特許 7562956 連続した液体クロマトグラフ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-09-30

(45)【発行日】2024-10-08

(54)【発明の名称】連続した液体クロマトグラフ

(51)【国際特許分類】

   G01N 30/26 20060101AFI20241001BHJP

   G01N 30/46 20060101ALI20241001BHJP

   G01N 30/88 20060101ALI20241001BHJP

   B01J 20/281 20060101ALI20241001BHJP

   G01N 30/02 20060101ALI20241001BHJP

【ＦＩ】

G01N30/26 M

G01N30/46 A

G01N30/26 Z

G01N30/88 Q

G01N30/46 Z

B01J20/281 R

G01N30/02 B

【請求項の数】 3

(21)【出願番号】P 2020027943

(22)【出願日】2020-02-21

(65)【公開番号】P2021131352

(43)【公開日】2021-09-09

【審査請求日】2023-01-18

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】000003300

【氏名又は名称】東ソー株式会社

(72)【発明者】

【氏名】植松 原一

【審査官】中村 直子

(56)【参考文献】

【文献】特公平０７－０４３３６２（ＪＰ，Ｂ２）

【文献】特開平０１－２９１１５９（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ ３０／００－３０／９６

Ｂ０１Ｊ ２０／２８１－２０／２９２

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

イオン交換カラムを用いる第一液体クロマトグラフ系と、
アフィニティカラムを用いる第二液体クロマトグラフ系と、
が切替えバルブを介して接続されたＳＡ１ｃ分析装置であって、
前記切替えバルブが、
前記第一液体クロマトグラフ系と前記第二液体クロマトグラフ系が繋がった流路となる第一の状態と、
前記第一液体クロマトグラフ系と前記第二液体クロマトグラフ系が独立した流路となる第二の状態と、
をとることが可能である、
前記第一液体クロマトグラフ系と前記第二液体クロマトグラフ系は、それぞれ送液ポンプに接続され、それらの送液ポンプの吸引側にそれぞれ切替え弁を配して、
前記第二液体クロマトグラフ系に流通する切替え弁により、組成が異なる２種の溶離液を選択できる、
ＳＡ１ｃ分析装置。

【請求項2】

さらに、前記第一液体クロマトグラフ系に流通する切替え弁により、前記第二液体クロマトグラフ系に使用される溶離液のいずれかと異なる３種の溶離液を選択できる、
請求項１に記載のＳＡ１ｃ分析装置。

【請求項3】

前記第二液体クロマトグラフ系における異なる２種の溶離液が、それぞれ
非糖化成分を溶出させるバッファと、糖化成分を溶出させるバッファであり、
糖化成分を溶出させるバッファをステップグラジエントで実施する、
請求項１に記載のＳＡ１ｃ分析装置。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、連続した液体クロマトグラフに関するものである。

【背景技術】

【0002】

糖尿病の判断基準の指標として、血液中の糖化ヘモグロビン（ＳＡ１ｃ）の割合を基に診断することが多く、その測定方法としてイオン交換クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィが例示できる。いずれの方法でも、塩濃度、組成の異なる複数のバッファを切替えて（ステップグラジエント）、目的である糖化ヘモグロビンを分離し、全体の占める割合からＳＡ１ｃ％を算出するものである。
イオン交換クロマトグラフィでは異常ヘモグロビン種の検体では、電荷の値が異なるため、正確に糖化されたヘモグロビンの量を算出できない、検体中に含まれる共存物質影響を受けるといった事例が報告されている。
一方、アフィニティクロマトグラフィでは、糖化／非糖化で分離するため、前記のような影響を受けにくいとされている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0003】

本発明の目的は、精密分離が得意なイオン交換クロマトグラフィと、検体の特性の影響を受けにくいアフィニティクロマトグラフィを、１回の検体注入で連続して行うことを可能とする装置を提供するものである。

【課題を解決するための手段】

【0004】

前記課題を解決するために、本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、本発明に到達した。

【0005】

すなわち本発明の一態様は、イオン交換カラムを用いる第一液体クロマトグラフ系と、アフィニティカラムを用いる第二液体クロマトグラフ系と、が切替えバルブを介して接続された分析装置であって、前記切替えバルブが、前記第一液体クロマトグラフ系と前記第二液体クロマトグラフ系が繋がった流路となる第一の状態と、前記第一液体クロマトグラフ系と前記第二液体クロマトグラフ系が独立した流路となる第二の状態と、をとることが可能であることを特徴とする。

【0006】

また本発明の別態様は、イオン交換カラムを用いる第一液体クロマトグラフ系と、アフィニティカラムを用いる第二液体クロマトグラフ系と、切替えバルブと、前記切替えバルブに接続された保留ループと、を備えた分析装置であって、前記切替えバルブは、前記第一液体クロマトグラフ系のみが前記保留ループと繋がった流路となる第一の状態と、前記第二液体クロマトグラフ系のみが前記保留ループと繋がった流路となる第二の状態と、をとることが可能であることを特徴とする。

【0007】

以下、本発明について詳細に説明する。

【0008】

イオン交換カラムを用いる第一液体クロマトグラフ系とは、少なくとも、複数のバッファを切替え可能な送液部、検体注入部、分析カラム、検出部を含んでなり、当該分析カラムがイオン交換カラムであることを特徴とする。

【0009】

アフィニティカラムを用いる第二液体クロマトグラフ系とは、複数のバッファを切替え可能な送液部、分析カラム、検出部を含んでなり、該分析カラムがアフィニティカラムであることを特徴とする。なお、第一液体クロマトグラフ系で分析されるものと同一の検体を第二液体クロマトグラフ系でも分析するため、第二液体クロマトグラフ系では検体注入部は備えていない。

【0010】

図１にシステム構成の一例を示す。符号１～１４までは第一液体クロマトグラフ系の構成要素、符号１５～２５までは第二液体クロマトグラフ系の構成要素を示している。
切替えバルブ２６により、第一液体クロマトグラフ系の可視光検出器１４の出口が第二液体クロマトグラフ系の分析カラム２４の上流側に流れる状態（状態１）と、可視光検出器１４の出口がそのままドレンに流れる状態（状態２）の、２つの状態に切替え可能である。
切替えバルブ２６が状態１の場合、アフィニティクロマトグラフィ用バッファは、分析カラム２４を通らず、そのままドレンに流れる流路をとり、状態２の場合、第二液体クロマトグラフ系ではアフィニティクロマトグラフィ用バッファがそのまま分析カラム２４に流れる流路をとる。図２は切替えバルブ２６が状態１の場合、図３は切替えバルブ２６が状態２の場合の流路を分かり易く示した図である。

【0011】

具体的な装置の操作方法としては以下の通りである。
まず、切替えバルブ２６を状態１の流路とする。第一液体クロマトグラフ系にて複数の分画（ピーク）に分離された溶出液についてカラム２４にそのまま導入させる。第一液体クロマトグラフ系にて分離された成分は、第二液体クロマトグラフ系では全く溶出されないため、カラム２４のヘッド部に留まり、濃縮される。
次に、切替えバルブ２６を状態２に切替え、カラム２４にアフィニティクロマトグラフィ用バッファ１を流す。切替えのタイミングとしては、第一液体クロマトグラフ系での分析に十分な時間が経過してからとする。切替えバルブ２６を状態２に切替え、時間Ｔ１までバッファ１を送液し、非糖化成分を溶出させ、時間Ｔ２までバッファ２を送液し糖化成分を溶出させる。図４は切替えバルブ２６の状態と第一液体クロマトグラフ系、第二液体クロマトグラフ系で得られるクロマトグラムを模式的に示した図である。

【0012】

本システムでは、検体の測定を実施する前に、第一液体クロマトグラフ系のみの測定で良いか、又は第一液体クロマトグラフ系と第二液体クロマトグラフ系の両方を測定するかを選択することが可能であり、検体の素性が予め分かっている際に有効な方法である。

【0013】

図５にシステム構成の別例を示す。符号１～１４までは第一液体クロマトグラフ系の構成要素、符号１５～２５までは第二液体クロマトグラフ系の構成要素を示している。
切替えバルブ２６により、第一液体クロマトグラフ系の可視光検出器１４の出口が１分析分のバッファ送液容量以上の容量を有する保留ループ２７を経由してドレンに流れる状態（状態１）、可視光検出器１４の出口がそのままドレンに流れる状態（状態２）と、の、２つの状態に切替え可能である。保留ループ２７の容量は、例えば、第一液体クロマトグラフ系の流量が１．５ｍＬ／ｍｉｎ、分離時間が１．５分の場合、２．２５ｍＬ以上の容量が必要である。
切替えバルブ２６が状態１の場合、アフィニティクロマトグラフィ用バッファは保留ループ２７を経由せず、分析カラム２４に流れる流路をとり、状態２の場合、第二液体クロマトグラフ系ではアフィニティクロマトグラフィ用バッファは、保留ループ２７を経由して分析カラム２４に流れる流路をとる。図６は切替えバルブ２６が状態１の場合、図７は切替えバルブ２６が状態２の場合の流路を分かり易く示した図である。

【0014】

具体的な装置の操作方法としては以下の通りである。
まず、切替えバルブを状態１の流路とする。第一液体クロマトグラフ系にて分離された成分は、検出器１４を通過後、保留ループ２７に導かれる。１分析が終了した時点、つまり、１分析分の溶出液が保留ループ２７内に収まった時点で、切替えバルブを状態２とする。これにより、保留ループ２７内に収まった溶出液がアフィニティクロマトグラフィ用バッファ１で分析カラム２４に導入することが可能となる。時間Ｔ１までバッファ１を送液し、非糖化成分を溶出させ、時間Ｔ２までバッファ２を送液し糖化成分を溶出させる。

【0015】

本システムでは、第一液体クロマトグラフ系で得られたクロマトグラムパターンや定量結果を判断材料として、第二液体クロマトグラフ系による測定を行うか否かを自動で実行する場合などに有効な方法である。

【発明の効果】

【0016】

本発明により、イオン交換クロマトグラフィとアフィニティクロマトグラフィを１回の検体注入で連続して行うことを可能となる。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】本発明のシステム構成を示した図である。上段部が第一液体クロマトグラフ系、下段部が第二液体クロマトグラフ系の役割を果たす部分である。切替えバルブ２６の太線は状態１、細線は状態２を示している。

【図2】図１の装置において、切替えバルブ２６が状態１の場合の流路を示した図である。

【図3】図１の装置において、切替えバルブ２６が状態２の場合の流路を示した図である。

【図4】図１の装置における第一液体クロマトグラフ系、第二液体クロマトグラフ系による分離を連続して行う際の様子を模式的に示した図である。上段が第一液体クロマトグラフ系、下段が第二液体クロマトグラフ系での分離を示している。中段は切替えバルブ２６の状態を示している。

【図5】本発明のシステム構成の別例を示した図である。上段部が第一液体クロマトグラフ系、下段部が第二液体クロマトグラフ系の役割を果たす部分である。切替えバルブ２６の太線は状態１、細線は状態２を示している。

【図6】図１の装置において、切替えバルブ２６が状態１の場合の流路を示した図である。

【図7】図１の装置において、切替えバルブ２６が状態２の場合の流路を示した図である。

【図8】実施例１で使用したシステム構成を示した図である。

【図9】実施例１の測定で得られたクロマトグラムである。図ａはキャリブレータ１、図ｂはキャリブレータ２である。それぞれ、上段が第一液体クロマトグラフ系で得られたクロマトグラム、下段が第二液体クロマトグラフ系で得られたクロマトグラムである。

【図10】実施例１のキャリブレータの分析結果から計算された検量線である。図ａは第一液体クロマトグラフ系、図ｂは第二液体クロマトグラフ系で得られた結果をそれぞれ示している。

【図11】実施例１の測定で得られたクロマトグラムである。図ａは第一液体クロマトグラフ系、図ｂは第二液体クロマトグラフ系で得られたクロマトグラムを重ね描いた図である。いずれも、実線は無添加、短破線はシアン酸ナトリウムを添加、長破線はアセトアルデヒドを添加した結果を示している。

【図12】実施例１で、第一液体クロマトグラフ系からの検体を含む溶出液が、アフィニティカラムに完全にトラップされたかを検証した図である。

【図13】実施例１で、第一液体クロマトグラフ系からの検体を含む溶出液をアフィニティカラムに導入する時間（バルブ切替え時間）を変化させた場合の、第二液体クロマトグラフ系で得られたクロマトグラムでのＡ０ピークの溶出挙動を示した図ある。図ａは検体注入からのＡ０ピークの溶出時間、図ｂは切替え時間からのＡ０ピークの溶出時間を示している。

【図14】実施例１で、第一液体クロマトグラフ系からの検体を含む溶出液をアフィニティカラムに導入する時間（バルブ切替え時間）を変化させた場合の、第二液体クロマトグラフ系で得られたクロマトグラムでのＡ１ｃピークの溶出挙動を示した図である。図ａは検体注入からのＡ１ｃピークの溶出時間、図ｂは切替え時間からのＡ１ｃピークの溶出時間を示している。

【図15】実施例２で使用したシステム構成を示した図である。

【図16】実施例２で得られたクロマトグラムを示した図である。図ａは第一液体クロマトグラフ系で得られたクロマトグラム、図ｂは第二液体クロマトグラフ系で得られたクロマトグラムである。図中実線はキャリブレータ１、破線はキャリブレータ２を示している。

【図17】実施例２のキャリブレータの分析結果から計算された検量線である。図ａは第一液体クロマトグラフ系、図ｂは第二液体クロマトグラフ系で得られた結果を示している。

【図18】実施例２で、バルブの切替え時間を変化させた場合の、第二液体クロマトグラフ系で得られたクロマトグラムの変化を示した図である。

【図19】実施例２で、バルブの切替え時間を変化させた場合の、定量結果への影響を示した図である。図ａは総面積、図ｂはＡ１ｃピーク面積、図ｃはＡ１ｃ面積％を示している。

【実施例】

【0018】

以下に本発明の実施例を説明するが、本発明はこれら実施例により何ら制限されるものではない。

【0019】

（実施例１）
図８に本検証で使用したシステム構成を示す。
第一液体クロマトグラフ系は、送液ポンプ８、試料注入機構９、イオン交換カラム１３及び可視光検出器１４を接続した。また、送液ポンプ８の吸引側に切替え弁５～７を配し、塩濃度等が異なる３種の溶離液１～３が選択できるようにした。
第二液体クロマトグラフ系は、送液ポンプ２０、アフィニティカラム２４及び可視光検出器２５を接続した。また、送液ポンプ２０の吸引側に切替え弁１８、１９を配し、組成が異なる２種の溶離液１５、１６が選択できるようにした。
また、第一液体クロマトグラフ系の出口と第二液体クロマトグラフ系の入口を、２つの流路構成がとれる２位置切替え６方バルブ２６で接続した。恒温槽１０、２１は、１つに集約し、イオン交換カラム１３とアフィニティカラム２４の両方を収納した。
いずれの構成機器も、全て東ソー（株）製の８０２０シリーズのＨＰＬＣを用いた。

【0020】

第一液体クロマトグラフ系の分析カラムおよび溶離液は、東ソー（株）製グリコヘモグロビン分析計ＧＨｂＶＩＩＩ用のものを使用した。
第二液体クロマトグラフ系の分析カラムは東ソー（株）製ＴＳＫｇｅｌ Ｂｏｒａｔｅ５ＰＷ（２．５ｍｍＩＤ＊１５ｍｍＬ）（リガンド：ｍ－アミノフェニルボロン酸）を使用した。
ＳＡ１ｃ吸着用溶離液（ｐＨ８．８）の組成は、以下のように調整した。
ＨＥＰＥＳ １０ｍＭ
塩化マグネシウム・６水和物 ５０ｍＭ
塩化ナトリウム ５００ｍＭ
アジ化ナトリウム ０．１％
ＳＡ１ｃ脱着用溶離液（ｐＨ８．８）の組成は、以下のように調整した。
ＨＥＰＥＳ １０ｍＭ
塩化ナトリウム ５００ｍＭ
Ｄ－ソルビトール ３０ｍＭ
アジ化ナトリウム ０．１％

【0021】

検体として、東ソー（株）製のキャリブレータ（Ｃａｌ＿１：ＨｂＡ１ｃ ５．９％［ＮＧＳＰ］、Ｃａｌ＿２：ＨｂＡ１ｃ １０．９％［ＮＧＳＰ］）、コントロール（Ｃｔｌ＿１：ＨｂＡ１ｃ ５．０±０．３％［ＮＧＳＰ］、Ｃｔｌ＿２：ＨｂＡ１ｃ １０．１±０．５％［ＮＧＳＰ］）を使用した。使用する際は、同取扱説明書の手順で溶解・希釈して用いた。併せて、実際の血液検体も使用した。使用する際は、東ソー（株）製グリコヘモグロビン分析計（ＨＬＣ－７２３シリーズ）専用の溶血／洗浄液にて溶解・希釈して用いた。

【0022】

その他の測定条件は以下の通りである（共通）。
送液流量 ：１．２５ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度 ：４０℃
検出波長 ：４１５ｎｍ（単波長）
検出器レスポンス ：０．１５ｓ
データ収集サンプリングピッチ：１００ｍｓ

【0023】

バルブ２６は、状態１の場合、第一液体クロマトグラフ系と第二液体クロマトグラフ系が流路と繋がった流路となり、第一液体クロマトグラフ系で分離された成分がアフィニティカラム２４に全量流れ込む流路となる。
バッファの切替えタイミング（ステップグラジエント）及びバルブ２６の切替えタイミングは以下の通りとした。
まず、バルブ２６を状態２で、それぞれのカラムをバッファ１で初期化した。続いて、バルブ２６を状態１に切替え、検体を注入し分析を開始した。第一液体クロマトグラフ系では、０．４５分までバッファ１、０．４５～０．８０分までバッファ２、０．８０～１．７０分までバッファ３が流れるステップグラジエントを実施した。
開始から２．５０分後にバルブ２６を状態２に切替えた。
第二液体クロマトグラフ系では、４．０分までバッファ１、４．０～６．０分までバッファ２が流れるステップグラジエントを実施した。図９にキャリブレータ１、２を測定し得られたクロマトグラムを示す。いずれも、上段が第一液体クロマトグラフ系、下段が第二液体クロマトグラフ系で得られたクロマトグラムである。なお、バルブの切替えのタイミングは「ＳＷ」と示し、以降の図でも同様である。

【0024】

下段のクロマトグラムから分かるように、０．０～２．５分までの間、ピークは検出されない。つまり、第一液体クロマトグラフ系で分離された検体は、アフィニティカラムに全く溶出せず、カラム入口で濃縮されていることとなる。バルブ２６を状態１から２に切替えることにより、アフィニティカラムにアフィニティクロマトグラフィ用バッファ１が流れ込み、非糖化ヘモグロビンが溶出し、更にバッファ２に切替えることで、糖化ヘモグロビンが溶出していることが分かる。

【0025】

図１０はこの結果を基にした検量線である。横軸が全ピーク面積に対する糖化ヘモグロビンピーク面積比（Ａ１ｃ面積％）、縦軸は糖化ヘモグロビン％（Ａ１ｃ％）を示している。

【0026】

次に、コントロール１、２、全血、全血に０．２５ｇ／Ｌの割合でシアン酸ナトリウム、アセトアルデヒドを添加し、３７℃下、１時間反応させた後、即溶血／希釈した検体について前記検量線から定量を実施した。

【0027】

図１１に得られたクロマトグラムを示す。
コントロール１、２および実検体に関しては、第一液体クロマトグラフ系と第二液体クロマトグラフ系でほぼ同じ値が得られているが、シアン酸ナトリウム、アセトアルデヒドを添加した検体では、第一液体クロマトグラフ系と第二液体クロマトグラフ系で差異が見られる。
クロマトグラムから分かるように、第一液体クロマトグラフ系では、定量目的であるＡ１ｃピークに妨害ピークがかぶり、正しく定量できていない。シアン酸ナトリウム添加検体では、０．１９％低く、アセトアルデヒドを添加した検体では、０．９８％高い値と計算されてしまう。第二液体クロマトグラフ系では添加による値の変動がほぼ見られない。

【0028】

【表1】

【0029】

さらに、バルブ２６の切替え時間（ＳＷ）及び第二液体クロマトグラフ系でのバッファ切替えを表２のように変化させ、定量性等の結果に影響しないか、検証を行った。なお、バッファ切り替えは、バルブ切り替え時間を基点とした場合、バッファ１から２への切替え時間は１．５０分、バッファ２から１への切替え時間は３．５０分と、一定になるように設定してある。

【0030】

【表2】

【0031】

図１２にキャリブレータ２を測定し得られた第二液体クロマトグラフ系で得られたクロマトグラムを示す。また、図１３にＡ０ピークの溶出時間の変化、図１４はＡ１ｃピークの溶出時間の変化を示す。図１３、１４は共に、図ａは試料注入を基点とした溶出時間、図ｂはバルブ切り替えを基点とした時間で表示してある。これらから分かるように、バルブ切り替え時間を遅くすると、各成分ピークはそれに伴い遅くなるが、切替え時間を基点としてみると、各成分ピークの溶出時間、ピーク形状は、ほぼ同じになっている。このことからも、第一液体クロマトグラフ系で分離された検体は、アフィニティカラムおよびイオン交換クロマトグラフィ用バッファ１～３では全く溶出していないことが分かる。

【0032】

（実施例２）
図１５に本検証で使用したシステム構成を示す。
切替えバルブ２６周辺の流路構成以外は、実施例１と同様である。バルブ２６は、状態１の場合、保留ループ２７は分析カラム２４の上流に接続した流路、状態２の場合、保留ループ２７は検出器１４下流側に接続された流路となる。

【0033】

実施例２での測定条件は下記の通りとした。なお、これ以外の条件は、実施例１と同じである。
第一液体クロマトグラフ系
ステップグラジエント：０．００分～０．２５分 バッファ１
０．２５分～０．５５分 バッファ２
０．５５分～１．０５分 バッファ３
設定流速 ：１．２５ｍＬ／ｍｉｎ
保留ループ容量 ：３．２４ｍＬ（内径１．０ｍｍ×４ｍ ＳＵＳ チューブ）
バルブ切替え時間 ：２．００分
第二液体クロマトグラフ系
分析カラム ：ＴＳＫｇｅｌ Ｂｏｒａｔｅ５ＰＷ
（７．５ｍｍＩＤ＊７５ｍｍ）
ステップグラジエント：０．０分～９．００分 バッファ１
９．００～１５．００分 バッファ２
設定流速 ：１．２５ｍＬ／ｍｉｎ

【0034】

まず、バルブ２６を状態１で、それぞれのカラムをバッファ１で初期化した。続いて、バルブ２６を状態１としたまま、検体を注入し分析を開始した。第一液体クロマトグラフ系では、上記ステップグラジエントを実施した。検出器１４からの溶出液は保留ループ２７に導かれることとなる。全成分の分析が終了する時間である２．０分にバルブ２６を状態２に切替えた。これにより、保留ループ２７内に保留された、分離成分を含むイオン交換クロマトグラフィ用バッファは、分析カラム２４の上流に配されることとなる。

【0035】

保留ループ２７内に保留された液は、アフィニティクロマトグラフィ用バッファ１により押し流され、分析カラム２４に導入され、分離が開始される。
検体注入から９分後、アフィニティクロマトグラフィ用バッファ２に切り替えた。

【0036】

図１６にキャリブレータ１、２を測定し得られたクロマトグラムを示す。図ａは第一液体クロマトグラフ系、図ｂは第二液体クロマトグラフ系で得られたクロマトグラムである。図ａで分かるように、第一液体クロマトグラフ系では約２分で分離が終了している。つまり、第一液体クロマトグラフ系の検出器出口に配された保留ループ２７内に、１分析分完全に保留されている。バルブを切替えた後は、保留ループ２７は第二液体クロマトグラフ系に配されるため、この容量分はイオン交換クロマトグラフィ用バッファがアフィニティカラム内を流れることとなる。

【0037】

表３に検量線作成用のキャリブレータ１、２及びコントロール１、２の測定定結果を示す。なお、キャリブレータ１、２で得られた結果から図１７に示す検量線が取得できた。

【0038】

【表3】

【0039】

次に、回収率の検証を行った。

【0040】

図１８に、バルブの切替え時間を０．５～３．０分まで変化させた場合の第二液体クロマトグラフ系のクロマトグラムを示す。なお、図中の破線は切り替え時間を示しており、時間軸を、切り替え時間を基準となるようにずらして配置してある。図１９は、第二液体クロマトグラフ系で得られた定量結果を示した図である。図ａは縦軸がピーク総面積、図ｂは縦軸がＡ１ｃピーク面積、図ｃは縦軸がＡ１ｃ面積％である。また、表４は第一液体クロマトグラフ系及び第二液体クロマトグラフ系で得られた定量結果を示した表である。

【0041】

【表4】

【0042】

図１８、１９から分かるように、バルブの切替え時間を基準とした場合、第二液体クロマトグラフ系で得られたクロマトグラムにおいて、各成分ピークの溶出時間に変化は見られない。つまり、バルブを切り替えた以降、正常にアフィニティ分離がなされていると言える。

【0043】

保留ループ２７の容量は、約３．２４ｍＬであり、計算上、イオン交換溶出液の約２．６分を保留できる。第一液体クロマトグラフ系での分離は２分弱で終了している。容量に換算すると、２．５ｍＬ（２分×１．２５ｍＬ／ｍｉｎ）となる。切替え時間が２分以上であれば、第一液体クロマトグラフ系での分離帯を全て保留ループに収めることができ、１００％の量を第二液体クロマトグラフ系に負荷できるが、切り替え時間を３分とした場合、保留ループの容量を超えてしまうため、第一液体クロマトグラフ系の分離帯の一部は保留ループから排出され、第二液体クロマトグラフ系への負荷量が減る結果となる。また、切り替え時間が極端に短い場合、第一液体クロマトグラフ系の分離帯を完全に保留ループ内に収められず、Ａ１ｃ面積％も正確に算出できないことも分かる。

【符号の説明】

【0044】

１．イオン交換クロマトグラフィ用バッファ１
２．イオン交換クロマトグラフィ用バッファ２
３．イオン交換クロマトグラフィ用バッファ３
４．イオン交換クロマトグラフィ用脱気装置
５．イオン交換クロマトグラフィ用バッファ１ 開閉機構
６．イオン交換クロマトグラフィ用バッファ２ 開閉機構
７．イオン交換クロマトグラフィ用バッファ３ 開閉機構
８．イオン交換クロマトグラフィ用送液ポンプ
９．イオン交換クロマトグラフィ用試料注入機構
１０．イオン交換クロマトグラフィ用恒温槽
１１．イオン交換クロマトグラフィ用ラインフィルタ
１２．イオン交換クロマトグラフィ用プレヒートコイル
１３．イオン交換カラム
１４．イオン交換クロマトグラフィ用可視光検出器
１５．アフィニティクロマトグラフィ用バッファ１
１６．アフィニティクロマトグラフィ用バッファ２
１７．アフィニティクロマトグラフィ用脱気装置
１８．アフィニティクロマトグラフィ用バッファ１ 開閉機構
１９．アフィニティクロマトグラフィ用バッファ２ 開閉機構
２０．アフィニティクロマトグラフィ用送液ポンプ
２１．アフィニティクロマトグラフィ用恒温槽
２２．アフィニティクロマトグラフィ用ラインフィルタ
２３．アフィニティクロマトグラフィ用プレヒートコイル
２４．アフィニティカラム
２５．アフィニティクロマトグラフィ用可視光検出器
２６．流路切替え機構
２７．保留ループ

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】