳにより形成されたマイクロ流路に供給して蛍光偏光分析を行う、蛍光偏光免疫分析法。
【請求項2】
前記シングルドメイン抗体が、ＶＨＨ抗体またはｖＮＡＲ抗体である、請求項１記載の蛍光偏光免疫分析法。
【請求項3】
前記蛍光色素は、フルオレセイン、ダンシル、ピレン、ローダミン、ジアルキルアミノナフタレン、ジアルキルアミノナフタレンスルホニル、インドレニン、およびルテニウムの金属錯体からなる群から選択される１以上である、請求項１または２記載の蛍光偏光免疫分析法。
【請求項4】
前記蛍光色素は、蛍光寿命が１～３，０００ナノ秒である、請求項１または２記載の蛍光偏光免疫分析法。
【請求項5】
前記測定対象物質が、生物由来物質、医薬、またはウイルスである、請求項１～４のいずれかに記載の蛍光偏光免疫分析法。
【請求項6】
前記測定工程では、複数のマイクロ流路で複数の前記試料を同時に測定する蛍光偏光分析を行う、請求項１～５のいずれかに記載の蛍光偏光免疫分析法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、シングルドメイン抗体に蛍光色素を結合した蛍光標識物質を用いる蛍光偏光免疫分析法に関する。
【背景技術】
【0002】
蛍光を用いた免疫分析法として蛍光偏光免疫分析法がある。X.Q. Guo et al., Anal. Chem. 1998, 70, 632-637に記載されるように、蛍光偏光度と測定対象物質の体積との間には以下の関係がある。
（１／Ｐ－１／３）＝（１／Ｐ ０ －１／３）（１＋ｋＴτ／ηＶ）
Ｐ：偏光度、Ｐ ０ ：回転拡散が無い場合の偏光度、ｋ：ボルツマン定数、η：溶液の粘度、Ｔ：絶対温度、τ：蛍光寿命、Ｖ：分子の体積
特許文献１には、抗体と比較して分子量の大きな物質に抗体（または抗原）を固定化した試薬を用いる方法であって、この試薬と蛍光標識された抗原（または抗体）との特異的抗原抗体反応によって大きな蛍光偏光度の変化が生じることを利用する蛍光偏光免疫分析法が記載されている。
（１／Ｐ－１／３）＝（１／Ｐ ０ －１／３）（１＋ｋＴτ／ηＶ）
Ｐ：偏光度、Ｐ ０ ：回転拡散が無い場合の偏光度、ｋ：ボルツマン定数、η：溶液の粘度、Ｔ：絶対温度、τ：蛍光寿命、Ｖ：分子の体積
特許文献１には、抗体と比較して分子量の大きな物質に抗体（または抗原）を固定化した試薬を用いる方法であって、この試薬と蛍光標識された抗原（または抗体）との特異的抗原抗体反応によって大きな蛍光偏光度の変化が生じることを利用する蛍光偏光免疫分析法が記載されている。
【0003】
蛍光偏光免疫測定法を利用して、高分子量の物質を測定する方法もある（特許文献２）。測定対象物質に特異的に結合する抗体等に、蛍光寿命が１０～２００ナノ秒の蛍光色素を共有結合した蛍光標識タンパク質を使用する点に特徴がある。実施例では、蛍光色素として長寿命蛍光色素であるピレンブタン酸を使用し、測定対象物質に特異的に結合する抗体として抗ＨＤＬポリクローナル抗体を使用してＨＤＬの検量線を作成し、測定対象物質に特異的に結合する抗体として抗ＬＤＬポリクローナル抗体を使用してＬＤＬ検量線を作成している。
【0004】
また、高分子量の物質を測定する方法として、蛍光標識物質と測定対象物質とが結合する前後の分子量変化を大きくするため、低分子化抗体を蛍光標識した蛍光標識物質を使用するものもある(特許文献３)。特許文献３では、低分子抗体として、少なくとも抗原認識部位を含むＦａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、ｓｃＦｖ抗体（single chain antibody）を記載する。実施例では、ＦａｂフラグメントとＦＩＴＣ(Fluorescein isothiocyanate)を反応させてＦａｂ標識化合物を調製し、これに各種濃度のヒト血清アルブミンを加えて蛍光偏光度を測定している。その結果、低濃度領域は２～３×１０-8Ｍ（１～２μｇ／ｍＬ）程度まで測定可能であると記載する。
【0005】
ここにＩｇＧ抗体などは２本の重鎖と２本軽鎖とからなるＹ字型の抗体であり、重鎖および軽鎖はそれぞれ可変領域を有する。Ｆａｂ抗体やｓｃＦｖ抗体は、このような抗体の一部で構成され、重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域とを含んでいる。これに対し軽鎖を含まず、２本の重鎖がＹ字型に結合した重鎖抗体も存在する。重鎖抗体の各重鎖はそれぞれ可変領域を有する。可変領域は、Ｆ１～Ｆ４からなるフレームワーク領域とＣＤＲ１～ＣＤＲ３からなる相補性決定領域（ＣＤＲ：complementary determining region）とを含み、この可変領域を介して抗体と特異的に結合することができる。可変領域は、フレームワーク領域とＣＤＲとによって抗原結合性を発揮するため、これらを単一のドメイン（以下、シングルドメインと称する。）とすれば、重鎖抗体は２つのシングルドメインを有している。ラクダ科動物の血清中には重鎖抗体が含まれ、重鎖の各可変領域はＶＨＨ(Variable domain of a heavy chain antibody)と称される。ラクダ由来のＶＨＨ抗体はシングルドメイン抗体である。特許文献４には、ＶＨＨ抗体の熱安定化を目的として、ＶＨＨ抗体の特定のアミノ酸をグリシン等で置換した熱安定性ＶＨＨ抗体を記載している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【文献】特開平３－１０３７６５号公報
【文献】特許第３２５５２９３号公報
【文献】特開平１１－４４６８８号公報
【文献】特開２０１９－２１０２６７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
蛍光偏光免疫分析法は測定対象物質と結合する前後の蛍光標識物質の蛍光偏光度の変化を観察するものである。蛍光偏光度は分子量に依存するため、分子量の大きな蛍光標識物質を使用した高分子量の物質の測定は容易でない。特許文献２は、高分子量の測定対象物質（約５０万以上）、例えばウイルス以上の大きさの測定対象物質（粒子として約２０ｎｍ以上）を測定するため、長寿命蛍光色素であるピレンブタン酸を使用して蛍光標識物質を調製し、使用している。しかしながら長寿命蛍光色素は高価であり、フルオレセインなどの蛍光寿命が１０ナノ秒以下の汎用性の高い蛍光色素で高分子量の物質を測定できる蛍光偏光免疫分析法の開発が望まれる。
【0008】
また、特許文献３では、低分子抗体を使用して２～３×１０-8Ｍ程度まで測定可能と記載する。しかしながら、微量の試料での測定を可能するために、より低濃度でも検出することができる蛍光偏光免疫分析法の開発が望まれる。
【0009】
また、特許文献４は、熱安定性が高いＶＨＨ抗体を開示するが、変異体の調製を開示するものであり、蛍光偏光免疫分析法に使用した例はない。また、ＶＨＨ抗体以外のシングルドメイン抗体に関する記載もない。
【0010】
また、微量の試料での測定を可能とするため、マイクロ流路を備えた測定機器が開発されている。マイクロ流路は半導体プロセスを用いて作製する数１０～数１００μｍ程度の流路を有するデバイスである。このマイクロ流路を用いた化学反応システムは、通常のバルクサイズの化学反応と比べて、大幅な反応時間の短縮、温度や濃度の優れた均一性に起因する安定した化学反応ができる利点がある。蛍光偏光免疫分析法で使用する装置は、蛍光偏光度に影響を与えない部材で構成される必要があり、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ；Polydimethylsiloxane）が使用されることが多い。ＰＤＭＳは石英ガラスに匹敵する透明度を持ち、自家蛍光性が低いため蛍光反応を利用する分析に適する。加えて、液状で粘度が低いためにサブミクロンからミクロンオーダーの微細加工も可能だからである。しかしながら、蛍光偏光免疫分析法は抗原抗体反応を利用するものである。蛍光標識物質や測定対象物質、およびそれらの結合物がＰＤＭＳに付着すると、正確な測定を行うことができない。
【0011】
上記現状に鑑みて、本開示は、シングルドメイン抗体に蛍光色素を結合した蛍光標識物質を用いた蛍光偏光免疫分析法を提供することを目的とする。
【0012】
また本開示は、マイクロ流路を有する測定機器でも測定可能な蛍光偏光免疫分析法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0014】
本開示者等は、蛍光偏光免疫分析法について詳細に検討した結果、シングルドメイン抗体は、蛍光寿命が４ナノ秒の蛍光色素を結合しても、１５０ｋＤａの高分子量の測定対象物を定量できること、このようにして得られた蛍光標識物質は蛍光偏光度の感度に優れ低濃度でも測定ができること、しかも蛍光標識物質と測定対象物質との結合物はマイクロ流路にも付着しないことを見出し、本開示を完成させた。
【0015】
すなわち本開示は、試料中の測定対象物質を分析するための蛍光偏光免疫分析法であって、
前記測定対象物質に結合能を有するシングルドメイン抗体を蛍光色素で標識した蛍光標識物質を、前記試料に含まれる前記測定対象物質と結合させる結合工程、および
前記測定対象物質が結合した前記蛍光標識物質の蛍光偏光度変化を測定する測定工程、を含み、
該測定工程では、前記蛍光標識物質、または前記測定対象物質が結合した前記蛍光標識物質を含む前記試料をＰＤＭＳにより形成されたマイクロ流路に供給して蛍光偏光分析を行う、蛍光偏光免疫分析法を提供するものである。
前記測定対象物質に結合能を有するシングルドメイン抗体を蛍光色素で標識した蛍光標識物質を、前記試料に含まれる前記測定対象物質と結合させる結合工程、および
前記測定対象物質が結合した前記蛍光標識物質の蛍光偏光度変化を測定する測定工程、を含み、
該測定工程では、前記蛍光標識物質、または前記測定対象物質が結合した前記蛍光標識物質を含む前記試料をＰＤＭＳにより形成されたマイクロ流路に供給して蛍光偏光分析を行う、蛍光偏光免疫分析法を提供するものである。
【0016】
また本開示は、前記蛍光色素は、蛍光寿命が１～３，０００ナノ秒である、前記蛍光偏光免疫分析法を提供するものである。
【発明の効果】
【0019】
本開示によれば、シングルドメイン抗体に蛍光色素を結合した蛍光標識物質を用いた蛍光偏光免疫分析法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【図1】測定対象物質の質量と蛍光偏光度および蛍光色素の蛍光寿命との関係を説明する図である。
【図2】実施例１の蛍光偏光度測定によるウサギＩｇＧの標準曲線の結果、および比較例１の蛍光偏光度測定によるウサギＩｇＧの標準曲線の結果を示す図である。
【図3】実施例２の抗体のＳＨ基にＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８を結合した蛍光標識物質を用いたＨｅｒ２の標準曲線の結果を示す図である。
【図4】実施例３の抗体のアミノ基にＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８を結合した蛍光標識物質を用いたＨｅｒ２の標準曲線の結果を示す図である。
【図5】実施例４で使用した蛍光偏光度測定装置の概略構成を示す図である。
【図6】試料発光部を観察する有効視野内のマイクロ流路を説明する図である。
【図7】実施例４で使用したマイクロ流路の蛍光偏光度測定画像を示す図である。
【図8】実施例４の蛍光偏光度測定によるウサギＩｇＧの標準曲線、および測定試料の蛍光偏光度の結果を示す図である。
【図9】実施例５の蛍光偏光度測定によるウサギＩｇＧの標準曲線の結果を示す図である。
【図10】比較例２の蛍光偏光度測定によるウサギＩｇＧの標準曲線の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0021】
本開示の第１は、試料中の測定対象物質を分析するための蛍光偏光免疫分析法であって、
前記測定対象物質に結合能を有するシングルドメイン抗体を蛍光色素で標識した蛍光標識物質を、前記試料に含まれる前記測定対象物質と結合させる結合工程、および
前記測定対象物質が結合した前記蛍光標識物質の蛍光偏光度変化を測定する測定工程、を含む、蛍光偏光免疫分析法である。シングルドメイン抗体を使用することで検出感度が向上し、測定対象物質を低濃度で含む試料や高分子量の測定対象物質でも測定することができる。
前記測定対象物質に結合能を有するシングルドメイン抗体を蛍光色素で標識した蛍光標識物質を、前記試料に含まれる前記測定対象物質と結合させる結合工程、および
前記測定対象物質が結合した前記蛍光標識物質の蛍光偏光度変化を測定する測定工程、を含む、蛍光偏光免疫分析法である。シングルドメイン抗体を使用することで検出感度が向上し、測定対象物質を低濃度で含む試料や高分子量の測定対象物質でも測定することができる。
【0022】
重鎖のみで構成される重鎖抗体は、フタコブラクダ、ヒトコブラクダ、ラマ、アルパカ、ビクーニャ、グアナコなどのラクダ科動物や、サメ、エイなどの軟骨魚類の体内で生産されることが知られている。ラクダ科動物由来の重鎖抗体の可変領域はＶＨＨ抗体と称され、軟骨魚類由来の重鎖抗体の可変領域はｖＮＡＲ(new antigen receptor)抗体と称される。重鎖抗体の各重鎖の可変領域は、それぞれフレームワーク領域とＣＤＲとによって抗原結合性を発揮するシングルドメイン抗体である。本開示における「シングルドメイン抗体」とは、１つの可変領域で構成される抗体を意味する。従って、ＶＨＨ抗体およびｖＮＡＲ抗体は、シングルドメイン抗体として使用することができる。
【0023】
本開示で使用するシングルドメイン抗体は、特定の測定対象物質への結合能を有するものに限定される。少なくとも測定対象物質のいずれか一部をエピトープとし、このエピトープを認識して結合できる結合能が必要である。
【0024】
このような結合能を有するシングルドメイン抗体は、測定対象物質を抗原とする重鎖抗体を調製し、その一部を切断などによって切り出して調製することができる。例えば、重鎖抗体生産動物に測定対象物質を抗原として免疫し、免疫動物のＢ細胞から抗原に結合する重鎖抗体を選択することができる。重鎖抗体を酵素その他で切断して得たＶＨＨ抗体やｖＮＡＲ抗体などの可変領域をシングルドメイン抗体として使用することができる。また、シングルドメイン抗体は、重鎖抗体からの分離物に限定されるものではない。従来公知のＶＨＨ抗体やｖＮＡＲ抗体のＤＮＡ配列を参照し、または、抗体ライブラリー等を使用して特定の物質に対して特異的な結合能を有するシングルドメイン抗体を遺伝子工学的に製造したものであってもよい。更にこのように調製されたシングルドメイン抗体に、測定対象物質への結合性を損なわない範囲で、耐熱性向上、耐薬品性向上、耐圧性向上、その他の目的で、アミノ酸の一部が他のアミノ酸残基に置換したものであってもよい。更に、従来公知のＦａｂ抗体やｓｃＦｖ抗体を分解して１つの可変領域を取出し、シングルドメイン抗体として使用してもよい。
【0025】
本開示で使用するシングルドメイン抗体は蛍光色素で標識され、蛍光標識物質として使用される。
【0026】
本開示において「蛍光」とは、電子を励起させる光を照射して生じる発光を意味する。また、「蛍光色素」とは、蛍光を発光する色素を意味する。リン光も蛍光同様に原子がエネルギーを吸収して励起状態になるため、本開示では、りん光を発光する色素も蛍光色素に含まれる。蛍光色素がりん光を発光する場合、蛍光に代えてりん光に基づく蛍光偏光度を測定してもよい。
【0027】
本開示で使用できる蛍光色素としては、クロロトリアジニルアミノフルオレセイン、４’－アミノメチルフルオレセイン、５－アミノメチルフルオレセイン、６－アミノメチルフルオレセイン、６－カルボキシフルオレセイン、５－カルボキシフルオレセイン、５および６－アミノフルオレセイン、チオウレアフルオレセイン、メトキシトリアジニルアミノフルオレセインなどのフルオレセイン化合物；ニトロベンゾオキサジアゾールクロライドなどのニトロベンゾオキサジアゾール誘導体；インドレニン；ダンシルなどのダンシル誘導体；ジアルキルアミノナフタレン、ジアルキルアミノナフタレンスルホニルなどのナフタレン誘導体；Ｎ－（１－ピレニル）マレイミド、アミノピレン、ピレンブタン酸、アルキニルピレンなどのピレン誘導体；白金、レニウム、ルテニウム、オスミウム、ユーロピウムなどの金属錯体；ローダミンＢ、ローダミン６Ｇ、ローダミン６ＧＰなどのローダミン誘導体；登録商標又は商品名としてＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８などのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒシリーズ、ＢＯＤＩＰＹシリーズ、ＤＹシリーズ、 ＡＴＴＯシリーズ、Ｄｙ Ｌｉｇｈｔシリーズ、Ｏｙｓｔｅｒシリーズ、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒシリーズ、 Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、Ｍａｒｉｎａ Ｂｌｕｅ、Ａｃｒｉｄｉｎｅ、Ｅｄａｎｓ、Ｃｏｕｍａｒｉｎ、ＤＡＮＳＹＬ、ＦＡＮ、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｇｒｅｅｎ－Ｘ、ＮＢＤ－Ｘ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、Ｙａｋｉｍａ Ｙｅｌｌｏｗ、ＶＩＣ、ＨＥＸ、Ｒ６Ｇ、Ｃｙ３、ＴＡＭＲＡ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ－Ｘ、Ｒｅｄｍｏｎｄ Ｒｅｄ、ＲＯＸ、Ｃａｌ Ｒｅｄ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、ＬＣ Ｒｅｄ ６４０、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、ＬＣ Ｒｅｄ ７０５などが挙げられる。ルテニウムはりん光を発し、その蛍光寿命は２，７００ナノ秒である。
【0028】
ここに蛍光色素の蛍光寿命、および蛍光偏光度と分子量との関係を図１に模式的に示す。この図は、"Use of a Long-Lifetime Re(I) Complex in Fluorescence Polarization Immunoassays of High-Molecular-Weight Analytes", Analytical chemistry, 1998, Vol.70. P632を参照して作成したものである。図１の横軸は分子量であり、縦軸は蛍光偏光度である。図１では、蛍光色素の蛍光寿命によって蛍光偏光度で測定可能な合計質量領域が異なること、および蛍光偏光度が所定範囲（図１では約０．０５～０．３５の範囲）で測定対象物質を定量できることを示している。例えば、蛍光寿命が４ナノ秒の蛍光色素を使用した場合には１×１０３～１×１０５（Ｄａ）の領域で、蛍光寿命が１００ナノ秒の蛍光色素を使用した場合には１×１０４～１×１０７（Ｄａ）の領域で、蛍光寿命が２，７００ナノ秒の蛍光色素を使用した場合には１×１０６～１×１０８（Ｄａ）の領域で蛍光偏光度が大きく変化する。蛍光偏光度は、励起されてから蛍光を発するまでの間に測定対象物質が結合した蛍光標識物質の回転拡散によって解消される。より長寿命の蛍光色素を用いればより高分子量の領域で蛍光偏光度の変化が測定できる。そのため、例えば、蛍光寿命が４ナノ秒の蛍光色素を１５０ｋＤａのＩｇＧ抗体に結合して蛍光標識物質としてとして用いる場合は、蛍光標識物質がすでに０．３７の蛍光偏光度を有するため、これが高分子量の測定対象物質と結合したとしても蛍光偏光度はほとんど変化しない。特許文献２の実施例では、ＩｇＧ抗体にピレン誘導体などの長寿命色素を使用することで、蛍光標識物質単体での蛍光偏光度を低下させ、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ；分子量１２万）、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ；分子量約４０万）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ；分子量３００万）などの高分子量物質を測定している。
【0029】
しかしながら、本開示では、測定対象物質の分子量に関わらず、蛍光寿命が４～３，０００ナノ秒の蛍光色素を使用することができる。ただし、測定対象物質の分子量、励起波長などの測定条件、測定サンプルの自家蛍光に応じて、上記蛍光寿命の範囲で適宜選択してもよい。例えば、測定対象物質の質量が約１５，０００～２×１０５Ｄａの場合に蛍光寿命が４ナノ秒程度の従来の蛍光色素を使用し、測定対象物質の質量が約２×１０5～１０８Ｄａの場合に蛍光寿命が１００ナノ秒程度の蛍光色素を使用するなどとしてもよい。後記する実施例に示すように、本開示では、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８などの蛍光寿命の短い蛍光色素を使用して、約１５０ｋＤａの高分子量の測定対象物質を定量することができる。しかも、定量下限は０．４５ｎＭと算出され、低濃度での検出が可能である。このように、汎用性の高いＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８などの蛍光色素を使用して高感度かつ高分子量の測定対象物質を測定できる理由は明確ではないが、シングルドメイン抗体が低分子量であること、抗原認識領域の近傍に蛍光色素を結合でき、これにより蛍光標識物質と測定対象物質との結合の揺らぎが減少することなどが相乗的に作用し、蛍光偏光度の感度が上昇したものと推定される。
【0030】
蛍光標識物質は、シングルドメイン抗体を蛍光色素と反応させて標識し、調製することができる。蛍光色素には一般に、アミノ基、カルボキシル基、ハロゲン、ニトロ基等の官能基が導入されている。シングルドメイン抗体はポリペプチドであるため、シングルドメイン抗体と蛍光色素とは、当業者に周知の条件に従って行うことができる。例えば、蛍光色素の官能基を活性化させシングルドメイン抗体と混合し、４～６５℃で数時間反応させ共有結合を形成させることができる。未反応の蛍光色素は、反応終了後に、常法により精製することができる。シングルドメイン抗体は、耐熱性に優れるため、高温での反応も可能であり、種々の反応条件で蛍光標識物質を調製することができる。なお、シングルドメイン抗体を遺伝子工学的に製造する場合には、蛍光色素の結合を希望する位置に、蛍光色素と反応できるアミノ基やカルボキシル基、チオール基などを有するアミノ酸残基を導入し、これに対応する官能基を有する蛍光色素を反応させてもよい。これにより、可変領域の近傍や、Ｎ末端、Ｃ末端、その他シングルドメイン抗体のアルギニン、アスパラギン、グルタミン、リジンに由来する－ＮＨ２基、システインに由来する－ＳＨ基、その他任意の位置に蛍光色素を結合させることができる。なお、シングルドメイン抗体と蛍光色素とを任意のリンカーを介して結合してもよい。
【0031】
シングルドメイン抗体１分子に対する蛍光色素の分子の結合数は、任意に選択することができる。好ましくはシングルドメイン抗体１分子に対して１分子以上であり、より好ましくは２～５分子である。シングルドメイン抗体の平均質量は１２～１５ｋＤａであり、５分子以上を結合させると測定対象物質との結合性が損なわれる場合がある。
【0032】
本開示で測定可能な測定対象物質としては、少なくともその一部をエピトープとするシングルドメイン抗体を調製できればよく、特に限定はない。例えば、好ましい質量は、１．５×１０３～１×１０８Ｄａ、より好ましくは１×１０５～１×１０８Ｄａである。また、大きさでは好ましくはストーク径が１ｎｍ～１０μｍであり、より好ましくは３ｎｍ～１０μｍである。この範囲で測定可能である。また、測定対象物質の由来や特性で分類すれば、生物由来物質、医薬、ウイルス、またはバクテリアなどの測定も可能である。生物由来物質としては、生物が体内に産生する各種成分、生体外に排出する各種成分、当該生物自体も含み、生物としては植物も動物も含むものとする。また、医薬としては、ヒト、動物に投与する医薬に限定されず、農薬などを含むものとする。
【0033】
生物由来物質としては、視床下部、下垂体、甲状腺、副甲状腺、副腎、膵臓、生殖器などの内分泌器官で合成、分泌される生理活性物質であるホルモン；核酸、尿酸、プリン体、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、アポリポタンパク質、ＨＤＬ、ＬＤＬ、糖化ヘモグロビン、などの代謝物質；マイコトキシン、アフラトキシンＢ１、ボツリヌストキシンＡなどの貝毒や細菌毒；モルヒネ、アトロピン、キニーネ、コカインなどの植物由来アルカロイド；大腸菌、レンサ球菌、桿菌、サルモネラ菌、緑膿菌などの細菌自体がある。また、医薬としては、クロラムフェニコール、シクロスポリン等の抗生物質、農業の効率化等に使用される殺菌剤、防黴剤、殺虫剤、除草剤、殺鼠剤、植物成長調整剤などの農薬がある。ウイルスは、他生物の細胞を利用して自己を複製させる極微小な感染性の構造体である。測定可能なウイルスとしては、インフルエンザウイルス、コロナウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、エイズウイルスがある。
【0034】
本開示の蛍光偏光免疫分析法では、測定対象物質が結合した蛍光標識物質の蛍光偏光度を測定する。試料に含まれる測定対象物質の特性に応じて純水その他の希釈用液で適宜希釈し、必要に応じて夾雑物等を除去して試料溶液を調製する。この試料溶液に蛍光標識物質を混合し、測定対象物質と蛍光標識物質とを結合させる。ついで測定対象物質と蛍光標識物質との結合物の蛍光偏光度を測定する。蛍光偏光度の測定には、任意の偏光測定装置を用い得ることができる。測定は測定対象物質が変性しない範囲であればよく、温度４～４０℃の範囲、好ましくは上記範囲内で一定温度で行う。測定対象物質を定量するには、予め既知の濃度の測定対象物質を含む溶液を用いて上記と同様に操作して得た検量線を作成し、試料溶液の測定値と比較すればよい。
【0035】
測定対象物質として細菌などの微生物を分析する場合も上記と同様である。予め、細菌のいずれか一部をエピトープとして特異的に結合するシングルドメイン抗体を調製し、およびこのシングルドメイン抗体と蛍光色素とが結合した蛍光標識物質を調製する。試料溶液に蛍光標識物質を添加して試料溶液に含まれる細菌と蛍光標識物質とを結合させる。次いで、細菌が結合した蛍光標識物質の蛍光偏光度変化を測定すればよい。予め既知の濃度の測定対象物質を含む溶液を用いて調製した検量線を用い、試料溶液の測定値と比較することで細菌量を定量することができる。細菌に代えてウイルスを測定する場合も同様である。
【0036】
本開示では、蛍光偏光度を測定できれば、装置に限定はない。一方、マイクロ流路で構成される測定装置を使用することで、微量の試料を用いて高感度の測定を行うことができる。蛍光偏光測定法で使用されるマイクロ流路は、蛍光偏光度に影響を与えない部材で構成される必要があり、ＰＤＭＳが使用されることが多い。しかし、Ｆａｂ抗体と蛍光色素とを結合させた蛍光標識物質を使用すると、蛍光標識物質と測定対象物質との結合物がＰＤＭＳに付着することが判明した。これに対しシングルドメイン抗体と蛍光色素とを反応してなる蛍光標識物質を使用すると、蛍光標識物質と測定対象物質との結合物はＰＤＭＳで形成したマイクロ流路に付着せず、迅速かつ正確な測定が可能である。シングルドメイン抗体の可変領域は１つであるが、Ｆａｂ抗体は４つの可変領域を含み、これに対応して体積も３～４倍となる。このような体積や構造の差によってＰＤＭＳに対する付着能が相違するものと推定される。
【0037】
このようなマイクロ流路を有する蛍光偏光度測定装置としては、後記する実施例４で使用する蛍光偏光度測定装置がある。蛍光標識物質や試料、測定対象物質が結合した蛍光標識物質などをマイクロ流路に供給し、蛍光偏光度を測定するが、少なくとも蛍光標識物質が励起光の照射によって蛍光を生ずる試料発光部をマイクロ流路で形成し、蛍光偏光度を測定することが好ましい。マイクロ流路であれば蛍光偏光度を測定する光学観察部分の有効視野内に複数の流路を形成することができ、複数のサンプルを同時に測定および画像解析を行うことができる。例えば、光学観察部分の有効視野が約３ｍｍφの場合でも、流路ピッチを約３００μｍに設定すれば、９本の流路を形成することができる。この流路ピッチに対して流路幅と流路間スペースの寸法を任意に設定でき、例えば流路幅と流路間スペースとを等間隔にすれば、流路幅１５０μｍ、流路間スペース１５０μｍに設定することができる。流路深さが深いほど測定感度が向上するため、流路深さを９００μｍ等と設定することができる。なお、測定感度を向上するため、マイクロ流路構成材料を黒色化してもよい。上記は一例である。製造容易性に対しては、流路深さと流路幅寸法との間で密接な関連があり、例えば流路深さが３００μｍの場合は、流路幅を２００μｍ以上等とすることもできる。流路幅が大きくなると、光学系の構成に依存せず光取り出し効率改善につながり、測定均一性が向上するという特長を有する。
【0038】
本開示の蛍光偏光測定法によれば、マイクロ流路を使用するか否かにかかわらず、試料に含まれる測定対象物質の濃度が、１００ｐＭ～１０μＭ、より好ましくは１～１，０００ｎＭの範囲で測定することができる。また、本開示の蛍光偏光測定法によれば、質量１．５×１０３～１×１０８Ｄａ、より好ましくは１×１０５～１×１０８Ｄａの測定対象物質の濃度を定量することができる。具体的には、質量約１５０ｋＤａの測定物質の場合には、濃度０．４～１０，０００ｎＭの範囲で測定することができる。しかも、後記する実施例に示すように、シングルドメイン抗体に蛍光寿命が１～１０ナノ秒の蛍光色素で標識した蛍光標識物質を使用することで、ＩｇＧなどの高分子量の測定対象物質を定量する場合でも、Ｆａｂ抗体を使用する場合より蛍光偏光度の変動幅を拡大することができる。
【0039】
本開示の第２は、シングルドメイン抗体に蛍光色素を結合した蛍光標識物質である。シングルドメイン抗体とは、上記したように、１つの可変領域で構成される抗体を意味する。ＶＨＨ抗体やｖＮＡＲ抗体は、シングルドメイン抗体として使用することができる。従来公知のＦａｂ抗体やｓｃＦｖ抗体を分解して１つの可変領域を取出し、シングルドメイン抗体として使用してもよい。更に、従来公知のＶＨＨ抗体やｖＮＡＲ抗体のＤＮＡ配列を参照し、また、抗体ライブラリー等を使用して遺伝子工学的に製造し、または適宜改変したものであってもよい。
【0040】
蛍光色素は、蛍光を発光する色素である。蛍光色素は、カルボキシル基、アミノ基、水酸基、チオール、フェニル基、などに結合し得る官能基を有することが好ましい。シングルドメイン抗体は、カルボキシル基、アミノ基、水酸基、チオール、フェニル基を有することが多く、蛍光色素がこれらに結合できる官能基を有すると蛍光標識物質の形成が容易だからである。
また、蛍光色素にはそれぞれ独自の蛍光寿命が存在する。本開示では、蛍光標識物質の使用目的に応じて、蛍光寿命が１～１０ナノ秒の蛍光色素、蛍光寿命が１０ナノ秒超から２００ナノ秒の蛍光色素、蛍光寿命が２００ナノ秒超から３，０００ナノ秒の蛍光色素を適宜選択して、使用することができる。
蛍光寿命が１～１０ナノ秒の蛍光色素としては、インドレニン、クロロトリアジニルアミノフルオレセイン、４’－アミノメチルフルオレセイン、５－アミノメチルフルオレセイン、６－アミノメチルフルオレセイン、６－カルボキシフルオレセイン、５－カルボキシフルオレセイン、５および６－アミノフルオレセイン、チオウレアフルオレセイン、メトキシトリアジニルアミノフルオレセインなどのフルオレセイン化合物、ローダミンＢ、ローダミン６Ｇ、ローダミン６ＧＰなどのローダミン誘導体；登録商標又は商品名としてＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８などのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒシリーズ、ＢＯＤＩＰＹシリーズ、ＤＹシリーズ、 ＡＴＴＯシリーズ、Ｄｙ Ｌｉｇｈｔシリーズ、Ｏｙｓｔｅｒシリーズ、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒシリーズ、 Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、Ｍａｒｉｎａ Ｂｌｕｅ、Ａｃｒｉｄｉｎｅ、Ｅｄａｎｓ、Ｃｏｕｍａｒｉｎ、ＤＡＮＳＹＬ、ＦＡＮ、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｇｒｅｅｎ－Ｘ、ＮＢＤ－Ｘ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、Ｙａｋｉｍａ Ｙｅｌｌｏｗ、ＶＩＣ、ＨＥＸ、Ｒ６Ｇ、Ｃｙ３、ＴＡＭＲＡ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ－Ｘ、Ｒｅｄｍｏｎｄ Ｒｅｄ、ＲＯＸ、Ｃａｌ Ｒｅｄ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、ＬＣ Ｒｅｄ ６４０、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、ＬＣ Ｒｅｄ ７０５がある。
また、蛍光色素にはそれぞれ独自の蛍光寿命が存在する。本開示では、蛍光標識物質の使用目的に応じて、蛍光寿命が１～１０ナノ秒の蛍光色素、蛍光寿命が１０ナノ秒超から２００ナノ秒の蛍光色素、蛍光寿命が２００ナノ秒超から３，０００ナノ秒の蛍光色素を適宜選択して、使用することができる。
蛍光寿命が１～１０ナノ秒の蛍光色素としては、インドレニン、クロロトリアジニルアミノフルオレセイン、４’－アミノメチルフルオレセイン、５－アミノメチルフルオレセイン、６－アミノメチルフルオレセイン、６－カルボキシフルオレセイン、５－カルボキシフルオレセイン、５および６－アミノフルオレセイン、チオウレアフルオレセイン、メトキシトリアジニルアミノフルオレセインなどのフルオレセイン化合物、ローダミンＢ、ローダミン６Ｇ、ローダミン６ＧＰなどのローダミン誘導体；登録商標又は商品名としてＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８などのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒシリーズ、ＢＯＤＩＰＹシリーズ、ＤＹシリーズ、 ＡＴＴＯシリーズ、Ｄｙ Ｌｉｇｈｔシリーズ、Ｏｙｓｔｅｒシリーズ、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒシリーズ、 Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、Ｍａｒｉｎａ Ｂｌｕｅ、Ａｃｒｉｄｉｎｅ、Ｅｄａｎｓ、Ｃｏｕｍａｒｉｎ、ＤＡＮＳＹＬ、ＦＡＮ、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｇｒｅｅｎ－Ｘ、ＮＢＤ－Ｘ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、Ｙａｋｉｍａ Ｙｅｌｌｏｗ、ＶＩＣ、ＨＥＸ、Ｒ６Ｇ、Ｃｙ３、ＴＡＭＲＡ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ－Ｘ、Ｒｅｄｍｏｎｄ Ｒｅｄ、ＲＯＸ、Ｃａｌ Ｒｅｄ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、ＬＣ Ｒｅｄ ６４０、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、ＬＣ Ｒｅｄ ７０５がある。
【0041】
蛍光寿命が１０ナノ秒超から２００ナノ秒の蛍光色素としては、ジアルキルアミノナフタレンスルホニルなどのナフタレン誘導体、Ｎ－（１－ピレニル）マレイミド、アミノピレン、ピレンブタン酸、アルキニルピレンなどのピレン誘導体がある。
蛍光寿命が２００ナノ秒超から３，０００ナノ秒の蛍光色素としては、白金、レニウム、ルテニウム、オスミウム、ユーロピウムなどの金属錯体がある。
蛍光寿命が２００ナノ秒超から３，０００ナノ秒の蛍光色素としては、白金、レニウム、ルテニウム、オスミウム、ユーロピウムなどの金属錯体がある。
【0042】
本開示の蛍光標識物質としては、シングルドメイン抗体に蛍光寿命が１～１０ナノ秒の蛍光色素を結合した蛍光標識物質であってもよく、シングルドメイン抗体に蛍光寿命が１０ナノ秒超から２００ナノ秒の蛍光色素を結合した蛍光標識物質であってもよく、シングルドメイン抗体に蛍光寿命が２００ナノ秒超から３，０００ナノ秒の蛍光色素を結合した蛍光標識物質であってもよい。この蛍光標識物質を使用して、質量１．５×１０３～１×１０８Ｄａ、より好ましくは１×１０５～１×１０８Ｄａの測定対象物質の濃度を蛍光偏光免疫分析法により測定することができる。
【0043】
蛍光色素とシングルドメイン抗体との結合は共有結合によることが好ましい。蛍光色素の前記した官能基とシングルドメイン抗体とを、当業者に周知の条件に従って反応させ、蛍光標識物質を製造することができる。例えば、蛍光色素の官能基を活性化させ、シングルドメイン抗体と混合し、温度４～６５℃で数時間反応させ共有結合を形成させることができる。反応終了後、未反応の蛍光色素を常法により除去する。また、シングルドメイン抗体を遺伝子工学的に製造する際に、蛍光色素の結合を希望する位置に、蛍光色素との反応できるアミノ基やカルボキシル基、チオール基などを有するアミノ酸残基を導入し、これに対応する官能基を有する蛍光色素を反応させてもよい。これにより、可変領域の近傍や、Ｎ末端、Ｃ末端、その他シングルドメイン抗体のアルギニン、アスパラギン、グルタミン、リジンに由来する－ＮＨ２基、システインに由来する－ＳＨ基、その他任意の位置に蛍光色素を結合させることができる。また、シングルドメイン抗体と蛍光色素とを、リンカーを介して結合してもよい。このようなリンカーとしては、オリゴエチレングリコール、アルキル鎖がある。後記する実施例に示すように、シングルドメイン抗体の可変領域近傍に該当するＮ末端に蛍光色素を結合した蛍光標識物質は、蛍光変更度の感度に優れる。
【0044】
本開示の蛍光標識物質は、蛍光偏光免疫分析法、サンドイッチイムノアッセイ、免疫染色に使用することができる。
【0045】
シングルドメイン抗体は、低分子抗体であるＦａｂ抗体やｓｃＦｖ抗体よりも低分子量であり、グアニジン塩酸塩や尿素などの変性剤溶液、高温、高圧などの変性状態下でも天然の構造へ巻き戻りやすく、耐熱性、耐圧性、耐薬品性に優れる。特に耐熱性に優れ、９０℃という高温条件下から室温に戻すと熱処理前と抗原結合活性を示す。温度変化等に耐性があり、流通や保存等の際に有利である。更に、水系溶媒に対する高い溶解度を有し、界面活性剤に対する安定性にも優れるため、測定対象物質に特異的に結合できるシングルドメイン抗体を遺伝子工学的に調製する際の操作性にも優れる。また、これを蛍光偏光免疫分析法で使用すると、蛍光寿命が１～１０ナノ秒の汎用性の高い蛍光色素を使用して高分子量の測定対象物質を測定することができ、低濃度でも測定できるため試料量の低減を図ることができるなどの利点がある。
【実施例】
【0046】
次に実施例を挙げて本開示を具体的に説明するが、これらの実施例は何ら本開示を制限するものではない。
【0047】
（実施例１）
（１）ウサギＩｇＧを定量するため、ウサギＩｇＧ（シグマアルドリッチ社製）をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（富士フィルム和光純薬株式会社製）に溶解し、３，２３０ｎＭ、１，０８０ｎＭ、３６０ｎＭ、１２０ｎＭ、４０ｎＭ、１３ｎＭ、４．４ｎＭ、１．５ｎＭ、０．４９ｎＭの９水準のウサギＩｇＧ溶液を作成した。
（２）測定対象物質（ウサギＩｇＧ）に結合能を有するシングルドメイン抗体を蛍光色素で標識した蛍光標識物質として、Ａｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ Ａｌｐａｃａ－ｍｏｎｏ， ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＶＨＨ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８修飾（ＶＨＨ）（Ｃｈｒｏｍｏｔｅｋ社製、質量１５ｋＤａ）を使用した。これをＰＢＳにて１００倍希釈し、蛍光標識物質溶液を調製した。
（３）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｂｉｏｗｅｓｔ社製）をＰＢＳを用いて１０倍希釈し、ＦＢＳ溶液を得た。
（４）前記蛍光標識物質溶液１６μＬ（ＶＨＨ５μｇ／ｍＬ含有）、ＦＢＳ溶液６０μＬ、９水準のウサギＩｇＧ溶液６０μＬ、ＰＢＳ４６４μＬを混合し、６００μＬの９種の標準曲線作成用サンプルを調製した。この調製により、抗体濃度は１０ｎＭとなった。各サンプル調製後、室温で２時間遮光静置後に蛍光偏光度を測定した。
（５）蛍光偏光度測定装置として、分光蛍光計Ｆ７１００（日立ハイテクサイエンス製）を使用し蛍光偏光モードで測定した。励起波長は４９０ｎｍ，検出波長は５１０－５４０ｎｍ、スキャンスピード６０ｎｍ／ｍｉｎ、初期待ち時間０ｓ、蛍光側スリット１０ｎｍ、励起側スリット１０ｎｍ、レスポンス０．００２ｓとした。０．０４９ｎＭのウサギＩｇＧを含む標準曲線作成用サンプル１５０μＬをセルに入れてＧ値測定を測定した。標準曲線作成用サンプルを石英セルに入れ、蛍光偏光度を測定した。データはいずれも３回測定とした。結果を図２に、ＶＨＨ抗体（１５ｋＤａ）として示す。
（１）ウサギＩｇＧを定量するため、ウサギＩｇＧ（シグマアルドリッチ社製）をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（富士フィルム和光純薬株式会社製）に溶解し、３，２３０ｎＭ、１，０８０ｎＭ、３６０ｎＭ、１２０ｎＭ、４０ｎＭ、１３ｎＭ、４．４ｎＭ、１．５ｎＭ、０．４９ｎＭの９水準のウサギＩｇＧ溶液を作成した。
（２）測定対象物質（ウサギＩｇＧ）に結合能を有するシングルドメイン抗体を蛍光色素で標識した蛍光標識物質として、Ａｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ Ａｌｐａｃａ－ｍｏｎｏ， ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＶＨＨ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８修飾（ＶＨＨ）（Ｃｈｒｏｍｏｔｅｋ社製、質量１５ｋＤａ）を使用した。これをＰＢＳにて１００倍希釈し、蛍光標識物質溶液を調製した。
（３）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｂｉｏｗｅｓｔ社製）をＰＢＳを用いて１０倍希釈し、ＦＢＳ溶液を得た。
（４）前記蛍光標識物質溶液１６μＬ（ＶＨＨ５μｇ／ｍＬ含有）、ＦＢＳ溶液６０μＬ、９水準のウサギＩｇＧ溶液６０μＬ、ＰＢＳ４６４μＬを混合し、６００μＬの９種の標準曲線作成用サンプルを調製した。この調製により、抗体濃度は１０ｎＭとなった。各サンプル調製後、室温で２時間遮光静置後に蛍光偏光度を測定した。
（５）蛍光偏光度測定装置として、分光蛍光計Ｆ７１００（日立ハイテクサイエンス製）を使用し蛍光偏光モードで測定した。励起波長は４９０ｎｍ，検出波長は５１０－５４０ｎｍ、スキャンスピード６０ｎｍ／ｍｉｎ、初期待ち時間０ｓ、蛍光側スリット１０ｎｍ、励起側スリット１０ｎｍ、レスポンス０．００２ｓとした。０．０４９ｎＭのウサギＩｇＧを含む標準曲線作成用サンプル１５０μＬをセルに入れてＧ値測定を測定した。標準曲線作成用サンプルを石英セルに入れ、蛍光偏光度を測定した。データはいずれも３回測定とした。結果を図２に、ＶＨＨ抗体（１５ｋＤａ）として示す。
【0048】
（比較例１）
Ａｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ Ａｌｐａｃａ－ｍｏｎｏ， ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＶＨＨ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８修飾（ＶＨＨ）に代えてＡｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ Ａｌｅｘａ標識 Ｆａｂフラグメント （Ｆａｂ） （Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社製、質量５０ｋＤａ）を使用した以外は実施例１と同様に操作した。結果を図２に、Ｆａｂ抗体（５０ｋＤａ）として示す。
Ａｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ Ａｌｐａｃａ－ｍｏｎｏ， ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＶＨＨ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８修飾（ＶＨＨ）に代えてＡｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ Ａｌｅｘａ標識 Ｆａｂフラグメント （Ｆａｂ） （Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社製、質量５０ｋＤａ）を使用した以外は実施例１と同様に操作した。結果を図２に、Ｆａｂ抗体（５０ｋＤａ）として示す。
【0049】
図２に示すように、Ｆａｂ抗体を使用した比較例１の蛍光偏光度は、０．１０８～０．１３８の範囲で変動し、変動幅は０．０３であった。一方、ＶＨＨ抗体を使用した実施例１の蛍光偏光度は、０．０８２～０．１３の範囲で変動し、変動幅は０．０４８であった。ＶＨＨ抗体を使用することでＦａｂ抗体を使用する場合より、変動幅１．６倍が広がった。
【0050】
また、実施例１および比較例１の結果を、表１に示す条件でシグモイド曲線を作成し、定量下限および定量上限を算出した。
その結果、Ｆａｂ抗体を使用した比較例１の定量下限は５．４ｎＭ、定量上限は１８ｎＭとなったが、ＶＨＨ抗体を使用した実施例１の定量下限は０．４５ｎＭ、定量上限は４１ｎＭと算出された。０．４５ｎＭという低濃度でも測定可能であることが判明した。
【表1】
【0051】
（実施例２）
（１）測定対象物質Ｈｅｒ２（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社製、ＥｒｂＢ２／Ｈｅｒ２ Ｆｃキメラリコンビナントタンパク質）に結合能を有するシングルドメイン抗体として、Ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２ Ａｌｐａｃａ， ｍｏｎｏｃｈｒｏｎａｌ， ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＶＨＨ（ＱＶＱ社製；１ｍｇ／ｍＬ）を使用した。
（２）この抗体２０μＬと２．７５当量のトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ－ＨＣｌ）水溶液（富士フィルム和光純薬株式会社製）を混合し、３７℃で２時間遮光静置した。これに６当量のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８マレイミド（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を添加し、２時間室温で遮光静置し、その後、Ｚｅｂａカラム（７ｋＤａ）を用いて２回精製を行い蛍光標識物質を製造した。この蛍光標識物質は、抗体のＳＨ基にＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８が結合している。
（３）測定対象物質Ｈｅｒ２をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（富士フィルム和光純薬株式会社製））で５０倍に希釈した。この希釈溶液を更にＰＢＳで順次５倍希釈し、４１０ｎＭ、８２ｎＭ、１６ｎＭ、３．３ｎＭ、０．６６ｎＭ、０．１３ｎＭの６水準の濃度のＨｅｒ２溶液を調製した。
（４）前記蛍光標識物質溶液を４４ｎＭとなるようにＰＢＳで希釈した溶液９２．５μＬ、各濃度のＨｅｒ２溶液２００μＬ、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｂｉｏｗｅｓｔ社製）５μＬ、ＰＢＳ４０２．５μＬを混合し、５００μＬの６種の標準曲線作成用サンプルを得た。この調製により、サンプル中のＶＨＨは８．２ｎＭとなった。また、前記蛍光標識物質溶液８０μＬ、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｂｉｏｗｅｓｔ社製）２μＬ、ＰＢＳ１６１μＬを混合し、合計２００μＬのＨｅｒ２を含まない対照サンプルを得た。各サンプル調製後、室温で２時間遮光静置後に蛍光偏光度を測定した。
（５）蛍光偏光度測定装置として、Ｔｅｃａｎ インフィニット２００ＰＲＯ Ｆ Ｐｌｅｘを使用した。励起波長は４９０ｎｍ，検出波長は５１０－５４０ｎｍとした。
結果を図３に示す。Ｈｅｒ２濃度が０．６６～１．６ｎＭの範囲で濃度に応じた蛍光偏光度の上昇を確認することができた。
（１）測定対象物質Ｈｅｒ２（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社製、ＥｒｂＢ２／Ｈｅｒ２ Ｆｃキメラリコンビナントタンパク質）に結合能を有するシングルドメイン抗体として、Ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２ Ａｌｐａｃａ， ｍｏｎｏｃｈｒｏｎａｌ， ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＶＨＨ（ＱＶＱ社製；１ｍｇ／ｍＬ）を使用した。
（２）この抗体２０μＬと２．７５当量のトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ－ＨＣｌ）水溶液（富士フィルム和光純薬株式会社製）を混合し、３７℃で２時間遮光静置した。これに６当量のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８マレイミド（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を添加し、２時間室温で遮光静置し、その後、Ｚｅｂａカラム（７ｋＤａ）を用いて２回精製を行い蛍光標識物質を製造した。この蛍光標識物質は、抗体のＳＨ基にＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８が結合している。
（３）測定対象物質Ｈｅｒ２をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（富士フィルム和光純薬株式会社製））で５０倍に希釈した。この希釈溶液を更にＰＢＳで順次５倍希釈し、４１０ｎＭ、８２ｎＭ、１６ｎＭ、３．３ｎＭ、０．６６ｎＭ、０．１３ｎＭの６水準の濃度のＨｅｒ２溶液を調製した。
（４）前記蛍光標識物質溶液を４４ｎＭとなるようにＰＢＳで希釈した溶液９２．５μＬ、各濃度のＨｅｒ２溶液２００μＬ、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｂｉｏｗｅｓｔ社製）５μＬ、ＰＢＳ４０２．５μＬを混合し、５００μＬの６種の標準曲線作成用サンプルを得た。この調製により、サンプル中のＶＨＨは８．２ｎＭとなった。また、前記蛍光標識物質溶液８０μＬ、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｂｉｏｗｅｓｔ社製）２μＬ、ＰＢＳ１６１μＬを混合し、合計２００μＬのＨｅｒ２を含まない対照サンプルを得た。各サンプル調製後、室温で２時間遮光静置後に蛍光偏光度を測定した。
（５）蛍光偏光度測定装置として、Ｔｅｃａｎ インフィニット２００ＰＲＯ Ｆ Ｐｌｅｘを使用した。励起波長は４９０ｎｍ，検出波長は５１０－５４０ｎｍとした。
結果を図３に示す。Ｈｅｒ２濃度が０．６６～１．６ｎＭの範囲で濃度に応じた蛍光偏光度の上昇を確認することができた。
【0052】
（実施例３）
（１）測定対象物質Ｈｅｒ２（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社製、ＥｒｂＢ２／Ｈｅｒ２ Ｆｃキメラリコンビナントタンパク質）に結合能を有するシングルドメイン抗体として、Ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２ Ａｌｐａｃａ， ｍｏｎｏｃｈｒｏｎａｌ， ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＶＨＨ（ＱＶＱ社製；１ｍｇ／ｍＬ）を使用した。この抗体２０μＬと５当量のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ ＳＤＰ ｅｓｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）をｐＨ８．５の条件で混合し、室温で１時間遮光撹拌した。その後、Ｚｅｂａカラム（７ｋＤａ）を用いて２回精製を行い、蛍光標識物質を製造した。この蛍光標識物質は、抗体の－ＮＨ２基に蛍光色素Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８が結合している。
（２）上記（１）で得た蛍光標識物質を使用した以外は、実施例２と同様に操作し、蛍光偏光度を測定した。結果を図４に示す。－ＮＨ２基にＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８が結合したＶＨＨ抗体を使用した場合は、Ｈｅｒ２濃度が０．６６～８．２ｎＭの範囲で濃度に応じた蛍光偏光度の上昇を確認することができた。また、蛍光偏光度は０．１５８～０．１８７の間で変動し、実施例２の－ＳＨ基に結合した場合より感度に優れて濃度に応じた蛍光偏光度が確認できた。
（１）測定対象物質Ｈｅｒ２（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社製、ＥｒｂＢ２／Ｈｅｒ２ Ｆｃキメラリコンビナントタンパク質）に結合能を有するシングルドメイン抗体として、Ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２ Ａｌｐａｃａ， ｍｏｎｏｃｈｒｏｎａｌ， ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＶＨＨ（ＱＶＱ社製；１ｍｇ／ｍＬ）を使用した。この抗体２０μＬと５当量のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ ＳＤＰ ｅｓｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）をｐＨ８．５の条件で混合し、室温で１時間遮光撹拌した。その後、Ｚｅｂａカラム（７ｋＤａ）を用いて２回精製を行い、蛍光標識物質を製造した。この蛍光標識物質は、抗体の－ＮＨ２基に蛍光色素Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８が結合している。
（２）上記（１）で得た蛍光標識物質を使用した以外は、実施例２と同様に操作し、蛍光偏光度を測定した。結果を図４に示す。－ＮＨ２基にＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８が結合したＶＨＨ抗体を使用した場合は、Ｈｅｒ２濃度が０．６６～８．２ｎＭの範囲で濃度に応じた蛍光偏光度の上昇を確認することができた。また、蛍光偏光度は０．１５８～０．１８７の間で変動し、実施例２の－ＳＨ基に結合した場合より感度に優れて濃度に応じた蛍光偏光度が確認できた。
【0053】
（実施例４）
（１）ウサギＩｇＧを定量するため、ウサギＩｇＧ（シグマアルドリッチ社製）とリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（富士フィルム和光純薬株式会社製）を用いて１,０８０ｎＭ、３６０ｎＭ、１２０ｎＭ、４０ｎＭ、１３ｎＭ、４.４ｎＭ、０．１５ｎＭの７水準のウサギＩｇＧ溶液を作成した。
（２）測定対象物質（ウサギＩｇＧ）に結合能を有するシングルドメイン抗体を蛍光色素で標識した蛍光標識物質として、Ａｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ Ａｌｐａｃａ－ｍｏｎｏ， ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＶＨＨ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８修飾（ＶＨＨ）（Ｃｈｒｏｍｏｔｅｋ社製、質量１５ｋＤａ）を用いた。これをＰＢＳにて１００倍に希釈し、蛍光標識物質溶液を調製した。
（３）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（ａｂｃａｍ社製）をＰＢＳに溶解し、１％ＢＳＡ溶液を得た。
（４）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｂｉｏｗｅｓｔ社製）をＰＢＳを用いて１０倍希釈し、ＦＢＳ溶液を得た。
（５）前記蛍光標識物質溶液８μＬ（ＶＨＨ５μｇ／ｍＬ含有）、ＢＳＡ溶液３０μＬ、各濃度のウサギＩｇＧ溶液３０μＬ、ＰＢＳ２３２μＬを混合し、７水準の各３００μＬの標準曲線作成用サンプルを得た。
（６）また、別個に１３ｎＭおよび１２０ｎＭのウサギＩｇＧを含有するウサギＩｇＧ溶液３０μＬをそれぞれ調製し、前記蛍光標識物質溶液８μＬ（ＶＨＨ１０ｎＭ含有）、ＦＢＳ溶液３０μＬ、ウサギＩｇＧ溶液３０μＬ、ＰＢＳ２３２μＬを混合し測定用サンプルを調製した。
（７）９つのマイクロ流路を有する蛍光偏光度測定装置を使用し、励起波長は４７０±５ｎｍ、検出波長は５２０±５ｎｍで、標準曲線作成用サンプルおよび測定用サンプルの蛍光偏光度を測定した。なおサンプルは、９つのマイクロ流路のうち、７つのマイクロ流路に上記（４）記載の７水準の標準曲線作成用サンプルをそれぞれ注入し、残りの２つのマイクロ流路に上記（５）記載の２水準の測定用サンプルをそれぞれ注入し、同時に測定した。使用した蛍光偏光度測定装置の概略構成を図５に示す。装置１０は、主にＬＥＤ光源部１、励起フィルタ２、蛍光フィルタ３、ダイクロイックフィルタ４、対物レンズ５、結像レンズ６、液晶素子７およびデジタルイメージング素子（ＣＭＯＳ ｏｒ ＣＣＤカメラ）８、および試料発光部９から構成される。中心波長４７０ｎｍのＬＥＤ光源部１からの励起光を励起フィルタ２および対物レンズ５を介して試料発光部９内の試料に照射し、試料が発する蛍光を、ダイクロイックフィルタ４、および蛍光フィルタ３を透過させ、ＣＭＯＳカメラ８により透過光を取得する。蛍光フィルタ３と結像レンズ６との間に配置された液晶素子７に印加して電圧を変調すると、透過する蛍光の偏光方向を変調することができる。この変調周波数とＣＭＯＳカメラ８の取り込み周波数を同期して画像を取得・演算し、偏光度Ｐを二次元画像として算出する。この装置１０の試料発光部９の光学観察部分の有効視野は約３ｍｍφである。標準曲線と実測すべきサンプルの同時測定を行うため９本の流路数を使用する。図６に示すように、円形で示すφ３ｍｍの有効視野内に、流路幅１１と流路間スペース１２とが等間隔に、流路幅１５０μｍ、流路間スペース１５０μｍに調製されている。なお、流路深さは９００μｍである。試料発光部９内に複数のマイクロ流路を形成することで、複数のサンプルを同時に測定することができる。実施例４で使用したマイクロ流路の蛍光偏光度測定画像を図７に示す。
（８）結果を図８に示す。図８において黒丸は標準曲線を示し、黒四角はＩｇＧを１，３ｎＭ、１２ｎＭ含む試料の測定結果である。ＶＨＨ抗体を使用すると、マイクロ流路を備える測定器でも、測定することができた。
（１）ウサギＩｇＧを定量するため、ウサギＩｇＧ（シグマアルドリッチ社製）とリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（富士フィルム和光純薬株式会社製）を用いて１,０８０ｎＭ、３６０ｎＭ、１２０ｎＭ、４０ｎＭ、１３ｎＭ、４.４ｎＭ、０．１５ｎＭの７水準のウサギＩｇＧ溶液を作成した。
（２）測定対象物質（ウサギＩｇＧ）に結合能を有するシングルドメイン抗体を蛍光色素で標識した蛍光標識物質として、Ａｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ Ａｌｐａｃａ－ｍｏｎｏ， ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＶＨＨ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８修飾（ＶＨＨ）（Ｃｈｒｏｍｏｔｅｋ社製、質量１５ｋＤａ）を用いた。これをＰＢＳにて１００倍に希釈し、蛍光標識物質溶液を調製した。
（３）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（ａｂｃａｍ社製）をＰＢＳに溶解し、１％ＢＳＡ溶液を得た。
（４）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｂｉｏｗｅｓｔ社製）をＰＢＳを用いて１０倍希釈し、ＦＢＳ溶液を得た。
（５）前記蛍光標識物質溶液８μＬ（ＶＨＨ５μｇ／ｍＬ含有）、ＢＳＡ溶液３０μＬ、各濃度のウサギＩｇＧ溶液３０μＬ、ＰＢＳ２３２μＬを混合し、７水準の各３００μＬの標準曲線作成用サンプルを得た。
（６）また、別個に１３ｎＭおよび１２０ｎＭのウサギＩｇＧを含有するウサギＩｇＧ溶液３０μＬをそれぞれ調製し、前記蛍光標識物質溶液８μＬ（ＶＨＨ１０ｎＭ含有）、ＦＢＳ溶液３０μＬ、ウサギＩｇＧ溶液３０μＬ、ＰＢＳ２３２μＬを混合し測定用サンプルを調製した。
（７）９つのマイクロ流路を有する蛍光偏光度測定装置を使用し、励起波長は４７０±５ｎｍ、検出波長は５２０±５ｎｍで、標準曲線作成用サンプルおよび測定用サンプルの蛍光偏光度を測定した。なおサンプルは、９つのマイクロ流路のうち、７つのマイクロ流路に上記（４）記載の７水準の標準曲線作成用サンプルをそれぞれ注入し、残りの２つのマイクロ流路に上記（５）記載の２水準の測定用サンプルをそれぞれ注入し、同時に測定した。使用した蛍光偏光度測定装置の概略構成を図５に示す。装置１０は、主にＬＥＤ光源部１、励起フィルタ２、蛍光フィルタ３、ダイクロイックフィルタ４、対物レンズ５、結像レンズ６、液晶素子７およびデジタルイメージング素子（ＣＭＯＳ ｏｒ ＣＣＤカメラ）８、および試料発光部９から構成される。中心波長４７０ｎｍのＬＥＤ光源部１からの励起光を励起フィルタ２および対物レンズ５を介して試料発光部９内の試料に照射し、試料が発する蛍光を、ダイクロイックフィルタ４、および蛍光フィルタ３を透過させ、ＣＭＯＳカメラ８により透過光を取得する。蛍光フィルタ３と結像レンズ６との間に配置された液晶素子７に印加して電圧を変調すると、透過する蛍光の偏光方向を変調することができる。この変調周波数とＣＭＯＳカメラ８の取り込み周波数を同期して画像を取得・演算し、偏光度Ｐを二次元画像として算出する。この装置１０の試料発光部９の光学観察部分の有効視野は約３ｍｍφである。標準曲線と実測すべきサンプルの同時測定を行うため９本の流路数を使用する。図６に示すように、円形で示すφ３ｍｍの有効視野内に、流路幅１１と流路間スペース１２とが等間隔に、流路幅１５０μｍ、流路間スペース１５０μｍに調製されている。なお、流路深さは９００μｍである。試料発光部９内に複数のマイクロ流路を形成することで、複数のサンプルを同時に測定することができる。実施例４で使用したマイクロ流路の蛍光偏光度測定画像を図７に示す。
（８）結果を図８に示す。図８において黒丸は標準曲線を示し、黒四角はＩｇＧを１，３ｎＭ、１２ｎＭ含む試料の測定結果である。ＶＨＨ抗体を使用すると、マイクロ流路を備える測定器でも、測定することができた。
【0054】
（実施例５）
（１）ウサギＩｇＧを定量するため、ウサギＩｇＧ（シグマアルドリッチ社製）をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（富士フィルム和光純薬株式会社製）に溶解し、３，２８０ｎＭ、１,０８０ｎＭ、３６０ｎＭ、１２０ｎＭ、４０ｎＭ、１３ｎＭ、４．４ｎＭ、１．５ｎＭ、０．４９ｎＭの９水準のウサギＩｇＧ溶液を作成した。
（２）測定対象物質（ウサギＩｇＧ）に結合能を有するシングルドメイン抗体を蛍光色素で標識した蛍光標識物質として、Ａｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ Ａｌｐａｃａ－ｍｏｎｏ， ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＶＨＨ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８修飾（ＶＨＨ）（Ｃｈｒｏｍｏｔｅｋ社製、質量１５ｋＤａ）をＰＢＳにて１０００倍希釈し、蛍光標識物質溶液を調製した。
（３）前記蛍光標識物質溶液２．７μＬ（ＶＨＨ０．５μｇ／ｍＬ含有）、各濃度のウサギＩｇＧ溶液１０μＬ、ＰＢＳ８７．３μＬを混合し、９水準の各１００μＬの標準曲線作成用サンプルを得た。
（４）９つのマイクロ流路を有する蛍光偏光度測定装置を使用し、励起波長は４７０±５ｎｍ、検出波長は５２０±５ｎｍで、標準曲線作成用サンプルの蛍光偏光度を測定した。なおサンプルは、９つのマイクロ流路に上記（４）に記載の９水準の標準曲線作成用サンプルをそれぞれ注入し、同時に測定した。使用した蛍光偏光度測定装置は実施例４と同一である。実施例５の測定結果を図９に示す。
（１）ウサギＩｇＧを定量するため、ウサギＩｇＧ（シグマアルドリッチ社製）をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（富士フィルム和光純薬株式会社製）に溶解し、３，２８０ｎＭ、１,０８０ｎＭ、３６０ｎＭ、１２０ｎＭ、４０ｎＭ、１３ｎＭ、４．４ｎＭ、１．５ｎＭ、０．４９ｎＭの９水準のウサギＩｇＧ溶液を作成した。
（２）測定対象物質（ウサギＩｇＧ）に結合能を有するシングルドメイン抗体を蛍光色素で標識した蛍光標識物質として、Ａｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ Ａｌｐａｃａ－ｍｏｎｏ， ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＶＨＨ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８修飾（ＶＨＨ）（Ｃｈｒｏｍｏｔｅｋ社製、質量１５ｋＤａ）をＰＢＳにて１０００倍希釈し、蛍光標識物質溶液を調製した。
（３）前記蛍光標識物質溶液２．７μＬ（ＶＨＨ０．５μｇ／ｍＬ含有）、各濃度のウサギＩｇＧ溶液１０μＬ、ＰＢＳ８７．３μＬを混合し、９水準の各１００μＬの標準曲線作成用サンプルを得た。
（４）９つのマイクロ流路を有する蛍光偏光度測定装置を使用し、励起波長は４７０±５ｎｍ、検出波長は５２０±５ｎｍで、標準曲線作成用サンプルの蛍光偏光度を測定した。なおサンプルは、９つのマイクロ流路に上記（４）に記載の９水準の標準曲線作成用サンプルをそれぞれ注入し、同時に測定した。使用した蛍光偏光度測定装置は実施例４と同一である。実施例５の測定結果を図９に示す。
【0055】
（比較例２）
Ａｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ Ａｌｐａｃａ－ｍｏｎｏ， ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＶＨＨ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８修飾（ＶＨＨ）に代えてＡｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ Ａｌｅｘａ標識 Ｆａｂフラグメント （Ｆａｂ）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社製、質量５０ｋＤａ）を使用した以外は実施例５と同様に操作した。比較例２の測定結果を図１０に示す。
Ａｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ Ａｌｐａｃａ－ｍｏｎｏ， ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＶＨＨ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８修飾（ＶＨＨ）に代えてＡｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ Ａｌｅｘａ標識 Ｆａｂフラグメント （Ｆａｂ）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社製、質量５０ｋＤａ）を使用した以外は実施例５と同様に操作した。比較例２の測定結果を図１０に示す。
【0056】
（結果）
実施例５の図９の結果に示すように、マイクロ流路を有する測定装置では、ＶＨＨ抗体使用においてＩｇＧ量を定量することが容易であった。一方、図１０の通り、マイクロ流路を有する測定装置でＦａｂ抗体を使用すると、実施例１で観察された濃度に対応する蛍光偏光度の増加が見られず、ＩｇＧ量を定量することが困難であった。この原因は、Ｆａｂ抗体がＶＨＨ抗体よりも分子量が大きいことにより、マイクロ流路壁面に吸着しやすい点にあると推定される。Ｆａｂ抗体のように抗体が吸着した場合は、抗体分子の回転拡散が抑制されるため、抗原と反応していない場合でも高い蛍光偏光値を示す。そのため、マイクロ流路を有する測定装置では実施例１のように抗原濃度に伴い蛍光偏光値が上昇する結果は得られず、抗原の測定が困難になったと考えられる。これに対しＶＨＨ抗体のように流路に吸着しにくい場合は、マイクロ流路を有する測定装置でも抗原の濃度が大きくなるにつれ蛍光偏光値が大きくなり、実施例１と同様に高い測定感度での測定が可能となった。
実施例５の図９の結果に示すように、マイクロ流路を有する測定装置では、ＶＨＨ抗体使用においてＩｇＧ量を定量することが容易であった。一方、図１０の通り、マイクロ流路を有する測定装置でＦａｂ抗体を使用すると、実施例１で観察された濃度に対応する蛍光偏光度の増加が見られず、ＩｇＧ量を定量することが困難であった。この原因は、Ｆａｂ抗体がＶＨＨ抗体よりも分子量が大きいことにより、マイクロ流路壁面に吸着しやすい点にあると推定される。Ｆａｂ抗体のように抗体が吸着した場合は、抗体分子の回転拡散が抑制されるため、抗原と反応していない場合でも高い蛍光偏光値を示す。そのため、マイクロ流路を有する測定装置では実施例１のように抗原濃度に伴い蛍光偏光値が上昇する結果は得られず、抗原の測定が困難になったと考えられる。これに対しＶＨＨ抗体のように流路に吸着しにくい場合は、マイクロ流路を有する測定装置でも抗原の濃度が大きくなるにつれ蛍光偏光値が大きくなり、実施例１と同様に高い測定感度での測定が可能となった。
【符号の説明】
【0057】
１：ＬＥＤ光源部、２：励起フィルタ、３：蛍光フィルタ、４：ダイクロイックフィルタ、５：対物レンズ、６：結像レンズ、７：液晶素子、８：ＣＭＯＳカメラ、９：試料発光部、１０：装置
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】